CZ119993A3

CZ119993A3 - The use of il-4 for increasing immune response to immunogens in vaccines

Info

Publication number: CZ119993A3
Application number: CS931199A
Authority: CZ
Inventors: Edward J Rozhon; Connell John E O; Stuart A Cox; Michael D Hayre; Jerome Schwartz
Original assignee: Schering Corp
Priority date: 1990-12-19
Filing date: 1991-12-17
Publication date: 1994-02-16
Also published as: EP0563254A1; ATE129900T1; PT99838A; HUT68529A; ZA919907B; DK0563254T3; SK59393A3; OA09863A; WO1992011030A1; CA2098726A1; ES2079851T3; IL100402A0; GR3018820T3; HU9301797D0; AU9161591A; DE69114519D1; CN1063227A; JPH06503830A; IE70453B1; IE914436A1

Description

vakcinach

Oblast vvnálezu

Tento vynález se týká farmaceutických přípravků, obsahujících IL-4 jako aktivní přísadu ke zvýšení primární imunitní odpovědi savců n.a imunogeny ve vakcinách. Vynález se také týká použití interleukinu-4 pro výrobu léčiva pro zvyšování primární imunitní odpovědi savců na imunogeny přítomné ve vakcině jakož i metod zvyšování efektivní primární imunitní odpovědi u savců na imunogeny přítomné ve vakcinách podáním účinného množství interleukinu-4 ve spojení s vskcinou těmto savcům.

Dosavadní stav techniky mu

Interleukin-4 (zde dále IL-4 známý ale také jako 3 Cell Stimulatory Factor 1 (35F-1)) byl původně popsán uí.Howardem a spol. v J.Exp.Led. (1982), díl.155, str.914-23 jako T-buňkami produkovaný růstový faktor, odlišn.ý od IL-2, který dovoluje dlouhodobou tkáňovou kultivaci normálních myších 3lymfocytů a který interaguje. s aktivovanými 3-iymfocyt.y a udržuje jejich prolifferaci déle než 4 měsíce. «Jelikož smíšené 3-lymfocytové vzorky byly použity k iniciování kultury bylo zjištěno, že 3-iymfocyt.y s nezralým feno typem se specificky zvyšují působením IL 4 ve tkáňové kultuře. Viz například C.Perchel a spol., J.Immunol.(1989), sv.142, 15581 568. Dále G.Tpenn a spol., J.Immunol.(1988), sv.140,11011106 popisuje, že IL-4 stimuluje vývoj cytotoxických T-buněk z Lyt-2+ subpopulace zbývajících myších T-lymfocytů.H.Spíts a spol., J.Immunol.(1987), díl 132, 1142-47 popisuje, žs IL-4 Oli růstového faktoru T-buněk u lidských buněk in vitro odlišnou od

IL-2.

-2•<*yší IL-4 gen b.yl klonován a exprimován v 003-7 buňkách (viz T.Otsuka a spol., Nuc.Ajids Pes. (1987), díl 15, 333—

334. Klonovaný faktor měl všechny aktivity ve tkáňové kultuře pozorované pro faktor purifikovaný ze supernatantu T-buněčné kultury. Κ]__οηον^ηί a exprese lidského IL-4 genu byly popsány N. Araiem a spol., J.Immunol.(1989), díl 142,274232 a T.Yokota-em a spol., Proč.Nati.Acad.^ci.(1986), sv.

83, 5844-5848 s faktorem produkovaným v COS-7 buňkách, majícím podobné aktivity jako nativní molekula, jak bylo studováno na tkáňové kultuře. IL-4 byl studován jak na lidském tak myším buněčném systému, navíc byly molekule přisouzeny in vitro tyto aktivity:i) IL-4 hraje významnou roli v indukci a regulaci syntézy IgE, procesu, vyskytujícím se v

3-l,ymfocytové subpopulaci, je-li indukována k proliferaci (viz Pene, J.Proc.Nat*1.ácad.Sci.(1 988), díl.856880- 6884)>

ii) IL-4 indukuje nízko afinitní Fc£. receptory (CD23) na normálních lidských 3-lymfocytesh. ve tkáňové kultuře, (viz

T.DeFrance a spol., J.Exp.Med. (1987), díl 165, 1459-1457), iii) IL-4 interaguje s dalšími lyafokiny, zejména interferonem- (viz P.L.Goffman a spol., Immunol.Res.(1988), díl

