JP3507067B2 - クラブラン酸の製法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、酵素反応による新
規化合物の製法、特に適当な前駆体に対する酵素の作用
によるβ−ラクタム類、特にクラブラン酸などのクラバ
ム類の製法における該酵素反応に関する。

【０００２】

【従来の技術】クラブラン酸はＺ−（２Ｒ,５Ｒ）−３
−（β−ヒドロキシエチリデン）−７−オキソ−４−オ
キサ−１−アザビシクロ［３.２.０］ヘプタン−２−カ
ルボン酸である。クラブラン酸は、β−ラクタマーゼ反
応性β−ラクタム抗生物質を劣化から防御するので、β
−ラクタマーゼ酵素の有効な阻害剤であり、臨床的価値
の高い化合物である。イギリス特許明細書第１ ５０８
９７７号は、クラブラン酸として知られるクラバム誘導
体を記載し、これは、ストレプトミセス・クラブリゲル
ス（Streptomyces clavuligerus）ＡＴＣＣ ２７０６４
またはその高産生突然変異体により産生される化合物で
ある。抗生物質ＡＵＧＭＥＮＴＩＮ（登録商標）の基本
成分である重要な生成物クラブラン酸の生合成経路は多
くの研究の対象であった。ＥＰ Ａ ０ ２１３ ９１４に
おいて、クラブラン酸は前駆体のプロクラバミン酸
（Ｆ）：

【化３】 に対する一連の酵素の作用により形成されることが報告
されている。

【０００３】

【特許文献１】英国特許第１５０８９７７号明細書

【特許文献２】欧州特許出願公開第０２１３９１４号明
細書

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】生合成経路における初
期の工程は説明するのがより困難であり、正確な工程は
未だ解明されていない。クラブラン酸の前駆体としての
アルギニンおよびオルニチンの活用を評価する試験法
が、Appl. Environ. Microbiol., 1986, 52(4), 892-7
に記載されている。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、今回、新
規中間体およびそのクラブラン酸への変換過程を同定し
た。従って、本発明は、ストレプトミセス属、好ましく
は、エス・クラブリゲルス（S.clavuligerus）由来の酵
素系を用い、Ｓ−アルギニン、式（Ｉ）：

【化４】 ［式中、Ｒ^１は

【化５】 （式中、Ｒ^２＝ＨまたはＣ_１−６アルキルを意味する）
で示される基を意味する］で示される化合物、あるいは
式（ＩＩ）：

【化６】 ［式中、Ｒ^１は

【化７】 （式中、Ｒ^２＝ＨまたはＣ_１−６アルキルを意味する）
で示される基を意味する］で示される化合物、あるいは
式（ＩＩＩ）：

【化８】 ［式中、ＲはＨまたはＯＨ、およびＲ^１は

【化９】 （式中、Ｒ^２＝ＨまたはＣ_１−６アルキルを意味する）
で示される基を意味する］で示される化合物のうちいず
れか一の化合物からクラブラン酸および他のクラバム誘
導体を製法する方法を提供する。

【０００６】

【発明の実施の形態】「他のクラバム類」なる語によ
り、７−オキソ−４−オキサ−１−アザビシクロ［３.
２.０］ヘプタン核を含有する化合物を意味する［ジャ
ーナル・オブ・ケミカル・ソサイエティ（Ｊ.Ｃ.Ｓ.，C
hem.Commun.（１９７９）,２８２］。したがって、本発
明は、クラバム類、特にクラブラン酸の製造において有
用な新規化合物を提供する。本発明によれば、式
（Ｉ）：

【化１０】 ［式中、Ｒ^１は

【化１１】 （式中、Ｒ^２＝ＨまたはＣ_１−６アルキルを意味する）
で示される基を意味する］で示される化合物が得られ
る。

【０００７】本発明者らは、今回、化合物（Ｆ）の前駆
体が、式（Ｃ）：

【化１２】 の化合物であることを見いだした。

【０００８】従って、好ましい態様において、化合物
（Ｃ）：トレオ−３−ヒドロキシ−５−グアニジノ−２
−（２−オキソ−アゼチジン−１−イル）ペンタン酸、
好ましくは（２Ｓ−３Ｒ）またはその誘導体が得られ
る。化合物［Ｃ］は、ジェイ・イー・ミラーおよびジェ
イ・ジェイ・ビショフ（J E MillerおよびJ J Bischof
f），シンセシス（Synthesis），１９８６，７７７の方
法または当該分野にて公知の関連した方法にしたがっ
て、

【化１３】 を

【化１４】 と反応させることにより製造できる。

【０００９】本発明によると、グアニジノ基を有する化
合物から尿素を除去できる、アミジノヒドロラーゼ活性
を有し、特に適当な条件下で（Ｃ）を（Ｆ）に変換でき
る酵素も提供される。適当には、酵素系は、微生物、特
にストレプトミセス属由来のものである。好ましくは、
酵素は、以下に記載する実施例１に従って、ストレプト
ミセスから調製される。あるいは、酵素は、組み換え体
源から調製してもよい。酵素は、さらに他の基質、例え
ば、（２Ｓ）−５−グアニジノ−２−（２−オキソ−ア
ゼチジン−１−イル）ペンタン酸（以下に定義する化合
物Ｂ）と反応させた場合に、グアニジノ基をアミノ基に
変換するのに有用である。

【００１０】アミジノヒドロラーゼ活性を有する酵素
（以下、アミジノヒドロラーゼという）は、ストレプト
ミセス属、特にストレプトミセス・クラブリゲルスから
得られる。アミジノヒドロラーゼ酵素は、好ましくは精
製された形態、有利には実質的に純粋な形態である。本
発明の別の態様において、エス・クラブリゲルス菌糸体
を遠心分離および超音波処理に付し、続いてイオン交換
クロマトグラフィによる分別により処理することにより
アミジノヒドロラーゼを調製する方法が提供される。本
発明のさらに別の態様において、実質的に以下の配列番
号１のアミノ酸配列を有するアミジノヒドロラーゼ活性
を有する蛋白質が提供される。

【００１１】配列番号１の配列は、アミジノヒドロラー
ゼをコードするＤＮＡの遺伝子配列から得られた。遺伝
子は、エス・クラブリゲルスから得られるアミジノヒド
ロラーゼ酵素のＮ末端を配列決定し、ｐＢＲＯＣ４４と
して公知のベクター上にクローンされた、エス・クラブ
リゲルス染色体ＤＮＡの一部において見られるオープン
リーディングフレームから予想される配列とその配列を
適合させることにより同定する。ｐＢＲＯＣ４４の調製
は、ＥＰ−Ａ−０３４９１２１の実施例６に記載されて
いる。

【００１２】さらなる態様において、本発明は、本質的
にアミジノヒドロラーゼをコードする遺伝子からなるＤ
ＮＡを提供する。本発明はまたこのようなＤＮＡ、好ま
しくは適当な宿主生物においてアミジノヒドロラーゼの
発現のための発現ベクターからなるベクター（ｐＢＲＯ
Ｃ４４以外）を提供する。ＤＮＡは「自然」の状態（自
然界で起こるような）ではなく、単離または実質的に精
製された形態であると考えられる。好ましくは、本発明
のＤＮＡはエス・クラブリゲルス由来のものであるが、
本発明は、他の適当な微生物、特に、好ましくは非常に
厳密な条件下で、配列番号２またはアミジノヒドロラー
ゼ活性を有する酵素をコードするそのサブフラグメント
のＤＮＡとハイブリダイゼーションするエス・クラブリ
ゲルス以外のクラブラン酸産生微生物に由来するＤＮＡ
配列も包含する。

【００１３】本発明のＤＮＡおよびこれを含有するベク
ターは種々の工業的用途がある。これは前記ベクターで
形質転換された宿主微生物およびこれが発現する酵素に
も適用される。例えば、前記ＤＮＡを含有する組換えベ
クターは、適当な宿主中に形質転換された場合に、多量
のクラブラン酸を合成する遺伝子工学的に修飾された微
生物の産生において重要である。好ましくは、ＤＮＡ
は、実質的に、以下の配列番号２に示す配列を有するか
または変性してこの配列になるが、配列番号１のアミノ
酸配列をコードする配列を有する。本発明はまた、アミ
ジノヒドロラーゼ活性を有する酵素をコードする突然変
異体または関連する配列にも及ぶ。

【００１４】本発明に従って、式［Ｃ］の化合物または
その塩または保護された形態またはその類似体をアミジ
ノヒドロラーゼ活性を有する酵素と接触させることによ
り、プロクラバミン酸を調製する方法が提供される。

【００１５】本発明は、また、式（ＩＩ）：

【化１５】 ［式中、Ｒ^１は

【化１６】 （式中、Ｒ^２＝ＨまたはＣ_１−６アルキルを意味する）
で示される基を意味する］で示される化合物を提供す
る。

【００１６】好ましい態様において、（２Ｓ）−５−グ
アニジノ−２−（２−オキソアゼチジン−１−イル）ペ
ンタン酸（Ｂ）である式（Ｂ）：

【化１７】 の化合物またはその誘導体が提供される。

【００１７】式［Ｂ］の化合物は、ジェイ・イー・ミラ
ーおよびジェイ・ジェイ・ビショフ（J E Millerおよび
JJ Bischoff），シンセシス（Synthesis）１９８６，７
７７の方法または当該分野において知られている関連法
にしたがって、

【化１８】 を

【化１９】 と反応させることにより調製できる。

【００１８】本発明にしたがって、式［Ｂ］の化合物ま
たはその塩またはその保護された形態またはその類似体
を、ヒドロキシル化活性を有する酵素、特にクラバミン
酸シンターゼ活性を有する酵素と接触させることにより
Ｃを製造する方法も提供される。好ましくは、酵素系
は、微生物、特にストレプトミセス属由来のものであ
る。別法として、酵素は組換え体源から産生できる。好
ましくは、酵素はＥＰ−Ａ−２１３９１４に記載される
クラバミン酸シンターゼ（ＣＡＳ）である。本発明は、
通常のクラブラン酸産生株のストレプトミセス・クラブ
リゲルスから調製されるＣＡＳ、ならびにＥＰ３４９１
２１の方法に従って得ることができる、例えば、ＣＡＳ
遺伝子を発現ベクター、特にベクターｐＢＲＯＣ４１３
［ｐＴ７.７（テイバー・エスおよびリチャードソン・
シー・シー（Tabor,S.＆Richardson,C.C.)、（１９８
５）プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンシズ（Proc.Natl.Acad.Sci.）ＵＳ
Ａ，８２，１０７４−１０７８）の非伝達性誘導体］内
にクローンしたイー・コリから得られる「組換え」ＣＡ
Ｓの両方のクラバミン酸シンターゼに関する。

【００１９】本発明にしたがって、また、式ＩＩＩ：

【化２０】 ［式中、ＲはＨまたはＯＨ、およびＲ^１は

【化２１】 （式中、Ｒ^２＝ＨまたはＣ_１−６アルキルを意味する）
で示される基を意味する］で示される化合物が得られ
る。

【００２０】好ましい態様において、Ｎ^２−（２−カル
ボキシエチル）−（Ｓ）−アルギニンである化合物
（Ａ）：

【化２２】 またはその誘導体、例えば活性化エステルが提供され
る。

【００２１】化合物Ａは新規であり、本発明の別の態様
である。化合物Ａは以下の反応スキームにしたがって調
製できる。

【化２３】

【００２２】本発明のさらに別の態様において、Ａまた
はその活性化誘導体、好ましくはエステルまたはＣｏＡ
チオエステルをストレプトミセス由来の酵素系、例えば
全細胞または遊離酵素系と接触させることにより、Ｂを
調製する方法が提供される。

【００２３】好ましい態様において、Ｎ^２−（２−カル
ボキシエチル）−３−ヒドロキシ−（Ｓ）−アルギニン
である化合物（Ｇ）：

【化２４】 またはその誘導体、たとえば活性化エステルが提供され
る。

【００２４】化合物Ｇは新規であり、本発明の別の態様
である。化合物Ｇは以下の反応スキームにしたがって調
製できる。

【化２５】 Ｒ^３、Ｒ^４は保護基であり、Ｒ^５＝保護基またはＨであ
る。

【化２６】 Ｒ^６、Ｒ^７、Ｒ^８は保護基であり、Ｒ^９＝保護基または
Ｈである。

【００２５】Ｘ型の化合物の調製は、ケイ・エイチ・バ
ガレイ、エス・ダブリュー・エルソン、エヌ・エイチ・
ニコルソンおよびジェイ・ティー・サイム（K.H.Baggal
ey，S.W.Elson,N.H.NicholsonおよびJ.T.Sime），ジャ
ーナル・オブ・ケミカル・ソサイエティー（J.Chem.So
c.Perkin Trans Ｉ）１９９０,１５２１に記載されてい
る。

