PT90373B

PT90373B - Processo para a preparacao enzimatica de beta-lactamas

Info

Publication number: PT90373B
Application number: PT90373A
Authority: PT
Inventors: Cornelis Jacobus Van Der Laken
Original assignee: Gist Brocades Nv
Priority date: 1988-04-26
Filing date: 1989-04-26
Publication date: 1994-09-30
Also published as: EP0339751A1; EP0339751B1; DK198789D0; GR3020486T3; PT90373A; JP2771244B2; DE68926548D1; ATE138690T1; DK198789A; DE68926548T2; KR890016184A; ES2090031T3; JPH01312998A

Description

DESCRIÇÃO

DA

PATENTE DE INVENÇÃO

N.°

373

REQUERENTE: GIST-BROCADES N.V., holandesa, com sede em Wateringsweg 1, P.O. Box 1, 2600 MA Delft, Países Baixos.

EPÍGRAFE:

INVENTORES:

PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO ENZIMÁTICA DE ^-LACTAMAS

Cornelis Jacobus Van Der Laken.

Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo 4.° da Convenção de Paris de 20 de Março de 1883.

Patente Europeia, em 26 de Abril de 1988, sob o n⁵

88200811.3.

INPI. MOD 113 R F 1C732

Descrição referente h patente de invenção de GIST-BHOCABSS K.V., holandesa, industriei e comercial com sede «o Wateringaaweg 1* P. 0. Box 1, 2600 Ií* Delft, Países Baixos , (inventort Comelis 3aoobus Tan Der Laken, residente na Holanda), pera PROCESSO PAR»

A PRISPARAÇÃO BgZIMiTICA pg f.-LACTAM AS»·

DFSCRIÇAQ

D.D. *

A presente invenção refere—ae a ua processo para a preparação enzimática de um derivado -lactâmico com uma cadeia lateral de 6-D-x-eoinofenilacetaaido submetendo um derivado de fenilglicina e o correspondente derivado de 6-emino- —lactama ã acção de uma ou de várias enzimas de origem microbiana·

Geralmente, este tipo de penicilina semiaintética e preparado por métodos químicos, por exemplo por reacção do 6 eido 6-aainopenicilteico (6-ApA), geralmente protegendo o eeu grupo carboxílico, com um precursor da cadeia lateral, seguido da remoção do grupo protector por hidrólise· Por exemplo, a eg pioilina (ácido 6*»D-«-«Mdnofenilseetamid0penleiltoieo) pode «ei preparada por reacção do 6-APA, oom o grupo carboxilo protegido dum modo adequado, com o cloridrato de cloreto de D-fenilglicina, seguida de hidrólise·

A publicação de pedido ds Patente Alemã 1Y> 2163792 descreve a preparação enzimática de compostos aminopenicilãni— eoa por reacção de um derivado com 6-AP* (não protegido )na prg sença da enzimas de um mleroorganiamo pertencente ao género £BAD ORIGINAL '

«totó· «·

- ·· i r í eetobacter. Janthòmoaag. Kyooplana. Protoaalnobacter oa Aeromonas. Ns Patente Austríaca Rfi 2439&Ó, ona enzima obtida β partir da oa» «apeei· da Paeodoaonas foi mencionada coso oa eetalisador para a reacção da um derivado da D-fenilglieina com o 6-APA, Ro pedido de Patente doa Países Baixos Rfi 7oo9136, foi descrita a enzima do mteroorganiamo fjavobac teriam TP-44-1O2 para oatall ser a mesma reacção.

A publicação de pedido de Patente Aleaã H* 2621618 descreve a preparação enzimática de coapoatoe aadnopeoiciliai— cos, por reacção de um derivado de D-fenilglicína coa 6-tPA aa presença de uaa preparação da aicélio a partir da nicroorgaaig noa do género Agbanocladlua oa Ceobalcaporiun.

principal inconveniente destes métodos enzim&ti— coa β o preço elevado do derivado estereoisomerieamente poro de D-fenilglicina usado como precursor da cadeia lateral.

Verificou-ee agora aurpreendentenente que este tipo de reacção enzimática poda aer realizado asando, como precursor da cadeia lateral, o raceaato do derivado da fenilglioina em vez da forma L pura, enquanto ae mantém eubetanoialmente o m«£ mo nível de rendimento dah-lactama com uma cadeia lateral de

6-D-X-aminofenilacetamido. Deate modo, deixa de aer necessária uma conversão dispendiosa de derivados da L,L—fenilglicina noΓββ gente de D-íenilglicina antea de reagir coa ο 6-APí.

