PT94253A - Processo para o isolamento, imobilizacao e utilizacao de enzimas para a preparacao de lipase a partir de candida rugosa - Google Patents

Description

RHONE-POULENC INC. "PROCESSO PARA O ISOLAMENTO, IMOBILIZAÇÃO E UTILIZAÇÃO DE ENZIMAS E IS0ZIMA5 PARA A PREPARAÇÃO DE LIPA5E A PARTIR DE CANDIDA RUGOSA" A presente invenção diz respeito ao isolamento, imobilização 0 utilização de enzimas e isozimas para a prepar£ ção de lipase a partir de Candida rugosa.

ANTECEDENTES DA PRESENTE INVENÇÃO

Durante alguns dos últimos anos, foi alvo de atenção considerável a utilização de lipases ou de estearases para hidrolisar estereosselectivamente os ésteres. Ver Cambou B. and A.M. Klibanov, Lipase-Catalyzed Production of Optically Active Acids via Asymmetric Hydrolysis of Esteres/Effect of the Alcohol Moiety, Appl Biochem & Biotech 3_, 225-260 (1984); Dahod, S.K. and P. Siuta-Mangano, Resolution of Racemic Mixture of Aliphatic Acid Esters, Stauffer Chemical Company, European Patent Application 86104201.8 (0326-1986) (hereinafter Dahod, EPA); Dahod, S.K. and P. Siuta-Mangano, Carbon Tetrachloride-Promoted Stereo Sele£ tive Hydrolysis of Methyl-2-Chloropropionate by Lipase, Biotech. & Bioeeg. 30, 959-999 (1987) (hereinafter Dahod Biotech); and

Walts, A.E., Fox, E.M., and C.B. Jackson, R-Glycidyl Butyrate: Evolution of A Laboratory Procedure to an Industrial Process, Biotech USA 1987, Online International, London. Este facto deve-se ao desejo de se produzirem intermediários agrícolas ou farmacêuticos com uma estereoquímica particular em que 0 enan-tiámero indesejável possuísse pouca ou nenhuma actividade, não obstante pudesse ser responsável por uma toxicidade indesejável. Ver Calton, G.J., Use of Microorganisms and Enzymes in the -2- -2-

\ \

Synthesis and Production of Optically Active Agricultural Chemicals, ACS Symposium Series 334 Biotechnology in Agricultural Chemistry, Amer. Chem. Soc., Washington D.C., 1987. Integram-se nesta categoria diversos derivados do ácido propiá-nico que se utilizam nos campos agrícola e farmacêutico. See Dahod EPA, Dahod Biotech; and Calton, and Caldwell, J., Hutt, A. J., and Fournel— Gigleux S., The Metabolic Chiral Inversion and Dispositional Enantioselectivity of the 2-Arylpropionic Acids and Their Biological Consequences, Biochemicai Pharmacology 37, 105-114 (1988).

Apesarde se ter ensaiado um grande número de lipases para a resolução dos alcoóis racémicos e/ou dos ácidos carboxílicos, estas geralmente, não apresentaram um grande sucesso devido às enantiospecificidades serem inferiores a 95%. Aceita-se, de um modo geral, que é necessária uma selectividade enantiomérica su perior a 95% para um processo industrial significativo. Ver Akiyama, A., Bednarski, M., Kim, M.-J., Simon, E.S., Waldmann, H. and Whitesides, G.M., Enzymes in Organic Synthesis, Chemtech 1988, 627-634 (daqui em diante Whitesides). Apenas um pequeno número de lipases referidas literáriamente, apresenta um elevado grau de estereospecificidade. Ver Dahod EPA; Dahod Biotech;

Walts, Nissan Chem Ind Japanese Pat Appl 8 6-20283/31; Stokes, T.M. and A.C. Oehlschlager, Enzyme Reactions in Apoiar Solvents:

The Resolution of (Í)-Sulcatol With Porcine Pancreatic Lipase,

Tetra. Lett. 28, # 19, 2091-2094 (1987); Kodera, Y., Takahashi, K., Nishimura, H., Matsushima, A., Saito, Y., and Y. Inada,

Ester Synthesis from -substituted Carboxylic Acid Catalyzed by Polyethylene Glycol-Modified Lipase From Candida rugosa in Benzene, Biotech. Lett. 8^, 881-884 (1986); and Klibanov, A.M. -3- e Kirchner, G. Enzymatic Production of Optical Isomers of 2--Halopropionic Acids, U.S. Patent 4,601,987, July 22, 1986.

Também se examinaram exaustivamente as lipases para a produção de ésteres ópticamente activos a partir de misturas de ácidos e/ou alcoóis e, apresentaram uma boa enantioselectividade para a esterificação com alcóois de cadeias longas. Ver Klibanov, A.M. and Kirchner, G., Enzymatic Production of Optical Isomers of 2-Halopropionic Acids, U.S. Patent 4,601,987, Jul 22, 1986; and Cambou B. and Klibanov, A.M., Preparative Production of Optically Active Esters and Alcohols Using Esterase--Catalyzed Stereospecific Transesterif_i cation in Organic Media, J. Am. Chem. Soc. 106, 2687-2692 (1984).

Utilizou-se extensivamente a lipase de Candida Rugosa (conhecida primeiramente, como Candida cylindracea) que apresejn tou uma estereoespecificidade limitada na hidrélise de alguns ésteres. Este enzima encontra-se comercialmente disponível a partir de um vasto número de fontes, incluindo a Sigma, Meito Sangyo, Biocatalysts, Enzyme Development Corp e Amano. A sua pr£ dução baseia-se na extracção a partir de caldos de fermentação e de células de C. rugosa ATCC 14830. 0 trabalho anterior demonstrou que a lipase da C. rugosa (Sigma) não proporcionava uma hidrólise estereoespecifica dos ésteres metllicos do ácido 2-cloropropiónico, mas proporcionava um elevado excesso enanti£ mérico na hidrólise do éster octilico do ácido 2-cloropropióni-co. Ver Klibanov, A.M. and Kirchner, G., Enzimatic Production of Optical Isomers of 2-Halopropionic Acids, U.S. Patent 4,601,987, Jul 22, 1986. Para além disso, demonstrou-se que a síntese do éster octilico era absolutamente estereoespecifica. Ver Cambou B. and Klibanov, A.M., Preparative Production of Optically Active

a' 5 Λ

Esters and Alcohols Using Esterase-Catalyzed Stereospecific Transesterification in Organic Media, J. Am. Chem. Soc. 106, 2687-2692 (1984).

Também se descobriu que, numa mistura a duas fases aquosa/orgânica, a baixas temperaturas, (4°C), se podia obter uma elevada pureza óptica (90¾ ee) apds hidrólise a 30¾. De um modo interessante observou-se que os dissolventes altameji te clorados eram superiores nesta hidrólise e que o CCl^ actjl vou o enzima na presença de substracto, enquanto que na ausência de - substracto o CCl^ desactivou rápidamente o enzima. Ver Dahod e Siuta-Mangano. Também se demonstrou que a pureza óptica obtida na reacção era uma função da extejn são da hidrólise, de acordo com as previsões anteriores e que a pureza óptica decresceu rapidamente à medida que a reacção se aproximava da hidrólise completa de um dos enantiómeros.

Sih e colaboradores (Sih, C. J., Gu, Q-M,Fulling, G.,

Wu, S.-H and Reddy, D.R. J. Indus. Micro Suppl 3, Develop Ind Micro., 1988, 29, 221-229; Gu, Q.-M., Chen, C.-5. and Sih, C. J. Tet Lett 1986, 27, 1763-1766) descobriram uma excelente re^ solução do enantiómero (S) dos ácidos 2-arilpropiónico, depeji dendo da natureza do substituinte arilo. Para o ácido 2-(6-me-toxi-2-naftil)-propiónico (naproxen) e para o ácido p-isobutil--hidratrópico (ibuprofen), a enantioespecificidade da lipase de Candida rugosa era superior a 98¾ ee. No entanto, para o ácido 2-(3-benzoil-fenil)-propiónico (Cetoprofen ), o ee foi apenas de 51¾.

Os trabalhadores da Nissan Chemical Industries (Patejn te de invenção japonesa 255917, 1986 da Nissan Chem Ind) tentaram tirar proveito da hidrólise estereosselectiva através -5- / de uma preparação de lipase Candida ruqosa para a produção de um ácido ariloxi-propiónico, (R)-(+)-2-(4-hidroxi-fenoxi)-pro-piónico (R-HPPA); no entanto, apenas obtiveram um ee de 87¾ nu[ ma hidrólise a 21% em solução aquosa.

Fez-se referência à lipase de Candida rugosa como se se tratasse de um único enzima, tendo em vista a sua fonte, apie sar de ter sido publicada recentemente a separação do enzima bruto. Ver Abramowicz, D. A. and Keese, C.R., Enzymatic Transeis terifications of Carbonate in Water-Restricted Environments, Biotech. Bioeng. 22.’ 14-9-156 (1989). No entanto á sabido, através da literatura existente, que muitos enzimas contêm um detejr minado número de isózimas diferentes com diferentes especificidades. Isolaram-se os isózimas da estearase do fígado de um suí^ no. Ver Farb, D.H., Multiple Forms of Microsomal Porcine Liver Esterase: I. Isolation and Properties, Estimation of Secondary Structure.il. pH Dependence of Rate Contacting Groups, Diss Ab.Int B 3J3, 5900-5901 (1978); Farb, D. and Jencks, W.P., Dependence on pH of the Activity of Pig Liver Esterase. Arch. Biophy. 203. 227-35 (1980); and Guanti, G., Banfi, L., Narisano, E., Riva, R. and Thea, 5., Enzymes in Asymmetric Synthesis: Effect of Reaction Media on the PLE Catalyzed Hydrolysis of Diesters, Tet. Let. 27, 4639-4642 (1986). Dependendo do substracto, cada um destes isózimas pode reagir de modo diferente às alterações nas condições de reacção e pode proporcionar estereoespecificidades diferentes. Contudo, não existe qualquer indicação da existência de isózimas na lipase da C. rugosa, apesar de se ter inves_ tigado o enzima extensivamente, utilizando até, a focalização isoeléctrica. Ver Gerlach, D., Schneider, S., Gollner, T., Kim, K. S., and Schreier, P., Screening of Lipases for Enantiomer -6- -6- ϊ .—

Resolution of Secondary Alcohols by Esterification in Organic Médium, Bioflavour ’87, Proc. Int. Conf., 1988 Walter de Gruyter & Co., Berlin. Não apresentando qualquer oposição aos esforços anteriores, existe ainda um âmbito considerável para se proporciona_ rem procedimentos melhorados para se hidrolisar estereosselecti^ vamente ou se trans-esterifiçarem ésteres ou para a esterifica-ção de ésteres ou de alcodis de acordo com meios enzimáticos.

Por exemplo, existe um interesse continuado na hidrólise enzimá tica do propionato de (R,S)-(+)-metil-2-(4-hidroxi-fenoxi) (HPPA--Me) para se produzir (R)-HPPA em quantidades superiores a 95% ee. 0 HPPA racémico é um valioso intermediário na produção de determinados herbicidas. Descobriu-se que mais de 95% da activi^ dade herbicida do etilo de quizalofop reside no isómero (R) que é sintetizado, de modo conveniente, a partir de (R)-HPPA. Por isso se reveste de considerável importância a possibilidade de resolver o éster racémico de HPPA de um modo económico, para pr£ duzir este intermediário em escala industrial. Um dos objectivos da presente invenção consiste em proporcionar tais aperfeiçoamentos dos procedimentos de hidrólise enzimática, esterificação e trans-esterificação. Tornar-se-ão evidentes, daqui em diante, outros objectivos.

SUMARIO DA PRESENTE INVENÇÃO A presente invenção proporciona processos para hidrolisar, de um modo estereosselectivo, misturas racémicas de ésteres de ácidos substituídos na posição 2, com determinadas preparações de lipase de Candida rugosa em sistemas aquoso/orgânicos, em que o ácido não é substituído na posição 2 por um átomo de

halogéneo. Estes processos são altamente estereosselectivos para a hidrólise. A presente invenção também contempla proces_ sos que envolvem a trans-esterificação de diversos ésteres e a esterificação de ácidos e de alcodis. A presente invenção iji clui, também, um processo para a produção de ácido R-2-(4-hidr£ xi-fenoxi)-propiónico com um excesso enantiomérico elevado, uti_ lizando um enzima. A presente invenção inclui, também, dois isó^ zimas altamente úteis, que se descobriu estarem presentes nas preparaçSes de lipase de Candida ruqosa e, um processo para a separação e purificação desses isózimas a partir da lipase de Candida rugosa, por cromatografia, bem como por focalização isoeléctrica. A utilização destes isózimas para hidrólise de é£ teres, trans-esterificação de ésteres e esterificação de ácidos constitui um outro aspecto da presente invenção. Para além dis-i so, proporciona-se a utilização destes isózimas para hidrolisar, esterificar ou trans-esterificar estereosselectivamente. Divul-gam-se métodos de imobilização e proporciona-se a utilização dos isózimas imobilizados bem como da lipase imobilizada da Candida rugosa. Também se proporciona um método para a purificação da actividade enzimática por imobilização. Para além disso, divulga-se um método para a utilização de agentes redutores para estabilizar as hidrólises enzimáticas. Também se descreve a ut.i lização de enzimas, isózimas e suas formas imobilizadas na presença de dissolventes orgânicos. Proporcionam-se processos para a produção estereosselectiva de ácidos 2-ariloxi substituídos e descreve-se a produção de ácido R-2-(4-hidroxifenoxi)-propióni-co utilizando isózimas. Descreve-se a produção estereo-selecti-va pelos isózimas dos ácidos 2-arilpropiónicos e também se proporcionam processos para a produção de S-cetoprofeno, S-ibupro- -8- / * Λ feno, S-fenoprofeno, ácido S-2-fenilpropidnico e S-indoprofeno, por esta via. Também se proporciona um método para aumentar a proporção ou a estereosselectividade de uma reacção mediada pela lipase.

De acordo com um dos aspectos da presente invenção, pr£ porciona-se um processo para hidrolisar, de um modo estereosse-lectivo, ésteres em ácidos num excesso enantiomérico elevado, quer com enzimas livres ou imobilizados num sistema orgânico aquoso com duas fases em que a fase orgânica consiste num dissolvente orgânico aromático e em que a posição dois do ácido n§o se encontra substituída por um átomo de halogéneo.

De acordo com outro aspecto da presente invenção, proporciona-se um processo para a produção de ácido R-2-(4-hidroxi-fénoxi)-propidnicocom enzimas de Candida rugosa.

Outros aspectos da presente invenção incluem o seguinte 1) um processo para melhorar a estabilidade de um enzima ou de um insdzima, utilizado na produção de ácido 2-(4-hidroxifeno xi )-propidnico, com a utilização de um agente redutor; 2) um processo para a purificação e separação de isdzimas a partir de preparaçSes de lipase de Candida rugosa, que consiste na utilização de cromatografia de permuta iónica, com um esquema de eluição adequado para separar os isdzimas da lipase. 3) um processo para purificar e separar os isdzimas da lip£ se de Candida rugosa utilizando focalização isoeléctrica; 4) um insdzima isolado da lipase de Candida rugosa e que possui a sequência aminoácida da extremidade amino Ní

Ala-Pro-Thr-Ala-U-Leu-Ala-Asn-Gly-V-

Thr-Ile-Thr-Gly-Leu-Asn-Ala-Ile-Ile-Asn-

Glu-Ala-Phe-Leu-Gly-Ile-W-X-Ala-Glu- -9-

Pro-Pro-Y-Z-Asn-P ha qual U, V, W, X, Y e Z representam aminoácidos e P representa o resíduo do peptido.

De um modo mais específico, e ainda de acordo com a presente invenção, proporciona-se um isdzima isolado, ref£ rido como CSC-1, e que possui a sequência aminoácida da extre^ midade N:

Ala-Pro-Thr-Ala-Lys-Leu-Ala-Asn-Gly-V-

Thr-Ile-Thr-Gly-Leu-Asn-Ala-Ile-Ile-Asn-

Glu-Ala-Phe-Leu-Gly-Ile-Pro-Phe-Ala-Glu-

Pro-Pro-Val-Gly-Asn-P na qual V representa um aminoácido e P representa o resíduo do peptido. Também de acordo com a presente iji venção, proporciona-se um isdzima isolado, referido como CSC-2, que possui a sequência aminoácida da extremidade N:

Ala-Pro-Thr-Ala-Thr-Leu-Ala-Asn-Gly-Asp-Thr-Ile-Thr-Gly-Leu-Asn-Ala-Ile-Ile-Asn-Glu-Ala-Phe-Leu-Gly-Ile-W-X-Ala-Glu-Pro-Pro-Y-Z-Asn-Leu-Phe-Ile-ZZ-Leu-P na qual W, X, Y, Z, e ZZ representam aminoácidos e P representa o resíduo do peptido.

Será evidente para o especialista na matéria que os isdzimas descritos antes podem obter-se de acordo com mé-

todos que envolvem o ADN recombinante, em que se tornem possíveis outros métodos de isolamento. Também é evidente que se podem efectuar pequenas alterações na sequência de aminoácidos menores na estrutura dos isézimas anteriormente descritos, que envolvem o ADN recombinante, sem se afectar a natureza da acção e a especificidade dos isézimas, embora alterando a sequência aminoácida anteriormente dada; 5) um processo para a hidrólise de ésteres na presença de um isdzima de lipase; 6) um processo para a esterificação de ácidos ou de alcoóis na presença de um isézima de lipase; 7) um processo para a trans-esterificação de ésteres na presença de um isézima de lipase; 8) um processo para se hidrolisarem estereosselec-tivamente, ésteres na presença de um isézima de lipase; 9) um processo para se esterifiçarem estereossele£ tivamente ácidos ou alcoóis na presença de um isdzima de lipase; 10) um processo para efectuar a trans-esterificação de ésteres, estereosselectivamente, na presença de uma isézima de lipase; 11) processos para se imobizarem os enzimas e isó-zimas da lipase de Candida rugosa; 12) processos para se utilizarem os enzimas imobilizados e os isézimas imobilizados' da lipase de Candida rugosa; 13) um processo para a purificação de um enzima por imobilização; /11- ''**«*. .% 14) processos para a utilização dos enzimas, isozimas ou enzimas imobilizados ou isozimas imobilizados em sistemas em duas fases aquosa/orgânica; 15) um processo para a produção de enantiómeros específicos de ácidos 2-ariloxi substituídos com isozimas de lipa-se ; 16) um processo para a produção de ácido R-2-(4-hidro-xifenoxi)propiónico com isozimas de lipase; 17) um processo para a resolução de ácidos 2-arilpro-piónicos com isozimas de lipase. De um modo específico, encon-tram-se incluídos processos para a produção de S-cetoprofeno, S-ibuprofeno, S-fenoprofeno, ácido S-2-fenil-propidnico e S-in-doprofeno. Estes processos revestem-se de especial valor para determinados ésteres que se descrevem; e 18) a utilização de determinados aditivos que aumentam a proporção de estereosselectividade da lipase de Candida rugo-sa ou dos isózimas de Candida ruqosa.

Na descrição pormenorizada que se segue evidenciam-se caracteristicas adicionais, objectivos e vantagens da presente invenção

DESCRIÇÃO DOS ASPECTOS .PREFERENCIAIS A presente invenção inclui um processo para se efectuar a hidrólise, de um modo estereosselectivo, de misturas racémi-cas de ésteres em ácidos. Este processo compreende as seguintes fases: a) imobilização do enzima de lipase ou de um isozima de Candida ruqosa; e b) fazer contactar o enzima imobilizado ou o isozima com uma mistura racémica de ésteres na presença de um dissolven / -12- te orgânico que aumenta a estereosselectividade do processo.

Os dissolventes orgânicos que optimizam a estereosselectividíi de do processo incluem dissolventes orgânicos aromáticos, especialmente hidrocarbonetos aromáticos. Um dissolvente orgâni_ co especialmente preferido é o tolueno. Ver exemplo 6. No entanto, também se podem utilizar outros dissolventes orgânicos. Estes incluem, sem qualquer limitação, hidrocarbonetos haloge-nados .

As condições de reacção, por exemplo, temperatura e tejn po, podem variar. Utiliza-se, de um modo vantajoso a temperatura ambiente (20°-25°C), apesar de serem, também úteis outras temperaturas. Podem determinar-se fácilmente, para qualquer situação especifica, os tempos de reacção óptimos, pH e outras condições .

Os ésteres preferenciais, que se podem hidrolisar es-tereoespecificamente, de acordo com as reivindicações da presente invenção, utilizando o enzima de lipase ou isozimas de Candida rugosa são os ésteres de ácidos 2-(ariloxi)-propióni-cos, especialmente do ácido 2-(4-hidroxifenoxi)-propiónico (r£ ferido, algumas vezes daqui em diante como "HPPA")· A estereojs selectividade aumenta quando se imobiliza o enzima, utilizando preferencialmente, um pré-polímero de poliaziridina. Podem ad_i cionar-se agentes redutores, por exemplo, o hidrossulfureto de sódio , em pequenas quantidades para evitar a oxidação de HPPA e dos seus ésteres.

Conforme se indica no exemplo 9, a estereoespecifici-dade do enzima imobilizado aumenta com a utilização. A primeira hidrólise por lotes de HPPA-Me para HPPA, originou a produção de 82% de R-HPPA e de 18% de S-HPPA, enquanto que na sétima -13- e na oitava hidrólise por lotes, a conversão foi de 100% de R-HPPA e de 0% de S-HPPA. Apesar da estereoespecificidade apresentar um acréscimo significativo com a utilização, a acti^ vidade decresce ligeiramente. 0 acréscimo de estereoespecifi-cidade obtido de acordo com este processo que se reivindica, é critico para um processo industrial, uma vez que, conforme se fez anteriormente notar, um processo industrial necessita normalmente de uma percentagem superior a 95% ee. A presente invenção também inclui, um processo para a purificação e separação estereosselectiva de enzimas de lipase de Candida rugosa, que consiste na utilização de cromatografia de permuta de iões; e na separação dos isózimas de lipase resultantes com um esquema de eluição adequado. 0 esquema de elui ção pode ser um sistema de pH passo a passo ou um esquema de gradiente de pH, ou um esquema de eluição por um sal. 0 esquema de eluição preferencial consiste no esquema de pH passo a passo. Uma aplicação preferencial deste processo envolve a purificação de enzimas de lipase de Candida rugosa de modo a eluir os dois isózimas CSC-1 e CSC-2.

Pode conseguir-se a purificação e separação dos isozi-mas estereosselectivos da lipase de Candida rugosa utilizando a focalização isoeléctrica. Conforme se demonstra no exemplo 58, pode separar-se o enzima da lipase de Candida rugosa em dois isózimas, CSC-1, e, CSC-2, os quais demonstraram uma acti^ vidade hidrolitica estereoespecifica excepcional. 0 processo de purificação e de separação da presente invenção é adequado para utilização em larga escala. Na preseji te invenção podem utilizar-se diversos suportes de cromatogra-fia. De um modo preferencial, o suporte cromatográfico é subs-

/ V -14- y

tituido por um ácido forte. De um modo mais específico, deriva-se o suporte cromatográfico com um grupo funcional de sul-

TM

fopropilo. Os suportes preferenciais incluem SP-Trisacryl e TM SP-Sephacryl . Ver exemplos 11, 12, 13 e 14.

Conforme se fez anteriormente notar, a presente inveji ção proporciona um isozima isolado de lipase de Candida rugosa que possui a sequência aminoácida da extremidade N: Ala-Pro-Thr-Ala-U-Leu-Ala-Asn-Gly-V-Thr-Ile-Thr-Gly-Leu-Asn-Ala-Ile-Ile-Asn-Glu-Ala-Phe-Leu-Gly-Ile-W-X-Ala-Glu-Pro-Pro-Y-Z-Asn-P na qual U, V, W, Y e Z representam aminoácidos e P representa um peptido, De um modo mais especifico, a presente invenção comtempla um isozima, referido como CSC-1 que possui a sequência:

Ala-Pro-Thr-Ala-Lys-Leu-Ala-Asn-Gly-V-

Thr-Ile-Thr-Gly-Leu-Asn-Ala-Ile-Ile-Asn-

Glu-Ala-Phe-Leu-Gly-Ile-Pro-Phe-Ala-Glu-

Pro-Pro-Val-Gly-Asn-P na qual V representa um aminoácido e P representa um peptido ou o resíduo do peptido. CSC-1 também se caracteriza por um ponto isoeléctrico situado entre 5,3 e 5,7 e um peso molecular de 55-65 000.

A presente invenção também proporciona um outro isózi-ma isolado a partir da lipase de Candida rugosa, referido como CSC-2 e que possui a sequência aminoácida da extremidade N: Ala-Pro-Thr-Ala-Thr-Leu-Ala-Asn-Gly-Asp-Thr-Ile-Thr-Gly-Leu-Asn-Ala-Ile-Ile-Asn-Glu-Ala-Phe-Leu-Gly-Ile-W-X-Ala-Glu-Pro-Pro-Y-Z-Asn-Leu-Phe-Ile-ZZ-Leu-P na qual W, X, Y, Z e ZZ representam aminoácidos e P representa o resíduo do peptido.