【００２６】本発明のさらに別の態様において、ＤをＣ
ＡＳと共に培養することからなるプロクラバミン酸
（Ｆ）の製法が提供される。

【化２７】 Ｄは（２Ｓ）−５−アミノ−２−（２−オキソ−アゼチ
ジン−１−イル）ペンタン酸である［ジャーナル・オブ
・ケミカル・ソサイエティー（J.Chem.Soc.,Perkin Tra
ns.Ｉ）１９９０,１５２１］。

【００２７】本発明のさらに別の態様において、ＤをＣ
ＡＳと共に培養することからなる（Ｅ）の製法が提供さ
れる。

【化２８】 Ｅは（２Ｓ）−（５−アミノ−２−（２−オキソ−アゼ
チジン−１−イル）ペント−２−エン酸であり、これは
本発明の別の態様である。

【００２８】Ａ、Ｂ、ＣおよびＧまたはその保護された
形態およびその塩の有用性は、以下に記載するようなク
ラブラン酸の調製法における中間体として作用する能力
に存する。好ましい態様において、本発明はまた、スト
レプトミセス属、好ましくは、エス・クラブリゲルス由
来の酵素系を用い、Ｓ−アルギニン、Ａ、Ｂ、Ｃまたは
Ｇのいずれかからのクラブラン酸および他のクラバム誘
導体の製法を提供する。

【００２９】さらに別の態様において、本発明は、式
（ＩＩ）の化合物、好ましくは、前記した化合物Ｂなら
びにアルファアミノ酸またはそのＮ−アシル誘導体（こ
こに、アルファアミノ酸基質は側鎖に塩基性基を有す
る）のベータ−ヒドロキシル化法であって、ヒドロキシ
ル化反応が、基質をＣＡＳと共に培養することにより行
われることを特徴とする方法を提供する。適当には、反
応を、必要な補助因子Ｆe ^２＋および酸素および補助基
質α−ケトグルタレートと共に実施する。適当な塩基性
基は、アミノ、グアニジノおよびアミジノを包含する。

【００３０】個々の基質は、Ｎ^２−アシルアルギニン誘
導体、例えば、Ｎ^２−アセチルアルギニンおよびＮ^２−
アシルオルニチン誘導体、例えば、Ｎ^２−アセチルオル
ニチンを包含する。本発明の化合物は、双性イオン形態
または塩形態、例えばナトリウム塩などの金属塩、酸付
加塩、アンモニウム塩または置換アンモニウム塩、例え
ば第三アミン塩の形態であってもよい。

【００３１】酸付加塩は、末端アミノ基で形成され、例
えば塩酸、臭化水素酸、オルトリン酸または硫酸などの
無機酸、あるいは例えばメタンスルホン酸、トルエンス
ルホン酸、酢酸、プロピオン酸、乳酸、クエン酸、フマ
ル酸、リンゴ酸、コハク酸、サリチル酸またはアセチル
サリチル酸などの有機酸との塩であってもよい。金属塩
は、カルボキシル基で形成され、例えば、アルミニウム
塩およびアルカリ金属塩およびアルカリ土類金属塩、例
えばリチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウムおよ
びマグネシウム塩であってもよい。

【００３２】置換アンモニウム塩は、例えば、トリエチ
ルアミンなどのＣ_１−６アルキルアミン、２−ヒドロキ
シエチルアミン、ビス−（２−ヒドロキシエチル）アミ
ンまたはトリ（２−ヒドロキシエチル）アミンなどのヒ
ドロキシ（Ｃ_１−６）アルキルアミン、ビシクロヘキシ
ルアミンなどのシクロアルキルアミン、または、プロカ
インとの塩、ジベンジルピペリジン、Ｎ−ベンジル−β
−フェネチルアミン、デヒドロアビエチルアミン、Ｎ,
Ｎ'−ビスデヒドロアビエチルアミン、グルカミン、Ｎ
−メチルグルカミンまたは例えばピリジン、コリジンま
たはキノリンなどのピリジンタイプの塩基との塩であっ
てもよい。

【００３３】本発明の化合物は、１またはそれ以上の存
在する官能基が保護された形態である化合物にも及ぶ。
従って、適当な場合には、カルボキシ基を保護するか、
グアニジノ、ヒドロキシまたはアミノ基を保護するか、
またはカルボキシおよびグアニジノ、ヒドロキシまたは
アミノ基の両方を保護してもよい。本明細書に記載する
化合物のこのような保護された形態はすべて「保護され
た形態」という語に包含される。加えて、本明細書に記
載の化合物に適用した場合、「保護された形態」なる語
は、「マスクした」中間体も包含し、該中間体は、ある
官能基を他のものに変換できることが公知の化学的プロ
セス（ここに、分子の残りの部分は、実質的に影響を受
けないままである）により最終化合物に変換できる。例
えば、好ましいマスクされた形態のアミンは、還元によ
り所望のアミンに変換できる対応するアジドおよびシア
ノ類似体を包含する。（対応するシアノ化合物は、側鎖
に１個少ない炭素原子を有し、シアノ基の炭素原子を除
外したものである。）

【００３４】適当なエステル形成カルボキシル保護基
は、所望により置換されていてもよいＣ_１−６アルキ
ル、Ｃ_２−６アルケニル、Ｃ_２−６アルキニル、Ｃ
_３−７シクロアルキル、アリール、アリールＣ_１−６ア
ルキルおよびトリＣ_１−６アルキルシリル基を包含す
る。

【００３５】本明細書において用いる場合、「アリー
ル」なる語は、フェニルおよびナフチルを含み、各々、
所望により５個までのフッ素、塩素、Ｃ_１−６アルキ
ル、Ｃ_{１ −６}アルコキシ、ハロ（Ｃ_１−６）アルキル、
ヒドロキシ、アミノ、カルボキシ、Ｃ_１−６アルコキシ
カルボニル、アリールオキシカルボニル、Ｃ_１−６アル
コキシカルボニル（Ｃ_１−６）アルキル、ニトロ、アリ
ールオキシカルボニルオキシ、アリールＣ_１−６アルキ
ルオキシカルボニルオキシ、Ｃ_１−６アルキルオキシカ
ルボニルオキシ、Ｃ_１−６アルキルカルボニルオキシ、
アリールカルボニルオキシ、アリールＣ_１−６アルキル
カルボニルオキシまたはアリールＣ_１−６アルキルオキ
シカルボニル基で置換されていてもよい。

【００３６】「ハロゲン」なる語は、フッ素、塩素、臭
素およびヨウ素を意味する。ハロおよびハライドなる語
も、それに応じて解釈されるべきである。本明細書にお
いて記載する所望により置換されていてもよい保護基の
任意の置換基の例は、ハロゲン、ヒドロキシ、Ｃ_１−６
アルコキシ、Ｃ_１−６アルキルチオ、シアノ、ニトロ、
カルボキシ、カルボン酸、Ｃ_１−６アルキルエステル、
カルバモイル、アミノ、モノ（Ｃ_１−６）アルキルアミ
ノおよびジ（Ｃ_１−６）アルキルアミノから選択される
３個までの基（同一または異なっていてもよい）を包含
する。

【００３７】特に適当なエステル形成カルボキシル保護
基は、通常の条件下で除去できるものである。このよう
な基は、メチルおよびエチルなどのＣ_１−６アルキル、
ベンジル、ｐ−メトキシベンジル、ベンゾイルメチル、
ｐ−ニトロベンジル、４−ピリジルメチル、２,２,２−
トリクロロエチル、２,２,２−トリブロモエチル、ｔ−
ブチル、ｔ−アミル、アリル、ジフェニルメチル、トリ
フェニルメチル、アダマンチル、２−ベンジルオキシフ
ェニル、４−メチルチオフェニル、テトラヒドロフル−
２−イル、テトラヒドロピラン−２−イル、ペンタクロ
ロフェニル、アセトニル、ｐ−トルエンスルホニルエチ
ル、メトキシメチル、またはシリル、スズまたはリン含
有基を包含する。

【００３８】カルボキシル基は、特定のエステル基に適
切な通常の方法により、前記エステルのいずれから再生
してもよい。例えば、分子の残りの部分が実質的に影響
を受けない条件下での酸および塩基触媒加水分解、また
は酵素触媒加水分解、または水添分解による。本発明の
化合物またはその塩またはアミノ保護誘導体における好
ましいカルボキシル保護基はベンジルである。

【００３９】アミノ基に関して適当な保護基は、容易に
開裂するものである。アミノ基を保護する方法および得
られた保護誘導体の開裂法の考察は、例えば、「有機合
成における保護基」（”Protective Groups in Organic
Synthesis”）（ティー・ダブリュ・グリーンおよびピ
ー・ジー・エム・ワッツ（T.W.Greene and PGM Wuts）
（ウィリー−インターサイエンス（Wiley-Interscienc
e），ニューヨーク，１９９１）に記載されている。

【００４０】アミノ保護基の適当な例は、前記したマス
キング基；所望により置換されていてもよいＣ_１−６ア
ルキルカルボニル；アリールカルボニル、アリールＣ
_１−６アルキルカルボニル；（ヘテロサイクリル）カル
ボニル（ここに、ヘテロサイクリル基は、酸素、窒素お
よび硫黄から選択される４個までのヘテロ原子を含む５
または６員芳香族環である）；またはフェニル環がＣ
_１−４アルキル、Ｃ_１−４アルコキシ、トリフルオロメ
チル、ハロゲンまたはニトロから選択される１または２
個の置換基で所望により置換されていていてもよいベン
ジルオキシカルボニルなどのカルバメートを与える基；
Ｃ_１−４アルキルオキシカルボニル、例えば、ｔｅｒｔ
−ブトキシカルボニル；またはＣ_１−４アルコキシ、ハ
ロまたはニトロから選択される３個までの置換基でアル
キル基が所望により置換されていていてもよいＣ_１−４
アルキルオキシカルボニル、例えば、２,２,２−トリク
ロロエトキシカルボニルまたは１−クロロエトキシカル
ボニルがある。

【００４１】本発明の化合物中に存在するアミノ基の好
ましいＮ−保護基の例は、後記するようなペプチド化学
のアミノ保護に関して通常公知のものを包含する。本発
明の化合物またはその塩またはそのカルボキシ保護誘導
体における特に好ましいアミノ保護基はベンジルオキシ
カルボニルである。適当なグアニジノおよびアミジノ保
護基は、ニトロ、ベンジルオキシカルボニル、アダマン
チルオキシカルボニル、トルエンスルホニル、および
２,２,５,７,８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニ
ルを包含する。

【００４２】望ましくは、化合物は核酸物質を含まない
単離された形態である。化合物は、適当には、例えば実
質的に純粋であり、より適当には、少なくとも７５％の
純度、好ましくは少なくとも８５％の純度、例えば９０
〜１００％の純度であるのが好ましい。好ましい単離形
態の一例としては、固体形態であり、より好ましくは結
晶形態である。しかし、純粋でない形態の化合物を使用
してはいけないわけではない。

【００４３】本発明の化合物を有機溶媒から結晶化また
は再結晶させる場合、結晶化溶媒が結晶生成物中に存在
する場合がある。本発明は、このような溶媒和物も包含
する。同様に、本発明の化合物は水を含有する溶媒から
結晶化または再結晶してもよい。このような場合、水和
水が形成される。本発明は、化学量論的水和物ならびに
凍結乾燥などのプロセスにより生じる種々の量の水を含
有する化合物も包含する。

【００４４】本発明に含まれる化合物またはその塩また
はその保護形態は以下のものを包含する： （Ａ）Ｎ^２−（２−カルボキシエチル）−Ｓ−アルギニ
ン （Ｂ）（２Ｓ）−５−グアニジノ−２−（２−オキソ−
アゼチジン−１−イル）ペンタン酸 （Ｃ）トレオ−３−ヒドロキシ−５−グアニジノ−２−
（２−オキソ−アゼチジン−１−イル）ペンタン酸、好
ましくは２Ｓ−３Ｒ （Ｅ）（２Ｓ）−５−アミノ−２−（２−オキソ−アゼ
チジン−１−イル）ペント−２−エン酸 （Ｇ）Ｎ^２−（２−カルボキシエチル）−３−ヒドロキ
シ−アルギニン