λ presente invenção é por conseguinte carset«risada por o derivado da fenilglicina cer asado ae forma D,l.

Oa derivados adequados d« fenilglicina (PG)pare o objectivo da presente invenção, c^o por exemplo, st feailglicin» e amidas e ésteres de PG (PG-X), tais como ésteres (de-alqú^L lo inferior) e !í-( alquilo inferior)-aaiides· 0 alquilo inferior é definido na presente memória descritiva oomo constituído per cadeias alquílicas lineares oa moificadae. Os derivados de PG preferidos c&o oa ésteres metílico « etílico a ea eni des R-(metil) a K-(etil) ds fenilglioina·

Oc compostos de ^-lácteas adequados dão, por exem2 - BAD ORIGINAL pio, ácidos penicilâniooa ou oa seus «ais ou ésteres.

Oa saia de ácidos penicilânicos adequados inclusa enis habituais não tóxicos, taie como ua aal dc metal alcalino (p. ex. sal de sódio, sal de potássio, etc.) e ua aal de metal alcalino-terroso (p. ex» sal da cálcio, sal de oagoéaio, etc»), ua sal de amónio, um sal de base orgânica (p. ex. ral da triactilamina, aal de trietilamina, aal da piridina, aal de picoli— na, eal de dicido-hexilaaina, sal de S,N*-dibenail«tilenodi*mi na, etc»), sal de um ácido orgânico (p. az* acetato, mleato, tartarato, aetanoseulfato, cinaaato, p-clorooínaaato, benuenos sulfonato, foraiato, tolnenosauífanato, etc.) tn aal inorgftnico (p. ex. cloridrato,/bromidreté, iodidrato, sulfato, fosfato, etc.) ou um sal comua ácido aadnado (p. ex. com arglnine, ácido aapártioo, ácido glutteieo, ate.) e semelhantes.

Os ésteres adequados doa ácidos penieiltaieoa incluem ésteres habituais não tóxicos, tais com» éster metilico, éster etílico, éster propilico, éster butllico ou éster benzilico, opcionalmente substituido, tal como o éster difenilmetílico e o éster 4-nitrobensllico, etc·, etc··

Ae ensinas adequadas elo por exeáplo, as enzimas de origem microbiana que catalise» e reacção das 6-eaino— j} -lactamas e de wc derivado de 3>PG. De prefertacia são usados para es ta reeoção as enzimas dos sicrocrganiamos Acetobactar paateuria· no e Xanthomonag citrii usando um derivado de D,I/-PG.

As condições da reacção dependem da v«rloe parâmetros, em particular dos reagentes, do tempo da reacção, da tem peratura e da concentração da enzima. As condições preferidas podem ser rapidamente datendLnados pelos aapecialiatae na matéria. Oaralmenta, a temperatura da reacção poda variar entre 0°C e 40°C. Os tempos de reacção adequados são da-pouoos minutos a várias horas, em especial de seroa, de 0,5-hora até cerca de 2 horas. As concentrações de enzima adequadas são da cerca dé 0,5 U/ml até cerca da 10 U/ial.

Rum* forma da concretização preferida, prepara-se do modo referido a ampicillna» De modo espeolalmante preferido.

prepara-se deste modo β ampicilina a eme temperatura de O e 25° C, de preferência de 5 * 15°C. Também a síntese enzimática da ampicilina por reacção do 6-apa com um derivado dn l>-fenllgLiel na de preferência e realizada a on» temperatura ds 0 a 25? C, de preferência de 5 a 15°C· Pode obtex*-se om rendimento mais elevado de cerca de 88 £ a uaa temperatura ds reacção de 5°C em ▼es ds cerca de 73 £ * sma temperatura de 30°C. I6fo se fiseram quaisquer tentativas para ορϋπύ.ζ»*’ os tempos de reacçao com a escolha ds outras enzimas, por exemplo·

Tta contraste com as reacções de adição ds cadeia la tsral por via química conhecida· na química das j) —lactanas» verlficou-se de modo surpreendente que as rsacçbss ensimêticss correspondentes são altamente estereoespecíficas. A reacção com um derivado da D,L-PG de acordo com a presente invenção produz a forma D da ^«laotaaa com uma cadeia lateral 6-ec-aaino-fenilcjj taaido oa mais que 96 £ em relação ao rendimento total. As ensi mas adequadas eSo consideradas capazes ds levar a cabo a reacçãc seguinte enzima

D,L-PGX + 6-APA ----------·> Aapi ♦ L-PGX.

