KR900002042B1

KR900002042B1 - 3-치환된 세팔로스포린의 제조방법

Info

Publication number: KR900002042B1
Application number: KR1019870001585A
Authority: KR
Inventors: 에드워드 발드윈 잭
Original assignee: 더 챈슬러, 매스터즈 앤드 스칼라스 오브 더 유니버서티 오브 옥스포드; 제이.클라크
Priority date: 1986-11-17
Filing date: 1987-02-25
Publication date: 1990-03-31
Also published as: HUT43644A; ES2042549T3; EP0268343A2; GR3005189T3; DE3779403D1; ATE76662T1; EP0268343A3; KR880006250A; EP0268343B1; IL81555A0; JPS63129995A

Abstract

내용 없음.

Description

3-치환된 세팔로스포린의 제조방법

본 발명은 3-치환된 세팔로스포린의 제조방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 익스판다제(expandase)효소를 사용하여 2α-치환된 페남을 3-치환된-3-세팜-4-카복실산으로 전환시키는 효소적 방법에 관한 것이다.

데아세톡시세팔로스포린 C합성 효소로도 알려진 익스판다제 효소는 세팔로스포륨 아크레모늄(Cephalosporium acremonium) 및 기타 유기체에 의한 세팔로스포린 C의 생합성에 관계한다. 익스판다제 효소는 하기의 생합성 경로에 나타낸 바와 같이 페니실린 N을 데아세톡시 세팔로스포린 C로 전환시킨다.

익스판다제 효소는 문헌 [참조 : Scheidegger, A., et al., J.Antibiotics, 37, 522-531(1984) 및 Kupka, J., et al., FEMS Microbiology Letters, 16(1983) pp.1-6]에 분리 및 연구되어 있다.

본 발명은 페니실린 N의 α-아미노아디포일 그룹을 m-카복시페닐아세틸 그룹으로 치환하여 익스판다제 효소에 의해 세팔로스포린으로 유효하게 전환되는 페남 기질을 제공할 수 있다는 발견에 근거하고 있다. 따라서, 6β-(3-카복시페닐아세틸아미노)-2,2-디메틸페남-3-카복실산은 7β-(3-카복시페닐아세틸아미노)-3-메틸-3-세팜-4-카복실산으로 유효하게 전환된다. 또한, 아디포일 그룹도 마찬가지로 페니실린 N의 α-아미노아디포일 그룹을 치환하여 익스판다제 효소에 의해 유효하게 전환되는 페남 기질을 제공할 수 있다.

상기 사실과는 대조적으로, 페닐아세틸 그룹은 페니실린 N의 α-아미노아디포일 그룹의 치환체로서 작용하지 않는 것으로 밝혀졌다. 6-APA의 6-아미노 그룹에 부착되었을때 익스판다제 효소용 페남 기질을 형성하지 못하는 기타 아실 그룹으로는 페녹시아세틸, δ-(L-α-아미노아디포일) 및 5-아미노발레릴이 있다.

본 발명에 따라, 하기 일반식(2)의 2β-메틸-2α-치환된 페남-3-카복실산을 2가 철이온, 아스코르브산염 및 α-케토글루타레이트의 존재하에 온도 약 20℃ 내지 약 40℃ 및 pH 약 6 내지 약 9의 수성 매질 속에서 데아세톡시세팔로스포린 C합성 효소와 접촉시킴을 포함하여 하기 일반식(1)의 3-치환된-3-세펨-4-카복실산을 제조하는 방법이 제공되다.

상기식에서, R은 3-카복시페닐아세틸 또는 아디포일이고, R₁은 C₁-C₃알킬, C₁-C₃알콕시, C₂-C₄알켄일 또는 알렌일이다.

본 방법은 산소의 존재하에 수행한다. 소규모의 실험에 있어서는, 개구반응 용기(open reaction vessel)를 사용하여 산소를 충분히 공급한다. 대규모의 실험, 특히 과량의 효소를 사용할 경우에는 공기 또는 산소를 배양 혼합물 속으로 통과시킴으로써 산소를 공급할 수 있다. 배양 혼합물은 공정 과정 도중에 교반 또는 진탕으로 잘 휘저을 수 있다.

본 방법에서 사용하는 익스판다제 효소는 바람직하게는 정제시키지만, 부분적으로 정제된 효소의 세포-유리 추출물로부터 수득한 반정제 효소도 사용할 수 있다. 익스판다제 효소는 다수의 미생물, 예를 들면, 세팔로스포륨 아크레모늄, 스트렙토마이세스 클라불리제루스(Streptomyces clavuligerus) 및 스트렙토마이세스리프마니(Stre ptomyces lipmanii)로부터 수득할 수 있다. 적합한 효소의 공급원은 세팔로스포린 C의 높은 역가를 제공하는 C. 아크레모늄의 균주(예 : ATCC 48272 및 ATCC 36225)이다. 효소의 세포-유리 추출물은 문헌[참조 : A.Scheidegger, et al., Supra.]에 기술된 바와 같은 공지의 방법으로 수득한다. 바람직하게는, 예를 들면, 부분적으로 정제된 세포-유리 추출물로부터 효소의 크로마토그라피 분리에 의해 수득되는 거의 순수 형태로 사용된다.

익스판다제 효소는 페니실린을 세팔로스포린으로 전환시키는데 필요한 양보다 훨씬 과량으로 사용하는 것이 바람직하다.

공지된 바와 같이, 익스판다제 효소에 의한 페니실린 N의 전환에 있어서, 최고의 효소 활성을 나타내기 위해 2가 철이온 및 아스코르브산 염과 같은 조인자 및 조기질 α-케토글루타레이트를 사용할 필요가 있다. 따라서, 이들 조인자가 본 방법에 사용된다. 효소를 활성화 시키는데 필요한 최소량의 2가 철이온이 사용된다. 2가 철 이온의 농도는 통상적으로 약 25μM 내지 약 0.2mM이다. 통상적으로, 효소의 순도가 높을수록 효소 최대 효율에 필요한 2가 철이온의 양은 더 적어진다. 2가 철이온의 공급원으로는, 예를 들면, 염화제 1철, 황산제 1철 또는 탄산제 1철과 같은 염이 있다. 황산제 1철이 본 방법에 사용되는 바람직한 염이다.

조인자 아스코르브산염으로는 바람직하게는 L-아스코르브산 또는 나트륨 또는 칼륨 L-아스코르브산염이 있고, 통상적으로 2가 철 이온과 동일한 농도로 사용하지만, 더 높은 농도로 사용할 수 있다.

조 기질 α-케토글루타레이트는 바람직하게는 1나트륨 또는 1칼륨염의 형태이고 약 0.5mM 내지 약 2mM, 바람직하게는 약 1mM의 농도로 존재하는 것이 바람직하다.

상기 일반식(2)의 기질 페니실린은 본 방법에서는 통상적으로 약 0.1mM 내지 약 5mM의 농도로 사용된다.

본 방법은 pH 약 6내지 약 9, 바람직하게는 약 7.5 내지 약 8에서 수행한다. pH는 완충액, 예를 들면, 탄산암모늄, 트리스 완충액(Tris buffer), 또는 MOPS완충액으로 유지시킨다. 바람직한 완충액은 트리스-HCl(pH 7.5)이다.

본 방법은 바람직하게는 약 25℃ 내지 35℃온도에서 수행한다. 특히 바람직한 온도는 약 30℃이다.

본 방법에 있어서, 환원제, 예를 들면, 디티오트레이톨(DTT), 디티오에리트리톨 또는 β-머캅토에탄올을 임의로 사용한다. 상기 환원제는 2가 철이온의 산화를 억제하고 효소내에 존재하는 설프하이드릴 그룹의 산화를 억제하여 효소의 활성을 유지시킨다.

일반식(2)의 2α-치환된 페남 기질의 실시예를 하기 표 1에 나타낸다.

[표 1]

본 방법에서 바람직한 기질은 R이 3-카복시페닐 아세틸 그룹인 일반식(2)로 나타내어진다. 보다 바람직한 기질 그룹은 R이 3-카복시페닐아세틸 그룹이고 R₁이 메틸, 메톡시 또는 비닐인 것이다.

페남 기질은 하기의 일반도식에 나타낸 바와 같이 2α-치환된-6β-아미노페남-3-카복실산을 3-카복시-보호된-페닐아세트산 또는 모노-카복시-보호된 아디프산으로 아실화시킴으로써 제조할 수 있다.

N-아실화는 페니실린의 제조에 통상적으로 사용되는 통상의 커플링 방법으로 수행할 수 있다. 예를 들면, 카복시-보호된 산 RCO₂H를 유리 카복시 그룹의 활성 유도체, 예를 들면, 산 할라이드, 산 아지드 또는 활성 에스테르로 전환시키고 활성 유도체를 사용하여 아실화시킨다. 바람직하게는, 아실화 과정 동안 페니실린 핵의 3-카복시 그룹을 보호시킨다. 아실화가 완결된 후에 카복시 그룹을 탈보호 시켜 목적하는 기질을 수득한다. 예를 들면, 3-(4-니트로벤질옥시카보닐)페닐아세트산을 옥살일 클로라이드를 사용하여 산 클로라이드로 전환시키고 산 클로라이드를 수혼화성 유기 용매 및 수용성 산 결합제, 예를 들면, 알칼리 금속 탄산염 또는 중탄산염을 포함하는 수성 매질 속에서 사용하여 6-APA를 아실화시킨다. 마찬가지로, 모노-(보호된 카복시)아디프산, 예를 들면, 아디프산 모노 4-니트로벤질 에스테르는 보다 용이한 아실화제, 예를 들면 산할라이드로 전환되며 이것은 6β-아미노페남 핵을 아실화시키기 위해 사용된다.

2α-비닐-6β-아미노 핵도 1986년 4월 29일에 출원되어 계류중인 본 출원인의 미합중국 특허원 제856,997호에 기술된 바와 같이 수득할 수 있다. 상기 특허원에서 기술된 바와 같이, 하기 구조식의 δ-(L-α-아미노아디포일)-L-시스테인일-D-γ, δ-디데하이드로이소로이신을 2가 철이온 및 아스코르브산의 존재하에 온도 약 20℃ 내지 약 40℃ 및 pH 약 6내지 9에서 이소페니실린 N합성효소(IPNS)를 사용하여 배양시켜 6β-(L-α-아미노아디포일)-2α-비닐-2β-메틸페남-3-카복실산을 생성시킨다.