Descobriu-se que os isózimas CSC-1 e CSC-2, obtidos a partir da lipase de Candida ruqosa possuem estereosselecti-vidades diferentes e, algumas vezes, opostas. Estes isózimas CSC-1 e CSC-2, são úteis na hidrdlise estereosselectiva de djl versos ésteres; conforme anteriormente descrito. A lipase de Candida rugosa, que aqui se utiliza tal como a que se utiliza para isolamento dos isózimas indicados, éncontra-se disponível a partir de diversas fontes comerciais. Embora os enzimas que se encontram comercialmente disponíveis sejam todos derivados de Candida ruqosa, diferem nas suas caracteris^ ticas de focalização isoeléctrica e também apresentam uma graji de variação na concentração da proteína que se encontra preseji te. Descobriu-se, também que as preparações enzimáticas comerciais apresentam graus variáveis de estereoespecificidade para a hidrólise de ésteres. A razão para as diferenças de estereoespecif icidade de hidrólise das lipases comercialmente disponíveis deve-se, aparentemente, à variação na concentração de diversas proteínas presentes na lipase de Candida ruqosa. Embora os isózimas de CSC-1 e de CSC-2 possam estar presentes em todas as lipases disponíveis de Candida ruqosa, dá-se preferência a determinadas destas preparações de lipase como fonte de isózimas. Utiliza-se de um modo vantajoso a lipase MY, de Meito Sangyo, no isolamento dosisózimas CSC-1 a- CSC-2.Também são ad£ quadas outras lipases, tais como a lipase AY e a lipase Sigma.

Analisaram-se amostras de CSC-1 e de CSC-2, de acordo com técnicas de micro-sequênciação. A micro-sequênciação indicou que duas fracções são, de facto, enzimas diferentes e

que não degradavam produtos uma da outra. Ver exemplo 13. A micro-sequênciação também indicou que existia uma grande an£ logia sequencial entre CSC-1 e uma acetilcolina-estearase de Torpedo californica, o gimnoto eléctrico. No entanto, após exame da acetilcolinoestearase do gimnoto quanto à sua capaci^ dade de hidrolisar os ésteres de HPPA, verificou-se uma acti-vidade hidrolltica muito fraca sem estereoespecificidade. Ver exemplo 13.

Isto serve para sublinhar o carácter pouco óbvio de que se reveste a descoberta de que o isózima é unicamente eficaz na sua actividade estereoespecifica. A composição dos dois novos isózimas, CSC-1 e CSC-2, encontra-se ilustrada pelas suas sequências aminoácidas da extremidade N, que anteriormen-te se fizeram notar, e de acordo com o apresentado no exemplo 13.

Descobriu-se, de acordo com a presente invenção, que quando se utilizam os isózimas CSC-1 e CSC-2, na hidrólise de uma mistura racémica de um éster, se produzem produtos altamente quirálicos. Demonstrou-se que o isózima CSC-1 proporciona uma hidrólise altamente estereosselectiva de misturas rac£ micas de ésteres etílico ou metílico do ácido 2-(4-hidroxife-noxi )-propiónico. Ver exemplos 15 e 16. 0 isózima CSC-2 é especialmente eficaz na hidrólise estereosselectiva de ésteres de cetoprofeno. Pode levar-se a efeito a hidrólise de ésteres utilizando CSC-1 e CSC-2, utilizando um meio de reacção a duas fases (aquosa/orgânica).

As actividades de CSC-1 e de CSC-2 variam significativamente e, pode dar-se preferência a uma delas para qualquer reacção especial. Uma comparação, por exemplo, entre CSC-1 e CSC-2 mostra que a proporção de conversão do éster metilico de HPPA racémico é muito superior com CSC-1 do que com CSC-2 e que o excesso enantiomérico se encontra também levemente ajj mentado. Ver exemplo 17. Por outro lado, obtiveram-se resulta dos superiores quando .se hidrolisaram os ésteres de cetoprofe-no com CSC-2. 0 isézima CSC-2, é, também superior à lipase MY para a hidrólise de ésteres de cetoprofeno e, a proporção para a hidrólise com CSC-2 é, também, significativamente melhor dada lipase MY, apesar de se poder utilizar a própria lipase. Ver exemplos 18 e 19. A utilização de uma mistura a duas fases no iso-octano ou em dissolventes semelhantes (de preferência hi-drocarbonetos) também proporciona excelentes excessos enantio-méricos (ee). Ver exemplo 18. Uma comparação do efeito de CSC-1, CSC-2 eda lipase MY indica a superioridade de CSC-2 na hidrólise do monoglicerido de cetoprofeno para além do seu excesso enantiomérico. Ver exemplo 19.

Podem utilizar-se, de um modo proveitoso, os dissol ventes orgânicos para aumentar a solubilidade dos ésteres metl-licos de cetoprofeno em água que usualmente se trata com um tampão para proporcionar um pH de cerca de 6-8. No entanto, d£ ve ter-se cuidado para assegurar que o dissolvente utilizado, ou as quantidades do mesmo não afectem os resultados. Deste modo, por exemplo, descobriu-se que a dissolução de ésteres de cetoprofeno em dimetilformamida (DMF) com quantidades progressivamente superiores de DMF pode ter um efeito prejudicial no isózima CSC-2. A hidrólise em larga escala de monoglicerido de cetoprofeno, pode, também, apresentar um baixo excesso enanti£ mérico quando se adiciona uma quantidade substancial de DMF.

Ver exemplos 20 e 21. -18-

%

De acordo com um outro aspecto da presente invenção, pode efectuar-se a hidrólise de ésteres com CSC-2 na presença de um tensioactivo. Uma vantagem da utilização de um adi^ tivo tal como um tensioactivo reside no facto de se poder evitar ou minimizar qualquer efeito adverso de DMF sobre ee. Ver exemplo 22. Os aditivos tensioactivos preferidos incluem os és_ teres de oleato, óleos vegetais, óleos animais e outros oleatos contendo tensioactivos. A utilização de dissolventes de baixa polarização num sistema de duas fases para a hidrólise do monoglicerido de cetoprofeno também apresenta vantagens, proporcionando percentagens superiores de ee. Ver exemplo 23.

Podem imobilizar-se de modo útil os isózimas ou lipase de acordo com uma grande diversidade de procedimentos, proporcionando todos eles materiais activos. Podem depois, uti^ lizar-se os isózimas imobilizados para produzir ácidos quiráli-cos. Por exemplo, pode imobilizar-se o isózima CSC-1 e utilizar^ -se na hidrólise de diversos ésteres. A imobilização do isózima CSC-1, utilizando poliaziridina ou Eupergit C, é altamente eficaz nas hidrólises. Ver exemplo 25. 0 exemplo 33 indica que existe um tempo de vida catalítico aumentado para o CSC-1 imobilizado de acordo com o procedimento de poliaziridina. Pode levar-se a efeito a imobilização na presença de um ácido orgânico. Ver exemplo 29. Também se descobriu que o alcoól de poli^ vinilo possui um efeito benéfico na imobilização da CSC-1 de lipase uma vez que a actividade relativa parece aumentar substancialmente pela adição deste reagente. Ver exemplo 30.

Um método de imobilização preferencial para o isózima CSC-2 envolve a utilização de sílica. Ver exemplo 24.

0 exemplo 31 ilustra a imobilização da lipase MY impura. Os ácidos orgânicos parecem possuir um efeito positivo na imobili^ zação, conforme se demonstra com a lipase MY, no exemplo 26. Embora cada um dos ácidos ensaiados se mostrasse um pouco eficaz, parece que os ácidos preferenciais são aqueles que possuem 12-18 átomos de carbono, dando-se preferência ao ácido esteárico. 0 efeito do ácido esteárico encontra-se relacionado com uma dose inferior a uma concentração de 5%, existindo acima deste nível um efeito de imobilização consistente. Ver exemplo 27.

Uma melhor delineação do efeito protector do ácido esteárico indica que 5% de ácido esteárico é óptimo para a actividade relativa. No entanto, podem utilizar-se outras doses eficazes.

Ver exemplo 28.

Um método alternativo para a produção de lipases estereoespecíficas demonstra que se podem utilizar permutadores de aniões e de catiões para se isolar CSC-1. Ver exemplo 34.

Os isdzimas CSC-1 e CSC-2 são eficazes na hidrólise de ésteres de ácidos 2-arilpropiónicos tais como, por exemplo, os ésteres de ibuprofeno o éster metílico de fenoprofeno, o éster metílico do ácido 2-fenilpropiónico e o monoglicérido de indoprofeno. Tal como se indica no exemplo 35, o ibuprofeno, um anti-inflamatório não esteroide, resolve-se de modo eficaz pela lipase MY, CSC-2 e- CSC-1, sendo as proporções e ee mais elevados com CSC-2. Para o éster metílico de fenoprofeno, outro anti-inflamatório não esteróide, CSC-1 e CSC-2 possuem percentagens e estereosselectividades claramente superiores. Ver exern pio 36. A percentagem eficaz de hidrólise dos ésteres me-tílicos de cetoprofeno e ibuprofeno parecem ser superiores com -2.0- CSC—2; no entanto, CSC-2 e CSC-1 são iguais na proporção para o fenoprofeno. Ver exemplo 36. 0 exemplo 37, indica a utilização de CSC-1 e de CSC-2 na resolução do éster metllico do ácido 2-fenilpropiónico. CSC-2 predomina, novamente, em percentagem e estereosselectividade apesar de ambos os insózimas serem superiores à lipase MY, ainda que se utilize a lipase MY numa quantidade muito superior. é A hidrólise do monoglicerido de indoprofeno indica que CSC-2 proporciona uma resolução estereoespecífica na qual a configuração S predomina, ao passo que a lipase MY e CSC-1 proporciona, predominantemente a configuração R. Ver exemplo 38. A utilização de um tensioactivo na hidrólise do mono-glicérido de cetoprofeno por CSC-2 originou um acréscimo na pr£ porção relativa. 0 Tween 80, por exemplo, é eficaz quando se adi^ ciona à mistura reaccional na presença ou na ausência de BSA.

Ver exemplo 39. Examinou-se depois este efeito, para um grande número de tensioactivos de diversos tipos. Pode observar-se, por exemplo, no exemplo 40 que os principais aceleradores da proporção enzimática para CSC-2 são os ésteres do ácido oleico. Avaliaram-se, em particular, ésteres de oleatos e, descobriu-se que a percentagem de ee e a proporção de hidrólise aumentavam com CSC-2 no monoglicerido de cetoprofeno. Ver exemplo 41. Avaliaram-se outros derivados do ácido oleico que, geralmente não se utilizam como tensioactivos e, demonstrou-se que o ácido oleico e os seus ésteres aumentavam a proporção assim como a enantio-selectividade. Ver exemplo 42.

Os ésteres de oleatos encontram-se também nos óleos naturais. Assim ensaiaram-se também os óleos naturais quanto ao seu efeito na hidrólise. 0 azeite apresentou uma estimulação 1- s .¾ específica da actividade de 0SC-2. Ver exemplo 43. Também se demonstrou que o azeite e o óleo de milho actuam como substra_ tos naturais na hidrólise, utilizando CSC-2 e que também se dá a trans-esterificação. Ver exemplo 44. Deste modo, a trans-esterificação pode aumentar o valor de óleos de baixo grau ou indesejáveis que possuem ou que se desejaria que possuíssem é£ teres oleicos. Podem, também utilizar-se os isdzimas da preseji te invenção, para se hidrolisarem tais óleos que possuem uma baixa graduação para se produzirem ácidos valiosos que é possível separar de acordo com métodos químicos conhecidos. Ver exemplo 44. Também se avaliaram outros triglicéridos que surgem na natureza. Ver exemplo 45. Descobriu-se que os óleos naturais ensaiados, que eram ésteres de glicerol, eram acelaradores da actividade de CSC-2. 0 exemplo 46 indica que a adição de um determinado número de ésteres oleicos ou de ácido de oleato aumeji tava a proporção e a enantio-especificidade da hidrólise de ésteres de cetoprofeno por CSC-2 e também indica que o procedimeji to de extracção utilizado deve ser tal que separe o óleo/ácido oleico do cetoprofeno. Ver exemplo 46.

No entanto, nem todos os óleos intensificam a activi^ dade de CSC-2 com todos os substratos. Por exemplo, o óleo mineral, ou uma mistura de hidrocarbonetos, não acelera a hidrólise do monoglicérido de cetoprofeno. Ver exemplo 47. Descobriu^ -se ainda, examinando os ésteres, outros para além dos do ácido oleico e do éster metílico de ácido linoleico que não apresentaram qualquer proporção de aumento. Ver exemplo 48.

Verificou-se que o ácido oleico possuia um efeito ijn tensificador da proporção sobre a lipase MY e sobre CSC-2, mas não sobre CSC-1. 0 ácido oleico, também aumentava o excesso enantiomérico de CSC-2, mas não o fazia de modo tão intenso para a lipase MY. Ver exemplo 49. Descobriu-se que o ácido oleico era eficaz na promoção da hidrólise dos ésteres hidro-xi de cetoprofeno. Observou-se o efeito do ácido oleico sobre a lipase MY e sobre a lipasé B Biocatalyst. Ver exemplo 50. Verificou-se um melho ramento notável na hidrólise do éster 2-cloroetilico de cetopr£ feno com CSC-2 e com a lipase MY na presença de ácido oleico e, mais uma vez, o ee aumentou. Ver exemplo 51.

Uma observação cuidadosa da hidrólise com outros enzimas com ácidos oleicos/ésteres e uma comparação do efeito na taxa de recuperação e no ee, demonstrou que a lipase OF e a lipase Biocatalyst de Candida proporciona aumentos dramáticos com ésteres de hidroxi. A estearase do fígado de suinos hidrolisa estes ésteres para proporcionar o enantiómero oposto. Ver exemplo 52. A utilização de CSC-2 imobilizado indicou o mesmo tipo de taxa de recuperação e de excesso enantiomérico que os do CSC--2 livre quando se adicionava o ácido oleico. Ver exemplo 53. A adição de um dissolvente orgânico, tal como o hexa-no, também indica um aumento significativo quando concentrações acrescidas de ácido oleico se encontram presentes. E útil uma concentração de 1 para 25¾ de ácido oleico em hexano, volume/v£ lume. 0 intervalo preferencial encontra-se compreendido entre 5 e 15¾. Ver exemplos 54 e 56. A observação de mais dissolventes mostrou que nem os dissolventes aromáticos (tolúeno) nem os dissolventes clorados (clorofórmio) eram benéficos. Contudo, dissolventes alifáticos tais como o hexano e o iso-octano dão taxas aumentadas significativamente. Ver exemplo 55. Uma avalija ção posterior de mais dissolventes com ésteres de monoglicérido de cetoprofeno (KPG) e, etileno-glicol de cetoprofeno (KPEG) mos -23-

traram que os dissolventes alifáticos melhoram a taxa e o excesso enantiomérico. Ver exemplo 56. Uma lipase Enzecco Rxx de C. rugosa, que parece ser a mesma que CSC-2, por IEF, possuia um peso molecular levemente mais elevado e proporcionava uma e£ tereosselectividade bastante diferente. De um modo pouco vulgar, verificou-se uma intensificação da proporção com o ácido oleico, na hidrólise de KPEG, mas não na do KPG. Isto indica que a SDS--PAGE ou a IFE isoladamente, não são suficientes para fazer a distinção dos diferentes enzimas. Ver exemplo 57.

Pode também efectuar-se a separação da preparação en-zimática da lipase MY numa escala preparatória por focalização isoleléctrica e, pode obter-se CSC-1 e CSC-2 de acordo com este procedimento. Ver exemplo 58. São do conhecimento do especialista os métodos adequja dos, que aqui se utilizam para se efectuar a imobilização da lji pase. Ver, por exemplo, a patente de invenção norte-americana nQ 4 436 813 que descreve a imobilização de enzimas ou de células que os contêm, utilizando materiais pré-poliméricos, tais como os pré-polímeros de poliazetidina (por exemplo, Polycup), os pré-polímeros de celulose carboximetilica, de isocianato de. polimetileno e de hidrogel de poliuretano. Pode utilizar-se qualquer um de£ tes materiais para os presentes objectivos, de acordo com o pr£ cedimento descrito na patente 4 436 813. Também são úteis aqui, para a imobilização do enzima, os pré-polímeros polifuncionais de aziridina terapêuticos, tais como os descritos na patente de invenção norte-americana n9 4 650 755, com o n2 de Série 938 248, cujo conteúdo aqui se engloba como referência. Outros agentes de imobilização encontram-se exemplificados nos exemplos que aqui se fornecem.

Os exemplos que se seguem ilustram, mas não limitam, a presente invenção. EXEMPLO 1

Examinaram-se as proteínas presentes nas lipases comerciais de C. rugosa, a partir de três fontes disponíveis (Meito Sangyo, Biocatalyst Ldt. e, Amano), por SDS-PAGE, para determinar as características dos pesos moleculares. Dissolveram-se as preparações enzimáticas em SDS a l%-0,05 M de Tris a pH 8,0, mercaptoetanol a 1% numa concentração de 1 mg/ml. Analisaram-se as amostras num sistema "Phast" (Pharmacia LKB) utiljl zando geles de poliacrilamida pré-fabricados num gradiente compreendido entre 10-15%. Aplicou-se a proteína (0,2 yug-2,0 jyig/pista) sobre o gel e deixou-se a 73 volts/hora a 15°C. Fixaram-se os geles em etanol-ácido acético e, corou-se a proteína com prata utilizando a câmara de desenvolvimento de Pharmacia. A lipase MY (Meito Sangyo), a lipase AY (Amano) e a lipase de Candida cylindracea (Biocatalyst) possuíam.cada uma delas.uma xa principal sobre o gel, com um peso molecular de 60 Kilodaltons, (ver fig.l) No entanto, tal como se indica na fig. 1, a Lipase AY (Pistas 2 e 5) possuiam uma outra banda principal.

Exemplo 2

Verificou-se a composição da lipase MY que se encontra comercialmente disponível, utilizando cromatografia em CM--Trisacryl e DEAE-Trysacryl. Dissolveu-se 0,33 mg de lipase MY tem 10 ml de Na2HP0^ 0,25 mM (pH 7,9), e eliminaram-se os sólidos por centrifugação. Aplicou-se a proteína a uma coluna M de CM-Trisacryl de 2,5 X 10 cm, equilibrada com o mesmo tampão. Ajustou-se o débito para 1,0 ml/minuto. Lavou-se a resina com o mesmo tampão até que a absorvância a 280 nm fosse zero. Eluiu-se um único pico de proteína contendo toda a actividade enzimáti-ca, utilizando esta resina de troca de iões.

Dissolveram-se 5 mg de lipase MY, em NaCl 0,15 M-Na^HPO^ 0,01 M (pH 7,3) e, removeram-se os sólidos por centrifugação. Dessalinizou-se a proteína por cromatografia numa coluna de resina Sephadex G-25 com Na2HP0^ (pH 7,0). Agregaram--se as fracções de proteína e aplicaram-se numa coluna de DEAD--Trisacryl M de 2,5 X 10 cm equilibrada com Νθ,,ΗΡΟ^ 25mM, a pH 7,0. Efectuou-se a eluição por lavagem da resina com o mesmo tampão. Eluiu-se toda a actividade enzimática e toda a proteína com um único pico. Tomando estes dados como ponto de partida, assumiu-se que a proteína, na preparação da lipase MY, é de uma única espécie.

Exemplo 3

Neste exemplo ilustra-se a hidrólise do éster metil_i co do ácido 2-(4-hidroxifenoxi)-propiónico (HPPA-Me) utilizando lipase MY.

Misturaram-se, com agitação, durante 5,5 horas, 340 mg de lipase MY (Meito Sangyo), 4 g de éster metílico de R,S--HPPA, e 200 ml de KP^PO^ mM (ajustado para o pH 6,5).

Efectuou-se a análise do ácido formado por extracção do éster após ajustamento da solução aquosa para pH 6,5 (ocorre uma ligeira descida de pH na hidrólise) com Ch^C^ seguido de ajustamento de pH para 2 e de extracção do ácido com acetato de etilo. Evaporou-se a solução por secagem, recolheu-se em água e analisou-se por HPCL com uma coluna "Macherey Nagel-Duren Resolvosil BSA-7", utilizando n-propanol a 5% Kh^PO^ 10 mM, a pH 5, a 2,7 ml/minuto com detecção a 220 nm. Nesse momento 35% de éster de R e de S tinham-se convertido em ácido. A proporção 26- de ácidos foi de 94% de R e de 6% de S.

Exemplo 4

Comparação da ester.eosselectividade das lipases comer cialmente disponíveis de C. ruqosa .

Compararam-se a lipase MY (Meito Sangyo), a lipase B de Candida (Biocatalyst), Ltd.), a lipase OF (Meito Sangyo) e a lipase AY (Amano), quanto à sua estereosselectividade para a produção de R-HPPA a partir do éster metllico de R,S-HPPA. AdjL cionaram-se as preparações, nas quantidades indicadas no quadro I, a 50 ml de éster metllico de HPPA 20 mM em KH2P0^ 50 mM, a pH 6,5. Incubaram-se as reacções de lipase com o substrato, com agitação, a 25°C, durante 22 horas. Determinou-se a proporção de ácido de configuração R, para ácido de configuração S por HPLC, conforme descrito no exemplo 3, numa hidrólise a, aprox£ madamente, 16% do éster. No quadro indicam-se os resultados. QUADRO 1 mg de % de

Preparações de lipase enzima adicionador ácido-R

Lipase MY 10,7 93 Lipase AY 10,6 93 Lipase B 9,4 69 Lipase OF 9,6 68

Conforme se indica, a lipase MY e a lipase AY demonjs traram uma maior estereoespecificidade do que a lipase B ou a lipase OF.

Exemplo 5

Neste exemplo descreve-se a hidrólise a duas fases com lipase MY de HPPA-Me.

Adicionou-se lipase MY solúvel (2 g) a tolueno (50 ml) contendo HPPA-Me 1 M (196 g/1) e 50 ml de Kh^PO^ 1 M, a pH 7,0 e deixou-se converter o éster R,S, no ácido. A proporção de ácido neste sistema bi-fásieo (tolueno/água), numa hidrdli^ se a 46¾ do éster R,S, foi de 92¾ de ácido de configuração R e de 8¾ de ácido de configuração S.

Exemplo 6

Optimização da hidrólise da lipase MY, em duas fases, em diversas misturas de dissolventes orgânicos /água.

Todas as reacções se levaram a efeito conforme se se gue: A. Combinou-se 75¾ de dissolvente orgânico/25?ó de tam pão aquoso cinquenta miligramas de R,S-HPPA-Me, numa ampola de cintilação, com 75 ml de dissolvente orgânico, 2,5 ml de tam^ pão de fosfato 50 mM, a pH 6,0 e 5 mg de lipase MY. Colocou-se as misturas reaccionais num agitador e agitaram-se durante um período de 0-43 horas, recolhendo-se amostras em diversos momeji tos. B. Combinou-se dissolvente orgânico a 2596/ tampão aquoso a 75¾ cinquenta miligramas de R,S-HPPA-Me, numa ampola de cintilação de 10 ml, com 2,5 ml de dissolvente orgânico, 7,5 ml de tampão de fosfato 50 mM (pH 6,8) e 5 mg de lipase MY. AgjL taram-se as misturas reaccionais durante um período de 0-143 horas sendo recolhidas amostras em diversos momentos.

Os dados do quadro 2 representam a % de conversão e a % de R-HPPA produzido utilizando os dissolventes orgânicos indicados num sistema a duas fases em que 75¾ do volume seco do veículo total (dissolvente) era água e o balanço (25¾) eram dissolventes orgânicos. '28-

.X QUADRO 2

Solvent % Tempo (Hr) Conversão O/D /0Í\ Solubilidade éster/áci 0/ /0 (HPPA-ME) do mg /ml Tetracloreto de carbono .25 2,7 58 79 33,0 75 2,7 61 76 1,2-dibromo-etano 25 43 33 73 565,7 75 43 23 57 tetracloro-etileno 25 5,3 61 83 1,4 75 5,3 58 85 1,1,2 tricloro-etano 25 43 29 79 558,0 tricloro-trifluoroetano 25 . 5,3 49 100 insolúvel 75 2,7 60 85 xilenos 25 5,3 49 100 75 5,36 41 89 tolueno 25 2,7 385 100 236,3 75 2,7 25 90 acetona 25 43 0 0 nt 75 43 0 0 nt 2-propanol 25 43 0 0 nt 75 43 0 0 nt cumeno 25 2,7 35 100 20,0 ciclo-hexano 25 2,7 35 100 66,4 75 2,7 31 83 fluoro-benzeno 25 5,3 40 95 155,5 75 5,3 29 86 álcool etílico 25 43 0 0 nt 75 43 0 0 nt -29-

Conforme se pode verificar, obtiveram-se os melhores resultados utilizando a menor quantidade de dissolvente com os hidrocarbonetos arilo ou clorofluoro-hidrocarbonetos misturados, nomeadamente, tricloro de trifluoroetano.

