JP2002010794A - トキソプラズマ・ゴンディ抗原、その調製およびその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は、トキソプラズマ・ゴンディ（Toxo
plasma gondii）抗原の同定および遺伝子工学によるそ
れらの調製およびその用途を提供する。 【解決手段】 トキソプラズマ・ゴンディ由来の特定の
アミノ酸配列を含むまたは該表のＤＮＡ配列によってコ
ードされるタンパク質またはその免疫原性部分。上記タ
ンパク質をコードする核酸を含むプラスミドによって原
核または真核細胞を形質転換させて、このプラスミドで
挿入されたＤＮＡを発現させて、発現産生物を単離する
ことを特徴とするタンパク質の調製法。上記タンパク
質、核酸または該タンパク質に対する抗体を含んでなる
診断剤。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、トキソプラズマ・
ゴンディ（Toxoplasma gondii）抗原の同定および遺伝
子工学によるそれらの調製に関する。この寄生虫のｃＤ
ＮＡ発現遺伝子バンクが調製された。診断的に興味がも
たれる組換えクローンを、高力価ウサギ抗−トキソプラ
ズマ・ゴンディ血清を用いて同定して、単離した。

【０００２】

【従来の技術】トキソプラズマ・ゴンディは、コクシジ
ウム（coccidium）に分類される偏性細胞内単細胞寄生
虫である。本寄生虫は、比較的広範囲の宿主域を有して
おり、きわめて多くの哺乳動物に加えてヒトにも感染す
ることができる。後者の場合、互いに生理学的に異なる
二つの型がある。タキゾイト（tachyzoites）は、多く
の異なる細胞型で無性的に繁殖する。この型は、感染の
急性の段階においてのみ見出される。これに対して、ブ
ラディゾイト（bradyzoites）は、心臓および骨格筋の
細胞および中枢神経系の細胞において被包性型で存続し
て、再感染に対する持続免疫を担っている。世界的に５
億人がトキソプラズマ・ゴンディに慢性的に感染してい
ると推定される。

【０００３】健康な成人においては、トキソプラズマ・
ゴンディ感染は通常無症状で、例外はリンパ節のわずか
な腫脹である。しかし、妊娠中および免疫抑制された患
者においては、この寄生虫による感染は著しい問題を起
こすかもしれない。したがって、免疫によってトキソプ
ラズマ・ゴンディからの防御を獲得していない妊婦にお
いては、これらの寄生虫の子宮内移動の危険性がある。
これによって、胎児感染が引き起こされ、子供の奇形ま
たは胎児の排出が起きるかもしれない。

【０００４】免疫抑制された患者においては、被包した
「ブラディゾイト」の再活性化の結果、しばしば急性の
トキソプラズマ・ゴンディ感染が起きる。ほとんどの場
合、これによって、大脳トキソプラズマ症（脳炎）が引
き起こされ、これは状況によっては致命的であるかもし
れない。大脳トキソプラズマ症に加えて、トキソプラズ
マ・ゴンディはまた、眼病（脈絡網膜炎）の原因とも既
述されている。これらの場合も「ブラディゾイト」の再
活性化が関与し得る感染である。

【０００５】トキソプラズマ症の臨床像は、しばしば、
臨床医の鑑別診断を困難にさせる。そのために診断の確
立における研究室分析による支持が求められる。したが
って、抗体の検出および力価または力価の動力学の決定
がトキソプラズマ症を診断するための必須の手段とな
る。ＧおよびＭクラスのトキソプラズマ特異性免疫グロ
ブリンの決定方法、例えば間接的免疫蛍光法（ＩＦ）、
補体結合反応（ＣＦ）、間接的血球凝集反応（ＩＨ
Ａ）、ラテックス凝集（ＬＡ）および酵素結合免疫法
（ＥＬＩＳＡ）は、血清診断の分野できわめてよく知ら
れたものであるが、しばしば誤りがある。例えば、これ
らの試験法は、特異性および感受性に関して非常に大き
く違っている。これらの違いは、血清学的試験に用いら
れる抗原の調製物によって主として起きる。ほとんどの
場合、非特異的細胞成分の多くを含み、誤った陽性の試
験結果を引き起こす原因となる全細胞抗原が、調製され
る。加えて、感染マウスから抗原を得ることは、研究室
において働くヒトへの感染の危険性がある。

【０００６】この型の診断の特異性および感受性を鑑み
て、ＩｇＧ−特異性とＩｇＭ−特異性抗−トキソプラズ
マ・ゴンディ抗体とを識別することを加えて可能にする
べき定義された免疫反応性抗原を用いることがしたがっ
て望ましい。

【０００７】診断的に興味がもたれる多くの抗原は、ト
キソプラズマ・ゴンディについて文献に記述されてい
る。例えば、Ｈｕｇｈｅｓは総説（Curr. Top. Microbi
ol. 120、105-139、1985）において、ＩｇＧクラスの抗
−トキソプラズマ・ゴンディ抗体の検出に適する可能性
のある分子量４５、３２、２７および２１キロダルトン
（ｋＤ）の四つの主要抗原を記述している。Ｈａｎｄｍ
ａｎら（Immunol. 40、579-588、1980）およびＰｏｔａ
ｓｍａｎら（J. Infect. Diseases、154、650-657、198
6）は、急性感染トキソプラズマ・ゴンディ患者の病気
の経過を通して採取した血清をウエスタンブロットを用
いて分析して、３５ｋＤの膜抗原がＩｇＧ抗体ときわめ
て初期の段階で反応することを示した。Ｄｅｃｏｓｔｅ
ｒら（Clinic. Exper. Immunol. 73、376-382、1988）
は、診断的に興味がもたれる分子量１０５、９７、６６
および２８．５ｋＤを有する四つの抗原について記述し
ているが、これらは３５ｋＤの抗原と対照的に、培養培
地から単離され得て、「排出分泌抗原」（ＥＳ抗原）と
名付けられている。１０５、９７および２８．５ｋＤの
抗原と反応するＩｇＧ抗体は、慢性トキソプラズマ症の
ためのよいマーカーのようである。３５ｋＤ抗原と同様
に、９７ｋＤ抗原および６６ｋＤ抗原は、きわめて初期
の段階において急性感染患者のＩｇＭ抗体によって認識
される。これらの抗原は、通常一つの分子量域にいくつ
かのタンパク質があるために、電気泳動分画後に分子量
を得ることによる充分な特徴付けがなされていないとい
うことが指摘されねばならない。