생성물 페남의 카복시 그룹은 에스테르화에 의해 보호되며 디에스테르를 탈아실화시켜 6β-아미노-2α-비닐페남 에스테르를 수득한다. 카복시-보호 에스테르 그룹은 페니실린 에스테르를 형성하기 위하여 통상적으로 사용하는 카복시-보호 에스테르 그룹, 예를 들면, t-부틸, 할로알킬(예 : 트리클로로에틸), 벤질, 치환된 벤질(예 : p-메톡시벤질 및 p-니토로벤질)일 수 있다. L-α-아미노아디포일 측쇄의 탈아실화는 공지된 방법에 따라 수행한다[참조 : 미합중국 특허 제3,499,909호 또는 R.B.Morin 등, J.Amer, Chem.Soc., 84, 3400], 기타 알겐일 유도체도 유사한 방법으로 제조할 수 있다.

하기 구조식의 6β-아미노-2α-알렌일페남 핵은 1986년 7월 28일에 출원하여 계류중인 본 출원인의 미합중국 특허원 제891,434호에서 기술한 바와같이 수행하여 수득할 수 있다.

상기 특허문헌에 기술된 방법에 따라, 하기 구조식(a)의 트리펩티드 기질을 2가 철이온, L-아스코르브산염 및 디티오트레이톨의 존재하에 pH 약 6 내지 9의 수성 매질 속에서 이소페니실린 N합성효소와 혼합시켜 하기 구조식(b)의 2α-알렌일페남을 수득한다.

이 생성물을 상술한 6β-아미노-2α-비닐페남-3-카복실산의 제조방법에 따라 N-탈아실화시켜 6β-아미노-2α-알렌일페남-3-카복실산 핵을 수득한다.

2α-(C₁-C₃알콕시)페남 핵은 본 출원인의 유럽특허원 제0174129호에 기술된 방법에 따라 유사하게 수득한다. 당해 특허문헌에 기술된 바와 같이, 하기 일반식(c)의 트리펩티드를 2가 철이온, L-아스코르브산, 디티오트레이톨, 소 간 카탈라제효소 (Catalase) 및 중탄산암모늄 완충액의 존재하에 pH 약 6 내지 약 9의 수성 매질 속에서 이소페니실린 N합성효소와 혼합시켜 하기 일반식(d)의 페남을 수득한다.

상기식에서, alk는 C₁-C₃알킬이다.

2α-알콕시페남의 N-탈아실화는 상술한 알.비.모린(R.B.Morin)의 니트로실 클로라이드 방법으로, 또한 모린(Morin) 방법에서 통상적으로 사용되는 포름산 대신에 아세트산을 사용함으로써 가장 잘 수행된다.

또한, R이 3-카복시페닐아세틸인 페남 기질[일반식(2)]은 1987년 9월 4일에 출원되어 계류중인 본 출원인의 미합중국 특허원 제903,548호에 기술된 방법에 의해 수득된다. 이 방법에 따라, 하기 일반식(e)의 N-(3-카복시페닐아세틸)-L-시스테인일-D-발린(또는 변형된 D-발린)디펩티드를 산소, 2가 철이온 및 L-아스코르브산의 존재하에 pH 약 6내지 9의 수성 매질 속에서 이소페니실린 N합성효소(IPNS)로 처리하여 하기 일반식(f)의 페니실린을 수득한다.

상기식에서, R₁또는 R₂가 메틸이면, 다른 것은 C₁-C₄알콕시, 비닐 또는 알렌일일 수 있다.

본 방법에 한 실시예에 있어서, 디티오트레이톨, 황산제 1철, L-아스코르브산, 카탈라제 효소를 포함하고 중탄산암모늄염으로 완충된 N-(3-카복시페닐아세틸-L-시스테인일-D-발린의 혼합물을 트리스-HCl완충액 중에서 이소페니실린 N합성효소로 처리하여 6β-(3-카복시페닐아세틸아미노)-2,2-디메틸페남-3-카복실산을 수득한다.

유사한 방법으로 적절히 치환된 디펩티드 기질을 사용하여, 6β-(3-카복시페닐아세틸아미노)-2α-비닐-2β-메틸페남-3-카복실산, 6β-(3-카복시페닐아세틸아미노)-2α-알렌일-2β-메틸페남-3-카복실산 및 6β-(3-카복시페닐아세틸아미노)-2α-메톡시-2β-메틸페남-3-카복실산을 수득한다.

하기표2에 본 발명의 방법에 따라 수득한 3-치환된 3-세펨-4-카복실산[일반식(1)]을 예시한다.

[표 2]

본 발명의 효소적 방법으로 수득한 세팔로스포린 생성물은 공지의 방법으로 공지된 세팔로스포린 반-합성 항생 물질로 전환시킬 수 있다. 예를 들면, 생성물의 3-카복시페닐아세틸 그룹과 아디포일 그룹을 탈아실화시켜 상응하는 3-치환된 7β-3-세펨 핵을 수득한다.

이후에 후자를 다시 아실화시켜 목적하는 7β-아실아미노 세팔로스포린을 수득한다. 전술한 내용을 하기의 일반적인 반응도식으로 나타낸다.

탈아실화와 재아실화는 일반식(1)의 유리 카복시 그룹을 보호하면서 바람직하게 수행된다. 카복시 그룹은 산성 카복시 작용기의 일시적 보호용으로 세팔로스포린 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 에스테르 그룹으로 보호 또는 차단될 수 있다. 이러한 공지된 에스테르 그룹은 페남의 카복시 작용기의 보호와 관련하여 상술한 그룹을 포함한다.

N-탈아실화는 페티그(Fechtig)등의 미합중국 특허 제3,697,515호에 기술된 방법에 따라 수행한다.

탈아실화는 디에스테르로서 세팔로스포린[일반식(1)]을 이미노 할라이드 생성제, 예를 들면, 인 할라이드(예 : 삼염화인 또는 오염화인)와 반응시켜 수행한다. 아미노 할라이드를 저급 알콜, 예를 들면, 메탄올 또는 이소부탄올로 처리하여 상응하는 이미노 에테르를 생성시킨다.

후자를 가수분해 또는 분해시켜 7β-아미노 핵 화합물을 생성시킨다. 본 방법의 한 실시예에 있어서, p-니트로벤질 7β-[3-(p-니트로벤질옥시카보닐)페닐아세틸아미노]-3-메틸-3-세펨-4-카복실레이트를 트리에틸아민의 존재하에 온도 약 5℃의 메틸렌 클로라이드 속에서 PCl₅로 처리하여 아미노 클로라이드를 생성시킨다. 혼합물을 냉각시킨 메틸알콜 또는 이소부탄올로 처리하여 이미노 에테르를 생성시킨다. 이후에 반응 혼합물을 실온으로 가온하고, 물을 가하여 7β-아미노 핵 에스테르를 생성시킨다. 핵을 통상적인 방법에 따라 염산염으로서 분리할 수 있다.

P-니트로벤질 7β-아미노-3-메틸-3-세펨-4-카복실레이트를 통상적인 제조방법으로 재아실화시켜 목적하는 7β-아실아미노 반-합성 세팔로스포린 항생물질을 수득한다. 예를 들면, 핵을 에틸 클로로포르메이트 및 에틸아세토아세테이트로 생성시킨 하기 구조식(g)의 엔아민-보호된 D-페닐글리신의 무수물과 혼합하여 아실화시켜 하기 구조식(h)의 세팔렉신 p-니트로벤질 에스테르의 아미노-보호된 유도체를 생성시킨다.

상기 유도체를 아연과 산(HCl)으로 처리하여 에스테르 그룹과 엔아민-보호그룹을 모두 제거하여 익히 공지된 경구적으로 유효한 항생물질 세팔렉신을 수득하다. 기타 공지된 세팔로스포린 항생물질은 공지된 아실화 방법으로 수득한다. 따라서 효소적 방법에 의한 생성물로서 수득할 수 있는 7β-아미노-3-세펨 핵의 예는 7-아미노-3-메틸-3-세펨-4-카복실산(7-ADCA), 7-아미노-3-에틸-3-세펨-4-카복실산, 7-아미노-3-메톡시-3-세펨-4-카복실산, 7-아미노-3-비닐-3-세펨-4-카복실산, 및 7-아미노-3-알렌일-3-세펨-4-카복실산을 포함한다.

7-아미노-3-세펨 핵 화합물은 공지되어 있다.

예를 들면, 7-ADCA는 스테드맨(Stedman)에 의해 문헌[J.Med.Chem., 7, 117(1964)]에 기술되어 있고; 3-메톡시 핵은 샤우베트(Chauvette)의 미합중국 특허 제3,917,587호에 기술되어 있으며; 3-비닐 핵은 미합중국 특허 제3,994,884호에 기술되어 있다.

상술한 바와 같이 본 발명의 방법에 따라 수득한 3-알렌일-3-세펨 핵 화합물은 본 발명의 추가의 국면이다.

이들 핵은 하기 일반식으로 나타낸다.

상기 식에서, R₃은 수소 또는 카복시-보호 그룹이다.

바람직한 카복시-보호 그룹, R₃은 t-부틸, 벤질, 4-메톡시벤질, 4-니트로벤질, 디페닐메틸 또는 트리-(C₁-C₄알킬)실일 그룹(예; 트리메틸실일 또는 디메틸-t-부틸실일)이다.

다음의 제조방법과 실시예는 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다.

I. 이소페니실린 N합성 효소에 의한 2α-치환된-페남의 제조방법

2α-비닐-2β-페남

[제조방법 1]

δ-(L-α-아미노아디포일)-L-시스테인일-D-γ,δ-디데하이드로이소로이신의 제조방법

A. 벤질 2-(t-부틸옥시카보닐아미노)-3-메틸펜트-4-에노에이트

벤질 브로마이드 4.4밀리몰, 중탄산나트륨 4.4밀리몰 및 요오드화나트륨 10mg을 함유하는 무수 DMF 10ml 중의 문헌[참조 : P.A.Bartlett et al., J.Org.Chem., 1982, 47, 3933]의 방법에 따라 제조된 2-(t-부틸옥시카보닐아미노) -3- 메틸펜트 -4-에네오산(2R, 3S; 3S, 2R) 4.4밀리몰의 혼합물을 20℃에서 15분 동안 교반한다. 이 혼합물을 에틸 아세테이트에 용해시키고, 용액을 물로 3회 세척한 다음, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과한 다음, 증발시킨다. 에스테르 생성물을 실리카겔 상에서 섬광 크로마토그라피하여 정제한다. 에스테르는 오일로서 80% 수율로 수득된다.

