PT96097B

PT96097B - Processo para a preparacao de antigene de toxoplasma gondii bem como de meios de diagnostico, vacinas e anticorpos deles derivados

Info

Publication number: PT96097B
Application number: PT96097A
Authority: PT
Inventors: Hans Kupper; Stefan Knapp; Robert Ziegelmaier
Original assignee: Behringwerke Ag
Priority date: 1989-12-08
Filing date: 1990-12-06
Publication date: 1998-02-27
Also published as: EP0431541B1; IE904426A1; ES2092483T3; DE59010913D1; EP0431541A2; KR910012244A; CA2031811C; DE59010915D1; ATE196162T1; US6419925B1; ATE141289T1; EP0431541A3; ES2149913T3; DE59010450D1; ES2161817T3; EP0748816A1; JP3366628B2; DK0431541T3; KR100215607B1; GR3020819T3

Description

DESCRIÇÃO

A presente invenção refere-se à identificação e à preparação por engenharia genética de antigenes de toxoplas ma gondii. A partir desta estirpe preparou-se um banco de genes de expressão de cDNA. Os clonos recombinantes, de interesse diagnóstico, identificaram-se e isolaram-se com um soro de coelho anti-toxoplasma gondii de elevada concentração.

toxoplasma gondii (T. gondii) é um organismo unicelular parasita exclusivamente intracelular, atribuído às coccídias. A estirpe possui um espectro hospedeiro relativamente largo e permite infectar, para além de numerosos mamíferos, também seres humanos. Neste caso encontram-se duas formas que se distinguem fisiologicamente uma da outra: os Taquizoitos que se multiplicam vegetativamente numa série de vários ti pos de células. Esta forma encontra-se exclusivamente nos esta1

dos agudos da infecção. Ao contrário, os bradizoitos são formas duradouras que persistem enquistados nas células da musculatura cardíaca e do esqueleto e nas células do sistema nervoso central, sendo responsáveis por uma imunidade duradoura em relação a uma re-infecção. Em todo o mundo existem cerca 500 milhões de pessoas cronicamente infectadas com T. gondii.

Uma infecção com T. gondii ocorre normalmente sem sintomas em adultos saudáveis, com excepção de ligeiros inchaços dos gânglios linfáticos. Na gravidez e em pacientes imunodeficientes uma infecção por esta estirpe pode contudo originar problemas especiais. Assim, em grávidas que não adquiriram protecção imunológica contra T. gondii, existe o perigo da trans posição intra uterina desta estirpe. Isto leva à infecção do fe to e pode originar má formação da criança ou conduzir ao aborto

Os pacientes imunodeficientes adquirem frequentemente uma infecção aguda por T. gondii na sequência da re activação dos bradizoitos enquistados. Isto leva na maior par te dos casos a uma toxoplasmose cerebral (encefalite) que em certas condições pode originar a morte. Para além da toxoplasmose cerebral é de referir que o T. gondii provoca também doenças de olhos (corio-retinite). Também neste caso se trata de in fecções atribuídas a uma reactivação dos bradizoitos.

O espectro patológico da toxoplasmose traz muitas vezes dificuldades de diagnóstico diferencial ao médico clínico, de modo que é necessário para o diagnóstico o recurso a investigações de laboratório. A identificação de anticorpos e a determinação do título ou da dinâmica do título tornaram-se por isso um instrumento essencial do diagnóstico da toxoplasmose. Desenvolveram-se largamente, na área do sero-diagnõstico, processos para a determinação complementar (CF), hemaglutinação indirecta (IHA), aglutinação-Latex (LA) e Enzyme-Linked Immuno -assay (ELISA), que apresentam contudo várias deficiências. Existe por exemplo nestes processos de teste uma forte variação no que respeita à especificidade e à sensibilidade. Estas dife2

renças resultam em primeiro lugar da preparação do antigene uti lizado para o teste serológico. Na maior parte dos casos trata-se de preparações de antigenes celulares globais, que contem uma elevada percentagem de componentes celulares não específicos, e que se tornam responsáveis pelo aparecimento de resultados positivos falsos no teste. Além disso, a preparação dos antigenes a partir de ratos infectados, traz o perigo de infecção para os operadores do laboratório.

No que respeita à especificidade e à sensibilidade de um tal meio de diagnóstico seria assim desejável auti lização de antigenes imuno-reactivos definidos, que permitissem ainda distinguir entre os anticorpos anti-T. gondii específicos de IgG e de IgM.

Na literatura encontra-se descrita uma série de antigenes interessantes para o diagnóstico de T. gondii. Hughes descreve num artigo de revisão (Curr. Top. Microbiol. (1985), 120:105-139) quatro antigenes principais com pesos mole culares de 45, 32, 27 e 21 kilodalton (KD), potencialmente adequados para a determinação de anticorpos anti-T. gondii da cias se IgG. Handman et al. (Immunol. (1980), 40:579-588) e Potasman et al. (J. Infect. Diseases (1986), 154:650-657) investigaram soros evolutivos de pacientes agudos infectados com T. gondii, pelo método Westernblot e mostraram que existe um antigene de membrana de 35 KD que reage muito precocemente com anticorpos IgG. De coster et al. (Clinic. Exper. Immunol. (1988), 73:376-382) descreveram quatro antigenes de interesse diagnóstico com pesos moleculares de 105, 97, 66 e 28,5 kD que, ao contrário do antigene de 35 kD, se podem isolar do meio de cultura e que se drsignam por excreted- secreated-antigens (antigenes ES). Os anticorpos IgG que reagem com os antigenes de 105, 97 e 28,5 kD, parecem ser bons marcadores para uma toxoplasmose crónica. Analogamente ao antigene de 35 kD, os antigenes de 97 kD e de 66 kD são reconhecidos precocemente pelo anticorpo IgM de pacientes agudos infectados. É de referir que a indicação de um peso molecular determinado por separação por electroforese não caracteriza suficientemente o antigene, pois em geral existem vá3

rias proteínas correspondentes a uma gama de pesos moleculares.

Um outro marcador para a toxoplasmose aguda é um antigene de 6 kD (Ehrlich et al., (1983), Infect. Immun.

41;683-690). No teste Westernblot de IgM este antigene reage fortemente. Até agora existem ainda muito poucos dados que permitem esclarecer a natureza deste antigene.

Até agora foram caracterizados bioquimicamente ainda muito poucos antigenes de T. gondii. Uma excepção é a proteína de superfície P30. Este antigene é uma glicoproteína ligada â membrana por um glicolípido (Nagel et al., (1989), J. Biol. Chem. 264; 5569-5576). 0 significado diagnóstico deste antigene é duvidoso uma vez que a )30 também reage com anticorpos não específicos da classe IgG (Potasman et al., (1986), J.Clin. Microbiol. 24:1050-1054).

isolamento e perfeição de antigenes individuais para utilização em serodiagnóstico é muitas vezes extremamente trabalhoso. Tanto a determinação do peso molecular como a da imuno-reactividade de um antigene pode variar considerável mente de caso para caso em antigenes purificados convencionalmente. A clonagem e expressão destes antigenes bem como a identificação estrutural dos genes correspondentes pode não só melhorar o rendimento em antigene purificado e ainda contribuir para a caracterização serológica e desse modo para o teste da relevância diagnóstica do antigene. Até agora estudaram-se do ponto de vista estrutural dois antigenes de T. gondii de interesse imunológico. As sequências de nucleótidos destes antigenes - trata-se da P30 (Burg et al., (1988), J. Immunol. 141: :3584-3591) e de um antigene de 28 kD (Prince et al., (1989), Mol. Biochem. Parasitol. 34/3-14) - são completamente conhecidas .

O objectivo da presente invenção é o de preparar por engenharia genética antigenes de T. gondii definidos e adequados para diagnóstico e profilaxia. Conseguiu-se identificar produtos genéticos de T. gondii apropriados, com um soro

de coelho anti-T.gondii de alto título, a partir de um banco de genes de expressão de cDNA gtll. Determinaram-se as sequências parciais de ácidos nucleicos e as sequências de aminoácidos delas derivadas para 8 clonos (F2, F28, F29, F34, F45, F61, F74 e F76). Todos os clonos acabados de mencionar reagem no teste de Western blot com soros humanos IgG anti T. gondii. Os clonos F34, F61 e F76 reagem ainda com anticorpos específicos da classe IgM. As sequências parciais de nucleótidos apresentam-se nas Tabelas 1-8, e sempre que indicado também os códigos de leitura (nas Tabelas 1-6) .

F61	(Tab.
F34	(Tab.
F29	(Tab.
F28	(Tab.
F2	(Tab.
F76	(Tab.
F45	(Tab.
F74	(Tab.
Por	meio
mais	nada

1) indica uma proteína com o peso molecular de 66kD.

2) pertence a uma proteína com cerca 68 kD.

3) pertence a uma proteína com cerca de 30 kD.

4) pertence a uma proteína com cerca de 28 kD.

5) pertence a uma proteína com cerca de 30 kD.

6) pertence a uma proteína com cerca de 35 kD.

7) pertence a uma proteína com cerca de 29 kD.

8) pertence a uma proteína com cerca de 64 kD.

das sequências parciais mencionadas é possível, sem , clonar os genes completos a essas sequências parciais

As sequências parciais indicadas nas Tabelas 1, 2 e 6 utilizaram-se, consequentemente, para completar as regiões de cDNA codificante dos genes a elas pertencentes. Para tal, marcaram-se radioactivamente os cDNA’s de F61, F36 e F76 e utilizaram-se como sondas para o Srreening do banco de genes de cDNA. A sequência da Tabela 1, F61, utilizou-se para isolar o cDNA da proteína F66. A sequência da Tab. 2, F34, serviu para o isolamento do cDNA da proteína F68. Para o isolamento de cDNA da proteína P35 utilizou-se a sequência da Tab. 6, F76. Isolaram-se os clonos recombinantes que apresentam homologias com estas sequências e caracterizaram-se estruturalmente, sequenciando-se as regiões de cDNA específicas de T. gondii inseridas As sequências de nucleótidos das zonas genéricas estruturais completas das proteínas P35, P66 e P68 apresentam-se nas Tabelas 9-11.

As regiões parciais imuno-reactivas (partes imunogénicas) descrevem-se representativamente nos exmeplos 6 e 7 para a P35, P66 e P68. Outras regiões proteicas imunogénicas testam-se ou determinam-se de modo análogo.

A invenção refere-se sucessivamente (a) ãs sequências de DNA inseridas, isoladas, dos clonos acima mencionados, incluindo os seus produtos de transcrição e as restantes sequências para a complementação dos genes estruturais em causa, (b) às estruturas de DNA e vectores que contêm estas sequências total ou parcialmente, (c) a células procarióticas ou eucarióticas transformadas com esse DNA, (d) aos polipéptidos expressos pelas células transformadas, ou a partes imunogénicas deles, incluindo a sua utilização para diagnóstico e terapia ou profilaxia, (e) ãs sequências de aminoácidos a eles pertencentes (AS), (f) a anticorpos contra os polipéptidos referidos em (d), incluindo a sua utilização para diagnóstico e terapia ou profilaxia de infecções de T.gondii, e ainda (g) a processos para a preparação por engenharia genética dos polipéptidos referidos em (d) ou de partes imunogénicas deles .

A invenção será ainda descrita nos exemplos e nas reivindicações da patente.