【０００８】６ｋＤの抗原は、急性トキソプラズマ症の
ためのさらなるマーカーである（Ｅｈｒｌｉｃｈら：In
fect. Immun. 41、683-690、1983）。ＩｇＭウエスタン
ブロットにおいて、この抗原は、比較的強く反応する。
今日まで、この抗原の性質を明らかにするデータはきわ
めて僅かである。

【０００９】これまでのところ、ごく僅かのトキソプラ
ズマ・ゴンディ抗原が生化学的に特徴付けされているに
すぎない。主要な表面タンパク質Ｐ３０は、例外であ
る。この抗原は、糖脂質を介して膜に固定された糖タン
パク質である（Ｎａｇｅｌら：J. Biol. Chem. 264、55
69-5576、1989）。Ｐ３０はまたＩｇＧクラスの非特異
性抗体と反応することから、この抗原の診断的重要性は
議論のあるところである（Ｐｏｔａｓｍａｎら：J. Cli
n. Microbiol. 24、1050-1054、1986）。

【００１０】血清診断における使用のための各抗原の単
離および精製は、しばしばかなりの仕事量となる。抗原
の分子量データおよび免疫反応性の分類の双方は、各々
の場合で、従来精製された抗原においては実質的に異な
り得る。そのような抗原のクローニングおよび発現なら
びに対応する遺伝子の構造の研究は、精製抗原の収量を
高めるばかりではなく、血清学的特徴付けに、したがっ
て、抗原の診断的関連の研究に、貢献するであろう。今
までのところ、二つの免疫学的に興味のあるトキソプラ
ズマ・ゴンディ抗原の遺伝子の構造が調べられている。
これら抗原の完全なヌクレオチド配列、すなわちｐ３０
（Ｂｕｒｇら：J. Immunol. 141、3584-3591、1988）お
よび２８ｋＤ抗原（Ｐｒｉｎｃｅら：Mol. Biochem. Pa
rasitol.34、3-14、1989）が知られている。

【００１１】［発明の具体的説明］本発明の目的は、診
断および予防に適する、トキソプラズマ・ゴンディの定
義された抗原を遺伝子工学によって調製することであ
る。高力価ウサギ抗−トキソプラズマ・ゴンディ血清を
用いて、λｇｔ１１ｃＤＮＡ発現遺伝子バンクから適当
なトキソプラズマ・ゴンディ遺伝子産生物を同定するこ
とは成功し得た。８個のクローン（Ｆ２、Ｆ２８、Ｆ２
９、Ｆ３４、Ｆ４５、Ｆ６１、Ｆ７４およびＦ７６）の
部分的核酸配列、およびそれらに由来するアミノ酸配
列、が決定された。上記のクローンの全部がウエスタン
ブロットにおいてヒト抗−トキソプラズマ・ゴンディＩ
ｇＧ血清と反応する。クローンＦ３４、Ｆ６１およびＦ
７６は、ＩｇＭクラスの特異的抗体ともさらに反応す
る。部分的ヌクレオチド配列は、表１〜８に示される通
りであり、明かである限り、翻訳解読枠も示されている
（表１〜６）。

【００１２】Ｆ６１（表１）は、分子量６６ｋＤを有す
るタンパク質である。Ｆ３４（表２）は、約６８ｋＤの
タンパク質に属する。Ｆ２９（表３）は、約３０ｋＤの
タンパク質に属する。Ｆ２８（表４）は、約２８ｋＤの
タンパク質に属する。Ｆ２（表５）は、約３０ｋＤのタ
ンパク質に属する。Ｆ７６（表６）は、約３５ｋＤのタ
ンパク質に属する。Ｆ４５（表７）は、約２９ｋＤのタ
ンパク質に属する。Ｆ７４（表８）は、約６４ｋＤのタ
ンパク質に属する。

【００１３】記述された部分的配列を用いて、上記の部
分的配列のための完全な遺伝子が容易にクローニングで
きる。

【００１４】したがって、表１、２および６に示された
部分的配列を、それらに属する遺伝子のコードｃＤＮＡ
領域を完成するために用いた。この目的のために、ｃＤ
ＮＡＦ６１、Ｆ３４およびＦ７６を放射性標識して、ｃ
ＤＮＡ遺伝子バンクのスクリーニングのためのプローブ
として用いた。表１からの配列、Ｆ６１、をＰ６６タン
パク質のｃＤＮＡを単離するために用いた。表２からの
配列、Ｆ３４、をＰ６８タンパク質のｃＤＮＡを単離す
るために用いた。Ｐ３５タンパク質のｃＤＮＡの単離の
ために、表６からの配列、Ｆ７６、を用いた。これらの
配列との相同性を有する組換えクローンを単離して、挿
入されたトキソプラズマ・ゴンディ特異性ｃＤＮＡ領域
の配列決定によって構造的に特徴付けした。Ｐ３５、Ｐ
６６およびＰ６８タンパク質の構造遺伝子の完全な範囲
のヌクレオチド配列は、表９〜１１に示される通りであ
る。