a separação adicional dos enantiómeros produzidos e de L—PGX, se pretendido, pode oer realizada por métodos conheci dos, por exemplo por cristalização·

A invenção é para além disso ilustrada pelos exemplos seguintes não limitativos

Txtracto de enzima de . Acetobacter gasteurlanua ATCC $033

A estirpe tcetobactsr pasteariapua ATCC 6033 f oicu? tivada de acordo com o método descrito por Kato (Kato, X st al·, Agxic· Biol· Chem· 4£, (1980) 1067-1074). Depois de 40 horas s 28°C o caldo ds cultura (5 1) foi centrlfugado durante 15 ainaBAD s ; _Q ¢,

7TÍÍ «ί* i : 4' tos β 11 000 g. Oa sólidos (200 g de peso em hõaido) forem suspensos οο 1 1 de TBIS 0,1 H (tampão de Tris-(hidroxiaetil)-eaino-metano )/HCl, a pH 8.0, A seguir adicionaram-se 1 g de lieozi ma e 4 g de EDTA e «gitou-ββ a solução durante 24 horas a 20°C. Adicionaram-se octanol a 1 £ v/v e Triton (B) x-100 v/v. Depois de 2 horas a 20°C, reduziu-se o pH ate 7,0 e adicionaram-se 4 g da KeClg β 1 mg de DRese. Depois de agitar durante 24 horas a 20°C, o caldo lisado foi centrifugaflo durante 10 ainutos a 11 600 g.

Diluiu—se o sobrenadante 4 reses com água, reduzi»—se o pH ate 6,0 e adicionaram-se 15 g de permutador de cetiões de Sephadex SP seco. Depois de agitar 1 hora, o material de âephadex foi filtrado β lavado com 500 al de tempão de ácido 4— —aorfollno-etanossulfânieo 10 «55 (E^-^) a pH 6,0. ''TLoín—se a actividade enzimática com uma solução da concentração de sal elevada (KeCl 0,5 U em tampão KES, pE 6,0)·

Rate concentrado enzimatico foi diallsado contra EPS 10 nE com pH 6,0 e foi usado tal qual em todos os exemplos que se seguem, a solução de enzima final te» una actividade de 18 ϋ/ml. Uma unidade corresponde fe quantidade de enzima que hi droliaa por minuto 1 pmole de éster metiiico de D-fenilglicina em D-PG sob condiçães normais (D-PGHe 30 «E, 100 mlá, pH 6,3i

30°C).

Exemplo II

Síntese estereoespecífioa da aapicilina

A síntese da aaploilina a partir do 6-*P* e de uma mistura racémica de D,l-PG3e foi realizada usando cotndiçães nor mais: pH estabilizado automaticamente, pH 6,3, 30°C e 6-*P<

raR.

forem tomadas amostras a tempos determinados e veri ficou-se a presença de ambos os isÓmeros por ET1C de fase inver ca descrita por F. Jehl et aí·, Path. Mol. 31. (1983) 370. Descrição pormenorizada: colunat p Bondapack C-18, 3,9 x 300 mm eluente: acetonitrilo a 10JC, 0,2 ff acetato de amónio com pH 5·Οι —------BADO^GINAL ml/óiin

.5:· detecção: 254 mm tempos de retençlo: *mpi :8,1 L-Aapi*:5»4 6-APA í3,7 PG :3»5 D,L-ÍS4e:9,2 m écido ó-L-x-aminofenilacetamidopenicilAnico

A Figura I «presente e percentagem de Ampl e de L-Ampi formadas (baseada ne concentração inicial de 6-*P<) usando 0,8 ϋ/ml da enzima de Açstobacter (preparada no T±eaplo I). Ho Quadro I apresentam-ae os resultados com outras concentrações de enzima.

Ho Quadro II apresenta—se o resultado de uma experiência usando enzima de Xanthomonaa cltril a 1 U/ml.

λ identidade da Ampl e da L-Ampi foi confirmada por analise de ¹H-HKK.