Exmeplo 1

Construção de um banco de genes de expressão de cDNA lambda-gtll de T. gondii

1) Isolamento da poli(A)-RNA

Infestaram-se culturas celulares HEp-2 confluentes com gérmens de T- gondii, segundo o método de Braveny et al. (Tromenmed. Parasitologie (1978), _2_9^: 432—434) . A partir do 49 dia após a infecção colheram-se os trofozoitos por centri fugação da camada sobrenadante de cultura. 0 RNA total de cerca de 500 mg de células de T. gondii peletizados (peso húmido) iso lou-se segundo uma modificação do método de Chomczynski e Sacchi (1987), Analytical Biochemistry, 162: 156-159), do seguinte modo: Lisaram-se as células em 20 ml de solução D (isotiocianato de guanidídio 4M, 0,5% de sarcosil, citrato de sódio 25 mM, pH 7,0, mercaptoctanol 0,1 M) e, após adição de 2 ml de acetato de sódio 2M, pH 4,0 20 ml de fenol (saturado em água) e 4 ml de clorofórmio, agitou-se vigorosamente e arrefeceu-se em gelo du rante 20 minutos. Após um passo de centrifugação (30 min, 49C, 15 000 g), precipitou-se o RNA a partir da fase aquosa com igual volume de isopropanol, durante 1 hora a 49C, e peletizou-se por centrifugação subsequente (20 min, 49C, 15 000 rpm). Ressuspendeu-se o peletizado em 600 μΐ de solução D e centrifugou-se em seguida o RNA com uma solução de CsCl 5,7 M (3 ml) (12 horas, 35 000 rpm, 10QC). Ressuspendeu-se o peletizado em 500 μΐ de água bidestilada (isenta de RNAse) e precipitou-se no vamente o RNA com 1/10 de volume de acetato de sódio e 2 volumes de etanol, durante 2 h a -20°C, e separou-se por centrifugação (10 min, 14 000 rpm, 4°C, numa centrifugadora de Eppendorf). Enriqueceu-se o poli(A)-RNA numa coluna de oligo(dT)-celulose (Pharmacia)(0,5 g de oligo dT-celulose em 10 mM Tris HCl, pH 7,5, 0^5 M KCL), do seguinte modo: Misturou-se o RNA, após desnaturação (70°C, 10 min) com LiCl (concentração final 0,5 M) e aplicou-se lentamente à coluna de oligo dT-celulose. Após lavagem da coluna com 20 ml de tampão de ligação (10 mM Tris HCL, pH 7,5, 0,5 MKCL), eluiu-se o poli(A)-RNA com 10 ml de ãgua bidestilada e precipitou-se com 1/20 de volume de LiCl 8 M e 2,5 volumes de etanol, a -20°C, durante 4 horas, peletizou-se em seguida por centrifugação (6000 Upm, 4°C, 30 min.), lavou-se com etanol a 70% e secou-se.

2) Síntese de cDNA

A síntese do cDNA efectuou-se de acordo com uma modificação do método de Gubler (U. Gubler, (1988), Nucl. Acids Res. 16:2726) . Após a desnaturação de 5 yug de RNA-poli (A) de T-gondii (5 min., 70°C) efectua-se a síntese da primeira cadeia de DNA na presença de 50 mM Tris HCI, pH 8,3, 75 mM HCI, mM DTT, 15 mM MgCl₂, 0,5 dNTP, 5 jig de oligo dT Primer (Boeh ringer, Mannheim) e 800 unidades de transcriptase reversa (BRL) numa mistura de 50 ju.l,a 37°C, durante 1 hora. Em seguida pára-se a reacção a 70°C, durante 10 min. e inicia-se a síntese da segunda cadeia de DNA após adição de 8 jul de 1 M Tris HCI, pH 7,5, 32 jil de IM KC1, 1,6 pl de IM MgCl₂, 1,6 )al de IM DTT, 50 unidades de E. coli-DNA-polimerase I (Boehringer Mannheim), 3,5 unidades RNA-SeH (Boehringer, Mannheim) em 320 pl de volume final. Incubou-se a mistura durante 1 hora a 16°C e 1 hora a 22° C. Precipita-se em seguida o cDNA com dois volumes de etanol de 1/10 de volume de acetato de sódio a -70°C durante 10 min., peletiza-se por centrifugação e seca-se. Ressuspende-se o peletizado em 100 Jil de tampão de DNA-polimerase T4 (20 mM (NH^^SO^, 50 mM Tris. HCI, pH 8,8, 10 mM MgCl₂, 50 jiM dNTP) e inicia-se a reacção de enchimento dos extremos do cDNA por meio da adição de 10 unidades de DNA-polimerase T4 (Boehringer, Mannheim). Incuba-se a mistura durante 10 min. a 37°C e fenoliza-se por adição de 100 jul de fenol/clorofórmio (1:1). A solução de cDNA cen trifuga-se em seguida através de uma coluna de Sephacryl S 200 (Pharmacia). A partir do eluido, precipita-se o cDNA com dois volumes de etanol e 1/20 de volume de acetato de sódio, centrifuga-se e seca-se.

3) Ligação do cDNA com adaptador EcoRI

Ressuspendeu-se o cDNA seco (1 pg) em 30 yul de tampão de ligação (30 mM Tris.HCI, pH 7,8, 10 mM HgCl₂, 0,5 mM ATP, 10 mM DTT), adicionaram-lhe 40 pmol de adaptador EcoRI (Promega) e 7,5 unidades de DNA ligase T4 e incubou-se a mistura durante 15 horas a 14°C. Após inactivação da ligase (10 min.

70°C) seguida de tratamento com quinase (30 min., 37°C) por adi ção de 4 jil de tampão de quinase (0,7 M Tris.HCl, pH 7,6, 0,1 M MgCÍ2, 50 mM DTT), 2 jil de ATP 0,1 mM e 10 unidades de quinase de polinucleótido T4 (Pharmacia), centrifuga-se de novo o cDNA através de uma coluna de Sephacryl S200 e precipita-se por fim, como descrito acima, com etanol e acetato de sódio.

4) Ligação do cDNA com fragmentos lambda gtll-EcoRI, in vitro Packaging e transfecção da lambda gtll

Para a reacção de ligação misturaram-se num volume de 10 jj.1 (66 mM Tris.HCl, pH 7,6, 6,6 mM HgC^z 1 mM ATP, 5 mM DTT) 1 jig de fragmentos lambda gtll-EcoRI desfosforilados com cerca de 50 ng de cDNA quinasado e, após adição de 3 unidades Weiss de DNA ligase T4 (Boehringer, Mannheim), incubou-se durante 15 horas a 14°C. Desta mistura utilizam-se 5 jil numa re acção in vitro packaging, efectuada de acordo com as instrucções do fornecedor da mistura de packaging (Giga Gold Mix, Stratagene).

Determinou-se o título em fagos recombinantes após transfecção da estirpe E. coli Y1090. Obteve-se um total g

de cerca de 10^υ fagos recombinantes.

Exemplo 2:

Selecção (Screening2) do banco de genes de expressão lambda gtll com um soro de coelho anti-T-gondii hiper-imune

Os anticorpos anti-E-coli adsorveram-se em primeiro lugar, a partir do soro de coelho anti-T. gondii, de acordo com métodos conhecidos (L. S. Osaki; (1986), J. Immun. Method. 89:213-219; Promega Biotec (1986), ProtoBlot Immunoscre ening System, Technical Mannual), para reduzir as reacções não específicas no imunoblot. Para este fim colocaram-se num total de 30 placas de agar LB fagos de tipo nativo lambda gtll com uma densidade de 5x10 em 9 ml agar mole LB/0,4% de maltose/ /10 mM MgSO^, por 90 mm de placa de agar. Após duas horas de in

cubação a 37°C cobriram-se as placas com filtros redondos de ni trocelulose secos, equilibrados em 10 mM IPTG (isopropil-^-D-tiogalactopiranóxido) e incubou-se durante mais duas horas. Em seguida viraram-se os filtros e incubaram-se de novo durante duas horas sobre o agar. Incubaram-se então os filtros em 5% de leite magro/tampão TBS(TBS:150 mM NaCl, 50 mM Tris.HCl, pH 8,0) durante 10 min. â temperatura ambiente e incubaram-se durante 4 horas à temperatura ambiente após transferência para 100 ml de soro de coelho diluido a 1/100 em 5% de leite magro/tampão TBS. Utilizou-se este soro diluido, pré-adsorvido, tanto para as experiências de screening como para as de Westernblot. sujei5 tou-se um total de 6x10 fagos recombinantes do banco de cDNA lambda gtll a um screening com este soro, de acordo com o método de R. Y. Young e R. W. Davis (Proc. Natl. Acad. Sei. 80: 1194 (1983)). Para tal, como descrito acima, transfeccionaram-se células de uma cultura da estirpe E. coli K12, Yio90, com 4 fagos lambda gtll recombinantes (3x10 fagos/100 jnl de cultura Y1090) e colocaram-se em placas de agar mole (total de 20 placas) . Após 2 horas de incubação a 7°C cobriram-se as placas com um filtro de nitrocelulose seco, embebido em lOmM IPTG, e incubou-se durante mais 2 horas. Após marcar a posição dos filtros sobre as placas de agar, retiraram-se os filtros cuidadosamente e agitaram-se em 250 ml de leite em pó a 5%/tampão TBS, durante 10 minutos â temperatura ambiente. Transferiram-se então os fil tros para leite em põ/tampão TBS fresco e guardaram-se durante a noite a 4°C.

Após uma nova incubação dos filtros em 250 ml de leite em pó/tampão TBS, agitaram-se estes ligeiramente com 100 ml de soro de coelho anti-T-gondii pré-adsorvido, durante 1 hora à temperatura ambiente. Em seguida lavaram-se os filtros três vezes com 250 ml de tampãp TBS de cada vez e agitaram-se durante mais 1 hora à temperatura ambiente com 250 ml do conjugado fosfatase alcalina/anti-coelho-IgG diluido a 1/300 em leite em põ/TBS. Após lavagem dos filtros (três vezes com 250 ml de TBS de cada vez, agitando-os à temperatura ambiente), incubaram -se estes durante 15 min. em 250 ml de uma solução substrata pa

ra fosfatase alcalina (200 ^ig/ml de sal de 5-bromo-4-cloroindoxil-fosfato-p-toluidina (xp), Firma Bachem, nQ de encomenda: M1205) e 500 jug/ml de azul de cloreto de 4-nitrotetrazõlio (Fir ma Sigma, nQ de encomenda:N6876). Identificaram-se as regiões da placa de Petri correspondentes aos clonos seropositivos, reconhecíveis pelas zonas anelares coradas à volta das áreas dos fagos, removeram-se com uma pipeta de Pasteur e ressupenderam-se em 1 ml de tampão SM.

Isolaram-se as áreas de fagos positivos por meio de duas operações de screening adicionais. Isolou-se um total de 83 clonos seropositivos. Caracterizaram-se estes clonos de modo a seguir indicado:

1) Caracterização imunológica dos clonos de cDNA

2) Caracterização estrutural das inserções de cDNA clonadas

a) Testes Dot blot DNA-DNA

b) Sequenciação parcial das inserções de cDNA para investigação do código de leitura aberta

c) Expressão dos cDNA's clonados como genes de fusão com lacZ ou lacZ (derivado encurtado da /2-galactosidade).

Exemplo 3

Caracterização imunilógica dos clonos de cDNA seropositivos

Por meio de soros específicos do cloro (entendem-se como tal os soros isolados a partir de soro de coelho policlonal por adsorção contra a proteína de fusão recombinante de um clono de cDNA), caracterizaram-se imunologicamente os cio nos seropositivos do banco de genes. Prepararam-se estes soros, de acordo com o método de Osaki et al, (J. Immun- Method. 89:

213-219 (1986), do modo seguinte: Colocaram-se em placas de 4 agar mole LB quantidades de 5x10 PFU de clonos de cDNA isolados, após adsorção em células de E. coli yl090 e, após duas horas de incubação, cobriram-se com um filtro de nitrocelulose pré-tratado com IPTG 10 mM e continuou a processar-se como descrito no exemplo 2. Por clono incubaram-se três desses filtros

pré—tratados em soro de coelho pré-adsorvido, durante 4 horas e lavaram-se depois em 50 ml de TBS durante 10 minutos (três mudanças de tampão). Os anticorpos ligados aos filtros removeram-se por lavagem com um total de 15 ml de um tampão de glicina O,1M/HC1 (pH 2_Z5) durante 5 min. à temperatura ambiente e neutralizaram-se com 3 ml de Tris 1M. Adicionou-se leite em pó até uma concentração final de 5%. Seleccionaram-se 20 clonos seropositivos. Estes clonos, cujas proteínas recombinantes apresentavam reacção cruzada com um soro, reuniram-se num grupo de cio nos. Em ensaios Southern Dot blot as inserções de DNA marca32 das com p mostraram homologia apenas com o DNA dos clonos, que se reuniram também num grupo baseado nos dados serológicos acima descritos. Escolheu-se um clono de cada grupo e testou-se por Westernblot com soros humanos anti-T.gondii. Para este fim subclonaram-se os fragmentos de inserção dos clonos de DNA em vectores de expressão adequados ou lisogenaram-se células E. coli da estirpe kl2 yl089 com os derivados lambda gtll recombinantes correspondentes.