【００１５】免疫学的に反応性の部分領域（免疫原性部
分）を、例６および７においてＰ３５、Ｐ６６およびＰ
６８について代表として記述する。他の免疫原性タンパ
ク質領域を、同様の方法で試験または決定する。

【００１６】したがって、本発明は以下のことに関す
る。 （ａ）上記クローンの単離された挿入されたＤＮＡ配列
であって、それらの転写産物および特殊の構造遺伝子を
完成するための残りの配列を含む。 （ｂ）これらの配列の全部または一部を含む、ＤＮＡ構
造物およびベクター。 （ｃ）この型のＤＮＡによって形質転換された原核また
は真核細胞。 （ｄ）この型の形質転換細胞によって発現されたポリペ
プチドまたはこれらの免疫原性部分であって、診断およ
び治療または予防のためのこれらの使用を含む。 （ｅ）これらに属するアミノ酸配列。 （ｆ）（ｄ）に記述のポリペプチドに対する抗体であっ
て、トキソプラズマ・ゴンディ感染の診断および治療ま
たは予防のためのこれらの使用を含む。 （ｇ）（ｄ）に記述のポリペプチドまたはそれらの免疫
原性部分の、遺伝子工学による調製法。

【００１７】本発明は、さらに諸例および特許請求の範
囲に記述される通りである。

【００１８】例１： トキソプラズマ・ゴンディのλｇｔ１１−ｃＤＮＡ発現
遺伝子バンクの構築 １）ポリ（Ａ）^＋ＲＮＡの単離 コンフルエントなＨｅｐ−２細胞培養物を、Ｂｒａｖｅ
ｎｙら（Tropenmed. Parasitologie、29、432-434、197
8）による記載の方法でトキソプラズマ・ゴンディ寄生
虫で感染させた。感染後４日目から、トロホゾイトを培
養上清の遠心分離によって集めた。沈澱させたトキソプ
ラズマ・ゴンディ細胞の約５００ｍｇ（湿重量）からの
全ＲＮＡを、ＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよびＳａｃｃｈ
ｉ(1987)（Analytical Biochemistry、162、156-159）
の修飾法によって以下のように単離した。細胞を２０ｍ
ｌの溶液Ｄ（４Ｍグアニジニウムイソチオシアネート、
０．５％サルコシル、２５ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐ
Ｈ７．０）、０．１Ｍメルカプトエタノール）中で溶解
して、２ｍｌの２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）、２
０ｍｌのフェノール（水で飽和にしたもの）および４ｍ
ｌのクロロホルムを添加した後、混合物を激しく振盪し
て、氷上で２０分間冷却した。遠心分離工程（３０分
間、４℃、１５０００ｇ）の後、ＲＮＡを１容量のイソ
プロパノールで１時間４℃で水相から沈澱させて、次い
で遠心分離（２０分間、４℃、１５０００ｒｐｍ）によ
って沈殿物が得られた。沈殿物を６００μｌのＤ溶液に
再懸濁させて、次いでＲＮＡを５．７Ｍ ＣｓＣｌ溶液
（３ｍｌ）を通して遠心分離した（１２時間、３５００
０ｒｐｍ、１０℃）。沈殿物を５００μｌの再蒸留水
（ＲＮＡｓｅを含まない）に再懸濁させて、ＲＮＡを１
／１０容量の酢酸ナトリウムおよび２容量のエタノール
で２時間−２０℃で再び沈澱させて、遠心分離によって
沈澱させた（エッペンドルフ遠心分離機中で１０分間、
１４０００ｒｐｍ、４℃）。ポリ（Ａ）^＋ＲＮＡをオリ
ゴ（ｄＴ）−セルロース（ファルマシア）カラム（１０
ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）、０．５Ｍ ＫＣｌ中の
０．５ｇオリゴｄＴ−セルロース）を次のようにして濃
厚富化した。ＬｉＣｌ（最終濃度０．５Ｍ）を、ＲＮＡ
溶液を変性（７０℃、１０分間）させた後、加えて、混
合物をオリゴｄＴ−セルロースカラムに通した。カラム
を２０ｍｌの結合緩衝液（１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ
７．５）、０．５ＭＫＣｌ）で洗浄した後、ポリ（Ａ）
^＋ＲＮＡを１０ｍｌの再蒸留水（double-distilled wat
er）で溶出して、１／２０容量の８Ｍ ＬｉＣｌおよび
２．５容量のエタノールで−２０℃で４時間沈澱させ
て、次いで遠心分離（６０００ｒｐｍ、４℃、３０分
間）によって沈澱させて、７０％エタノール中で洗浄し
て、乾燥させた。

