JPS6348520B2

JPS6348520B2 -

Info

Publication number: JPS6348520B2
Application number: JP54146489A
Authority: JP
Inventors: Yukio Hashimoto; Seigo Takazawa; Tadashi Hirata; Masao Matsukuma; Shigeo Yoshiie
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1979-11-14
Filing date: 1979-11-14
Publication date: 1988-09-29
Also published as: US4335211A; JPS5672698A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は一般式（）（式中、R₁は置換または非置換の飽和または不
飽和炭素６員環残基、複素５員環残基を表わし、
R₂は水素またはカルボン酸保護基を表わし、Hal
はハロゲン原子を表わし、６、７位の水素はシス
の関係にあり、Ｘは水素、低級アルキル基、水酸
基、カルボキシル基またはアミノ基を表わす）で
表わされるセフアロスポリン類縁体の光学活性体
即ち、一般式（−１）の絶対構造式（6R、7S）で表わされる化合物お
よびその塩の製造法に関する。尚以下の説明においては、一般式（）、（）、
……で表わされる化合物を、化合物〔〕、化合
物〔〕、……と記述することがある。従来、セフアロスポリンの硫黄原子が炭素原子
に置き換えられたカルバセフエム類化合物〔カル
バセフエムの命名はJ.Am.Chem.Soc.、96、7584
（1974）の記述に従つた〕については３位に置換
メチル基をもつ化合物が知られている〔前記の文
献並びにJ.Med.Chem.、20、551（1977）〕が特に
強い抗菌活性を示す化合物は知られていない。カルバセフエム核の４位、５位または３位に
種々の置換基を有する各種の化合物に関しては本
出願人によつて既に出願され一部公開されている
〔特願昭53−34696（特開昭54−128591号）、同53−
122403、同53−133072、同53−162005および54−
8408号〕。特に光学不活性なセフアロスポリン類
縁体に関しては特願昭54−92035号明細書に詳し
い記載がされている。さらに、それらの新規カル
バセフエム核をもつアシル体の中には極めて強い
抗菌作用をもつものが見い出され一部公開されて
いる〔特願昭53−34696（特開昭54−128591号）、
同53−122402、同53−127027、同53−133071、同
53−162006、同53−162007、同54−8409および同
54−92035号〕。しかしながら上記に記載されているカルバセフ
エム核をもつ化合物は光学不活性な原料を用い全
合成的手法を用いて製造されるため、原則的に光
学的に不活性なdl体〔又は（±）体〕である。即
ち、６位、７位の水素がシスの関係にある一般式
〔〕（式中、R₂およびHalは前記と同義を表わし、６
位、７位の水素はシスの関係にある。）で表わさ
れる化合物は、お互いに鏡像体の関係にある化合
物〔−１〕、化合物〔−２〕の等量混合物と
して存在する。化合物〔−１〕、〔−２〕はそ
れぞれ次式で示される化合物である。

【式】

【式】従つて、これらカルバセフエム核をもつ化合物
より誘導される各種アシル体はすべて光学不活性
体であつた。一方これら光学不活性なカルバセフ
エム核をもつ化合物に光学活性なアシル基例えば
Ｄ−フエニルグリシル基を導入した一般式（）で表わされる化合物は、それぞれのジアステレオ
マーに分離されている（特願昭54−92035号）。得
られた化合物はそれぞれ以下の推定絶対構造式を
有するものと考えられる。しかしこの方法は化合物（）の合成において
アミノ基、カルボニル基の保護および脱離工程を
必要とし、工程が複雑である。一方本願発明におけると同様の微生物の培養物
もしくはその処理物等を用いて光学活性なカルバ
セフエム核をもつ化合物を得る方法が同一出願人
により特願昭54−14534、54−14533および54−
45897号の明細書に開示されている。54−14533、
54−14534号に開示された方法は工程が複雑且つ
重複している。一方、同一出願人により出願され
た特願昭54−45897号明細書には、一般式（）
または一般式（−１）において３位のHalがＨ
である化合物にアシル基を導入するに際し、光学
選択的にアシル化する能力を有する微生物を用い
て、直接アシル誘導体の光学活性体〔一般式（
−１）において３位のClがＨである化合物など〕
を製造する方法が示されている。本発明者らはさ
らに研究した結果、一般式（）または一般式
（−１）で表わされる化合物を、光学選択的に
アシル化する能力を有する微生物を用いて一般式
（−１）で表わされる化合物を製造することが
可能であることを見出し、本発明を完成するに至
つた。本発明によれば、アエロモナス属、アクロモバ
クター属、アースロバクター属、アセトバクター