Exemplo 7

Neste exemplo ilustra-se a utilização da lipase MY imobilizada, na hidrólise de HPPA-Me.

Agitou-se a lipase MY imobilizada que se preparou, de acordo com os métodos seguintes, com uma solução de tolueno de HPPA-Me e de fosfato tampão (pH 6,5), à temperatura ambiente durante cerca de 60 horas. Depois, ensaiou-se a solução aqu£ sa para se verificar a concentração de R-HPPA por HPLC, de acor do com o exemplo 3. Lavou-se o enzima com água desionizada e adicionou-se a um novo lote. A. Imobilização da Lipase MY em "Amberlite IRC-84" ou "DP-1 com XAMA-7". Misturou-se cuidadosamente a lipase MY (1,10 g), com 2,5 g de Amberlite IRC-84 ou de Amberlite DP-1 desidratadas, 0,85 g de XAMA-7 e 2 ml de tampão de fosfato (pH 6,5, 0,1M). Deixou-se a mistura em repouso, à temperatura ambiente, durante 4 horas, período de tempo durante o qual se imobilizou o enzima. Lavou-se o agente catalítico e, depois armazenou-se a 4°C. B. Imobilização da Lipase MY sobre "Amberlite DP-1" com "Policup”. Aqueceram-se a 45°C, durante 4 horas, 0,15 g de lipase MY, 0,5 g de Amberlite DP-1 desidratada e 2 ml de Policup. Lavou-se o enzima imobilizado e ensaiou-se com HPPA-Me. A percentagem de imobilização foi de 40?ó. /30-

C. Imobilização da Lipase MY sobre Gotas de Celulose Activadas por Periodato de Sódio. Agitaram-se 0,15 g de lipase MY e 1 g de gotas de celulose activadas por periodato de sódio (NalO^) em 5 ml de solução salina de tampão fosfato (PBS), à temperatura ambiente, durante 20 horas. Recolheu-se o enzima imobilizado, lavou-se e ensaiou-se com HPPA--Me. A percentagem da imobilização foi de 90%. D. Imobilização da lipase MY em Chitina com Glutaral-d e í d o. Agitaram-se 0,25 g de lipase MY,0, 5 g de chitina e 500 jxl de glutaraldeido (50%) em 10 ml de PBS, à temperatura ambiente, durante 20 horas. Recolheu-se o enzima imobilizado, lavou-se e ensaiou-se com HPPA-Me. A percentagem de imobilização foi de 67%. ' E. Imobilização de Lipase MY sobre Hexanodiamina -Qotas de Celulose com Glutaraldeido. Agitaram-se 0,25 g de lipase MY 1 g de gotas de hexanodiamina-celulose e 500 jil de glutaraldeido (50%) em 5 ml de PBS, à temperatura ambiente, durante 20 horas. Recolheu-se o enzima imobilizado, lavou-se e ensaiou-se com HPPA-Me. A percentagem de imobilização foi de 54%. F. Imobilização da Lipase MY em Poli-etileno-imina (PEI) - qotas de Celulose com Glutaraldeido. A pr£ paração de PEI-gotas de celulose consistiu em misturar 10 g de gotas de celulose desidratada, 3 g de PEI (50%), 2 g de cloreto cianúrico e 2,5 ml de trietilamina, em 20 ml de acetonitrilo a 40°C, durante 15 horas. Depois recolheram-se as gotas e lavaram-se com 200 ml de HC1 0,01 N, 200 ml de metanol, 200 ml de NaOH 0,05 N, 200 ml de metanol e 200 ml de água desionizada. Imobilizou-se a lipase MY (0,25 g) agitando 2 g de PEI- gotas -31-

de celulose e 500 Jl· 1 de glutaraldeído (50¾ em 10 ml de PBS, à temperatura ambiente, durante 24 horas. Recolheu-se o enzima imobilizado, lavou-se e ensaiou-se com HPPA-Me. A percentíi gem de imobilização foi de 71¾. G. Imobilização da lipase MY em PEI-gotas de celulose com carbo-di-imida. Agitaram-se 0,25 g de lipase MY, 1 g de PEI-gotas de celulose (do ponto F, anterior) e 0,25 g de carbo-di-imida em 10 ml de PBS a 4°C, durante 65 horas. Recolheu-se o enzima imobilizado, lavou-se e ensaiou-se com HPPA-Me. A percentagem de imobilização foi de 34¾. H. Imobilização da lipase MY em PEI-gotas de celulose (do ponto F, anterior) com 2,4-di-isocianato de tolueno. Agitou-se 0,25 g de lipase MY, 1 g de PEI-gotas de celulose e 2,4-di-isocianato de tolueno (10 mg), em 5 ml de PBS à temperatura ambiente, durante 20 horas. Recolheu-se o enzima imobilizado, lavou-se e ensaiou-se com HPPA--Me. A percentagem de imobilização foi de 4,4¾.

Exemplo 8

Neste exemplo ilustra-se o efeito dos agentes redutores na estabilização da lipase, na presença de HPPA.

Levou-se a efeito a hidrólise assimétrica de HPPA--Me num sistema bifásico aquoso-orgânico, utilizado no exemplo 5. 0 éster encontrava-se, predominantemente na fase orgânica enquanto que o enzima e o ácido se encontravam, predominantemente na fase aquosa.

Avaliou-se o efeito do hidrossulfito de sódio (quadro 3), sulfito de sódio (quadro 4), cistina (quadro 5) e de diversos outros agentes redutores (quadro 6). 0 hidrossulfito de sódio foi eficaz na prevenção da perda de actividade do en- zima. Nem o sulfato de sódio, ,nem a cistina foram eficazes na prevenção da perda da actividade enzimática.

Imobilizaram-se 5,0 g de lipase MY sobre 10 g de Amberlite DP-1 com 2,5 g de XAMA-7. Agitaram-se 0,89 g do enzima imobilizado (eq. a 150 mg de enzima impuro) com 2,5 ml de ΗΡΡΑ 1M (fosfato, a pH 6,5) contendo 2,4, 8 e 16 mg/ml de reagentes redutores, durante 4 dias. Ensaiaram-se a cistina o hipofosfito de sódio, o boro—hidreto de tetra-butil-amónio, o ciano-boro-hidreto, o sulfito de sódio e o hidrossulfito de sódio. Depois, lavou-se o enzima imobilizado com água desioni^ zada e ensaiou-se com ΗΡΡΑ-Me. Utilizou-se o enzima imobilizado não tratado como controlo, para calcular a actividade residual do enzima tratado com ΗΡΡΑ. A lipase tratada com HPPA cori servou 70% da actividade quando não se utilizaram reagentes redutores. QUADRO 3

Tempo de HPPA-Me Na2S2 °4 (mg) Lote reacção Cone. Φ (hrs) (mMole) 0 2 ? 5 5 10 25 50 Conversão (?ó) de HPPA- Me para HPPA 1 15 10 33 37 36 30 25 24 3 15 10 25 29 29 31 21 17 7 15 10 20 30 27 25 25 25 11 15 10 13 21 24 31 34 33 14 15 10 19 21 22 21 23 23 18 15 10 18 16 17 19 29 33 22 15 10 12 14 13 13 18 23 30 15 10 13 17 17 17 31 38 (1) Imobilizaram -se 180 mg de lip ase MY, sobre 2 ml de IRC- com 90 mg de XAMA-7, de acordo com o procedimento do exem pio 7A. (2) HPPA-Me/Tolueno = 1 M/10 ml, pH 7 de fosfato tampão 0,25 Μ X 20 ml. -34-

QUADRO 4

Lote Tempo de HPPA-Me Na2 S0^ (mg’) reacção Cone . (hrs) (mMole) 0 2,5 5 10 11 5£ Conversão (%) de HPPA- Me para HPPA 33 15 10 28 39 20 26 32 25 7 15 10 13 17 14 20 17 25 9 15 10 13 14 11 16 13 18 12 15 10 14 16 12 14 12 18 14 15 10 13 13 9 13 10 16 18 15 10 16 14 10 14 12 12 19 15 10 13 13 11 15 12 13 20 15 10 14 14 10 14 11 14 1) Imobilizaram-se 200 mg de lipase MY em 2 ml de IRC-84 com 100 mg de XAMA-7, de acordo com o procedimento do exemplo 1, parte A. 2) HPPA-Me/Tolueno = 1 M/10 ml, pH 7 de fosfato tampão 0,25 Μ X 20 ml. -35-

QUADRO 5

Tempo de HPPA-Me

Lote reacção Cone . Cistina (mg) Φ (hrs) (mMole) 0 2,5 5 10 25 1 15 10 36 30 34 35 36 5 15 10 27 - 31 28 26 9 15 10 14 19 11 16 16 15 15 10 17 19 17 16 17 16 15 10 19 17 16 15 13 20 15 10 19 16 16 17 16 21 15 10 15 20 18 15 17 22 15 10 17 20 17 17 17 1) Imobilizaram-se 240 mg de lipase MY em 2 ml de IRC- 84 com 120 mg de XAMA-7, de acordo com o procedimento fornecido no exemplo 7, parte A. 2) HPPA-Me/Tolueno - 1 M/10 ml , pH 7 de fosfato tampão 0,25 Μ X 20 ml. QUADRO 6

Cone. Actividade (mg/ml) 0/ /0 cistina 2 83 4 76 8 81 16 83 NaH2P02 2 84 4 81 8 91 16 91 Bu^N cnbh3 2 83 4 81 8 88 16 85 Bu4N BH4 2 - 4 - 8 78 16 79 Na2S03 2 95 4 101 8 110 16 111 Na2S2°4 2 - 4 - 8 111 16 112 relativa

Enzima de Controlo a 100%

Enzima tratado com HPPA a 70,4% -37

Exemplo 9

Neste exemplo ilustra-se o acréscimo da enantio-se-lectividade da lipase My imobilizada obtido com um acréscimo de utilização.

Combinaram-se 20 gramas de lipase MY impura (Meito Sagyo Ltd) com 20 ml de tampão de acetato de aménio 25 mM, a pH 6,5 e agitou-se fortemente durante 10 minutos. Adicionaram--se, então, lentamente, dez gramas de pré-polímero de poliazi-ridina, XAMA-7 (Cordova Chemical Co), e agitou-se a mistura durante 1 minuto. Adicionaram-se à mistura quarenta gramas de resina de permuta de iões Amberlite DP-1 (Rhom-Haas), com agitação constante, durante um período de 1 minuto. Deixou-se em repouso durante 12 horas, a 4°C para se completar a polimeri-zação. Lavaram-se com tampão de acetato de amónio 25 mM, a pH 6,5 as gotas livres resultantes que fluiram, e que compreendiam Amberlite coberta com poliaziridina e, que transportavam a lipase imobilizada. Recuperaram-se 160 mililitros de lipase MY catalítica imobilizada.

Efectuou-se uma série de reacções por lotes, utilizando este agente catalítico imobilizado. Cada lote consistia em 2 moles de propionato de R,S-metil-2-(4-hidroxifenoxi), (HPPA-Me), 14 moles de tolueno, 214 moles de água desionizada (Dl), 2 moles de acetato de amónio e 0,017 moles de ditionito de sódio. Ajustou-se o pH para 6,5 utilizando ácido fosfórico. Agitou-se a mistura reaccional durante 12 horas para assegurar a solubilização completa de HPPA-Me antes de se adicionar a li^ pase MY imobilizada.

Adicionou-se a lipase MY ao substrato e continuou-se a agitar até a hidrólise atingir a produção de, pelo menos, -38- r / 0,8 moles de ácido HPPA. Recolheram-se periodicamente amostras da fase aquosa e analisaram-se, tal como se indica no exemplo 3. Quando a conversão de HPPA-Me em HPPA atingiu 40¾ (800 mMo-les de HPPA produzidas) eliminaram-se as gotas de enzima por filtração e introduziram-se num novo lote de substrato.

Os resultados analíticos, no termo da reacção, indicam-se a seguir , em oito lotes separados, que decorreram sucessivamente utilizando a mesma lipase MY imobilizada. QUADRO 7

Tempo de Hidrólise % 0/ /0 Lote Φ Hidrólise (h)total (M) R-HPPA S -HPPA 1 120 1 82 18 2 130 1 90 10 3 140 1 91 9 4 90 0,88 98 2 5 95 0,80 98 2 6 140 0,8 99 2 7 100 0,8 100 0 8 100 0,8 100 0 Como se torna evidente, a partir dos dados anteriores, a estereosselectividade da lipase MY imobilizada aumentou de modo uniforme com a utilização ao longo dos oito lotes enquan- to que a actividade da lipase MY imobilizada (¾ de hidrólise) decresceu um pouco. Deste modo, a hidrólise dos primeiros lotes de HPPA-Me para HPPA originou a produção de 82¾ de R-HPPA e de 18¾ de S-HPPA, enquanto que na hidrólise do sétimo e oitavo l£ tes a conversão foi de 100¾ de R-HPPA e de 0¾ de S-HPPA. Embora a actividade decrescesse levemente, isso não constitui uma desvantagem. 0 factor importante reside no aumento de este-reoespecificidade, uma vez que um processo industrial necessi ta duma percentagem de eesuperior a 95%.

Exemplo 10

Neste exemplo descreve-se a focalização isoelétrica da lipase de Candida rugosa, para determinar as suas caracte-risticas de composição.

Examinaram-se por focalização isoelétrica (FIE) para determinar as características de composição, amostras de lipase de Candida rugosa, comercialmente disponível, na Meito Sangyo, Biocatalyst Ltd e Amano. Efectuou-se uma separação da proteína com base na carga de rede, utilizando FIE num sistema Phast (Pharmacia LKB) utilizando geles IEF previamente fabricados, pl's 3-9. Dissolveram-se as preparações de enzimas em água di£ lizada, 3 horas antes da FIE. Aplicaram-se 0,1 ^ug-2,0 jkg de proteína/pista, sobre o gel e fez-se percorrer por 590 volts--hora, a 15°C. Fixaram-se os geles com ácido tricloroacético a 10% e depois corou-se a proteína com prata utilizando uma câtna ra de desenvolvimento Pharmacia. Determinaram-se os pl's dos enzimas por comparação com diagramas com pl's conhecidos. A lipase MY (Meito Sangyo) e a lipase AY (Amano) apr£ sentaram caracteristicas muito semelhantes (fig. 2). Cada uma delas possuia 4 bandas principais de proteína, uma com um pi de 5,5, duas com pl's préximos de 4,0 e uma com um pi próximo de 3,5. A lipase 0F (Meito Sangyo) e a lipase de Candida rugosa (Biocatalyst) possuíam caracteristicas diferentes com 4-5 bandas de proteínas com pl's próximos de 4,0. Estas preparações não possuíam a banda de enzima com um pi próximo de 5,5. -40- /

Exemplo 11

Neste exemplo descreve-se o fraccionamento da lipa-se MY da Candida rugosa (Cromatografia SP-trisacryl) em duas fracções de isózimas.

Dissolveu-se um grama de lipase MY (Meito Sangyo) em 60 ml de água e dializou-se contra 2 litros de NaH^PO^ 0,025 M, a pH 3,3, durante 16 horas. Eliminou-se o material insolúvel por centrifugação e reagustou-se o pH para 3,3. Preparou-se uma coluna de permuta iónica de 2,5 X 20 cm de SP-Trisacryl (IBF Biotechnics) equilibrada com Nal^PO^ 0,025 M (tampão inicial). Aplicou-se a lipase solúvel sobre a coluna e eluiu-se da resina o material que não se ligou com o tampão inicial. Levou-se a efeito uma separação da fracção de lipase (isdzimas), com um gradiente de pH passo a passo, utilizando tampão de citrato de sódio 0,007 M fosfato de sódio 0,015 M. Efectuou-se a eluição utilizando o acima referido tampão de citrato-fosfato a pH 4,75 para eluir a actividade enzimática, CSC-2, com lavagens continuas até que o ^23q voltasse à linha de base. Eluiu-se, então uma fracção de lipase, CSC-1 com 150 ml de tampão de citrato-fosfato, a pH 6,80. As características de eluição da proteína encontram-se na fig. 3. Todas as proteínas que continham fracçSes foram submetidas a FIE (fig.4). 0 CSC-1 possuía um PI de aproximadamen-te 5,5, enquanto que CSC-2 possuía um pi de, aproximadamente 4,4.

Exemplo 12

Neste exemplo descreve-se a preparação de lipase es-tereoespecífica de Candida rugosa utilizando cromatografia em SP-Sephadex.

Dialisou-se 1,3 mg de lipase MY (Meito Sangyo) em -41- Cí'«.KW»JfHJW0* y 60 ml de água disionizada contra 2 litros de citrato 7mM--Na2HP0^ 15 mM, a pH 3,3. Ajustou-se para 3,3 o pH da solução do enzima impuro antes de se efectuar a cromatografia colocou--se a proteína numa coluna Sephadex de 2,5 X 20 cm equilibrada com o tampão anterior citrato - Na2HPO^ a 60 ml/hora, a 25°C. Lavou-se a coluna com 120 ml do mesmo tampão. Efectuou-se uma eluição, passo a passo, com os tampões de pH aumentado. Em pri^ meiro lugar, eluiu-se a coluna com 100 ml de citrato 7 mH -

Na2HP0^ 15 mM, a pH 4,7 para se obter a CSC-2 de lipase (fig.5). Depois, eluiu-se a coluna com 100 ml de citrato 7 mM-Na2HP0^ 15 mM a pH, 6,8. Este tampão eluiu uma fracção que continha a fracção do enzima designada por CSC-1.

Com base na análise de focalização isoeláctrica sobre um gel de FIE 3-9, cada uma destas fracções da coluna continha uma única banda principal de proteína. A banda eluida com tampão a pH 4,7 possuía um pi de 4,4 e designou-se por CSC-2. A banda que se eluiu a pH 6,8 possuía um pi de 5,2 e designou-se por CSC-1.

Exemplo 13

Composição aminoácida e análise de sequenciação dos isózimas CSC-1 e CSC-2, de acordo com o obtido a partir da lipase de Candida rugosa. 0 procedimento de purificação para CSC-1 e CSC-2 ex_i ge uma solubilização inicial de lipase MY a 50 g/litro em fosfato dibásico de sódio 25 mM (pH final de 6,5). Decorridas 2-3 horas de agitação a 4°C, centrifugou-se a amostra (10 000 rpm, 10 minutos) e pôs-se de parte o sedimento. Fez-se baixar o pH de um dos sobrenadantes para 3-3,2 com ácido fosfórico e dia-lisou-se o sobrenadante num dispositivo oco de fibra ou dessa- linizou-se numa coluna GF-05 de Trisacryl, equilibrada com fo_s fato monobásico de sódio 25 mM, a pH 3,2. Depois, carregou-se a amostra numa coluna SP-Trisacryl equilibrada a pH 3,2. Lavou^ -se, então a coluna (25 mM, pH 3,2) e eluiu-se sequencialmente com tampão de citrato/fosfato de sódio a pH 4,8 e a pH 6,8 (tampSes Mcllvaine, 25 mM, aproximadamente). Todos os tampões continham 0,02% de azida de sódio. Podiam substituir-se os si£ temas de tampões anteriores por acetato de sódio 25 mM, com ajustamento de pH, utilizando ácido acético. E também possível efectuar um tampão e uma troca de pH numa coluna Trisacryl GF05. Esta coluna podia também tratar-se com água destilada. Descobriu-se que as bandas predominantes de enzimas se encontravam localizadas em geles SDS-PAGE Phast a 55 000-60 000 MW. Esta banda é bastante difusa, e caracterizou-se melhor utilizando a focalização isoleléctrica (FIE). Os geles de FIE que percorriam o sistema Phast (pH compreendido entre 3-9) revelaram que os enzimas (CSC-2) no pico de eluição a pH 4,8 (primeiro), possuíam um pi de aproximadamente 4,4, enquanto os de CSC-1 possuíam um pi mais alcalino (aproximadamente 5,2). Visualizarani -se estas bandas no topo (extremo ácido) do gel (CSC-2) ou pró^ ximo do meio (CSC-1). Verteram-se os geles de FIE num protocolo de um sistema Phast normalizado, utilizando um máximo de 2 000 volts, 3,5 watts e um total de 500 volts-hora.

Purificaram-se, posteriormente as amostras de CSC-1 e de CSC-2 por concentração num dispositivo oco de fibra (CD Laboratories) e/ou por uma segunda cromatografia em SP-Trisacryl, no caso de CSC-2. 0 CSC-1 preparado, deste modo consistia numa banda principal sobre geles de FIE. 0 CSC-2 continha 4 ou mais bandas, tal como se tornou evidente, de acordo com todas as bandas acldicas muito próximas na lipase MY. A amostra de CSC--2 utilizada continha uma banda predominante. A fotografia do gel (fig.6) representa um gel Phast de FIE a pH 3-9, que se fixou com ácido tricloroacético e que se revestiu com prata. Diluiram-se todas as amostras em água destilada e carregaram--se sobre o gel a 1 microlitro por pista. As pistas 1 e 8 eram pi de FIE normalizados. Estas proteínas normalizadas e os seus pontos isoeléctricos eram amilóglucosidase (3,5), corante vermelho de metilo (3,75), inibidor da tripsina de soja (4,55), beta-lactoglobulina A (5,2), anidrase carbónica B de bovino (5,85), anidrase carbónica B humana (6,55), mioglobulina de equino (6,85 e 7,35), lectina de lentilha (8,15, 8,45 e 8,65) e tripsinogénio (9,3). As pistas 2 e 3 são amostras de lipase MY (sem dessalinização/purificação). As pistas 4 e 5 eram de CSC-1 e as pistas 6 e 7 eram de CSC-2. Uma vez que não se conheciam os coeficientes de extinção das proteínas nas amostras, e a absorvância a 280 nm era artificialmente elevada devido à interferência de cromóforos, calculou-se o teor de proteínas adicionando 100 yil de soluções de proteínas a 3 ml de reagente de Pierce e determinou-se o DO a 595 nm, após 10 minutos (o espectrofotómetro não apresentou resultado com reagente). Deste modo, 50 mg de lipase MY em 1 ml de água proporcionaram um D0 de 595 de 0,4 (- 400 ^*g/ml),ou (-1,8¾ de proteína). 1,2 mg de CSC-2 em 1 ml de água proporcionaram um D0 595 de 0,34 (-340 yig/m.l, ou -28% de proteína).

No quadro 8 apresenta-se a composição aminoácida de CSC-1 e de CSC-2. -44-

QUADRO 8

Análise Aminoácida de CSC-1 e de CSC-2

Aminoácidos % Composição % Composição CSC-1 CSC-2 Alanina 9,57 8,05 Arginina 3,62 3,5 Acido Aspártico/ Asparagina 11,29 12,8 Cistina/2 N.D. N.D ácido glutâmico/ /Glutamina 10,76 10,6 -Glicina 9,7 10,3 -Histidina 1,78 1,39 -Isoleucina 4,6 4,46 -Leucina 7,9 8,3 Lisina 4,5 4,38 Metionina 1,58 1,99 Fenilalanina 4,3 5,0 Prolina 3,0 6,59 Serina 10,9 7,9 Treonina 7,0 6,2 Triptofano N.D. N.D. Tirosina 3,49 3,38 Valina 5,79 4,9 * Hidrólise de 6N- HCl/0,05% mercaptoetanol durante 20 horas 115°C; adicionou -se um cristal de fenol antes da hidrólise do ácido. Aumentou-se a serina em 10% e a teonina de 5% para compensar a destruição pelo ácido. N.D. não determinada

/

Purificou-se, posteriormente uma amostra de CSC-1, numa coluna C4 de fase inversa e num sistema dissolvente de ácido trifluoroacético a 0,07% em água, ácido trifluoroacéti-co a 0,7% em acetonitrilo. No sistema de eluição obtiveram-se as proteínas por gradiente de 20-50% de acetonitrilo. Resolveu-se CSC-2, de modo idêntico, por um gradiente de acetonitrji 10 de 45-75% nas mesmas condições de CSC-1. Depois, separam-se CSC-1 e CSC-2 por electroforese, transferiram-se para um filtro PVDF (Millipore) e efectuou-se a sequênciação da banda que migrou a 60 000 daltons. Não, é possível estabelecer com certeza a posição 10 de CSC-1, embora deva tratar-se de um triptofano, que se torna dificil identificar nas condições de sequênciação, devido, possivelmente a uma carboximetilação incompleta.

