JP2604571B2 - ジオキシゲナーゼ酵素 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】この発明は、ジオキシゲナー
ゼ酵素、特に新規なクラバム誘導体に関する。またこの
発明はクラバム誘導体の製造法に関する。イギリス国特
許第1,508,977号明細書には、クラバラン酸として知ら
れているクラバム誘導体が記載され、これはストレプト
ミセス・クラブリゲルス（Streptomyces clavuligeru
s）ＡＴＣＣ27064号もしくはその高収率産生の変異菌株
が産生する化合物である。クラバラン酸は下記構造式
（Ａ）で表され、その絶対立体化学構造と番号付け方式
を示す。

【０００２】

【化３】

【０００３】したがって、クラバラン酸はＺ−（２Ｒ，
５Ｒ）−（β−ヒドロキシエチリデン）−７−オキソ−
４−オキサ−１−アザビシクロ〔３．２．０〕ヘプタン
−２−カルボン酸である。クラバラン酸は、β−ラクタ
マーゼ酵素類の有効な阻害剤であり、β−ラクタマーゼ
の作用を受けやすいβ−ラクタム構成物質類が分解する
のを防止するので、非常に重要な価値ある化合物であ
る。

【０００４】この発明は、式（Ｉ）：

【０００５】

【化４】

【０００６】（式中、前記クラバラン酸と同じ方式で番
号が付され、第２位および第５位における絶対立体化学
構造はクラバラン酸のそれと逆の２Ｓ，５Ｓである）で
表される化合物、その塩または保護された形態の化合物
を提供するものである。したがって式（Ｉ）の化合物、
その塩およびエステルは、２３０−２４０ｎｍの領域
で、円偏光二色性スペクトル（circular Dichroism spe
ctsum）に負のコットン効果を示すが、クラバラン酸は
これと異なり、同領域で正の偏向を示す。

【０００７】式（Ｉ）の化合物およびその塩が有用なの
は、下記のようにクラバラン酸の製造法において中間体
としてはたらく性能を有することにある。式（Ｉ）の化
合物は、双性イオン形態、または塩形態、例えばナトリ
ウム塩のような金属塩、酸付加塩、もしくはアンモニウ
ム塩や、ｔ−アミン塩のような置換アンモニウム塩であ
ってもよい。

【０００８】酸付加塩は、末端のアミノ基に形成させる
ことができ、例えば塩酸、臭化水素酸、オルト燐酸もし
くは硫酸のような無機酸、またはメタンスルフォン酸、
トルエンスルフォン酸、酢酸、プロピオン酸、乳酸、ク
エン酸、フマル酸、リンゴ酸、コハク酸、サリチル酸も
しくはアセチルサリチル酸のような有機酸の塩であって
もよい。

【０００９】金属塩はカルボキシル基に形成させること
ができ、例えばアルミニウム塩、例えばリチウム、ナト
リウム、カリウム、カルシウムおよびマグネシウム塩の
ようなアルカリ金属塩やアルカリ土類金属塩であっても
よい。置換アンモニウム塩としては、Ｃ_1-6アルキルア
ミンの塩でもよく、例えばトリエチルアミン；２−ヒド
ロキシエチルアミン、ビス（２−ヒドロキシエチル）ア
ミンもしくはトリ（２−ヒドロキシエチル）アミンのよ
うなヒドロキシ（Ｃ_{1- 6}）アルキルアミン類；ビシクロ
ヘキシルアミンのようなシクロアルキルアミン類との塩
があり、またはプロカイン、ジベンジルピペリジン、Ｎ
−ベンジル−β−フェネチルアミン、デヒドロアビエチ
ルアミン、Ｎ，Ｎ’−ビスデヒドロアビエチルアミン、
グルカミン、Ｎ−メチルグルカミンまたはピリジン、コ
リジンもしくはキノリンのようなピリジン型塩基との塩
であってもよい。

【００１０】この発明は、その１以上の官能基が保護さ
れた形態の式（Ｉ）の化合物も含むと理解すべきであ
る。したがってそのカルボキシ基が保護されていてもよ
く、アミノ基が保護されていてもよく、また両者が保護
されていてもよい。式（Ｉ）の化合物やこの明細書に記
載されている他の化合物のかような保護された形態のも
のは、“保護形態（protected form）”の用語に含めら
れる。さらに、その明細書に記載の化合物に適用される
“保護形態”の用語は“マスクされた”中間体類も包含
し、これらは、一つの官能基を他の基に変換することが
できる（分子の残余の部分は実質的に変化しないままで
残る）。例えば、アミンの好ましいマスクされた形態に
は、還元反応によって所望のアミンに変換できる対応す
るアジド類およびシアノ類が含まれる（対応するシアノ
化合物は、そのシアノ基の一つの炭素原子を除いて、側
鎖中に一つ少ない炭素原子を有する）。

