JP3085972B2

JP3085972B2 - トキソプラズマ・ゴンディ抗原、その調製およびその使用

Info

Publication number: JP3085972B2
Application number: JP02336906A
Authority: JP
Inventors: シュテファン、クナップ; ロベルト、ツィーゲルマイアー; ハンス、キューペル
Original assignee: デイド、ベーリング、マルブルク、ゲゼルシャフト、ミット、ベシュレンクテル、ハフツング
Priority date: 1989-12-08
Filing date: 1990-11-30
Publication date: 2000-09-11
Anticipated expiration: 2015-09-11
Also published as: JP2002010793A; EP0431541A2; DE3940598A1; ES2149913T3; ES2152357T3; ES2092483T3; JP2000308495A; EP0748815A1; US6419925B1; JP3366628B2; EP0751147A1; DE59010450D1; DK0431541T3; ATE197068T1; KR100215607B1; PT96097B; GR3020819T3; US6326008B1; ATE206435T1; JP2002010794A

Description

【発明の詳細な説明】［技術分野］本発明は、トキソプラズマ・ゴンディ（Toxoplasma g
ondii）抗原の同定および遺伝子工学によるそれらの調
製に関する。この寄生虫のcDNA発現遺伝子バンクが調製
された。診断的に興味がもたれる組換えクローンを、高
力価ウサギ抗−トキソプラズマ・ゴンディ血清を用いて
同定して、単離した。

［従来技術］トキソプラズマ・ゴンディは、コクシジウム（coccid
ium）に分類される偏性細胞内単細胞寄生虫である。本
寄生虫は、比較的広範囲の宿主域を有しており、きわめ
て多くの哺乳類物に加えてヒトにも感染することができ
る。後者の場合、互いに生理学的に異なる二つの型があ
る。タキゾイト（tachyzoites）は、多くの異なる細胞
型で無性的に繁殖する。この型は、感染の急性の段階に
おいてのみ見出される。これに対して、ブラディゾイト
（bradyzoites）は、心臓および骨格筋の細胞および中
枢神経系の細胞において被包性型で存続して、再感染に
対する持続免疫を担っている。世界的に５億人がトキソ
プラズマ・ゴンディに慢性的に感染していると推定され
る。

健康な成人においては、トキソプラズマ・ゴンディ感
染は通常無症状で、例外はリンパ節の僅かな腫脹であ
る。しかし、妊娠中および免疫抑制された患者において
は、この寄生虫による感染は著しい問題を起こすかもし
れない。したがって、免疫によってトキソプラズマ・ゴ
ンディからの防御を獲得していない妊婦においては、こ
れらの寄生虫の子宮内移動の危険性がある。これによっ
て、胎児感染が引き起こされ、子供の奇形または胎児の
排出が起きるかもしれない。

免疫抑制された患者においては、被包した「ブラディ
ゾイト」の再活性化の結果、しばしば急性のトキソプラ
ズマ・ゴンディ感染が起きる。ほとんどの場合、これに
よって、大脳トキソプラズマ症（脳炎）が引き起こさ
れ、これは状況によっては致命的であるかもしれない。
大脳トキソプラズマ症に加えて、トキソプラズマ・ゴン
ディはまた、眼病（脈絡網膜炎）の原因とも既述されて
いる。これらの場合も、「ブラディゾイト」の再活性化
が関与し得る感染である。

トキソプラズマ症の臨床像は、しばしば、臨床医の鑑
別診断を困難にさせる。そのために診断の確立における
研究室分析による支持が求められる。したがって、抗体
の検出および力価はまたは力価の動力学の決定がトキソ
プラズマ症を診断するための必須の手段となる。Ｇおよ
びＭクラスのトキソプラズマ特異性免疫グロブリンの決
定方法、例えば間接的免疫蛍光法（IF）、補体結合反応
（CF）、間接的血球凝集反応（IHA）、ラテックス凝集
（LA）および酵素結合免疫法（ELISA）は、血清診断の
分野できわめてよく知られたものであるが、しばしば誤
りがある。例えば、これらの試験法は、特異性および感
受性に関して非常に大きく違っている。これらの違い
は、血清学的試験に用いられる抗原の調製物によって主
として起きる。ほとんどの場合、非特異的細胞成分の多
くを含み、誤った陽性の試験結果を引き起こす原因とな
る全細胞抗原が、調製される。加えて、感染マウスから
抗原を得ることは、研究室において働くヒトへの感染の
危険性がある。

この型の診断の特異性および感受性を鑑みて、IgG−
特異性とIgM−特異性抗−トキソプラスマ・ゴンディ抗
体とを識別することを加えて可能にするべき定義された
免疫反応性抗原を用いることがしたがって望ましい。