【００１９】２）ｃＤＮＡ合成 ｃＤＮＡの合成を、Ｇｕｂｌｅｒの修飾法（Ｕ．Ｇｕｂ
ｌｅｒ：Nucl. AcidsRes. 16、2726、1988）によって行
った。５μｌのトキソプラズマ・ゴンディポリ（Ａ）^＋
ＲＮＡを変性（５分間、７０℃）させた後、最初のＤＮ
Ａ鎖の合成を、５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．３）、７
５ｍＭ ＫＣｌ、５０ｍＭ ＤＴＴ、１５ｍＭ ＭｇＣ
ｌ_２、０．５［ｍＭ］ｄＮＴＰ、５μｇのオリゴｄＴプ
ライマー（ベーリンガー、マンハイム）および８００ユ
ニットの逆転写酵素（ＢＲＬ）の存在下で５０μｌの混
合物で３７℃で１時間で行う。次いで、反応を７０℃で
１０分停止させて、８μｌの１Ｍトリス塩酸（ｐＨ７．
５）、３２μｌの１ＭＫＣｌ、１．６μｌの１Ｍ Ｍｇ
Ｃｌ_２、１．６μｌの１Ｍ ＤＴＴ、５０ユニットの大
腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ（ベーリンガー、マンハイ
ム）、３．５ユニットのＲＮＡｓｅＨ（ベーリンガー、
マンハイム）を最終容量３２０μｌで添加後、第二のＤ
ＮＡ鎖の合成を始める。混合物を１６℃で１時間および
２２℃で１時間インキュベートする。次いで、ｃＤＮＡ
を２容量のエタノールおよび１／１０容量の酢酸ナトリ
ウムで−７０℃で１０分間で沈澱させて、遠心分離によ
って沈殿物を得て、乾燥させる。沈殿物を１００μｌの
Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液（２０ｍＭ（ＮＨ_４）_２
ＳＯ_４、５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．８）、１０ｍＭ
ＭｇＣｌ_２、５０μｍ ｄＮＴＰ）に再懸濁させて、
１０ユニットのＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（ベーリンガ
ー、マンハイム）を加えることによってｃＤＮＡ末端の
埋填反応を開始する。混合物を３７℃で１０分間インキ
ュベートして、１００μｌのフェノール／クロロホルム
（１：１）の添加後にフェノール処理する。次いで、ｃ
ＤＮＡ溶液をＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ２００カラム（フ
ァルマシア）を通して遠心分離する。

【００２０】ｃＤＮＡを２容量のエタノールおよび１／
１０容量の酢酸ナトリウムを用いて溶出液から沈澱させ
て、遠心分離して、乾燥させる。

【００２１】３）ｃＤＮＡの、ＥｃｏＲＩアダプターと
の連結 乾燥させたｃＤＮＡ（１μｇ）を３０μｌの連結緩衝液
（３０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．８）、１０ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ_２、０．５ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＤＴＴ）に再
懸濁して、４０ｐｍｏｌのＥｃｏＲＩアダプター（プロ
メガ）および７．５ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼを加
えて、混合物を１４℃で１５時間インキュベートした。
リガーゼの不活化（１０分間、７０℃）の後および４μ
ｌのキナーゼ緩衝液（０．７Ｍトリス塩酸（ｐＨ７．
６）、０．１Ｍ ＭｇＣｌ_２、５０ｍＭ ＤＴＴ）、２
μｌの０．１ｍＭ ＡＴＰおよび１０ユニットのＴ４ポ
リヌクレオチドキナーゼ（ファルマシア）の添加、それ
に続くキナーゼ処理（３０分間、３７℃）の後、ｃＤＮ
Ａを再びSephacryl Ｓ２００カラムを通して遠心分離
して、次いで、上記のようにエタノールおよび酢酸ナト
リウムで沈澱させる。

【００２２】４）λｇｔ１１ＥｃｏＲＩ断片とのｃＤＮ
Ａの連結、インビトロパッケージングおよびλｇｔ１１
のトランスフェクション 連結反応のために、約５０ｎｇのキナーゼ処理したｃＤ
ＮＡを１０μｌの混合物（６６ｍＭトリス塩酸（ｐＨ
７．６）、６．６ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ ＡＴＰ、
５ｍＭ ＤＴＴ）に入れた１μｇの脱燐酸化したλｇｔ
１１ＥｃｏＲＩ断片に加えて、３Weiss単位のＴ４ＤＮ
Ａリガーゼ（ベーリンガー、マンハイム）の添加後、混
合物を１４℃で１５時間インキュベートした。５μｌの
この混合物を、パッケージングミックス製造者（Giga G
old Mix、Stratagene）の説明書に従って行われたイン
ビトロパッケージング反応において用いる。大腸菌Ｙ１
０９０株のトランスフェクションの後、組換えファージ
の力価を決定した。全部で約１０^６個の組換えファージ
が得られた。

【００２３】例２： 高度免疫ウサギ抗−トキソプラズマ・ゴンディ血清を用
いる、λｇｔ１１発現遺伝子バンクのスクリーニング イムノブロットにおける非特異的反応を減らすために、
抗−大腸菌抗体を先ず、ウサギ抗−トキソプラズマ・ゴ
ンディ血清から既知の方法（Ｌ．Ｓ．Ｏｓａｋｉ：J. I
mmun. Method. 89、213-219、1986、Promega Biotec、P
rotoBlot Immunoscreening System、Technical Manua
l、1986）にて吸着させた。この目的のために、λｇｔ
１１野生型ファージを、全部で３０枚のＬＢ寒天プレー
トに９０ｍｍの寒天プレート当り、９ｍｌのＬＢ軟寒天
／０．４％マルトース／１０ｍＭＭｇＳＯ_４に５×１０
^４ ＰＦＵの密度で分布させた。３７℃で２時間インキ
ュベートした後、各々の場合に１０ｍＭ １ＰＴＧ（イ
ソプピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド）中で平衡に
した乾燥円形ニトロセルロースフィルターでプレートを
覆って、更に２時間インキュベートした。次いで、フィ
ルターを反転させて、寒天上で２時間再びインキュベー
トした。次いで、フィルターを５％脱脂粉乳／ＴＢＳ緩
衝液（ＴＢＳ：１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭトリス
塩酸（ｐＨ８．０））中で室温で１０分間インキュベー
トして、５％脱脂粉乳／ＴＢＳ中で１／１００に希釈し
た１００ｍｌのウサギ血清中に移した後、４時間室温で
インキュベートした。この前吸着させた希釈血清を、ス
クリーニング実験およびウエスタンブロットの双方に使
用した。全部で６×１０^５個のλｇｔ１１ｃＤＮＡバン
クの組換えファージを、この血清とともにＲ．Ｙ．Ｙｏ
ｕｎｇおよびＲ．Ｗ．Ｄａｖｉｓ（Proc. Natl. Acad.
Sci. 80、1194、1983）の方法によるスクリーニングに
供した。この目的のために、大腸菌Ｋ１２ Ｙ１０９０
株の培養細胞を、上記のように、組換えλｇｔ１１ファ
ージ（３×１０^４ファージ／１００μｌＹ１０９０培養
液）でトランスフェクトさせて、軟寒天プレート（全部
で２０プレート）上に分布させた。７℃で２時間インキ
ュベートした後、プレートを、各々に、１０ｍＭ ＩＰ
ＴＧに浸して乾燥させたニトロセルロースフィルターで
覆って、さらに２時間インキュベートした。寒天プレー
ト上のフィルターの位置を印付けした後、フィルターを
注意深く引き上げて、２５０ｍｌの５％脱脂粉乳／ＴＢ
Ｓ緩衝液中で１０分間室温で振盪した。次いで、フィル
ターを新鮮な脱脂粉乳／ＴＢＳ緩衝液中に移して、４℃
で一晩保持した。