As composições dos novos isázimas, CSC-1 e CSC-2, encontram-se ilustradas pelas sequências aminoácidas da extremidade N, conforme se segue: CSC-1 I 5 10

Ala-Pro-Thr-Ala-Lys-Leu-Ala-Ans-Gly-(?) 11 15 20

Thr-Ile-Thr-Gly-Leu-Ans-Ala-Ile-Ile-Asn 21 25 30

Glu-Ala-Phe-Leu-Gly. - Ile-Pro-Phe-Ala-Glu- 31 35

Pro-Pro-Val-Gly-Asn- CSC-2 15 10

Ala-Pro-Thr-Ala-Thr-Leu-Ala-Asn-Gly-Asp II 15 20

Thr-Ile-Thr-Gly-Leu-Asn-Ala-Ile-Ile-Asn- -46- 21 25 30

Glu-Ala-Phe-Leu-Gly-Ile-X-X-Ala-Glu 31 35 39

Pro-Pro-X-X-Asn-Leu-Phe-IIe-Leu

Observou-se uma grande homologia sequencial entre CSC-1 e CSC-2 uma vez que estes enzimas apenas diferem nas po. sições 5 e 10 tanto quanto se sabe, habitualmente, das suas sequências.

Também se verificou que existe uma grande homologia sequencial de CSC-1 e acetil-colinesterase (AsEs) de Torpedo Californica, coma se demonstra a seçjuir: 4 CSC-1 Ala-Pro-Thr-Ala

AcEs Asp-His-Ser-Glu-Leu-Leu-Val-Asn-Thr-Lys-1 10 5 10 14 CSC-1 Lys-Leu-Ala-Asn-Gly-(?)-Thr-IleThr-Gly-AcEs Ser-Gly-Lys-Val-Met-Gly-Thr-Arg-Val-Pro-11 20 15 20 24 CSC-1 Leu-Asn-AI a-IIe-Ile-Asn^Glu-Ala-Phe-Leu-

AcEs Val-Leu-Ser-Ser-His-Ile-Ser-Ala-Phe-Leu- 21 30 25 30 34 CSC-1 Gly-Ile-Pro-Phe-Ala-Glu—Pro-Pro-Val-Gly-AcEs Gly-Ile-Pro-Phe-Ala-Glu— Pro-Pro-Vai-Gly-31 40 35 CSC-2 Asn-AcEs Asn- 41 47- /

No entanto, a acetilcolinesterase de T. californica não hidrolisa estereosselectivamente HPPA-Me- em R-HPPA no ensaio que se segue. Combinaram-se 200 mililitros de KI-^PO^ (pH 6,5) com 400 mg de HPPA-Me e 500 unidades de acetilcolines terase de T. californica. Agitou-se a mistura reaccional durante 24 horas e, depois analisaram-se as amostras, tal como no exemplo 3. Observou-se uma actividade hidrolítica muito fr£ ca.

Exemplo 14

Separação em larga escala de isózimas de lipase MY, utilizando SP-trisacryl.

Equilibrou-se uma coluna LS de SP-Trisacryl de 10 X 25 cm, com NaH2P0^ 25 mM (pH 3,0), (tampão A). Dissolveram-se 150 mg de lipase MY impura (Meito Sangyo), em 3,0 litros de NaH2pO^ 25 mM (pH 6,5), durante 2 horas. Centrifugou-se a suspensão a 10 000 X g, durante 20 minutos. Ajustou-se o pH da fracção solúvel para 3,0 com H^PO^ 5N . Filtrou-se a solução enzimática e dialisou-se durante 3 horas contra 100 volumes de água desio-nizada. Verteu-se a solução enzimática numa coluna de permuta de iões a 1,25 L /hora. Lavou-se, o material que não se ligou, através da coluna com tampão A. Efectuou-se uma eluição de pH em duas fases, primeiro com 5 litros de ácido cítrico 7 mM -Na2HP0^ 15 mM (pH 4,8), seguida de 5 litros de ácido cítrico 7 mM - Na2HP0^ 15 mM, a pH 6,80. Indica-se na fig. 7 o cromatogra_ ma resultante. Agregou-se o primeiro pico da proteína (pH 6,80) eluído pelo tampão, concentrou-se por ultrafiltração num disp£ sitivo de fibra oco (Amicon). A partir desta coluna recuperou--se um total de 1,35 mg de lipase CSC-1. Verificou-se por FIE, que esta proteína era idêntica à CSC-1 de lipase produzida no /-48- & exemplo 11. Exemplo 15

Hidrólise do éster metílico de HPPA com CSC-1 de lipase .

Hidrolisou-se, a 25°C, o éster metílico de R,S HPPA (25 mM) em 25 ml de Na2HP0^ 50 mM, a pH 6,5, com 50 yUg de enzima CSC-1 de lipase (a partir do exemplo 11). Após uma hora de reacção, recolheu-se uma amostra e, analisou-se por cromato-grafia liquida a alta pressão, em que se separaram as formas R e S dos ácidos e se determinou a respectiva concentração. Utilizou-se uma coluna analítica (150 X 4 mm) Resolvosil-BSA-7 (Macherey-Nagel) com ΚΗ£Ρ0^ 10 mM, a pH 5,0, e n-propanol a 5%, como a fase móvel a 2,0 ml/minuto. Nesse momento a reacção continha ácido de configuração R, 2,9 mM e não se detectava ácido de configuração S. Deixou-se prosseguir a reacção até a uma con versão de 46% do éster racémico, sendo nesse momento a proporção de ácidos formados de 97% de ácido de configuração R e de 5% de ácido de configuração S.

Exemplo 16

Hidrólise do éster etílico de HPPA com CSC-1 isento de lipase

Hidrolisaram-se 25 ml de éster etílico de R,S HPPA (20 mM), em Ν3£ΗΡ0^ 50 mM, a pH 6,5, a 25°C, com um 1 mg do enzima CSC-1. Após uma hora de reacção, recolheu-se uma amostra e analisou-se por cromatografia liquida de alta pressão para determinar a concentração dos ácidos R e S. Utilizou-se uma coluna analítica (150 X 4 mm) Resolvosil-BAS-7 (Macherey-Nagel), e utilizou-se KH2P0^ 10 mM (pH 5,5) e n-propanol a 5% como fase móvel a 2,0 ml/minuto. Decorrida uma hora, ocorrera uma hidrólise de 30% do éster racémico e a pureza enantiomérica do 49- ácido produzido era de 98% para o ácido de configuração R e de 2% para o ácido de configuração S.

Exemplo 17

Comparação da hidrálise de éster metílico de HPPA por CSC-1 e por CSC-2.

Colocaram-se dentro de dois balões de Erlenmeyer de 100 ml, vinte e cinco ml de tampão HPPA-Me 25 mM/KH2P0^ 100 mM (pH 6.5). Colocou-se CSC-1 num balão (uma fracção de 50 jxl elui^ da a partir da coluna de SP-Trisacryl, exemplo 11) e noutro balão, colocou-se CSC-2 (uma fracção de 50 yul, fracção eluída a partir da coluna de SP-Trisacryl, exemplo 11). Recolheram-se amostras das misturas reaccionais conforme se indica a seguir e analisaram-se, tal como no exemplo 3, dando origem aos seguiji tes resultados: QUADRO 9 CSC-1 CSC-2

Tempo (Hr) Conversão %R-HPPA Conversão 1 4 100 5 2 11 100 7 3 17 100 8 5 25 99 13 22 52 97 40 30 _ 49

“óR-HPPA 97 96 97 96 · 93 91

Tal como se indica, a percentagem de conversão do éjs ter metílico de HPPA, racémico, foi substancialmente elevada para CSC-1.A pureza enantiomérica do produto obtido com CSC-1 foi também superior, em comparação com a que se obteve com CSC--2, embora proporcionassem ambos resultados úteis.

Exemplo 18

Neste exemplo, faz-se a comparação dos resultados que se obtiveram por hidrólise de ésteres de cetoprofeno utilizando CSC-2 e lipase MY impura.

Adicionaram-se a uma solução de 9 ml de fosfato de amónio 100 mM, (pH. 5,5) em balões de Erlenmeyer de 50 ml, uma determinada quantidade de éster (quer directamente ou dissol^ vida em 200 de DMF). Adicionou-se uma solução da quantida de determinada de enzima em 1 ml do mesmo tampão. Agitou-se a mistura num misturador rotativo, a 250 rpm, a 35°C, durante 22 horas. Acidificou-se a mistura reaccional com 8 gotas de HCL 6 (N) a pH 1,5-2,0 extraiu-se com CHC1^4 (2 X 10 ml). Analisou--se a solução de CHCl^ por cromatografia liquida de alta pressão, (CLAR) para se determinar a percentagem de ácido produzido na hidrólise. Secou-se α extracto de CHCL^ (5 ml) da mistura reaccional de hidrólise sobre Na^SO^ anidro e filtrou-se. Arrefeceu-se o produto resultante da filtração até 0°C em frascos rolhados e adicionaram-se 100 ywl de N-metilmorfolina, seguidos de 100 jk 1 de cloroformato de isobutilo. Após ter-se agitado lentamente a 0°C, durante 10 minutos, adicionaram-se 100 y»l de D-(+)-l-feniletilamina e continuou-se a agitar lentamente a 0°C durante 5 minutos. Agitou-se então a mistura reaccional à temperatura ambiente, durante 5 minutos. Lavou-se a mistura reaccional com água (5 ml), HCL 1 (N) (5 ml) e, novamente com água (5 ml). Analisaram-se, então as amidas diastereoméricas produzidas, por CLAP numa coluna, como se fez especialmente notar, para se determinar o ee (%S-%R) do ácido produzido por /51- ϊ hidrólise enzimática dos ésteres.

Hidrolisaram-se os ésteres de cetoprofeno (50 mg) tal como anteriormente descrito. Efectuaram-se as análises por CLAP para a quantidade de ácido produzida pela hidrólise dos ésteres monogliceridico e etilenoglicólico de cetoprofeno, numa coluna (9,4 mm X 100 mm, Whatman), Partisil 5 ODS-3 RAC utilizando CH^OH: (NH^) t^PO^ 10 mM (60:40), a 4 ml/minuto e, monitorizando a 254 nm. Efectuaram-se as análises de CLAP do ácido produzido por hidrólise de outros ésteres, numa coluna ODS-3 RAC, utilizando CH30H: (ΝΗή) H2P04 10 mM (80:20) a 2 ml/ minuto e monitorizando a 254 nm. Determinou-se o excesso enan-tiomérico do cetoprofeno produzido por cada hidrólise, por aná lise das amidas por CLAP numa coluna ODS-3 RAC, utilizando-se CH^OH: (NH^H^PO^ 10 mM (60:40) a 4 ml/minuto e efectuando-se a monitorização a 254 nm. Os resultados encontram-se no quadro a seguir. QUADRO 10

Resultados da Hidrólise de Diversos Esteres de Cetoprofeno com CSC-2 e Comparação dos Resultados com os da Lipase MY Bruta.

Proporção ee do Reacção yummole/ S-ácido Ester Enzima em h/mq (¾) metílico Lipase MY tampão 0,002 36 CSC-2 tampão 0,222 96 n-butílico Lipase MY tampão 0,005 88 CSC-2 tampão 0,519 > 99 CSC-2 duas fases* 0,314 > 99 n-octllico Lipase MY tampão 0,004 94 CSC-2 tampão 0,192 ND CSC-2 duas fases* 0,069 ND 2-cloroetllico Lipase MY tampão 0,014 32 CSC-2 tampão 1,405 98 CSC-2 duas fases* 2,735 98 2,2,2-trifluoro£ tílico Lipase MY tampão 0,023 15 CSC-2 tampão 2,931 78 CSC-2 duas fases* 1,855 81 monoglicerilico Lipase MY tampão 0,034 77 CSC-2 tampão 2,079 98 CSC-2 duas fases* 3,815 ND * Iso-octano - 100 mM (NH4 )H2P04 (pH 5,5) (1 : 1) sistema de duas fases. ND = Não determinado '-53-

Como é evidente, obtiveram-se valores de ee e, proporções de hidrólise muito melhores, utilizando CSC-2, em com paração com os valores obtidos com a lipase MY, na hidrólise dos ésteres de cetoprofeno.

Este exemplo também indica resultados úteis (por exem Pio, proporção e ee elevados) quando se utiliza um sistema bi--fásico, que inclua iso-octano.

Exemplo 19

Neste exemplo faz-se a comparação dos resultados que se obtiveram na hidrólise do monoglicerido de cetoprofeno, ut_i lizando lipase MY impura, CSC-1 e CSC-2. A uma solução de 9 ml de tampão de fosfato de amónio 100 mM (pH 5,5), adicionaram-se 50 mg de monoglicerido de ceto profeno directamente ou dissolvido em 200 jkI de DMF, seguida de uma solução de enzimas em 1 ml do mesmo tampão. Após ter-se agitado, a 250 rpm, a 35°C, durante 22 horas, acidificaram-se as misturas reaccionais e extraíram-se com clorofórmio (2 X 10 ml) e, analisaram-se por CLAP, para se determinar a quantidade de ácido pr£ duzida e, analisou-se, tal como descrito no exemplo 18. Indi-cam-se a seguir, os resultados.

\ QUADRO 11

Resultados da Hidrólise do Monoglicerido de Celoprofeno

Percentagem de Acido a EE do Calc.EE Percentagem partir da Propor S-áci do S-aci DMF Enzima de ácido Hidrólise ção do(?ó) do (%)' 200 ul Sem Enzima 0,3 0 ul Sem Enzima 0,4 200 ul Lipase MY (50 mg) 28,3 28,0 0,039 75,2 76,0 0 ul Lipase MY (50 mg) 27,2 26,8 0,037 68,0 69,0 200 ul CSC-2 (1 mg) 21,3 21,0 1,455 95,4 96,6 0 ul CSC-2 (1 mg) 27,7 27,3 1,891 96,4 97,8 200 ul CSC-1 (1 mg) 3,6 3,3 0,229 74,6 81,0 0 ul CSC-1 (1 mg) 4,5 4,1 0,284 84,6 92,6 . Calculado por subtracção das formas R e S de ácido presentes no material de partida com impurezas

Os resultados indicam que é preferível utilizar CSC--2 com o monoglicerido de cetoprofeno, devido à sua proporção de hidrólise substancialmente superior e melhor excesso enan-tiomérico (ee).

Exemplo 20

Efeito da dimetil-formamida (DMF) na hidrólise.

Efectuou-se a hidrólise do monoglicerido de cetoprofeno (50 mg) em diversas misturas de tampSes (pH 5,5), DMF -(ΝΗ^Ι^ΡΟή 100 mM. Adicionou-se a cada balão uma solução de -*55-

V .¾ i monoglicerido de cetoprofeno (50 mg) em DMF (200 Adicio nou-se DMF, seguido de uma solução tampão de (NH^Í^PO^ 100 mM. Adicionou-se uma solução de 1 mg de CSC-2 purificado, em 0,5 ml de tampão. Decorridas 22 horas, acidificam-se amostras de DMF a 2%, 5% e 10%, extraíram-se com CHCl^ (2 X 10 ml) e analisaram-se. As outras amostras analisaram-se directamente, tal co mo se descreveu no exemplo 18. 0 ácido produzido decresceu com o aumento da quantidade de DMF. % DMF % ácido 2 23 5 18 10 11 20 3 30 0,7 40 0,3 50 0,4

Exemplo 21

Hidrólise em grande escala de monoglicérido de cetoprofeno.

Adicionou-se, a uma solução de 100 mg de CSC-2 em 500 ml de tampão de fosfato de amánio 100 mM (pH 5,5), em balões de Fernbach de 2 litros, uma solução de 10 g de monoglicerido de cetoprofeno em 10 ml de DMF. Apás agitação, num mis^ turador rotativo a 300 rpm, a 35°C, durante 166 horas, ajustou -se a mistura reaccional para pH 10, com NaOH 1 M e extraíu-se com acetato de etilo (3 X 500 ml) para eliminar a fracção neutra (contendo o éster de cetoprofeno). Acidificou-se a camada aquosa (contendo ácido cetoprofénico) para pH 1,5 com HC1 6 N e, extraíu-se com acetato de etilo (3 X 500 ml). A eliminação /-56- 1 % dos dissolventes do éster e do ácido, proporcionou, respecti-vamente, 6,55 g (65,5/¾) de éster impuro e 2,32 g (30¾) de áci_ do impuro. Cristalizou-se o ácido impuro no seio de etanol diluído em água para se obter 1,69 g (21,8¾). de cetoprofeno sob a forma de um pó branco. Verificou-se, por CLAP das amidas, tal como se descreveu no exemplo 18, que o ácido possuía um excesso enantiomérico de 91,3¾ para o ácido com a configuração S. Exemplo 22

Neste exemplo, demonstra-se o efeito de DMF e agentes tensioac-tivos na hidrólise do monoglicérido de cetoprofeno em cetoprofeno utilizando CSC-2. Os tensioactivos utilizados foram o Tween 80 e Span 85.

Adicionaram-se pequenas quantidades de DMF à mistura reaccional para aumentar o solubilidade de monoglicérido de cetoprofeno (MCP). Utilizou-se em todos os casos tampão de fosfato de amónio 100 mM (pH 5,5) e, adicionaram-se 2¾ (v/v) de detergentes e, o volume total era de 10 ml. 0 MCP foi adicionado directamente ou dissolvido em 200 de DMF. Em todos os casos a proporção enzima substracto de 1:50. Fornecem-se, a seguir, os resultados que se obtiveram, após análise efectuada tal como se descreveu no exemplo 18.

QUADRO 12

Efeito de DMF na hidrólise de KRG na presença de detergentes KPG DMF Tween-80 em tampão Span-85 em tampão (mg) (/Jl) Proporção Proporção Rei. %ee Proporção Proporção Rei. %e 50 200 1,63 .. 1001 96 1,37 1002 9 j 100 200 0,64 40 92 2,39 175 96 200 200 0,28 17 86 1,47 107 91 50 0 2,10 129 97 3,69 269 91 100 0 1,62 99 96 2,9? 216 91 200 0 1,04 64 93 1,70 124 91 = estabeleceu-se 100 comonorma para todas as reacções em Tween-80 2 = estabeleceu-se 100 como norma para todas as reacções em Span-85

Os resultados obtidos indicam o efeito prejudicial de DMF na proporção e no ee. A utilização de tensioctivos proporcionou uma boa proporção e um bom ee.

Exemplo 23

Hidrólise do monoglicérido de cetoprofeno num sistema bi-fási-co aquoso-orgânico.

Adicionou-se monoglicérido de cetoprofeno (10,9 mg) em DMF (50 y^l) a diversos dissolventes orgânicos (2 ml de cada) e adicionou-se a cada um, uma solução de CSC-2 (0,4 mg) em tampão de fosfato de amónio 100 mM (pH 5,^ 2 ml). A reacção com tampão (entrada # 2 no quadro) continha enzima em tampão (2 ml) e a reacção apenas com tampão (entrada Sjj^l, no quadro) não continha enzima.

Após ter-se agitado a 150 rpm, analisaram-se as mis- -58- turas reaccionais, de acordo com métodos normalizados, tal como descrito no exemplo 18. No quadro 13, indicam-se os resultados . 59- t" / QUADRO 13

Hidrólise do Monoqlicérido de Cetoprofeno por .CSC-2 em siste- mas de duas fases - orgânica - aquosa N° Solvente Proporção relativa EE do S--ácido(%) 1 Apenas com tampão (sem enzima)* 2 Tampão 100 96 3 Hexano 80 93 4 Iso-octano 214 96 5 Ciclo-hexano 185 95 6 Ciclo-hexeno 146 89 7 Ciclo-octeno 387 95 8 Tolueno 15 58 9 Xilenos 44 81 10 Etil-benzenos 18 48 11 Cumene 91 86 12 1,2,3,4-Tetra-hidro-naftaleno 136 85 13 Tetracloreto de carbono 48 95 14 Clorofórmio S 0 15 Dicloro-metano 0 16 1,1,1-Tricloro-etano 25 75 17 Dicloreto de etileno S 0 18 1,1,2-tricloro-etano S 0 19 Tetracloro-etileno 3 27 20 1,1,2-Tricloro-trifluoro-etano 123 99 21 Eter etílico S 0 22 Eter isopropllico 53 69 23 Eter n-butllico 59 69 24 Ciclo-hexanona S 0 25 3-íPentanona S 0 26 n-butanol S 0 27 n-hexanol S 0 28 n-0ctanol S 0 29 Alcoól benzílico 0 30 Acetato de etilo 0 * Todos os valores do quadro foram corrigidos por este contro- lo S reacções que duraram 16 horas, todas as outras tiveram a duração de 26 horas.

Os resultados anteriores mostram que se podem utilizar determinados dissolventes de baixa polaridade para melhorar a proporção de hidrólise com efeitos mínimos sobre o excesso enantiomérico.

Exemplo 24

Imobilização de CSC-2 e a sua utilização na hidrólise do mono-glicérido de cetoprofeno.

Adicionou-se a 10 ml de fosfato de amónio 100 mM (pH 5,5), uma solução de 50 mg de monoglice^rido de cetoprofeno em 200 y*l de DMF, seguindo-se-lhe CSC-2 (imobilizado, de acordo com diferentes métodos e, contendo o equivalente a 2 mg de CSC-2). Após ter-se agitado a 250 rpm, a 35°C, acidificaram-se as misturas reaccionais, extraíram-se com clorofórmio e, analisaram--se por CLAP, de acordo com o exemplo 8. No Quadro 14, indicam -se os resultados.

Os métodos de imobilização foram os seguintes: 1) 269-1

Misturaram-se 2 mg de lipase CSC-2 com 0,3 g de Amberlite DP-1 e 200 mg de XAMA-7 em 10 ml de ciclo-octeno. Agitou-se a mistura, à temperatura ambiente, durante 4 horas, antes de se evaporar o ciclo-octeno. Lavou-se o enzima imobilizado com água Dl e, armazenou-se a 4°C. 2) 269-11

Idêntico a 269-1, com excepção de se terem adicionado 50 mg de ácido esteárico. 3) Idêntico a 269-1, com excepção de se terem adicionado 50 mg de hexadecilamina.

4) 269-A a 2G

Idêntico a 269-11. Ajustou-se o pH da Amberlite DP-I, con- -61- forme se segue: 2A pH 3,5 2B pH 4,5 2C pH 5,5 2D pH 6,5 2E pH 7,5 2F pH 8,5 2G pH 9,5

5) 269-5A

Agitaram-se 2 mg de lipase CSC-2, dissolvidos em 1 ml de tampão fosfato (0,01 M, pH 6,5), com gotas de celulose (0,5 g) activadas com periodato de sódio (5%), à temperatura ambieji te. Lavou-se o enzima imobilizado com água desionizada e armaze nou-se a 4 C.

6) 269-5B

Agitaram-se 2 mg de lipase CSC-2, dissolvidos em 1 ml de tampão fosfato (0,01 M, pH 6,9), com 0,58 g de Affi-Prep 10, à temperatura ambiente, durante 24 horas. Lavou-se o enzima imobilizado e, armazenou-se a 4°C.

7) 269-7F

Equilibrou-se resina Amberlite DP-1, a pH 3,5, lavou-se com acetona e, desidratou-se a 100°C. Misturam-se 2 mg de lipase CSC-2, em 1 ml de tampão fosfato (0,01 M, pH 5,0) com 0,3 g de resina desidratada e liofilizou-se a mistura. Agitou-se o er^ zima liofilizado em 5 ml de ciclo-octeno contendo ácido esteárico (50 mg) e XAMA-7 (50 mg), à temperatura ambiente e, deixou-se o ci^ clo-octeno evaporar, durante a noite. Lavou-se o enzima imobilizado e armazenou-se a 4°C. Utilizaram-se gotas de celulose para se preparar 269-7G, de acordo com o mesmo procedimento, Dowex 50 w X 4 para 269-7E e Amberlite A15 para 269-7D. -62-

8) 269-8A

Idêntico a 269-7F mas com XAMA-7.

269-8B

Idêntico a 269-7F

9) 269-9A

Agitaram-se 2 mg de lipase CSC-2, com 0,5 g de gotas de celulose activadas por ^2^4 em tampão, a pH 5,0, durante 20 horas recolheu-se o enzima, lavou-se e, armazenou-se a 4°C.

10) 269-9B

Idêntico a 269-9A, mas a pH 7,0. 11) 269-10

Misturaram-se 25,1 mg de lipase CSC-2, com 0,2 g de celulose CM em 5 ml de ciclo-octeno, contendo 1,0 ml de ácido esteárico a 10%. Agitou-se a mistura durante 1 hora antes de se adicionarem 2,0 ml de XAMA-7 a 10%, no mesmo dissolvente. Agitou-se a mistura, à temperatura ambiente durante a noite e, eva porou-se durante a noite o ciclo-octeno. Recolheu-se 0 enzima imobilizado, lavou-se e armazenou-se a 4°C.

12) 269-11A e 269-11D

Misturaram-se 10 mg de lipase CSC-2 e 150 mg de glicose em 5 ml de água desionizada, com 1,25 g de Amberlite DP-1 (pH 3,5) e, liofilizou-se a mistura. Agitou-se o enzima liofiliza-do em 20 ml de ciclo-octeno (269-11A) ou de 1,1,2-tricloro-tri^ fluoroetano (269-11D) com 250 mg de XAMA-7 e 500 mg de ácido ess teárico. Utilizou-se este procedimento para se prepararem 269--11B, 269-11C, 269-11E e, 269-11F.