診断的に興味がもたれる多くの抗原は、トキソプラズ
マ・ゴンディについて文献に記述されている。例えば、
Hughesは総説（Curr.Top.Microbiol.120、105−139、19
85）において、IgGクラスの抗−トキソプラズマ・ゴン
ディ抗体の検出に適する可能性のある分子量45、32、27
および21キロダルトン（kD）の四つの主要抗原を記述し
ている。Handmanら（Immunol.40、579−588、1980）お
よびPotasmanら（J.Infect.Diseases、154、650−657、
1986）は、急性感染トキソプラズマ・ゴンディ患者の病
気の経過を通して採取した血清をウエスタンブロットを
用いて分析して、35kDの膜抗原がIgG抗体ときわめて初
期の段階で反応することを示した。Decosterら（Clini
c.Exper.Immunol.73、376−382、1988）は、診断的に興
味がもたれる分子量105、97、66および28.5kDを有する
四つの抗原について記述しているが、これらは35kDの抗
原と対照的に、培養培地から単離され得て、「排出分泌
抗原］（ES抗原）と名付けられている。105、97および2
8.5kDの抗原と反応するIgG抗体は、慢性トキソプラズマ
症のためのよいマーカーのようである。35kD抗原と同様
に、97kD抗原および66kD抗原は、きわめて初期の段階に
おいて急性感染患者のIgM抗体によって認識される。こ
れらの抗原は、通常一つの分子量域にいくつかのタンパ
ク質があるために、電気泳動分画後に分子量を得ること
による充分な特徴付けがされていないということが指摘
されねばならない。

6kDの抗原は、急性トキソプラズマ症のためのさらな
るマーカーである（Ehrlichら:Infect.Immun.41、683−
690、1983）。IgMウエスタンブロットにおいて、この抗
原は、比較的強く反応する。今日まで、この抗原の性質
を明らかにするデータはきわめて僅かである。

これまでのところ、ごく僅かのトキソプラズマ・ゴン
ディ抗原が生化学的に特徴付けされているにすぎない。
主要な表面タンパク質P30は、例外である。この抗原
は、糖脂質を介して膜に固定された糖タンパク質である
（Nagelら:J.Biol.Chem.264、5569−5576、1989）。P30
はまたIgGクラスの非特異性抗体と反応することから、
この抗原の診断的重要性は議論のあるところである（Po
tasmanら:J.Clin.Microbiol.24、1050−1054、1986）。

血清診断における使用のための各抗原の単離および精
製は、しばしばかなりの仕事量となる。抗原の分子量デ
ータおよび免疫反応性の分類の双方は、各々の場合で、
従来精製された抗原においては実質的に異なり得る。そ
のような抗原のクローニングおよび発現ならびに対応す
る遺伝子の構造の研究は、精製抗原の収量を高めるばか
りではなく、血清学的特徴付けに、したがって、抗原の
診断的関連の研究に、貢献するであろう。今までのとこ
ろ、二つの免疫学的に興味のあるトキソプラズマ・ゴン
ディ抗原の遺伝子の構造が調べられている。これら抗原
の完全なヌクレオチド配列、すなわちp30（Burgら:J.Im
munol.141、3584−3591、1988）および28kD抗原（Princ
eら:Mol.Biochem.Parasitol.34、３−14、1989）が知ら
れている。

［発明の具体的説明］本発明の目的は、診断および予防に適する、トキソプ
ラズマ・ゴンディの定義された抗原を遺伝子工学によっ
て調製することである。高力価ウサギ抗−トキソプラズ
マ・ゴンディ血清を用いて、λgt11cDNA発現遺伝子バン
クから適当なトキソプラズマ・ゴンディ遺伝子産生物を
同定することは成功し得た。８個のクローン（F2、F2
8、F29、F34、F45、F61、F74およびF76）の部分的核酸
配列、およびそれらに由来するアミノ酸配列、が決定さ
れた。上記のクローンの全部がウエスタンブロットにお
いてヒト抗−トキソプラズマ・ゴンディIgG血清と反応
する。クローンF34、F61およびF76は、IgMクラスの特異
的抗体ともさらに反応する。部分的ヌクレオチド配列
は、表１〜８に示される通りであり、明かである限り、
翻訳解読枠も示されている（表１〜６）。