属、アルカリゲネス属、エシエリキア属、キサン
トモナス属、クルイベラ属、グルコノバクター
属、クロストリジウム属、コマモナス属、コリネ
バクテリウム属、ザルシナ属、スタフイロコツカ
ス属、スピリルム属、バチルス属、プシユードモ
ナス属、フラボバクテリウム属、ブレビバクテリ
ウム属、プロタミノバクター属、プロテウス属、
ベネケア属、ミクロコツカス属、ミコプラーナ
属、ロドプシユードモナス属の微生物の培養物、
その処理物、またはそれより抽出した酸素の存在
下に、一般式（）（式中、R₁、Ｘは前記と同義を表わす）で表わ
されるα，α−ジ置換カルボン酸類またはその反
応性誘導体と化合物（）を反応させると、一方
の鏡像体｛化合物〔−１〕｝が化合物（）と
光学選択的にアシル化反応をし、一般式（−
１）で示されるセフアロスポリン類縁体の光学活
性体を製造することができる。また、化合物〔−１〕も化合物（）とアシ
ル化反応することを見い出した。本発明によつて得られる光学活性なカルバセフ
エム核をもつ化合物のアシル誘導体は、対応する
光学異性体｛化合物〔−２〕｝のアシル誘導体
に比べ強い抗菌活性を示すこと、さらにセフアロ
スポリン類の絶対構造と活性相関との知見とか
ら、下記の一般式〔−１〕で表わされる（6R、7S）の絶対構造を有するも
のと考えられる。従つて本発明における光学活性
体はこの推定絶対構造式をもつものとして説明さ
れている。本発明において用いられる化合物〔〕は例え
ば特願昭53−162008号明細書の記載の方法によつ
て製造することができ、具体的な方法は後記参考
例に示す。一般式（）中、R₁で表わされる不飽和炭素
６員環残基、複素５員環残基としては、フエニル
基、シクロヘキシル基、シクロヘキセニル基、シ
クロヘキサジエニル基、チエニル基、フリル基な
どが例示され、これらの置換基として水酸基、ハ
ロゲン基、ニトロ基、アミノ基、メタンスルホン
アミド基があげられる。Ｘのアルキル基としては、炭素数１−５の直鎖
もしくは分岐したアルキル基、例えばメチル、エ
チル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチ
ル、ｉ−ブチル、sec−ブチル、tert−ブチル基
などがあげられる。化合物〔〕の反応性誘導体としては、水性媒
体中で、本発明で使用される微生物、該微生物の
培養物、該微生物の培養処理物、およびまたは該
微生物の産生する酵素により加水分解されて化合
物〔〕を与えるものをいい、例えばメチル、エ
チルその他のアルキルエステル、チオグリコール
酸のようなチオエステルなどがあげられる。一般式〔〕中、R₂としては炭素数１−５の直鎖もしくは分岐したアルキ
ル等（例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、
イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、sec
−ブチル、ｔ−ブチル基など）、炭素数１−５の直鎖もしくは分岐した低級ア
ルコキシメチル基（例えば、メトキシメチル、
エトキシメチル基など）炭素数１−５の直鎖もしくは分岐したハロゲ
ン化アルキル基（例えばクロロメチル、２，
２，２−トリクロロエチル、２，２，２−トリ
フロロエチル基など）低級アルキルスルホニルエチル基（例えばメ
チルスルホニルエチル、エチルスルホニルエチ
ル基など）炭素数７−12のアリールメチル基（例えばベ
ンジル、ジフエニルメチル、トリチル、トリフ
エニルメチル基など）炭素数７−20の置換アリールメチル基（置換
基としてはメトキシ基、ニトロ基等が例示さ
れ、フエニル基上の置換基数は１〜５である。）
または一般式（）（式中、R₃は炭素数１−５の直鎖もしくは分
岐した低級アルキル基、炭素数１−５の直鎖も
しくは分岐した低級アルコキシ基、フエニル基
を表わし、R₄は水素もしくは炭素数１−５の
直鎖もしくは分岐した低級アルキル基を表わ
す）で表わされるエステル残基などが例示され
る。化合物〔〕と化合物〔〕の光学選択的なア
シル化反応もしくは化合物〔〕と化合物〔−
１〕のアシル化反応は化合物〔〕と化合物
〔〕もしくは化合物〔〕と化合物〔−１〕
とからアシル化反応を行つて光学活性な化合物
〔〕（即ち化合物〔−１〕）を合成する能力を
有する微生物、該微生物の培養物、該微生物の培
養処理物およびまたは該微生物の産生する酵素を
用いて行なうことができる。上記アシル化反応も
しくは光学選択的アシル化反応を行なうことがで
きる微生物としてはプシユードモナス属、キサン
トモナス属、エシエリキア属、アエロモナス属、
アクロモバクター属、アースロバクター属、アセ
トバクター属、アルカリゲネス属、クルイベラ
属、グルコノバクター属、クロストリジウム属、
コマモナス属、コリネバクテリウム属、ザルシナ
属、スタフイロコツカス属、スピリウム属、バチ
ルス属、フラボバクテリウム属、ブレビバクテリ
ウム、プロタミノバクター属、ベネケア属、ミク
ロコツカス属、ミコプラーナ属、ロドプシユード
モナス属、プロテウス属に属し、化合物〔〕ま
たはその反応性誘導体と、化合物〔〕もしくは
化合物〔−１〕とから、光学活性な化合物〔