NMR(300MHz, CHCl₃) : δ1.01(3H,d,J=6Hz,3-CH₃), 1.44(9H,s,t-부틸), 2.58 내지 2.71(1H,m,3-H), 4.32 내지 4.40(1H,m,2-H), 5.01 내지 5.27(5H,m, 5-H,NH,CH₂C₆H₅), 5.05 내지 5.37(1H,m,4-H), 7.33 내지 7.41(5H,m,C₆H₅-H).

IR(CHCl₃) : λmax 3005m, 1730s(CO₂), 1701S(CO₂), 1600w, 1502m, 1205s, 1160m cm^-1.

m/e(NH₃, 탈착 화학적 이온화) : 320(MH⁺, 100%)

B. 벤질 2-아미노-3-메틸펜트-4-에네오에이트 포름산염 벤질 에스테르(단계 A, O.40밀리몰)를 포름산 1ml에 용해시키고, 용액을 20℃에서 2시간 동안 교반한다. 이 용액을 증발시켜 조악한 포름산염을 수득하고, 추가로 정제하지 않고 다음 단계에서 사용한다.

C. 벤질 에스테르 포름산염(단계 B)을 문헌[참조; J.E.Baldwin et al., -J.Chem.Soc.Perkin 1, 1981,2253]에 기술된 바와 같이 EEDQ를 사용하는 표준 커플링 조건하에서 하기 구조식의 보호된 α-아미노아디포일-L-시스테인일 디펩디드와 커플링시킨다.

S-벤질, CBz-보호된 표제 화합물 트리펩티드 디벤질 에스테르는 상응하는 부분입체이성질체인 알로-이소로이신일 트리펩티드와의 1 : 1 혼합물로서 50%수율로 수득된다.

보호된 표제 화합물 트리펩티드는 용리액으로서 에틸 아세테이트 : 헥산을 4 : 6(v : v)으로 사용하여 실리카겔상의 판층 크로마토그라피하여 부분입체이성질체 혼합물로부터 분리한다. 보호된 표제 화합물 트리펩티드를 결정화하여 에틸 아세테이트 : 핵산으로부터 균질화시키며, 이것의 융점은 116℃ 내지 118℃이다.

IR(CHCl₃) : λmax 1730s(CO₂), 1700s(CO₂), 1508m, 1378m, 1205w.

NMR(300MHz, CHCl) : δ1.00(3H,d,J=6Hz,CHCH₃), 1.61 내지 1.92(4H, m,CH₂-CH₂CH₂CO), 1.07 내지 1.25(3H,m,CH₂-CO,CHCH), 2.58 내지 2.88 (2H,m,CH₂S), 3.75(2H,s,SCH₂C₆H₅), 4.36 내지 4.48(2H,m2×NHCHCO), 4.57 내지 4.63(1H,m,NHCHCO), 4.99 내지 5.21(8H,m,3×OCH₂C₆H₅,C=CH₂), 5.56 내지 5.75(2H,m,CH=CH₂,NH), 6.35(1H,d,J=8Hz,NH), 6.91(1H,d,J=8.5Hz,NH), 7.31 내지 7.37(20H,m,아릴 H).

m/e(장 탈착) 779(M⁺).

분리된 표제 화합물의 구조는 1대기압에서 1시간 동안 벤젠중에서 [(C₆H₅)₃P]₃RhCl를 사용하여 수소로 문헌[참조 : J.E.Baldwin et al., J.Chem, Soc., Chem, Commun., 1984, 1167 및 상기 문헌에서 인용된 참고문헌]에 기술된 상응하는 할로-이소로이신일 트리펩티드로 환원시킴으로써 더 잘 알 수 있다.

D. 표제 화합물 트리펩티드의 탈보호

N-CBz S-벤질 보호된 트리펩티드 디벤질 에스테르(단계 C)를 문헌[참조 : J.E.Baldwin et al., J.Chem. Soc., Perkin 1, 1981, 2253]에 기술된 조건하에 나트륨/액체 암모니아 속에서 탈보호시켜 표제 화합물 트리펩티드를 수득한다.

이후에, pH 8인 묽은 수산화암모늄 속에서 산소 기체를 용액 속으로 2시간 동안 통과시켜 탈보호된 트리펩티드를 이황화물로 산화시킨다. 이황화물은 예비 전기영동 (pH 3.5, 4KV, 80분) 시키고 양극을 향해서 5 내지 10cm 이동한 닌하이드린-활성 밴드를 추출시켜 정제한다. 정제된 이황화물은 77%수율로 수득한다.

NMR(300MHz,D₂O,HOD=4.63 p.p.m.) : δ0.87(3H,d,H=5.5Hz,CHCH₃), 1.51 내지 1.74(4H,m,CH₂-CH₂CH₂CO), 2.08 내지 2.26(2H,m,CH₂CO), 2.55 내지 2.57(1H,m,CHCH₃), 2.77 내지 3.03(2H,m,CH₂S), 3.47 내지 3.58(1H,m, NHCHCO), 4.14(1H,d,J=5.5Hz,NHCHCO), 4.91 내지 4.96(2H,m,C=CH₂), 5.60 내지 5.67(1H,m,CH=CH₂).

m/e(양성 아르곤 F.A.B., 디티오르레이톨의 존재하에서) 376(MH⁺, 12%),

[제조방법2]

6β-(L-α-아미노아디포일)-2β-메틸-2α-비닐페남-3-카복실산

제조방법 1에 기술된 바와 같이 제조된 δ-(L-α-아미노아디포일)-L-시스테인일-D-γ, δ-디데하이드로이소로이신 이황화물의 수용액(28mM,0.100ml)을 디티오트레이톨(100mM, 0.100ml), L-아스코르브산(50mM, 0.100ml), 황산제 1철(5mM, 0.100ml), 소 간카탈라제 효소(10,000단위/ml, 0.05ml) 및 중탄산 암모늄(50mM, 3.5ml)의 수성 용액과 혼합시킨다. 혼합된 용액의 pH를 조정하고, 필요에 따라 묽은 수산화나트륨(100mM)을 가하여 pH 8로 조정한다. 혼합된 용액을 27℃에서 5분 동안 진탕하고, 탄산암모늄 50mM 용액중의 세팔로스포륨 아크레모늄(5 I.U./ml, 1ml)으로부터 분리시킨 이소페니실린 N합성효소 제제를 가한다. 배양혼합물을 2개의 10ml바이알에서 27℃에서 45분 동안 진탕시킨 다음, 아세톤 7ml로 단백질을 침전시킴으로써 반응을 종결시킨다. 침전물을 원심분리하여 분리시킨다. 상청액을 진공중에서 증발시켜 아세톤을 제거하고, 잔사를 동결건조시켜 하기 구조식의 조악한 2α-비닐-페남을 수득한다.

조 생성물을 역상 옥타데실실란 HPLC(250×4.6mm칼럼); 이동상 : 10mM 중탄산암모늄 수용액; 유속 1ml/min; 체류 시간=7 내지 8분으로 정제시킨다.

NMR(500MHz D₂O, 3-트리메틸실일프로피오네이트[2,2,3,3-₂H₄]TSP= 0.00p.p.m.) : δ1.53 내지 1.77(4H,m,CH₂CH₂CH₂CO), 1.59(3H,s,3β-CH₃), 2.25 내지 2.38(2H,m,CH₂CO), 3.56 내지 3.59(1H,m,CH(CH₂)₃), 4.18(1H,x,2-H), 5.03(1H,d,J=10.5Hz, CH=CH₂), 5.22(1H,d,J=17Hz,CH=CH₂), 5.35 내지 5.45(2H,ABq,J=4Hz,5,6-H), 5.91(1H,dd,J=10.5,17Hz,CH=CH₂).

2β-메틸 그룹에 대한 화학적 이동의 배열은 핵오버하우저 실험(Nuclear Overhauser experiments)에 따른다. 따라서, δH 1.59에서 2β-CH₃그룹을 조사하면 5-H가 아닌 2-H가 증강(12%)되는 반면, δH 5.91에서 CH=CH₂양자를 조사하면 5-H가 증강(3%)된다

m/e(양성 아르곤 고속 원자 충격) 372(MH⁺).

[제조방법 3]

6β-아미노-2α-비닐-2β-메틸페남-3-카복실산

6β-(L-α-아미노아디포일)-2β-메틸-2α-비닐페남-3-카복실산을 N-프탈로일 유도체로 전환시키고, 유도체의 나트륨염을 무수 메틸렌 클로라이드 속에 현탁시킨다. 현탁액을 피리딘의 존재하에 트리메틸클로로실란으로 처리하여 트리메틸실일 에스테르를 생성시킨다. 실일에스테르 유도체 약 -5℃에서 오염화인과 반응시켜 상응하는 이미노 클로라이드를 생성시킨다. 반응 혼합물을 약 -20℃로 냉각시키고, 메틸 알콜로 처리하여 상응하는 이미노 에스테를 생성시킨다. 혼합물을 약 0℃까지 가온하고, 물을 가하여 표제 핵 화합물을 생성시킨다. 혼합물을 물 및 메틸 알콜의 냉각 혼합물 속에 부어 넣고, 수성 층을 분리시킨다. pH를 약 4로 조정한 후, 용액을 약 5℃에서 정치시켜 표제 핵 화합물을 침전시킨다.

2α-알렌일-2β-페남

[제조방법 4]

6β-아미노-2α-알렌일-2β-메틸페남-3-카복실산을 하기와 같이 수득한다. 2R,3R-2-(t-부틸옥시카보닐아미노)-2-요오드부탄산 디페닐 메틸 에스테르를 무수 탈기벤젠 중에서 과량의 트리페닐프로파길 주석 및 아조비스 (이소부티로니트릴)(AIBN)과 혼합하고, 용액을 질소하에 환류 온도에서 약 18시간 동안 가열한다. 혼합물을 냉각시키고, 증발시며 건조시키고, 잔사를 아세토니트릴에 용해시킨 다음, 핵산으로 세척한다. 증발시킨 후에 생성물의 잔사를 실리카겔 상에서 크로마토그라피하여 디페닐메틸 2-(t-부틸옥시카보닐아미노)-3-메틸-4, 5-헥사디에노에이트를 수득한다.

아미노-보호 t-BOC 그룹을 차가운 에탄올 중의 무수 p-톨루엔설폰산을 사용하여 생성물로부터 제거하고 유리 아미노 에스테르를 하기 구조식의 아미노-보호되고 S-보호된 δ-(L-α-아미노아디포일아미노)-L-시스테인디에스테르와 커플링시킨다.

상기식에서, pMB는 p-메톡시벤질이다.