【００２４】フィルターを２５０ｍｌの脱脂粉乳／ＴＢ
Ｓ緩衝液中でさらにインキュベートした後、これらを１
００ｍｌの前吸着させたウサギ抗−トキソプラズマ・ゴ
ンディ血清と室温で１時間軽く振盪した。次いで、フィ
ルターを３回、各々、２５０ｍｌのＴＢＳで室温で１０
分間洗浄して、脱脂粉乳／ＴＢＳで１／３００に希釈し
た２５０ｍｌの抗−ウサギＩｇＧ／アルカリホスファタ
ーゼＩｇＧ抱合物（Behringwerke、Marburg）とともに
室温でさらに１時間振盪した。フィルターを洗浄（２５
０ｍｌのＴＢＳで３回、各々１０分間室温で振盪する）
の後、これらを２５０ｍｌのアルカリホスファターゼの
ための基質溶液（２００μｇ／ｍｌの５−ブロモ−４−
クロロ−インドキシホスフェート（ＸＰ）（Ｂａｃｈｅ
ｍ社製、注文番号：Ｍ１２０５）のｐ−トルイジン塩、
５００μｇ／ｍｌの４−ニトロテトラゾリウムクロリド
ブルー（シグマ社製：注文番号：Ｎ６８７６））中で１
５分間再びインキュベートした。ファージプラークの周
りに形成される環の呈色域から認められる血清陽性（se
ropositive）クローンを、ペトリ皿上の領域と照合し
て、パスツールピペットを用いてくり抜き、１ｍｌのＳ
Ｍ緩衝液中に再懸濁させた。陽性ファージプラークの各
クローンを、２回のさらなるスクリーニング工程で調製
した。全部で８３個の血清陽性クローンを単離した。こ
れらクローンをさらに次のように特徴付けした。 １）ｃＤＮＡクローンの免疫学的特徴付け ２）クローニングされたｃＤＮＡ挿入物の構造的特徴付
け ａ）ＤＮＡ−ＤＮＡドットブロット分析 ｂ）転写解読枠を調べるための、ｃＤＮＡ挿入物の部分
的配列決定 ｃ）ｌａｃＺまたはＬａｃＺ’（部分的に欠失したβ−
ガラクトシダーゼ誘導体）との遺伝子融合物としての、
クローニングされたｃＤＮＡの発現

【００２５】３）血清陽性ｃＤＮＡクローンの免疫学的
特徴付け 遺伝子バンクの血清陽性クローンを、「クローン特異
性」血清（これはｃＤＮＡクローンの組換え融合タンパ
ク質上の吸着によってポリクローナルウサギ血清から得
られた血清を意味する）を用いて免疫学的に特徴付けし
た。これら血清を、Ｏｚａｋｉら（J. Immun. Method.
89、213-219、1986）の方法により、次のように調製し
た。各々、５×１０^４ＰＦＣの各ｃＤＮＡクローンを、
大腸菌Ｙ１０９０細胞に吸着させた後に、軟寒天中でＬ
Ｂプレートに分布させて、２時間インキュベートした
後、各々、１０ｍＭ ＩＰＴＧで前処理しておいた１枚
のニトロセルロースフィルターで覆って、例２に記述の
ように処理を続けた。このようにして前処理したクロー
ン当り３枚のフィルターを、各々、前吸着させたウサギ
血清中で４時間インキュベートして、次いで、５０ｍｌ
のＴＢＳで１０分間洗浄した（緩衝液を３回交換）。フ
ィルターに結合した抗体を全部で１５ｍｌの０．１Ｍグ
リシン／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ２．５）を用いて室温で５
分間洗い出して、３ｍｌの０．１Ｍトリスで中和した。
脱脂粉乳を最終濃度５％になるように加えた。

【００２６】単一特異性血清を２０の各々のクローンか
ら生じさせた。すべての血清陽性クローンの組換えタン
パク質に対するこれら血清の免疫反応性をドットブロッ
ト実験において試験した。組換えタンパク質が血清と交
差反応したクローンを、クローン群に一緒にグループ分
けした。サザンドットブロット分析において、^３２Ｐ−
標識した挿入ＤＮＡのみが上記の血清学的データの結果
として一つのグループに入れられたクローンＤＮＡと相
同性を示した。一つのクローンを各グループから選択し
て、ウエスタンブロットにおいてヒト抗−トキソプラズ
マ・ゴンディ血清を用いて試験した。この目的のため
に、クローンＤＮＡの挿入断片を、適当な発現ベクター
中にサブクローニングするかまたは、大腸菌Ｋ１２ Ｙ
１０８９株を特定の組換えλｇｔ１１誘導体で溶原化さ
せた。