【００１１】エステル形成性カルボキシ保護基の適切な
ものには、任意に置換された、Ｃ_{1- 6}アルキル、Ｃ_2-6ア
ルケニル、Ｃ_2-6アルキニル、Ｃ_3-7シクロアルキル、ア
リール、アリールＣ_1-6アルキルおよびトリＣ_1-6アルキ
ルシリル基が含まれる。この明細書において用いられる
“アリール”という用語は、フェニルおよびナフチル基
と、それぞれ五つまでの下記基で任意に置換された基を
含む。弗素原子、塩素原子、Ｃ_1-6アルキル、Ｃ_1-6アル
コキシ、ハロ（Ｃ_1-6）アルキル、ヒドロキシ、アミ
ノ、カルボキシ、Ｃ_1-6アルコキシカルボニル、アリー
ルオキシカルボニル、Ｃ_1-6アルコキシカルボニル（Ｃ
_1-6）アルキル、ニトロ、アリールオキシカルボニルオ
キシ、アリールＣ_1-6アルキルオキシカルボニルオキ
シ、Ｃ_1-6アルキルオキシカルボニルオキシ、Ｃ_1-6アル
キルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、ア
リールＣ_1-6アルキルカルボニルオキシまたはアリール
Ｃ_{1 -6}アルキルオキシカルボニル基である。

【００１２】“ハロゲン”という用語は、弗素原子、臭
素原子およびヨー素原子を意味する。したがってハロお
よびハロゲン化物という用語は上記に対応して解釈され
るべきである。この明細書に記載されている、保護基の
任意の置換基の例としては、ハロゲン原子、ヒドロキ
シ、Ｃ_1-6アルコキシ、Ｃ_1-6アルキルチオ、シアノ、ニ
トロ、カルボキシ、カルボン酸Ｃ_1-6アルキルエステ
ル、カルバモイル、アミノ、モノ（Ｃ_1-6）アルキルア
ミノおよびジ（Ｃ_1-6）アルキルアミノ基から選択され
る三つまでの基（同一もしくは異なってもよい）が挙げ
られる。

【００１３】特に適切なエステル形成カルボキシ保護基
は、通常に条件下で除去しうる基である。かような基に
は、メチルおよびエチル基のようなＣ_1-6アルキル基、
ベンジル、ｐ−メトキシベンジル、ベンゾイルメチル、
ｐ−ニトロベンジル、４−ピリジルメチル、２，２，
２，−トリクロロエチル、２，２，２−トリブロモエチ
ル、ｔ−ブチル、ｔ−アミル、アリル、ジフェニルメチ
ル、トリフェニルメチル、アダマンチル、２−ベンゾイ
ルオキソフェニル、４−メチルチオフェニル、テトラヒ
ドロフリ−２−イル、テトラヒドロピラン−２−イル、
ペンタクロロフェニル、アセトニル、ｐ−トルエンスル
フォニルエチル、メトキシメチル基、シリル基、スタン
ニル基または燐含有基が含まれる。

【００１４】カルボキシ基は、上記のいずれのエステル
基からでも、その特定のエステル基に対して適切な通常
の方法、例えば酸触媒加水分解法および塩基触媒加水分
解法、酵素触媒加水分解法または分子の残余部分が実質
的に変化しない条件下での水素添加分解反応によって、
再生することができる。式（Ｉ）の化合物、その塩また
はそのアミノ基が保護された誘導体の好ましいカルボキ
シ保護基はベンジル基である。