102,5-27 a S.Romagnani a spol., výše) a T-buňkami (viz P.L.Goffman a spol. výše, S.Romagnani a spol. výše a M.D·® Widmer a spol., Nátuře (1987), díl 326,795-96) k vyvolání určité 3-huněčné proliferace a alterace; iv) IL-4 zvyšuje sekreci specifických protilátkových třiď, tj.např. Ig lidskými

3-buňkami (viz J.3.Splawski a spol., ď.Immunol.(1 989), díl 142, 1569-1572; v) IL-4 má stimulační účinky ns T-buňky, mastocyty a ma.krofágy (viz K. H. Srsbstein a spol., J.Immunol. (1987), díl 139, 1148-1153; F.Lee a spol., Proč.Nati. Lcad.

Sei (1986), díl 83,2061 a A.Zlotnik a spol., J.Immunol.(1987), díl 138, 4275-4279) a vi) IL-4 zvyšuje expresi MHC antigenů

II.třídy u zbývajících 3-buněk (R.Noelle a spol., ΡΝΛ3 81. 6149-6153, 1984). T.R.^osmann a spol. v J.Immuno., díl.132,

1813-1816 popisuje, še lidský a myší IL-4, které jsou z 50 %

3homologní v aminokyselinové sekvenci 1-50 a 129-149byly druhově soecifické.

Použití IL-4 ke zvýšení imunitní odpovědi na infekční antigenické podněty, napře viry, bakteriemi, houbami nebo protozoami způsobené chronická infekce, ja popsáno ve zveřejněné americké přihlášce vynálezu č. 07/496332, odpovídající POT přihlášce US-91/01733, podané 03/19/91.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález poskytuje použití IL-4 pro výrobu léčiv, zvyšujících primární imunitní odpověS u savců na imunogeny přítomné ve vakcině podáním účinného množství IL-4 těmto savcům ve spojení s uvedenou vakcinou.

Předkládaný vynález také poskytuje farmaceutickou kompozici pro zvyšování primární imunitní odpovědi, savců na imunogeny přítomné ve vakcině, takové kompozice obsahují množství IL-4 účinné pro takové zvýšení a farmaceuticky přijatelný nosič.

Předkládaný vynález také poskytuje metodu pro Xvýšení primární imunitní odpovědi savců na imunogeny přítomné ve vakcině, které obsahuje Dodání IL-4 ve spodem s vakcinou v množství dostačujícím pro zajištění takového účinku uvedeným zvířatům.

Předkládaný vynález také poskytuje metodu zvýšeni primární imunitní odpovědi savců na imunogeny ve virové vakcině, která zahrnuje podání pro tento účel účinného množství IL-4 ve spojení s uvedenou vakcinou, těmto savcům.

Předkládaný vynález dále poskytuje metodu zvýšení primární imunitní odpovědi u savců na imunogeny přítomné ve vakcině tetanového toxoidu, která zahrnuje podání pro tento účel účinného množství IL-4 ve spojení s uvedenou vakcinou tetanového toxoidu.

Předkládaný vynález také poskytuje metodu zvýšení primární imunitní odpovědi u savců na imunogeny přítomné ve vakcině, kde primární imunitní odpověď těchto savců za nepřítomnosti IL-4 není příliš silná nebo rychlá tak, aby zabránila chorobě, kde metoda zahrnuje podání množství IL-4 účinného pro tento účel uvedeným savcům ve spojení s vakcinou.

Předkládaný vynález také poskytuje kit pro zvýšení primární imunitní odpovědi na imunogeny ve vakcině, který zahrnuje: 1) kontejner farmaceutického přípravku IL-4 a jeho farmaceuticky vhodného nosiče a 2) kontejner farmaceutického přípravku vakcin.y a jejího farmaceuticky vhodného nosiče-.

Popid obrázků na výkresech

Obr.1 ilustruje chronologii imunitní odpovědi vyvolané podáním rekombinantního lidského IL-4 a vakciny tetatického toxoidu opici cynomolgus v souladu s předkládaným vynálezem.