F61（表１）は、分子量66kDを有するタンパク質であ
る。

F34（表２）は、約68kDのタンパク質に属する。

F29（表３）は、約30kDのタンパク質に属する。

F28（表４）は、約28kDのタンパク質に属する。

F2（表５）は、約30kDのタンパク質に属する。

F76（表６）は、約35kDのタンパク質に属する。

F45（表７）は、約29kDのタンパク質に属する。

F74（表８）は、約64kDのタンパス質に属する。

記述された部分的配列を用いて、上記の部分的配列の
ための完全な遺伝子が容易にクローニングできる。

したがって、表１、２および６に示された部分的配列
を、それらに属する遺伝子のコードcDNA領域を完成する
ために用いた。この目的のために、cDNA F61、F34およ
びF76を放射性標識して、cDNA遺伝子バンクのスクリー
ニングのためのプローブとして用いた。表１からの配
列、F61、をP66タンパク質のcDNAを単離するために用い
た。表２からの配列、F34、をP68タンパク質のcDNAを単
離するために用いた。P35タンパク質のcDNAの単離のた
めに、表６からの配列、F76、を用いた。これらの配列
との相同性を有する組換えクローンを単離して、挿入さ
れたトキソプラズマ・ゴンディ特異性cDNA領域の配列決
定によって構造的に特徴付けした。P35、P66およびP68
タンパク質の構造遺伝子の完全な範囲のヌクレオチド配
列は、表９〜11に示される通りである。

免疫学的に反応性の部分領域（免疫原性部分）を、例
６および７においてP35、P66およびP68について代表と
して記述する。他の免疫原性タンパク質領域を、同様の
方法で試験または決定する。

したがって、本発明は以下のことに関する。

（ａ）上記クローンの単離された挿入されたDNA配列
であって、それらの転写産物および特殊の構造遺伝子を
完成するための残りの配列を含む。

（ｂ）これらの配列の全部または一部を含む、DNA構
造物およびベクター。

（ｃ）この型のDNAによって形質転換された原核また
は真核細胞。

（ｄ）この型の形質転換細胞によって発現されたポリ
ペプチドまたはこれらの免疫原性部分であって、診断お
よび治療または予防のためのこれらの使用を含む。

（ｅ）これらに属するアミノ酸配列。

（ｆ）（ｄ）に記述のポリペプチドに対する抗体であ
って、トキソプラズマ・ゴンディ感染の診断および治療
または予防のためのこれらの使用を含む。

（ｇ）（ｄ）に記述のポリペプチドまたはそれらの免
疫原性部分の、遺伝子工学による調製法。

本発明は、さらに諸例および特許請求の範囲に記述さ
れる通りである。

例1: トキソプラズマ・ゴンディのλgt11−cDNA発現遺伝子バ
ンクの構築１）ポリ（Ａ）＋RNAの単離コンフルエントなHep−２細胞培養物を、Bravenyら
（Tropenmed.Parasitologic、29、432−434、1978）に
よる記載の方法でトキソプラズマ・ゴンディ寄生虫で感
染させた。感染後４日目から、トロホゾイトを培養上清
の遠心分離によって集めた。沈澱させたトキソプラズマ
・ゴンディ細胞の約500mg（湿重量）からの全RNAを、Ch
omczynskiおよびSacchi（1987）（Analytical Biochemi
stry、162、156−159）の修飾法によって以下のように
単離した。細胞を20mlの溶液Ｄ（4Mグアニジニウムイソ
チオシアネート、0.5％サルコシル、25mMクエン酸ナト
リウム（pH7.0）、0.1Mメルカプトエタノール）中で溶
解して、2mlの2M酢酸ナトリウム（pH4.0）、20mlのフェ
ノール（水で飽和にしたもの）および4mlのクロロホル
ムを添加した後、混合物を激しく振盪して、氷上で20分
間冷却した。遠心分離工程（30分間、４℃、15000g）の
後、RNAを１容量のイソプロパノールで１時間４℃で水
相から沈澱させて、次いで遠心分離（20分間、４℃、15
000rpm）によって沈澱物が得られた。沈澱物を600μｌ
のＤ溶液に再懸濁させて、次いでRNAを5.7M CsCl溶液
（3ml）を通して遠心分離した（12時間、35000rpm、10
℃）。沈澱物を500μｌの再蒸留水（RNAseを含まない）
に再懸濁させて、RNAを1/10容量の酢酸ナトリウムおよ
び２容量のエタノールで２時間−20℃で再び沈澱させ
て、遠心分離によって沈澱させた（エッペンドルフ遠心
分離機中で10分間、14000rpm、４℃）。ポリ（Ａ）⁺RNA
をオリゴ（dT）−セルロース（ファルマシア）カラム
（10mMトリス塩酸（pH7.5）、0.5M KCl中の0.5gオリゴd
T−セルロース）を次のようにして濃厚富化した。LiCl
（最終濃度0.5M）を、RNA溶液を変性（70℃、10分間）
させた後、加えて、混合物をオリゴdT−セルロースカラ
ムに通した。カラムを20mlの結合緩衝液（10mMトリス塩
酸（pH7.5）、0.5 MKCl）で洗浄した後、ポリ（Ａ）⁺R
NAを10mlの再蒸留水（double−distilled water）で溶
出して、1/20容量の8M LiClおよび2.5容量のエタノール
で−20℃で４時間沈澱させて、次いで遠心分離（6000rp
m、４℃、30分間）によって沈澱させて、70％エタノー
ル中で洗浄して、乾燥させた。