Exemplo 4

Expressão das proteínas de fusão da /^-galactosidade

Para o teste da reactividade imunológica subclonaram-se os fragmentos de cDNA dos clonos lambda gtll F2, F29, F28, F34, F61 e F64, como genes de fusão com um derivado encurtado lacZ, em vectores da série pSEM (Knapp et al., submetido para publicação) e induziu-se a expressão das proteínas de fusão em E. coli W 3110 lacl^ L8 (Brent e Ptashne (1981) , Proc. Natl. Acad. Sei., 78:4204-4208) por adição de ITPG. Para a expressão das proteínas de fusão dos clonos F45 e F74 lisogenou-se a estirpe E. coli yl089 com ambos os derivados lambda gtll e induziu-se em seguida a proteína de fusão, de acordo com méto dos conhecidos (Huynh et al., em:Glover, DNA Cloning, Volume I, pág. 49-78, IRT Press, Oxford (1985)). As proteínas do extracto celular total separaram-se por electroforese em SDS-PAGE (10%) , após indução por IPTG, e transferiram-se para nitrocelulose.

Testou-se a reactividade das proteínas recombinantes por Westhernbolt com soros humanos IgG e IgM. Os clonos assim caracterizados submeteram-se finalmente a sequenciação.

Exemplo 5

Sequenciação dos fragmentos de cDNA

A sequenciação dos fragmentos de cDNA efectuou-se de acordo com o método didesoxi de Sanger (Proc. Natl. Acad. Sei. (1977) , 74: 5436) utilizando o Primer KS (Promega). Os fragmentos de inserção dos clonos F2, F29, F34, F28, F45,

F61, F74 e F76 cindiram-se com EcoRI a partir do DNA Lambda gtll recombinante e, após inserção na posição de corte EcoRI do vector Bluescript KS, transformaram-se na estirpe E. coli XLl-Blue (Stratagene, San Diego). Isolou-se o DNA de cadeia simples destes plasmídeos recombinantes, após infecção dos clonos com o fago de levedura VCS, de acordo com métodos conhecidos (Stratagene, San Diego). Conforme a orientação dos fragmentos clonados obtém-se a sequência do extremo 5' ou 3' do cDNA.

As tabelas 1-8 (página 6 desta tradução) mostram os códigos de leitura translacionais (Tab. 1-6) e as sequências de nucleótidos parciais (Tab. 1-8) dos clonos acima mencionados.

Exemplo 6

Utilidade diagnóstica dos antigenes de T. gondii recombinantes rP35, rp66 e rP68.

Exprimiram-se sequências parciais da região genética estrutural dos antigenes P35, P66 e P68, utilizando os vectores de expressão pSEM (Knapp et al., Biotechniques (1990) 8:280) em E. coli W3110. Os produtos de expressão são constitui dos por um derivado de $-galactosidase N-terminal de 375 aminoácidos que contém uma parte de fusão específica da inserção C13

-terminal. A síntese das proteínas de fusão pode induzir-se com IPTG como descrito por Knapp et al. (biotechniques (1990), 8: 280). Para os testes subsequentes separaram-se os extractos celulares totais dos derivados E. coli X3110 recombinantes, após indução com ITPG, em SDS-PAGE. A transferência das proteínas, a incubação com amostras de soro específicas, bem como a incubação dos conjugados (fosfatase alcalina IgG anti-humana) e a coloração, efectuaram-se de acordo com um protocolo padrão (em: Sambrook et al.: Molecular Cloning, Cold Spring harbor Laboratory Press (1989)). Exprimiram-se as seguintes regiões parciais das proteínas de T. gondii acima mencioandas:

rP35: pares de bases 363-527 ; contida no plasmídeo híbrido pPS76 rP68: pares de bases 176-1927*; contida no plasmídeo híbrido pPS34 rP66: pares de bases 1-2074*; contida no plasmídeo híbrido pPS61.

(* as coordenadas das sequências de nucleótidos referem-se aos dados das tabelas 9-11).

Testou-se a reactividade de anticorpos IgG e IgM específicos de soros humanos de pacientes com infecções agu das e crónicas de T. gondii, por ensaios de Western Blot. Os resultados destes testes apresentam-se resumidos na Tabela 12. Mostra-se assim serem apropriadas todas as três proteínas hibri das rP35, rP66 e rP68 para a identificação de anticorpos IgG específicos. Particularmente adequada é a rP35; 25 de 26 soros reagiram com a proteína híbrida em testes weztern Blot de IgG; com a rP68 reconheceram-se anticorpos específicos IgG em 27 de 31 soros. Ambas as proteínas de fusão, rP35 e rP68 reagiram sem excepção com anticorpos IgG anti-T. gondii de soros agudos (n=

21) que tinham uma concentração em anticorpos IgM específicos detectável. Por isso, tanto a rP35 como a rP68 são particularmente adequadas como marcadores para a identificação de anticor

pos IgG anti-T. gondii na fase aguda da toxoplasmose. Pelo contrário, estas duas proteínas de fusão não se podem empregar para a identificação de anticorpos IgM específicos: apenas 2 de 21 soros de dadores com toxoplasmose aguda reagiram em IgM-Blot com a P35 recombinante. A P68 recombinante não mostrou nestes testes qualquer especificidade para anticorpos IgM anti-T.gondii A rP66 reagiu com 17 de 21 soros em IgM-Blot e pode como tal utilizar-se como marcador para a identificação de anticorpos específicos desta classe de imunoglobulinas.

Exemplo 7

Utilidade das proteínas recombinantes de T.gondii rP35 e rP68 em testes ELISA

Testou-se a reactividade das proteínas recombinantes de T.gondii rP35 e rP68 com anticorpos IgG específicos em ensaios ELISA. Utilizaram-se ambas as proteínas como antigenes de fase sólida em conjunto ou isoladamente para cobrir placas ELISA. Ambas as proteínas híbridas se isolaram a partir de E. coli do modo seguinte:

Diluiu-se uma cultura de uma noite da estirpe recombinante de E. coli W 3110 com os plasmídeos pPS76 ou pPS34 a 1/50 em 2 1 de ampicilina L-Broth/lOOmg/ml e desenvolveu-se até uma ΏΟ^θθ=0,7 a 37°C, sob vigorosa agitação. Após adição de IPTG (concentração final 1 mM) continuou a agitar-se vigorosamente as culturas durante 3 horas a 37°C, centrifugou-se, tomou-se o peletizado celular em 150 mM NaCl/50 mM Tris.HCl, pH 8,0/1 mg/ml de lisosi ma e incubou-se durante 10 min. a 37°C. Para abertura das células tratou-se a suspensão celular duas vezes numa french press Centrifugou-se a massa obtida (1000 rpm, 10 min. a 4°C) e lavou -se o peletizado contendo a proteína de fusão na forma de inclusion bodies pouco solúveis, sucessivamente com soluções de ureia de várias concentrações (1M a 6M em ureia). Procedeu-se de forma a agitar primeiro o peletizado em 30 ml de 1M ureia/10 mM Tris/1 mM EDTA, pH 8,0 (TE), à temperatura ambiente durante 1 hora. Após centrifugação (10 000 rpm, 10 min. a 4°C) tomou-se o

peletizado em ureia 2M como descrito acima e incubou-se. Estas incubações repetiram-se depois com soluções de ureia 3M, 4M, 5M e 6M. Guardaram-se as camadas sobrenadantes após os passos de centrifugação e analizaram-se as proteínas nelas solúveis por SDS-pAGE. Para o revestimento das placas ELISA utilizaram-se as camadas sobrenadantes que para além das proteínas de fusão continham apenas pequenas contaminações com proteínas de E. coli (cerca de 75% de proteínas de fusão). Dializaram-se estes sobre nadantes 72 h a 4°C contra 1M ureia/0,1% SDS. Para o revestimen to das placas ELISA ajusta-se a concentração em proteínas das amostras dialisadas a 2 ^ug/ml com PBS a pH 7,0. O revestimento efectuou-se a 4°C durante a noite, utilizando-se 100 jtil por ori fício. Lavaram-se então as placas 3 vezes com tampão de lavagem AP (Behring, Refs n° 1353115), antes de aplicar as amostras de soro sobre as placas.

Adsorpção de anticorpos anti-E.coli nas amostras de soro:

Em primeiro lugar removeram-se das amostras de soro os anticorpos anti-E.coli. Para tal centrifugaram-se as células de uma cul tura de uma noite de E.coli W 3110 e ressuspendeu-se o peletizado em 5 ml de PBS a pH 7,0. Lisaram-se as células por ultra-som (3 vezes com um Branson Sonifier, grau 7) e incubaram-se após adição do DNAse I (concentração final 1 jig/ml) durante 10 min. a 37°C.

Misturaram-se o soro humano e o antigene lisado na proporção 1:1 diluiu-se em PBS a pH 7,0 a 1/50 e agitou-se durante 30 min. ã temperatura ambiente. Após centrifugação adicionou-se ã camada sobrenadante 5% de leite magro/PBS a pH 7,0 (concentração final 1%), incubaram-se 100 jil dessa mistura por orifício em placas ELISA, durante lha 37°C e lavou-se 3 vezes com tampão de lava gem AP.

Em seguida incubaram-se 100 ^ul/orifício do conjugado AP IgG anti-humano (Behring; nQ de encomenda OSDH 04/05) pré-diluido a 1/70 em tampão de diluição-conjugado AP (Behring: nQ de encomen da 1332115), a 37°C durante uma hora. Lavaram-se as placas 3 ve zes com tampão de lavagem AP e incubaram-se com 100 jul/orifício de solução de substracto AP (Behring, comprimidos de substrato

AP, n° de encomenda: OSC x 96; Behring, dietanolamina a 10%, nQ de encomenda: 0243115; solução do substrato:2 comprimidos em 10 ml de dietanolamina a 10%), durante 30 minutos a 37°C e determi nou-se a densidade óptica da solução de substrato a 405 nm.

Nos testes recolheram-se 9 soros de um seroconvertor (paciente A). Recolheram-se as amostras de soro do da dor nos seguintes dias: A, 9.8.1988; B, 18.8.1988; C, 29.8.1988; D, 12.10.1988; E, 2.12.1988; F, 13.1.1989; G, 28.2.1989; H, 12. .5.1989; I, 17.7.1989; A infecção revelou-se no dia 31.7.1988. Como se vê pela tabela 13, logo o soro humano B, recolhido ao 17Q dia, revelou anticorpos IgG específicos contra rP35 e rP68. Pelo contrário, esta amostra de soro revelou-se negativa num sistema ELISA clássico não recombinante (identificação de IgG).

Além disso, testaram-se 30 soros humanos de da dores com toxoplasmose aguda, contendo anticorpos IgM específicos, num ensaio ELISA em relação a anticorpos IgG contra rP35 e rP68. Estes soros humanos reagiram sem excepção em ELISA conten do os dois antigenes recombinantes rP35 e rP68 sobre a fase sólida.