【００１５】アミノ基の適切な保護基は、容易に脱離さ
せることのできる基である。アミノ基を保護できる方法
および得られた保護された誘導体の脱離法に関する広範
な議論が、例えばT.W. Greene著“Protective Groups i
n Organic Synthesis”（Wiley-Interscience, New Yor
k,1981)に記載されている。アミノ保護基の適切な例に
は、上記のマスキング基が含まれる。すなわち、任意に
置換されたＣ_1-6アルキルカルボニル；アリールカルボ
ニル；アリールＣ_1-6アルキルカルボニル；（ヘテロシ
クリル）カルボニル（そのヘテルシクリル基は酸素原
子、窒素原子および硫黄原子から選択される四つまでの
異原子を有する５員もしくは６員の芳香族環である）；
そのフェニルリングが、Ｃ_1-4アルキル、Ｃ_1-4アルコキ
シ、トリフルオロメチル、ハロゲン原子またはニトロか
ら選択される一つもしくは二つの置換基で任意に置換さ
れたベンジルオキシカルボニル基のようなカルバメート
を与える基；ｔｅｒ−ブトキシカルボニル基のようなＣ
_{1- 4}アルキルオキシカルボニル基；または２，２，２−
トリクロロエトキシカルボニルもしくは１−クロロエト
キシカルボニルのような、Ｃ_1-4アルコキシ、ハロゲン
原子もしくはニトロ基から選択される三つまでの置換基
によってそのアルキル基が任意に置換されたＣ_1-4アル
キルオキシカルボニル基である。

【００１６】式（Ｉ）の化合物のアミノ基のＮ−保護基
の好ましい例には、下記のように、ペプチド化学におい
てアミノ基を保護するのに通常知られている基が含まれ
る。式（Ｉ）の化合物その塩もしくはカルボキシ基が保
護された誘導体の特に好ましいアミノ保護基はベンジル
オキシカルボニル基である。式（Ｉ）の化合物は、単離
された形態で核酸物質の存在しないものが好ましい。こ
の化合物は、例えば実質的に純粋なものが適切であり、
少なくとも75％純度のものが一層適切であり、少なくと
も85％純度の例えば90〜100％純度のものが好ましい。
一つの好ましい単離形態は固体であるが結晶形態の方が
好ましい。しかし、式（Ｉ）の化合物を純粋でない形態
で用いることを排除するものではない。

【００１７】この発明の化合物を有機溶媒から結晶化も
しくは再結晶させるばあい、結晶化の溶媒が結晶生成物
内に存在していてもよい。この発明は、その権利範囲
に、かような溶媒和物を含む。同様にこの発明の化合物
は、水含有の溶媒から結晶化もしくは再結晶させてもよ
い。この場合、水和物が形成される。この発明は、その
権利範囲に、凍結乾燥のごとき方法で製造できる種々の
量の水を含有する化合物のみならず化学量論的水和物を
含むものである。

【００１８】式（Ｉ）で表される化合物、その塩もしく
は保護形態のこの発明の特定の化合物は次のとおりであ
る。Ｚ−（２Ｓ，５Ｓ）−３−（β−アミノエチリデ
ン）−７−オキソ−４−オキサ−１−アザビシクロ
〔３．２．０〕ヘプタン−２−カルボン酸；Ｚ−（２
Ｓ，５Ｓ）−３−（β−ベンジルオキシカルボニルアミ
ノエチリデン）−７−オキソ−４−オキサ−１−アザビ
シクロ〔３．２．０〕ヘプタン−２−カルボン酸；およ
びベンジルＺ−（２Ｓ，５Ｓ）−３−（β−ベンジルオ
キシカルボニルアミノエチリデン）−７−オキソ−４−
オキサ−１−アザビシクロ〔３．２．０〕ヘプタン−２
−カルボキシレート。

【００１９】またこの発明は、式（II）：

【００２０】

【化５】

【００２１】で表される前駆化合物もしくはその塩を、
所望の環化反応をなすことができる酵素系で処理し、そ
の後、必要もしくは所望により、生成物をその塩もしく
は保護された形態の化合物に変換することからなる、式
（Ｉ）の化合物、その塩もしくは保護形態の化合物の製
造方法を提供するものである。この明細書で用いられる
“酵素系”という用語は、一つの酵素または一系列の酵
素を意味する。

【００２２】またこの発明は、式（II）の化合物、その
塩または保護形態の化合物を提供するものである。式
（II）の化合物は、二つの不斉炭素原子を有し、式中星
印でマークしてある。それ故これらの化合物には四つの
立体異性体がある。この発明は、他の異性体を含有しな
いものとか、または他の異性体といずれかの比率で混合
したものであろうとも、式（II）の化合物の立体異性体
全部を包含し、したがって例えば鏡像体類のラセミ混合
物を包含する。式（II）の化合物もしくはその塩の溶媒
和物、特に水和物もこの発明の範囲に含まれる。またこ
の発明は、式（II）の化合物の保護された誘導体、すな
わち１以上の官能基が保護された形態の化合物も含まれ
る。