커플링은 트리에틸아민의 존재하에 무수 디클로로메탄속에서 질소하에 실온에서 1-에톡시카보닐-2-에톡시-1, 2-디하이드로퀴놀린(EEDQ)을 사용하여 수행한다.

수득한 보호된 트리펩티드 생성물을 트리플루오로아세트산 및 아니솔과 함께 환류온도에서 30분 동안 가열하여 탈보호시켜 하기 구조식의 트리펩티드를 수득한다.

트리펩티드를 디티오트레이톨, L-아스코르브산, 황산제 1철 및 소 간 카탈라제 효소를 포함하는 수성 매질(pH 7.7 내지 8.0)속에서 약 27℃에서 과량의 이소페니실린 N합성효소를 사용하여 배양한다. 약 1시간 후에 아세톤을 가하여 반응을 종결시킨다. 침전된 단백질은 원심분리하여 분리시키고 생성물을 함유하는 상청액을 증발시켜 아세톤을 제거하고, 잔류 수용액을 동결건조시켜 하기 구조식의 생성물 리오필을 수득한다.

2α-알렌일페남은 하기 제조방법 3에 따라 탈아실화시킨다.

2α-알콕시페남

[제조방법 5]

δ-(L-α-아미노아디포일)-L-시스테인일-(2R,3R)-2-아미노-3-메톡시부탄산

(1) 2R, 3R- 및 2S,3S-2-브로모-3-메톡시부탄산

크로톤산(8.6g, 100밀리몰)을 메탄올(50ml)에 용해시키고, N-브롬아세트아미드(13.8g, 10밀리몰)를 30분에 걸쳐서 조금씩 가한다. 용액을 25℃에서 15시간 동안 교반한 다음, 용매를 증발시키고, 잔사를 디에틸에테르와 물 사이에 분배한다. 에테르층을 Na₂SO₄로 건조시키고, 여과한 다음, 증발시키고, 잔사를 증류시켜 표제 화합물을 비점이 88 내지 89℃/0.5mm인 무색 오일(14.3g, 73%)로서 수득한다.

(2) 2R, 3R- 및 2S,3S-2-아미노-3-메톡시부탄산

2R, 3R- 및 2S,3S-2-브로모-3-메톡시부탄산(14g, 71밀리몰)을 암모니아 (비중 0.88, 250ml)에 용해시키고, 혼합물을 오토클레이브에서 95℃에서 8시간 동안 가열한다. 혼합물을 25℃로 냉각시키고 증발시킨 다음, 잔사를 아세톤 속에 현탁시킨다. 생성된 무색 고체를 제거하고, 아세톤으로 세척하여 표제 화합물을 잔류 브롬화암모늄을 함유하는 융점이 180 내지 184℃(분해)인 무색 고체(12.1g)로서 수득한다.

(3) 2R, 3R- 및 2S,3S-N-벤질옥시카보닐-2-아미노-3-메톡시부탄산 벤질 에스테르

2R, 3R- 및 2S,3S-2-아미노-3-메톡시부탄산(3.1g)을 1M 수산화나트륨 (27ml), 물(20ml) 및 디옥산(40ml)의 혼합물에 용해시킨다. 이옥산(20ml) 중의 벤질 클로로포르메이트(3.8ml, 22밀리몰) 및 1M 수산화나트륨(27ml)을 각각 동일한 속도로 25분에 걸쳐서 용액에 가한다. 혼합물을 1시간 동안 교반하고, 에틸 아세테이트 (3×200ml)로 추출한 다음, 2N 염산으로 pH 1로 산성화시키고, 에틸 아세테이트 (3×200ml)로 다시 추출한다. 유기 추출물을 모으고, 건조시킨 다음, 여과하고, 증발시켜 오일을 얻는다. 오일을 무수 디메틸 포름아미드(20ml)에 용해시키고, 용액에 탄산수수소나트륨(3.14g, 41밀리몰), 브롬화벤질(3.81ml, 33밀리몰), 무수황산나트륨 (200mg) 및 요오드화나트륨(10mg)을 가하고, 전체를 25℃에서 시간 동안 교반한다. 이후에 혼합물을 디클로로메탄(200ml)으로 추출하고, 물(4×300ml)로 세척한 다음, 황산나트륨으로 건조시키고, 여과시키고 증발시킨다. 연속적인 용출제로서 에틸 아세테이트와 석유 에테르를 사용하여 실리카겔 상에서 크로마토그라피하여 정제함으로써 표제 화합물을 무색 오일(4.2%, 65%)로서 수득하고, 정치시켜 고형화시킨다. 융점은 44℃이다.

(4) 2R, 3R- 및 2S,3S-2아미노-3-메톡시부탄산 벤질 에스테르

2R, 3R- 및 2S,3S-N-벤질옥시카보닐-2-아미노-3-메톡시부탄산 벤질 에스테르(500mg, 1.4밀리몰)를 무수 디클로로메탄(3ml)에 용해시키고, 브롬화수소산(아세트산 중 45%, 2ml)을 가한다. 혼합물을 아르곤하에서 20분 동안 교반하고, 증발시킨다. 잔사를 디클로로메탄(3×3ml)에 용해시키고, 3회 재증발시켜 추가의 잔사를 수득하고, 크실렌(2×3ml)에 용해시킨 다음, 2회 재증발시킨다. 이후에 석유 에테르 (5ml)를 가하고, 생성물을 5분 동안 연마한 다음, 모액을 버리고, 고체 잔사를 디클로로메탄(5ml)에 용해시킨다. 디클로로메탄 용액에 트리에틸아민(1ml)을 가한 다음, 2분 동안 교반하고, 증발시킨다. 잔사를 디클로로메탄(3×5ml)에 용해시키고, 3회 재증발시켜 추가의 잔사를 수득하고, 디에틸 에테르(5ml)로 연마한다. 생성된 고체를 여과시켜 제거하고, 디에틸 에테르(2×5ml)로 재추출한 다음, 에테르성층을 모으고, 증발시켜 표제 화합물을 무색 오일(290mg, 93%)로서 수득한다.

(5) (N-벤조일옥시카보닐-α벤질-δ-L-아미노아디포일)-S-벤질-L-시스테인일-(2R,3R-2-아미노-3-메톡시부탄산), 벤질 에스테르

2R, 3R- 및 2S,3S-2-아미노-3-메톡시부탄산 벤질 에스테르(177mg, 0.79밀리몰)를 무수 디클로로메탄(10ml) 및 2-에톡시-N-에톡시-카보닐-1,2-디하이드로퀴놀린(195mg, 0.79밀리몰)에 용해시키고, 문헌[Baldwin et al., Journal of the Chemical Society, Perkin I, 1981, 2253]에 기술된 바와 같이 제조된 N-벤질 옥시카보닐-α-벤질-δ-(L-α-아미노아디포일)-S벤질-L-시스테인(456mg, 0.79밀리몰)과 황산나트륨(100mg)을 가한 다음, 혼합물을 24시간 동안 교반한다. 용액을 증발시키고, 잔사를 에틸 아세테이트(150ml)에 용해시킨 다음, 에틸 아세테이트 용액을 2M 염산(50ml), 탄산수소나트륨 포화 용액(50ml) 및 염수(50ml)의 순서대로 사용하여 세척하고, 건조시킨 다음, 여과시키고, 증발시킨다. 연속적인 용출제로서 에틸 아세테이트와 헥산을 사용하여 실리카겔 상에서 크로마토그라피하여 정제함으로써 표제 화합물을 무색 고체(180mg, 29%)로서 수득한다. 융점 116내지 118℃; [α]₇ ²⁰-11.7°(C1,CHCl₃)(2R,3R 이성체는 2S,3S, 이성체보다 극성이 작다.)

(6) δ-(L-α-아미노아디포일)-L-시스테인일-(2R,3R-2-아미노-3-메톡시부탄산)

N-벤질옥시카보닐-a-벤질-8-(L-a-아미노아디포일)-S-벤질-L-시스테인일-(2R. 3R-2-아미노-3-메톡시부탄산)벤질

에스테르 전기영동(pH 3.5, 3kv, 2시간)으로 표제 화합물을 이황화물 형태의 무색 고체(10mg, 26%)로서 수득한다.

¹H n.m.r.(D₂O, 외부적 표준은 TMS임) δ1.5 내지 1.8(4H,m) 2.25(2H, t,J=7.0Hz) 2.73(2H,m), 3.19(3H,s), 3.65(2H,ABX, J_AB=10.5 J_AX=3.9,J_BX= 5.5Hz), 3.84(1H,t,J=6.2Hz), 4.40(1H,t,J=5.8Hz), 4.47(1H,m).

[제조방법 6]

6-δ-(L-α-아미노아디프아미도)-2α-메톡시-2β-메틸페남-3-카복실산

δ-(L-α-아미노아디포일)-L-스스테인일-(2R,3R-2-아미노-3-메톡시부탄산)(120μg)을 트리스-HCl완충액(50mM, pH 7.5 : 트리스는 2-아미노-2-하이드록시메틸프로판 1,3-디올을 나타낸다)중조 인자 디티오트레이톨(2.11mM), 아스코르브산(1.06mM), 황산제 1철 0.11mM) 및 카탈라제 효소(소 간, 1800시그마 단위)의 존재하에, 정제된 이소페니실린 N합성 효소(1.1단위)를 사용하여 진탕기 (250r.p.m)에서 27℃에서 공기에 노출시키면서 30분 동안 총 용적 1ml로 배양시킨다. 70용적%의 아세톤을 가하여 혼합물로부터 단백질을 침전시킨 후, 원심분리하여 분리시키고, 상청액을 동결건조시킨다. 동결건조된 물질을 물(500μl)에 재용해시키고, 생성물을 용출용매로서 50mM KH₂PO₄90용적%/메탄올 10용적%를 사용하여 HPLC (Waters : Z Module Radial Compression Separator System with Radial-Pak C₁₈10 cartridge)로 정제하며, 이 항생 물질은 220nm에서 흡수하여 검출된다. 이후에 수득된 생성물을 즉시 동결건조시켜 표제 화합물을 수득한다.