Obr.2-5 graficky ilustrují stav protilátek proti tetanu jako funkci času k vakcině tetahického toxoidu na modelu opice cynomolgus podáním 0,5 /ug/kg a 20 ^ug/kg rekombinantního lidského IL-4 a vakciny tetanického toxoidu v souladu s předkládaným vynálezem.

překvapením bylo zjištěno, .že podání rekombinantního lidského IL-4 (dále rhIL4) opicím cynomolgus současně s vakcinou tetanického'toxoidu ke zvýšení primární imunitní odpovědi opice. Tento výsledek je zvláště překvapivý, protože když byl podán rh!L4 opicím cynomolgus během druhé inokulace

-2rekcmbinantním vire.ii hepatitid.y 3 (rH3Vax) asi 2 měsíce po podání rH37^ax a stejně tak jako tehdy, je-li IL4 podán opicím cynomolgus v průběhu druhé inokulace 5alk vakcíny inaktivovaného polioviru asi jeden měsíc po podání Salk vakčiny inaktivovaného viru, nebyla pozorována žádná snamnestická, tj.sekundární nebo paměťová odpověď, metody tohoto vynálezu pro poskytnutí podání IL-4 spolu s vakoinou, mají následující výhody. ^óelková antigenická zátěž podávané vakcinv může být snížena, protože méně antigenu za přítomnosti IL-4 by mělo zvýšit imunologickou odpověď alespoň ekvivalentně tomu, co bylo dosaženo podáním vakoiny výše uvedeným Protože bude požadováno méně antigenu. pro vakcinaci díky podání IL-4 ^postupem podle vynálezu, bude snížena pravděpodobnost nežádoucích účinků běžně spojených s některými vakcinami. Navíc protože je požadováno menší množství imuno· genu k dosažení účinné ochrany, budou sníženy celkové nákla dy vakoiny na pacienta. Imunitní odpověď jiného typu jedinců, kterrí odpovídají slabě na vakcinaci, bude zvýšena podáním IL-4 v souladu s tímto vynálezem. Takové typy jedinců, kteří mohou výhodně využít metod tohoto vynálezu jsou

1) ty typy, mající poškozenou imunitní odpovídavost jako jsou děti narozené § jistými imunodeficiencemi, 2) dříve normální individua, která neodpovídají na jisté vakcíny stejně jako 3) jedinci, kteří se podrobili imunosupresivní terapii, včetně radiace, kortikosteroidů atd.

3ylo zjištěno, še byly nalezeny 1) zvýšení účinné primární imunitní ců na imunogeny přítomné ve vakcině diny protilátek u savců vystavených 3)zvýšení primární imunitní odpovědi ve vakcině u savců, kde jejich imunii účinné metody odpovědi u takových sav , 2) zvýšení účinné hla imunogenům ve vakcině a na imunogeny přítomné ni odooved za neontomnosti IL-4 není dostatečn i lná nebo rychlá k zsbráněi choroby. IL-4 noh

Imunitní odpovědi t u být ne dostatečné chto savců zs nepři temnosti silné Či dosti rychlé k zabrá-činění choroby těchto savců, ale bylo zjištěno, že existují účinné metody, které zahrnují podání IL-4, výhodněji rekombinantního IL-4 v množství účinném pro tento účel takovým savcům:.

Vakciny zamýšlené pro použití v souladu s tímto vynálezem, zahrnují bakteriální vakciny, vakciny toxoidů (inaktivovaných toxoidů) a virové vakciny nebo jejich směsi (mnohonásobné antigeny) používané pro aktivní imunizaci u lidí. Viz například kapitola 75 nazvaná Immunizing Agents v Remington*s Pharmaceutical Sciences 14,vydání 1990 Iviack Publishing- Co. str.1426-Í441 a antitoxiny, toxoidy, vakciny a živé vakciny schválené PDA a uvedené na str.210 (Product Category Index) Physicians*Desk Reference, 44.vyd.1990» Vhodné bakteriální vakciny zahrnují bakteriální vakciny proti, následujícím chorobám nebo stavům: choleře, pertussis, moru, tyfové horečce, meningitidě, pneumokokové pneumonii, H.influenzae typ B, lepře, kapavce, meningokokové skupině 3 a skupině 3 streptokoků, G-negativní sepsis, E,coli sepsis a Pseudomonadě aeruginosa.