−１〕を合成する能力を有する微生物であればい
ずれも使用できる。具体的な菌株としてはアエロモナス、ヒドロフ
イラIFO12634、アクロモバクター・アセリス
IFO3320、アースロバクター・シンプレツクス
ATCC15799、アセトバクター・アウランチス
IFO3245、アセトバクターSP・ATCC21760、ア
ルカリゲネス・フエカリスATCC8750、エシエリ
キア・コリATCC11105、エシエリキア・コリ
ATCC13281、キサントモナス・シトリIFO3835、
キサントモナス・フイザリデイコーラIFO13555、
クルイベラ・シトロフイラATCC21285、グルコ
ノバクター・リケフアシエンスATCC14835、グ
ルコノバクター・デオキシアセトニカス
IFO3271、クロストリジウム・アセトブチリカム
IFO3346、コマモナス・テリゲナIFO12685、コ
リネバクテリウム・トリチシIFO1216、ザルシ
ナ・ルテアATCC9341、スタフイロコツカス・ア
ウレウスIFO3060、スピリルム・メタモルフアム
IFO12012、バチルス・メガテリウム
ATCC14945、プシユードモナス・メラメゲナム
ATCC17808、プシユードモナス・アエルギノー
サIFO3451、フラボバクテリウムspATCC21429、
ブレビバクテリウム・セリナムATCC15112、ブ
ロタミノバクター・アルボフラバスIFO13221、
プロテウス・レトゲリATCC9250、ベネケア・ヒ
ベロブテイカATCC15803、ミクロコツカス・ル
テウスAHU1427、ミコプラーナ・ブラタ
IFO13267、ミコプラーナ・デモルフア
IFO13213、ロドプシユードモナス・スフエロイ
ダスATCC21286が挙げられる。光学選択的アシ
ル化には、上記微生物の培養液もしくは培養処
理物分離菌体｛培養液より遠心分離等により分
離する。さらにはこの菌体を食塩水（通常約１
％）、緩衝液等で洗つてから使用してもよい｝も
しくは分離菌体懸濁液菌体破砕液（上記で得ら
れた菌体を機械的もしくは化学的に破砕した液）
酵素抽出液（上記で得られた菌体破砕液から菌
体残渣を除いた液）精製酵素液（上記で得られ
た酵素液、好ましくは上澄液に、硫安等を加えて
酵素蛋白を沈殿させた後、これをゲル過法や、
イオン交換セルロースカラムクロマト、イオン交
換セフアデツクスカラムクロマト等の手段により
精製した酵素液）なども同様に使用できる。さら
に菌体あるいは抽出精製された酵素を常法により
固定化した固定化酵素も使用することができる。反応は反応に影響しない不活性溶媒中０〜50
℃、好ましくは15〜35℃、PH５〜８で行なわれ
る。最も好ましい溶媒としては水があげられる。
有機溶媒、例えばアセトン、メタノール、エタノ
ール、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチル
スルホキシドなどを単独もしくは水と混合して用
いることもできる。反応時のPHをコントロールす
るために、リン酸塩緩衝剤、ベロナール緩衝剤、
クエン酸緩衝剤を添加することも効果的である。
反応時間は、菌体等の種類、濃度、基質の種類、
濃度、反応温度、反応PH等により影響されるが、
通常30分〜24時間である。反応収率が最大値に達
した時に反応を終了するのが最も好ましい。用い
られる菌体濃度は乾燥重量で反応液１ml当たり１
mgから50mgが好ましい。精製された酵素を用いる
場合はその活性が前記乾燥菌体量に相当するだけ
用いられる。用いられる基質濃度は化合物〔〕
が反応液１ml当たり、0.5mg〜50mgが好ましい。
化合物〔〕の濃度は反応液１ml当たり0.1〜50
mgが好ましい。菌体反応に妨害となる酵素活性、
例えばβ−ラクタマーゼ、エステラーゼなどが使
用する菌体に含有されている場合は、該菌体に変
異処理を施して、これを消失せしめた菌体を取
り、この菌体を使用することもできる。これら妨
害となる酵素の阻害剤を反応系に添加することに
より、反応収率を向上させることもできる。反応
終了後、目的物の単離は、一般に培養液から有機
化合物の精製単離法として知られている各種担体
を用いる吸着またはイオン交換クロマトあるいは
ゲル過、液々抽出法などにより行なわれる。次に本発明を実施例により説明する。実施例１（6R、7S）−７−｛（Ｒ）−２−フエニル−２−
アミノアセトアミド｝−３−クロロ−１−アザ
ビシクロ〔４，２，０〕オクト−２−エン−８
−オン−２−カルボン酸の製造。 (1‐1) 菌体懸濁液の調製 (a) 光学選択的アシル化能を有する微生物の培
養種菌としてプシユードモナス・メラ）ゲナ
ム（Pseudomonas melanogenum）
ATCC17808〔菌学的記載は日本農芸化学会
誌、37、71（1963）参照〕を用いる。種培地として、ポリペプトン１％、酵母エ
キス１％、肉エキス0.5％、グルタミン酸ナ
トリウム0.5％、食塩0.25％を含む水溶液を
5N−NaOHでPH7.0に調整した溶液を用い
た。種菌１白金耳を50mlの太型試験管中の10
mlの種培地に植菌し、30℃で24時間振とう培
養した。この種培地の全量を、２のひだ付