[제조방법 7]

6β-아미노-2α-메톡시-2β-메틸페남-3-카복실산

아세토니트릴(0.3ml)중의 제조방법 6에서 얻은 2α-메톡시-2β-메틸페남 용액에 질소하 0℃에서 아세트산(0.61M, 0.025ml) 중의 니트로실 클로라이드를 가한다. 5분 후 0℃에서 용액을 증발시켜 실온에서 건조시킨다. 메탄올(0.4ml)을 가하고, 용액을 5분 동안 정치시키고, 메탄올을 진공 중에서 제거시킨다. 염산/염화칼륨 완충액 (0.04M HCl, 0.16M CKl, pH 2, 0.4ml)을 가하고, 용액을 실온에서 3분 동안 정치시킨다. 용액을 중탄산나트륨(70nM, 0.3ml)으로 중화시키고, 동결건조시킨다. HPLC(용리액으로 5nM NaH₂PO₄/Na₂HPO₄/KC1 pH 7 완충액 : 메탄올(19:1)을 사용하는, 역상 옥타데실실란컬럼)로 정제하여 표제 화합물(0.05mg, 7%)을 수득한다.

Ⅱ. 이소페니실린 N합성 효소에 의한 6β-(3-카복시페닐 아세틸아미노) -2α-치환된-2β-메틸페남-3-카복실산의 제조방법

[제조방법 8]

N-(3-카복시페닐아세틸)-L-시스테인일-D-발린

A. 이소-프탈산 모노벤질 에스테르

메틸 알콜(200ml) 및 H₂O(10ml) 중의 이소-프탈산(11.2g, 0.1몰)의 현탁엑에 메틸 알콜(100ml) 중의 수산화칼륨(11.2g, 0.2몰) 용액을 가하고, 혼합물을 실온에서 밤새 교반한다. 용매를 감압하에서 제거하고, DMF(250ml) 및 벤질 브로마이드 (13.5ml, 1.1g)을 가한다. 혼합물을 100℃에서 2시간 동안 가열하고, 중탄산나트륨 수용액(물 500ml중 10g) 속에 부어 넣은 다음, 에틸 아세테이트로 추출한다. 수성 층을 진한 HCl로 산성화시키고, 에틸 아세테이트로 추출한 다음, 여과하여 침전된 이소-프탈산을 제거한다. 에틸 아세테이트 층을 염수로 세척하고, Na₂SO₄로 건조시킨 다음, 증발시킨다. 잔사(모노벤질 에스테르 및 이소-프탈산)를 실리카겔 상에서 크로마토그라피하여 모노벤질 에스테르를 3.73g(15%) 수득한다.

¹H NMR(300MHz, CDC1₃) : δ5.42(2H,s), 7.30 내지 7.50(5H,m), 7.59(1H,t,J=7.7Hz), 8.32(2H,t,J=4.5Hz, 8.81(1H,s).

IR(CHCl₃) : 2700 내지 3400(COOH), 1720(S), 1700(S)cm^-1.

B. 2,2,2-트리클로로에틸 3-(벤질옥시카보닐)-페닐 아세테이트

이소-프탈산 모노벤질 에스테르(2.6g), 무수 벤젠(8ml)과 순수한 티오닐 클로라이드(2.6ml, 3eq)의 혼합물을 80℃에서 1시간 동안 가열한다. 용매를 감압하에 제거한 후 무수 벤젠(10ml)을 가하고 용매를 감압하에서 다시 제거하여 반응하지 않은 미량의 티오닐 클로라이드를 제거한다. 산 클로라이드를 무수 벤젠(20ml)에 용해시키고, 용액을 0℃에서 과량의 디아조메탄의 에테르성 용액속에 부어넣는다. 용액을 0℃에서 20분 동안 교반하고, 실온에서 밤새 교반한다. 용매와 과량의 디아조메탄을 감압하에 제거한다. 디아조케톤에 2,2,2-트리클로로에탄올 12ml를 가하고, 따뜻한 혼합물(50 내지 60℃)에 산화은(0.3g)을 가한다. 질소를 방출시키고, 2시간 후에 추가로 산화은(0.3g)을 가한 다음, 30분 동안 계속 가열한다. 추가의 산화은 0.2g을 가하고, 30분 후에 디아조케톤을 (TLC에 의해) 제거된다. 혼합물은 클로로포름으로 희석시키고, 목탄으로 처리한 다음, 여과하고 증발시켜 농축시킨다. 잔사를 섬광 크로마토그라피[벤젠-석유 에테르(1:1)]로 정제한다. 2,2,2-트리클로로에틸 에스테르 3.6g(88% 수율)을 수득한다. 사용된 디아조에탄은 N-니트로소메틸우레아를 사용하여 수득한다.

¹H NMR(CDC1₃,300MHz) : δ3.83(2H,s), 4.76(2H,s), 5.37(2H,s), 7.30 내지 7.60(7H,m), 8.04(2H,m).

IR(CHCl₃) : 3020(m), 3960(w), 1755(s), 1740(s), 1610(w), 1590(w), 1500(w), 1450(m), 1375(m), 1280(s)cm^-1.

MS m/e : 90(100), 225[22, M-(Cl₃CH₂OC(0))], 293[45, M-Ph(H₂O)], 295(42), 297(14), 400(7.7,M⁺35Cl₃), 402(6.9,M+2), 404(2.8,M+4).

C. 3-(벤질옥시카보닐)페닐아세트산 테트라하이드로푸란(36ml) 중 상술된 바와 같이 제조된 2,2,2-트리클로로 에틸 에스테르(3.6g)의 급속히 교반시킨 용액에 실온에서 아연 분말(7.2g), 1M 수성 인산이수소화칼륨(KH₂PO₄)(7.2ml)을 가한다. 15분이 경과한 후 TLC에 따르면 아무런 반응도 일어나지 않았음을 알 수 있다. 아연 7.2g을 추가로 가한다. 수분 후에 온도가 상승된다. 30분 후에 아연을 여과 제거하고, 용매를 감압하에 제거한다. 잔사를 클로로포름에 용해시키고, 2N CHl(20ml)을 가한 다음, 혼합물을 1시간 동안 교반한다. 클로로포름 층을 분리하고, 수성 층을 클로로포름으로 추출한다. 추출물을 클로로포름 층과 합하고, 염수로 세척한 다음, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 증발시킨다. 잔사를 섬광 크로마토그라피(에틸 아세테이트)로 정제하여 3-(벤질옥시카보닐)페닐아세트산 869mg(37% 수율)을 수득한다.

융점 95 내지 96℃(에테르 중)

원소분석 : C₁₆H₁₄O₄

이론치 : C; 71.10, H; 5.22.

실측치 : C; 71.22, H; 5.27.

¹H NMR(300MHz, CDCl₃) : δ3.72(2H,s), 5.37(2H,s), 7.30 내지 7.55(7H,m), 7.98 내지 8.09(2H,m).

MS m/e : 91(34), 163[100, M-Ph(H₂O)], 252(6.7, M-H₂O), 270(M⁺,10).

IR(CHCl₃) : 2800 내지 3400(COOH), 1715(C=O)cm^-1.

D. S-(4-메톡시벤질)-L-시스테인일-D-발린 디페닐메틸 에스테르의 아실화

10ml의 무수 메틸렌 클로라이드 중의 3-(벤질옥시카보닐)페닐아세트산 (427mg, 1.58밀리몰), EEDQ(390mg, 1당량) 및 S-(4-메톡시벤질)-L-시스테인일-D-발린 디페닐 메틸 에스테르(1당량)의 혼합물을 실온에서 밤새 교반한다. 용매를 증발시키고, 잔사를 에틸 아세테이트 80ml에 용해시킨다. 용액을 수성 중탄산나트륨, 염수, 10% 수성 시트르산, 염수로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시킨다. 용매를 증발시키고, 잔사를 섬광 크로마토그라피(20% 에틸 아세테이트-석유 에테르)로 정제한다. 용점이 약 136℃ 내지 약 137℃인 N-[3-(벤질옥시카보닐)-페닐아세틸]-S-(4-메톡시벨질)-L-시스테인일-D-발린 디페닐메닐 에스테르(디에틸 에테르) 1.005g을 수득한다.

원소분석 : C₄₅H₄₆N₂O₇S

이론치 : C; 71.22, H; 6.11, N; 3.69

실측치 : C; 71.12, H; 6.02, N; 3.59

¹H NMR(CDC1₃,300MHz) : δ0.73 내지 0.85(각기 3H,d,J=6.9Hz, 2.23 (1H,m), 2.62(1H,dd,J=14.0,7.5Hz), 2.82(1H,dd,J=14.0,5.4Hz), 3.56(2H, s), 3.69(2H, s) 3.76(3H,s), 4.52(1H,dd,J=7.5, 5.4Hz), 4.63(1H,dd,J= 8.5,4.4Hz), 5.35(2H,s), 6.35(1H,d,J=7.5Hz), 6.70(1H,d,J=85Hz), 6.83 내지 7.16(각기 2H,d,J=8.0Hz,6.91(1H,s), 7.28 내지 7.48(17H,m), 7.96(2H,m).

IR(CHCl₃) : 3400, 3010, 2960, 1720, 1670, 1610, 1515, 1500cm^-1.

MS : 758(M⁺).

3중 보호된 N-아실화 생성물(150mg, 0.2밀리몰)을 메틸렌 클로라이드 3ml에 용해시키고, 아니솔 0.36ml를 가한다. 용액을 빙욕에서 냉각시키고, 니트로메탄 중의 0.5M 알루미늄 클로라이드 용액 2ml를 가한다. 혼합물을 0℃에서 2시간 동안 교반하고, 실온에서 3시간 동안 교반한다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석시키고, 1N 염산으로 세척한 다음, 5% 수성 중탄산나트륨으로 추출한다. 추출물을 에틸 아세테이트로 세척하고, 염산으로 산성화시킨 다음, 탈보호된 펩티드를 에틸 아세테이트로 추출한다. 추출물을 염수로 세척하고, 건조시킨 다음, 증발시켜 융점(아세톤 중)이 약 196℃ 내지 약 197℃(분해)인 표제 화합물 70mg(93%수율)을 수득한다.

원소분석 : C₁₇H₂₂N₂O₆S

이론치 : C; 53.39, H; 5.80, N; 7.32

실측치 : C; 53.55, H; 5.82, N; 7.23

¹H NMR(300MHz, CD₃OD) : δ0.89 및 0.94(각기 3H,d,J=6.9Hz, 2.15(1H,m), 2.81 및 2.90(각기1H,dd,J=14.0,6.5Hz), 3.67(2H,s), 4.31(1H,d,J =5.4Hz), 4.58(1H,t,J=6.5Hz), 7.42(1H,t,J=7.7Hz), 7.56(1H,d,J=7.7Hz), 7.90 (1H,d,J=7.7Hz), 8.01(1H,s).

MS(FAB EX.글리세록/옥살산) m/e : 383(M+1)

IR(KBr) : 3300, 2800 내지 3300(broad), 2680(w), 2560(w), 1730, 1700, 1650, 1605cm^-1.