【００２３】式（II）の化合物のカルボキシ基とアミノ
基の適切な保護基には、式（Ｉ）の化合物のカルボキシ
基とアミノ基を保護するのに適切な基として前記したも
のが含まれる。式（II）の化合物のカルボキシ基の好ま
しい保護基はベンジル基である。式（II）の化合物のア
ミノ基の好ましい保護基にはベンジルオキシカルボニル
基とアジド基が含まれる。

【００２４】式（II）の化合物のヒドロキシ基の適切な
保護基には、T. W. Greeneが前記文献で論じた基が含ま
れる。特に適切な保護基としては次のようなエステル類
を与える基が含まれる。例えば、アセテートのような任
意に置換されたＣ_1-6アルカノイルエステル基；任意に
置換されたＣ_1-6のアルキルカーボネート基およびアリ
ールカーボネート基；任意に置換されたＣ_1-6アルキ
ル、アリール、およびアリールＣ_1-6アルキルエーテル
基；任意に置換されたトリ−Ｃ_1-6アルキルシリルエー
テル；並びにアセタール類（例えば、テトラヒドロピラ
ニルオキシ誘導体，ＴＨＰエーテルと記載される場合が
ある）である。

【００２５】式（II）の化合物は、単離された形態で核
酸物質を含有しないものが望ましい。この化合物は、例
えば実質的に純粋なものが適切であり、少なくとも純度
が７５％のものがより適切であり、少なくとも純度が８
５％のもの例えば純度９０〜１００％のものが好まし
い。単離された形態として好ましいものとして固体のも
のが挙げられるが、より好ましいのは結晶形態である。
しかし、上記のことから、式（II）の化合物を純粋でな
い形態で用いることが妨げられるものではないと解され
るべきである。

【００２６】式（II）の化合物は双性イオンの形態であ
ってもよい。式（II）の化合物の塩は、例えば酸付加
塩、金属塩、アンモニウム塩および置換アンモニウム
塩、例えば第三アミン塩であってもよい。塩は、カルボ
キシ基と末端アミノ基のいずれかもしくは両者に形成さ
せることができる。適切な塩の例には、化合物（Ｉ）の
塩について前記した基が含まれる。

【００２７】式（II）の化合物、その塩または保護形態
の特定の化合物として、次のものが含まれる。５−アミ
ノ−３−ヒドロキシ−２−（２−オキソアゼチジン−１
−イル）吉草酸（valeric acid）；５−ベンジルオキシ
カルボニルアミノ−３−ヒドロキシ−２−（２−オキソ
−アゼチジン−１−イル）吉草酸；ベンジル ５−ベン
ジルオキシカルボニルアミノ−３−ヒドロキシ−２−
（２−オキソアゼチジン−１−イル）バレレート（vale
rate）；およびベンジル ５−アジド−３−ヒドロキシ
−２−（２−オキソアゼチジン−１−イル）−バレレー
ト。

【００２８】この発明の製造方法は、例えば無細胞系、
すなわち生きた細胞が存在しない系で行うのが適切であ
る。用いられる酵素系は、微生物の特にストレプトミセ
ス種（a species of Streptomyces）由来のものが好ま
しい。かわりに、酵素は遺伝子工学で産出されたもので
あってもよい。

【００２９】無細胞系を用いる場合、無細胞抽出物は、
微生物を音波処理するかもしくは他の破壊処理に付し、
任意に、その後細胞の破片を除去して、溶液の酵素系を
残すことによって作製するのが好ましい。式（Ｉ）の化
合物もしくはその塩を産生する酵素系として適切なもの
は、例えばオキシゲナーゼ酵素からなるものが適切であ
る。

【００３０】このオキシゲナーゼ酵素は、例えばジオキ
シゲナーゼのタイプのものが適切であり、この場合二つ
の酸素原子からなる分子の一つの原子が二つの基質の分
子のそれぞれに移行（transfer）される。この二つの基
質分子は同一でも異なってもよい。式（II）で表される
前駆化合物は、一つの基質分子として仂くことができ、
２−オキソグルタル酸のような２−オキソ−酸のごとき
分子は、第２の基質〔補基質（co-substrate）〕分子と
して仂くことができる。２−オキソグルタル酸が補基質
として仂くこれらの酵素類は、この発明の製造法に用い
るのに好ましいジオキシゲナーゼである。

【００３１】このオキシゲナーゼ酵素は酵素分子を利用
するので、反応を容易にするのに、好ましくは、適切な
溶解酸素圧力（dissolued oxygen ten sion）を維持す
るため十分な酸素を供給すべきであることは、上記のこ
とか ら理解されるであろう。酸素の、気相から溶液
相への移行は、反応媒体を撹拌もしくは振盪することに
よって効果的に促進することができる。