【００４５】本明細書において用いる「酵素系」なる語
は、１個の酵素または１連の酵素を意味する。系は、適
当ならば補助基質および補助因子を含むのが適当であ
る。不整炭素原子を有する化合物は、立体異性体として
存在する。本発明は、本発明の化合物のすべての立体異
性体を包含し、他の異性体を含まないかまたは他の異性
体と任意の割合で混合されたもののいずれであっても、
その使用を包含し、従って、例えばエナンチオマーのラ
セミ混合物を包含する。本発明の化合物またはその塩の
溶媒和物、特に水和物も本発明の範囲に含まれる。

【００４６】本発明の方法は、適当には、例えば、無細
胞系、即ち、生きた細胞の非存在下で行うのが適当であ
る。好ましくは、採用される酵素系は、微生物、特にス
トレプトミセス属由来のものである。別法として、酵素
は遺伝子工学により製造してもよい。無細胞系を採用し
た場合、無細胞抽出物は好ましくは、超音波処理または
他の微生物の破壊により製造され、所望によりその後細
胞片を除去し、溶液中に酵素系を残してもよい。

【００４７】プロクラバミン酸（Ｆ）またはその塩を産
生する酵素系は、例えばアミジノヒドロラーゼ酵素を含
むのが適当である。酵素は、本明細書に記載した実施例
にしたがって調製するのが適当である。

【００４８】基質に加えて、酵素反応混合物は、１また
はそれ以上の他の補助因子を含有してもよい。通常、こ
れらの補助因子は、別のマンガンイオン（Ｍn^２＋）源
を含む。好ましい酵素源は、ストレプトミセス属、例え
ば、エス・クラブリゲルス（S.clavuligerus）、エス・
ジュモンジネンシス（S.jumonjinensis）、エス・カツ
スラハマヌス（S.katusurahamanus）およびエス・リプ
マニイ（S.lipmanii）由来の株である。特に、以下の微
生物の株が有用である：エス・クラブリゲルス ＡＴＣ
Ｃ２７０６４、エス・ジュモンジネンシス ＡＴＣＣ２
９８６４、エス・カツラハマヌス Ｔ−２７２およびエ
ス・リプマニイＮＲＲＬ３５８４。

【００４９】好ましい酵素は、エス・クラブリゲルスＡ
ＴＣＣ２７０６４由来のものである。酵素は、通常の方
法、特に適当な液体または半固体培地中、好気性条件下
で微生物を培養することにより調製される。一般に、微
生物が同化できる炭素および窒素源および微生物の成長
に必須の無機塩栄養素が培養培地中に含まれる。培地
は、金属イオン、例えば鉄イオン源を含む。培養条件
は、１０℃〜８０℃の温度、３〜１０の範囲のpＨであ
る。好ましい条件は、２０℃〜３０℃、pＨ５〜９、適当
には例えば、約pＨ７で０.５〜５日間である。

【００５０】酵素は、破壊細胞調製物からの濾液または
粗細胞ホモジネートなどの不純な状態で得られた場合、
精製された形態、部分的に精製された形態で単離され、
用いられる。最適には、酵素は、例えば少なくとも部分
的に精製され、前駆体の分解を触媒する他の酵素、酵
素、またはクラバム核を除去したものである。酵素は、
不溶性ポリマー支持体に付着していてもよい。

【００５１】本発明のプロセスは、一般に水性培地中で
行われ、反応混合物はpＨ４〜９の範囲に維持されるの
が適当であり、より適当には、例えば６.５〜９.０、好
ましくは約pＨ８.５に維持する。pＨは例えば緩衝液、
例えば、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸緩
衝液（pＨ７）を用いて調節するのが適当である。ま
た、pＨは適当な酸または塩基を添加することにより調
節してもよい。反応温度は、用いた酵素に適したもので
あり、一般に１５℃〜６０℃、好ましくは約３０℃であ
る。反応時間は反応物の濃度などの因子および補助因
子、温度およびpＨに依存する。

【００５２】化合物またはその塩は、例えば、酵素と混
合する前に緩衝液中に溶解するのが適当である。前駆体
溶液の濃度は、前駆体の溶解度に依存し、一般に前駆体
溶液の濃度は、５％ｗ／ｖ〜０.００１％ｗ／ｖの範囲
である。反応終了後、酵素を反応混合物から分離し、化
合物またはその塩を通常の方法により単離する。化合物
またはその塩の初期精製はクロマトグラフィー工程を含
むのが好都合である。存在するカルボキシルおよび／ま
たはアミノ基が保護された形態で化合物を単離し、所望
により、保護基を続いて除去して、純粋な形態の化合物
を得る。

【００５３】無細胞系を採用する代わりに、本発明のプ
ロセスは、完全な微生物を用いて行う。前駆体化合物ま
たはその塩を次に微生物と接触させ、化合物またはその
塩を得る。微生物は、増殖培養物、静止培養物、洗浄菌
糸体、固定化細胞またはプロトプラストの形態であって
もよい。本発明の化合物は、酵素合成、例えば無細胞合
成またはストレプトミセス属の適当な株、例えば、エス
・クラブリゲルス、エス・ジュモンジネンシス、エス・
カツラハマヌスまたはエス・リプマニイからの単離によ
り調製してもよい。適当には、化合物の単離は、菌糸体
の破壊、細胞内容物からの化合物の単離が含まれる。典
型的には、化合物の精製された形態での単離は、クロマ
トグラフィー工程を含む。別法として、化合物は不純な
形態または部分的に純粋な形態で用いてもよい。

【００５４】化合物の塩は、出発物質の塩を用いるか、
または調製した遊離化合物を続いて塩に変換する前記方
法により調製してもよい。また、所望により、調製した
化合物の塩を遊離の塩形態にしていない化合物または化
合物の他の塩の形態に変換もよい。化合物の塩は、例え
ば、化合物を適当な酸または塩基で処理することにより
製造される。前記プロセスにより製造された化合物およ
びその塩は、通常の方法により回収される。

【００５５】２個のキラル中心を有する化合物を、所望
により、例えば適当な溶媒、例えばメタノールまたは酢
酸エチルまたはその混合物からの分別結晶化によりエナ
ンチオマーのジアステレオアイソマー対に分離する。１
対のエナンチオマーまたは他のエナンチオマー対を通常
の手段、例えば、光学活性な塩を分割剤として用いるか
または、例えばサブチリシンなどの適当な酵素を用いた
保護基の立体選択的除去により個々の立体異性体に分離
してもよい。化合物のジアステレオアイソマーの混合物
において、ジアステレオアイソマーの割合は、非求核塩
基、例えば、１,５−ジアザビシクロ［４.３.０］ノン
−５−エンでの処理により変わる。

【００５６】分割剤として用いられる適当な光学活性な
化合物は「トピックス・イン・ステレオケミストリー」
（’Topics in Stereochemistry’，Ｖol.６，ウィリー
−インターサイエンス（Wiley Interscience），１９７
１，アリンジャー・エヌ・エルおよびエリエール・ダブ
リュ・エル（Allinger,N.L.およびEliel,W.L.）編）に
記載されている。また、化合物のいずれのエナンチオマ
ーも立体配置が既知の光学的に純粋な出発物質を用いた
立体特異的合成により得られる。

【００５７】本発明は、またクラブラン酸の合成におい
て用いる化合物またはその塩も含む。本発明のさらに別
の態様において、クラブラン酸またはその塩の調製法が
提供され、該方法は、本発明の化合物またはその塩を酵
素系で処理することからなる。本発明により、このよう
な方法により調製されたクラブラン酸またはその塩も提
供される。好ましくは、採用した酵素系は、微生物、特
にストレプトミセス属由来のものである。適当には、プ
ロセスを無細胞系で行う。適当には、クラブラン酸の無
細胞合成法は、化合物またはその塩をストレプトミセス
属の抽出物で処理することからなる。

【００５８】ストレプトミセス属がクラブラン酸産生種
であるのが適当である。ストレプトミセス属からの抽出
物は、酵素系を含む。無細胞抽出物は、好ましくは、ス
トレプトミセス細胞の超音波処理または他の破壊により
得られ、所望によりその後、細胞片を除去し、溶液また
は懸濁液中に酵素系を残してもよい。酵素系は、いずれ
かの源由来のものである。例えば、酵素は、遺伝子工学
により産生されるのが適当である。好ましい酵素系は、
ストレプトミセスのクラブラン酸産生種、例えば、エス
・クラブリゲヌス、エス.ジュモンジネンシスおよびエ
ス・カツラハマヌスのクラブラン酸産生種またはこれに
由来の株、例えば突然変異株由来のものである。特に、
これらの微生物の以下の株が適当である：エス・クラブ
リゲルスＡＴＣＣ２７０６４、エス.ジュモンジネンシ
スＡＴＣＣ２９８６４およびエス・カツラハマヌスＴ−
２７２。

【００５９】無細胞系を用いる代わりに、前記プロセス
は、完全な微生物を用いて行ってもよい。前駆体化合物
またはその塩を次に微生物と接触させ、クラブラン酸ま
たはその塩を得る。微生物は、増殖培養物、静止培養
物、洗浄菌糸体、固定化細胞またはプロトプラストの形
態であってもよい。酵素系は、微生物を通常の方法、特
に適当な液体または半固体培地中で好気性条件下で培養
することにより調製する。一般に、微生物が同化できる
炭素および窒素源および微生物の成長を促進するために
用いられる無機塩栄養素が培養培地中に含まれる。培養
条件は、１０℃〜８０℃の温度、３〜１０の範囲のpＨ
である。好ましい条件は、２０℃〜３０℃、pＨ５〜
９、適当には例えば、約pＨ７で０.５〜５日間である。
酵素系を単離し、破壊細胞調製物からの濾液または粗細
胞ホモジネートとして不純な状態で得られた場合、精製
された形態、部分的に精製された形態で用いる。

【００６０】最適には、酵素系は、少なくとも部分的に
精製され、前駆体、酵素または反応生成物の分解を触媒
する他の酵素を除去したものである。酵素を不溶性支持
体に付着させてもよい。プロセスは、一般に水性培地中
で行われ、反応混合物はpＨ４〜９の範囲に維持される
のが適当であり、より適当には、例えば６.５〜８.５に
維持する。pＨは、適当には、当該分野にて知られてい
る通常の緩衝液を用いて調節される。一例として、例え
ば、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸緩衝液
（pＨ７）を用いる。反応温度は、用いた酵素に適した
ものであり、一般に１５℃〜４０℃、好ましくは約３０
℃である。反応時間は反応物の濃度、温度およびpＨな
どの因子および補助因子に依存する。

【００６１】化合物またはその塩は、例えば、酵素系と
混合する前に緩衝液中に溶解するのが適当である。濃度
は、化合物またはその塩の溶解度に依存する。適当に
は、化合物またはその塩の溶液の濃度は、５％ｗ／ｖ〜
０.００１％ｗ／ｖの範囲である。反応終了後、酵素を
反応混合物から分離し、クラブラン酸またはその塩を通
常の方法により単離する。クラブラン酸またはその塩の
初期精製はクロマトグラフィー工程を含むのが好都合で
ある。本発明の他の具体例において、化合物またはその
塩を前記の酵素系で処理することによりクラブラン酸ま
たはその塩に変換する方法が提供される。反応は、化合
物またはその塩の中間体を単離せずに、無細胞合成によ
り行うのが適当である。あるいは、化合物のクラブラン
酸への変換は、直接完全な微生物を用いて行う。以下の
実施例は、本発明を例示するものである。すべてのパー
センテージは、重量基準であり、すべての割合は、容積
基準である。

【００６２】

【実施例】実施例−新規化合物の調製 化合物Ａ Ｎ^２−（２−カルボキシエチル）アルギニン二塩酸塩 調製例１ ５−グアニジノ−２−（２−オキソアゼチジン−１−イ
ル）ペンタン酸（４６ｍｇ、０.１８ミリモル）を１Ｍ
ＨＣｌ（５ｍｌ）に溶解し、室温で１時間撹拌する。反
応混合物を蒸発乾固させ、水と共沸し、乾燥して、潮解
性白色固体のＮ ^２−（２−カルボキシエチル）アルギニ
ン二塩酸塩を得る。 （Ｃ_９Ｈ_１８Ｎ_４Ｏ_４・２ＨＣl・Ｈ_２Ｏとして、測定
値：Ｃ＝３１.６９；Ｈ＝６.５７；Ｎ＝１７.０８;計算
値：Ｃ＝３２.０５、Ｈ＝６.５８、Ｎ＝１６.６２％）;
ｍ／ｅ（ＦＡＢ、グリセロール）ＭＨ＋ ２４７（Ｃ_９
Ｈ_１８Ｎ_４Ｏ_４として）計算値２４７；νmax（ＫＢr）
３４１０、２９２５、１７２５および１６６１ｃ
ｍ^−１；δH（２５０ＭＨｚ、Ｄ_２Ｏ）１.５５〜1.８３
（２Ｈ,ｍ）、１.８５〜２.１５（２Ｈ,ｍ）（３−Ｈ,
４−Ｈ）、２.８５（２Ｈ,ｔ,Ｊ＝６.５Ｈｚ,２'−
Ｈ）、３.２３（２Ｈ,ｔ,Ｊ＝６.８Ｈｚ）、３.３４
（２Ｈ,ｔ,Ｊ＝６.５Ｈｚ）（５−Ｈ,１'−Ｈ）、３.９
３（１Ｈ,ｔ,Ｊ＝６.３Ｈｚ,２−Ｈ）