[제조방법 9]

IPNS에 의한 6β-(3-카복시페닐 아세틸아미노)-2,2-디메틸페남-3-카복실산

50mM 중탄산암모늄 중의 N-(3-카복시페닐아세틸)-L-시스테인일-D-발린(1.4mg, 3.66×10^-3밀리몰), 100mM 디티오프레이톨 100μl, 5mM 황산 제1철 100μl, 500mM L-아스코르브산 100μl, 카탈라제 효소(1/10희석) 50μl, 50mM 중탄산암모늄 1ml 및 이소페니실린 N합성 효소 용액의 혼합물[트리스. HCl완충액중의 IPNS(활성 2700c.u.ml^-1, 비활성 109.8c.u.m^-1)1ml로부터 제조됨]을 동일한 용적으로 2분시키고, 각각의 1/2을 개구 바이알에 넣는다. 각각의 바이알의 내용물을 30℃에서(공기에 개방한 채로) 250rpm으로 배양한다. 30분이 경과한 후에 100mM 디티오트레이톨 50μl 및 5mM 황산 제1철 50μl를 각각의 바이알에 가하고, 30분동안 계속 배양한다. 배양된 혼합물을 합하고, 아세톤 12ml를 가한 다음, 혼합물을 원심분리한다. 상청액을 따라내고, 증발시켜 건조시키고, 생성물의 잔사를 동결건조시킨다. 생성물은 3% 아세토니트릴-90% 10mM 중탄산암모늄을 사용하여 역상 C₁₈분석 컬럼을 사용하여 정제한다.

¹H NMR(300MHz, D₂O) : δ1.30(3H,s), 1.38(3H,s), 3.55 및 3.64(각기 1H,d,J=15.0Hz), 4.07(1H,s), 5.25 및 5.35(각기 1H,d,J=3.8Hz), 7.35(2H,m), 7.71(2H,m)

생성물을 나트륨 트리메틸실일 프로피오네이트 -d₄(1.83×10_-4밀리몰)로 NMR 검사하여 β-락탐을 검출한다. 생성물, 6β-(3-카복시페닐아세틸아미노)페니실란산의 수율은 68%이다.

[제조방법 10]

6β-(3-카복시페닐아세틸아미노)-2α-비닐-2β-메틸페남-3-카복실산을 기질 N-(3-카복시페닐아세틸)-L-시스테인일-D-γ,δ-디데하이드로이소로이신과 IPNS를 사용하여 제조방법 9의 방법을 수득한다.

[제조방법 11]

6β-(3-카복시페닐아세틸아미노)-2α-메톡시-2β-메틸페남-3-카복실산은 기질 N-(3-카복시페닐아세틸)-L-시스테인일-(2R,3R)-2-아미노-메톡시부탄산 및 IPNS를 사용하여 제조방법9의 방법을 수득한다.

Ⅲ. 이소테니실린 N 합성효소에 의한 6β-(5-카복시펜탄아미도)-2α-치환된-2β-메틸페남-3-카복실산의 제조방법

[제조방법 12]

아디포일-(L)-시스테인일-(D)-발린

1) 아디프산 모노-벤질 에스테르

아디프산(2.92g, 20.0밀리몰)을 디메틸포름아미드(25ml)에 용해시키고, 70℃까지 가온한 다음, 디사이클로 헥실아민(4ml)을 가한다. 70℃에서 15분동안 교반하고, 벤질 브로마이드(3.42g, 20.0밀리몰)를 가한 다음, 생성된 현탁액을 70℃에서 20분동안 추가로 교반하고, 20℃로 냉각시킨다. 에틸 아세테이트(100ml)를 가하고, 현탁액을 여과한 다음, 여액을 물(3×200ml)로 세척하고, 수성층을 중탄산나트륨 수용액으로 pH 11로 염기화시킨다. 수성층을 분리하고, 에틸 아세테이트(2×100ml)로 세척한 다음, 2N HCl로 (매그로) 산성화시키고, 에틸 아세테이트(2×100ml)로 재추출한다. 후자 유기 추출물을 모으고, 물(3×100ml)로 세척한 다음, Na₂SO₄로 건조시키고, 여과시키고, 증발시켜 건조시킨다. 크로마토그라피[섬광 실리카(에틸 아세테이트)]하여 1)을 오일(890mg, 19%)로서 수득한다.

TLC(에틸 아세테이트) : R_f0.8

¹H NMR(60MHz, CDC1₃) : δ1.48 및 ,083(2H,m, CH₂CH₂CH₂CO), 2.15 내지 2.51(4H,m, CH₂CO), 5.05(2H,s,CH₂Ar), 7.25 내지 7.28(5H,m,Ar-H, 10.91(1H,s,CO₂H).

m/e(전자 충격) : 236(M⁺, 5%), 91(CH₂Ph, 100%).

2) N-[5-(벤질옥시카보닐)펜타노일]-S-벤질-L-시스테인일-(D)-발린 벤질 아빠테르

커플링 제조방법에 관한 참고 문헌 : J.E.Baldwin et al., J.Chem.Soc., Perkin I, 1981, 2253.

1(787mg, 3,33밀리몰)을 (트리에틸아민/이소부틸클로로포르메이트를 사용하면서) S-벤질-L-시스테인과 커플링시켜, 조 N-아실화된 S-벤질-L-시스테인 (1.53g, 〉100%)을 수득하고, 정제시키지 않고 발린 벤질 에스테르(1-에톡시카보닐 -2-에톡시-1,2-디하이드로 퀴놀린)와 커플링시켜 조 2를 얻는다. 크로마토그래피[섬광 실리카(에틸 아세테이트/디클로로메탄)]하여 2를 오일(309mg, 50%)로서 수득한다.

TLC(10% 에틸 아세테이트/디클로로메탄) : R_f0.45.

¹H NMR(300MHz, CD₃OD) : δ0.87(3H,d,J 7Hz, CHCH₃), 0.88(3H,d,J 7Hz, CHCH₃), 1.56 내지 1.61(4H,m,CH₂CH₂CH₂CO), 2.10 내지 2.17(3H,m, CH₂CO, CHCH₃), 2,33 내지 2.37(2H,m,CH₂CO), 2.63 내지 2.83(2H,ABX 계 CHCH₂S의 8라인 AB부), 3.75(2H,s,SCH₂Ar), 4.31 내지 4.36(1H,m,NCH),4.51 내지 4.58(1H,m,NCH, 5.09(2H, 대략 s,CH₂Ar), 5.11, 5.15(2H,ABq,J= 12Hz,CH₂Ar), 6.70(1H,d,J=7.5Hz,NH), 7.03(1H,d,J=8Hz,NH), 7.24 내지 7.37 (15Hm,Ar-H).

m/e(탈착 화학적 이온화) : 618(MH⁺).

탈보호 제조방법에 관한 참고문헌 : J.E.Baldwin et al., J.Chem.Soc., Perkin I, 1981, 2253.

액체 암모니아를 아르곤하에 나트품상에서 환류시켜 건조시키고, -78℃에서 무수 THF(5ml)중의 2(250mg, 0.40밀리몰) 용액을 함유하는 플라스크 속으로 증류시킨다 (50 내지 100ml). 이후에 새로 절단한 나트륨을 -78℃에서 발생된 청색이 10분동안 유지될 때까지 조금씩 교반시킨 반응 혼합물에 가한다. 이후에 청색이 사라질 때까지 무수 황산암모늄을 가하고, 아르곤 증기하에 암모니아와 THF를 증발시킨다. 잔사를 50mM 수성 황산(20ml)속에 현탁시키고, 용액을 여과한다. 침전물을 추가의 50mM 수성 황산(10ml)으로 세척한다. 이후에 침전이 중단될 때까지, 모은 여액과 세척액에 홉킨스 시약(Hopkins reagent)을 가한다. 침전물을 원심분리하여 모으고, 물(3×10ml)로 세척한다. 고체 잔사를 물속에 현탁시키고, 황화수소를 용액중으로 약 40분동안 버블링시킨다. 흑색 혼합물을(셀라이트) 여과하고, 물(10ml)로 세척한다. 이후에 여액과 세척액을 모으고, 증발건조시켜 표제 화합물(85mg, 60%)을 수득한다.

¹H NMR(300MHz, CD₃OD) : δ0.90(3H,d,J 7Hz, CHCH₃), 0.95(3H,d,J 7Hz, CHCH₃), 1.58 내지 1.74(4H,m,CH₂CH₂CH₂CO), 2.08 내지 2.23(1H,m, CHCH₃), 2,24 내지 2.40(4H,m,CH₂CO), 2.77 내지 2.94(2H,ABX계중 AB부분의 8라인, CHCH₂S), 4.20[1H,d,J=5Hz,CHCH(CH₃)₂], 4.49 내지 4.58(1H,m, CHCH₂S).

m/e(고속 원자 충격) : 349(MH⁺).

[제조방법 13]

6β-(5-카복시펜탄아미노도)-2,2-디메틸페남-3-카복실산

1) IPNS의 일반적인 배양방법

기질(약 3mg)의 수용액을 디티오트레이티톨(100μl, 0.100ml), L-아스코르브산(50mM, 0.100ml), 소 간카탈라제 효소(10,000단위/ml, 0.050ml)의 수용액 및 NH₄HCO₃용액(50mM, 3.5ml)과 혼합한다. pH수치를 점검하고, 필요에 따라 묽은 NaOH(100mM)를 가하여 8로 조정한다. 용액을 27℃에서 5분동안 진탕하고, NH₄HCO₃용액(50mM)중의 세팔로스포륨 아크레모늄 CO 728(약 5I.U./ml, 1ml)로부터 분리시킨 이소페니실린 N합성 효소 제제를 가한다. 배양 혼합물을 2개의 10ml 용량의 바이알 속에 27℃에서 45분동안 진탕시키고, 아세톤(7ml)으로 단백질을 침전시켜 반응을 종결시킨 다음, 원심분리하여 침전물을 분리시킨다. 진공중에 아세톤을 제거하고, 잔사를 동결건조시킨 다음, 양성자 NMR(500MHz)로 조 반응 생성물을 점검한다.

2) 아디포일-(L)-시스테인일-(D)-발린은 상기 일반적 방법으로 IPNS를 사용하여 배양시킨다.

HPLC에 의해 분리된 조 배양 혼합물의 화합물 : (2S, 5R, 6R)-6-(5-카복시펜탄아미도)-2,3-디메틸-7-옥소-1-아자-4-티아비사이클로[3.2.0]헵탄-2-카복실산

¹H NMR(300MHz, D₂O) : δ1.35 내지 1.55(4H,m,CH₂CH₂CH₂CO), 1.36 (3H,s,3-Me), 1.48(2H,s,3-Me), 2.05 내지 2.32(4H,2×m, CH₂CO), 4.08(1H, s,2-H), 및 5.29, 5.39(2H,2×d,JHz, 5-H, 6-H).