Testaram-se ainda 150 dadores de sangue em relação a anticorpos

IgG específicos anti-rP35 e anti-rP68. Testaram-se os mesmos anR ti-soros no ensaio Enzygnost Toxoplasmosis (IgG; produtor: Behringwerte AG) em relação a anticorpos IgG específicos e compara ram-se entre si os resultados dos dois testes. Verificou-se que os soros positivos no Enzygnost também eram positivos em rP35/ rP68-ELISA. Também no caso dos soros negativos anti-T.gondii os dados dos testes Enzygnost^R-ELISA e rP35/rP68-ELISA foram concordantes .

TABELA 12

RESULTADOS DO TESTE WESTERN BLOT”

Proteína de T. gondii	r- P29	r- P35	r- P66	r- P68
Plasmídeo de expressão	pPS29	pPS76	pPS61	pPS34
IgG	5/16	25/26	21/31	27/31
IgM	0/21	2/21	17/21	0/21

TABELA 13

Comparação entre os testes ELISA de T. gondii recombinante e não recombinante

Claims

REIVINDICAÇÕES

- lã Processo para a preparação de proteínas com sequências de aminoácidos de acordo com as tabelas 1 a 11 que se seguem:

CATATACTGCACTGACTTCGACACCATC-GAGCAAAGGCTGCCAATTATTCTACTTGTTCT

GTATATGACGTGACTGAAGCTGTGGTACCTCGTTTCCGACGGTTAATAAGATGAACAAGA

IYCTDFDTMEQRLPIILLVL

CTCTGTGTTCTTCAGTTCAACCCCAAGCGCCGCCCTTTCGAGCCÂCAATGGAGTCCCCGC ---------4-------------------4·---------©----------r----------r 120

GAGACACAAGAAGTCAAGTTGGGGTTCGCGGCGGGAAAGCTCGGTGTTACCTCAGGGGCG

SVEF5STPSAALSSHNGVPATTATCCATCGTATGCACAGGTATCGCTCTCTTCCAACGGCGAGCCACGGCACAGGGGCAT

---------+---------+---------+---------+---------+---------+ ião

AATAGGTAGCATACGTGTCCATAGCGAGAGAAGGTTGCCGCTCGGTGCCGTGTCCCCGTA

Y ? SYAQVSLSSNGEPRHRGIACGCGGCAGCTTCCTCATGTCCGTAAAGCCACACGCAAACGCTGATGACTTCGCCTCCGA

----------:-----------j-----------:-----------;-----------j-----------j- 240

TGCGCCGTCGAAGGAGTACAGGCATTTCGGTGTGCGTTTGCGACTACTGAAGCGGAGGCT

RG5 FLMSVKPHANADDFASDCGACAACTACGAACCGCTGCCGAGTTTCGTGGAAGCTCCTGTCAGAGGCCCGGACCAAGT

---------+----------u---------+----------i.---------+---------+ 3oo

GCTGTTGATGCTTGGCGACGGCTCAAAGCACCTTCGAGGACAGTCTCCGGGCCTGGTTCA dnyep’lps FVEAPVRGPDQVCCCTGCCAGAGGAGAAGCTGCTCTTGTCACAGAGGAGACTCCAGCGCAACAGCCGGCGGT

----------i-----------1-----------1-----------·-----------1-----------l 360

GGGACGGTCTCCTCTTCGACGAGAACAGTGTCTCCTCTGAGGTCGCGTTGTCGGCCGCCA

PARGEAALVTEET PAQQPAV- 19 - ggctctaggcagtgcagaaggggaggggactccacctactgaatccgcctccgaaaattc __________[_________ ---------í-----------;-----------—4. 4/0

CCGAGATCCGTCACGTCTTCCCCTCCCCTGAGGTGGATGACTTAGGCGGAGGCTTTTAAG algsaegegtpptssasensTGAAGATGATGACACGTTTCACGATGCCCTCCAAGAGCTTCCAGAGGATGGCCTCGAAGT __________I______—----i-----------i-----------:-----------1-----------480

ACTTCTACTACTGTGCAAAGTGCTACGGGAGGTTCTCGAAGGTCTCCTACCGGAGCTTCA

EDDDTFH DALQELPEDGLEVGCGCCCACCAAATGCACAGGAGCTGCCCCCACCAAATGT.ACAGGAGCTGCCCCCACCAAA __.___________—4-—_——-----í------------t- ——— -------i-----------*- 54 0 kGCGGGTGGTTTACGTGTCCTCGACGGGGGTGGTTTACATGTCCTCGACGGGGGTGGTTT ί R P PNAQELPPPNVQELPPPNTGTAC AGGAGCTGCCCCCACCAACTGAACAGGAGCTGCCCCCACCAACTGAACAGGAGCT ________{_}___________________+-------------------+---------^{+ 600}

ACATGTCCTCGACGGGGGTGGTTGACTTGTCCTCGACGGGGGTGGTTGACTTGTCCTCGA ^;VQELPPPTEQELP PPTEQELGCCCCCACGAACTGAACAGGAGC7GCC

ACCAACTGAACAGGAGCTAGCCCCATCAAC

CGGGGGTGGTTGACTTGTCCTCGACGGGGGTGGTTGACTTGTCCTCGATCGGGGTAGTTG ???TEQEL???TEQELAPST

66 0

TGAACAGGAGCTGCCCCCACCAGTGGGCGAAGGTCAACGTCTGCAAGTCCCTGGGGAACA · : : i-----------1-----------l 720

ACTTGTCCTCGACGGGGGTGGTCACCCGCTTCCAGTTGCAGACGTTCAGGGACCCCTTGT eqelpppvgegqrlqvpgehTGGGCCACAGGGGCCCCCATACGATGATCAGCAGCTGCTTTTAGAGCCTACGGAAGAGCA

---------+---------₊-------------------4----------₊---------_{x 780}

ACCCGGTGTCCCCGGGGGTATGCTACTAGTCGTCGACGAAAATCTCGGATGCCTTCTCGT

GPQGPPYDDQQLLLEPTEEQACAGGAGGGCCCTCAGGAGCCGCTGCCACCGCCGCCGCCCCCGACTCGGGGCGAACAACC

---------+---------₊---------+---------+---------₊---------840

TGTCCTCCCGGGAGTCCTCGGCGACGGTGGCGGCGGCGGGGGCTGAGCCCCGCTTGTTGG

QEGPQEPLPPPPPRTRGEQPCGAAGGACAGCAGCCGCAGGGACCAGTTCGTCAAAATTTTTTTCGTCGGGCGTTGGGGGC

---------+---------+---------+---------+---------4----------4- 90C

GCTTCCTGTCGTCGGCGTCCCTGGTCAAGCAGTTTTAAAAAAAGCAGCCCGCAACCCCCG

EGQQPQGPVRQNEERRALGA- 20 -
2GCAAGAAGCCGATTCGGAGGTGCACGACGCCATGTCAGTGGGGTGTTCCGAAGAGTCAG

----------1----------—;——— ----1 —--------i-------— ί- 960
3CGTTCTTCGGCTAAGCCTCCACGTGCTGCGGTACAGTCACCCCACAAGGCTTCTCAGTC

ARSRFGGARRHVSGVFRRVRAGGTGGTTTGAACCGTATAGTAGGTGGAGTGAGGAGTGGTTTCAGGCGTGCAAGAGAAGG

----------1-----------(.---------₊---------
4----------4----------+ 10 20

TCCACCAAACTTGGCATATCATCCACCTCACTCCTCACCAAAGTCCGCACGTTCTCTTCC

GGLNRIVGGVRSG RRRAREGTGTCGTTGGGGGAGTCCGTCGTTTAACAAGTGGTGCCAGTCTGGGTCTCGGTCGTGTAGG

---------4.---------4----------+----------i----------+---------+ 1080

ACAGCAACCCCCTCAGGCAGCAAATTGTTCACCACGGTCAGACCCAGAGCCAGCACATCC

VVGGVRRLTSGAS LGL-GRVGi AGAAGGTTTAGGTAGGAGTTTCTATCGTGTAAGAGGAGCTGTCAGTAGCGGTCGTAGGCG

---------4----------4---------+----------r---------+---------+ 11 4 O

TCTTCCAAATCCATCCTCAAAGATAGCACATTC7CCTCGACAGTCATCGCCAGCATCCGC 'eglgrsfyrvrgavssgrrrTGCAGCAGATGGTGCCAGCAATGTAAGAGAAAGATTCGT

---------4----------+---------+---------1179

ACG7CG7CTACCACGGTCGTTACATTCTC7TTC7AAGCA

AADGASNVRERF

CTGAACAC-GAGGGTTTGCGGGAAACAGAGGTGGCGCATCAGCATGAGACAGAAGAACAGT

---------4-----------L·----------1-----------j-----------i.---------4- 5 Q

GACTTGTCGTCCGAAACGGCCTTTGTCTCCACCGCGTAGTCGTACTCTGTCTTCTTGTCA

EQEGLPETEVAHQHETEEQYACGGGACTGAAGGGATGCCCCCCCCTGT7CTGCCACCTGCACCGG7AGTCGATCCGCGTT

----------1-----------1-----------!-----------!-----------!-----------4 120

7GCCCTGACTTCCCTACGGGGGGGGACAAGACGGTGGACGTGGCCATCAGGTAGGCGCAA

GTEGMPPPVLPPAPVVHPRFTTATTGCAGTACCAGGGCCGTCGGTGCCTGTTCCATTTTTCAGTTTGCCAGACATCCACC — ———f—·--------------------—·-----------1------------4 180

AATAACGTCATGGTCCCGGCAGCCACGGACAAGGTAAAAAGTCAAACGGTCTGTAGGTGG

IAVPGPSVPVPFFSLPDIHP- 21 • i

CGGATCAGGTTGTGTATATTCTAAGGGTTCAGGGATCTGGGGACTTCGACATCAGTTTCG

----------H--------------------+----------í---------------------+ 240

GCCTAGTCCAACACATATAAGATTCCCAAGTCCCTAGACCCCTGAAGCTGTAGTCAAAGC

DQVVYILRVQGSGDFDI S F Ξ AAGTTGGCCGAGCTGTGAAGCAGTTGGAAGCCATCAAGAAAGCATACAGAGAAGCCACCG

---------₊---------4.---------₊---------₊---------₊---------_{+ 300}

TTCAACCGGCTCGACACTTCGTCAACCTTCGGTAGTTCTTTCGTATGTCTCTTCGGTGGC

VGRAVKQLEAIKKAYREATGGGAAGCTAGAAGCAGACGAGCTTGAGTCAGAAAGGGGACCTGCTGTTTCACCTCGACGAA ί-----------1-----------!-----------[-----------1-----------j. 3 5 Q

CCTTCGATCTTCGTCTGCTCGAACTCAGTCTTTCCCCTGGACGACAAAGTGGAGCTGCTT

KL eadelesergpavsprrrGGCTGGTTGACCTGATCAAAGATAACCAGCGACGACTCAGGGCGGCGCTTCAGAAGATAA

---------+----------j.---------+---------4----------+---------+ 4 20

CCGACCAACTGGACTAGTTTCTATTGGTCGCTGCTGAGTCCCGCCGCGAAGTCTTCTATT

LVDLIKDNQRRLRAALQKIK: AGATACAGAAAAAGTTGGAGGAGATTGATGACTTACTTCAGCTGACACGCGCACTGAAGG

---------4----------4---------+---------4----------+---------4 480

TCTATGTCTTTTTCAACCTCCTCTAACTACTGAATGAAGTCGACTGTGCGCGTGACTTCC iqkkleeiddllqltralkaÍCCATGGATGCCCGTCTGAGAGCCTGCCAGGATATGGCACCGATTGAGGAGGCGCTGTGTC |-----------:-----------I-----------------------!-----------u 540