【００６３】調製例２ ａ）Ｎ^２−（２−カルボメトキシエチル）−Ｎ^ω−ニト
ロ−Ｓ−アルギニンベンジルエステルの調製 Ｎ^ω−ニトロ−Ｓ−アルギニンベンジルエステルジトシ
レート（６.５６ｇ、０.０１モル）（エイチ・オーツカ
（H.Otsaka）ら、ビュレティン・オブ・ケミカル・ソサ
イエティ・ジャパン（Bull.Chem.Soc.Jap.）３９,８８
２,１９６６と同様にして調製）、トリエチルアミン
（１３.９ｍｌ、０.１モル）およびアクリル酸メチル
（９ｇ、０.１０５モル）のエタノール（１００ｍｌ）
中混合物を室温で４日間撹拌する。溶媒を真空下に除去
し、残渣をクロロホルム中に溶解し、水で洗浄する。ク
ロロホルム溶液を乾燥し（ＭgＳＯ_４）、濾過し、蒸発
させてガム状物質を得る（８.９ｇ）。この物質を、５
％ＭeＯＨ／ＣＨＣl_３を溶離剤として用いてシリカゲル
上クロマトグラフィーに付し、再び５〜１０％ｎ−Ｐr
ＯＨ／ＣＨＣl_３で溶出して、標記化合物を得る（２.２
４ｇ、６０％）。νmax（ＫＢr）３３１０、１７３８、
１６３０、１６００および１２６５ｃｍ^−１；δH（２
５０ＭＨｚ、ＣＤＣl_３）１.３〜１.９（５Ｈ,ｍ）、
２.３（２Ｈ,ｍ）、２.７〜２.８５（１Ｈ,ｍ）、２.８
５〜３.０（１Ｈ,ｍ）、３.２〜３.４（３Ｈ,ｍ）、３.
６９（３Ｈ,ｓ）、５.１７（２Ｈ,ｓ）、７.３６（５
Ｈ,ｍ）、７.６（２Ｈ,ｓ)、８.７５（１Ｈ,ｓ）；ｍ／
ｚ（ＮＨ_３ Ｃ.Ｉ.）（測定値ＭＨ^＋３９６ Ｃ_１７Ｈ
_２５Ｎ_５Ｏ_６としての計算値３９６）

【００６４】ｂ）Ｎ^２−（２−カルボキシエチル）−Ｓ
−アルギニン（化合物Ａ）の調製 前記メチルベンジルエステル（前記（ａ）において調
製）（２.２ｇ、５.５６ミリモル）、水酸化ナトリウム
（０.４５ｇ、１１ミリモル）のＴＨＦ／Ｈ_２Ｏ（１：
１（２０ｍｌ））中溶液を室温で４時間撹拌する。溶液
のｐＨを希ＨＣlで６にし、溶媒を蒸発させ、その残渣
をＨ_２Ｏ／ＭeＯＨ／ＡcＯＨ（２５ｍｌ：２５ｍｌ；５
ｍｌ）中に溶解し、１０％Ｐd／Ｃ（５００ｍｇ）上で
水素添加する。触媒を濾過により除去し、溶液を蒸発乾
固し、残渣を水中に溶解し、凍結乾燥する。メタノール
を残渣に添加して、白色固体の標記化合物Ａを得る（６
２６.４ｍｇ、４５％）。融点２６０℃分解。 （Ｃ_９Ｈ_１８Ｎ_４Ｏ_４・１／２Ｈ_２Ｏとして、測定値：
Ｃ＝４２.３３、Ｈ＝７.３５、Ｎ＝２０.６；計算値：
Ｃ＝４２.３５、Ｈ＝７.５、Ｎ＝２１.９５％；νmax
（ＫＢr）２９３９、１６２４、１４０１ｃｍ−^１；δH
（２５０ＭＨｚ、Ｄ _２Ｏ）１.３〜１.７５（２Ｈ,
ｍ）、１.８〜２.２（２Ｈ,ｍ）、２.５４（２Ｈ,ｔ,Ｊ
＝６.５Ｈｚ）、３.１３〜３.２８（４Ｈ,ｍ）、３.６
３（１Ｈ,ｔ,Ｊ＝６.１Ｈｚ）；ｍ／ｚ（ＦＡＢ、チオ
グリセロール）測定値：ＭＨ^＋２４７、Ｃ_９Ｈ_１８Ｎ_４
Ｏ_４としての計算値２４７。

【００６５】化合物Ｂ ５−グアニジノ−２−（２−オキソアゼチジン−２−イ
ル）ペンタン酸 ５−アミノ−２−（２−オキソアゼチジン−１−イル）
ペンタン酸（３１０ｍｇ、１.５９ミリモル）を水（３
０ｍｌ）中に溶解し、炭酸カリウム（２４０ｍｇ、１.
７４ミリモル）およびアミノイミノ−メタンスルホン酸
（２６９ｍｇ、２.１７ミリモル）で処理し、室温で６
時間撹拌する。反応混合物を蒸発乾固させ、水（４.５
ｍｌ）中に溶解し、これにエタノール（３０ｍｌ）を添
加し、溶液を素早く１５％水性エタノール中シリカ６０
のカラム上クロマトグラフィーに付し、５−グアニジノ
−２−（２−オキソアゼチジン−１−イル）ペンタン酸
（２２０ｍｇ、５４％）を得る。 （Ｃ_９Ｈ_１６Ｎ_４Ｏ_３・１.５Ｈ_２Ｏとして、測定値：
Ｃ＝４２.５６、Ｈ＝７.５２、Ｎ＝２２.１５；計算
値：Ｃ＝４２.３４、Ｈ＝７.５０、Ｎ＝２１.９５
％）；νmax（ＫＢr）３４２３、１７２０、１６５８、
１６３７ｃｍ^−１；δH（２５０ＭＨｚ、Ｄ_２Ｏ）１.４
５〜１.６３（２Ｈ,ｍ）、１.６３〜１.９４（２Ｈ,
ｍ）（３−Ｈおよび４−Ｈ）、２.８０〜３.００（２
Ｈ,ｍ,３'−Ｈ）、３.１７（２Ｈ,ｔ,Ｊ＝６.８Ｈｚ,５
−Ｈ）、３.２６〜３.４６（２Ｈ,ｍ,４'−Ｈ）、４.０
３（１Ｈ,ｄｄ,Ｊ＝５.１および９.５Ｈｚ,２−Ｈ）お
よび５−アミノ−２−（２−オキソアゼチジン−１−イ
ル）ペンタン酸（９０ｍｇ、２９％）を得る。

【００６６】化合物Ｃ ３−ヒドロキシ−５−グアニジノ−２−（２−オキソア
ゼチジン−１−イル）ペンタン酸 プロクラバミン酸（８４.５ｍｇ、０.４２ミリモル）
を、５−グアニジノ−２−（２−オキソアゼチジン−１
−イル）ペンタン酸（化合物Ｂ）に関して前記したよう
にアミノイミノメタンスルホン酸で処理して、白色固体
の３−ヒドロキシ−５−グアニジノ−２−（２−オキソ
アゼチジン−１−イル）ペンタン酸を得る（６２ｍｇ、
５３％）（Ｃ_９Ｈ_１６Ｎ_４Ｏ_４・２Ｈ_２Ｏとして、測定
値：Ｃ＝３８.７６、Ｈ＝６.８３、Ｎ＝１９.５４；計
算値：Ｃ＝３８.５７、Ｈ＝７.１９、Ｎ＝１９.９９
％）；ｍ／ｅ（ＦＡＢ、チオグリセロール）ＭＨ^＋２４
５、Ｃ _９Ｈ_１６Ｎ_４Ｏ_４としての計算値２４５；νmax
（ＫＢr）３３６３、１７１９、１６７３、１６００ｃ
ｍ^−１；δH（４００ＭＨｚ、Ｄ_２Ｏ）１.７３〜１.９３
（２Ｈ,ｍ,４−Ｈ)、３.０７（２Ｈ,ｔ,Ｊ＝４.０Ｈｚ,
３'−Ｈ）、３.４１（２Ｈ,ｔ,Ｊ＝６.５Ｈｚ,５−
Ｈ）、３.４２〜３.６０（１Ｈ,ｍ）、３.６０〜３.６
８（１Ｈ,ｍ)(４'−Ｈ）、４.１２（１Ｈ,ｄ,Ｊ＝５.４
Ｈｚ,２−Ｈ）、４.２２（１Ｈ,ｍ,３−Ｈ）。

【００６７】（２ＳＲ,３ＲＳ）−１,２,３'−［^１３Ｃ
_３］−［Ｎ^２−（２−カルボキシエチル）−３−ヒドロ
キシ−５−グアニジノ−ペンタン酸の調製 （^１３Ｃで標識したＧ）不純な（２ＳＲ,３ＲＳ）−１,
２,３'−［^１３Ｃ_３］−３−ヒドロキシ−５−グアニジ
ノ−（２−オキソ−アゼチジン−１−イル）−ペンタン
酸（２７０ｍｇ）を１Ｍ ＨＣl（５ｍｌ）中に溶解し、
室温で２時間静置する。溶液を蒸発させ、水（１.５ｍ
ｌ）中に溶解し、ダウエクス（Dowex）５０Ｗｘ８イオ
ン交換樹脂（Ｈ^＋型）のカラム（３ｘ１.５ｃｍ）に付
す。カラムを水（２０ｍｌ）で洗浄し、水酸化アンモニ
ウム（０.４Ｍ）で溶出し、５ｍｌフラクションを集め
る。サカグチ反応に陽性を示すフラクションを冷却し、
凍結乾燥して、吸湿性固体の標記化合物を得る（９９.
２ｍｇ）。^１３Ｃ_３Ｃ_６Ｈ_１８Ｎ_４Ｏ_５・１.５Ｈ_２Ｏ
として、測定値：Ｃ＝３６.８６、Ｈ＝６.０４、Ｎ＝１
９.８８％；計算値：Ｃ＝３７.３６、Ｈ＝７.３、Ｎ＝
１９.３７％；δH（４００ＭＨｚ、Ｄ_２Ｏ）１.５〜１.
９５（１Ｈ,ｍ）、１.９５〜２.１５（１Ｈ,ｍ）、２.
６５（２Ｈ,ｑ,Ｊ＝６.１Ｈz)、３.１〜３.２８
（ｍ）、３.３〜３.４（ｍ）および３.４〜３.５（４
Ｈ）、３.７２（１Ｈ,ｄｄ,Ｊ＝７.５および４.５Ｈ
ｚ）、４.０（１Ｈ,ｔ,Ｊ＝７.５Ｈz）；δC（１００Ｍ
Ｈｚ、Ｄ_２Ｏ）６８.２９（ｄ,Ｊ＝５２Ｈｚ,Ｃ−
２）、７２.５２（ｄ,Ｊ＝５２Ｈｚ,Ｃ−１）、１７９.
６４（ｓ,Ｃ−２'）

【００６８】実施例１ アミジノヒドロラーゼ酵素 １.１ アミジノヒドロラーゼ酵素の調製および反応 酵素の粗調製物を、エス・クラブリゲルスＡＴＣＣ２７
０６４菌糸体（ＥＰ−Ａ−０３４９１２１参照）からの
４８時間再単離物より、遠心分離および５０ｍＭトリス
緩衝液（pＨ７.０）中超音波処理に付して調製する。酵
素調製物による（Ｃ）から（Ｆ）の加水分解は、１当量
の尿素の産生と定量的である。酵素調製物を５０ｍＭト
リス、５０μＭ ＭnＣl_２、２５０μｇ／ｍｌ化合物Ｂ
またはＣおよび５ｍＭアセトヒドロキサミン酸と一緒に
培養する。アセトヒドロキサミン酸を加え、抽出物内の
ウレアーゼ活性を阻害する。混合物をpＨ８.５、２８℃
で１５分以上培養する。