エルレンマイヤーフラスコ中に入れた本培地
300mlに植菌し、30℃で振とう培養する。本醗酵培地は種培地と同一組成のものを用
いた。 (b) 菌体懸濁液の調製上記本培養24時間後に、醗酵液から遠心分
離により菌体をとりだし、0.9％食塩水50ml
で２回洗浄する。この菌体を1/30Ｍ燐酸バツ
フアー（PH6.5）中に懸濁する。菌体濃度は
20mg／mlで、菌体重量は乾燥菌体換算であ
る。 (1‐2) 基質溶液の調製後記参考例３の如くに得られる（±）−シス
−７−アミノ−３−クロロ−１−アザビシクロ
〔４，２，０〕オクト−２−エン−８−オン−
２−カルボン酸・トリフロロ酢酸塩200mgと、
Ｄ−フエニルグリシンメチルエステル塩酸塩
800mgを1/30Ｍ燐酸カリウム緩衝液（PH6.5）９
mlに加える。5N−KOHを微量ずつ添加し、次
いでPHを再び6.5に調整すると前記２化合物は
溶解する。最後に脱イオン水を添加して全容を
10mlに調整する。 (1‐3) 酵素反応前記菌体懸濁液10mlを上記基質溶液10mlに加
え、30℃で２時間酵素反応を行なう。反応は高
速液体クロマト法により追跡する。装置は日本
分光(株)製、高速液体クロマトグラフ装置TRI
ROTARにガスクロ工業(株)社製のプレパツクカ
ラムNucleosil 10C 18を装着して用いる。溶
出液として７％メタノール含有0.2Mリン酸−
カリ水溶液を用いる。反応時間２時間で収率は最高である。 (1‐4) 目的物の単離精製反応終了後、反応液から遠心分離によつて菌
体を除き減圧濃縮後、ダイヤイオンHP−10
〔三菱化成(株)製〕100mlを充填したカラム（直径
1.6cm、樹脂高50cm）にチヤージする。脱イオ
ン水200mlで洗つた後溶出は25％メタノール水
溶液で行なつた。目的物は通液量200mlから260
mlのフラクシヨンに溶出された。このフラクシ
ヨンを５mlに減圧濃縮し、セフアデツクス
LH20〔フアーマシアフアインケミカル社
製〕130mlを充填したカラム（直径1.6cm樹脂高
64.5cm）にチヤージし、溶出は水−メタノール
（１：１容量比）混合液で行なう、通液量55ml
から75mlのフラクシヨンを集め、減圧濃縮して
メタノールを除き、次いで残液を凍結乾燥して
白色粉末78mgを得る。このものの物性値は以下
の通りで後記抗菌活性のデータ等を参照して表
記化合物と同定した。〔α〕²¹゜_D＝＋34.0゜（Ｃ＝0.35、H₂O）融点300℃以上（褐変） IRν^KBr _nax（cm^-1）：1770、1700、1620 NMR（100M D₂O−DSS）δ：7.51（5H、ｓ）、
5.36（1H、ｄ、Ｊ＝4.6Hz）、5.19（1H、ｓ）、
3.83−4.00（1H、ｍ）、2.41−2.56（2H、ｍ）、
1.49−1.76（1H、ｍ）、1.14−1.45（1H、ｍ）、実施例２（6R、7S）−７−〔（Ｒ）−２−ｐ−ヒドロキシ
フエニル−２−アミノアセトアミド〕−３−ク
ロロ−１−アザビシクロ〔４，２，０〕オクト
−２−エン−８−オン−２−カルボン酸の製
造。 (2‐1) 菌体懸濁液の調製種菌としてキサントモナス・シトリ
（Xanthomonas citri）IFO3835〔菌株の菌学的
記載はBergey´s Mannual of Determinative
Bacteriology 、P156（1948）参照〕を用い
る他は実施例（１−１）と同様に行なつて調製
する。 (2‐2) 基質溶液の調製後記参考例３と同様にして得られる（±）−
シス−7β−アミノ−３−クロロ−１−アザビ
シクロ〔４，２，０〕オクト−２−エン−８−
オン−２−カルボン酸のトリフルオロ酢酸塩
200mgとＤ−ｐ−ヒドロキシフエニルグリシン、
メチルエステル塩酸塩800mgを1/30燐酸カリウ
ム緩衝液（PH6.5）９mlに加える。5N−KOH
を微量ずつ添加し、次いでPHを再び6.5に調整
すると前記化合物は溶解する。最後に脱イオン
水を添加して全量を10mlに調整する。 (2‐3) 酵素反応および(2‐4) 目的物の単離精製反応終了後、反応液から遠心分離によつて菌
体を除き減圧濃縮後、ダイヤイオンHP・
20AG100〜200メツシユ〔三菱化成(株)製〕100
mlを充填したカラム（直径1.6cm樹脂高50cm）
にチヤージする。脱イオン水150ml、10％メタ
ノール水溶液150mlをそれぞれ通液した後、20
％メタノール水溶液で目的物を溶出した。20％
メタノール水溶液の通液量210mlから750mlのフ
ラクシヨンを集めて３mlに減圧濃縮した後、セ
フアデツクスLH20（フアーマシアフアイン
ケミカル社製）43mlを充填したカラム（直径
0.88cm樹脂高70cm）にチヤージし溶出は水−メ
タノール（１：１、容量比）混合液で行なう。
通液量28mlから34mlのフラクシヨンを集め、減
圧濃縮してメタノールを除き、次いで残液を凍
結乾燥して白色粉末47mgを得た。このものの物
性値は以下の通りで表記化合物と同定した。〔α〕²⁰゜_D＝＋44.0゜（Ｃ＝0.25、1M燐酸緩衝液、
PH7.0） IRν^KBr _nax（cm^-1）：1765、1695、1615 NMR（100M D₂O−DSS）δ：7.36（2H、ｄ、