13) 269-12A

Idêntico a 269-9B mas, com EDTA a 0,1%.

269-12B /-63-

Idêntico a 269-12A, mas a pH 8,5. 14) 269-13

Idêntico a 269-8A, mas, com adição de 110 mg de amido.

15) 269-MA

Misturaram-se 10 mg de lipase CSC-2 em 5 ml de água desio-nizada, com 1 g de gotas de celulose desidratada e liofilizou--se a mistura. Imobilizou-se o enzima liofilizado em 20 ml de ciclo-octeno com 400 mg de ácido esteárico e 200 mg de XAMA-2. Utilizaram-se gotas de celulose CM para se preparar 269-14B. 16) 279-SD1

Adicionou-se a 1 g de sílica (Sepharosil, 400 LS, IBF), uma solução de 10 mg de lipase CSC-2 em 4 ml de tampão de fo£ fato de amdnio 100 mM (pH 5,5) e agitou-se lentamente a mistura, durante 22 horas. Filtraram-se os sálidos e, lavaram-se com o mesmo tampão (5 X 10 ml). Descobriu-se que a solução não possuía actividade, toda a actividade se tinha conservado na parte sólida. •64- f .¾ QUADRO 14

Estudos com CSC-2 Imobilizado

Actividade (¾) de ee do CSC-2 S-ácido

Cddiqo

imobilização com DP-1 livre 269-1 1 ND 269-11 23 70 269-11 5 ND 269-2A a -2G 1-5 ND 269-7F 51 80 269-8A 9 ND 269-8B 38 70 269-11A 41 81 269-11D 22 81 269-13 4 ND Imobilização com celulose 269-7G 59 87 269-11B 31 76 269-11E 7 ND 269-14A 48 87 Imobilização com CM-eelulose 269-10 7 ND 269-11C 50 82 269-11F 40 82 269-14B 61 85 Imobilização com celulose activada por periodato 269-5A 27 96 269-9A 10 92 269-9B 17 93 269-12A 7 ND 269-12B 7 ND

Imobilização com outros suportes 269-5B 11 76 269-7D 1 ND 269-7E 6 ND 279-SD1 107 97 ND = Não determinado

Exemplo 25

Imobilização do ensózima de lipase CSC-2 purificado em Eupergit C e a aua utilização na hidrólise.

Lavou-se 1 mg de resina Eupergit C (Hoechst), com 20 volumes de Νθ2ΗΡ0^ 0,1 M, a pH 6,0. Adicionaram-se à resina seis mililitros do mesmo tampão contendo 3,0 mg de lipase purificada e deixou-se reagir a 4°C mexendo lentamente, durante 16 horas. Lavou-se, então este agente catalítico com 10 volumes de tann pão pH 6,0 . Adicionou-se o agente catalítico a 100 ml de HPPA-Me 25 mM em Na2HP0^ 50 mM, a pH 6,5 a 25°C e agitou-se lentamente. A recuperação da actividade relativa do enzima imobilizado foi de 39%, com base nos ensaios de CLAP da conversão de éster em ácido de configuração R e ácido de configuração S. A hidrólise a 42% do éster R-S em ácido foi de 97% de R.

Exemplo 26

Neste exemplo, descreve-se o efeito dos ácidos orgânicos na itno bilização da lipase MY.

Misturou-se lipase MY (0,45 g), Amberlite DP-1 desidratada (0,9 g) e XAMA-7 (propionato de pentaeritritol-tris--(beta-N-aziridinilo) (100 mg ), em 10 ml de tolueno contendo um dos seguintes ácidos saturados: ácido propiónico (30 mg), ácido butírico (30 mg), ácido valérico (30 mg), ácido hexanoico -66-

(30 mg), ácido heptanoico (30 mg), ácido octanoico (40 mg), ácido nonanoico (40 mg), ácido decanoico (40 mg), ácido unde-canoico (40 mg) ácido láurico (40 mg), ácido tridecanoico (40 mg), ácido mirístico (40 mg), ácido pentadecanoico (50 mg), ácido palmitico (50 mg), ácido heptadecanoico (50 mg) ácido esteárico (50 mg) ácido docosanoico (30 mg), ácido eicosanoico (50 mg) e ácido tetracosanoico (50 mg). Agitaram-se as misturas, â temperatura ambiente e depois evaporou-se, cuidadosamente, o tolueno. Hidrataram-se as preparaçães de enzima imobilizado, lavaram-se com água desionizada e ensaiaram-se. Como se indica na fig. 8, um ácido de 18 carbonos, o ácido esteárico, proporciona percentagens de imobilização superiores.

Exemplo 27

Efeito do ácido esteárico na actividade da lipase.

Misturaram-se 0,45 g de lipase MY, 0,9 g Amberlite DP-1 desidratada e 100 mg de XAMA-7, em 10 ml de tolueno contendo 4,5, 11,25; 22,5; 45 e 90 mg de ácido esteárico, de acordo com o procedimento do exemplo 24. Na fig. 9, indicam-se os resultados.

Exemplo 28

Optimizaçao da adição de ácido esteárico para imobilização.

Agitaram-se 3,6 g de lipase MY, em 200 ml de tampão de acetato de sádio (1 M, pH 3,5) com 27 g de Amberlite DP-1 e ajustou-se o pH para 4,5 com ácido acético. Agitou-se a mistura a 4°C durante a noite e recolheram-se as gotas, lavaram-se com água desionizada e liofilizaram-se para se obter 8,1 g de gotas secas. Adicionaram-se então as gotas, (1 g), a 10 lm de t£ lueno contendo 100 mg de XAMA-7 e 10; 25 ou 50 mg de ácido esteárico e misturou-se lentamente. Indicam-se na figura 10 os r£ -67- sultados do ensaio, que se obtiveram tal como descrito no exem pio 24.

Exemplo 29

Imobilização de CSC-1 com poliaziridina.

Combinaram-se 500 mg de isúzima CSC-1 com 0,5 gramas de álcodl de polivinilo hidrolisado a 75¾ (3000 MW) e 230 ml de água desionizada arrefecida com gelo e misturam-se, durante 15 minutos. Adicionou-se à mistura 100 gramas de resina de pe£ muta de iSes, Amberlite DP-1 anidra (Rhom-Haas), a pH 7,0. Dei^ xou-se a mistura em repouso, durante 20 minutos, à temperatura ambiente antes de se liofilizar o material. Apds ter-se compl£ tado a liofilização, adicionaram-se às gotas uma mistura de 140 ml de tolueno e 3,5 gramas de ácido esteáricoedeixou-se em repouso durante 1 hora. Adicionou-se à mistura, 40 ml de tolue_ no e 7 gramas do pré-polímero de poliaziridina de XAMA-7, e ad_i cionou-se novamente igual quantidade, uma hora mais tarde. Cobriu-se a mistura e agitou-se lentamente durante um período de 4 horas, tendo-se neste ponto, evaporado o tolueno lentamente. Lavou-se a preparação de enzima imobilizado com duas aliquotas de 250 ml de água desionizada.

Determinou-se a actividade do CSC-1 purificado numa forma solúvel, era de 550 yuMoles/hora/mg a uma conversão de 35¾ de HPPA-Me em HPPA. Descobriu-se que o CSC-1 imobilizado desta experiência possuia uma actividade de 920 y*Moles/hora/g de gotas imobilizadas a uma conversão de 37?ó ou 231 mMoles/ho-ra para o lote total. Verificou-se que o material de lavagem das gotas possuía uma actividade de 32 mMoles/hora em todos os materiais de lavagem. Com base nestes dados, descobriu-se que 84¾ da actividade do enzima estava imobilizada, 12¾ encontrava- -68-

-se no material de lavagem e não se quantificou 4% da activi-dade.

Exemplo 30

Neste exemplo ilustra-se o efeito do álcool polivini-lico (PVA) na imobilização de CSC-1 de lipase e na sua activi-dade.

Liofilizaram-se 5 mg de CSC-1 de lipase em 5 ml de água desionizada, com Amberlite DP-1 (0,3 g) e, 0, 10,.20, 30, 40 e 50 mg de álcool de polivinilo (MW 3 000, hidrolisado a 75% ou MW 10 000, hidrolisado a 88%). Imobilizou-se então o enzima com 50 mg de ácido esteárico e 50 mg de XAMA-7 em 6 ml de tolu£ no. Após ter-se evaporado o tolueno, ensaiou-se o enzima imobilizado com HPPA-Me e, calculou-se a actividade relativa do enzi_ ma. PVA (MW 3.000) Actividade Relativa (mg) (%) 0 100 10 149 20 145 30 143 40 136 '50 153 PVA (MW 3.000) Actividade relativa (mg) (¾) 0 100 10 119 20 123 30 126 40 121 50 97

Os resultados anteriores mostram que a adição de PVA serve para aumentar a actividade relativa de CSC-1 de lipase.

Exemplo 31

Imobilização da lipase MY impura.

Combinou-se 1 grama de lipase MY com 25 ml de Na^HPO^ 25 mM, a pH 6,5 e misturou-se bem, durante 20 minutos e depois centrifugou-se. Arrefeceu-se o sobrenadante para 10°C e adicionou-se a 13 mililitros de Amberlite DP-1 anidra (pH 7,0). Liofilizou-se, então, este material. Adicionou-se uma jis tura de 16 ml de tolueno e 0,42 g de ácido esteárico do material liofilizado e agitou-se durante uma hora. Depois, adicionou-se uma mistura de 10 ml de tolueno e 2,5 g de pré-polímero de XA-MA-7, durante um período de uma hora. Cobriu-se a mistura e deixou-se em agitação durante 4 horas após o que o tolueno eva porou lentamente. Lavaram-se as gotas duas vezes com aliquotas de 100 ml de água desionizada. Uma comparação da actividade hjL drolítica sobre HPPA-Me de lipase MY e lipase MY imobilizada demonstrou que a actividade da lipase MY foi de 4700 yuiMoles/ hora/grama a uma conversão de 17¾ de HPPA-Me em HPPA. A lipase MY imobilizada possuía uma actividade de 2160 yiMoles/hora/lote a uma conversão de 16¾. Os materiais de lavagem possuíam uma actividade estimada em 175 yUMoles/hora/lote. Deste modo, conservou-se 50¾ da actividade do enzima, da actividade original 46¾ encontrava-se imobilizada e, 4¾ encontrava-se no material de lavagem.

Exemplo 32

Isolamento do ácido R-2-(4-hidroxifenoxi)-propidnico.

Dissolveu-se éster metílico de RS-HPPA (2 moles; 392 gm) em 1500 ml de tolueno. Adicionaram-se ao tolueno três litros de acetato de amónio 0,58 M, a pH 6,5. e 3 g de Na2 ^0^. Adicionou-se lipase MY imobilizada (160 ml, preparada de acordo

com o exemplo 9), à mistura de duas fases do substracto anterior e, deixou-se reagir com agitação a 25°C, durante 120 horas. Neste ponto, 40,8% do éster encontrava-se hidrolisado. Separou-se a fase aquosa da camada orgânica e ajustou-se o pH para 7,0. Extraiu-se esta fase 4 vezes com 0,25 volumes de cl£ reto de metileno, para eliminar o éster. Ajustou-se a fase aqu£ sa para pH 2,5 e extraiu-se 4 vezes com 0,25 volumes de acetato de etilo. Adicionou-se MgSO^ (anidro) ao acetato de etilo para eliminar a água e, filtrou-se a camada orgânica. Eliminou--se o acetato de etilo em condições de pressão reduzida, a 50°C deixando o ácido R-2-(4-hidroxif enoxi) propiónico sdlido. 0 áci do continha 95% de ácido com a configuração R e 5% de ácido com a configuração S.

Exemplo 35

Neste exemplo demonstra-se o melhoramento do tempo de vida do agente catalítico imobilizado^ CSC-1.

Colocou-se CSC-1 imobilizado (19 ml), preparado tal como no exemplo 29, numa coluna de cromatografia de 1 cm X 24 cm . Lavou-se, então este material com 50 volumes da coluna de água desionizada para eliminar a proteína não ligada. Preparou-se substrato HPPA-Me 25 mM, por combinação de 34,8 g de K^HPO^, 4 litros de água desionizada e 4 g de ditionito de sódio, ajus tando-se o pH para 6,5, utilizando ácido fosfórico e adicionan do depois 19,6 gramas de R,S-HPPA-Me. Fez-se passar esta solução através de um enzima a 0,75 ml/minuto (2,4 volumes de col£ na/hora). Analisaram-se as amostras diáriamente para se determinar a actividade enzimática do agente catalítico.

Conforme se indica· na figura. 11, tratou-ee- a coluna durante período de 40 dias sem perda aparente da actividade catalítica. -71- /

Exemplo 34

Preparação de lipase de Candida rugosa por cromatografia QA-Tri sacryl M.

Como um método alternativo para se isolar CSC-1 da l_i pase, dissolveram-se 2,1 mg de lipase MY (meito Sangyo) em 32 ml de água desionizada e dialisou-se contra Na2HP04 25 mM, a pH 6,3.Eliminaram-se os sólidos por centrifugação. Aplicou-se a proteína numa coluna QA-Trisacryl M (IBF), de 2,5 X 4,0 cm, equilibrada com histidina 25 mM - HC1 a pH 6,0, a 62 ml/hora. Lavou-se a coluna com o mesmo tampão até que a absorvância a 280 nm atingisse a linha base. Recuperou-se um grande pico de material não ligado a A2gg con^enc*0 CSC-1 de lipase e 4-5 componentes proteicos menores, com base numa análise FIE com pH conn preendido entre 3-9 utilizando um sistema' de gel Pharmácia Phast.

Eluíu-se a proteína que se ligou à coluna de QA-Tris£ cryl M, utilizando um gradiente de 200 ml de NaCl entre 0 e 0,3 M, em histidina -HC1 25 mM, a pH 6,0.

Ensaiou-se a fracção representativa de CSC-I para a hidrólise estereosselectiva do éster metílico de R,S-HPPA, tal como descrito no exemplo 3. A 41¾ de conversão o produto consÍ£ tia em 98?ó ácido de configuração R.

Exemplo 35

Hidrólise do éster metílico de ibuprofeno.

Submeteu-se o éster metílico de ibuprofeno (200 mg) a hidrólise enzimática, tal como descrito no exemplo 18 e dete£ minou-se a quantidade de ácido produzida por CLAP numa coluna ODS-3 RAC, utilizando CHjOH: (NH4)H2P04 10 mM (80:20), 2 ml/ minuto e monitorizando a 220 nm. Determinou-se o ee de ácido produzido por conversão em amida diastomérica, tal como no exern -72- ./

( pio 18 e analisou-se por CLAP numa coluna Hibar Lichrosorb Si60 (5 ymm, 4 mm X 25 cm, E. Merck), utilizando Ct^C^iCHjCN (96:4) como eluente a 2 ml/minuto e monotorizando a 254 nm. No quadro a seguir, indicam-se os resultados. QUADRO 15

Resultados da Hidrólise do Ester Metílico de Ibuprofeno

Percentagem Proporção % eè do ácido de

Balão DMF Enzima de ácido Mole/hr/mg confiquração S 1* 200 μΐ Sem enzima 0 4 200 l·1 Lipase MY (50 mg) 29 0,2 96 5 0 yjl Lipase MY (50 mg) 28 0,2 96 6 200 f-1 CSC-2 (1 mg) 32 13,3 97 7 0 t11 CSC-2 (1 mg) 28 11,4 98 8 200 f1 CSC-1 (1 mg) 4 1,8 96 9 0 H1 CSC-1 (1 mg) 5 2,1 95 * Para este ensaio de controlo utilizaram-se 100 mg de éster metílico de ibuprofeno

Exemplo 56

Hidrólise do éster metílico de fenoprofeno:

Utilizou-se o éster do mesmo modo que sem qualquer DMF.

Submeteu-se éster metílico de fenoprofeno (56 mg ou 112 mg) a hidrólise enzimática, de acordo com o descrito no exemplo 18 e determinou-se a quantidade de ácido produzida por CLAP numa c£ luna 0DS-3RAC, utilizando CHjOH: (NH4)H2P04 10 mM (60:40), co mo eluente a 4 ml/minuto e monitorizou-se a 254 nm. Determinou_ -se o ee do ácido produzido por conversão em amidas diastoméri_ cas tal como no exemplo 18, e analisando depois por CLAP numa coluna Hibbar Lichrosorb Si60 (5 j\m), utilizando C^C^íCH^CN (96:4) a 2 ml/minuto e monitorizando a 254 nm. Indicam-se os resultados no quadro que se segue.

Hidrólise do Ester Metílico de Fenoprofeno

Proporção ee do ácido de con

Ester Enzima Acido (?á) juMole/hr/mg fiquração 56 mg Sem enzima 0 56 mg Lipase MY (50 mg) 16 0,03 80 112 mg Lipase MY (50 mg) 17 0,07 89 56 mg CSC-2 (1 mg ) 22 2,2 96 112 mg CSC-2 (1 mg ) 13 2,6 96 56 mg CSC-1 (1 mg) 20 2,0 95 112 mg CSC-1 (1 mg) 14 2,8 96 Exempl o 37 Neste exemplo descreve -se a hidrólise do éster metílico do áci do 2-fenil-propiónico.

Submeteu-se o éster a hidrólise enzimática sem adição de DMF, efectuada de acordo com o descrito no exemplo 18. Detejr minou-se a quantidade de ácido produzida por CLAP numa coluna ODS-3 RAC, utilizando CH^OH: (NH4)H2P04 10 mM (60:40) a 4 ml/ minuto e, monitorizando a 220 nm. 0 ácido produzido na reacção foi convertido nas amidas diastoméricas, tal como no exemplo 18, e analisado numa coluna Hibbar Lichrosorb Si60 (5 jxm) util_i zando C^C^^CH^CN (98:2) a 2 ml/minuto e monotorizando-se a 254 nm para se determinar o excesso enantiomérico. Indicam-se os resultados no quadro 16, a seguir: -74- QUADRO 16

Hidrólise do éster metilico do ácido 2-fenilpropiónico

Ester Enzima Percentagem Proporção ee do ácido de de Acido pMole/hr/mg configuração S (! (mg) 43,7 Lipase MV (50 mg) 28 0,07 88 31 0, 08 88 46,7 CSC- 2 (1 mg) 18 2,4 93 17 2,1 93 47,4 CSC-1 (1 mg) 9 1,2 91 9 1,2 89

Exemplo 38

Neste exemplo descreve-se a hidrólise do monoglicérido de indo-profeno.

Submeteu-se a hidrólise o monoglicérido de indoprofe-no (50 mg), tal como descrito no exemplo 18, com quantidades si£ periores de enzimas, tal como se indica no quadro 17. Decorridas 68 horas, extraiu-se a mistura reaccional de acordo com o procedimento indicado no exemplo 18 e determinou-se a quantidade ácido produzido, por CLAP numa coluna ODS-3 RAC, utilizando CH-jOH- (NH^)H2P0^ 10 mM (60:40) a 4 ml/minuto e detecção a 254 nm. Determinou-se o excesso enantiomérico por CLAP da amida diajà tomérica (preparada de acordo com o exemplo 18) no mesmo sistj3 ma. 0 isómero R e o isómero S da amida do autêntico R,S-indoprçj feno proporcionou picos numa área ligeiramente diferente e, ca^L culou-se o excesso enantiomérico tendo em conta esta diferença. Para além disto, separou-se uma pequena quantidade de mistura -75-

reaccional em ácido e éster por extracção com NaHCO^ e determinaram-se e referem-se adiante as suas rotações. Por analogia com outros profenos, designou-se o ácido com rotação positiva e cuja amida diastomérica com D-(+)-l-fenil-etil-amina que se eluiu posteriormente no sistema CLAP por configuração S.

No quadro 17 indicam-se os resultados. QUADRO 17

Hidrólise do monoglicérido de Indoprofeno Rotação Acido (S- R) Acido Observada ' Enzima Acido ' (?0 Proporção («) (30 Acido Ester RS-Indoprofeno 15,8 Lipase MY 8.2 0,0017 -35,4 51,2 (R) +.012 +.005 (100 mg) CSC-2 2.3 0,0048 40,8 25,0(S) -.007 -.005 (10 mg) CSC-1 1.8 0,0037 -43,8 59,6(R) +.013 +.002

Exemplo 39 0 efeito de Tween 80 na hidrólise do monoglicérido de cetopro-feno por CSC-2, demonstra-se a seguir. A presença de um tensioactivo, tal como o Tween 80, aumenta a solubilidade dos compostos lipofllicos na água. Efec-tuaram-se ensaios para se descobrir se o tensioactivo podia aumentar a solubilidade do monoglicérido de. cetoprofeno e determinar os seus efeitos na hidrólise com CSC-2. Em balões de 50 ml, dissolveu-se 1 mg de CSC-2 em 10 ml de tampão (NH^h^PO^ 100 mM (pH 5,5). Adicionou-se Tween 80 para se obter uma solu-

ção a 1% e a 2% (v/v). Adicionou-se a cada um dos dois balSes albumina de soro de bovino (BSA) (10 mg). Adicionou-se a cada um deles uma solução de 50 mg de monoglicerido de cetoprofeno em 200 jxl de DMF. Decorridas 20 horas, acidificaram-se as mi£ turas de reacção a 250 rpm e 35°C, extrairam-se e analisaram--se de acordo com o procedimento usual CLAP, descrito no exem pio 18. No quadro 18 indicam-se os resultados. QUADRO 18

Efeito de "Tween 80" e de BSA na Hidrólise

Reacçao Proporção relativa ee do ácido de configuração S (¾) Sem Tween nem BSA 100 98 1% Tween e BSA 114 95 2% Tween e BSA 142 96 2% Tween sem BSA 118 96 Exemplo 40

Utilizaram-se diversos tensioactivos a 2% do volume reaccional para se determinar o seu efeito na reacçao enzimát_i ca envolvendo a conversão do monoglicérido de cetoprofeno (KPG) em cetoprofeno (KP). Adicionaram-se a balões de Erlenmeyer 200 jXÍ de tensioactivo, 50 mg de KPG dissolvido em 200 yjl de DMF 1 mg de enzima CSC-2 em 1 ml de tampão e 9 ml de tampão (NH^) H2P0^, 100 mM, pH 5,5). Cobriram-se os balões com uma membrana e incubaram-se em banho maria a 35°C a 250 rpm, geralmente durante a noite. Pôs-se termo às reacções por acidificação, extraíram-se com CHCl^ (2 X 10 ml). Determinou-se a percentagem de ácido e a percentagem de ee, de acordo com o método do exeni pio 18. No quadro 19, indicam-se os resultados do ensaio, utilizando tensioactivos. Deve notar-se que os valores do Balanço /-77-

Hidrofílico-Lipofilico (BHL) não tiveram, aparentemente influên cia na capacidade do tensioactivo para aumentar a capacidade de conversão de KPG em KP. -78- QUADRO 19

Efeitos dos Surfactantes na Hidrólise do Monoglicárido de Ceto profeno Aditivo HLB Proporção Relativa 0 (enzima apenas, Lipase ! CSC-2) - ! 100 Arlacel 83 3,7 172 Brij 35 16,9 26 11 72 4,9 106 II 76 12,4 18 II 78 15,3 14 II 92 4,9 27 II 96 - 27 II 99 15,3 15 Igepal C0-210 4,6 42 II C0-430 8,9 27 11 C0-520 10,5 25 11 C0-530 10,9 23 II C0-720 13,3 32 11 C0-890 17,1 30 PEG PI - 98 11 P4 - 96 II Pll - 69 Pluronic P2010 - 79 II V10 - 39 II P75 - 29 II L64 - 33 II L92 - 12 11 F147 - 82 Span 20 8,6 75 11 40 6,7 99 11 60 4,7 108 II 80 4,3 160 II 85 1,8 181 Tween 20 16,9 39 11 40 15,6 29 II 60 14,9 23 II 61 14,9 92 II 65 10,5 39 80 15,0 136 11 85 11,0 27 79- / f

Dos tensioactivos anteriormente referidos, efectuou--se a série Tween de sorbitanos de polioxietileno (POE) com 20 unidades de POE, com excepção do Tween 61 em que se utilizaram 5 unidades de POE. Efectuou-se a série Span, dos sorbita_ nos (sem POE) com idêntica sequência de numeração. Todos os tensioactivos descriminados são de Sigma, salvo especificação em contrário. 0 Tween e o Span 20 são um monolaurato, o 40 é um monopalmitato, o 60 é um monoestearato, o 61 (Serva) é tam bém um monoestearato, o 65 é um triestearato, o 80 é um mono--oleato e o 85 é um tri-oleato.' 0 Arlacel 83 é sesquiolato de sorbitano. A série Brij efectuou-se a partir de ésteres polioxietileno (POE). 0 Brij 35 ê éter laurllico de POE-23. Brij 72 é éter estearilico de POE-2, o Brij 76 é éter estearílico de P0E-10, o Brij 78 éter estearílico de P0E-20, Brij 92 é éter oleilico de POE-2, Brij 96 é éter oleílico de P0E-10 e Brij 99 é éter oleílico de P0E-20. A série Igepal (GAE), efectuou-se a partir de éteres nonilfenélicos de POE, consistindo todos eles em C-^t^O, com quantidades variáveis (n) de Ο^,Η^Ο ligadas. Igepal C0-210 é c15H240-(C2H40)n=l,5, 00-430 n=4, C0-520 n=5, C0-530 n=6, C0-720 n=2, e C0-890 n=40. Os ésteres dimetí-licos de polietilenoglicol (PEG) (Hoechst) utilizados, possuíam um comprimento de 2000 (P4), 1000 (Pl) e 250 (Pll). Os plura-cois e plurónicos referidos na lista são poliois.