２）cDNA合成 cDNAの合成を、Gublerの修飾法（U.Gubler:Nucl.Acid
s Res.16、2726、1988）によって行った。５μｌのトキ
ソプラズマ・ゴンディポリ（Ａ）⁺RNAを変性（５分間、
70℃）させた後、最初のDNA鎖の合成を、50mMトリス塩
酸（pH8.3）、75mM KCl、50mM DTT、15mM MgCl₂、0.5
［mM］dNTP、５μｇのオリゴdTプライマー（ベーリンガ
ー、マンハイム）および800ユニットの逆転写酵素（BR
L）の存在下で50μｌの混合物で37℃で１時間で行う。
次いで、反応を70℃で10分停止させて、８μｌの1Mトリ
ス塩酸（pH7.5）、32μｌの1M KCl、1.6μｌの1M MgC
l₂、1.6μｌの1M DTT、50ユニットの大腸菌DNAポリメラ
ーゼＩ（ベーリンガー、マンハイム）、3.5ユニットのR
NAseH（ベーリンガー、マンハイム）を最終容量320μｌ
で添加後、第二のDNA鎖の合成を始める。混合物を16℃
で１時間および22℃で１時間インキュベートする。次い
で、cDNAを２容量のエタノールおよび1/10容量の酢酸ナ
トリウムで−70℃で10分間で沈澱させて、遠心分離によ
って沈澱物を得て、乾燥させる。沈澱物を100μｌのT4D
NAポリメラーゼ緩衝液（20mM（NH₄）₂SO₄、50mMトリス
塩酸（pH8.8）、10mM MgCl₂、50μmdNTP）に再懸濁させ
て、10ユニットのT4DNAポリメラーゼ（ベーリンガー、
マンハイム）を加えることによってcDNA末端の埋填反応
を開始する。混合物を37℃で10分間インキュベートし
て、100μｌのフェノール／クロロホルム（1:1）の添加
後にフェノール処理する。次いで、cDNA溶液をSephacry
l S200カラム（ファルマシア）を通して遠心分離する。

cDNAを２容量のエタノールおよび1/10容量の酢酸ナト
リウムを用いて溶出液から沈澱させて、遠心分離して、
乾燥させる。

３）cDNAの、EcoR Iアダプターとの連結乾燥させたcDNA（１μｇ）を30μｌの連結緩衝液（30
mMトリス塩酸（pH7.8）、10mM MgCl₂、0.5mM ATP、10mM
DTT）に再懸濁して、40pmolのEcoR Iアダプター（プロ
メガ）および7.5ユニットのT4DNAリガーゼを加えて、混
合物を14℃で15時間インキュベートした。リガーゼの不
活化（10分間、70℃）の後および４μｌのキナーゼ緩衝
液（0.7Mトリス塩酸（pH7.6）、0.1M MgCl₂、50mM DT
T）、２μｌの0.1mM ATPおよび10ユニットのT4ポリヌク
レオチドキナーゼ（ファルマシア）の添加、それに続く
キナーゼ処理（30分間、37℃）の後、cDNAを再びSephac
ryl S200カラムを通して遠心分離して、次いで、上記の
ようにエタノールおよび酢酸ナトリウムで沈澱させる。

４）λgt11EcoR I断片とのcDNAの連結、インビトロパッ
ケージングおよびλgt11のトランスフェクション連結反応のために、約50ngのキナーゼ処理したcDNAを
10μｌの混合物（66mMトリス塩酸（pH7.6）、6.6mM MgC
l₂、1mM ATP、5mM DTT）に入れた１μｇの脱燐酸化した
λgt11EcoR I断片に加えて、3Weiss単位のT4DNAリガー
ゼ（ベーリンガー、マンハイム）の添加後、混合物を14
℃で15時間インキュベートした。５μｌのこの混合物
を、パッケージングミックス製造者（Giga Gold Mix、S
tratagene）の説明書に従って行われたインビトロパッ
ケージング反応において用いる。