Ｊ＝8.8Hz）、6.96（2H、ｄ、Ｊ＝8.8Hz）、5.36
（1H、ｄ、Ｊ＝4.6Hz）、5.11（1H、ｓ）、3.81
−4.00（1H、ｍ）、2.42−2.58（2H、ｍ）、1.59
−1.77（1H、ｍ）、1.17−1.48（1H、ｍ）

【表】実施例３（6R、7S）７−（Ｒ）−フエニルグリシンアミ
ド−３−クロロ−１−アザビシクロ〔４，２，
０〕オクト−２−エン−８−オン−２−カルボ
ン酸の製法（別法） (1‐1) 菌体懸濁液の調製 (a) 光学選択的アシル化能を有する微生物の培
養種菌としてプシユードモナス・メラノゲナ
ム（Pseudomonas melanogenum）
ATCC17808〔菌学的記載は日本農芸化学会
誌、37、71（1963）参照〕を用いる。種培地として、ポリペプトン１％、酵母エ
キス１％、肉エキス0.5％、グルタミン酸ナ
トリウム0.5％、食塩0.25％を含む水溶液を
5N−NaOHでPH7.0に調整した溶液を用い
た。種菌１白金耳を50mlの太型試験管中の10
mlの種培地に植菌し、30℃で24時間振とう培
養した。この種培地の全量を、２のひだ付
エルレンマイヤーフラスコ中に入れた本培地
300mlに植菌し、30℃で振とう培養する。本醗酵培地は種培地と同一組成のものを用
いた。 (b) 菌体懸濁液の調製上記本培養24時間後に、醗酵液から遠心分
離により菌体をとりだし、0.9％食塩水50ml
で２回洗浄する。この菌体を1/30Ｍ燐酸バツ
フアー（PH6.5）中に懸濁する。菌体濃度は
20mg／mlで、菌体重量は乾燥菌体換算であ
る。 (1‐2) 基質溶液の調製後記参考例７の如くに得られる（−）シス−
７−アミノ−３−クロロ−１−アザビシクロ
〔４，２，０〕オクト−２−エン−８−オン−
２−カルボン酸（原料化合物ａ）100mgと、Ｄ
−フエニルグリシンメチルエステル塩酸塩（原
料化合物ｂ）800mgを1/30Ｍ燐酸カリウム緩衝
液（PH6.5）９mlに加える。5N−KOHを微量
ずつ添加し、次いでPHを再び6.5に調整すると
前記２化合物は溶解する。最後に脱イオン水を
添加して全容を10mlに調整する。 (1‐3) 酵素反応前記菌体懸濁液10mlを上記基質溶液10mlに加
え、30℃で１時間半酵素反応を行なう。反応は
高速液体クロマト法により追跡する。装置は日
本分光(株)製、高速液体クロマトグラフ装置TRI
ROTARにガスクロ工業(株)社製のプレパツクカ
ラムNucleosil 10C 18を装着して用いる。溶
出液として７％メタノール含有0.2Mリン酸−
カリ水溶液を用いる。反応時間１時間半で収率
は最高であり、原料化合物ａに対する反応収率
は90％に達した。 (1‐4) 目的物の単離精製反応終了後、反応液から遠心分離によつて菌
体を除き、減圧濃縮後、ダイヤイオンHP−10
〔三菱化成(株)製〕100mlを充填したカラム（直径
1.6cm樹脂高50cm）にチヤージする。脱イオン
水200mlを通した後、25％メタノール水溶液を
通すと目的物は溶出された。次いで目的物を含むフラクシヨンを減圧濃縮
して５mlとしセフアデツクスLH20〔フアーマ
シアフアインケミカル社製〕130mlを充填
したカラム（直径1.6cm樹脂高64.5cm）にチヤ
ージし、水−メタノール（50：50）混合液で溶
出した。通液量55mlから75mlに目的物が溶出さ
れたのでこれを減圧濃縮し、凍結乾燥して白色
粉末12.8mgを得る。このものの物性値は実施例
１で得られる化合物および参考例５の低極性異
性体とそれぞれ一致した。実施例４（6R、7S）−７−〔（Ｒ）−２−フエニル−２−
アミノアセトアミド〕−３−クロロ−１−アザ
ビシクロ〔４，２，０〕オクト−２−エン−８
−オン−２−カルボン酸の製造（別法）種菌としてクルイベラ・シトロフイラ
（Kluyvera citrophila）ATCC21285〔本菌株の菌
学的記載はJ.General Applied Microbiology３
27〜31（1957）参照〕を用いる他は実施例（１−
１）と同様に培養を行なう。本培養24時間後に醗
酵液から遠心分離により菌体をとり出し、実施例
（１−１）と同様にして菌体を処理し菌体懸濁液
を得る。実施例（１−２）と同様にして基質溶液
を調製し実施例（１−３）と同様にして酵素反応
を行なう。但し反応時間は20時間とした。実施例
（１−４）と同様にしてHP10〔三菱化成(株)製〕お
よびセフアデツクスLH20〔フアーマシアフア
インケミカル社製〕のカラムクロマトにより精
製を行ない、目的物を含むフラクシヨンを凍結乾
燥して86mgの白色粉末を得た。このものの物性値
はすべて実施例１で得られた化合物と一致した。参考例１（±）シス−７−アジド−３−クロロ−２−ｔ
−ブチルオキシカルボニル−１−アザビシクロ
〔４，２，０〕オクト−２−エン−８−オンの
製造：本化合物は以下の(a)、(b)、(c)、(d)の工程を経て
製造される。 (a) （±）シス−７−アジド−３−フエニルチオ
−１−アザビシクロ〔４，２，０〕−オクタン
−８−オン−２−カルボン酸、第三ブチルエス