【００２７】例４： β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質の発現 免疫反応性を調べるために、λｇｔ１１クローンＦ２、
Ｆ２９、Ｆ２８、Ｆ３４、Ｆ６１およびＦ７６のｃＤＮ
Ａ断片を、部分欠失したＬａｃＺ誘導体との遺伝子融合
物としてｐＳＥＭシリーズ（Ｋｎａｐｐら：Biotechniq
ues、8、280、1990）のベクター中にサブコローニング
して、融合タンパク質の発現を大腸菌Ｗ３１１０ ｌａ
ｃＩ^ｑＬ８（ＢｒｅｎｔおよびＰｔａｓｈｎｅ：Proc.
Natl. Acad. Sci.、78、4204-4208、1981）中でＩＰＴ
Ｇの添加によって誘導した。クローンＦ４５およびＦ７
４の融合タンパク質の発現のために、大腸菌Ｙ１０８９
株を、双方のλｇｔ１１誘導体で溶原化させて、次い
で、融合タンパク質を既知の方法（Ｈｕｙｎｈら：Glov
er、DNA、CloningVolume I、49-78、IRL Press、Oxfor
d、1985）で誘導した。全細胞抽出物からのタンパク質
を、ＩＰＴＧ誘導後、ＳＤＳ ＰＡＧＥ（１０％）で電
気泳動的に分画して、ニトロセルロースに移した。組換
えタンパク質の反応性を、ヒトＩｇＧおよびＩｇＭ血清
を用いてウエスタンブロットにおいて確認した。最後
に、このようにして特徴付けしたクローンを配列決定し
た。

【００２８】例５： ｃＤＮＡ断片の配列決定 ｃＤＮＡ断片の配列決定を、「ＫＳプライマー」（プロ
メガ）を用いてＳａｎｇｅｒのジデオキシ法（Proc. Na
tl. Acad. Sci. 74、5463、1977）によって行った。ク
ローンＦ２、Ｆ２９、Ｆ３４、Ｆ２８、Ｆ４５、Ｆ６
１、Ｆ７４およびＦ７６の挿入断片を、ＥｃｏＲＩを用
いて組換えλｇｔ１１ＤＮＡから切り出して、ベクター
ブルースクリプトＫＳのＥｃｏＲＩ切断部位に挿入の
後、大腸菌ＸＬ１−ブルー株（Stratagene、San Dieg
o）中に形質転換させた。これら組換えプラスミドの１
本鎖ＤＮＡを、ヘルパーファージＶＣＳによるクローン
の感染の後、既知の方法（Stratagene、San Diego）で
単離した。クローニングされた断片の位置方向によっ
て、ｃＤＮＡの５’または３’末端の配列が得られる。
表１〜８は、上記クローンの翻訳解読枠（表１〜６）お
よび部分的ヌクレオチド配列（表１〜８）を示す。

【００２９】例６： 組換えトキソプラズマ・ゴンディ抗原ｒＰ３５、ｒＰ６
６およびｒＰ６８の、診断的適合性 抗原Ｐ３５、Ｐ６６およびＰ６８の構造遺伝子の領域か
らの部分的配列を、大腸菌Ｗ３１１０中でｐＳＥＭ発現
ベクター（Ｋｎａｐｐら：Biotechniques、8、280、199
0）を用いて発現させた。発現産物は、Ｃ末端に挿入特
異性融合タンパク質を含む３７５個のアミノ酸のＮ末端
β−ガラクトシダーゼ誘導体からなる。融合タンパク質
の合成は、Ｋｎａｐｐら（Biotechniques、8、280、199
0）による記述のようにＩＰＴＧによって誘導され得
る。ウエスタンブロット実験のために、組換え大腸菌Ｗ
３１１０誘導体の全細胞抽出物を、ＩＰＴＧ誘導後、Ｓ
ＤＳＰＡＧＥで分画した。タンパク質をニトロセルロー
スペーパーに移して、特異的血清サンプルおよび抱合物
（抗ヒトＩｇＧ／アルカリホスファターゼ）とともにイ
ンキュベートして、標準法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら：Mole
cular Cloning、Cold Spring Harbor Laboratory Pres
s、1989）に従って染色した。上記のトキソプラズマ・
ゴンディタンパク質の次の部分を発現させた。 ｒＰ３５：塩基対３６３−５２７＊：ハイブリドプラス
ミドｐＰＳ７６に含まれる ｒＰ６８：塩基対１７６−１９２７＊：ハイブリドプラ
スミドｐＰＳ３４に含まれる ｒＰ６６：塩基対１−２０７４＊：ハイブリドプラスミ
ドｐＰＳ６１に含まれる （＊ 表９〜１１中のデータのヌクレオチド配列に対応
する）。