大腸菌Y1090株のトランスフェクションの後、組換え
ファージの力価を決定した。全部で約10⁶個の組換えフ
ァージが得られた。

例2: 高度免疫ウサギ抗−トキソプラズマ・ゴンディ血清を用
いる、λgt11発現遺伝子バンクのスクリーニングイムノブロットにおける非特異的反応を減らすため
に、抗−大腸菌抗体を先ず、ウサギ抗−トキソプラズマ
・ゴンディ血清から既知の方法（L.S.Osaki:J.Immun.Me
thod.89、213−219、1986、Promega Biotec、ProtoBlot
Immunoscreening System、Technical Manual、1986）
にて吸着させた。この目的のために、λgt11野生型ファ
ージを、全部で30枚のLB寒天プレートに90mmの寒天プレ
ート当り、9mlのLB軟寒天/0.4％マルトース/10mMMgSO₄
に５×10⁴PFUの密度で分布させた。37℃で２時間インキ
ュベートした後、各々の場合に10mM IPTG（イソプロピ
ルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド）中で平衡にした乾
燥円形ニトロセルロースフィルターでプレートを覆っ
て、さらに２時間インキュベートした。次いで、フィル
ターを反転させて、寒天上で２時間再びインキュベート
した。次いで、フィルターを５％脱脂粉乳/TBS緩衝液
（TBS:150mM NaCl、50mMトリス塩酸（pH8.0））中で室
温で10分間インキュベートして、５％脱脂粉乳/TBS中で
1/100に希釈した100mlのウサギ血清中に移した後、４時
間室温でインキュベートした。この前吸着させた希釈血
清を、スクリーニング実験およびウエスタンブロットの
双方に使用した。全部で６×10⁵個のλgt11cDNAバンク
の組換えファージを、この血清とともにR.Y.Youngおよ
びR.W.Davis（Proc.Natl.Acad.Sci.80、1194、1983）の
方法によるスクリーニングに供した。この目的のため
に、大腸菌K12Y1090株の培養細胞を、上記のように、組
換えλgt11ファージ（３×10⁴ファージ/100μlY1090培
養液）でトランスフェクトさせて、軟寒天プレート（全
部で20プレート）上に分布させた。

７℃で２時間インキュベートした後、プレートを、各
々に、10mM IPTGに浸して乾燥させたニトロセルロース
フィルターで覆って、さらに２時間インキュベートし
た。寒天プレート上のフィルーターの位置を印付けした
後、フィルターを注意深く引き上げて、250mlの５％脱
脂粉乳/TBS緩衝液中で10分間室温で振盪した。次いで、
フィルターを新鮮な脱脂粉乳/TBS緩衝液中に移して、４
℃で一晩保持した。

フィルターを250mlの脱脂粉乳/TBS緩衝液中でさらに
インキュベートした後、これらを100mlの前吸着させた
ウサギ抗−トキソプラズマ・ゴンディ血清と室温で１時
間軽く振盪した。次いて、フィルターを３回、各々、25
0mlのTBSで室温で10分間洗浄して、脱脂粉乳/TBSで1/30
0に希釈した250mlの抗−ウサギIgG/アルカリホスファタ
ーゼIgG抱合物（Behringwerke、Marburg）とともに室温
でさらに１時間振盪した。フィルターを洗浄（250mlのT
BSで３回、各々10分間室温で振盪する）の後、これらを
250mlのアルカリホスファターゼのための基質溶液（200
μg/mlの５−ブロモ−４−クロロ−インドキシホスフェ
ート（XP）（Bachem社製、注文番号:M1205）のｐ−トル
イジン塩、500μg/mlの４−ニトロテトラゾリウムクロ
リドブルー（シグマ社製：注文番号:N6876））中で15分
間再びインキュベートした。ファージプラークの周りに
形成される環の呈色域から認められる血清陽性（seropo
sitive）クローンを、ペトリ皿上の領域と照合して、パ
スツールピペットを用いてくり抜き、1mlのSM緩衝液中
に再懸濁させた。陽性ファージプラークの各クローン
を、２回のさらなるスクリーニング工程で調製した。全
部で83個の血清陽性クローンを単離した。これらクロー
ンをさらに次のように特徴付けした。