テルの製造：特開昭54−128591号公報に開示されたと同様
の手法により製造された（±）シス−７−アジ
ド−１−アザビシクロ〔４，２，０〕オクト−
２−エン−８−オン−２−カルボン酸、第三ブ
チルエステル528mg（２ｍ mole）を無水ベン
ゼン15mlに溶解しこれにチオフエノール0.2ml
（２ｍ mole）およびピペリジン0.2ml（２ｍ
mole）を添加し、室温で２時間撹拌する。反応後反応液を10％クエン酸、飽和食塩水で
洗浄後無水硫酸ナトリウムで乾燥する。減圧下
溶媒を留去し、得られる油状残渣をシリカゲル
カラムクロマトグラフイー〔30ｇ、溶出溶媒
酢酸エチル−ｎ−ヘキサン（１：４）〕に付し
精製すると目的化合物を720mg（96.3％）を得
る。融点77.5−78.0℃ IRν^KBr _nax（cm^-1）：2110、1765、1745 NMR（CDCl₃）δ：7.28−7.60（5H、ｍ）、4.78
（1H、ｄ、Ｊ＝５Hz）、4.33（1H、ｓ）、3.78
−3.98（1H、ｍ）、3.81（1H、ｓ）、1.50−2.34
（4H、ｍ）、1.42（9H、ｓ） (b) （±）シス−７−アジド−３−フエニルスル
フイニル−１−アザビシクロ〔４，２，０〕オ
クタン−８−オン−２−カルボン酸、第三ブチ
ルエステルの製造：前記参考例１−(a)で得られる３−フエニルチ
オ体480mg（1.28ｍ mole）を50mlの無水クロ
ロホルムに溶解し、氷冷下ｍ−クロロ過安息香
酸240mg（1.41ｍ mole）を添加する。撹拌し
ながら氷冷下30分反応後、反応液を飽和重曹
水、飽和食塩水で洗浄し次いで無水硫酸ナトリ
ウムで乾燥する。減圧下に溶媒を留去すると目
的物500mg（99.9％）が得られる。融点95.5−96.5℃ IRν^KBr _nax（cm^-1）：2120、2100、1780、1735、1035 NMR（CDCl₃）δ：7.55−7.91（5H、ｍ）、4.87
（1H、ｄ、Ｊ＝4.6Hz）、4.05（1H、ｓ）、3.90
−4.10（1H、ｍ）、3.10（1H、ｓ）、1.70−2.84
（4H、ｍ）、1.30（9H、ｓ） (c) （±）シス−７−アジド−３−クロロ−３−
フエニルスルフイニル−１−アザビシクロ
〔４，２，０〕−オクタン−８−オン−２−カル
ボン酸、第三ブチルエステルの製造：前記参考例１−(b)で得られるスルホキシド化
合物109mgを無水塩化メチレン１mgに溶解し、
酸化カルシウム23.5mg（0.42ｍ mole）を添加
する。氷冷下塩化スルフイニル27μ（0.34ｍ
mole）を添加する。撹拌しつつ氷冷下１時
間反応後、反応液を10％クエン酸、飽和重曹
水、次いで飽和食塩水で洗浄し、次いで無水硫
酸ナトリウムで乾燥する。溶媒を減圧留去し、
得られる油状残渣をシリカゲルクロマトグラフ
イー（シリカゲル５ｇ溶出溶媒酢酸エチル−ｎ
−ヘキサン＝１：５）に付し精製すると油状目
的物が66.5mg（56.1％）得られる。 IRν^CHCl _3nax（cm^-1）：2120、1770、1735、1055 NMR（CDCl₃）δ：7.53−8.00（5H、ｍ）、4.90
（1H、ｄ、Ｊ＝５Hz）、4.43（1H、ｓ）、4.15
−4.35（1H、ｍ）、1.83−2.85（4H、ｍ）、1.38
（9H、ｓ）ｄ（±）シス−７−アジド−３−クロロ−１−
アザビシクロ〔４，２，０〕オクト−２−エン
−８−オン−２−カルボン酸、第三ブチルエス
テルの製造：前記参考例１−(c)と同様にして得られる３−
クロロ−３−フエニルスルフイニル化合物1.3
ｇ（3.06ｍ mole）を四塩化炭素100ml中で６
時間加熱還流する。反応終了後減圧下溶媒を留
去して得られる残渣をシリカゲルクロマトグラ
フイー（シリカゲル100ｇ、溶出溶媒：酢酸エ
チル：ｎ−ヘキサン＝１：５）に付し精製する
と目的物が596mg（65.2％）得られる。融点96−97℃ IRν^KBr _nax（cm^-1）：2120、1765、1735、1630 PMR（CDCl₃）δ：4.93（1H、ｄ、Ｊ＝５Hz）、
3.72−3.92（1H、ｍ）、2.56−2.70（2H、ｍ）、
1.86−2.32（2H、ｍ）、1.55（9H、ｓ） CMR（CDCl₃）δ：127.7、125.0 参考例２（±）シス−７−アミノ−３−クロロ−１−ア
ザビシクロ〔４，２，０〕オクト−２−エン−
８−オン−２−カルボン酸、第三ブチルエステ
ルの製造：参考例１−(d)で得られるアジド体350mg（1.17
ｍ mole）をエタノール20mlに溶解し、1N−塩
酸1.2mlおよび10％Pd−C70mgを添加する。常温
常圧で水素ガスを３時間通気後パラジウム炭素を
去し、液を減圧下濃縮し得られる固体を水に
溶解しエーテル洗浄する。水層に重曹を添加して
弱アルカリ性とした後、酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル層を飽和食塩水で洗浄後無水硫酸ナ
トリウムで乾燥する。溶媒を十分に減圧留去し目