GGTACC7ACGGGCAGACTCTCGGACGGTCCTATACCGTGGCTAACTCCTCCGCGACACAG

MDARLRACQDMAP IEEALCHACAAGACGAAGGCGTTTGGAGAAATGGTGTCCCAGAAAGCCAAGGAAATTCGGGAGAAAG

---------4·---------+---------4---------4----------4---------4 6 00

TG7TCTGCTTCCGCAAACCTGTTTACCACAGGGTCTTTCGGTTCCTTTAAGCCCTCTTTC

KTKAFGEMVSQKAKEIREKACGGCGTCCTTGTCTTCATTGTTAGGTGTCGATGCTGTCGAAAAAGAATTGCGGCGxGiC^ $6. GCCGCAGGAACAGAAGTAACAATCCACAGC7ACGACAGC7TTTTCTTAACGCCGCACAGC , c -.sSLLGVDAVEKELRRVnAACCGGAACATGAAGATAACACCAGAGTTGAAGCCAGGGTAGAGGAATTGCAGAAGGCGC

TTGGCCTTGTACTTCTATTGTGGTCTCAACTTCGGTCCCATCTCCTTAACGTCTTCCGCG p SHEDNTRVEARVEELQKAL tggagaaggccgcgtctgaggcaaagcagctcgtggggaccgcagcaggcgaaatagagg ____________________₊_________4_________4-----------h---------4- 780 acctcttcgggcgcagactccgtttcgtcgagcacccctggcgtcgtccgctttatctcc ekaaseakqlvgtaageieeaaggagtaaaagcggatactcaggctgtgcaagatagctcgaaagacgtgttgacgaaga _____________________L____________________4----------+----------- 840 ttcctcattttcgcctatgagtccgacacgttctatcgagctttctgcacaactgcttct

G V KADTQAVQDS S KDVLTK3gtccagt^gcgctcgtggaagcctttaaagcgatccagagggctcttcttgaggcgaaga _________₊_________+_________4-___________________4----------+ 900 caggtcaacgcgagcaccttcggaaatttcgctaggtctcccgagaagaactccgcttct pvalveafkaiqralleaktcaaaggaactagtagagccta

---------₊----------u- 921

GTTTCC7TGATCATCTCGGAT

K Ξ L V Ε P

Tab. 3

GCCGGAACTAACAGAGGAGCAACAGAGAGGCGACGAACCCCTAACCACCGGCCAGAATGT

---------+---------------------4---------+-------------------4 60

CGGCCTTGATTGTCTCCTCGTTGTCTCTCCGCTGCTTGGGGATTGGTGGCCGGTCTTACA

PELTEEQQRGDEPLTTGQNVGGGCACTGTGTTAGGCTTCGCAGCGCTTGC7GCTGCCGCAGCGTTCCTTGGCATGGG7C7

---------+---------4---------4---------4-----------4---------4- 120

CCCGTGACACAATCCGAAGCGTCGCGAACGACGACGGCGTCGCAAGGAACCGTACCCAGA

GTVLGFAALAAAAAFLGMGLCACGAGGACGTACCGACATTTTTCCCCACGCAAAAACAGATCACGGCAGCCTGCACTCGA +---------4----------4----------4----------4---------4 180

GTGCTCCTGCATGGCTGTAAAAAGGGGTGCGTTTTTGTCTAGTGCCGTCGGACGTGAGCT

TRTYRHFSPRKNRSRQPALEGCAAGAGGTGCCTGAATCAGGCGAAGATGGGGAGGATGCCCGCCAG

---------4----------+---------4---------4------226

CGTTCTCCACGGACTTAGTCCGCTTCTACCCCTCCTACGGGCGGTC . QEVPESGEDGEDARQ

Tab. 4

Uc;x 1Lj<-X CovjLsO xLr<atcttctcccaccttttatcagttaagttgtacagtgagtg

GGCAACGACAGCCCCACGATAGAAGAGGGTGGAAAATAGTCAATTCAACATGTCACTCAC

R C C H G A I FSHLLSVXLYS SC

TCAGCTTGTTTCGACACGTCTGTATAGAC3CAACTCGGTTTGCTTGTGTTGTTTGGTGGC

120

AGTCGAACAAAGCTGTGCAGACATATCTGCGTTGAGCCAAACGAACACAACAAACCACCG

QLVSTRLYRRNSVCLCC LVA

TGGCCAAATCAAAGGCTATTCATTTTTCACTTGCTGTTGTTCTTTGAAGAAATCAAGCAA

---------4.---------4.--------------------1-----------1----------4.

ISO

ACCGGTTTAGTTTCCGATAAGTAAAAAGTGAACGACAACAAGAAACTTCTTTAGTTCGTT

GQIKGYSFFTCCCSLKKSSKGATGGTGCGTGTGAGCGCTATTGTCGGAGCTGCTGCATCGGTGTTCGTGTGCCTGTCTGC

---------4----------4.---------j.---------4----------.4----------4. 240

CTACCACGCACACTCGCGATAACAGCCTCGACGACGTAGCCACAAGCACACGGACAGACG

MVRVSAIVGAAASVFVCLSACGGCGCTTACGCTGCCGAAGGCGGCGACAACCAGTCGAGCGCCGTCTCAGATCGGGCGTC

----------1-----------ί-----------·-------— (---------_4 -----—--I- 300

GCCGCGAATGCGACGGCTTCCGCCGCTG7TGGTCAGCTCGCGGCAGAGTCTAGCCCGCAG

GAYAASGGDNQSSAV5DRASTCTCTTTGGTTTGCTGAGTGGAGGGACAC-GGCA

---------_---------4-------------333

AGAGAAACCAAACGACTCACCTCCCTGTCCCGT

LFGLLSGG7G

Tab. 5

CAGTTTCGCGCG7CCCGTTTCCACGGACAAAATGGCAATGAAATACGTCGCTGCTTACCT

-------:------------ 6 0

GTCAAAGCGCGCAGGGCAAAGGTGCCTGTTTTACCGTTACTTTATGCAGCGACGAATGGA s ? A R p v S T D κ Ϊ1 A Μ κ Y v A A Y L - 24 -

GATGGTGGTGCTGTCGGGAACCGACACTCCGACCAAGAAGCAGGTTGAGAAAACCCTCTC

----------1-----------u---------4-----------!-----------!----------J. 120

CTACCACCACGACAGCCCTTGGCTGTGAGGCTGGTTCTTCGTCCAACTCTTTTGGGAGAG

MVVLSGTDTPTKKQVEKTLSCTCTGTGGGTATTGATGTTGAAGACGACATCATGGACACCTTCTTCAAAGCTGTCGAAGG

----------1-----------1-----------i-----------1-----------j-----------L 180

GAGACACCCATAACTACAACTTCTGCTGTAGTACCTGTGGAAGAAGTTTCGACAGCTTCC

SVGIDVEDDIMDTFFKAVE.GAAAGACCCCCCACGAGCTGATTGCCGCGGGTATGGAGAAGCTCCAGAAGGTACCTTCTGG --------- —i-----------1-----------j—— —————-í™ ——————-ί- 240

I TTTCTGGGGGGTGCTCGACTAACGGCGCCCATACCTCTTCGAGGTCTTCCATGGAAGACC

KTPHELIAAGMEKLQKVPSGTGGTGTCGCTGCTGCTGCTGCTCCTGCTGCTGGCGCTGCCGATGCTGGTGCGGGTGCTGC

----------1-----------1-----------1-----------[-----------;-----------u 300

ACCACAGCGACGACGACGACGAGGACGACGACCGCGACGGCTACGACCACGCCCACGACG

GVAAAAAPAAGAADAGAGAATGCTGCGAAGAAGGAGGAGGAAAAGAAGGAGGAAGAGGAGGAGGAAGACGACATG

---------4----------+----------r---------+--------------355

ACGACGCTTCTTCCTCCTCCTTTTCTTCCTCCTTCTCCTCCTCCTTCTGCTGTAC

AAKKEEEKKEEEEEEDDM

GCCACAGCCAGAGATACCGCCTGTTCATCGGCCGCCGCCTCCGGGTTTCCGTCCCGAAGT ---------₊---------4.-------------------u.-------------------- 6 0

CGGTGTCGGTCTCTATGGCGGACAAGTAC-GGGGCGGCGGAGGCCCAAAGGCAGGGCTTCA

PQPEIPPVHEPPPPGFEPEVGGCTCCCGTGCCCCCGTATCCAGTGGGCACTCCAACGGGCATGCCCCAGCCGGAGATACC

---------4.---------₊------------------+---------4----------- 120

CCGAGGGCACGGGGGCATAGGTCACCCGTGAGGTTGCCCGTACGGGGTCGGCCTCTATGG

APVPPYPVG TPTGMPQPEZPGGCAGTTCACCATCCGTTCCCCTACGTTACGACAACCACGACAG ---------4.---------4.-------------------4-----16 4 . CCGTCAAGTGGTAGGCAAGGGGATGCAATGCTGTTGGTGCTGTC • AVHHPFPYVT TTTT

- 25 Tab.

atatatgtgtctcgtgcttgagtgtgttctttgtatgatcaaaactcgttaaaatgcgca

TATATACACAGAGCACGAACTCACACAAGAAACATACTAGTTTTGAGCAATTTTACGCGT

CGTTACCGCATGGGTAGTAGTTCGAGACAGCTTGTGTGTACCTGAGGGGCCGCGTGTTGC

----------1-----------j-----------1-----------1-----------!-----------^L

GCAATGGCGTACCCATCATCAAGCTCTGTCGAACACACATGGACTCCCCGGCGCACAACG

CAAAAGTGCCTAGTCTTACACGGCCGACAAGAGGGTTCCTCGGTTCTTCTCTGCGTTCTT __________1-----------i-----------ί-------——— —---— ———

GTTTTCACGGATCAGAATGTGCCGGCTGTTCTCCCAAGGAGCCAAGAAGAGACGCAAGAA

CCTTCTCCCATCCGATTCTTCAAGTTCTGAACAAATCTGTCGTGTCTCGACTGATGTGCG ___________I___________I___________i-----------1-----------!GGAAGAGGGTAGGCTAAGAAGTTCAAGACTTGTTTAGACAGCACAGAGCTGACTACACGC

TGCGTTTTGA

---------+ 250

ACGCAAAACT

Tab. 8

120

180

240

GGAATTCTTGTTACGCGGTCAGATGTTTCTTGAGTAGTGAATCAAAATGTATTATGGTGT

----------í___________·_________,___·___________·___________j____________L

CCTTAAGAACAATGCGCCAGTCTACAAAGAACTCATCACTTAGTTTTACATAATACCACA

AATCCTGTCAGTTTTATACGTATTGTCATACGTCCACGCATCTCACGTACGGGCGCGAAC

---- ---------------—-1------— —i— —~a———___—-»

TTAGGACAGTCAAAATATGCATAACAGTATGCAGGTGCGTAGAGTGCATGCCCGCGCTTG

GCAGCAAGTGACGAGAGATCATCCCACTCGTTTGGTGACGCTGCAAAATACAAGTGTATT

CGTCGTTCACTGCTCTCTAGTAGGGTGAGCAAACCACTGCGACGTTTTATGTTCACATAA

ATACGGTCAGTCGGCTCTACAACATTCAAAACGAGTTGTCTCGCTTCAACCACAAAGCGC

----------1-----------μ----------[-----------:___________,___________

TATGCCAGTCAGCCGAGATGTTGTAAGTTTTGCTCAACAGAGCGAAGTTGGTGTTTCGCG

CACACT

------246

GTGTGA

Tabela 9

Sequência de nucleótidos de cDNA e sequência de aminoácidos antigena P35 de T. Gondii dela derivada