１）cDNAクローンの免疫学的特徴付け２）クローニングされたcDNA挿入物の構造的特徴付けａ）DNA−DNAドットブロット分析ｂ）転写解読枠を調べるための、cDNA挿入物の部分的配
列決定ｃ）lacZまたはLacZ′（部分的に欠失したβ−ガラクト
シダーゼ誘導体）との遺伝子融合物としての、クローニ
ングされたcDNAの発現３）血清陽性cDNAクローンの免疫学的特徴付け遺伝子バンクの血清陽性クローンを、「クローン特異
性」血清（これはcDNAクローンの組換え融合タンパク質
上の吸着によってポリクローナルウサギ血清から得られ
た血清を意味する）を用いて免疫学的に特徴付けした。
これら血清を、Ozakiら（J.Immun.Method.89、213−21
9、1986）の方法により、次のように調製した。各々、
５×10⁴PFCの各cDNAクローンを、大腸菌Y1090細胞に吸
着させた後に、軟寒天中でLBプレートに分布させて、２
時間インキュベートした後、各々、10mM IPTGで前処理
しておいた１枚のニトロセルロースフィルターで覆っ
て、例２に記述のように処理を続けた。このようにして
前処理したクローン当り３枚のフィルターを、各々、前
吸着させたウサギ血清中で４時間インキュベートして、
次いで、50mlのTBSで10分間洗浄した（緩衝液を３回交
換）。フィルターに結合した抗体を全部で15mlの0.1Mグ
リシン/HCl緩衝液（pH2.5）を用いて室温で５分間洗い
出して、3mlの1Mトリスで中和した。脱脂粉乳を最終濃
度５％になるように加えた。

単一特異性血清を20の各々のクローンから生じさせ
た。すべての血清陽性クローンの組換えタンパク質に対
するこれら血清の免疫反応性をドットブロットン実験に
おいて試験した。組換えタンパク質が血清と交差反応し
たクローンを、クローン群に一緒にグループ分けした。
サザンドットブロット分析において、³²P−標識した挿
入DNAのみが上記の血清学的データの結果として一つの
グループに入れられたクローンDNAと相同性を示した。
一つのクローンを各グループから選択して、ウエスタン
ブロッドにおいてヒト抗−トキソプラズマ・ゴンディ血
清を用いて試験した。この目的のために、クローンDNA
の挿入断片を、適当な発現ベクター中にサブクローニン
グするかまたは、大腸菌K12Y 1089株を特定の組換えλg
t11誘導体で溶原化させた。

例4: β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質の発現免疫反応性を調べるためには、λgt11クローンF2、F2
9、F28、F34、F61およびF76のcDNA断片を、部分欠失し
たLacZ誘導体との遺伝子融合物としてpSEMシリーズ（Kn
appら:Biotechniques、８、280、1990）のベクター中に
サブコローニングして、融合タンパク質の発現を大腸菌
W3110 lac I^aL8（BrentおよびPtashne:Proc.Natl.Acad.
Sci.、78、4204−4208、1981）中でIPTGの添加によって
誘導した。クローンF45およびF74の融合タンパク質の発
現のために、大腸菌Y1089株を、双方のλgt11誘導体で
溶原化させて、次いで、融合タンパク質を既知の方法
（Huynhら:Glover、DNA CloningVolume I、49−78、IRL
Press、Oxford、1985）で誘導した。全細胞抽出物から
のタンパク質を、IPTG誘導後、SDS PAGE（10％）で電気
泳動的に分画して、ニトロセルロースに移した。組換え
タンパク質の反応性を、ヒトIgGおよびIgM血清を用いて
ウエスタンブロットにおいて確認した。最後に、このよ
うにして特徴付けしたクローンを配列決定した。

例5: cDNA断片の配列決定 cDNA断片の配列決定を、「KSプライマー」（プロメ
ガ）を用いてSangerのジデオキシ法（Proc.Natl.Acad.S
ci.74、5463、1977）によって行った。クローンF2、F2
9、F34、F28、F45、F61、F74およびF76の挿入断片を、E
coR Iを用いて組換えλgt11DNAから切り出して、ベクタ
ーブルースクリプトKSのEcoR I切断部位に挿入の後、大
腸菌XL1−ブルー株（Stratagene、San Diego）中に形質
転換させた。これら組換えプラスミドの１本鎖DNAを、
ヘルパーファージVCSによるクローンの感染の後、既知
の方法（Stratagene、San Diego）で単離した。クロー
ニングされた断片の位置方向によって、cDNAの５′また
は３′末端の配列が得られる。

表１〜８は、上記クローンの翻訳解読枠（表１〜６）
および部分的ヌクレオチド配列（表１〜８）を示す。

例6: 組換えトキソプラズマ・ゴンディ抗原rP35、rP66および
rP68の、診断的適合性抗原P35、P66およびP68の構造遺伝子の領域からの部
分的配列を、大腸菌W3110中でpSEM発現ベクター（Knapp
ら:Biotechniques、８、280、1990）を用いて発現させ
た。発現産物は、Ｃ末端に挿入特異性融合タンパク質を
含む375個のアミノ酸のＮ末端β−ガラクトシダーゼ誘
導体からなる。融合タンパク質の合成は、Knappら（Bio
techniques、８、280、1990）による記述のようにIPTG
によって誘導され得る。ウエスタンブロット実験のため
に、組換え大腸菌W3110誘導体の全細胞抽出物を、IPTG
誘導後、SDS PAGEで分画した。タンパク質をニトロセル
ロースペーパーにを移して、特異的血清サンプルおよび
抱合物（抗ヒトIgG/アルカリホスファターゼ）とともに
インキュベートして、標準法（Sambrookら:Molecular C
loning,Cold Spring Harbor Laboratory Press、1989）
に従って染色した。上記のトキソプラズマ・ゴンディタ
ンパク質の次の部分を発現させた。