的物を218.4mg（68.4％）粉末状として得る。融点102.5−104.5℃ IRν^KBr _nax（cm^-1）：1770、1720、1620 NMR（CDCl₃）δ：4.43（1H、ｄ、Ｊ＝５Hz）、
3.52−3.90（1H、ｍ）、2.52−2.72（2H、ｍ）、
2.22（2H、br）、1.87−2.17（2H、ｍ）、1.55
（9H、ｓ）参考例３（±）シス−７−アミノ−３−クロロ−１−ア
ザビシクロ〔４，２，０〕オクト−２−エン−
８−オン−２−カルボン酸・トリフロロ酢酸塩
の製造：参考例２で得られるアミノ−エステル体102.2
mg（0.31ｍ mole）に氷冷下トリフロロ酢酸１
mlを添加し、室温で30分撹拌する。減圧下溶媒を
留去し得られる油状残渣にエーテルを添加し粉末
状とした後、吸引取する。更に真空乾燥し目的物を75.5mg（60.9％）得
る。融点208−220℃（分解） IRν^KBr _nax（cm^-1）：1795、1630 参考例４（±）−シス−７−（２−フエニル−２−ｔ−ブ
チルオキシカルボニルアミノアセトアミド）−
３−クロロ−１−アザビシクロ〔４，２，０〕
オクト−２−エン−８−オン−２−カルボン
酸、第三ブチルエステルの製造：参考例２に従い合成される（±）−シス−７−
アミノ−３−クロロ−１−アザビシクロ〔４，
２，０〕オクト−２−エン−８−オン−２−カル
ボン酸、第三ブチルエステル150mg（0.55ｍ
mole）を無水塩化メチレン３mlに溶かす。Ｎ−
ｔ−ブチルオキシカルボニル−（Ｒ）−フエニルグ
リシン166mg（0.66ｍ mole）を５mlの無水テト
ラヒドロフランに溶かし−15〜−10℃に冷却し、
1N−Ｎ−メチルモルホリンのテトラヒドロフラ
ン溶液0.66mlおよび1Nクロル蟻酸イソブチルの
テトラヒドロフラン溶液0.66mlを滴下し、同温度
で20分間撹拌する。この温度に維持しながら上記
で調製したアミン溶液を滴下した後徐々に室温に
戻し、さらに一夜室温で撹拌した。反応液に塩化
メチレン10mlを加えた後10％クエン酸、飽和重曹
水、飽和食塩水の順で洗い、無水硫酸ナトリウム
で乾燥する。減圧濃縮しシリカゲルクロマトグラ
フイーで精製し（シリカゲル：和光純薬社製Ｃ−
200、20ｇ、溶媒酢酸エチル：ｎ−ヘキサン＝
１：５容量比、以下同じ）目的物（ジアステレオ
異性体混合物））124mg（収率44.6％）を得る。このものの物性値は以下のとおりである。 IRν^KBr _nax（cm^-1）：1780、1730、1680、1655、1550 NMR（CDCl₃）δ：7.34（5/2Ｈ、ｓ）、7.31（5/2
Ｈ、ｓ）、6.93（1H、ｍ）、5.63（1H、ｍ）、5.30
（1/2Ｈ、dd、Ｊ＝5.4、6.8Hz）、5.11〜5.22（3/2
Ｈ、ｍ）、3.76〜3.91（1H、ｍ）、2.33〜2.66
（2H、ｍ）、1.52（9H、ｓ）、1.41（9H、ｓ）、
0.92〜1.97（2H、ｍ）参考例５（6R、7S）７−（Ｒ）−フエニルグリシンアミ
ド−３−クロロ−１−アザビシクロ〔４，２，
０〕オクト−２−エン−８−オン−２−カルボ
ン酸(A)および（6S、7R）７−（Ｒ）−フエニル
グリシンアミド−３−クロロ−１−アザビシク
ロ〔４，２，０〕オクト−２−エン−８−オン
−２−カルボン酸(B)の製造：

【式】

【式】参考例４と同様の方法に従い合成した（±）−
シス−７−（２−フエニル−２−ｔ−ブチルオキ
シカルボニルアミノアセトアミド）−３−クロロ
−１−アザビシクロ〔４，２，０〕オクト−２−
エン−８−オン−２−カルボン酸、第三ブチルエ
ステル128.4mg（0.25ｍ mloe）に氷冷下塩化メ
チレン１mlおよびトリフロロ酢酸１mlを加え、同
温度で1.5時間撹拌する。減圧下に溶媒を留去し
得られる油状物質を高速液体クロマトグラフイー
に付し〔カラム：マイクロボンダパツクＣ−18
（ウオーターズ社製）、溶媒７％メタノール0.2N
KH₂PO₄〕ジアステレオ異性体を分離する。各々分離した溶出分画を減圧濃縮しHP−10
（三菱化成社製）レジン10ml（溶媒メタノー
ル：水＝１：１）で脱塩処理し、高極性異性体(B)
9.4mgおよび低極性異性体(A)7.6mg（計収率19.1％）
を得た。高極性異性体(B) 〔α〕²¹゜_D：−75.8゜（ｃ＝0.4、H₂O）融点300℃以上（褐変） IRν^KBr _nax（cm^-1）：1765、1700、1550 NMR（D₂O）δ：7.49（5H、ｓ）、5.16（1H、ｄ、
Ｊ＝4.7Hz）、5.05（1H、ｓ）、3.78−4.03（1H、
ｍ）、2.53−2.67（2H、ｍ）、1.26−2.09（2H、
ｍ）低極性異性体(A) 〔α〕²¹゜_D：＋34.0（ｃ＝0.35、H₂O）融点300℃以上（褐変） IRν^KBr _nax（cm^-1）：1770、1700、1620 NMR（D₂O）δ：7.51（5H、ｓ）、5.36（1H、ｄ、
Ｊ＝4.6Hz）、5.19（1H、ｓ）、3.83−4.00（1H、
ｍ）、2.41−2.56（2H、ｍ）、1.49−1.76（1H、
ｍ）、1.14−1.45（1H、ｍ）後記の如く、低極性異性体(A)に強い抗菌作用が
みられることからこの異性体(A)の絶対配位を