Exemplo 41 0 efeito dos tensioactivos de éster de oleato na actividade de CSC-2 com monoglicerido de cetoprofeno demonstrou-se como se segue: .Pesaram-se individualmente, 75 mg de KPG (na ausência de DMF) e colocaram-se em balões de Erlenmeyer. Adi-

cionou-se 1 mg de CSC-2 em 1 ml de tampão, bem como 100, 200, ou 500 /1 de tensioactivos de éster de oleato, perfazendo com eles o volume da mistura reaccional de 1%, 2% e 5¾. Adicionaram-se 9 ml de (NH^ÍH^PO^ 100 mM, a pH 5,5 e colocaram-se os balões numa incubadora, a 35°C, a 750 rpm, em banho maria, du rante 20 horas. Acidificaram-se as misturas reaccionais, extra_I ram-se com CHC13 e examinaram-se por CLAP, tal como no exemplo 18. Determinou-se a percentagem de ee, tal como no exemplo 18. No quadro 20, indicam-se os resultados.

Quadro 20

Aditivo % de Acido Acido de configuração S 0 19 96 100 /1 Tween 80 12 200 t1 II 22 96 500 /1 fl 18 100 /1 Span 85 28 200 /1 11 33 96 500 /1 II 34 100 /1 Arlacel 83 30 200 / II 30 99 500 f VI 29 100 r1 Span 80 27 200 /1 II 28 97 500 ul II 27

Exemplo 42

Para se determinar o efeito do ácido oleico e de outros ésteres do ácido oleico, efectuou-se um ensaio utilizando um protocolo idêntico ao do exemplo 41. Dissolveram-se 50 mg de KPG em 200 yul de DMF, adicionou-se 1 mg de CSC-2 em 1 ml de tampão e utilizaram-se 9 ml de tampão. Adicionaram-se diversas quantidades de ácido oleico ou dos seus ésteres, pôs-se termo às reacções nos períodos indicados, acidificaram-se, extraíram-se com CHCl^ e analisaram-se tal como no exemplo 18. Apr£ sentam-se os resultados no quadro 21. QUADRO 21

Tempo Aditivo % de ácido Proporção % ee de ácido de configuração S 18 hr Nenhum 23 2 ND tl 100 pl trioleina 38 3 ND 11 100 pl Dioleina 42 4 ND II 100 jul Monoleina 43 4 ND 23 hr Nenhum 29 2 96 II 200 JJl de ácido oleico 47 3 96 II 200 JJl ácido éster'metílióo oleico 51 3 97 11 200 pl ácido éster'etílico oleico 52 4 96 ND = Não Determinado

Exemplo 43 A utilização de azeite como um intensificador da actividade de CSC-2, demonstra-se do seguinte modo:

Efectuou-se um ensaio, tal como no exemplo 41, mas utilizou-se 100, 200 e 500 pl de azeite para se determinar se este poderia intensificar a percentagem de conversão de KPG em KP. 0 método foi idêntico ao utilizado no exemplo 41 (50 mg de KPG 1 mg de CSC-2 em 1 ml de tampão, 9 ml de tampão, azeite, 35°C, 250 rpm, 20 horas). Decorridas 20 horas, acidificaram-se todas as misturas reaccionais, extrairam-se com CHC13 e analisaram-se por CLAP tal como no exemplo 18. Indicam-se a seguir os resultados:

Aditivo ?ó ácido

Nenhum 19 100 μΐ azeite 34 200 μΐ azeite 40 300 |jl azeite 42

Exemplo 44

Utilizou-se o azeite e outros óleos como substratos para a hidrólise com CSC-2, tal como se segue:

Efectuou-se uma suspensão de azeite (1 g), em 10 ml de tampão de fosfato de amónio 100 mM (pH 5,5). Adicionou-se uma solução de 1 mg de CSC-2 em 1 ml do mesmo tampão e agitou--se a mistura a 250 rpm a 35°C, durante 1 hora. Pôs-se termo á reacção mediante a adição de 10 ml de uma mistura de acetona e metanol (1:1), diluída com 50 ml de água e titulada com uma solução normalizada de hidróxido de sódio, utilizando fenolfta-leína como indicador. Comparou-se então, o resultado com a reac ção de controlo sem o enzima. A reacção com enzima produziu 1,31 moles de ácido, numa hora.

Ensaiaram-se outros triglicé-ridos naturais como substratos de lipase MY, CSC-1 e de CSC-2. Colocaram-se 200 ^il de cada um dos óleos numa ampola de cintilação com enzima (1 mg de CSC-1 ou CSC-2 ou 50 mg de lipase MY) em 2 ml de tampão (NH^) h^PO^ 100 mM, a pH 5,5). Alguns balões receberam também 20-30 mg de monoglicerido de cetoprofeno (KPG). Também se utilizou 0 ácido oleico como um substrato para trans-esterificação. Após uma incubação durante a noite a 35°C, a 250 rpm, analisaram-se

as misturas reaccionais por cromatografia em camada fina CCF utilizando placas de gel de sílica. 0 sistema dissolvente consistia em 95:5 CHCl^rCH^QH. Visualizaram-se as placas com vapor de iodo. Noutras experiências verificou-se que o ácido m_i ristico (C14), o ácido palmítico (Cl6) e o ácido esteárico (C18) são difíceis de detectar nestas condições, e que dos áci_ dos gordos não saturados em C18 o oleico, o linoleico, o lino-lénico não se separavam bem. No quadro 22, indicam-se as condições e resultados (presença de espaços correspondentes aos ácidos gordos insaturados em C18, ésteres tri, di e mono gli-ceridicos do ácido oleico) utilizando azeite, dleo de milho e ácido oleico como substratos. QUADRO 22 Substratos: azeite óleo de milho ácido oleico Cl 8 tri di mono Cl 8 tri di mono Cl 8 tri di mono apenas substrato + + + substrato + CSC-2 + + + + + + + + + Substrato + CSC-2 + KPG + + + + + + Substrato + CSC-1 + + + + + + Substrato + CSC-1 + KPG . + + + + + + + + + + + substrato + Lipase MY + + + + + + + Substrato + Lipase MY + KPG + + + + + + + + + + + +

Exemplo 45

Para se determinar o efeito de outros óleos naturais (ésteres triglÍRô ridicosdo ácido oleico e de outros ácidos), na hidrólise do moniglicérido de cetroprofeno com CSC-2, efectuou-se uma série de ensaios. -84-

Pesaram-se 50 mg de KPG em balões de Erlenmeyer.

Adicionou-se 1 mg de CSC-2 em 1 ml de tampão (NH^ÍH^PO^ 100 mM, a pH 5,5 e, 20 yul de óleo, com 9 ml de tampão. Incubaram- -se os balões a 35°C, a 250 rpm, durante 23 horas. Pôs-se ter_ mo às reacções por acidificação, extraiu-se com CHjCl e anali- 3 saram-se por CLAP, tal como no exemplo 18. Encontraram-se li£ tados os aditivos assim com a sua composição percentual de gli_ ceridos de ácido oleico. Obtiveram-se os resultados seguinte: QUADRO 23 % de Oleatos no óleo

ee de ácido de configuração S

Aditivo % de Acido 0 32 97 20 jjl óleo de milho 43 41 96 20 pl óleo de amendoim 42-61 42 96 20 pl óleo de soja 23-31 41 96 20 pl de óleo de banha de porco 38-44 40 96 20 ul de azeite 64-84 41 96

Exemplo 46

Preparação de cetoprofeno de configuração S na presença de adi^ tivos.

Para se determinar os problemas associados com o fa£ to de existirem ácido oleico ou ésteres de oleatos no meio reac cional , efectuou-se o seguinte ensaio. Adicionaram-se a balSes de Erlenmeyer de 250 ml, 5 g de KPG, 50 mg de enzima CSC-2 e 5 gramas de oleatos (óleos ou ácido oleico). Colocaram-se os balões numa incubadora, a 35°C, a 250 rpm, e efectuou-se uma amostragem da mistura reaccional recolhendo aliquotas de 200 ul f em diversos momentos. Analisaram-se estas aliquotas por CLAP (coluna ODS-3 RAC, utilizando CH30H: (NH^I^PO^ 10 mM (60:40), como eluente a um débito de 4 ml/minuto, detecção a 254 nm) para se determinar a evolução da reacção. Quando se havia pr£ duzido, aproximadamente 40¾ de ácido, pôs-se termo às reacções colocando os balões no congelador a -70°C. Utilizaram-se dois procedimentos de extracção para se determinar o melhor método para se isolar o cetoprofeno de configuração S, isento de ácido oleico. A primeira (que se indica como procedimento de extracção I, no quadro que se segue) envolveu, em primeiro lugar a alcalinização da solução (pH 10) com NaOH, depois, extracção com hexano e depois com CHCl^. Depois acidificou-se a camada aquosa para pH 1,5, com HC1, extraiu-se com hexano e depois com CHCl^. Depois agregaram-se as fracções contendo cetoprofeno, e_x traíram-se com CHCl^ e eliminou-se o ácido de cetoprofeno com NaHCO^ a 5¾. Depois extraíu-se com CHCl^, evaporou-se e cristji lizou-se utilizando etanol. Como se pode verificar no quadro s£ guinte (quadro 24) o ácido oleico não se separou completamente do cetoprofeno. Extraíram-se os outros balões utilizando o pr£ cedimento de extracção II. Acidificaram-se em primeiro lugar as soluções (pH 1,5) com HC1 6N e extraíu-se o ácido de cetoprof£ no com CHCl^. Eliminou-se, então, o ácido de cetoprofeno com NaHCO^ a 5¾ que se acidificou depois e, se extraiu com CHCl^. Evaporou-se o CHCl^ e recuperou-se o cetoprofeno. Por CCF sobre placas de sílica utilizando 95:5 CHCI^íCH^OH e desenvolvimento de vapor de iodo, bem como por RMN verificou-se que o ácido de cetoprofeno continha < de 5¾ de ácido oleico. Indicam-se os resultados no quadro 24: /-86- QUADRO 24

Procedimento % de ácido Proporção Final uMole/hr/mq Acido iso lado (q) Acido de configuração S Isolado % ee Extracção apenas CSC-2 40,5 0,53 0,86 95,8 II + azeite 37 1,1 1,07 95,4 II +ácido oleico 39 1,2 ? CO CO >· I + óleo de milho 31 0,95 ? 84,8 I +Tween 80 34,9 0,46 0,78 94,3 II +Span 85 28,9 0,87 0,84 95,1 II Exemplo 47 Neste exemplo ilustra -se o efeito do óleo mineral sobre a hidró lise do monogliclrido de cetoprofeno com CSC-2. Para se determinar se existia um efeito itensificador não especifico dos óleos de parafina na proporção de conversão de KPG em KP por CSC- 2, repetiu- -se o procedimento de hidrólise enzimática do exemplo 44. Neste ensaio utilizou-se óleo mine- ral a 2% do volume de. reacção. 1 3ôs-se termo às reacçães, decor- ridas 23 horas, acidificaram-se. , extraíram-se com CHCl^ e ana- lisaram-se por CLAP tal como no exemplo 18. Não se observou um aumento significativo na proporção da produção de ácido, utili- zando óleo mineral. % de Acido CSC-2 29 CSC-2 + 200 jjI de óleo mineral 30

Exemplo 48

Neste exemplo ilustra-se a especificidade do aumento da propor^ -87- ção de reacção de CSC-2 utilizando ácido oleico.

Para determinar o efeito dos compostos estreitamente ligados ao ácido oleico e aos seus ésteres, (para além dos tensioactivos já mencionados), efectuou-se uma série de ensaios, tal como no exemplo 40, incluindo a utilização de 200 ^ul de DMF para solubilizar o substrato. Pôs-se termo às reacçôes nos momentos indicados, acidificaram-se, extraíram-se com CHCl^ e anja lisaram-se por CLAP de acordo com o exemplo 18, com os seguintes resultados: QUADRO 25

Tempo (hr) Aditivo % de Acido 18 0 23 11 200 jul Triacetina 12 11 100 jjI Tributirina 3 23 0 29 11 200 pl ácido linoleico 21 H 200 jj 1 éster metílico do ácido linoleico : 34 II 200 jjI éster etílico do ácido linoleico 26 11 100 jjI dilinoleina 20 11 100 jj 1 trilinoleína 20 23 0 32 11 25 jjl monoestearina 31 11 25 pi diestearina 30 11 28 pl triestearina 25 11 200 pl ácido linolénico 13 -88-

Exemplo 49

Este exemplo ilustra o efeito de aumento da proporção do ácido oleico sobre a lipase MY, CSC-1, e CSC-2.

Para se determinar qual o enzima que na preparação de lipase MY respondia ao ácido oleico e aos seus ésteres com um aumento da proporção de conversão de ésteres de, especialmente monoglicerido de cetoprofeno, em cetoprofeno, pesaram-se 50 mg de KPG na ausência de DMF, num balão, ao qual se tinha acidionado ou 1 mg de CSC-2 em 1 ml de tampão, ou 1 mg de CSC--1 em 1 ml de tampão, ou 50 mg de lipase MY em 1 ml de tampão. Adicionaram-se 9 ml de tampão (NH^H^PO^ 100 mM a pH 5,5) e 200 pl de ácido oleico,a alguns dos balões. Incubaram-se os balões a 35°C, a 250 rpm, durante 21 horas. Pôs-se termo às reacções por acidificação e extracção com CHCl-j e analisaram-se por CLAP, tal como no exern pio 18·

Obtiveram-se os resultados apresentados no quadro 26. QUADRO 26 % ee de ácido de Enzima Aditivo % de Acido configuração S 50 mg Lipase MY 0 31 81 200 μΐ ácido oleico 46 83 1 mg CSC-1 0 6 85 200 jul ácido oleico 5 84 1 mg CSC-2 0 33 97 200 jj! ácido oleico 52 97 /89-

Exemplo 50

Neste exemplo demonstra-se o efeito do ácido oleico na taxa de hidrólise de diversos ésteres de cetoprofeno, pela lipase MY e pela lipase B de Candida (Biocatalyst).

Uma vez que o ácido oleico aumenta a taxa de conver são de KPG em KP, pela lipase MY e CSC-2, utilizou-se uma série de ésteres de cetoprofeno. Neste ensaio, faz-se a comparação entre o aumento, originado pelo ácido oleico, da taxa de conversão de diferentes ésteres de cetoprofeno pela lipase MY ou pela lipase B de Candida (Biocatalyst). Colocou-se num balão de Erlenmeyer éster de cetoprofeno (50 mg) e adicionaram--se 50 mg de lipase MY ou de Lipase Biocatalyst (que se repetiu, num dos casos descriminados a 10 mg, 16 horas) em 1 ml de tampão, assim como 9 ml de tampão. Adicionou-se ácido oleico (200 pl) a alguns balões. Incubaram-se as misturas reaccionais a 35°C, 250 rpm, durante 17 horas, acidificaram-se, extrairam--se com CHCl^ e analisaram-se por CLAP. Os dados indicam-se a seguir no quadro 27 90- ¢- m QUADRO 27

Ester de Cetoprofeno Lipase MY Só % de +ácido oleico Lipase Só % de B de Cândida +ácido oleico Substrato ácido % de ácido ácido % de ácido metilo 4 4 14 15 n-propilo 15 13 43 33 n-hexilo 4 7 26 15 2,22-tricloro- etilo 34 13 41 39 monoglicérido 23 40 44* 53* * 10 mg, 16 hrs Exemplo 51

Neste exemplo descreve-se o melhoramento na estereosselectividei de e taxa de relação pelo ácido oleico, utilizando o éster 2--cloroetllico de cetoprofeno .

Efectuou-se um ensaio utilizando 50 mg de éster 2-clo_ roetilico de cetoprofeno (na ausência de DMF). Os enzimas utili^ zados foram 50 mg de Lipase MY ou 50 mg de Lipase B de Candida (Biocatalyst) ou 1 mg de CSC-1 ou de CSC-2, dissolvidos em 1 ml de tampão. Utilizou-se o ácido oleico para a 200 yu 1 e adiciona-ram-se 9 ml de tampão. Incubaram-se as misturas reaccionais a 35°C, a 250 rpm, durante 15,5 horas, acidificaram-se e extrai-ram-se com CHC1,. Efectuou-se a análise de acordo com o descri- j to no exemplo 18. Apresentam-se os dados obtidos, no Quadro 28 ✓ * 91- QUADRO 28

Ester 2-cloro-etílico de cetoprofeno % ee de ácido de

Enzima Aditivo % de Acido confiqu 50 mg Lipase MY 0 12 21 200 jjl ácido oleico 20 87 1 mg CSC-2 0 12 93 200 jjl ácido oleico 26 99 1 mg CSC-1 0 4 89 200 jjI ácido oleico 2 55 50 mg de Lipase B de Candida 0 8 25 200 jjl ácido oleico 9 85

Exemplo 52

Neste exemplo descreve-se o efeito do ácido oleico na taxa de reacção e estereoespecificidade de outros enzimas e de outros ésteres de cetoprofeno.

Para se determinar quando se podia utilizar o ácido oleico para aumentar a proporção/selectividade utilizando outra lipase e/ou substratos, efectuou-se o ensaio que se segue. Colocaram-se em balões de Erlenmeyer de 50 mg de éster monome-tilico de trietileno-glicol, de éster monoglicerídico ou de éster etileno glicólico. Adicionaram-se 50 mg de Lipase MV, 50 mg de lipase de Mucor miehei, 2,5 mg de lipase de Candida cy-lindracea (Biocatalyst) ou 50 mg de lipase 0F, todas elas em 1 ml de tampão. Também se utilizaram 10 jj 1 de estearase de fígado de porco. Adicionou-se o ácido oleico aos balões a 200 μΐ. -92-

Adicionou-se o tampão para um volume final de 10 ml e incubararn -se os balões a 35°C, 250 rpm, acidificaram-se e extrairam-se com CHC13 e analisaram-se por CLAP tal como no exemplo 18. No quadro 29, apresentam-se os dadas obtidos. QUADRO 29

Ester dieti-leno-glicóli_ co de ceta-profeno

Ester mono metilotrie_ tileno-gH eólico de cetoprofe_ no

Ester monogLi cerídico de cetoprofeno

Ester etileno -glicónico de cetoprofeno % Acido ?óee % Acido %ee % Acide i %ee % Acido %ee Lipase MY >38 48 16 62 18 70 9 60 + ácido oleico 41 66 16 81 37 82 27 95 Mucor mischei 24 41R 26 36R 20 40R 17 54R + ácido oleico 20 2R 6 IR 4 35R 10 42 R estearase de fígado de porcino 11 7 20 2R 10 36R 3 51R + ácido oleico 5 8 5 15 1 14R 3 64R Biocatalisador Lipase de Candida 24 54 9 60 19 57 7 47 + ácido oleico 33 53 10 70 34 78 25 91 Lipase 0F 40 39 17 61 35 41 13 31 + ácido oleico 48 60 18 81 48 69 39 88

Exemplo' 55

Neste exemplo descreve-se o aumento originado pelo ác£ do oleico na hidrólise dos ésteres de cetoprofeno com enzimas im£ bilizados ou livres.

Adicionaram-se 200 mg de KPEG ou de KPG a um balão de f -93- .%

Erlenmyer, ao qual se adicionou 1 mg de CSC-2 livre em 1 ml de tampão ou 200 mg de CSC-2 imobilizado sobre gel de sílica (279-SD1), tal como no exemplo 24, pista 16 (que se determinou ser equivalente a 1 mg de enzima livre). Adicionou-se áci^ do oleico a 0,50, 200, 500 ou 1 000 μΐ, e, tampão até um volu[ me final de mistura reaccional de 10 ml. Decorridas 14 a 21 horas, pôs-se termo às reacções por acidificação e, extracção com CHCl^ e determinou-se a percentagem de ácido e a percentja gem de ee, tal como no exemplo 18. No quadro 30 indicam-se os resultados obtidos. -94-

QUADRO 30

Acido % ee de ácido Enzima Substrato oleico (ul) % de ácido configuração C5C-2 Imobilizado Ester etileno glicdlico de 0 2 95 cetoprofeno 50 2 95 200 5 97 500 11 97 1000 18 98 CSC-2 livre Ester etileno -glicdlico de cetoprofeno 0 3 93 50 5 97 200 12 98 500 28 97 1000 33 97 CSC-2 Imobilizado Ester monogli cérido de ce- toprofeno 0 1 87 50 2 92 200 4 93 500 5 92 1000 7 92 CSC-2 livre Ester monogli· - 0 1 91 cerido de ceto 50 3 93 profeno 200 9 95 500 15 94 1000 21 96 -95-

Exemplo 54

Neste exemplo demonstra-se o efeito do ácido oleico, hexano e água na produção de cetoprofeno por CSC-2.

Para se determinar se era possível a trans-esterif_i cação sem hidrólise enzimática e, também para se evitarem os problemas inerentes a um sistema multifásico de ácido oleico em tampão aquoso, tentou-se a conversão enzimática dos ésteres de cetoprofeno em cetoprofeno, em hexano e ácido oleico misturados em diversas proporções. Neste ensaio, utilizou-se KPEG a 200 mg, CSC-2 imobilizado sobre Sílica (279-SD1), tal como no exemplo 53,anterior, utilizado a 200 mg (equivalente a 1 mg de enzima livre) e hexano e ácido oleico utilizados a diversos níveis (desde 10 ml e 0 ml cada a 0 ml e 10 ml cada). Adicionou-se tampão a alguns balões a 50 ^Lil (0,5% do volume de reac ção). Incubaram-se os balões a 35°C, 250 rpm, e recolheu-se uma alíquota de 200 jul, decorridas 17,30 horas, diluiu-se em metanol e injectou-se directamente em CLAP. A coluna normalizada ODS-3 RAC com CHjOH: (NH4)H2P04 10 mM (60:40) como eluen te a um débito de 4 ml/minuto e utilizou-se a detecção a 254 nm. Indicam-se a seguir os dados, no quadro 31: QUADRO 31 Hexano Acido oleico Tampão % de Acido Proporção (ml) (ml) (/il) ^iMole/hr/mg 10 0 0 1 1 10 0 50jj1 0 0 8 2 0 18 6 8 2 50jj1 15 5 2 8 0 5 2 2 8 50jj1 13 4 0 10 0 5 2 0 10 50jj1 10 4 96-

Exemplo 55

Neste exemplo descreve-se o efeito dos dissolventes orgânicos na produção de cetoprofeno.

Para se optimizar o dissolvente orgânico utilizado na presença de ácido oleico, utilizaram-se diversos dissolventes orgânicos, conjuntamente com uma diversidade de ésteres de cetoprofeno. Neste ensaio pesaram-se dentro de balões 50 mg de ésteres de cetoprofeno, conjuntamente com 1 ml de ácido oleico e 9 ml de um dissolvente orgânico. Taparam-se os balões e incubaram-se a 35°C, 250 rpm, durante 10-26 horas antes de se por termo à reacção, adicionando em is lugar 4 ml de CHCl^ para solubilizar os substratos e produtos, depois filtrando atrji vés de um filtro Gelman Nylaflo 0,2 pm. Diluiram-se as amostras em metanol e analisaram-se por CLAP tal como no exemplo 18. Efectuou-se também o ensaio utilizando 200 de ácido oleico e 10 ml de tampão, que se acidificou, extraiu com CHCl-j e se analisou por CLAP, como anteriormente. Indicam-se os dados a seguir, no quadro 32: -97- / ί QUADRO 32 10 ml de 9 ml de 9 ml de 9 ml de is(3 9 ml de tampão 0A hexano tolueno -octano 0A chci3 Ester de Cetoprofeno 200jul 0A 1 ml 0A 1 ml 1 ml 0A 1 ml % ácido % ácido % ácido % ácido (¾ ee) % ácido (¾ ee) (% ee) CD ω às (¾ ee) éster etileno-glicólico 21 (98) 29 (95) 0 47 (98)* 0 éster monoglicérido 26 (96) 47 (97) 0 31 (96) 0 éster-2-cloroetílico 18 (96) 7 (92) 1 (<1% )18 (97) 2 (3) éster dietileno-gli- eólico 32 (30) 56 (13)* N.D. 60 (17)* N.D. éster metílico 2 (96) 0,8 0 2 (93) 0 * Pôs-se termo à reacção às 10 H ND - Não determinado 0A - Acido oleico

Exemplo 56

Uma vez que KPG e KPEG parecem ser os ésteres mais eficazes nos dissolventes orgânicos, efectuou-se uma experiência utilizando KPG e KPEG como substratos e uma diversidade de dissolventes orgânicos ou de tampões todos na presença de 1 ml de ácido olei_ co .