【００３０】急性または慢性トキソプラズマ・ゴンディ
感染を有する患者のヒト血清からの特異的ＩｇＧおよび
ＩｇＭ抗体の反応性を、ウエスタンブロット実験におい
て調べた。これら実験の結果は表１２に要約される通り
である。このように、三つのハイブリドタンパク質、ｒ
Ｐ３５、ｒＰ６６およびｒＰ６８の全てが、特異的Ｉｇ
Ｇ抗体の検出に適している。ｒＰ３５については特に強
調されるべきである。２５／２６血清はＩｇＧウエスタ
ンブロットにおいてハイブリドタンパク質と反応した。
ｒＰ６８を用いて、特異的ＩｇＧ抗体は２７／３１血清
において認められた。ｒＰ３５およびｒＰ６８の両融合
タンパク質は、検出可能な特異的ＩｇＭ抗体力価を有し
ていた急性血清（ｎ＝２１）からのＩｇＧ抗−トキソプ
ラズマ・ゴンディ抗体と例外なく反応した。このため
に、ｒＰ３５およびｒＰ６８の双方は、トキソプラズマ
症の急性期におけるＩｇＧ抗−トキソプラズマ・ゴンデ
ィ抗体の検出のためのマーカーとして、特に適してい
る。ｒＰ６６はＩｇＭブロットにおいて試験された２１
個の血清のほとんどと反応し、したがって、この免疫グ
ロブリンクラスの特異的抗体の検出のためのマーカーと
して適している。

【００３１】例７： 組換えトキソプラズマ・ゴンディタンパク質ｒＰ３５お
よびｒＰ６８の、ＥＬＩＳＡにおける適合性 特異的ＩｇＧ抗体との組換えトキソプラズマ・ゴンディ
タンパク質ｒＰ３５およびｒＰ６８の反応性をＥＬＩＳ
Ａにおいて調べた。二つのタンパク質を、一緒にまたは
各々別々にＥＬＩＳＡプレートを被覆するための固相抗
原として用いた。二つのハイブリッドタンパク質を、大
腸菌から次のように単離した。

【００３２】プラスミドｐＰＳ７６またはｐＰＳ３４を
含む組換え大腸菌Ｗ３１１０株の一晩培養物を、２リッ
トルのＬ−ブロス／１００ｍｇ／ｍｌアンピシリン中で
１／５０に希釈して、激しく振盪しながら、ＯＤ６００
＝０．７になるまで３７℃で増殖させた。ＩＰＴＧ（最
終濃度１ｍＭ）の添加後、培養物を３７℃でさらに３時
間激しく振盪して、遠心分離して、細胞沈殿物を１５０
ｍＭ ＮａＣｌ／５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）／
１ｍｇ／ｍｌリゾチーム中で溶解して、３７℃で１０時
間インキュベートした。細胞破砕のために、細胞懸濁液
をフレンチプレスで２回処理した。破砕された細胞を遠
心分離（１００００ｒｐｍ、１０分間、４℃）して、難
溶性封入体として存在する融合タンパク質を含む沈殿物
を種々の濃度の尿素溶液（１Ｍ〜６Ｍ尿素）で連続して
洗浄した。この工程において、最初に沈殿物を３０ｍｌ
の１Ｍ尿素／１０ｍＭトリス／１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ
８．０）（ＴＥ）中で室温で１時間撹拌した。遠心分離
（１００００ｒｐｍ、１０分間、４℃）の後、沈殿物を
上記のように２Ｍ尿素に溶解して、インキュベートし
た。次いで、これらインキュベーションは、３Ｍ、４
Ｍ、５Ｍおよび６Ｍ尿素で続けられた。遠心分離工程の
後の上清を保存して、これに溶解性のタンパク質を、Ｓ
ＤＳ ＰＡＧＥで分析した。融合タンパク質に加えて大
腸菌タンパク質の僅かな混入を含むのみ（約７５％融合
タンパク質）であるこれら上清を、ＥＬＩＳＡプレート
の被覆にさらに用いた。これら上清を１Ｍ尿素 ／０．
１％ＳＤＳに対して４℃で７２時間透析した。ＥＬＩＳ
Ａプレートの被覆のために、透析したサンプルのタンパ
ク質濃度をＰＢＳ（ｐＨ７．０）で２μｇ／ｍｌに調製
した。被覆を、１００μｌ／ウェルを用いて４℃で一晩
行った。次いで、血清試料をプレートに供する前に、プ
レートをＡＰ洗浄緩衝液（ベーリング、注文番号：１３
５３１１５）を用いて３回洗浄した。

【００３３】血清サンプルにおける抗−大腸菌抗体の吸
着：まず、抗−大腸菌抗体を、血清サンプルから除去し
た。この目的のために、大腸菌Ｗ３１１０の一晩培養細
胞を遠心分離して、沈殿物を５ｍｌのＰＢＳ（ｐＨ７．
０）の中に再懸濁させた。細胞を超音波処理（音波処理
３回、Branson sonifierを７にセット）によって溶解さ
せて、ＤＮＡｓｅＩ（最終濃度１μｇ／ｍｌ）を加えた
後、３７℃で１０分間インキュベートした。

【００３４】ヒト血清および溶解物抗原を、１：１の比
で混合して、ＰＢＳ（ｐＨ７．０）中で１／５０に希釈
して、室温で３０分間振盪した。遠心分離後、５％脱脂
乳／ＰＢＳ（ｐＨ７．０）を上清に加えて（最終濃度１
％）、その１００μｌ／ウェルをＥＬＩＳＡプレート上
で３７℃で１時間インキュベートして、これらを３回Ａ
Ｐ洗浄緩衝液で洗浄した。

【００３５】次いで、ＡＰ抱合物希釈緩衝液（ベーリン
グ注文番号：１３３２１１５）中で１／７０に予備希釈
した１００μｌ／ウェルの抗−ヒトＩｇＧ／ＡＰ抱合物
（ベーリング注文番号：ＯＳＤＨ ０４／０５）を、３
７℃で１時間インキュベートした。プレートを３回ＡＰ
洗浄緩衝液で洗浄して、１００μｌ／ウェルのＡＰ基質
溶液（ベーリングＡＰ基質錠剤、注文番号：ＯＳＣＸ９
６、ベーリング１０％ジエタノールアミン、注文番号：
０２４３１１５、基質溶液：１０ｍｌの１０％ジエタノ
ールアミン中に２錠）とともに３７℃で３０分間インキ
ュベートして、基質溶液の吸光度を４０５ｎｍで決定し
た。