rP35:塩基対363−527＊：ハイブリドプラスミドpPS76に
含まれる rP68:塩基対176−1927＊：ハイブリドプラスミドpPS34
に含まれる rP66:塩基対１−2074＊：ハイブリドプラスミドpPS61に
含まれる（＊表９〜11中のデータのヌクレオチド配列に対応す
る）。

急性または慢性トキソプラズマ・ゴンディ感染を有す
る患者のヒト血清からの特異的IgGおよびIgM抗体の反応
性を、ウエスタンブロット実験において調べた。これら
実験の結果は表12に要約される通りである。このよう
に、三つのハイブリドタンパク質、rP35、rP66およびrP
68の全てが、特異的IgG抗体の検出に適している。rP35
については特に強調されるべきである。25/26血清はIgG
ウエスタンブロットにおいてハイブリドタンパク質と反
応した。rP68を用いて、特異的IgG抗体は27/31血清にお
いて認められた。rP35およびrP68の両融合タンパク質
は、検出可能な特異的IgM抗体力価を有していた急性血
清（ｎ＝21）からのIgG抗−トキソプラズマ・ゴンディ
抗体と例外なく反応した。このために、rP35およびrP68
の双方は、トキソプラズマ症の急性期におけるIgG抗−
・トキソプラズマ・ゴンディ抗体の検出のためのマーカ
ーとして、特に適している。

rP66はIgMブロットにおいて試験された21個の血清の
ほとんど反応し、したがって、この免疫グロブリンクラ
スの特異的抗体の検出のためのマーカーとして適してい
る。

例7: 組換えトキソプラズマ・ゴンディタンパク質rP35および
rP68の、ELISAにおける適合性特異的IgG抗体との組換えトキソプラズマ・ゴンディ
タンパク質rP35およびrP68の反応性をELISAにおいて調
べた。二つのタンパク質を、一緒にまたば各々別々にEL
ISAプレートを被覆するための固相抗原として用いた。
二つのハイブリドタンパク質を、大腸菌から次のように
単離した。

プラスミドpPS76またはpP34を含む組換え大腸菌W3110
株の一晩培養物を、２リットルのＬ−ブロス/100mg/ml
アンピシリン中で1/50に希釈して、激しく振盪しなが
ら、OD600＝0.7になるまで37℃で増殖させた。IPTG（最
終濃度1mM）の添加後、培養物を37℃でさらに３時間激
しく振盪して、遠心分離して、細胞沈澱物を150mM NaCl
/50mMトリス塩酸（pH8.0）/1mg/mlリゾチーム中で溶解
して、37℃で10分間インキュベートした。細胞破砕のた
めに、細胞懸濁液をフレンチプレスで２回処理した。破
砕された細胞を遠心分離（10000rpm、10分間、４℃）し
て、難溶性封入体として存在する融合タンパク質を含む
沈澱物を種々の濃度の尿素溶液（1M〜6M尿素）で連結し
て洗浄した。この工程において、最初に沈澱物を30mlの
1M尿素/10mMトリス/1mM EDTA（pH8.0）（TE）中で室温
で１時間攪拌した。遠心分離（10000rpm、10分間、４
℃）の後、沈澱物を上記のように2M尿素に溶解して、イ
ンキュベートした。次いで、これらインキュベーション
は、3M、4M、5Mおよび6M尿素で続けられた。遠心分離工
程の後の上清を保存して、これに溶解性のタンパク質
を、SDS PAGEで分析した。融合タンパク質に加えて大腸
菌タンパク質の僅かな混入を含むのみ（約75％融合タン
パク質）であるこれら上清を、ELISAプレートの被覆に
さらに用いた。これら上清を1M尿素/0.1％SDSに対して
４℃で72時間透析した。ELISAプレートの被覆のため
に、透析したサンプルのタンパク質濃度をPBS（pH7.0）
で２μg/mlに調製した。被覆を、100μl/ウェルを用い
て４℃で一晩行った。次いで、血清試料をプレートに供
する前に、プレートをAP洗浄緩衝液（ベーリング、注文
番号:1353115）を用いて３回洗浄した。