Colocaram-se em balões de Erlenmeyer 50 mg de KPG ou de KPEG assim como 100 mg de CSC-2 imobilizado sobre Sílica (279--5D-1) equivalente a 0,5 mg de enzima livre. Adicionou-se 1 ml de ácido oleico, tal como 9 ml de tampão ((NH^)H2P0^) 100 mM, pH 5,5. ou de dissolvente orgânico. Colocaram-se os balões numa incubadora a 35°C e, agitaram-se a 250 rpm, durante 13 horas. Pôs-se termo à reacção mediante a adição de 5 ml de CHCl^ para solubilizar o material orgânico e filtraram-se as soluções utilizando membranas Gelman Nylaflo 0,2 jjm para eliminar o enzima. Analisaram-se amostras numa coluna 0DS-3 RAC utilizando CH^:0H: (NH^h^PO^, 10 mM (60:40) como eluente, a um débito de 4 ml/mi-nuto e efectuou-se a detecção a 254 nm. Determinou-se a percentagem de ee pela resolução das amidas diastereoméricas no sistjs ma CLAP anterior, tal como no exemplo 18. Indicam-se os resultei dos no quadro 33: -99- τ 5ι QUADRO 33

Ester mono- /ó ee do éster etileno % ee noglicérido ácido de -glicol de ce de ácido i Solvente cetoprofeno configu- toprofeno configura· 9 ml/1 ml % de ácido ração S % de ácido ção S Tampão/ácido oleico 17 97 19 97 Hexano/ácido oleico 12 94 16 87 Iso-octano/ácido oleico 39 98 48 97 Ciclo-hexano/ácido oleico 38 98 29 83 Ciclo-hexano/ácido oleico 12 94 3 52 Ciclo-octeno/ácido oleico 38 98 16 92 Tetra-hidro-naftaleno/áci do oleico 2 68 1 1 1,1,1,Tricloro-etano/ácido oleico 1 0 0 0 Tetracloro-etileno/ácido oleico 1 0 0 0

Exemplo 57

Ensaiou-se uma outra lipase de C. rugosa, Enzeco Rxx, que se encontra disponível no Enzyme Development Corporation, por SDS-PAGE e FIE. A SDS-PAGE demonstrou que o peso molecular de Enzeco Rxx era ligeiramente superior ao de CSC-2 (figura 12). No entanto, o FIE demonstrou uma banda principal no mesmo ponto isoeléctrico de CSC-2. A avaliação da actividade de Enzeco Rxx com KPG ou com KPEG (50 mg) em 10 ml de de .tampão ΝΗ^Η2Ρ0^ 100 mM,

a pH 5,5, com ou sem a adição de 200jjI de ácido oleico, por um período de incubação de 18 horas a 35°C e a 750 rpm propo£ cionou os resultados indicados no quadro 34. QUADRO 34

Acido KPG . % ee do KPEG % ee do

Enzima Oleico adicio nado % de áci do for- Proporção mado (pMole/hr/mq) ácido de configuração S % de áci do formado Proporção (pMole/hr/mq) ácido de configuração S / CSC-2 200ul 44 4 98 60 5 97 CSC-2 / 0 75 1 95 20 2 93 Enzeco Rxx 200pl 33 3 66 36 3 83 Enzeco Rxx 0 33 3 22 20 20 19

Jlxemplo 58

Neste exemplo descreve-se a separação e purificação dos isózimas da lipase MY utilizando a focalização isoeléctrica.

Como um método alternativo para a utilização de colunas de permuta de iões, utilizou-se uma célula preparatória de focalização isoeléctrica (FIE), para separar os isózimas da lipase MY com base nas suas cargas individuais. Liofilizou-se a lipase MY que tinha sido préviamente dessalinizada numa coluna Trisacryl GF-05 e dissolveram-se 400 mg em 50 ml de água desio-nizada com 2 ml de anfólitos de pH 2,5-5. Colocou-se esta amostra numa célula preparatória de FIE e fez-se incidir 12 watts, a 4°C, durante 4 horas. Não se estabeleceu qualquer limite eficaz para a voltagem e para a corrente (3000 volts e 150 mAmps, como máximo). Decorridas 4 horas, recolheram-se as amostras por aspiração em vácuo e determinou-se o seu pH e conteúdo proteico sem qualquer diálise (para remover os anfálitos) das fracções.

Os resultados encontram-se no gráfico da figura 13. Um gel FIE analítico das fracções a pH compreendido entre 3 e 9 mostrou a separação obtida da lipase CSC-2 (fracções 8-12) e da lipase CSC-1 (fracçSes 13-17). Como demonstração da actividade das fra£ ções, ensaiou-se 1 ml de determinadas fracções quanto à sua acti vidade hidrolitica estereoespecífica em tampão aquoso, contra 50 mg de éster monoglicerídico de cetoprofeno na presença ou a£ sência 200 pl de ácido oleico, tal como no método do exemplo 18. No quadro 35, a seguir, apresenta-se a actividade e a percenta- gem de ee. QUADRO 35 % ee ácido de PH Fracção % Acido configuração S 3,9 2 3 63 2 + ácido oleico 6 86 4,15 4 8 92 4 + ácido oleico 23 96 4,1 5 4 85 5 + ácido oleico 14 94 4,2 7 8 90 7 + ácido oleico 30 96 4,3 9 18 96 9 + ácido oleico 43 98 4,4 11 11 95 11 + ácido oleico 40 97 /102- /

Exemplo 59

Neste exemplo ilustra-se a utilização da lipase AY para a preparação de CSC-1 e CSC-2.

Solubilizaram-se 30 mg de lipase AY (Amano) em 40 ml de água desionizada e dialisaram-se num saco de diálise de traji sição de 2 000 m.w., 2 vezes, em 10 ml de água desionizada, djj rante 18 horas. Centrifugou-se, a 730 rpm, durante 20 minutos, o material retido e pôs-se de parte o sedimento. Efectuou-se, então a cromatografia do sobrenadante numa coluna de resina de troca de iões SP-Trisacryl M (13 X 25 cm). Equilibrou-se previea mente a coluna SP-Trisacryl M com acetato de sódio 25 mH, a pH 3,3. Verteu-se o sobrenadante a 50 ml/hora; lavou-se a coluna com tampão de equilíbrio até à linha base e eluiu-se com tampão de acetato 25 mM a pH 4,6. Analisaram-se as fracções recolhidas durante o processo por FIE. Utilizando este procedimento isola-ram-se eficazmente CSC-1 e CSC-2.

Exemplo 60

Neste exemplo ilustra-se mais uma vez que a estereosselectivida-de da lipase MY aumenta com a imobilização e a utilização.

Ensaiaram-se 150 mg de lipase MY livre ou imobilizada, em 10 ml de tampão a pH 7 e 5 ml de HPPA-Me 1 M. 0 enzima imobilizado mostrou-se mais selectivo. No entanto, a hidrólise não terminou após o éster de configuração R ter sido completamente consumido. 103- k QUADRO 36 Enzima livre versus. Enzima Imobilizado Tempo Livre XAMA-2 XAMA-7 (hrs) % R (¾ Conv) % R.(Sií-Cónv) % R (% Conv) 4 73(16) 87(15) 84(17)

Exemplo 61

Condições de Reacção

Num balão de Erlenmeyer de 500 ml colocou-se substrato e 400 mg de (R,S)-HPPA-Me e adicionaram-se 200 ml de tampão Kh^PO^ 0,20 M (pH 6,5), seguindo-se-lhe a adição de 0,3 g de lipase MY. Agitou-se a mistura a 250 rpm num agitador de Dubnoff, à temperatura ambiente (25°C), durante 21,5 horas. Recolheram--se amostras a intervalos de 0,5 horas de 0-6,5 horas e depois às 21,5 horas, para análise.

Optimizagão do pH

Adicionou-se 196 mg, de (R,S)-HPPA-Me, a uma série de scj luções de 100 ml de tampão de fosfato, encontrando-se o pH no intervalo compreendido entre 4 e 8,5 com aumentos de 0,5 unidades, em balões de 250 ml. Agitaram-se as misturas durante 20 minutos para solubilizar o éster. Preparou-se uma solução de lmg/ml de lipase MY, centrifugou-se a 7500 rpm, durante 20 minutos e adicionou-se 0,5 ml deste sobrenadante a cada um dos bji Iões. Colocaram-se os balões num misturador de Dubnoff, à tejn peratura ambiente e efectuou-se uma amostragem, decorridas 7 horas para se determinar a percentagem de conversão de (R,S)— -HPPA-Me em (R)-HPPa e a pureza enantiomárica do produto final.

V -104- f 0 Efeito de Elevadas concentrações de (R,5)-HPPA-Me

Combinou-se (R,S)-HPPA-Me (1,5 moles) com 1 litro de tampão de fosfato 0,5 M, a pH 7,0. Controlou-se a temperatura da reacção entre 40° e 45°C em banho maria e adicionou-se em seguida 1 g de lipase MV. Agitou-se mecânicamente a mistura reaccional, durante 114 horas e recolheram-se amostras em diversos intervalos de tempo para se determinar a pureza enanti£ mérica e a concentração de (R)-HPPA produzido.

Temperatura óptima

Colocou-se 240 mg de (R, S)-HPPA-Me num balão de Erlenmeyer de 2,1, com 1 litro de acetato de amónio 1 M, a pH 7,05, 150 ml de tolueno e 2 g de lipase MY. Manteve-se a temperatura da rea£ ção a 12°, 21°, 35° ou 45°C através de um banho de arrefecimento com água fria ou através de um banho de aquecimento com água. Recolheram-se amostras da camada aquosa, a determinados intervalos de tempo, para se determinar a concentração total de HPPA produzido e as quantidades relativas de HPPA, com as configura-çães R e S.

Inibição do Produto A. Inibição da actividade pelo álcool produzido após hidrólise.

Efectuaram-se duas reacções de hidrólise para se determinar o efeito do metanol, produzido como um produto secundário da hidrólise de HPPA-Me, sobre a actividade da lipase MY. Colocaram-se em balões com ou sem 0,75 moles de metanol, 1,5 moles de (R,S)-HPPA-Me, 1 litro de NH^OAc 1 M, a pH 6,5, 150 ml de tolueno e 2 g de lipase MY. Agitaram-se lentamente as misturas e recolheram-se amostras a diversos intervalos de tempo para se determinar as concentrações de cada um dos estereoisóme-ros de HPPA que se haviam produzido.

Β. Inibição da actividade por (R)-HPPA.

Para se determinar o efeito do (R)-HPPA produzido du_ rante a hidrólise de (R,S)-HPPA-Me sobre a actividade da li-pase MY, efectuou-se uma série de três ensaios. Combinaram-se 200 ml de acetato de amónio 0,04 M, a pH 7,0, com 30 ml de t£ lueno, 40 mmoles de (R,S)-HPPA-Me, 25 mg de lipase MY e (R)-HPPA 0,30, ou 100 mM. Agitaram-se lentamente as misturas reaccio-nais, durante 136 horas e recolheram-se amostras a diversos ijn tervalos de tempo para se determinarem as concentrações de cada estereoisómero de HPPA que se havia produzido. C. Efeito de Diluição

Para se determinar o efeito da concentração do substrato na actividade da lipase MY, efectuaram-se reacções contendo 25, 175, ou 375 ml de água, 0,04 moles de HPPA-Me, 0,04 moles de acetato de amónio (pH ajustado para 7,0), 30 ml de t£ lueno e 25 mg de lipase MY dissolvida em 25 ml de água. Agitaram-se as misturas reaccionais durante 164 horas. Analisaram-se amostras da camada aquosa a diversos intervalos de tempo, para se determinarem as concentrações de cada um dos estereoisóme-ros de HPPA que se haviam formado.

Recção ã Escala do Quilograma

Agitaram-se 25 g de lipase MY em 1 litro de acetato de amónio 0,2 N, a pH 6,5, durante 20 minutos, centrifugaram-se a 10 000 X g e adicionou-se o sobrenadante a 1,176 Kg de (R,S)--HPPA-Me em 9 litros de água, 2,5 litros de tolueno e agitou-se a mistura lentamente, durante 29 horas. Recolheram-se periodicamente amostras e analisaram-se por CLAP. No final da reacção aspirou-se a fase aquosa e extraíu-se com CH2CI2· Ajustou-se então a fase aquosa para pH 2,1 e extraiu-se com acetato de eti- -J.06- lo. Adicionou-se sulfato de magnésio para eliminar os vestígios de água. Eliminou-se o acetato de etilo no vácuo e obteve-se o produto sob a forma de um pó de aspecto castanho claro. Resultados

As condições dadas pela CLAP proporcionam a separação na linha base do éster de cada um dos ácidos enantioméricos (figura 14). (R·, S)-HPPA-Me eluído a 1,3 minutos, (R)-HPPA elujt do a 8,8 minutos e (S)-HPPA eluído a 12,4 minutos.

Nas condições de reacção iniciais obteve-se uma pureza dptica de ee de 88%, após hidrólise a 35% de (R,S)-HPPA-Me.

Indica-se no quadro 39 o efeito do pH na taxa de hidró^ lise e na enantioespecif icidade. 0 pH óptimo para a taxa de h_i drólise enzimática foi de 8,0, em que se atingiu 51% da conver são, após 7 horas de tempo de reacção (146,6 jjM/hora/mg. A taxa óptima encontrava-se claramente nítida sendo as proporções de hidrólise práticamente as mesmas compreendidas no intervalo compreendido entre 6,5 e 8,5. 0 pH óptimo para a enantiossele£ tividade ocorreu entre pH 3 -4, em que o ee era de 88% para (R)-HPPA. No entanto, a selectividade a estes níveis de pH era baixa. Todos os outros ensaios decorreram a pH 6,5, no sentido de se conservar a actividade adequada e a pureza enantiomérica. Os controlos sem enzimas demonstraram que os valores de pH superiores a 7 originaram um acréscimo na hidrólise química de (R,S)-HPPA-Me e decréscimo da pureza enantiomérica. A pureza enantiomérica de HPPA produzido também decresceu à medida que a percentagem de conversão se aproximava de 50% (figura 15). Isto deve-se à especificidade incompleta da lipase MY para o Substracto HPPA-Me.

Efectuou-se um ensaio para se determinar o efeito de -1 tff- uma solução aquosa saturada de (R,S)-HPPA-Me sobre a activida-de do enzima e sobre a pureza enantiomérica do produto. A soltj bilidade de HPPA é inferior a 25 mM a pH 6,5, em solução aquosa, enquanto que HPPA possui uma elevada solubilidade em solução aquosa a pH 6,5. A enantiosselectividade e a actividade do enzima sofreram quando se saturou a solução com (R,S)-HPPA-Me. A enantiosselectividade do enzima numa solução saturada de (R,S)--HPPA-Me foi completamente destruída. A actividade do enzima no substrato (R,S)-HPPA-Me 25 mM, a uma conversão de 4% foi de 6,5 mmoles/hora/mg. Por comparação com os dados do substrato saturado (quadro 38), a ac.tividade foi 6,5 vezes superior, com uma solução de HPPA-Me 25 mM.

Verificou-se que a temperatura óptima para hidrólise enzimática de (R,S)-HPPA-Me a pH 7,0 e hidrólise a 20%, era de 21°C (quadro 39). A actividade inicial é substancialmente sup£ rior a 35°C ou a 45°C, tal como se esperava, contudo, a activi^ dade decresce rápidamente indicando a inactivação do enzima. Não há variação na enantiosselectividade do enzima com base nas diferenças na temperatura da reacção.

Ensaiaram-se de modo independente, os produtos da hidrólise de HPPA-Me, metanol e HPPA, para se determinarem os seus efeitos na actividade do enzima. A introdução de 0,5 equi^ valentes de metanol no inicio da reacção de hidrólise originou um decréscimo de 39% na actividade do enzima (figura 16). Concentrações sucessivamente aumentadas de HPPA demonstraram um decréscimo correspondente na actividade do enzima. 0 efeito da diluição na actividade do enzima num sistema bifásico, está indicado na figura 17. A taxa encontra-se substancialmente aumentada pela diluição da fase aquosa, apesar -108-

·* do éster residir quase exclusivamente na camada de tolueno.

Numa reacção à escala do quilograma, aplicando as coji dições óptimas anteriormente obtidas, a pureza óptica do (R)--HPPA produzido foi de 84% de ee a uma conversão de 39%, figi£ ra 18. A pureza óptica do produto assim obtido podia ser aumejn tada por recristalização no seio de diversos dissolventes orgânicos incluindo o acetato de etilo e o clorofórmio. QUADRO 37

Actividade e Enantioespecificidade da Lipase MY em Função do pH da Solução £H % de Conversão Actividade % ee fyumol/hr/mg) 3,0 34 96 89 4,0 33 95 88 4,3 35 100 87 5,0 36 103 86 5,5 38 109 84 6,0 42 121 80 6,5 47 134 78 7,0 46 133 77 7,5 50 142 76 8,0 51 147 67 8,5 48 136 52 Fizeram-se reagir, durante 7 horas, 196 mg de (R,S)-HPPA-Me, 100 ml de tampão de fosfato com o pH indicado e 0,5 ml de uma solução de 1 mg/ml de lipase MY, preparada por centrifugação a 7500 rpm , durante 20 minutos, e analisaram-se por CLAP. QUADRO 38

Efeito da Saturação com (R,S)-HPPA-Me Sobre a Actividade Enzi-mática

Tempo C HPPA 7 Activi dade de (¾ de Conversão) (R)-HPPA (Hrs) (mM) /jM/hr/mg ee % 18 19,8 1,1 (2) 18 45 41,4 .92 (4) 8 65 66,2 1,0 (7) 4 114 114 .8 <11, 4) 6 Agitaram- se mecânicamente (R, S)-HPPA-Me (1,5 moles) em 1 litr de tampão fosfato 0,5 M, a pH 7,0 a 40° -45°C e 1 g de Lipase MY, durante 114 horas e, analisaram-se as amostras por CLAP, conforme se indicou na figurai. QUADRO 39

Efeito da temperatura na Actividade e Enantioespecificidade

Tempo 12°C 21°C 35°C 45°C Irs) C hppa 7 CD CD C HPPA 7 ee (¾) CHPPA 7 ee (%) ZT HPPA 7 ee i 1 - - - - 28 94 31 92 3 — — — 67 96 52 92 20 - - - 154 92 101 90 31 115 90 178 — - - - 44 201 92 255 94 209 92 162 90 51 202 92 269 94 - - - - 69 227 92 248 90 - _ - - 88 253 92 289 88

Conservaram-se à temperatura indicada, 294 g de HPPA-Me, 1 litro de acetato de amónio 1 M, a pH 7,05, 150 ml de tolueno e 2 g de lipase MY Analisaram-se as amostras da camada aquosa, conforme indicado na figura 1.

As figuras anexas são as seguintes:

Lista de Figuras

Figura 1 SDS-PAGE de lipase MY, lipase AY e lipase Biocata-lyst.

Figura 2 Figura 3 Figura 4 Figura 5 Figura 6 Figura 7 Figura 8 Figura 9 Figura 10 Figura 11 Figura 12 Figura 13 Figura 14 Figura 15 Figura 16 Figura 17 Figura 18

Gel FIE, pi 3-9 das lipases comerciais de C.ruqosa. Cromatografia SP-Trisacryl M de lipase MY Gel FIE, pi 3-9 de SP-Trisacryl M de fracções da co_ luna de lipase MY

Cromatografia SP-Sephadex da lipase MY

Gel de FIE, pi 3-9 de fracções de lipase MY de uma coluna de cromatografia SP-trisacryl LS.

Cromatografia SP-Trisacryl LS de lipase MY Efeito dos ácidos orgânicos na imobilização da lipase MY.

Efeito do ácido esteárico (0-20%) na imobilização da lipase MY.

Efeito do ácido esteárico (0-10%) na imobilização da lipase MY.

Estabilidade da lipase CSC-1 imobiliz.ada. SDS-PAGE de lipases de C. rugosa, CSC-2 e Enzeco Rxx.

Focalização Isoeléctriea preparatória da lipase MY. Cromatograma.

Conversão versus excesso enantiomérico HPPA produzido versus tempo HPPA produzido versus tempo Percentagem de conversão versus tempo 11- Legendas das Figuras

Figura 1

Figura 2

Figura 3

Figura 4

Figura 5 SDS-PAGE de lipase MY, lipase AY e de lipase Bio-catalyst. Pistas 1 e 4, lipase Biocatalyst; pistas 2 e 5, lipase AY (Amano); pistas 3 e 6, lipase MY (Meito Sangyo). (ver Ex. 1) Gel de FIE, pi 3-9 de lipases comerciais de C. ru-gosa. Fez-se percorrer o gel por 390 volts/hora. Pista 1, lipase da Sigma; pista 2, lipase 0F; pista 3, lipase MY; pista 4, lipase AY; pista 5, lipase Biocatalyst; pista 6, padrões pi. (ver Ex. 10) Cromatografia SP-Trisacryl M da lipase MY (C. rugo-sa). Aplicou-se lipase MY (1,0 g) em Nah^PO^ 25 mM, a pH 3,3, numa coluna de 2,5 X 20 cm, equilibrada com Nah^PO^ 25 mM, a pH 3,3. Eluiu-se a proteína sob a forma de duas fracções utilizando tampão citrato-f osf ato, a pH 4,75, seguido de tampão de ci-trato-fosfato, a pH 6,80 (ver Ex.11). Gel FIE, pi 3-9 de fracções de lipase MY numa colii na SP-Trisacryl M. Pista 1, lipase MY; pista 2, fracção ao longo da passagem; pista 3, pico 1 de proteína; pista 4, pico 2 de proteína; pista 5, pico 3 da proteína; pista 6, pi normalizadas 3-9; C£ rou-se o gel com prata, (ver Ex. 11). Cromatografia de SP-Sephadex de lipase MY (C.ruqosa ). Aplicou-se lipase MY (1,30 mg) em tampão de citrat£ -fosfato, a pH 3,3, a uma coluna 2,5 X 20 cm, no mesmo tampão. Eluição passo a passo, efectuada com tampão de citrato-fosfato, pH 4,70, seguida de tampão citrato-fosfato, a pH 6,80. -112- *· f *

Figura 6

Figura 7

Figura 8

Figura 9

Figura 10

Gel de FIE, pi 3-9 de fracções de lipase MY numa coluna de SP-Trisacryl LS. Pistas 1 e 8 são pa-. drões FIE pI; as pistas 2 e 3 são amostras de ljl pase MY; as pistas 4 e 5 são agregados de protej[ nas eluidas com tampão a pH 6,80 (CSC-1) pistas 6 e 7 são agregados de proteínas eluidas a pH 4,75 (CSC-2). Corou-se o gel com prata, (ver Ex. 13). Cromatografia SP-Trisacryl LS de lipase MY. A coluna (9 X 45 cm) foi equilibrada com fosfato de s£ - dio 25 mM, a pH 3,2. Dissolveu-se a lipase MY (150 mg) em 3,0 litr_os de Nah^PO^ 25 mM, a pH 6,5. Eliminaram-se os sólidos e ajustou-se o pH para 3. descrevem-se os detalhes de eluição na legenda da Figura 3. (ver Ex. 14). Efeito dos ácidos orgânicos na imobilização da li-pase MY. Misturou-se lipase MY (0,45 g), Amberlite DP-1 (0,9 g) e XAMA-7 (100 mg) em 10 ml de tolueno contendo 30-50 mg de um ácido saturado. Após tratja mento, hidratação e lavagem ensaiou-se o enzima pjj ra se observar a sua actividade na hidrólise 'do éj3 ter de HPPA-Me. (ver Ex. 26). Efeito do ácido esteárico (0-20%) sobre a imobilizjj ção da lipase MY. Imobilizou-se a lipase MY, conforme descrito na legenda da Figura 8, utilizando diversas concentrações de ácido esteárico. Ensaiou -se a actividade hidrolítica do éster de HPPA-Me (ver Ex. 27). Efeito do ácido esteárico (0-10%) na imobilização da lipase MY. Misturou-se lipase MY e resina DP-1

e liofilizaram-se a partir de um tampão a pH 4,5 antes de se adicionarem a tolueno, contendo XAMA--7 e ácido esteárico. Evaporou-se o dissolvente para se efectuar a polimerização. Ensaiou-se a actividade tal como descrito na legenda da Figura 8. (ver Ex. 28).

Figura 11 Estabilidade de CSC-1 de lipase imobilizado. Utili zou-se a lipase CSC-1 isolada, que se imobilizou utilizando XAMA-7 e resina Amberlite DP-1 (ver Ex. 13) como agente catalítico, para converter 25 mM de éster HPPA-Me. A coluna (1 X 24 cm) funcionou a 0,75 ml/minuto na presença de 1,0 g/1 de ditionito de sódio. Ensaiou-se diáriamente a actividade en-zimática. (ver Ex. 33).