Vhodné toxoidy zahrnují difteria toxoid, toxoid botulismu a toxoid tetanu. Vhodné virové vakciny zahrnují živé a inaktivované virové vakciny proti následujícím chorobám a stavům: poliomyelitida, spalničkám, zarděnkám, žluté horečce, příušnicím a hepatitidě 3.

Vhodné mnohonásobné antigeny zahrnují difterii a teta nový toxoid, trojit;/ antigen - difterie, pertusse a tetanový toxoid tak, jak jsou dosažitelné od Coansught Leboratories Ino. Swiftevater, PA 18370. Široký rozsah virových kmenů a buněčných substrátů, používaných V různých zemích a imunizační postupy jsou popsány v Tabulce 1 O-ó a 10-7 resp. kapitole 10 nazvané Immunization against viral diseases v (str 4,ř.27 str. 283-301 knihy D.O.Vhitea a F.Fennera, Medicinsl

-7Virology,(1936)3.vydání, Academie Press Inc.Grlando, Fla).

Výraz ve spojení s jak je zde používán, značí podání j.L-4 současně, během nebo ihned před nebo po podání vskciny. ^apříklad In-4 může být podán 10 až 14 dní po a před podáním vhodné vakciny. Normálně je možno podat IL-4 ořed podáním vhodné vakciny,v době dostačující k získání stálé hladiny -i-L-4 v lymfatické tkáni savců. Tyto hladiny jsou určovány použitím standardních farmakokiňetiekých měření. Podání IL-4 by mělo být kontinuální po podání vakciny po dobu, během které jsou imunogen.y přítomné ve vakcině zpracovávány savčím imunitním systémem a po dobu dostatečnou k tomu, aby IL-4 přinesl zvýšení primární imunitní odpovědi. Vskcina je podána cestou a silou doporučenou pro každý užívaný druh.

Jakýkoliv vhodný IL-4 může být použit v předkládaném vynálezu. Komplementární DNA (cDNA) pro IL-4 byly nedávno klonovány a sekvenovány v mnoha laboratořích, např. Yokota-ou a spol., Proč.Nati.Acad.Sci.USA (1986) sv.83:5894-5898 (lidské), Lee-em a spol., Proc.Natl.Acad.Sci.USA (1986) sv.33:20612065 (myší), Noma-ou a spol. N_ature(l98ó) sv.319:640-646 (myší) a Genzyme Corporation, Boston, Massachusetts (lidské a myší). Navíc byl nerekombinantní IL-4 čištěn, z různých kulturových supernatantů, např. Sanderson a spol., Proc.Natl. Acad.3ci.USA (1986)sv.83:437-440 (myší), Grabstein a spol.,

U.Sxp.^ed.(1985),sv.163:1405-1413 (myší), Ohara a spol., J.

Immunol.(1985)sv.135:2518-2523 (myší 33F-1), 3utler a spcl.,

J.Immunol.133:(1984)sv.251-255 (lidský 3CGF) a Parrar a spol., U.Immunol.(1933)sv.131:1838-1842 (myší 3CGF). Všechny předchozí citace jsou zde zařazeny jako odkazy vzhledem k jejich informacím o DNA a aminokyselinových sekvencích a metodách získání vhodných IL-4 materiálů pro použití v předloženém vynálezu.

iL-Ί

Výhodně je IL-4 používaný v předloženém vynálezu]a nejvýhodněji je to lidská verze sekvence popsané v práci, je-8jímž autorem je Yokcto a spol., Proc.Natl.Acad.3ci.U3 A (1386), sv.83:5894-5838 a PCT patentové přihlášce č.87/02990 publikované 21.května 1987, která je exprimována vt a izolována z E.coli (US patentová přihlášky č.. 079666, podaná 29.července 1987 a US patentová přihláška č. 194799 podané ^.července 1988). Produkce IL-4 z CHO buněk je popsána v US patentové přihlášce· SN 386937, podané' 31 .října 1982. Citované články, PCT přihlášky a US patentové přihlášky jsou zde uvedeny jako odkazy·.