【００６９】反応を停止させ、産生された尿素を「シグ
マ（Sigma）」キット５３５Ｂを用いて測定する。２種
の化合物ＣおよびＢを個々に酵素調製物と共に培養し
（２８℃）、あるならばその喪失をｈｐｌｃによりモニ
ターする。誘導体ＣおよびＢを加水分解してそれぞれＦ
およびＤにし、反応は酵素により媒介される。Ｃの加水
分解の速度は、ｈｐｌｃおよび、プロクラバミン酸
（Ｆ）およびデヒドロキシプロクラバミン酸（Ｄ）の産
生で測定するとＢよりも著しく速い（＞１００）。Ｃか
らＦへの加水分解は、１当量の尿素の産生と定量的であ
る。Ｂの加水分解は完了しないが、尿素の産生は生成し
たＤの量と当量である。

【００７０】条件を最適化する実験から以下のものが明
らかになる： ａ） 前記定義の式Ｃの化合物またはその塩を前記定義
のプロクラバミン酸またはその塩に変換する能力； ｂ） 酵素活性は、Ｍｎ^２＋の存在下に向上し、最適の
Ｍｎ^２＋濃度は約５０μＭである； ｃ） 緩衝液のｐＨプロフィルは燐酸およびホウ酸に基
づく緩衝液がＴＲＩＳ、炭酸塩／炭酸水素塩またはグリ
シン緩衝液と比べた場合、酵素活性を阻害することを示
す ｄ） 緩衝液の塩基性がｐＨ９.０に向かって強くなる
ほど酵素活性は強くなると思われる。しかし、種々の緩
衝液のｐＨでの化合物の安定性の研究により、化合物
は、ｐＨ９.０以上で不安定になることがわかる。Ｃの
プロクラバミン酸への酵素の最大変換率は、５０ｍＭ
ＴＲＩＳ中ｐＨ８.５で起きる。 ｅ） 有機溶媒（例えば、メタノール、アセトニトリ
ル）を添加して、酵素反応を停止することは、尿素また
はｈｐｌｃ分析のいずれかと干渉する。したがって、サ
ンプルをアセトン／ドライアイス（−７０℃）浴中に入
れることにより反応を停止し、ただちに検定の直前まで
−２０℃の冷凍庫に移す。この酵素は、アルギニンを開
裂しない（検出できる割合で）が、（２Ｓ）−５−グア
ニジノ−２−（２−オキソ−アゼチジン−１−イル）ペ
ンタン酸を開裂することが判明した。アルギナーゼ活性
は、精製（以下の１．２）の間に、アミジノヒドロラー
ゼ活性から区別される。

【００７１】１．２ アミジノヒドロラーゼ精製 実験 エス・クラブリゲルス細胞を標準的炭水化物培地中で成
長させ、収穫し、以下の緩衝液中で超音波処理する：５
０ｍＭ Ｔris−酢酸（Ｔris−Ａc）、５０μＭＭnＣ
l_２、１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド（Ｐ
ＭＳＦ）、１ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）、pＨ
８.０。前記緩衝液に対して透析した後、超音波処理物
をイオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥ−セファロ
ース・ファースト・フロー（Sepharose Fast Flow）、
ファーマシア（Pharmacia））を用いて、０〜１Ｍ Ｎa
Ｃl勾配溶出で分別する。酵素尿素産生をシグマ尿素キ
ット５３５Ｂを用い、ウレアーゼ活性を阻害するのに５
ｍＭアセトヒドロキサミン酸を添加して評価する。各フ
ラクションを各基質としてＳ−アルギニンおよび化合物
Ｃで２回分析し、アルギナーゼおよびアミジノヒドロラ
ーゼ活性を測定する。両活性は、約０.５Ｍ ＮaＣl（カ
ラム頂上部）で溶出し、特異性活性は、各々、１.９倍
および２.４倍に増加する。この方法から得た活性フラ
クションを金属キレートアフィニティーカラムに付す前
に５０ｍＭ Ｔris−Ａc／０.５Ｍ ＮaＣl／pＨ８.０に
対して透析する。これをＣuＳＯ４７５％容量イミノ二
酢酸−アガロース（シグマ）を用いて調製し、前記緩衝
液中平衡化する。カラムを０〜２００ｍＭグリシン勾配
で溶出し、鋭いアミジノヒドロラーゼ活性のピークを得
る。このピークはアルギナーゼ活性も示すが、弱い。

【００７２】活性フラクションをプールし、リシン−ア
ガロースアフィニティーカラムにかける前にファーマシ
ア（Phaarmacia）ＰＤ１０カラム上で脱塩する。リシン
は、多くのアルギナーゼを阻害することが知られている
ので、有用なアフィニティーリガンドであることが予想
される。しかし、アミジノヒドロラーゼ活性は、カラム
処理により保持されない。（恐らく、カラムに強く結合
するため、アガロース活性はこのカラム処理後に失われ
る）。洗浄フラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析および
リス−アガロースカラムからの溶出液は洗浄フラクショ
ン中３３ｋＤで強いバンドを示す。これは、もっともよ
く知られているアルギナーゼである。しかし、アミジノ
ヒドロラーゼおよびアルギナーゼが同じ酵素であるかど
うかを決定するためには、さらに精製することが必要で
ある。

【００７３】これは、ＨＰＬＣゲル濾過（ＴＳＫ Ｇ３
０００ ＳＷ ＸＬカラム ５０ｍＭＴris−Ａc／５０μ
Ｍ ＭｎＣl_２ ｐＨ７.２、流速０.２ｍｌ／分）を用い
て達成される。リシン−アガロースカラムからの洗浄フ
ラクションを凍結乾燥し、カラムに注入する前に少量の
緩衝液中に再懸濁する。フラクションを集め、アミジノ
ヒドロラーゼおよびアルギナーゼ活性に関して分析す
る。アミジノヒドロラーゼ活性はすべて、１つのフラク
ション中に存在するが、アルギナーゼ活性はどのフラク
ションにおいても検出されず、６時間の反応後、アミジ
ノヒドロラーゼフラクションは依然として検出可能なア
ルギナーゼ活性を示さない。

【００７４】ゲル濾過カラムをタンパク標準を用いて使
用前に校正し、測定値をもとのアミジノヒドロラーゼの
Ｍrにする。これを３５０＋／−５０ｋＤで計算する。
これはＳＤＳ−ＰＡＧＥによるとサブユニットＭrより
約１０倍大きい。このことは、非変性タンパク質が複数
の状態で存在することを示す。フラクションのＳＤＳ−
ＰＡＧＥ分析から、アミジノヒドロラーゼを含有するフ
ラクションは３３ｋＤで強いバンドを有することがわか
る。

【００７５】活性サンプルからのウェスタンブロットを
標準的タンパク配列技術により配列決定する。得られた
配列は以下のとおりである： タンパク質配列：ＩＤＳＨＶＳＰＲＹＡＱＩＰＴＦＭ ｐＢＲＯＣ４４（ＥＰ−Ａ−０３４９１２１参照）の配
列決定から判明したオープンリーディングフレーム（Ｏ
ＲＦ）の予想されるアミノ配列を、前記で得られたＮ−
末端配列と比較すると、以下のとおりである： 遺伝子配列（予想されるアミノ酸配列）：ＭＥＲ／ＩＤ
ＳＨＶＳＰＲＹＡＱＩＰＴＦＭ 配列を並べると、完全に一致する（１６／１６）。最初
の３個のアミノ酸がもとのタンパク質の遺伝子配列に存
在しないことは、翻訳後修飾が行われたことを示す。

【００７６】実施例２ クラバミン酸シンターゼ ２．１ クラバミン酸シンターゼ精製 クラバミン酸シンターゼ（ＣＡＳ）をエス・クラブリゲ
ルスからＥＰ Ａ０２１３９１４に記載された方法を用
いて精製する。凍結乾燥した、部分的に精製した酵素
（２５０ｍｇ）をＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ（Ph
armacia，ウプサラ，スウェーデン）カラム（３０ｘ２.
４ｃｍ）に付し、１００ｍｌの５０ｍＭトリス緩衝液
（pＨ７.０）で洗浄し、５０から５００ｍＭの勾配のト
リス緩衝液（pＨ７.０）で溶出する。ＣＡＳ陽性フラク
ションをプールし、固体硫酸アンモニウムで８０％飽和
にする。懸濁液を氷上に１時間保持し、２４０００ｘｇ
で６０分間遠心分離する。沈殿を１ｍｌの５０ｍＭトリ
ス緩衝液（pＨ７.０）＋０.５ｍｌの３０％シュークロ
ース溶液（同じ緩衝液で構成）中に再懸濁し、セファデ
クスＧ７５スーパーファイン（Pharmacia）カラム（６
３.５ｘ３.５ｃｍ）に付し、５０ｍＭトリス緩衝液で溶
出する。ＣＡＳ陽性フラクションをプールし、固体硫酸
アンモニウムで８０％飽和にし、得られた沈殿を遠心分
離により除去し、−２０℃で貯蔵する。この段階でＣＡ
Ｓ酵素は、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド
ゲル電気泳動で調べた場合、分子量約４８０００ダルト
ンに相当する１つのバンドを生成する。等電点を等電点
分画電気泳動法により測定するとｐＩ＝５.６５であっ
た。精製した酵素を以下の分析法を用いてＢからＣへの
変換に関して分析する。

【００７７】２．２ クラバミン酸シンターゼヒドロキ
シル化分析 すべての試薬は、特記しないかぎり、５０ｍＭトリス、
１０ｍＭ ＭgＣl_２および１０ｍＭ ＫＣlからなり、５
Ｍ ＨＣlを添加してpＨ７.５にする。１００ｍｌについ
て、トリス（０.６０６ｇ）、ＭgＣl_２（０.２０３
ｇ）、ＫＣｌ（０.０７４ｇ）が必要である。可能なら
ば、酵素精製に用いたのと同じ緩衝液を用いる。以下の
溶液が必要である：Ｈ_２Ｏ中、補助因子ＦeＳＯ_４１０
ｍＭ（２.７８ｍｇ／ｍｌ）；Ｈ_２Ｏ中、Ｂ１００ｍＭ
（２０ｍｇ／ｍｌ）；ジチオトレイトール（ＤＴＴ）１
０ｍＭ（１.５ｍｇ／ｍｌ）および補助基質α−ケトグ
ルタレート５０ｍＭ（二ナトリウム塩９.５ｍｇ／ｍ
ｌ）。

【００７８】前記溶液の混合物を調製し、得られた溶液
の４０μｌを１.５ｍｌのエッペンドルフ管に移し、次
に６０μｌのタンパク抽出物で処理して反応を開始す
る。反応物を周囲温度で５分間酸素の存在下で振盪せず
に培養し、試験管の蓋を閉める。反応混合物を６０ｗ電
子オーブン中で１５秒間パワー４でのフラッシュ加熱に
より急冷する。１〜２ｍｇ／ｍｌ以上のタンパク質濃度
で沈殿が形成し、溶液が白濁する。サンプルをミクロ遠
心分離器中で１３０００ｒｐｍで１０秒間回転させ、サ
ンプルをドライアイス上で貯蔵する。２５マイクロリッ
トルアリコートを、ＯＤＳカラム（２５０ｘ４.６ｍ
ｍ、ミリＱ Ｈ２中１ｍｌ／分で平衡化、０.２ＡＵＦ
Ｓ、ラムダ＝２１８ｎｍ、１ｃｍ／分）上に注入する。
生成物Ｃは約４.５分、基質Ｂは約８分で溶出する。

【００７９】２．３ 化合物のＣＡＳおよび組換えＣＡ
Ｓとの培養 一般的方法 「ＣＡＳ」は通常のクラブラン酸産生株ストレプトミセ
ス・クラブリゲルスから調製されるクラバミン酸シンタ
ーゼを意味し、「組換えＣＡＳ」は例えばＥＰ３４９１
２１（ビーチャム・グループ・パブリック・リミテッド
・カンパニー（Beecham Group plc））にしたがって調
製されたクラバミン酸シンターゼを意味する。

【００８０】反応生成物の単離が必要な場合、ＣＡＳ
（または組換えＣＡＳ）を１０ｍＭ炭酸水素アンモニウ
ム緩衝液＋１０ｍＭ ＭgＣl_２、１０ｍＭ ＫＣlおよび
１ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）（ｐＨ７.５）中
ＰＤ−１０またはＮＡＰ−５ Ｇ−２５セファデクスゲ
ル濾過カラムのいずれかを用いて交換する。ＰＤ−１０
カラムの場合、２ｍｌ酵素溶液を緩衝液で平衡化したカ
ラムに付し、３.５ｍｌの緩衝液で溶出する。ＮＡＰ−
５カラムの場合、０.５ｍｌの酵素をカラムに付し、１
ｍｌの同じ緩衝液で溶出させる。