정제 : 역상 옥타데실실란 HPLC(250×4.6mm컬럼) ; 이동상 ; 50mM NH₄HCO₃(수성) ; 유동 속도 1ml/분; 체류시간=6.1분

생물 시험 : 포도상구균 아우레우스에 대해 양성

동결건조시킨 배양 혼합물을 물(2ml)속에 현탁시키고, pH 1로 산성화시킨 다음(2N HCl), 에틸 아세테이트(3×5ml)로 추출한다. 이후에 과량의 에테르 중의 디아조메탄을 가한다. 10분 동안 교반하고, 용액을 증발시켜 건조시킨다. 크로마토그라피 [예비 층 크로마토그라피(에틸 아세테이트/디클로로메탄)]하여 표제 화합물을 오일로서 수득한다.

TLC(에틸 아세테이트/디클로로메탄, 1 : 1) : R_f0.8.

¹H NMR(300MHz, CDCl₃) : δ1.51[(3H,s,(CH₃)], 1.58[3H,s,(CH₃)], 1.66 내지 1.74(4H,m,CH₂CH₂CH₂CO), 2.26 내지 2.38(4H,m,CH₂CO), 3.79(3H,s, OCH₃), 4.44(1H,s,2-H), 5.55(1H,d,J=4Hz, 5-H), 5.73(1H,dd,J=8.56Hz, 6-H), 6.14(1H,d,J=8.5Hz. 6-H).

m/e(탈착 화학적 이온화) : 373(MH⁺, 31%), 200(15%), 174(100%)

[제조방법 14]

6-APA에 의한 6β-(5-카복시펜탄아미도)-2,2-디메틸페남-3-카복실산의 다른 제조방법

1) 아디프산 모노-p-니트로벤질 에스테르

p-니트로벤질 브로마이드를 벤질 브로마이드 대신에 사용하는 이외에는 상기 모노-벤질 에스테르의 제조 방법에서 사용한 것과 동일한 방법으로 아디프산으로부터 화합물(1)을 제조한다. 재결정화시킨 후 조물질의 수율은 아디프산(2.92g, 20.0밀리몰)으로부터 0.5g 9%이다.

TLC(에틸 아세테이트) : R_f0.5

¹H NMR(60MHz, CDCl₃) : δ1.65 내지 2.04(4H,m,CH₃CH₂CH₂CO), 2.26 내지 2.70(4H,m,CH₂CO), 5.23(2H,s,CH₂Ar), 7.52 내지 8.15(4H, 2×ABq, J=9Hz, Ar-H), 9.85(1H,bs,CO₂H).

2) 6β-[5-(4-니트로벤질옥시카보닐)펜탄아미도]-2,2-디메틸페남-4-카복실산 4-니트로벤질 에스테르

6-아미노페니실산 p-니트로벤질 에스테르(172mg, 0.50밀리몰)를 디클로로메탄(10ml)에 용해시키고, 1-에톡시카보닐-2-에톡시-디하이드로퀴놀린(EEDQ) (124mg, 0.05밀리몰), 화합물 1(140mg, 0.50밀리몰) 및 무수 황산나트륨(50mg)을 가한다. 반응물을 불황성 대기하에서 24시간 동안 교반하고, 이를 증발시켜 건조시킨다. 잔사를 에틸 아세테이트(50ml)에 용해시키고, 2N 염산(25ml), 수성 중탄산나트륨 (25ml) 및 염수(25ml)로 세척한 다음, Na₂(SO₄)로 건조시키고, 여과시키고 증발시켜 건조시킨다. 잔사를 크로마토그라피[섬광 실리카(디에틸 에스테르/디클로로메탄)]하여 표제 생성물 2)를 수득한다.

¹H NMR(300MHz, CDCl₃) : δ1.56(3H,s,CH₃), 2.12(3H,s,CH₃, 1.68 내지 1.73(4H,m,CH₂CH₂CH₂CO), 2.26 내지 2.30(2H,m,CH₂CO), 2.41 내지 2.46(2H, m,CH₂CO), 4.49(1H,s,2-H), 5.21(2H, 대략 s, CH₂Ar), 5.28, 5.29(2H,A Bq,J =13Hz, CH_2,Ar), 5.54(1H,d,J=4Hz, 5-H), 5.73(1H,dd,J=9.4Hz, 6-H), 6.10 (1H,d,J=9Hz, 6-H), 7.49 내지 7.56(4H,m,Ar-H), 8.21 내지 8.28(4H,m,Ar-H).m/e(전자 충격) : 614(M⁺).

디에스테르 생성물을 탈에스테르화시켜 하기와 같은 표제 화합물을 수득한다 : 테트라하이이드푸란(15ml)중의 상기 디에스테르(160mg, 0.17밀리몰)의 용액에 물(15ml)중의 중탄산나트륨(29mg, 0.34밀리몰) 용액 및 10% 팔라듐/목탄(100mg)을 가한다. 반응 혼합물을 1시간 동안 수소화한 후, 이를(셀라이트)여과한다. 여액을 에틸 아세테이트(20ml)로 세척하고, 증발시켜 건조시켜 5를 수득한다.

¹H NMR(300MHz, D₂O) : 표제 화합물의 생합성 표본으로 보고된 것과 동일하다.

m/e(고속 전자 충격) : 345(MH⁺).

[제조방법 15]

6-APA에 의한 6β-(3-카복시페닐 아세틸아미노)-2,2-디메틸페남-3-카복실산의 다른 제조방법

1) 이소프탈산 모노-p-니트로벤질 에스테르

에틸 아세테이트(65ml)중의 이소프탈산(3.22g, 28밀리몰), p-니트로벤질 브로마이드(6.0g, 28밀리몰) 및 트리에틸아민(7.7ml, 56밀리몰)의 혼합물을 6시간 동안 환류시킨다. 농축시키면 1 및 이소프탈산(약 1 : 1)의 혼합물(4.6g, 약 25%)인 침전물을 얻는다. 혼합물을 정제하지 않고 추가로 변형시킨다.

¹H NMR(CDCl₃,60MHz) : δ5.53(2H,s,CH₂C₆H₄NO₂), 7.42 내지 7.85, 8.08 내지 8.0 및 8.47 내지 8.52(8H,3×m,Ar-H).

2) 3-(p-니트로벤질옥시카보닐)페닐아세트산

벤젠(16ml)중의 조 모노에스테르 1(4g, 약 50% 순도, 약 13밀리몰) 용액을 티오닐 클로라이드(16ml)로 처리하고, 80℃에서 1.5시간 동안 가열한다. 냉각시킨 후에, 용매를 진공중에서 제거하고, 벤젠(15ml)을 가한 다음, 잔류 티오닐 클로라이드를 제거하기 위하여 다시 진공 중에서 벤젠(15ml)을 가한다. 조 산클로라이드를 벤젠(20ml)에 재용해시키고, 0℃에서 디아조메탄의 에테르성 용액(과량)으로 처리한 다음, 20분 동안 교반한다. 이후에 반응 혼합물을 증발시켜 건조시키고, p-메톡시벤질 알콜(6ml)로 처리한다. 생성된 혼합물을 50 내지 60℃로 가온하고, Ag₂O를 20분 간격으로 소량씩(3×0.3g) 가한 다음, 추가로 30분동안 교반한다. 반응 혼합물을 냉각시키고, 클로 로포름(30ml)으로 희석시킨 다음, 목탄(약 0.5g)으로 처리하고, (셀라이트) 여과시키고, 증발시켜 건조시킨다. 크로마토그라피[섬광 실리카(메탄올/디클로로메탄)]하여 이소프탈산으로부터 0.77g, 10%를 수득한다.

TLC(메탄올/치클로로메탄, 3 : 97) : R_f0.5.

융점 : 148 내지 149℃(클로로포름 중)

i.r.(KBr disc) : 260 내지 3300(b), 1728(s), 1707(s), 1607(m), 1522 (m), 1425(m), 1378(s), 1351(m), 1284(m), 1231(m), 1198(m)cm^-1.

¹H NMR(300MHz, CDCl₃) : δ3.74(2H,s,ArCH₂CO₂), 5.47(2H,s,CO₂CH₂Ar), 7.46(1H,t,J=9Hz,Ar-H), 7.51(1H,d,J=9Hz,Ar-H), 7.61(2H,d,J=9Hz, Ar-H), 8.01(1H,s,Ar-H), 8.02(1H,d,J=9Hz,Ar-H), 8.26(2H,d,J=9Hz,Ar-H).

m/e(탈착 화학적 이온화) : 333(M+NH₄ ^-1), 288, 198(100%)

원소분석 : C₁₆H₁₃NO₆

이론치 : C; 60.95, H; 4.61, N; 4.44

실측치 : C; 60.90, H; 4.11, N; 4.31

3) 6β-[3-(4-니트로벤질옥시카보닐)페닐 아세틸아미노]-2,2-디메틸페남 -3-카복실산 4-니트로벤질 에스테르

디클로로메탄(30ml)중의 6-아미노페니실산-p-니트로벤질 에스테르-p톨루엔설포네이트 염(235mg, 0.45밀리몰), 트리에틸아민(63μl, 0.45밀리몰) 및 1-에톡시카보닐-2-에톡시-1, 2-디하이드로퀴놀린(EEDQ)(111mg, 0.45밀리몰) 용액 (142mg, 0.45밀리몰)을 불활성 대기하에 20℃에서 15시간동안 교반한다.

혼합물을 에틸 아세테이트(50ml)로 희석시키고, 수성 중탄산나트륨(25ml), 염수(25ml), 10% 시트르산 용액(25ml), 염수(25ml)로 세척한 다음, Na₂SO₄로 건조시키고 증발시켜 건조시킨다. 크로마토그라피[섬광 실리카(에탈 아세테이트/40 내지 60 석유 에테르)]하여 64%수율로서 186mg을 수득한다.

i.r.(CHCl₃) : 3420(m), 3030(m), 2970(w), 2930(w), 1785(s), 1750(s), 1740(s), 1690(s), 1610(s), 1525(s)cm^-1.