（6R、7S）と決めた。参考例６（±）−シス−７−フエニルアセトアミド−３
−クロロ−１−アザビシクロ〔４，２，０〕オ
クト−２−エン−８−オン−２−カルボン酸の
製造：参考例３の方法に従い得られる（±）−シス−
７−アミノ−３−クロロ−１−アザビシクロ
〔４，２，０〕オクト−２−エン−８−オン−２
−カルボン酸・トリフロロ酢酸塩150mg（0.45ｍ
mole）を水２mlおよびアセトン２mlの混合溶
媒に懸濁させ、これに重曹134mg（1.5ｍ mole）
を加えて均一溶液とする。これに氷冷下フエニル
アセチルクロリド84.2mg（0.54ｍ mole）を0.5
mlのアセトンにとかして１時間かけて滴下する。
さらに３時間撹拌後、反応液を1N塩酸でPH２と
し２mlの酢酸エチルで５回抽出し、これを減圧濃
縮、乾燥して80mg（55.0％）の目的物を得る。 IRν^KBr _nax（cm^-1）：1790、1705、1630、1560 NMR（CD₃OD）δ：7.29（5H、ｓ）、5.36（1H、
ｄ、Ｊ＝５Hz）、3.79−3.99（1H、ｍ）、2.56−
2.75（2H、ｍ）、1.17−2.02（2H、ｍ）参考例７（−）−シス−７−アミノ−３−クロロ−１−
アザビシクロ〔４，２，０〕オクト−２−エン
−８−オン−２−カルボン酸｛（−）−７−アミ
ノ−２−カルボキシ−３−クロロ−１−アザビ
シクロ〔４，２，０〕オクト−２−エン−８−
オン｝の製造法。１−１菌体懸濁液の調製 (イ) 光学選択的脱アシル化能を有する微生物の
培養種菌としてクルイベラ・シトロフイラ
（Kluyvera citrophila）ATCC21285〔菌学的
記載はJ.General Applied Microbiology３、
28−31（1957）参照〕を用いる。種培地として、ポリペプトン１％、酵母エ
キス１％、肉エキス0.5％、グルタミン酸ナ
トリウム0.5％、食塩0.25％を含む水溶液を
5N−NaOHでPH7.0に調整した溶液を用い
た。種菌１白金耳を50mlの太型試験管中の10
mlの種培地に植菌し、30℃で24時間振とう培
養した。この種培地の全量を、２のひだ付
エルレンマイヤーフラスコ中に入れた本培地
300mlに植菌し、30℃で振とう培養する。本培養培地は種培地と同一組成のものを用
いた。 (ロ) 菌体懸濁液の調製上記本培養24時間後に、培養液から遠心分
離により菌体をとりだし、0.9％食塩水50ml
で２回洗浄する。この菌体を1/30Ｍ燐酸バツ
フアー中（PH8.0）に懸濁する。菌体濃度は
40mg／mlで、菌体重量は乾燥菌体換算であ
る。１−２基質溶液の調製前記参考例６と同様に作成した（±）−シス
−７−フエニルアセトアミド−３−クロロ−１
−アザビシクロ〔４，２，０〕−オクト−２−
エン−８−オン−２−カルボン酸200mgを1/3Ｍ
リン酸緩衝液（PH8.0）９mlに加える。この時
該化合物は溶解しないが2N−NaOHを微量ず
つ添加し、次いでPHを再び8.0に調整すると溶
解した。最後に脱イオン水を添加して全量を10
mlに調節した。１−３酵素反応前記菌体懸濁液10mlを基質溶液10mlに加え、
40℃で80分酵素反応を行なう。反応の経時変化
を第１表に示す。

【表】１−４目的物の単離精製反応終了後遠心分離によつて反応液から菌体
を除き、ついで減圧濃縮により５mlにする。こ
れを100mlのダイヤイオンHP−10（三菱化成社
製）を充填したカラム（カラム径1.75cm 樹脂
高42cm）にチヤージする。溶出は脱イオン水で
行なつたところ90mlから120mlのフラクシヨン
に目的物が溶出された。このフラクシヨンを合
せ減圧濃縮して２mlとした後、1N塩酸でPHを
3.5に下げると結晶が析出した。この結晶を
別し、少量のメタノールで洗浄した後乾燥し、
38mgの白色粉末を得た。このものの物性値は以
下の通りで表記化合物と同定した。 IR（KBr）ν_cn-1 ^max ：3200、1800、1790（sh）、
1640（sh）、1630、1555 NMR（100M D₂O−DSS）δ：4.47（1H、ｄ、
Ｊ＝5.1Hz）、3.88（1H、ｍ）、2.64（2H、ｍ）、
1.93（2H、ｍ）旋光度：〔α〕²⁵ _D＝−27゜（ｃ＝0.24、1M燐酸緩衝
液、PH7.0）

Claims

【特許請求の範囲】１プシユードモナス属、キサントモナス属また
はクルイベラ属に属し、一般式（）（式中、R₁は置換もしくは非置換の不飽和炭素
６員環残基を表わす）で表わされるα，α−ジ置
換カルボン酸類またはその反応性誘導体と一般式
（）（式中、R₂は水素またはカルボン酸保護基を表
わし、Halはハロゲン原子を表わし、６位、７位
の水素はシスの関係にある。）で表わされるセフ
アロスポリン類縁体とから一般式（−１）で表わされる化合物を生成する能力を有する微生
物、該微生物の培養物およびまたは該培養物の処
理物の存在下に、一般式（）で表わされるα，
α−ジ置換カルボン酸類またはその反応性誘導体
と一般式（）で表わされる光学不活性なセフア
ロスポリン類縁体とを反応させることを特徴とす
る一般式（−１）で表わされるセフアロスポリ
ン類縁体またはその塩の製造法。