【００８１】酵素溶液（１.２ｍｌ）を１０ｍｌガラス
バイアル中２００μｌの１０ｍＭ硫酸鉄（ＩＩ）、２０
０μｌの１０ｍＭ ＤＴＴおよび２００μｌの５０ｍＭ
α−ケトグルタレート（１０ｍＭ ＮＨ_４ＨＣＯ_３、１
０ｍＭ ＭgＣl_２、１０ｍＭＫＣl、１ｍＭ ＤＴＴ（pＨ
７.５）で構成）と混合する。２００μｌの基質（特記
しないかぎり、１０ｍｇ／ｍｌ水溶液）を添加すること
により、反応を開始する。混合物を２７℃、２５０ｒｐ
ｍでニュー・ブランズウィック・サイエンティフィック
（New Brunswick Scientific）Ｇ２４環境インキュベー
ター振盪器中で培養する。２０分後、さらに５０μｌア
リコートのＤＴＴおよび硫酸鉄（ＩＩ）ストック溶液を
添加する。合計４５分後、５ｍｌのアセトンを添加する
ことにより反応を停止し、４℃で２５０００ｘｇで２分
間（１４０００ｒｐｍ）ベックマンＪＡ−２０遠心分離
ローターに付すことにより蛋白質を除去する。上清を次
に１０ｍｌ洋ナシ型フラスコ中に移し、アセトンをロー
タリーエバポレーターで真空下に除去する。培養混合物
を注意してドライアイス上に維持し、遠心分離後の操作
間で起こりえる不安定な生成物の分解を避ける。残存す
る水性液体を４〜５滴の１％（ｖ／ｖ）水中水性ギ酸で
約pＨ５.０に滴定し、少なくとも５時間凍結乾燥して水
および残存する微量のアセトンを除去する。ＨＰＬＣに
より生成物を単離する前に、粗混合物を５００ＭＨｚの
^１Ｈ ＮＭＲにより通常どおり分析する。以下の実験に
おいて、基質の変換の程度は、５００ＭＨｚの^１Ｈ Ｎ
ＭＲスペクトルの適当なピークの積分にもとづく。収率
は特に記載しないかぎり、精製された生成物に関する。

【００８２】（２Ｓ)−５−アミノ−２−(２−オキソア
ゼチジン−１−イル)ペンタン酸（Ｄ）の培養 化合物ＤをＣＡＳ（１.２ｍｇ、０.３４ ＩＵｍ
ｇ^−１）と共に前記の標準的方法にしたがって培養す
る。約７％のＥ−（２Ｓ）−５−アミノ−２−（２−オ
キソアゼチジン−１−イル）ペント−３,４−エノエー
ト（Ｅ）への変換率が観察される（５００ＭＨｚの^１Ｈ
ＮＭＲスペクトルの積分により判定）。ＨＰＬＣ精製
［ＯＤＳカラム（２５０ｘ７ｃｍ）２５ｍＭ ＮＨ_４Ｈ
ＣＯ_３で１.５ｍｌ／分で平衡化］により保持容量９.１
５ｍｌのＥ（９６μｇ）が単離される：δH（５００Ｍ
Ｈｚ，Ｄ_２Ｏ）２.９５〜３.０（２Ｈ,ｍ,Ｈ−３'）、
３.４〜３.５（２Ｈ,ｍ,Ｈ−４'）、３.５〜３.６（２
Ｈ,ｍ,Ｈ−５）、５.８〜５.９（１Ｈ,ｍ,Ｈ−４）、
５.９〜６.０（１Ｈ,ｍ,Ｈ−３）。Ａ ２Ｄ ＣＯＳＹ相
関スペクトルは、提案されたＥの構造と一致し、約４.
６ｐｐｍで残存するＨＯＤピーク下でシグナルを示す。
ｍ／ｚ（電子照射）＝１８５（ＭＨ^＋、１００％）。

【００８３】化合物Ｄを粗組換えＣＡＳ（６ｍｇ、０.
０３４ ＩＵ／ｍｇ^−１）と共に標準的方法にしたがっ
て培養する。約３０％のＥへの変換および＜５％のＦへ
の変換が観察される（５００ＭＨｚの^１Ｈ ＮＭＲスペ
クトルの積分により判断）。ＨＰＬＣ精製［ＯＤＳ（２
５０ｘ７ｃｍ）２５ｍＭ ＮＨ_４ＨＣＯ_３で１.５ｍｌ
／分で平衡化］により保持容量９.１５ｍｌのＥ（２０
０μｇ）、保持容量６.９ｍｌのＦ（＜＜５μｇ）が単
離される。Ｅに関する分光分析データは部分的に精製し
たＣＡＳと共に培養することにより得られたものと一致
する。Ｆの^１Ｈ ＮＭＲスペクトル（５００ＭＨｚ）を
完全に記録することはできないが、共鳴は提案される構
造と一致する。ｍ／ｚ（電子照射）＝２０３（ＭＨ^＋、
１００％）。トレオ−５−アミノ−３−ヒドロキシ−２
−（２−オキソアゼチジン−１−イル）ペンタン酸Ｆの
場合、ｍ／ｚ（電子照射）＝２０３（ＭＨ^＋、１００
％）。粗培養混合物のＨＰＬＣ分析［ＯＤＳカラム（２
５０ｘ４.６ｃｍ）、２５ｍＭ ＮＨ_４ＨＣＯ_３、１ｍｌ
／分］は２サンプルを混合した場合、Ｆが真のプロカル
バミン酸Ｆ（３.１ｍｌ）と同一の保持容量を有するこ
とが示され、一方２サンプルを混合した場合、Ｆは合成
エリスロ−５−アミノ−３−ヒドロキシ−２−（２−オ
キソアゼチジン−１−イル）ペンタン酸（即ち、エリス
ロ−プロカルバミン酸）（保持容量３.４ｍｌ）と明確
に区別される。

【００８４】（２Ｓ）−５−グアニジノ−２−（２−オ
キソアゼチジン−１−イル）ペンタン酸（Ｂ）の培養 化合物Ｂを部分的に精製したＣＡＳ（２ｍｇ、０.３ Ｉ
Ｕｍｇ^−１）と共に前記の標準的方法にしたがって培養
する。８５％より大きな５−グアニジノ−３−ヒドロキ
シ−２−（２−オキソアゼチジン−１−イル）ペンタン
酸Ｃへの変換が観察される（^１Ｈ ＮＭＲスペクトル
（５００ＭＨｚ）の積分により判断）。ＨＰＬＣ精製
［ＯＤＳ（２５０ｘ４.６ｍｍ）、Ｈ_２Ｏ、１ｍｌ／
分］により保持容量７.５ｍｌの（Ｃ）（３４０μｇ）
が単離される：δH（５００ＭＨｚ Ｄ_２Ｏ）１.７〜
１.８（１Ｈ,ｍ,Ｈ−４）、１.８〜１.９（１Ｈ,ｍ,Ｈ
−４）、３.０（２Ｈ,ｔ,Ｊ＝４Ｈｚ,Ｈ−３'）、３.３
６（２Ｈ,ｔ,Ｊ＝７Ｈｚ,Ｈ−５）、３.５〜３.５５
（１Ｈ,ｍ,Ｈ−４'）、３.５９〜３.６１（１Ｈ,ｍ,Ｈ
−４'）、４.１（１Ｈ,ｄ,Ｊ＝５.５Ｈｚ,Ｈ−２）、
４.１５〜４.２（１Ｈ,ｍ,Ｈ−３）。２Ｄ ＣＯＳＹ相
関スペクトルは、提案されたＣの構造と一致する。ｍ／ｚ
（電子照射）＝２４５（ＭＨ^＋、１００％）。この反応
から残存するＢは回収されなかった。

【００８５】化合物Ｂを粗組換えＣＡＳ（５.５ｍｇ、
０.０Ｉ４ ＩＵ／ｍｇ）と共に標準的方法にしたがって
培養する。８５％より大きなＣへの変換が観察される（
^１ＨＮＭＲスペクトル(５００ＭＨｚ）の積分により判
断）。ＨＰＬＣ精製［ＯＤＳ（２５０ｘ４.６ｍｍ）、
Ｈ_２Ｏ、１ｍｌ／分］により保持容量７.５ｍｌのＣ
（３６９μｇ）が単離される。Ｃに関する分光分析デー
タは部分的に精製したＣＡＳと共に培養することにより
得られたＣと一致する。化合物Ｂを粗組み換えＣＡＳ
（０.１８ｍｇ、０.３７ ＩＵ／ｍｇ）と共に標準的方
法にしたがって培養する。８５％より大きなＣへの変換
が観察される（^１Ｈ ＮＭＲスペクトル（５００ＭＨ
ｚ）の積分により判断）。ＨＰＬＣ精製［ＯＤＳ（２５
０ｘ４.６ｍｍ）、Ｈ_２Ｏ、１ｍｌ／分］により保持容
量７.５ｍｌのＣ（３５０μｇ）が単離される。Ｃに関
する分光分析データは部分的に精製したＣＡＳと共に培
養することにより得られたＣと一致する。

【００８６】Ｎ^２−アセチル−Ｌ−オルニチンの培養 Ｎ^２−アセチル−Ｌ−オルニチンを粗組換えＣＡＳ（６
ｍｇ、０.０３５ ＩＵｍｇ^−１）と共に標準的方法にし
たがって培養する。約１７％の（２Ｓ）−２−アセトア
ミド−５−アミノ−３−ヒドロキシペンタン酸（Ｘ）へ
の変換および約５％のＥ−（２Ｓ）−５−アミノ−２−
アセトアミドペント−３,４−エン酸（Ｙ）への変換が
観察される（^１Ｈ ＮＭＲスペクトル（５００ＭＨｚ）
の積分により判断）。ＨＰＬＣ精製［ボンダパクアミン
（bondapakamine）（２５０ｘ７ｍｍ）、ＯＤＳガード
カラム、０.０１５Ｍ ＨＣＯ_２Ｈ、２ｍｌ／分］により
保持容量９.４〜１０.０ｍｌのＹ（３０μｇ）が単離さ
れる。さらに８〜９ｍｌののフラクションをＨＰＬＣ精
製［ＯＤＳ（２５０ｘ４.６ｍｍ）、０.０５％水性ＨＣ
Ｏ_２Ｈ、１ｍｌ／分］に付し、保持容量５.５〜９.０ｍ
ｌのＸ（９９μｇ）を単離する。

【００８７】Ｅ−(２Ｓ)−５−アミノ−２−アセトアミ
ドペント−３,４−エノエート（Ｙ）の場合：δH（５０
０ＭＨｚ Ｄ_２Ｏ）２.０（３Ｈ,ｓ,ＣＨ_３−）、２.３
３（２Ｈ,ｄ,Ｊ＝５Ｈｚ,Ｈ−５）、３.５５（１Ｈ,ｍ,
Ｈ−２）、５.６５〜５.７５（１Ｈ,ｍ,Ｈ−４）、５.
９〜６.０（１Ｈ,ｍ,Ｈ−３）。２Ｄ ＣＯＳＹ相関スペ
クトルは、Ｘの結合と一致する。ホモニュークレアデカ
ップリング実験によるとＪ＝３Ｈ、４Ｈ＝１５.２Ｈｚ
で、これは二重結合がＥ立体化学を有することを示す。
ｍ／ｚ（電子照射）＝１７３（ＭＨ^＋、１００％）。

【００８８】（２Ｓ）−２−アセトアミド−５−アミノ
−３−ヒドロキシペンタン酸（Ｘ）の場合：δH（５０
０ＭＨｚ Ｄ_２Ｏ）１.７５〜１.８５（２Ｈ,ｍ,Ｈ−
４）、２.１（３Ｈ,ｓ,ＣＨ_３−）、３.１５（２Ｈ,ｔ,
Ｊ＝５Ｈｚ,Ｈ−５）、４.２〜４.２５（１Ｈ,ｍ,Ｈ−
３）、４.３０（１Ｈ,ｄ,Ｊ＝３.５Ｈｚ,Ｈ−２）。２
ＤＣＯＳＹ相関スペクトルは、Ｙの結合と一致する。ｍ
／ｚ（電子照射）＝１９１（ＭＨ^＋、１００％）。