血清サンプルにおける抗−大腸菌抗体の吸着：まず、抗−大腸菌抗体を、血清サンプルから除去し
た。この目的のために、大腸菌W3110の一晩培養細胞を
遠心分離して、沈澱物を5mlのPBS（pH7.0）中に再懸濁
させた。細胞を超音波処理（音波処理３回、Branson so
nifierを７にセット）によって溶解させて、DNAse I
（最終濃度１μg/ml）を加えた後、37℃で10分間インキ
ュベートした。

ヒト血清および溶解物抗原を、1:1の比で混合して、P
BS（pH7.0）中で1/50に希釈して、室温で30分間振盪し
た。遠心分離後、５％脱脂乳/PBS（pH7.0）を上清に加
えて（最終濃度１％）、その100μl/ウェルをELISAプレ
ート上で37℃で１時間インキュベートして、これらを３
回AP洗浄緩衝液で洗浄した。

次いで、AP抱合物希釈緩衝液（ベーリング注文番号:1
332115）中で1/70に予備希釈した100μl/ウェルの抗−
ヒトIgG/AP抱合物（ベーリング注文番号:OSDH 04/05）
を、37℃で１時間インキュベートした。プレートを３回
AP洗浄緩衝液で洗浄して、100μl/ウェルのAP基質溶液
（ベーリングAP基質錠剤、注文番号:OSCX96、ベーリン
グ10％ジエタノールアミン、注文番号:0243115、基質溶
液:10mlの10％ジエタノールアミン中に２錠）とともに3
7℃で30分間インキュベートして、基質溶液の吸光度を4
05nmで決定した。

血清変換された患者（患者A1）の９個の血清を、試験
に含めた。血清サンプルを、供与者から次の日に採取し
た。A:1988年８月９日、B:1988年８月18日、C:1988年８
月29日、D:1988年10月12日、E:1988年12月２日、F:1989
年１月13日、G:1989年２月28日、H:1989年５月12日、I:
1989年７月17日。証明し得るような感染は1988年７月31
日に起きた。表13に見られるように、第17日後に採取さ
れたヒト血清Ｂは、rP35およびrP68に対する特異的IgG
抗体を既に示している。これに対して、この血清サンプ
ルは、古典的な非組換えELISAシステム（IgG検出）にお
いては陰性であった。

さらに急性トキソプラズマ症の供与者の、特異的IgM
抗体を含む、30個のヒト血清を、rP35およびrp68に対す
るIgG抗体についてELISAにおいて分析した。これらヒト
血清は、固相に組換え抗原rP35およびrP68の双方を含む
ELISAにおいて例外なく反応した。さらに、供与者から
の150個の血清を、特異的IgG抗−rP35および抗−rP68抗
体について分析した。同じ抗血清を、Enzygnost^Rトキソ
プラズマ症（IgG、製造者:Behringwerke AG）において
特異的IgG抗体について分析して、二つの試験の結果を
互いに比較した。これによって、Enzygnost^Rにおいて陽
性であった血清はrP35/rP68ELISAにおいても陽性であっ
たことが示された。抗−トキソプラズマ・ゴンディ陰性
血清についてもまた、rP35/rP68ELISAからのデータは、
Enzygnost^RELISAからのものと一致した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩＣ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/569 ＡＧ０１Ｎ 33/569 Ｃ１２Ｎ 15/00 (72)発明者ハンス、キューペルドイツ連邦共和国マールブルク、ワンコプクシュトラーセ、12 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07K 14/45 A61K 39/012 C12N 15/00 C12P 21/02 ZNA C12P 21/08 C12Q 1/68 G01N 33/569 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】次の表１および10に示されるアミノ酸配列
を含むまたは該表のDNA配列によってコードされるタン
パク質またはその血清反応性部分。
【請求項２】請求項１に記載のタンパク質をコードす
る、核酸。
【請求項３】請求項２に記載の核酸を含む、プラスミ
ド。
【請求項４】請求項３に記載のプラスミドによって形質
転換された原核または真核細胞。
【請求項５】請求項１に記載のタンパク質に対するモノ
クローナルまたはポリクローナル抗体。
【請求項６】請求項３に記載のプラスミドによって原核
または真核細胞を形質転換させて、このプラスミドで挿
入されたDNAを発現させて、発現産生物を単離すること
を特徴とする、請求項１に記載のタンパク質の調製法。
【請求項７】請求項１に記載のタンパク質を含んでな
る、トキソプラズマ症感染の検出のための診断剤。
【請求項８】請求項２に記載の核酸を含んでなる、診断
剤。
【請求項９】請求項５に記載の抗体を含んでなる、診断
剤。
【請求項１０】P35および／またはP68または該タンパク
質の免疫原性部分を各々含んでなる、請求項７に記載の
診断剤。
【請求項１１】試験される体液を請求項７または10に記
載の診断剤を用いて試験することを特徴とする、トキソ
プラズマ症感染の検出法。