120

180

240 do

26 61

121

181

241

301

361

421

481

CAGTTTCCGCGCTGTAGTAAGATGGCTT7ACCATTGCGTGTTTCGGCCACGGTGTTCGTG

-μ-»—————4.——-—— h——6 0

GTCAAAGGCGCGACATCATTCTACCGAAATGGTAACGCACAAAGCCGGTGCCACAAGCAC

MetAlaLeuProLeuArgValSerAlaThrValPheVal

GTCTTCGCTGTCTTTGGTGTAGCTCGCGCCATGAACGGTCCTTTGAGTTATCATCCAAGC

---------+--------*---------+---------+---------+---------₊ 120

CAGAAGCGACAGAAACCACATCGAGCGCGGTACTTGCCAGGAAACTCAATAGTAGGTTCG

ValPheAlaValPheGlyValAlaArgAlaMetAsnGlyProLeuSerTyrHisProSer

AGTTACGGAGCGTCGTATCCGAATCCGAGTAATCCTCTGCATGGAATGCCCAAGCCAGAG

----------1-----------1----------₊----------μ----------μ---------+ 180

TCAATGCCTCGCAGCATAGGCTTAGGCTCATTAGGAGACGTACCTTACGGGTTCGGTCTC

SerTyrGlyAlaSerTyrProAsnProSerAsnProLeuHisGlyMetProLysProGlu

AACCCGGTGAGACCGCCTCCTCCCGGTTTCCATCCAAGCGTTATTCCCAATCCCCCGTAC

------——I-----—---—-i-----------1—— ------Η—----------μ 240

TTGGGCCACTCTGGCGGAGGAGGGCCAAAGGTAGGTTCGCAATAAGGGTTAGGGGGCATG

Asn.ProValArgProProProProGlyPheHisProSerValIleProAsnProProTyr

CCGCTGGGCACTCCAGCGAGCATGCCACAGCCAGAGGTTCCGCCACTTCAGCATCCCCCG

----------1-----------1-----------1----------1----------1-----------μ 300

GGCGACCCGTGAGGTCGCTCGTACGGTGTCGGTCTCCAAGGCGGTGAAGTCGTAGGGGGC

ProLeuGlyThrProAlaSerMetProGlnProGluValProProLeuGlnHisProPro

CCAACGGGTTCCCCTCCCGCGGCCGCTCCCCAGCCTCCATATCCAGTGGGTACTCCAGTA ——————---μ——---——μ 360

GGTTGCCCAAGGGGAGGGCGCCGGCGAGGGGTCGGAGGTATAGGTCACCCATGAGGTCAT

PrQThrGlySerProProAlaAlaAlaProGlnProProTyrProValGlyThrProVal

ATGCCACAGCCAGAGATACCGCCTGTTCATCGGCCGCCGCCTCCGGGTTTCCGTCCCGAA ---------1----------1-----------1----------1----------1-----------μ 420

TACGGTGTCGGTCTCTATGGCGGACAAGTAGCCGGCGGCGGAGGCCCAAAGGCAGGGCTT

MetProGlnProGluIleProPEQValHisArgProPraProProGlyPheArgProGlu

GTGGCTCCCGTGCCCCCGTATCCAGTGGGCACTCCAACGGGCATGCCCCAGCCGGAGATA

------μ----------i— --------—μ—-----1--------------------μ 480

CACCGAGGGCACGGGGGCATAGGTCACCCGTGAGGTTGCCCGTACGGGGTCGGCCTCTAT

ValAlaProValProPEoTyrProValGlyThrProThrGlyMetProGlnProGluIle

CCGGCAGTTCACCATCCGTTCCCCTACGTTACGACAACCACGACAGCTGCTCCTCGTGTG

----------1-----------1-----------1----------1---------f-----------μ 540

GGCCGTCAAGTGGTAGGCAAGGGGATGCAATGCTGTTGGTGCTGTCGACGAGGAGCACAC

PraAlaValHisKiãProPheProTyrVaiThrTiirThrThrThrAlaAlaProArgVal

CTGGTTTATAAGATTCCCTATGGAGGCGCTGCACCCCCCCGTGCTCCTCCAGTGCCACCC

----------1-----------1-----------1-----------1-----------1-----------μ 600

GACCAAATATTCTAAGGGATACCTCCGCGACGTGGGGGGGCACGAGGAGGTCACGGTGGG

LauValTyrLysIleProTyrGlyGlyAlaAlaProProArgAlaProProValProPra

541 » i

660

CGTATGGGCCCGAGTGATATCAGCACTCACGTGCGGGGTGCAATCCGGCGTCAACCCGGT 601 —_____ —4-----------μ — —| ---+

GCATACCCGGGCTCACTATAGTCGTGAGTGCACGCCCCACGTTAGGCCGCAGTTGGGCCA

ArgMetGlyProSerAspIleSerThrHisValArgGlyAlalleArgArgGlnProGly

ACCACCACCACCACTACTTCCCGCAAACTACTATTCAGGACAGCGGTAGTGGCTGCAATG 661 ——--------(----------ί----------1------—----η———— —--------Η

TGGTGGTGGTGGTGATGAAGGGCGTTTGATGATAAGTCCTGTCGCCATCACCGACGTTAC

ThrThrThrThrThrThrSerArgLysLeuLeuPheArgThrAlaValValAlaAlaMet

720

GCAGCAGCCTTGATAACCCTGTTCAGACAAAGACCTGTGTTCATGGAGGGGGTACGGATG 721 ———-----1-----------1--------+

CGTCGTCGGAACTATTGGGACAAGTCTGTTTCTGGACACAAGTACCTCCCCCATGCCTAC

AlaAlaAlaLeulleThrLeuPheArgGlnArgProValPheMetGluGlyValArgMet

780

TTTCCAAATCTCCACTACAGATTCACCGTAACGACGCAGAATTAAATTTCCGGTTGACGA

781 ———————_4·_______—_4·---———----1----------1----------1----------1AAAGGTTTAGAGGTGATGTCTAAGTGGCATTGCTGCGTCTTAATTTAAAGGCCAACTGCT

PheProAsnLeuHisTyrArgPheThrValThrThrGlnAsn.

840 atatagaagtcacttatacagtgggtacacgaccttcgtggcgtccacaccttgtttccg 841 ---------+---------f---------(·---------1---------+---------+

TATATCTTCAGTGAATATGTCACCCATGTGCTGGAAGCACCGCAGGTGTGGAACAAAGGC

900

TTCCGGTCACAGGTTGTGTCTACAAACGAACACGGTGGTATGTGCTGTAGACTCAGGGGT 901 ----------l·--------1----------+---------1----------+---------+

AAGGCCAGTGTCCAACACAGATGTTTGCTTGTGCCACCATACACGACATCTGAGTCCCCA

960

GGGAGGAGCGCTGTAGGGCCTTCTGGAGAGCTCTCAATGTGCGCTATCCGCTTATATTCG 961 ---------η----------1----------+---------h----------h----------+

CCCTCCTCGCGACATCCCGGAAGACCTCTCGAGAGTTACACGCGATAGGCGAATATAAGC

1020

TGCAGCGTTATCCTCGTGAGGAGCGTCGATTGTGTCGTGCCCAGTGTCGCCGGACTCGAA 1021 ---------+---------+--------+---------f---------+---------+

ACGTCGCAATAGGAGCACTCCTCGCAGCTAACACAGCACGGGTCACAGCGGCCTGAGCTT

TCAGAAACCTGC

1081 --------+— 1092

AGTCTTTGGACG

Tabela lo

Sequência de nucleótidos do cDNA e sequencia de aminoácidos antigene P66 de T. Gondii dela derivada do

TTGCTGTCGCCGTTGCTGTCGCATATACTGCACTGACTTCGACACCATGGAGCAAAGGC? 1 ----------i------------!-----------i-----------i-----------!-----------r

AACGACAGCGGCAACGACAGCGTATATGACGTGACTGAAGCTGTGGTACCTCGTTTCCGA

MetGluGlnArgLe

121

181

241

301

361

421

481

541

GCCAATTATTCTACTTGTTCTCTCTGTGTTCTTCAGTTCAACCCCAAGCGCCGCCCTTTC ——————4·———————4——™——+—————μ—----————4—---------l· 120

CGGTTAATAAGATGAACAAGAGAGACACAAGAAGTCAAGTTGGGGTTCGCGGCGGGAAAG uProilelleLeuLeuValLeuSerValPhePheSerSerThrProSerAlaAlaLeuSe

GAGCCACAATGGAGTCCCCGCTTATCCATCGTATGCACAGGTATCGCTCTCTTCCAACGG

CTCGGTGTTACCTCAGGGGCGAATAGGTAGCATACGTGTCCATAGCGAGAGAAGGTTGCC rSerHisAsnGlyValProAlaTyrProSerTyrAlaGlnValSerLeuSerSerAsnGl

CGAGCCACGGCACAGGGGCATACGCGGCAGCTTCCTCATGTCCGTAAAGCCACACGCAAA ——----— 1 —————---+— ----4-—----———4——----1----——----μ 240

GCTCGGTGCCGTGTCCCCGTATGCGCCGTCGAAGGAGTACAGGCATTTCGGTGTGCGTTT yGluProArgHisArgGlylleArgGlySerPheLeuMetSerValLysProHisAlaAs

CGCTGATGACTTCGCCTCCGACGACAACTACGAACCGCTGCCGAGTTTCGTGGAAGCTCC

----------1----------1-----------1-----------1-----------1-----------). 300

GCGACTACTGAAGCGGAGGCTGCTGTTGATGCTTGGCGACGGCTCAAAGCACCTTCGAGG nAlaAspAspPheAlaSerAspAspAsnTyrGluPror.euProSerPheValGluAlaPr

TGTCAGAGGCCCGGACCAAGTCCCTGCCAGAGGAGAAGCTGCTCTTGTCACAGAGGAGAC

----—— -—h———————4——-------1----------—|-----------[-----------μ 360

ACAGTCTCCGGGCCTGGTTCAGGGACGGTCTCCTCTTCGACGAGAACAGTGTCTCCTCTG oValArgGlyProAspGlnValProAlaArgGlyGluAlaAlaLeuValThrGluGluTh

TCCAGCGCAACAGCCGGCGGTGGCTCTAGGCAGTGCAGAAGGGGAGGGGACTCCACCTAC

---------4-----------)--------------------u.------—4—————4. 420

AGGTCGCGTTGTCGGCCGCCACCGAGATCCGTCACGTCTTCCCCTCCCCTGAGGTGGATG rProAlaGlnGlnProAlaValAlaLeuGlySerAlaGluGlyGluGlyThrProProTh

TGAATCCGCCTCCGAAAATTCTGAAGATGATGACACGTTTCACGATGCCCTCCAAGAGCT

----------}-----------j-----------j-----------i-----—— μ—-*------μ 480

ACTTAGGCGGAGGCTTTTAAGACTTCTACTACTGTGCAAAGTGCTACGGGAGGTTCTCGA r GluS e rAl aS e rGluAsnSe r GluAspAspAspThr PheHi sAspAl aLeuGlnGluLe

TCCAGAGGATGGCCTCGAAGTGCGCCCACCAAATGCACAGGAGCTGCCCCCACCAAATGT

----------1-----------1-----------1----------!———— 1-----------(- 540

AGGTCTCCTACCGGAGCTTCACGCGGGTGGTTTACGTGTCCTCGACGGGGGTGGTTTACA uProGluAspGlyLeuGluValArgProProAsnAlaGlnGluLeuProProProAsnVa

ACAGGAGCTGCC CCCAC CAAATGTACAGGAGCTGCC C C CACCAACTGAACAGGAGCTGCC

----------:----------4---------------------------------μ----------TGTCCTCGACGGGGGTGGTTTACATGTCCTCGACGGGGGTGGTTGACTTGTCCTCGACGG iGlnGluLeuProProProAsnValGlnGluLeuProProProThrGluGlnGluLauPr

50(

CCCACCAACTGAACAGGAGCTGCCCCCACCAACTGAACAGGAGCTGCCCCCACCAACTGA

----------1------------1-----------1------------j-----------1-----------μ 66

GGGTGGTTGACTTGTCCTCGACGGGGGTGGTTGACTTGTCCTCGACGGGGGTGGTTGACT oProProThrGluGlnGluLeuProProProThrGluGlnGluLeuProProProThrGl

601 i 4

ACAGGAGCTAGCCCCATCAACTGAACAGGAGCTGCCCCCACCAGTGGGCGAAGGTCAACG 661 ----------1-----------1-----------1-----------1-----------1-----------η 720