【００８９】Ｎ^２−アセチル−Ｌ−アルギニンの培養 Ｎ^２−アセチル−Ｌ−アルギニンを粗組換えＣＡＳ（６
ｍｇ、０.０３５ ＩＵｍｇ^−１）と共に標準的方法にし
たがって培養する。８５％より大きな（２Ｓ）−２−ア
セトアミド−５−グアニジノ−３−ヒドロキシ−ペンタ
ン酸（Ｋ）への変換が観察される（^１Ｈ ＮＭＲスペク
トル（５００ＭＨｚ）の積分により判断）。ＨＰＬＣ精
製［ＯＤＳ（２５０ｘ４.６ｍｍ） Ｈ_２Ｏ １ｍｌ／
分］により保持容量４.５ｍｌのＫ（３２０μｇ）が単
離される。δH（５００ＭＨｚ Ｄ_２Ｏ）１.８〜２.０
（２Ｈ,ｍ,Ｈ−４）、２.１（３Ｈ,ｓ,ＣＨ_３−）、３.
１５（２Ｈ,ｍ,Ｈ−５）、４.２０〜４.２２（１Ｈ,ｍ,
Ｈ−３）、４.２５（１Ｈ,ｄ,Ｊ＝３.５Ｈｚ,Ｈ−
２）。２Ｄ ＣＯＳＹ相関スペクトルは（Ｋ）の結合と
一致する。 ｍ／ｚ（電子照射）＝２３３（ＭＨ^＋、１００％）。

【００９０】Ｎ−α−アセチル−Ｄ−アルギニンをＣＡ
Ｓと共に培養すると、あるとしてもわずかな（５％未
満）ヒドロキシル化生成物が得られる。このことは、Ｃ
ＡＳが（２Ｓ）立体化学特性を有する基質を変換するこ
とを示す。Ｎ−α−ベンゾイル−Ｄ−アルギニンをＣＡ
Ｓと共に培養してもＮ−α−ベンゾイル−Ｄ−アルギニ
ンの変換は観察されない。これらの結果は、ＣＡＳがオ
ルニチンおよびアルギニンの単純な誘導体を非活性化位
置で酸化できることを示す。

【００９１】クラバミン酸シンターゼ触媒反応の立体特
異性の研究 （２Ｓ,３Ｓ）−５−グアニジノ−２,３−［^２Ｈ_２］−
２−（２−オキソアゼチジン−１−イル）ペンタン酸お
よび（２Ｓ,３Ｒ）−５−グアニジノ−３−［ ^２Ｈ］−
２−（２−オキソアゼチジン−１−イル）ペンタン酸を
クラバミン酸シンターゼと共に培養すると、Ｃ−３で高
度に立体特異的なヒドロキシル化が起こり、各々、プロ
−Ｒプロトンまたは重陽子が除去される。これらの結果
は、ＣＡＳにより触媒された場合、Ｂのヒドロキシル化
がＣ−３の立体配置を保持しながら優勢に進行すること
を示す。

【００９２】実施例３−実験 ３．１ 実験１ クラブラン酸の前駆体としてのアルギ
ニンの測定^１４ Ｃ−アルギニンを、各々、オルニチントランスカル
バモイラーゼおよびアルギニンスクシネートシンセター
ゼで遮断されていることがわかっている２つのエス・ク
ラブリゲルスの突然変異体培養物に供給する（これらは
オルニチンからアルギニンへの変換に関与する酵素であ
る）。標識をクラブラン酸に導入する。^１４Ｃ−オルニ
チン標識を同様に２つの突然変異体培養物に供給した場
合、クラブラン酸に標識は取り込まれない。以下に記載
の文字および数字を用いて図１および２に言及する。

【００９３】３．２ 実験２−２個の新規アルギニン誘
導体（Ａ）および（Ｇ） 実験１はアルギニンが生合成経路でクラブラン酸にされ
るアミノ酸であることを示す。該経路での次の公知の中
間体はモノサイクリックβ−ラクタムプロクラバミン酸
^１である。したがって、β−ラクタムはアルギニン炭素
骨格のＮ^２位置に導入されなければならず、ヒドロキシ
ル基を、Ｃ−３に導入し、Ｎ^５グアニジノ官能基を加水
分解する。

【００９４】モノサイクリックβ−ラクタム（Ｂ）およ
び（Ｃ）を、各々、親アミンであるプロクラバミン酸
（２）^１およびデヒドロキシプロクラバミン酸^１をアミ
ノイミノメタンスルホン酸^２と反応させることにより調
製する。β−アミノ酸２Ｓ−（Ａ）は以下に示す経路に
より得られ、β−アミノ酸（Ｇ）はβ−ラクタム（Ｃ）
の酸加水分解により得られる。

【００９５】

【化２９】 試薬および条件：ｉ．Ｅｔ_３Ｎ／アクリル酸メチル；ｉ
ｉ．ＮaＯＨ／ＴＨＦ：Ｈ_２Ｏ（１：１）；ｉｉｉ．Ｈ
_２、Ｐd−Ｃ（１０％）

【００９６】これらの推定される代謝物のうちエス・ク
ラブリゲルスからの培養上清中容易に検出可能なものは
ない。したがって、プロクラバミン酸およびクラブラン
酸の産生において遮断されたエス・クラブリゲルスの突
然変異体を試験する。これらの変異体のうちフェニルイ
ソシアネート^３での誘導体合成により示されるようなア
ミン基を含有する化合物を蓄積するものもある。このよ
うな変異体の選択した物を発酵させ、培養ブロスをサカ
グチ着色反応^４によりグアニジノ基を有する化合物の存
在に関してスクリーンする。変異株エス・クラブリゲル
スdclＨ６５は着色試験に良好な応答を示す。したがっ
て、培養濾液をダウエクス−５０、ファーマシアＨＲ５
／５モノＳおよびパーティシル１０ＳＣＸカチオン交換
マトリックスを用いて分別し、グアニジノ含有物質の精
製につづいてサカグチ試験方法の変法を行う（サカグチ
反応において形成される色相の強度を５１５ｎｍで測定
する）。

【００９７】２つの化合物を約１０：１の割合で単離
し、その分光学的性質（両方の化合物に関して^１Ｈ ｎ.
ｍ.ｒ.およびｆ.ａ.ｂ.／ｍ.ｓ.、主要成分に関して
^１３Ｃ）を推論的中間体として調製された化合物の性質
と比較して、その構造体を（Ａ）および（Ｇ）とする。

【００９８】エス・クラブリゲルスdclＨ６５培養ブロ
スのクロマトグラフィーによる精製法は酸性培地を含む
ため、新しい培養濾液の分析的ｈ.ｐ.ｌ.ｃ.は閉環物質
の存在を示さないが、（Ａ）および（Ｇ）は対応するβ
−ラクタム誘導体（Ｂ）および（Ｃ）の開環体である可
能性がある。したがって、培養ブロスの分別はほぼ中性
条件を保って、β−ラクタム化合物の加水分解を避けな
がら行う。dclＨ６５の新しい培養ブロスを遠心分離
し、凍結乾燥し、エタノール／水（１：１）で処理し、
高分子量化合物を除去し、可溶性フラクションを濃縮す
る。濃縮物を次に、溶出液のpＨを４と７.５の間に維持
しながらアンバーライトＩＲＡ６８アニオン交換樹脂、
セファデクスバイオゲルＰ２およびシリカゲル上クロマ
トグラフィーに付す。サカグチ−陽性物質を各段階で収
集する。主要サカグチ陽性物質を単離し、^１Ｈ−ｎ.ｍ.
ｒ.、ｉ.ｒ.、ｃ.ｄ.、重量スペクトルにより分析す
る。これらのデータから主要生成物の構造がＳ−（Ａ）
であることが確認される。副サカグチ−陽性化合物は単
離するのに十分な量で存在しないが、合成（Ｇ）と共に
溶出される物質はｈ.ｐ.ｌ.ｃ.およびキャピラリーゾー
ン電気泳動で検出される。

【００９９】結論 ２つの新規アルギニン誘導体、Ｎ^２−（２−カルボキシ
エチル）−アルギニン（Ａ）およびＮ^２−（２−カルボ
キシエチル）−３−ヒドロキシ−アルギニン（Ｇ）はク
ラブラン酸生合成において遮断されているストレプトミ
セス・クラブリゲルスdclＨ６５の変異体により産生さ
れる。これらの化合物はクラブラン酸合成において有用
である。さらにこれらの化合物のクラブラン酸生合成経
路の中間体としての役割に関するデータを実験３．３に
示す。

【０１００】３．３−実験３ クラブラン酸生合成の中
間体としての（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｇ）および
（８）の役割に関する標識実験 プロクラバミン酸に先立つ可能な生合成配列を第１図に
示す。（Ａ）から始めて、少なくとも３つの生化学工
程、即ち、ヒドロキシル基の導入（工程ａ）、β−ラク
タム環の形成（工程ｂ）およびグアニジノ基のアミノ基
への加水分解（工程ｃ）が、プロクラバミン酸の生成に
必要である。どの化合物（Ａ）、（Ｇ）、（Ｂ）、
（Ｃ）および（８）が実際経路に存在するかを調べるた
めに、供給実験についてこれらを^１３Ｃで三重に標識し
て合成する。各場合において、５個の炭素鎖を１および
２−位で標識し（９９％^１３Ｃ）、さらに３個の炭素単
位のカルボニル基を標識する（９１％^１３Ｃ）。３個の
標識炭素のすべてが結合が切れることなく取り込まれた
場合、クラブラン酸の７、３および１０の炭素間にスピ
ン−スピンカップリングが^１３Ｃ−ｎ.ｍ.ｒ.において
観察されることがわかっているので^５、この標識手順を
採用する。

【０１０１】ＤＬ−トレオ−［１,２,２'−^１３Ｃ_３］
−プロクラバミン酸^５をアミノイミノメタンスルホン酸
^２で処理して［１,２,２'−^１３Ｃ_３］−（Ｃ）を得、
これを酸加水分解に付して［１,２,３'−^１３Ｃ_３］−
（Ｇ）を得る。［１,２,２'− ^１３Ｃ_３］−（Ｆ）の酸
加水分解により、［１,２,３'−^１３Ｃ_３］−（８）を
得る。[１,２,３'−^１３Ｃ_３］−（Ａ）および［１,２,
２'−^１３Ｃ_３］−（Ｂ）の合成は第２図にしたがう。
第２図において、試薬および条件は以下のとおりであ
る：Ｚ＝ＰhＣＨ_２ＯＣＯ−；ｉ，ＥtＯＨ、ＨＣl、
Δ；ｉｉ，ＰhＣＨＯ、ＭgＳＯ_４、Ｅt_３Ｎ；ｉｉｉ，
ＬＤＡ、ＨＭＰＡ、ＩＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨＺ；ｉｖ，１Ｍ
ＨＣl；ｖ，ＮaＯＨ、ＢrＣＨ_２ＣＨ_２ ^１３ＣＯＣｌ；
ｖｉ，粉末ＫＯＨ、ＴＢＡＢ、Ｈ_２Ｏ、超音波処理物；
ｖｉｉ，Ｎa_２ＣＯ_３、４０％ＥtＯＨ水溶液；^１６ ｖ
ｉｉｉ，Ｈ_２、Ｐd−Ｃ（１０％）；ｉｘ，Ｋ_２Ｃ
Ｏ_３、アミノイミノメタンスルホン酸；ｘ，１Ｍ ＨＣl

【０１０２】ストーク（Stork）らの方法^６にしたがっ
て、^１３Ｃ_２−グリシン（９９％１,２−^１３Ｃ）を保
護した［１,２−^１３Ｃ_２］−オルニチン誘導体（１
０）にベンジリデングリシンエステル（９）を経由して
導入する。（１０）の穏やかな酸加水分解によりアミノ
エステルを得、これを［１−^１３Ｃ］−３−ブロモプロ
ピオニルクロリド（９１％１−^１３Ｃ）^５でアシル化し
て、（１１）を得る。（１１）の塩基処理により、β−
ラクタム（１２）を得る。カルボキシおよびアミノ保護
基の開裂により［１,２,２'−^１３Ｃ_３］−（Ｄ）^１を
得、これをアミノイミノメタンスルホン酸^２で目的とす
るグアニジノ酸［１,２,２'−^１３Ｃ_３］−（Ｂ）に変
換する。［１,２,２'−^１３Ｃ_３］−（Ｂ）の酸処理に
より、［１,２,３'−^１３Ｃ_３］−（Ａ）を得る。この
反応スキームの工程の平均収率は８７％である。