【００３６】血清変換された患者（患者Ａ１）の９個の
血清を、試験に含めた。血清サンプルを、供与者から次
の日に採取した。Ａ：１９８８年８月９日、Ｂ：１９８
８年８月１８日、Ｃ：１９８８年８月２９日、Ｄ：１９
８８年１０月１２日、Ｅ：１９８８年１２月２日、Ｆ：
１９８９年１月１３日、Ｇ：１９８９年２月２８日、
Ｈ：１９８９年５月１２日、Ｉ：１９８９年７月１７
日。証明し得るような感染は１９８８年７月３１日に起
きた。表１３に見られるように、第１７日後に採取され
たヒト血清Ｂは、ｒＰ３５およびｒＰ６８に対する特異
的ＩｇＧ抗体を既に示している。これに対して、この血
清サンプルは、古典的な非組換えＥＬＩＳＡシステム
（ＩｇＧ検出）においては陰性であった。

【００３７】さらに急性トキソプラズマ症の供与者の、
特異的ＩｇＭ抗体を含む、３０個のヒト血清を、ｒＰ３
５およびｒＰ６８に対するＩｇＧ抗体についてＥＬＩＳ
Ａにおいて分析した。これらヒト血清は、固相に組換え
抗原ｒＰ３５およびｒＰ６８の双方を含むＥＬＩＳＡに
おいて例外なく反応した。さらに、供血者からの１５０
個の血清を、特異的ＩｇＧ抗−ｒＰ３５および抗−ｒＰ
６８抗体について分析した。同じ抗血清を、Ｅｎｚｙｇ
ｎｏｓｔ^Ｒトキソプラズマ症（ＩｇＧ、製造者：Ｂｅｈ
ｒｉｎｇｗｅｒｋｅ ＡＧ）において特異的ＩｇＧ抗体
について分析して、二つの試験の結果を互いに比較し
た。これによって、Ｅｎｚｙｇｎｏｓｔ^Ｒにおいて陽性
であった血清はｒＰ３５／ｒＰ６８ＥＬＩＳＡにおいて
も陽性であったことが示された。抗−トキソプラズマ・
ゴンディ陰性血清についてもまた、ｒＰ３５／ｒＰ６８
ＥＬＩＳＡからのデータは、Ｅｎｚｙｇｎｏｓｔ^Ｒ
ＥＬＩＳＡからのものと一致した。

【００３８】

【表１】

【表２】

【表３】

【表４】

【表５】

【表６】

【表７】

【表８】

【表９】

【表１０】

【表１１】

【表１２】

【表１３】

【表１４】

【表１５】

【表１６】

【表１７】

【表１８】

【表１９】

【表２０】

【表２１】

【表２２】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 16/20 Ｃ１２Ｐ 21/08 ４Ｈ０４５ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ａ 21/08 33/577 Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 33/577 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ // Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者 ロベルト、ツィーゲルマイアー ドイツ連邦共和国マールブルク、ホーエ、 ロイヒテ、33 (72)発明者 ハンス、キューペル ドイツ連邦共和国マールブルク、ワンコプ クシュトラーセ、12 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA13 BA31 BA41 CA04 DA06 EA04 GA11 HA01 HA12 HA15 4B063 QA01 QA07 QQ42 QR32 QR55 QR62 QS05 QS34 4B064 AG26 AG27 CA19 CC24 DA01 DA15 4C084 AA02 AA06 AA07 BA01 BA20 BA22 CA53 NA14 ZB38 4C085 AA03 AA13 AA14 BA02 DD62 4H045 AA11 BA10 CA21 DA75 DA76 EA29 EA31 EA52 FA74

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】表６、９に示されるアミノ酸配列を含むま
   たは該表のＤＮＡ配列によってコードされるタンパク質
   またはその免疫原性部分。
2. 【請求項２】請求項１に記載のタンパク質をコードす
   る、核酸配列。
3. 【請求項３】請求項２に記載の核酸配列を含む、プラス
   ミド。
4. 【請求項４】請求項３に記載のプラスミドによって形質
   転換された原核または真核細胞。
5. 【請求項５】請求項１に記載のタンパク質に対するモノ
   クローナルまたはポリクローナル抗体。
6. 【請求項６】請求項３に記載のプラスミドによって原核
   または真核細胞を形質転換させて、このプラスミドで挿
   入されたＤＮＡを発現させて、発現産生物を単離するこ
   とを特徴とする、請求項１に記載のタンパク質の調製
   法。
7. 【請求項７】請求項１に記載のタンパク質を含んでな
   る、トキソプラズマ症感染の検出のための診断剤。
8. 【請求項８】請求項１に記載の一つまたはそれ以上のタ
   ンパク質を含んでなる、ワクチン。
9. 【請求項９】請求項２に記載の核酸配列を含んでなる、
   診断剤。
10. 【請求項１０】請求項５に記載の抗体を含んでなる、診
    断剤。
11. 【請求項１１】Ｐ３５および／またはＰ６８または該タ
    ンパク質の免疫原性部分を各々含んでなる、請求項７に
    記載の診断剤。
12. 【請求項１２】試験される体液を請求項７または１１に
    記載の診断剤を用いて試験することを特徴とする、トキ
    ソプラズマ症感染の検出法。
13. 【請求項１３】請求項１に記載のタンパク質、請求項２
    に記載の核酸配列、または請求項５に記載の抗体の、ト
    キソプラズマ症感染の検出のための使用。