QUADRO I

6-APA (milimo- les)	D,L—PGMe (milimoles)	THZIKA (U/al)	AMPI FORMADA $	L-AMPI FORMADA $
10	60	0.8	66.8	2.2
20	120	1.7	59.8	2.0
40	240	3.4	67.7	2.6
60	360	5.1	59.2	2.0

BAD original

-AlàV' WS?QUAPfcO II

£ «ru W** ·-.«!* -a (milimo» lss)	▼ a^e***· p umo (milimo- les)	n^e** a·» ·	i Ιγ-ΑμχΙ PvwieAD^ f
r* (U/fcil)	aSU ± X VA«e MA> n $
20	60	1.0	35	1

^xemplo III

DepeadSnoia da temperatura da clatnsc eatsreoegrecifica

õ.* ampicilina

A síntese eziziaAtloa foi realisada com acilase obti da a partir de Acetobacter pasteurianum (preparada no templo

I)·

As condiçdee do ensaio foram: pH eatebiliz»do auto-* maticaments» pH 6,3, 6-APA 10 mM, D,L—PGMe 60 atf·

As ajcostra· z'ztix-rdaa 2 intervalos rteulzira ícran analisadas como descrito no Pxemplo II· lio Quoãro III F.pr€2s:;t-2x-se as percentagens ds Ampi e de L~<mpi formadas (baseadas em 6-APA 10 mM) a diferentes tem peraturas· quadro ui

: ι·νχρ (°c) · 1 i 1	TSiziMA (U/el)	AMPI ί F02KADA ($)	X—AMPI 708KADA ($)
•5	13	π	8
10	6	66	4
30	1	60	^v;t2 ..·. V'·: : -

i ι

templo IV

Pependtocia da temperatura da síntese da ampicilina

Para a síntese enzimática da ampicilina usou-se a a cilase de *cetobqcter pasteurianua (preparada no ^Xenplo I).

As condições do ensaio foram: pH eetebilizado automaticanente, pS 6,3, 3O°C, 6-«PA 10 ffiM, D «w, 1>-Ρί»τ«» 30 mV.

As amostras tomadas a intervalos regulares fora® anslisadas por HPLC de fase inversa como descrito por B.G. Lauta ck et al., J. of Liq. Ohrom. /2» (Ã9Ô4) 124o.

Descrição pormenorizada· coluna: n Bonda pack C-18, 3,9 x 150 mo eluente: SDS 3,5 mH, 32,5^ v/v rcetonitrilc, AcOH 0,25 M, pH 3.0

Detecção: 254 na»

Tempos de retenção: 6-‘PA ; 3,4 min ‘spi : 9,1 min

D,L-PG«e í 11 min

Adicionou-se uma quantidade fixa da enzima (1 Π/ml).

tempo necessãrio para alcançar a eficiência de conversão máxima e a eficicucíe dc conversão mãxima propriamente dita são apresentados no Quadro IV para diferentes temperaturas de incubação.

BAD ORIGINAL

- 8 CXJASRO IV

TTKP (°c) J	AKPI FORMADA ($)	T+EPO (hor*»fi)
5	88	6.0
10	85	4.0
15	85	2.0
20	80	1.5
25	78	0.75
		/* c
«·*	4 J	w.y
35	72	0.5

Obtém-se essenclelmente o mesmo resultado usando o éster etílico de D-PG.

Claims

R VI NDI C Ã ¢5 ?S

- lfc Processo p^re a preparação enzimática âe um derivado de y—lact^aa com uma cadeia lateral de 6-D-«—aminofenilacetaai— do por submissão de um derivado de i enil glicina e do correspondente derivp.âo de 6-amiro-j>*lactac? ã ecção dr ama ou de várias enzimas adequadas de origem microbiana caracterizado por se user um derivado de fenil glicina sob a fores D,L.

- 2* Processo de «eordo com a reivindicação 1, caracteri— zaio por se usar o éster metilico ou etílico de D, L-f enil glicina.

- 3a Processo de acordo com a raivirdic+ç~o 1, c-rocterizado por ee as^rea ao enzir^s dos ricrooryvni^CG «cetobacter pastguriuuuu ou Zerthouon»? citril.

- 4â Processo de acordo coca qualquer das reivindicações 1 s 3» caracterizado por ser preparada aapicilina.

- 5» Processo de acordo com n reivindicação 4» caracterizado por se preparar ampicilina a uua tenperrtuia GUtre C ô 25>°C.

- 6 a Pruceuuo de acordo oom a i-eiviudicaç+c 4, caracteri— sado por se preparar ampicilina ε ume temperatura entre 5 e 15°G.

- 7- Processo pare a preparaçao enzimática ãe espicilir.e a partir de 6-iPA e de um derivado de D-feni lgli <rf n«> earaeterizado por a reacçlo ser levada a efeito a «asm temperatura en- 10

BAD ORIGINAL tre Ο β 25°C.

- 8* IrocGsco do scordo cos a reivindicação 7» caracterizado por ee preparar ampicilina β ama temperatura entre 5 e 15°C.

* requerente reivindica a prioridade do pedido de pe tente europeia apresentado em 26 de *bril de 1988, sob o n.a 88200811.3.