TGTCCTCGATCGGGGTAGTTGACTTGTCCTCGACGGGGGTGGTCACCCGCTTCCAGTTGC uGlnGluLeuAlaProSerThrGluGlnGluLeuProProProValGlyGluGlyGlnAr

TCTGCAAGTCCCTGGGGAACATGGGCCACAGGGGCCCCCATACGATGATCAGCAGCTGCT 721 ---------+----------+---------+---------+---------h---------+ 780

AGACGTTCAGGGACCCCTTGTACCCGGTGTCCCCGGGGGTATGCTACTAGTCGTCGACGA gLeuGlnValProGlyGluHisGlyProGlnGlyProProTyrAspAspGlnGlnLeuLe

TTTAGAGCCTACGGAAGAGCAACAGGAGGGCCCTCAGGAGCCGCTGCCACCGCCGCCGCC 781 ----—--------1——————————4—840

AAATCTCGGATGCCTTCTCGTTGTCCTCCCGGGAGTCCTCGGCGACGGTGGCGGCGGCGG uLauGluProThrGluGluGlnGlnGluGlyProGlnGluProLeuProProProProPr

CCCGACTCGGGGCGAACAACCCGAAGGACAGCAGCCGCAGGGACCAGTTCGTCAAAATTT 841 ----------1—-———---——+~-—————»—————4—,————900

GGGCTGAGCCCCGCTTGTTGGGCTTCCTGTCGTCGGCGTCCCTGGTCAAGCAGTTTTAAA oProThrArgGlyGluGlnProGluGlyGlnGlnProGlnGlyProValArgGlnAsnPh

TTTTCGTCGGGCGTTGGGGGCCGCAAGAAGCCGATTCGGAGGTGCACGACGCCATGTCAG 901 ---------(.---------₊----------μ---------1----------μ---------₊ 950

AAAAGCAGCCCGCAACCCCCGGCGTTCTTCGGCTAAGCCTCCACGTGCTGCGGTACAGTC ePheArgArgAlaLeuGlyAlaAlaArgSerArgPheGlyGlyAlaArgArgHisValSe

TGGGGTGTTCCGAAGAGTCAGAGGTGGTTTGAACCGTATAGTAGGTGGAGTGAGGAGTGG 951 --------+---------+----------i----------1-----------1----------1- 102(1

ACCCCACAAGGCTTCTCAGTCTCCACCAAACTTGGCATATCATCCACCTCACTCCTCACC rGlyValPheArgArgValArgGlyGlyLeuAsnArglleValGlyGlyValArgSerGl

TTTCAGGCGTGCAAGAGAAGGTGTCGTTGGGGGAGTCCGTCGTTTAACAAGTGGTGCCAG 1021 ---------+---------+---------+--------4---------+---------+ 1081!

AAAGTCCGCACGTTCTCTTCCACAGCAACCCCCTCAGGCAGCAAATTGTTCACCACGGTC yPheArgArgAlaArgGluGlyValValGlyGlyValArgArgLeuThrSerGlyAlaSe

TCTGGGTCTCGGTCGTGTAGGAGAAGGTTTAGGTAGGAGTTTCTATCGTGTAAGAGGAGC 1081 --------4--------4---------4------------------+--------+ 114)

AGACCCAGAGCCAGCACATCCTCTTCCAAATCCATCCTCAAAGATAGCACATTCTCCTCG rLeuGlyLeuGlyArgValGlyGluGlyLeuGlyArgSerPheTyrArgValArgGlyAl

TGTCAGTAGCGGTCGTAGGCGTGCAGCAGATGGTGCCAGCAATGTAAGAGAAAGATTCG?

1141 -----------------------------4----------4----------4----------- 1200

ACAGTCATCGCCAGCATC2GCACGTCGTCTACCACGGTCG7TACATTCTCTTTC7AAGCA aValSerSerGlvArgArgArgAlaAlaAspGlyAlaSerAsnValArgGluArgPheVa

TGCCGCAGGCGGGAGAGTCAGAGACGCTTTCGGCGCGGGATTGACGCGCCTCCGCAGGCG

1201 —---------i-----------1-----------í-----------í----------—4™™----——4· 1260

ACGGCGTCCGCCCTCTCAGTCTCTGCGAAAGCCGCGCCCTAACTGCGCGGAGGCGTCCGC lAlaAlaGlyGlyArgValArgAspAlaPheGlyAlaGlyLeuThrArgLeuArgArgAr

1261

1321

1381

1441

1501

1561

1621

1681

1741

1301

1861

1921

CGGCAGAACTAATGGCGAGGAGGGCAGGCCCCTACTGGGCGAAGGAAGAGAGCAGGATGA

-------1——————4.———4.————1320

GCCGTCTTGATTACCGCTCCTCCCGTCCGGGGATGACCCGCTTCCTTCTCTCGTCCTACT gGlyArgThrAsnGlyGluGluGlyArgProLeuLeuGlyGluGlyArgGluGlnAspAs

TGGATCGCAATAATACGGGCAGCATGCTGCTGGATTCGGCGAAGACGACCGTTTCTCGTA ———————4·—————————4——————4-———————-4————————4*———————4- 1380

ACCTAGCGTTATTATGCCCGTCGTACGACGACCTAAGCCGCTTCTGCTGGCAAAGAGCAT pGlySerGln

AACGACAGCGGGTCCTCCGAAGTTAAGAAACCCGGTAAACGTGTGTGCCGTAACGGTGAT

----------μ---------+-------+--------μ---------4---------+ 1440

TTGCTGTCGCCCAGGAGGCTTCAATTCTTTGGGCCATTTGCACACACGGCATTGCCACTA

CGAGTTTGCAGATGGTTCCTTGTGTACCACGTGGCTTCTCGAGACCAATCGTGCTTTGTT

----------1-------—---μ—---------1--------——--------1----------4 1500

GCTCAAACGTCTACCAAGGAACACATGGTGCACCGAAGAGCTCTGGTTAGCACGAAACAA

AGGGTCTAGTAGTTCGGACAGGATTTTATTGAACTGCAGGAATGCTTGCAGAAGAGAAGC _——------1-----------—|----————————+· 1560

TCCCAGATCATCAAGCCTGTCCTAAAATAACTTGACGTCCTTACGAACGTCTTCTCTTCG

CGTGAGGCAATGCAGGTTCTTGCGTCTGTGCGAGCAGGACTTGAAAGATTCGTTGTGGTG

----------1-------——4——.-----——i————— 4—----— 1-----—----4 1620

GCACTCCGTTACGTCCAAGAACGCAGACACGCTCGTCCTGAACTTTCTAAGCAACACCAC

GCAACCTTGTGCCTATCTATCCGAAGCCTCGCTGACTCGCAGAAATAAGGGTCGAGATCC

----------i-----------,--------1-----------1---------1----------μ 1680

CGTTGGAACACGGATAGATAGGCTTCGGAGCGACTGAGCGTCTTTATTCCCAGCTCTAGG

ATGAGAGCTTTCTGGGTGGTGAGGCCAGGGCTTGTGAGAACTTCGTGGGAAGATGTGCTT

----------1-----------1-----------i------—---4——----—---!-----------4- 1740

TACTCTCGAAAGACCCACCACTCCGGTCCCGAACACTCTTGAAGCACCCTTCTACACGAA

GAGCTTCGTCAGCAACTTCACGGAGAGCGCCACCTGATCTAAACATCCGAACATTTTTAG

----------1---------1---------1-----------1--------1----------f. 1800

CTCGAAGCAGTCGTTGAAGTGCCTCTCGCGGTGGACTAGATTTGTAGGCTTGTAAAAATC

CTCGACATGTTCACAGAAATGTTGATAGGTTGAGGCGTGTAAAGGTTCGTTCTGGGAAGA

----------1-----------;-----------u----------i-----------1-----------r 1360

GAGCTGTACAAGTGTCTTTACAACTATCCAACTCCGCACATTTCCAAGCAAGACCCTTCT

CGAGTAATCATGTCACGCCATGTTAGCGGTCATGTCGCTGCCTCATTGTATTCGGGTGTC

----------1-----------;-----------(-----------1-----------}--------——4 1920

GCTCATTAGTACAGTGCGGTACAATCGCCAGTACAGCGACGGAGTAACATAAGCCCACAG

ACTGTGCCTTCAAACATCAGTCGTGGTTCAGCAGTGTTTGCTGACGTTCGACACACGGAA ——-----—4— —— [------— —4—---—-----4——-------+ —--------4 1980

TGACACGGAAGTTTGTAGTCAGCACCAAGTCGTCACAAACGACTGCAAGCTGTGTGCCTT

CTCCGGCGAGACTGTCTCGGCAAATGTGACGCACTTTGTATTCATGTGGCAAACCGTTTC

1981 4.———+——-----------————h—————·——4· 2040 gaggccgctctgacagagccgtttacactgcgtgaaacataagtacaccgtttggcaaag

AACGCGGTAATGTGTTTTCTTGTTAAAAAAAAAA

2041 ---------+---------+---------+---- 2074

TTGCGCCATTACACAAAAGAACAATTTTTTTTTT

Tabela 11

Sequência de nucleótidos do cDNA e sequência de aminoácidos do antigene P68 de T. Gondii dela derivada

GCCACTGCTGTGTCTGAAGCGTGCCGATGTGTGCGCGTACGCTTACAGAGAGCCTGCAAG 1 ------------í-----————4·———————|-----————s- δ 0

CGGTGACGACACAGACTTCGCACGGCTACACACGCGCATGCGAATGTCTCTCGGACGTTC acactggttggaagacaaaatttttcttctcaagagttgagctttagtttggtcactcgc

61 ----------!-----------1-----------1-----------1-----------1-----------1- 120 tgtgaccaaccttctgttttaaaaagaagagttctcaactcgaaatcaaaccagtgagcg cgttggttgttctgtgtgctagacgtactctaacgcaaaccagtcgaggaacacacgaac

221 —------—r——————4——--------i ———-—s- 180 gcaaccaacaagacacacgatctgcatgagattgcgtttggtcagctccttgtgtgcttg

GAGAGAGACGGCAATATCTCCCGTCGCGCTATCATACCGGCAACATGGATTGCGGACAGT

131 ----------j-----------l·—------———4—---------!------------[-----—-----r 240

CTCTCTCTGCCGTTATAGAGGGCAGCGCGATAGTATGGCCGTTGTACCTAACGCCTGTCA

MetAspCysGlyGlnC

GCAGAAGGCAACTGCACGCAGCAGGTGTTCTAGGCTTGTTTGTCACCCTTGCCACAGCAA

241 ----------i-----------————4————— 1-------———4.—————— 1- 300

CGTCTTCCGTTGACGTGCGTCGTCCACAAGATCCGAACAAACAGTGGGAACGGTGTCGTT ysArgArgGlnLeuHisAlaAlaGlyValLeuGlyLeuPheValThrLeuAlaThrAlaT

CCGTAGGATTGAGCCAAAGGGTGCCAGAGCTACCAGAAGTGGAGTCCTTTGATGAAGTAG

301 ----------í— -----———i--------.—-i——-----——ι----------1-----------í- 360

GGCATCCTAACTCGGTTTCCCACGGTCTCGATGGTCTTCACCTCAGGAAACTACTTCATC

ΗΓν^ίΟΙγΕιδνδθΓΟΙιιΑ^ν^ίΡΕαΟΐιιΙίβηΡΓοσίιιν^ΐΟίπεβΓΡήθΑερΟΐι^^ΙΟ

GCACGGGAGCTCGACGGTCCGGGTCCATTGCGACCCTTCTTCCACAAGACGCTGTTTTAT 361 ----------l·----------h---------1-------4----------4----------4- 420

CGTGCCCTCGAGCTGCCAGGCCCAGGTÃACGCTGGGAAGAAGGTGTTCTGCGACAAAATA lyThrGlyAlaArgArgSerGlySerlleAlaThrLeuLeuProGlnAspAlaValLeuT atgagaactcagaggacgttgccgttccgagtgattcagcatcgaccccgtcatactttc