【０１０３】５個のラセミ^１３Ｃ_３−標識化合物
（Ａ）、（Ｇ）、（Ｂ）、（Ｃ）および（８）を、各
々、クラブラン酸産生期にある、エス・クラブリゲルス
ＡＴＣＣ２７０６４発酵に供給し、産生されたクラブラ
ン酸サンプルをベンジルエステルとして単離する。投与
された化合物の取り込みのレベルを^１３Ｃ−ｎ.ｍ.ｒ.
により測定し、シリル化後、９−Ｏ−シリル化誘導体の
ｇ.ｃ／ｍ.ｓ.を測定する。観察される^１３Ｃ−取り込
みを以下の第１表にまとめる：

【０１０４】

【表１】 ＮＤ＝どの炭素中心でも濃縮が検出されない。計算は用
いた１エナンチオマーに基づく。

【０１０５】３サンプルにおいて、^１３Ｃ−濃縮が観察
され［化合物（Ａ）、（Ｂ）＆（Ｃ）]、濃縮はクラブラ
ン酸塩の炭素３、７および１０に特異的であり、すべて
の３個の標識された中心間で^１３Ｃ−^１３Ｃスピン−ス
ピンカップリングが観察される（第３図 Ｂの供給から
のクラブラン酸ベンジルの炭素７、１０および３の ^１３
Ｃ−ｎ.ｍ.ｒ.スペクトル、Ｊ７,１０ ３.８、Ｊ３,７
１.９およびＪ３,１０ ６７.２Ｈｚ）。このことは、取
り込み中、結合の破壊が起こらなかったことを示す。

【０１０６】これらの結果から、（Ａ）、（Ｂ）および
（Ｃ）がプロクラバミン酸の生合成における前駆体、し
たがって、クラブラン酸であり、経路中、この順番に論
理的に起こることが結論できる。Ｇおよび８の場合、こ
れらの実験条件下では、濃縮は起こらない。しかし、当
該分野で周知のβ−ラクタム環形成の方法を用いて（例
えば、文献１）、Ｇおよび８（またはその保護誘導体）
を、各々、Ｃおよびプロクラバミン酸に変換することに
より、これらの化合物は、クラバム類、例えばクラバミ
ン酸の産生に関して、例えば合成または半合成プロセス
において有用である。

【０１０７】（Ｃ）のプロクラバミン酸への形質転換
は、アルギナーゼ型酵素により媒介される。したがっ
て、この酵素活性の証拠を調べる。エス・クラブリゲル
スＡＴＣＣ２７０６４の無細胞調製物はラセミ体の
（Ｃ）の１個のエナンチオマーを定量的にプロクラバミ
ン酸（５）および尿素に変換できる。活性は、Ｍn^２＋
の存在下に向上し、この現象は、バチルス・アンスラシ
ス（Bacillus anthracis）^７およびスタフィロコッカス
^７'８源からのアルギナーゼに関して報告されている。
対応する（２Ｓ）−アミノ誘導体^１から調製される（２
Ｓ）−（Ｂ）も、これらの条件下で加水分解するが、
（Ｃ）より迅速でなく、（Ａ）または（Ｇ）について、
加水分解は検出されない。明らかに、この酵素はこれら
の初期生合成前駆体のグアニジノ基の間を有効に区別で
きる。天然のプロクラバミン酸の絶対的立体化学は（２
Ｓ,３Ｒ）であるので、アミジノヒドロラーゼの基質で
ある（Ｃ）のエナンチオマーも恐らく（２Ｓ,３Ｒ）立
体化学を有する。

【０１０８】アミジノヒドロラーゼを前記１．２項にし
たがって精製する。純粋な酵素は、アルギニンをオルニ
チンに加水分解せず、したがって、すでにエス・クラブ
リゲルス^９において報告されているアルギナーゼとは異
なる。アミジノヒドロラーゼのＮ−末端アミノ酸配列は
クラブラン酸遺伝子クラスター中のアミジノヒドロラー
ゼ関連遺伝子のオープンリーディングフレームと関連が
ある。ＤＮＡ配列から計算されるアミジノヒドロラーゼ
についてのＭrは３３,３７４である。前記データから、
（２Ｓ,３Ｒ）−（Ｃ）はおそらくクラブラン酸への生
合成パスにおいて（２Ｓ,３Ｒ）−プロクラバミン酸に
直接変換されると結論できる。

【０１０９】（Ｂ）および（Ｃ）に比べて^１３Ｃ−標識
（Ａ）化合物の取り込みのレベルが低いことは、化合物
が細胞中に有効に輸送されていないか、真の中間体が
（Ａ）の誘導体、例えば閉環に都合よい補酵素Ａチオエ
ステルであることを示す。（Ａ）に関する結果は、
（Ｂ）のβ−ラクタムの生成が、生化学的に先例のない
プロセス、即ち、アミド結合形成によることを示すが、
文献では、他のモノサイクリックβ−ラクタムの前駆
体、ノカルジシン^１０およびおそらくモノバクタム^{１０
'１１}が閉環の前に形成されたアミド結合を有すること
を示している。これらの化合物において、閉環はセリル
ヒドロキシル官能基のＳＮ２置換による。

【０１１０】先の標識研究は、クラブラン酸のβ−ラク
タム炭素が解糖経路由来のものであり、ピルビン酸エス
テル^１２がβ−ラクタム環中に特異的に取り込まれるこ
とを示す。本発明者らは、乳酸エステルもβ−ラクタム
環中に特異的に取り込まれることを見いだした。

【０１１１】したがって、（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）
のＣ３基は同じ経路由来のものである。ピルビン酸エス
テルおよび乳酸エステルは、生化学的に、アクリル酸エ
ステル^１３およびマロン酸セミアルデヒド^１４に変換で
きることは公知である。酵素で触媒されたアルギニンの
アクリル酸エステルへのミカエル添加、またはマロン酸
セミアルデヒドに関するシッフ塩基添加と、それに続く
還元により、いずれの場合においても前駆体（Ａ）が得
られる。アルギニンのマロン酸セミアルデヒドとの反応
からの可能な（Ａ）の誘導は、シッフ塩基形成およびそ
れに続く還元が起こるオピン代謝物の生合成と強い類似
性を示すので、特に興味深い。

【０１１２】得られた証拠から、プロクラバミン酸のβ
−ラクタム環はアミド形成反応を含む新しい方法で構築
されることがわかる。アルギニン誘導体（２Ｓ）−
（Ｂ）および（２Ｓ,３Ｒ）−（Ｃ）はプロクラバミン
酸の生合成前駆体であり、（２Ｓ）−（Ｂ）はヒドロキ
シル化されて（２Ｓ,３Ｒ）−（Ｃ）になり、酵素アミ
ジノヒドロラーゼは（２Ｓ,３Ｒ）−（Ｃ）を加水分解
してプロクラバミン酸にする新規酵素である（プロクラ
バミン酸アミジノヒドロラーゼと命名する）。

【０１１３】結論 実験１および３は、アルギニンの、Ａ、ＢおよびＣが、
プロクラバミン酸、かくしてクラブラン酸への経路上に
あることを示し、アルギニンはオルニチンに比べて、ク
ラブラン酸のより直接の前駆体であることを示す。

【０１１４】文献 １．ケイ・エイチ・バガレイ、エス・ダブリュー・エル
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n）、テトラヘドロン・レターズ（Tetrahedron Letter
s）,１９９１,３２,３２７.

【０１１５】

【配列表】 配列一覧表 （１）一般情報 （ｉ）出願人 （Ａ）名称：スミスクライン・ビーチャム・パブリック・リミテッド・カン パニー （Ｂ）通り名：ニュー・ホライズンズ・コート （Ｃ）都市名：ブレンフォード （Ｄ）州名：ミドルセックス （Ｅ）国名：イギリス国 （Ｆ）郵便番号（ＺＩＰ）：ＴＷ８ ９ＥＰ （Ｇ）電話番号：０７３７ ３６４１４７ （Ｈ）テレファックス：０７３７ ３６４００６ （Ｉ）テレックス：９１１４１５ （ｉｉ）発明の名称：新規化合物 （ｉｉｉ）配列数：２ （ｉｖ）コンピューター・リーダブル・フォーム： （Ａ）媒体形態：フロッピーディスク （Ｂ）コンピューター：互換性ＩＢＭ ＰＣ （Ｃ）操作システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウェアー：パテントイン・リリース（PatentIn Release） ＃１.０，バージョン＃１.２５（ＥＰＯ） （２）配列番号１に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：３１３アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）トポロジー：不明 （ｉｉ）分子の型：蛋白質 （ｉｉｉ）仮定性：イエス （ｖ）フラグメントの型：Ｎ−末端 （ｖｉ）起源： （Ａ）微生物：ストレプトミセス・クラブリゲルス （Ｂ）菌株：エス・クラブリゲルスＡＴＣＣ２７０６４の再単離体 （ｘｉ）配列の記載：配列番号１：

【化３０】 （２）配列番号２に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：９４２塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：不明 （ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム） （ｉｉｉ）仮定性：ノー （ｖｉ）起源： （Ａ）微生物：ストレプトミセス・クラブリゲルス （Ｂ）菌株：エス・クラブリゲルスＡＴＣＣ２７０６４の再単離体 （ｘｉ）配列記載：配列番号２：

【化３１】

【図面の簡単な説明】

【図１】 クラブラン酸の生成工程を示すスキームであ
る。

【図２】 化合物Ａの生成工程を示すスキームである。

【図３】 ^１３Ｃ_３−標識した化合物Ｂをエス・クラブ
リゲルスＡＴＣＣ２７０６４発酵に供給したときの産生
したクラブラン酸ベンジルの炭素７、１０および３の
^１３Ｃ−ｎ.ｍ.ｒ.スペクトルである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ネビル・ヒューバート・ニコルソン イギリス国サリー・アールエイチ３・７ エイジェイ、ベッチワース、ブロッカ ム・パーク スミスクライン・ビーチャ ム・ファーマシューティカルズ (72)発明者 スティーブン・ウィリアム・エルソン スペイン国28760トレスカントス、サン ティアゴ・ドリソラ４番、パルケ・テク ノロジー・デ・マドリード、スミスクラ イン・ビーチャム (72)発明者 ジェフリー・エドワーズ イギリス国ウエスト・サセックス・ビー エヌ14・８キューエイチ、ワーシング、 クラレンドン・ロード スミスクライ ン・ビーチャム・ファーマシューティカ ルズ (72)発明者 アリソン・ジェーン・アール イギリス国ウエスト・サセックス・ビー エヌ14・８キューエイチ、ワーシング、 クラレンドン・ロード スミスクライ ン・ビーチャム・ファーマシューティカ ルズ (72)発明者 ウィリアム・ヘンリー・ホルムス イギリス国グラスゴー・ジー11・６エイ キュー、ダンバートン・ロード54番、ロ バートソン・インスティテュート・オ ブ・バイオテクノロジー、バイオフラッ クス・リミテッド (72)発明者 デイビッド・マイケル・マウスデイル イギリス国グラスゴー・ジー11・６エイ キュー、ダンバートン・ロード54番、ロ バートソン・インスティテュート・オ ブ・バイオテクノロジー、バイオフラッ クス・リミテッド (72)発明者 ジャック・エドワード・ボールドウィン イギリス国オックスフォード・オーエッ クス１・３キューワイ、サウス・パーク ス・ロード、オックスフォード・ユニバ ーシティ、ダイソン・ペリンズ・ラボラ トリー (72)発明者 クリストファー・スコフィールド イギリス国オックスフォード・オーエッ クス１・３キューワイ、サウス・パーク ス・ロード、オックスフォード・ユニバ ーシティ、ダイソン・ペリンズ・ラボラ トリー (56)参考文献 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ. 29，Ｎｏ．27（1990）ｐ．6499−6508 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ. 30，Ｎｏ．８（1991）ｐ．2281−2292 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 アルファ−アミノ酸基質が側鎖にアミ
   ノ、グアニジノまたはアミジノ基を有する式（ＩＩ）： 【化１】 ［式中、Ｒ^１は 【化２】 （式中、Ｒ^２＝ＨまたはＣ_１−６アルキルを意味する）
   で示される化合物、アルファ−アミノ酸またはそのＮ−
   アシル誘導体のベータ−ヒドロキシル化法であって、該
   基質をクラバミン酸シンターゼと共にインキュベートす
   ることでヒドロキシル化反応を実施することを特徴とす
   る方法。
2. 【請求項２】 Ｎ−アシルアミノ酸がＮ−アセチルアル
   ギニンまたはＮ−アセチルオルニチンである請求項１記
   載の方法。
3. 【請求項３】 ５−アミノ−２Ｓ−（２−オキソ−アゼ
   チジン−１−イル）ペンタン酸をクラバミン酸シンター
   ゼと共にインキュベートすることにより得られる５−ア
   ミノ−２Ｓ−（２−オキソ−アゼチジン−１−イル）ペ
   ント−２−エン酸。