Figura 12 SDS-PAGE de lipases de C, rugosa, CSC-2 e Enzeco

Rxx. Separaram-se amostras de proteína num gel de poliacrilamida de gradiente 8-15?ó. Pista 1, lipase Enzeco Rxx, pista 2, lipase CSC-2;. pista 3, padrões de pesos moleculares. A banda principal de lipase de 60 Kdalton encontra-se assinalada com uma seta (ver Ex. 57).

Figura 13 Focalização isoeléctrica preparatória da lipase MY.

Dessalinizo.u-se a lipase MY (400 mg) e eliminaram--se os sólidos. Ligou-se a amostra com 2 ml de an-fólitos (pH 2,5-5) e fez-se incidir sobre ela 12 watts a 4°C, durante 4 horas.

Figura 14 Cromatograma de (R,S)-HPPA, (R)-HPPA e de (S)-HPPA.

Condições de cromatografia: Coluna, Resolvosil BSA--7, Macherey-Nagel, fase móvel, n-propanol a 5% / -114- / (v/v) em KH^PO^ 10 mM, tampão a pH 5,0; débito, 2,7 ml/minuto, temperatura 22°C, detecção UV a 220 nm.

Figura 15

Figura 16

Figura 17

Figura 18

Efeito da abordagem do limite teórico da conversão em ee.

Efeito de HPPA sobre a hidrólise de HPPA-Me. Combinaram-se 200 ml de acetato de amónio, 0,04 M, a pH 7,0, com 30 ml de tolueno, 40 mmoles de HPPA--Me, 25 mg de Lipase MV e a quantidade indicada de (R,S)-HPPA. Efectuaram-se amostragens das reac ções, conforme indicado e analisaram-se, tal como descrito na Figura 1.

Efeito da diluição na taxa de enzima. Deixou-se reagir durante 164 horas, a quantidade de água ijn dicada, 0,04 moles de HPPA-Me, 0,04 moles de acetato de amónio, a pH . 7,30 ml de tolueno, e 25 mg de lipase MY, em 25 ml de água. Analisaram-se as amostras da camada aquosa tal como indicado na Figura 1.

Produção à escala de quilogramas de (R)-HPPA. Deixaram-se reagir durante 29 horas, 25 g de lipase MY, 1 litro de acetato de amónio 0,2 N, pH 6,5, 9 litros de água, 2,5 litros de tolueno e 1,176 Kg de (R,S)-HPPA-Me. Analisaram-se as amostras por CLAP, tal como indicado na Figura 1.

Como é evidente, a partir do anteriormente exposto, encontram-se contempladas diversas modificações na prática da presente invenção. 0 âmbito da presente invenção encontra-se, assim definido nas reivindicações em anexo.

Claims (122)

11^-ψ REIVINDICAÇÕES 1. - Processo para hidrolisar estéreo-selectivamente misturas racémicas de ésteres de ácidos 2-substituídos, diferentes dos ácidos 2-halo-propiónicos, com elevado excesso enantiomérico, para proporcionar diversos ácidos, caracterizado por se fazer contactar essa mistura racémica com uma lipase de Candida rugosa na presença de um solvente orgânico.

2. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o solvente orgânico ser um solvente orgânico aromático. 3.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado V)/

% pelo facto de o solvente orgânico aromático ser o tolueno.

4. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o éster referido ser um éster do ácido 2-ariloxi-propiõnico.

5. - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo facto de o referido éster ser um éster do ácido 2-(4-hidro-xi-fenoxi)-propiõnico. * 6,- Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo facto de o referido éster ser o éster metílico ou o éster etílico do ácido 2-(4-hidroxi-fenoxi)-propiõnico.

7. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se imobilizar a referida lipase.

8. - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo facto de se imobilizar a lipase utilizando uma poliaziridina para a imobilização.

9. - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo facto de se imobilizar a referida lipase utilizando como suporte uma resina permutadora de iões. »«·

10. - Processo de acordo com a reivindicação 9, caracteriza-do pelo facto de a resina permutadora de iões ser substituída com um grupo ácido carboxílico.

11. - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo facto de se imobilizar a lipase na presença de um ácido orgânico . . 12.- Processo de acordo com a, reivindicação 11, caracterizado pelo facto de o ácido orgânico possuir uma cadeia com mais do que sete átomos de carbono.

13. - Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo facto de o ácido orgânico possuir entre 12 e 18 átomos de carbono.

14. - Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo facto de o ácido orgânico ser o ácido esteárico.

15. - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo facto de se adicionar um agente redutor.

16. - Processo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo facto de o agente redutor ser o hidro-sulfito de sódio, o sulfito de sódio ou um boro-hidreto.

17. - Processo de acordo com a reivindicação 16, caracteri-zado pelo facto de o agente redutor ser o hidro-suífito de sódio.

18. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracteriza-do pelo facto de a lipase de Candida rugosa possuir a composição da lipase MY ou da lipase AY.

19. - Processo para a purificação de uma enzina, caracteriza do pelo facto de se imobilizar uma mistura de enzimas.

20. - Processo para a purificação de uma enzima de Candida rugosa, caracterizado pelo facto de se imobilizar uma mistura de enzimas preparada a partir daquela.

21. - Processo para a purificação de uma enzima de Candida rugosa, 'caracterizado pelo facto de se imobilizar uma mistura de enzimas preparada a partir daquela e de se utilizar essa mistura repetidamente.

22. - Processo para a purificação de uma enzima de Candida rugosa, caracterizado pelo facto de se imobilizar uma mistura de enzimas preparada a partir daquela e de se utilizar essa mistura repetidamente num solvente orgânico.

23.- Processo de acordo com a reivindicação 20, caracteri- ( 119 / // zado pelo facto de a purificação proporcionar uma actividade acrescida. :

24. - Processo de acordo com a reivindicação 23, caracteri-zado pelo facto de a purificação originar uma estéreo-selectivi-dade acrescida.

25. - Processo para a purificação e para a separação de enzimas da lipase de Candida rugosa, caracterizado pelo facto de se utilizar cromatografia de permuta iõnica e de se separar as iso-zimas de lipase resultantes recorrendo a um sistema de eluição apropriado.

26. - Processo de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo facto de o esquema de eluição consistir num sistema de pH escolonado ou num sistema de gradiente de pH.

27. - Processo de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo facto de o sistema de eluição ser um sistema de pH escalonado.

28.- Processo de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo facto de a referida cromatografia de permuta iónica utilizar um suporte cromatográfico transformado com um ácido forte. i 120

29.- Processo de acordo com a reivindicação 28, caracteri-zado pelo facto de o suporte cromatográfico ser transformado com um grupo funcional sulfopropilo.

30.- Processo de acordo com a reivindicação 29, caracteriza-do pelo facto de o suporte cromatográfico ser um polímero de N-acriloíl-2-amino-2-hidroxi-l,3-propanodiol transformado pelo grupo funcional sulfopropilo. / 31.- Processo de acordo com a reivindicação 29, caracteri-zado pelo facto de o suporte cromatográfico ser um dextrano de ligações reticulares transformado por um grupo funcional sulfopropilo.

32. - Processo de acordo com a reivindicação 29, caracteriza-do pelo facto de o suporte cromatográfico ser um dextrano de ligações reticuladas com um polímero de Ν,Ν'-metileno-bis-acrilamida, transformado pelo grupo funcional sulfopropilo.

33. - Processo de acordo com a reivindicação 29, caracteri-zado pelo facto de o suporte cromatográfico ser uma agarose transformada por um grupo funcional sulfopropilo.

34.- Processo para a purificação e para a separação de enzimas da ligase de Candida rugosa, caracterizado pelo facto de se I 121

utilizar focalização isoeléctrica.

35.- Processo de acordo com a reivindicação 1, carac-terizado pelo facto de a lipase conter uma ou várias das isozi mas possuindo a seguinte sequência de aminoácidos N-terminal: Ala-Pro-Thr-Ala-U-Leu-Ala-Asn-Gly-V- Thr-Ile-Thr-Gly-Leu-Asn-Ala-Ile-Ile-Asn- Glu-Ala-Phe-Leu-Gly-Ile-W-X-Ala-Glu- Pro-Pro-Y-Z-Asn-P em que U, V, ¥, X, Y e Z representam aminoácidos e P representa a porção restante do pêptido. ,/122 .¾

36. - Processo de acordo cora a reivindicação 35, carac-terizado pelo facto de a lipase de Candida rugosa ser a lipase MY ou a lipase AY.

37. - Processo para hidrolisar ésteres, para transeste-rificar ésteres ou ácidos ou para esterificar ácidos ou álcoois, caracterizado pelo facto de se fazer contactar o referido éster, ou- ácido ou álcool com urna isoziraa de Candida rugosa.

38. - Processo para estéreo-selectivamente hidrolisar ésteres, transesterificar ésteres ou ácidos ou esterificar ácidos ou álcoois,.caracterizado pelo facto de se fazer contactar esse éster, ácido ou álcool com uma isoziraa de Candida rugosa.

39. - Processo parà hidrolisar ésteres, caracterizado pelo facto de se efectuar essa hidrólise na presença de uma iso ziraa de lipase conforme definida na reivindicação 35.

40. - Processo para hidrolisar ésteres, caracterizado pelo facto de se efectuar essa hidrólise na presença de uma iso ziraa de lipase possuindo a seguinte sequência de aminoácidos N--terminal: Ala-Pro-Thr-Ala-Lys-Leu-Ala-Asn-Gly-V- Thr-Ile-Thr-Gly-Leu-Asn-Ala-Ale-Ile-Asn- Glu-Ala-Phe-Leu-Gly-Ile-Pro-Phe-Ala-Glu- 123 Pro-Pro-Val-Gly-Asn-P em que V representa um aminoácido e P representa a porção res-tante do péptido.

41. - Processo para hidrollsar ésteres, caracterizado pelo facto de se efectuar essa hidrólise na presença de uma iso zima de lipase.possuindo a seguinte sequência.de aminoácidos N--terminal: Ala-Pro-Thr-Ala-Thr-Leu-Ala-Asn-Gly-Asp- . Thr-Ile-Thr-Gly-Leu-Asn-Ala-Ile-Ile-Asn- Glu-Ala-Phe-Leu-Gly-Ile-W-X-Ala-Glu- Pro-Pro-Y-Z-Asn-Leu-Phe-Ile-ZZ -Leu-P-em gue W, X, Y, z e ZZ representam aminoácidos e P representa a porção .restante, do péptido.

42. - Processo de esterificação, caracterizado pelo facto de se efectuar essa esterif icação na presença de uma isozima de lipase conforme, definida na reivindicação 38.

43. - Processo.de esterificação, caracterizado pelo facto de se efectuar essa esterificação na presença de uma isozima de lipase conforme definida na reivindicação 40.

44. - Processo de esterificação, caracterizado pelo facto de se efectuar essa esterificação na presença de uma isozima 124

de lipase conforme definida na reivindicação 41.

45. - Processo de transesterificação, caracterizado pelo facto de se efectuar essa transesterificação na presença de uma isozima de lipase conforme definida na reivindicação 38.

46. - Processo de transesterificação, caracterizado pelo facto de se efectuar essa transesterificação na presença de uma isozima de lipase conforme definida na reivindicação 40. 47;-. Processo de transesterificação,· caracterizado pelo facto de se efectuar essa transesterificação na presença de uma isozima de lipase conforme definida na reivindicação 41.

48. - Processo parà a hidrólise estéreo-selectiva de uma mistura racémica de- esteres, caracterizado pelo facto de se efec tuar essa hidrólise na presença de uma isozima conforme definida na reivindicação 38.

49. - Processo para a hidrólise, estéreo-selectiva de uma mistura racémica de ésteres,, caracterizado pelo facto de se efe£ tuar essa hidrólise na presença de uma isozima conforme definida na reivindicação 40.

50.- Processo para a hidrólise estéreo-selectiva de uma mistura racémica de ésteres, caracterizado pelo facto de se efeç tuar essa hidrólise na presença de uma isozima conforme definida na reivindicação 41.

51. - Processo para a transesterificação estéreo-selecti va de uma mistura racémica de ésteres ou de ácidos, caracterizado pelo facto de se efectuar essa transesterificação na presença de uma isozima de lipase conforme definida na reivindicação 38.

52. - Processo para a transesterificação. estéreo-selecti va de uma mistura racémica de· ésteres ou de· ácidos, caracterizado pelo facto de se efectuar essa transesterificação na presença de uma isozima de lipase conforme definida na reivindicação 40.

53. - Processo parà a transesterificação estéreo-selecti va de uma mistura racémica de ésteres ou de ácidos, caracteriza-do pelo facto de se efectuar essa transesterificação na presença de uma isozima de lipase conforme definida na reivindicação 41. 54'.- Processo para. esterif icação estéreo-selectiva de uma mistura racémica de álcoois ou de ácidos, caracterizado pelo facto de se efectuar essa esterificação na presença de tuna isozi ma de lipase conforme definida na reivindicação 38.

55.- Processo para a esterificação estéreo-selectiva de 126 uma mistura racémica de álcoois ou de ácidos, caracterizado pelo facto de se efectuar essa‘esterificação na presença de uma isozima de lipase conforme definida na reivindicação 40.

56. - Processo para a esterificação estéreo-selectiva de uma mistura racémica de álcoois ou de ácidos, caracterizado pelo facto de se efectuar essa esterificação na presença de uma isozima de lipase conforme definida na reivindicação 41.

57. - Processo de·'acordo com as reivindicações 37-56, ca racterizado pelo facto de se imobilizar a referida isozima.

58. - Processo de acordo com a · reivindicação 57, caracte rizado pelo facto de. se imobilizar a.referida isozima utilizando uma poliaziridina para.a. imobilização.

59. - Processo de acordo com a reivindicação 58, caracte rizado pelo facto de. se imobilizar a referida isozima utilizando como suporte uma resina permutadora de iões.

60. - Processo de acordo com a reivindicação. 59, caracte rizado pelo facto de a resina permutadora. de iões. ser substitui da com um grupo ácido carboxílico.

61. - Processo de acordo com a reivindicação 57, caracte rizado pelo facto de se imobilizar a isozima na presença de um ácido orgânico.

62. - Processo de acordo com a reivindicação 61, carac-terizado pelo facto de o referido ácido orgânico possuir uma cadeia com mais do que 7 átomos de carbono.

63. - Processo de acordo com a reivindicação 62r carac-terizado pelo facto de o ácido orgânico possuir 12 a 18 átomos de carbono.

64. - Processo de acordo com a reivindicação 63, carac-terizado·pelo facto de o ácido orgânico ser o ácido esteárico.

65. - Processo de acordo com a reivindicação 57, carac-terizado pelo facto de se imobilizar a isozima na presença de álcool polivinílico.

66. - Processo de acordo com a reivindicação. 57, carac-terizado pelo facto de se imobilizar a isozima sobre silica.

67. - Processo de acordo com a reivindicação 57, carac-terizado pelo facto de a isozima ser a isozima definida na rei vindicação 40. /28

68.- Processo de acordo com a reivindicação 57, carac-terizado pelo facto de a isozima ser a isozima definida na rei vindicação 41.

69. - Processo de acordo com as reivindicações 39-41 e 48-51, caracterizado pelo facto de se efectuar na presença de um solvente orgânico.

70. - Processo de acordo com a reivindicação 69, caracterizado pelo facto de se imibilizar a isozima.

71. - Processo de acordo com a reivindicação 70, caracterizado pelo facto de- se imobilizar a isozima tal como se definiu nas reivindicações. 58-66.

72. - Processo de acordo com as reivindicações 42-44 e 54-56, caracterizado pelo facto de se efectuar na presença de um solvente orgânico.

73. - Processo de acordo com a reivindicação 72, caracterizado pelo facto de se imobilizar a isozima.

74. - Processo de acordo com a reivindicação 73, caracterizado pelo facto de se imobilizar a isozima de acordo com as reivindicações 58-66.

75. - Processo de acordo com as reivindicações 45-47 e 51-53/ caracterizado pelo facto de se efectuar na presença de um solvente orgânico.

76. - Processo de acordo com a reivindicação 75, carac terizado pelo facto de se imobilizar'a isozima.

77. - Processo de acordo com a reivindicação 76, carac terizado pelo facto de se imobilizar a isozima conforme definida nas reivindicações 58-66.

78. - Processo para hidrolisar estéreo-selectivamente misturas racémicas de ésteres, caracterizado pelo facto de se fazer contactar essas misturas racémicas com uma isozima de lipase.

79. - Processo de acordo com a reivindicação 78, carac terizado pelo facto de imobilizar a isozima de lipase.

80. - Processo de acordo com a reivindicação 78, carac terizado pelo facto de efectuar na presença de um solvente or gãnico.

81.- Processo de acordo com a reivindicação 78, carac terizado pelo facto de o solvente orgânico ser o tolueno.

82. - Processo de acordo com as reivindicações 78-80, ca racterizado pelo facto de a lipase ser a isozima de acordo com as reivindicações 38 ou 40.

83. - Processo de acordo com a reivindicação 82,. caracte rizado pelo facto de a lipase ser a isozima de acordo com a rei vindicação 40.

84. - Processo de acordo com as reivindicações 78-80, ca racterizado pelo facto de o éster ser o éster de ácido 2-arilo-xi-propiõnico.

85. - Processo de acordo com a. reivindicação 84, caracte rizado pelo facto de. o éster ser um éster do ácido 2-(4-hidro-xi-fenoxi)-propiõnico.

86. - Processo de acordo com a reivindicação 85, caracte rizado pelo facto de esses ésteres serem os ésteres metílico ou etílico do ácido 2-(4-hidroxi-fenoxi)-propiõnico.

87. - Processo de acordo com a reivindicação 85, caracte rizado pelo facto de. se adicionar um agente redutor.

88. - Processo de acordo com a reivindicação 87, caracte rizado pelo facto de o agente redutor ser o hidro-sulfito de sõ 131

dio, o sulfito de sódio ou um boro-hidreto.

89. - Processo de acordo com a reivindicação 88, carac-terizado pelo facto do agente redutor ser o hidro-sulfito de sódio.

90. - Processo de acordo com a reivindicação 78, carac-terizado pelo facto de os ésteres serem ésteres dos ácidos 2--arilpropiónicos.

91. - Processo de acordo com à reivindicação 79, carac-terizado pelo facto de - os ésteres serem ésteres dos ácidos 2--arilpropiõnicos.

92. - Processo de -acordo com a reivindicação 80, carac-terizado pelo facto de os ésteres serem ésteres dos ácidos 2--arilpropiõnicòs.

93. - Processo de acordo com as reivindicações 90-92, caracterizado pelo facto de a isozima ser a isozima de acordo com as reivindicações.38, 40 ou 41.

94. - Processo para a transesterificação estéreo-selec-tiva de uma mistura racémica de ésteres de- ácidos 2-arilpropiõ nicos, caracterizado pelo facto de se utilizar uma isozima de lipase.

95. - Processo de acordo com a reivindicação 94, carac-terizado pelo facto de se imobilizar a isozima.

96. - Processo de acordo com a reivindicação 94, carac-terizado pelo facto de a isozima ser á isozima de acordo com as reivindicações 38, 40 ou 41.

97. - Processo de acordo com a reivindicação 94, carac-terizado por sé utilizar um solvente orgânico.

98. - Processo de acordo com a reivindicação 92 ou 97, caracterizado pelo facto de o solvente orgânico ser um solvente orgânico alifático.

99. - Processo de acordo com as reivindicações 90-98, caracterizado pelo facto de os ésteres serem ésteres de ceto-profeno.

100.- Processo de acordo com as reivindicações 90-93, caracterizado pelo facto de os ésteres de cetoprofeno serem os ésteres metílico, etílico, n-propxlico, n-butílico, n-hexílico ou n-octílico ou qualquer outro· éster alquílico.

101.- Processo de acordo com as reivindicações 90-98, caracterizado pelo facto de os ésteres de cetoprofeno serem ésteres substituídos por átomos de halogéneo tais como os ésteres 2-cloro-etílico, 2,2,2-tricloro-etílico ou. 2,2,2-trifluo ro-etílico.

102. - Processo de acordo com as reivindicações 90-98, caracterizado pelo facto de os ésteres de cetoprofeno serem os· ésteres mono-glicerílico, 2-hidroxi-etílico, ésteres mono-metilícos de dietileno-glicol ou de trietileno-glicol ou outros· ésteres hidroxilados. .. *

103. - Processo de acordo com as reivindicações 90-98, caracterizado pelo facto de os ésteres serem ésteres de ibupro feno.

104.- Processo de acordo com as reivindicações 90-93, caracterizado pelo facto de os ésteres serem ésteres de fenopro feno.

105.- Processo de acordo com as reivindicações 90-93, caracterizado pelo facto de os ésteres serem ésteres do ácido 2-fenilpropiõnico.

106.- Processo de acordo com as reivindicações 90-93,

caracterizado pelo facto de os ésteres serem ésteres de indopro feno.

107. - Processo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de a estéreo-selecti-vidade ou a velocidade da hidrólise de uioa mistura de ésteres racêmicos proporcionada por uma enzima ser aumentada ao adi-cionar-se um ácido gordo ou um éster de um ácido gordo.

108. - Processo de acordo com a reivindicação 107, ca-racterizado pelo facto de a enzima ser uma isozima.

109. - Processo de acordo com a reivindicação 108, caracterizado pelo facto de a isozima ser a isozima definida nas reivindicações 38, 40 ou 41.

110. - Processo de acordo com a reivindicação 107, caracterizado pelo facto de a enzima ser uma lipase.

111. - Processo de acordo com a reivindicação 110, caracterizado pelo facto de a lipase ser uma lipase de Candida rugosa.

112. - Processo de acordo com as reivindicações 90-98, caracterizado pelo facto de se utilizar um aditivo constituído 135 / por um ácido gordo ou por um éster de um ácido gordo guando se aumenta a velocidade ou a estéreo-selectividade da reacção.

113. - Processo de acordo com a reivindicação 112, carac terizado pelo facto de se seleccionar o aditivo entre esteres oleato, óleos vegetais, óleos de origem animal ou agentes ten-sio-activos contendo oleato.

114. - Processo de acordo com a reivindicação 112, carac terizado pelo facto de o aditivo ser- o ácido oleico. 115.- terizado pelo linoleico. Processo de acordo com a reivindicação 112, carac facto de o aditivo ser o éster metálico do ácido

116. - Processo de acordo com a. reivindicação 112, carac terizado pelo facto de o radical- álcool do- éster da mistura ra-cémica conter um grupo de remoção de electróes.

117. - Processo de acordo com a reivindicação 112, carac terizado pelo facto de o radical álcool do éster conter um ou vários grupos hidroxilo livres.

118. - Processo de acordo com a reivindicação 112, carac terizado pelo facto de o radical álcool do éster ser um éster 136

2-cloro-etílico.

119. - Processo de acordo com a reivindicação 117, ca-racterizado pelo facto de a mistura racémica de ésteres ser com posta por monoglicéridos de cetoprofeno,.· éster 2-hidroxi-etíli-co de cetoprofeno, éter mono-etílico de cetoprofeno-dietileno--glicol ou de cetoprofeno-trietileno-glicol.

120. - Processo de. acordo com as reivindicações 92 ou 97, caracterizado pelo facto de o solvente orgânico ser o ácido oleico.

121. - Processo para hidrolisar mono- ou di- ou tri--glicèridos, caracterizado.pelo facto de se utilizar uma isozima de- lipase livre ou imobilizada.

122. - Processo de acordo com a reivindicação 121, ca-racterizado pelo facto de a isozima ser a isozima de acordo com as reivindicações 38, 40 ou 41.

123. - Processo de acordo com a reivindicação 121, caracterizado pelo facto de. se utilizar um solvente orgânico.

124. - Processo para transesterificar mono-, di- ou tri-glicèridos, caracterizado pelo facto de se fazer contactar 1 137

ΰ esses gliceridos cora. uma isoziraa de lipase no estado livre ou no estado imobilizado.

125. - Processo de acordo, com a reivindicação 124, ca-racterizado pelo facto de a isoziraa ser a isoziraa definida nas reivindicações 38, 40 ou 41.

126. - Processo de acordo com a reivindicação 124, ca-racterizado pelo facto de se utilizar um solvente orgânico.

127. - Processo para a esterificação de álcoois mono-, di-, tri- ou poli-funcionais, caracterizado pelo facto de se fazer contactar esses álcoois cora uma isoziraa.de lipase no estado livre ou no estado imobilizado, na presença ou na ausência de um solvente orgânico.

128. - Processo de acordo com a reivindicação 127, caracterizado pelo facto de a isoziraa ser a isozima definida nas reivindicações 38, 40 ou 41.

129. - Processo de acordo com a reivindicação 127, caracterizado pelo facto de se utilizar um solvente orgânico. Lisboa, 21 de Janeiro de 1991 O Agente Ohciol cia Propriedade Incteslriaf