¹H NMR(300MHz, CDCl₃) : δ1.39, 1.49(2×3H, 2×s, 2×CH₃), 3.70 (2H,s,ArCH₂CO), 4.45(1H,s,2-H), 5.25(2H,ABq, J=13Hz, CH₂ArNO₂), 5.47 (2H, 대략 s,CH₂ArNO₂), 5.52(1H,d,J=4Hz, 5-H), 5.68(1H,dd,J=9.4Hz, 6-H), 6.07(1H,d,J=9Hz,NH), 7.45 내지 7.63(6H,m,Ar-H), 7.99 내지 8.06(2H,m,Ar-H), 8.20 내지 8.46(4H,m,Ar-H).

m/e(탈착 화학적 이온화 : 355(10%), 295(12%)

[a]_D ²⁰=+99.9°(C=0.96, CHCl₃).

하기와 같이 디에스테르를 탈에스테르화시켜 표제 화합물을 수득한다 : 탄산수소나트륨(5.2mg, 6:2×10^-2밀리몰)을 함유하는 50% 수성 테트라하이드로푸란(4ml)중에서 용액(20mg, 3.1×10^-2밀리몰)을 10% 팔라듐/목탄(20mg)상에서 30분동안 수소화한다. 반응 혼합물을(셀라이트) 여과하고, 에틸 아세테이트(5ml)로 세척한 다음, 증발, 건조시켜 표제 화합물을 이나트륨염(11mg, 84%)으로서 수득한다.

¹H NMR, m/e 및 HPLC 체류 시간은 천연적 생합성 방법으로 얻은 화합물과 동일하다.

[제조방법 16]

탈아세톡시세팔로스포린 C합성 효소의 정제 : 아크레모늄 크리소게늄으로부터의 환 익스판다제 효소의 활성(세팔로스포륨 아크로모늄)

1. 유기체의 성장

아크레모늄 크리소게늄 균주 CO 728을 화학적으로 규정한 매질 중에서 생육시킨다. 성장을 Pye Unican SP6-550 분광광도계로 550mM에서 추적한다. 균사를 수거하여 -70℃에서 보관한다.

2. 세포-유리 추출물의 제조방법

다이노-밀 분쇄기(Dyno-Mill grinder)(Glen Creston, Stanmore, Middx., G.B)를 사용하여 DTT(1mM) 및 나트륨 아자이드(0.015%)를 함유하는, pH 7.4의 트리스/HCl 완충액(50mM) 및 연속 유동법으로 제조한다.

3. 효소 정제

(a) 초기 단계

모든 단계는 4℃에서 수행한다. 황산 프로타민을 세포-유리 추출물에 가하여 최종 농도가 0.5%로 되도록 한다. 12,000g에서 30분동안 원심분리하고, 황산암모늄을 상청액에 가하여 최종 농도가 55%로 되도록 한다. 평형 및 원심분리(12,000g에서 30분동안)한 후에, 상청액의 황산암모늄 중에서 75%에 이르도록 하고, 12,000g에서 30분동안 원심분리하여 침전물을 수집한다.

상기 물질을 추출 완충액에 재용해시키고, 세파덱스 G-75겔 여과 컬 (130×5cm)상에 놓아 추출 완충액과 평형을 이루게 한다. 4℃에서 밤새 용리시킨 후에, 분획을 생물시험에 의한 익스판다제 효소 활성 시험한다. 활성 분획을 합하고, 4℃에서 추출 완충액과 미리 평행시킨 DEAE-세파로즈(Sepharose) 고속 유동 컬럼 (10×5cm)에 공급한다(유동 속도=24ml/h). 활성 효소를 유동 속도 24ml/h에서 500ml당 0.05 내지 1M NaCl의 선형 구배로 용리시킨다. 생물 시험에 의해 시험된 활성 분획을 합하고, 그 물질을 초기 연구에 사용한다.

b) 염료-리간드(ligand), 이온-교환 FPLC, 및 겔여과 FPLC 크로마토그라피

거의 균질한 정제를 위해, 세파덱스 G-75상에서 크로마토그라피시킨 후에 모은 활성 분획을 아가로즈(Matrex Gel Red A, Amicon Corp., Mass, U.S.A.)에 결합시킨 프로시온 레드(Procion Red) HE 3B 컬럼(30×2.5cm)에 공급한다(유동 속도= 10ml/h). 예비 시험에서, 프로시온 레드(0.1mM)가 익스판다제 효소 활성을 완전히 억제시키는 것으로 밝혀졌다. 컬럼을 350ml 추출 완충액으로 유동 속도 24ml/h로 세척하고, 효소를 500ml당 0 내지 1.5M KCl의 선형 구배로 동일한 유동 속도로 용리시킨다. 활성 분획을 합하고, FPLC용 모노(Mono)Q 16/10 강한 음이온/교환 컬럼(Pharmacia Ltd.)에 공급한다(유동 속도=8ml/분). 효소를 DTT(2mM)를 함율하는 pH 8.0의 트리스/HCl 완충액(20mM)중의 80 내지 400mM NaCl의 선형 구배로 동일한 유동 속도로 용리시킨다. 활성 분획을 합하고, 농축시킨 다음, 수퍼로즈(Superose) 12 FPLC 겔여과 컬럼에 공급한다(유동 속도=0.25ml/분). 효소를 DTT(2mM)를 함유하는 pH 8.0의 트리스/HCl 완충액(0.1M)으로 용리시킨다. 활성 분획을 합하고, 농축시킨 다음, 전환시험에서 사용한다.

[실시예]

익스판다제 효소-기질의 일반적인 배양 방법

익스판다제 효소는 정제시킨 후에 pH 7.4의 50mM 트리스-HCl 완충액(약 0l5 내지 1I.U./ml)중의 현탁액으로서 수득한다. 0.2mg의 기질을 배양시키기 위하여, 하기의 방법을 사용한다. 물(3ml)중의 황산 제1철(0.42mg, 1.5×10^-3밀리몰) 및 L-아스코르브산(4.3mg 2.4×10^-2밀리몰)을 함유하는 용액을 α-케토글루타레이트(5.3mg)에 가한다. 이후에 혼합물을 pH를 수성 수산화나트륨(100mM)으로 pH 7.6으로 조정한다. 이후에 조인자 용액(0.25몰)을 50mM 트리스-HCl(1.65ml, 약 1I.U.)중의 익스판다제 효소 용액에 가하고, 혼합물을 27℃에서 5분동안 270rpm으로 예비배양 시킨다. 이후에 물 0.1ml중의 기질을 가하고, 혼합물을 2시간 동안 배양시킨다. 단백질 제거 및 후처리는 IPNS 효소를 사용하는 배양과 동일한 방법으로 한다.

[실시예 1]

7β-(5-카복시펜탄아미도)-3-메틸-3-세펨-4-카복실산

제조방법 13에 의해 기술한 바와 같이 하여 수득한 6β-(5-카복시펜탄아미도)-2,2-디메틸페남-3-카복실산을 상기 일반적인 방법으로 익스판다제 효소를 사용하여 배양 시킨다. 조 배양 혼합물을 HPLC하여 화합물을 분리시킨다.

¹H NMR(D₂O, 500MHz) : δ1.46 내지 1.53(4H,m,CH₂CH₂CH₂CH₂), 1.79 (3H,s,Me), 2.09 내지 2.10, 2.22 내지 2.30(4H,2×m, CH₂CO), 3.12, 3.47 (2H,ABq, J=13, 4-H), 5.96, 5.44(2H,ABq, J=4.5, 6-H, 7-H).

정제 : HPLC에 관한 자세한 것은 제조방법 13에 기술한 바와 동일하지만 체류 시간은 6.8분이다.

생성물은 하기 방법을 사용하여 유도한다. HPLC로부터 얻은 생성물의 샘플을 2N HCl(2ml)에 용해시키고, 에틸 아세테이트(2×10ml)로 추출시킨다. 이후에 유기층을 약 5ml로 농축시킨다. 이후에 과량의 에테르중의 디아조메탄을 교반시킨 용액에 가한다. 10분동안 교반시킨 후에, 용액을 증발, 건조시켜 조 디에스테르를 수득한다.

¹H NMR(500MHz, CHCl₃) : δ1.43 내지 1.71(4H,m,CH₂CH₂CH₂CH₂), 1.70(3H,s,CMe), 2.29 내지 2.35(4H,m,2×CH₂CO), 3.24, 3.50(2H,ABq, J= 18Hz,4-H), 3.68, 3.85(6H,2×s, 2×OMe), 4.98(1H,d,J=4.5Hz, 6-H), 5.79 (1H,dd,J=4.5Hz, 8.5 7-H), 6.18(1H,d,J=8.5Hz, NH)

m/e(NH₃, 탈착 화학적 이온화) : 388(32,M+NH₄ ^-1), 371(34,M⁺+1).

[실시예 2]

7β-(3-카복시페닐아세틸아미노)-3-메틸-3-세펨-4-카복실산

6β-(3-카복시페닐아세틸아미노)-2,2-디메틸페남-3-카복실산은 일반적인 방법으로 익스판다제 효소를 사용하여 배양시킨다.

조 배양 혼합물의 HPLC에 의해 분리된 화합물 : (6R,7R)-1-아자-3-메틸-7-(m-카복시페닐아세틸)-8-옥소-5-티아비사이클로[4.2.0]헥스-2-엔 카복실산

¹H NMR(500MHz, D₂O) : δ1.77(3H, 2, CH₃), 3.06, 3.37(2H, ABq, J=18Hz, SCH₂), 3.57, 3.63(2H, ABq, J=15Hz, CH₂Ar), 4.89 및 5.39(2H, 2×d, J=4.5Hz, 6-H, 7-H), 7.31 내지 7.43(2H, m, Ar-H), 7.74 내지 7.77(2H, m, Ar-H).

m/e(고속 원자 충격) : 399(M⁺+Na).

정제 : HPLC에 관해 자세한 것은 제조방법 13에 기술한 바와 동일하나 ; 이동상은 2% CH₃CN/98% 10mM NH₄HCO₃이고, 체류시간은 8.5분이다.

Claims

하기의 일반식(2)의 2β-메틸-2α-치환된 페남-3-카복실산을 산소, 2가 철이온, 아스코르브산염 및 α-케토글루타레이트의 존재하에 온도 약 20℃ 내지 약 40℃ 및 pH 약 6 내지 약 9의 수성 매질속에서 데아세톡시세팔로스포린 C 합성 효소와 접촉시킴을 포함함을 특징으로 하여 하기 일반식(1)의 화합물을 제조하는 방법

상기식에서, R은 3-카복시페날아세틸 또는 아디포일이고, R₁은 C₁-C₃알킬이다.
제1항에 있어서, R이 3-카복시페닐아세틸인 방법.
제2항에 있어서, R₁은 메틸인 방법.