Výraz účinné množství, jak je zde používán v souvislosti s účinným množstvím IL-4 podaným v souladu s tímto vynálezem, znamená množství IU-4, které produkuje nárůst hladiny protilátek dostatečný ke zvýšení ochrany proti infekčnímu agens. Přesné zvýšení hladiny protilátek, které může být považováno za signifikantní, může být malé. účinné množství podaného IL-4 se typicky pohybuje od 0,25 do 15 mikrogramů IL-4, výhodně lidského IL-4 rekombinantně produkovaného E.ooli nebo CHO buňkami, na kilogram tělesné hmotnosti a den.Ueště výhodněji je savcům podáno 0,25 - 5 mikrogramů rhlL4 na kilogram tělesné hmotnosti a den a nejvýhodněji je savcům podáno 0,25 - 1 mikrogram hIL-4 na kilogram tělesné hmotnosti a den.

Množství, frekvence a perioda podání budou záviset a měnit se v závislosti na faktorech jako je hladina titru specifických protilátek, třídě indukovaných protilátek, typu vakciny jakož i věku pacienta,jeho výživě atd. Obvykle bude podání IL-4 z počátku denní a může pokračovat periodicky po celou dobu pacientova života. Velikost dávky a frekvence může být určena během počátečního soreeningu titru soecifických protilátek a velikosti účinku IL-4 na zvýšení titru protilátek.

Podání dávky může být intravenozní, nasální, parenterální, orální, subkutánní, intramuskulární, topické, transdermální či jakoukoliv jinou přijatelnou metodou. IL-4- může být podán v jakékoliv z různých konvenčních dávkových forem. Parenterální preparáty zahrnují sterilní roztoky nebo suspenze, inhalační podání může být formou nasálního nebo orálního spreje nebo insuflací. Topické dávkové formy zahrnují krémy, masti, pletové vody, transdermální přípravky (tj. obvyklé rezervoáry nebo typy matricových náolastí) a podobno.

Formulace farmaceutických přípravků uvedených v těchto dávkových formách je možno dosáhnout s obvyklými farmaceuticky přijatelnými přísadami a excipienty za použití běžných technik.

V současné době je IL-4 výhodně podáván intravenosní cestou. Roztok, který má být podán, může být rekonstituovaný lyofilizovaný prášek a může navíc obsahovat chránící látky, pufry, disperganty atd.

Výhodně je IL-4 rekonstituován s 10 milimolárním citrátovým pufrem o vhodném pH a je prostjfa ochranných látek, vodou prostou ochranných látek o maximální koncentraci nepře sáhující 100 mikrograaů na mililitr a je podáván kontinuální intravenosní infuzí nebo intravenosní injekcí, ^ro kontinuál ní infuzi může být denní dávka přidána k 5 ml normálního salinického roztoku a roztok pak je infundován mechanickou pumpou nebo působením gravitace.

Materiály a metody í IL-4 použitý v následujících expe CHO-buňkami a metody jeho přípravy

Lidský rekombinantn imentech byl derivován jsou popsány v ÚJ3 patentové přihlášce, července 1969.

SN 366937, po

Příklad provedení vynálezu ^roois experimentu:

-10Opice: Dospělí samci opice Qynomolgus získaní z jihovýchodní ásie byljt dodán# obvyklými zdroji, např. Hazelton and Charles -^xiver Laboratories. Všechny opice byly před užitím minimálně 90 dhů v karanténě.

Tetanus toxoid a inokulace zvířat:

Vakcína tetanus toxoidu použitá v tomto experimentu •p byla tetanus toxoid purgonated* tetanus toxoid tekutý, získaný od Lederle Laboratories, Pearl Hiver,NY 10965.

Patnáct (15) dospělých samců opice Cynomolgus bylo infikováno opicím cytomegalovirem (PCMV) před začátkem této studie» Po celou dobu zvířata vykazovala měřitelný titr protilátek proti PCMV. účel zahrnutí této interní kontroly byl otestovat, zdali léčba lL-4 bude nespecificky ovlivňovat hladinu protilátek. Neočekávalo se od IL-4, že bude produkovat zvýšení protilátek proti PCST7, protože PCMV vakciny nebyla podána. Standardní postupy použité k měření protilátkových odpovědí byly radioimmunoassay pro PCivíV a radioimmunoassay pevné fáze (viz 3erzofask.y, J.A.a spol.”ántigen-ántibody Interactions and i»onoclona.l Aitibociesstr.315-356 v In Pundamental Immunology(I989)2.vydání (W.S.Paul vyd.) Naven Press Ν.Υ.,ΖΤ.Υ. pro rHBVax a Salk inaktivovanou vakcinu polioviru.