421 ---------b-------1-----+-------I--------+--------+

TACTCTTGAGTCTCCTGCAACGGCAAGGCTCACTAAGTCGTAGCTGGGGCAGTATGAAAG yrGluAsnSerGluAspValAlaValProSerAspSerAlaSerThrProSerTyrPheH atgtggaatctccaagtgctagtgtggaagccgcgactggcgcggtgggagaggtggtgc

--—-—4—--—4 —„_«.4—. *-**-+

TACACCTTAGAGGTTCACGATCACACCTTCGGCGCTGACCGCGCCACCCTCTCCACCACG

IsValGluSerProSerAlaSerValGluAlaAlaThrGlyAlaValGlyGluValValP

CGGACTGTGAAGAACGACAGGAACAGGGTGACACGACGTTATCCGATCACGATTTCCATT □ ----------ί-----------i------------------------------------------------ óoo

GCCTGACACITCTTGCTGTCCTTGTCCCACTGTGCTGCAATAGGCTAGTGCTAAAGGTAA roAspCysGluGluArgGlnGluGlnGlyAspThrThrLeuSerAspHisAspPheHisS

CAGGTGGAACTGAACAGGAGGGTTTGCCGGAAACAGAGGTGGCGCATCAGCATGAGACAG δ 01 ---------4----------+---------4·---------4---------+--------4- 5 ó 0

GTCGACCTTGACTTGTCCTCCCAAACGGCCTTTGTCTCCACCGCGTAGTCGTACTCTGTC εϋαίγΘίγΤΕΓαΙιισίηΰΙιιΰΙγΙ^ιιΡΓοσίΐΐΤΐΊΓσΙτινΗίΑΐΗΗίεΟίηΗίΞΟίηΤίΐΓσ

AAGAACAGTACGGGACTGAAGGGATGCCCCCCCCTGTTCTGCCACCTGCACCGGTAGTCC
5o 1 ---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊---------+ ₇₂₀

TTCTTGTCATGCCCTGACTTCCCTACGGGGGGGGACAAGACGGTGGACGTGGCCATCAGG luGluGlnTyrGlyThrGluGlyMetProProProValLeuProProAlaProValValH

ATCCGCGTTTTATTGCAGTACCAGGGCCGTCGGTGCCTGTTCCATTTTTCAGTTTGCCAG /21 ——--------1--------——b———————1——————— ———+ 7 8 Q

TAGGCGCAAAATAACGTCATGGTCCCGGCAGCCACGGACAAGGTAAAAAGTCAAACGGTC isProArgPhelleAlaValProGlyProSecValProValProPhePheSerLeuProA

ACATCCACCCGGATCAGGTTGTGTATATTCTAAGGGTTCAGGGATCTGGGGACTTCGACA

781 _—+—”—————b——»—_—b——————4.——___—-----——840

TGTAGGTGGGCCTAGTCCAACACATATAAGATTCCCAAGTCCCTAGACCCCTGAAGCTGT splleHisProAspGlnValValTyrlleLeuArgValGlnGlySerGlyAspPheAspl | TCAGTTTCGAAGTTGGCCGAGCTGTGAAGCAGTTGGAAGCCATCAAGAAAGCATACAGAG ‘841 --------+-------4----------+---------b---------+--------+ 900

I AGTCAAAGCTTCAACCGGCTCGACACTTCGTCAACCTTCGGTAGTTCTTTCGTATGTCTC j leSerPheGluValGlyArgAlaValI.ysGln.LeuGluAlaIleLysLysAlaTyrArgG

AAGCCACCGGGAAGCTAGAAGCAGACGAGCTTGAGTCAGAAAGGGGACCTGCTGTTTCAC

901 ---------+---------+---------+---------4---------4---------+ 960

TTCGGTGGCCCTTCGATCTTCGTCTGCTCGAACTCAGTCTTTCCCCTGGACGACAAAGTG luAlaThrGlyLysLeuGluAlaAspGruLeuGluSerGluAxgGlyProAlaValSerP

CTCGACGAAGGCTGGTTGACCTGATCAAAGATAACCAGCGACGACTCAGGGCGGCGCTTC 961 ---------4----------4----------4----------4---------4----------4- 1020

GAGCTGCTTCCGACCAACTGGACTAGTTTCTATTGGTCGCTGCTGAGTCCCGCCGCGAAG roArgArgArgLeuValAspLeu.IleLysAspAsnGlnArgArgLeuArgAlaAlaLeuG

AGAAGATAAAGATACAGAAAAAGTTGGAGGAGATTGATGACTTACTTCAGCTGACACGCG LO 21 ---------+--------f-----+-------4-------+-------+ 108 (

TCTTCTATTTCTATGTCTTTTTCAACCTCCTCTAACTACTGAATGAAGTCGACTGTGCGC

InLyslleLysIleGlnLysLysLauGluGluIleAspAspLeuLeuGlnLeuThrArgA

CACTGAAGGCCATGGATGCCCGTCTGAGAGCCTGCCAGGATATGGCACCGATTGAGGAGG ₍

L081 ---------η--------+-------H---------1----------i---------*+ 114(

GTGACTTCCGGTACCTACGGGCAGACTCTCGGACGGTCCTATACCGTGGCTAACTCCTCC laLeuLysAlaMetAspAlaArgLeuArgAlaCysGlnAspMetAlaProIleGluGluA j

CGCTGTGTCACAAGACGAAGGCGTTTGGAGAAATGGTGTCCCAGAAAGCCAAGGAAATTC

1x41 ———————u—----—----}-----------1-----------1---------.—j----------—u 1200

GCGACACAGTGTTCTGCTTCCGCAAACCrCTTTACCACAGGGTCTTTCGGTTCCTTTAAG laLauCysHisLysThrLysAlaPheGlyGluiletValSerGlnLysAlaLysGluIlsA

GGGAGAAAGCGGCGTCCTTGTCTTCATTGTTAGGTGTCGATGCTGTCGAAAAAGAATTGC

1201 ----------i----------1----------1-----————4------————x~-.———.4. 1260

CCCTCTTTCGCCGCAGGAACAGAAGTAACAATCCACAGCTACGACAGCTTTTTCTTAACG rgGluLysAlaAlaSerLeuSerSerLeuI.euGlyValAspAlaValGluI.ysGluI.euA

GGCGTGTCGAACCGGAACATGAAGATAA.CACCAGAGTTGAAGCCAGGGTAGAGGAATTGC

1261 ---------1-------— 1———4.™———+—.—4. 1320

CCGCACAGCTTGGCCTTGTACTTCTATTGTGGTCTCAACTTCGGTCCCATCTCCTTAACG rgArgValGluProGluHisGluAspAsnThrArgValGluAlaArgValGluGluLeuG

AGAAGGCGCTGGAGAAGGCCGCGTCTGAGGCAAAGCAGCTCGTGGGGACCGCAGCAGGCG

1321 —————4.—————4——--™—4*--------—|— -------—1--------μ 1380

TCTTCCGCGACCTCTTCCGGCGCAGACTCCGTTTCGTCGAGCACCCCTGGCGTCGTCCGC

InLysAlaLeuGluLysAlaAlaSerGluAlaLysGlnLeuValGlyThrAlaAlaGlvG

AAATAGAGGAAGGAGTAAAAGCGGATACTCAGGCTGTGCAAGATAGCTCGAAAGACGTGT

1381 ----------1-----------1----------1-----------1-----------1-----------1- 1440

TTTATCTCCTTCCTCATTTTCGCCTATGAGTCCGACACGTTCTATCGAGCTTTCTGCACA luIleGluGluGlyValLysAlaAspThrGlnAlaValGlnAspSerSerLysAspValL

TGACGAAGAGTCCAGTTGCGCTCGTGGAAGCCTTTAAAGCGATCCAGAGGGCTCTTCTTG

1441 ----------1-----------1-----------!-----------—1---------—í ——·———-4- 1500

ACTGCTTCTCAGGTCAACGCGAGCACCTTCGGAAATTTCGCTAGGTCTCCCGAGAAGAAC euThrLvsSerProValAlaLeuValGluAlaPheLysAlalleGlnArgAlaLeuLeuG

AGGCGAAGACAAAGGAA.CTAGTAGAGCCTACGTCTAAAGAAGCGGAGGAAGCTCGTCAGA

1501 ——--------1-----------i--------h---------1----------1----——----κ 1560

TCCGCTTCTGTTTCCTTGATCATCTCGGATGCAGATTTCTTCGCCTCCTTCGAGCAGTCT

IuAlaLysThrLysGluLeuValGluProThrSerLysGluAlaGluGluAlaArgGlnX

TCTTAGCGGAACAGGCAGCTTGATTTCCCAAGGATGCAGTTAAAGATGGGGATGCATGAT

1561 —---———1—---—4 ————4——————4· 1620

AGAATCGCCTTGTCCGTCGAACTAAAGGGTTCCTACGTCAATTTCTACCCCTACGTACTA leLeuAlaGluGlnAlaAla

AGGTAGCGCGCCCATTATCCCAATCCTTTAGCCGTCTACCGTGACGTGGATCATTATAGG

1621 -------+------+-----+-----4----+----+ 1580

TCCATCGCGCGGGTAATAGGGTTAGGAAATCGGCAGATGGCACTGCACCTAGTAATATCC

GGAAACAAGCATTAGCAGAATGATCGTGTATCGCGGAACACACGCATATCCGCACCAGTT

1681 --------+-------+------1------<------+-----+ ¹⁷ 4 C

CCTTTGTTCGTAATCGTCTTACTAGCACATAGCGCCTTGTGTGCGTATAGGCGTGGTCAA

TTTCTAACGTATGGTGAATGGGTTCAAGTCTGGGTTCAAGGCGCAGTGTCTATGCAACAG

1741 -------4---------H--------1-----»-------+-------^{+ 18 0C}

AAAGATTGCATACCACTTACCCAAGTTCAGACCCAAGTTCCGCGTCACAGATACGTTGTC

CGCGGGTTTCTGCCCTTCGTTTTTGCACATGTGCACAGGTATGTACAGTGTTTATGTATA

1 a 01 ---------+---------+--------4----------4---------4---------4- 1360

GCGGCCAAAGACGGGAAGCAAAAACGTGTACACGTGTCCATACATGTCACAAATACATAT

TGGGGCAGTGTGCGCTTCGTCAATGATGTACAGAAAAAAAAAAAAAAAA

1361 ---------4----------+---------4---------4---------- 1909

ACGCCGTCACACGCGAAGCAGTTACTACATGTCTTTTTTTTTTTTTTTT ou codificados pelas sequências de cDNA das referidas Tabelas, ou de partes imunogénicas delas, caracterizado por se transformarem células procarióticas ou eucarióticas com pias mídeos que codificam para as referidas proteínas, se exprimirem essas proteínas e se isolarem os produtos de expressão.

- 2ã Processo para a preparação de um meio de diagnóstico para a toxoplasmose, caracterizado por se empregarem proteínas preparadas de acordo com a reivindicação 1.

- 3ã Processo para a preparação de uma vacina, caracterizado por se empregarem proteínas preparadas de acordo com a reivindicação 1.

- 4§ Processo para a preparaçao de anticorpos mono- ou poli-clonais, caracterizado por se utilizarem para a imu nização proteínas preparadas de acordo com a reivindicação 1.

- 5ã Processo para a preparação de um meio de diagnóstico da toxoplasmose, caracterizado por se empregarem sequências de ácidos nucleicos de acordo com as Tabelas 1 a 11.

- 6ã Processo para a preparação de um meio de diagnóstico da toxoplasmose, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por se empregar a P35 e/ou a P68 ou partes imunogénicas delas.

A requerente reivindica a prioridade do pedido alemão apresentado em 8 de Dezembro de 1989, sob o número P 39 40 598.2.

Lisboa, 6 de Dezembro de 1990