Odběr krve pro zkoušky na PCMV a tetanus toxoid protilátky byl providěn jednou týdně po dobu deseti týdnů (2-7 obr.1) před podáním IL-4 a dvakrát každý týden po 22 týdnů (S-33) studie.. I.v. podání rhIL-4 dvakrát denně v dávkových hladinách (5,0 a 20,0 ^ug/kg/den 3.I.D) a placebo začalo mezi týdny 8 a 12 a pokračovalo po dobu celkem 25 dnů. Vakcina tetanového toxoidu (0,5 ml obsahujících 5 Lf jednotek tetanického toxoidu) byla podána intramuskulární injekcí každé z 15 opic v 11.dnu podávání rhIL-4. Výsledky určení titru protilátek proti tetanu pro tři skupiny (průměr pro skupinu) jsou uvedeny na obr.2 a v tabulce 1. Obr.2 ilustruje graficky

-1 1zvýšení odpovědi skupiny s 5 yug/kg/den ve srovnání se skupinou kontrolní a skupinou 20 ^ug/kg/den. Odpověď skupiny s /Ug/kg/den (uvedená na obr.2 a 4) byla statisticky výfcnamná k odpovědi kontrolní skupiny, uvedené na obr.2 a 3.

Tabulka 1 ukazuje, že 1)v týdnech 4-6 po vakcinaci tetanovým toxoidem skupina, která obdržela 5 /Ug/kg/den IL-4 měla statisticky vyšší titr protilátek než měla skupiny, která obdržela placebo, 2) v týdnech 7-9 po vakcinaci měly obě skupiny, které obdržely IL-4 (0,5 yug/kg a 20 ^ug/kg) vyšší titr protilátek proti tetanu než měla kontrolní skupina s placebem.

Tabulka 1

Odpověď protilátek na primární tetanovou vakcinu:

vliv IL-4

IL-4 dávka^

Skupina	hladina	týden 11	týden 12—13	týden 14-16 týden 17·
I	0	37+21 ^}	2127+606	2456+488	1223+139
II	5	49+30	2178+529	5333+697	3973+631
III	20	46+20	1560+228	2355+152	1677+227

) - y-ug/kg hmotnosti živočicha

2) - hodnoty představují průměrný titr protilátek během období; N = 5 opic na skupinu ( + = S.E.LÚ.).

Vzhledem k výše uvedeným výsledků se očekává, že IL-4, výhodně rhIL-4, by mohl zvyšovat imunitní odpověď savců po primární expozici vakcině tam, kde primární odpověď uvedených savců není dostatečně silná nebo rychlá k prevenci infekce.

Podobné výsledky jsou očekávány pro bakt vé vakciny a jejich směsi s toxoidy.

iálr.í a viro- 12 -

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Použití IL-4 pro výrobu léčiva pro zvýšení primární imunitní odpovédi u savců na imunogeny přítomné ve vakcině.
2. Farmaceutický přípravek pro zvýšení primární imunitní odpovédi u savců na imunogeny přítomné ve vakcině, vyznačuj ící se tím, že zahrnuje množství IL-4 účinné pro toto zvýšení a farmaceuticky přijatelný nosič.
3. Farmaceutický přípravek podle nároku 2 pro parenterální podání, vyznačující se tim. Se zahrnuje účinné množství IL-4 a farmaceuticky přijatelný nosič.
4.

Farmaceutický prostředek podle nároku 2 nebo 3, vyznačující se tím. Se jako IL-4 zahrnuje lidský IL-4, výhodné od E.coli odvozený rekombinatní IL-4.
5. Kit pro zvýšení primární proti látkové odpovédi u savců k imunogenům ve vakciné, vyznačující se tím. Se zahrnuje i) kontejner farmaceutického přípravku IL-4 a jeho farmaceuticky přijatelného nosiče a 2) kontejner farmaceutického přípravku vakciny a jejího farmaceuticky přijatelného nosiče.
6. Kit podle nároku 5, vyznačující se tím. Se vakcinou je virová vakcína nebo bakteriální vakcina nebo toxoidni vakcína.

Kit podle nároku ó, vyznačující se tím toxoidni vakcinou je tetanová toxoidni vakcina.

Chronologický náčrt studia a rozvrh podání /W- Ϊ

Φ — CM ® O — CM

C3 ss

SS

I ; τ T