【００３２】補基質と酸素に加えて、このオキシゲナー
ゼ酵素反応混合物は、１以上の他の補因子を含有してい
てもよい。通常これらの補因子には、第一鉄イオンの添
加源が含まれるが、最も適切なものとして、例えば硫酸
第一鉄がある。オキシゲナーゼ酵素源の好ましいもの
は、ストレプトミセス種の菌株であるが、例えばエス・
クラブリゲルス、エス・ジュモンジネンシス（S.jumonj
inensis）、エス・カツラハマヌス（S.Katsurahamanu
s）およびエス・リップマニー（S.lipmanii）の菌株も
しくはこれら由来の菌株である。特にこれら微生物の次
の菌株が有用である。すなわち、エス・クラブリゲルス
ＡＴＣＣ ２７０６４、エス・ジュモンジネンシス
ＡＴＣＣ ２９８６４、エス・カツラハマヌス Ｔ−２
７２、エス・リップマニー ＮＲＲＬ ３５８４であ
る。

【００３３】この発明の好ましい酵素は、エス・クラブ
リゲルス ＡＴＣＣ ２７０６４由来のものであり、下
記の特性を示す。 (a) 前記定義の、式（II）の化合物もしくはその塩を、
前記定義の、式（Ｉ）の化合物もしくはその塩に変換す
る機能； (b) ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電
気泳動法による試験での、約４８０００ダルトンの分子
量に対応するシングルバンド； (c) 等電点電気泳動法による試験での、５．６５の等電
点（ＰＩ）。

【００３４】このオキシゲナーゼ酵素は、特に、適切な
液体もしくは半固体の培地中、好気的条件下、通常のし
かたで、微生物を培養することによって製造することが
できる。一般に、微生物が消化吸収しうる炭素と窒素の
ソースと、微生物の生育に必須の無機塩栄養はその培養
基中に含有されている。オキシゲナーゼ酵素中の補欠分
子族の性質から見て、この培養基は、例えば鉄のような
金属イオン源を含有していなければならない。培養条件
は、温度が１０℃〜８０℃でｐＨが３〜１０の条件であ
る。好ましい条件は、２０〜３０℃，ｐＨ５〜９、適切
なのはｐＨ７で、０．５〜５時間である。

【００３５】キシゲナーゼ酵素は単離され純粋形態で使
用されてもよく、また、純粋でない状態でえられたり、
破壊された細胞の製剤の濾液もしくは組成の細胞ホモジ
ネートのような部分的に（若干）精製されたものであっ
てもよい。最も適切な酵素は、例えば少なくとも部分的
に精製され、前記の前駆物質、酵素もしくはクラバム核
の破壊を触媒するかもしれない他の酵素が除去されたも
のである。酵素は不溶性のポリマーの担体に結合させて
もよい。

【００３６】この発明の方法は一般に水性培地で行わ
れ、その反応混合物は、ｐＨ４〜９に保持するのが適切
で、より適切なのは例えば６．５〜８．５で、好ましい
のは約ｐＨ７．０〜７．５である。ｐＨの制御は、例え
ば３−（Ｎ−モリフォルノ）プロパンスルホン酸緩衝液
（ｐＨ７）のような緩衝液を使って行うのが適切であ
る。代わりにｐＨは、適切な酸もしくは塩基を添加する
ことによって制御してもよい。反応温度は使用酵素に適
する温度でなければならないが一般に１５〜６０℃であ
り、好ましいのは約３０℃である。反応時間は、反応物
質と補因子の濃度、温度およびｐＨのごとき因子に依存
する。

【００３７】前駆体（II）もしくはその塩は、例えば酵
素と混合する前に、緩衝液に溶解するのが適切である。
前駆体の溶液の濃度は、その溶解性に依存するが、通
常、前駆体溶液の濃度は５％Ｗ／Ｖ〜０．００１％Ｗ／
Ｖの範囲にある。反応が完了した後、酵素を反応混合物
から分離し、ついで式（Ｉ）の化合物もしくはその塩を
通常の方法で単離することができる。式（Ｉ）の化合物
もしくはその塩の初期の精製法には通常、クロマトグラ
フィ工程が含まれている。式（Ｉ）の化合物は、そのカ
ルボキシ基および／またはアミノ基が保護された形態で
単離されてもよく、次いで所望により、その保護基は除
去されて化合物（Ｉ）を純粋な形態で生成させてもよ
い。

【００３８】無細胞系を使う代わりに、この発明の方法
は健全な（無傷の）微生物を用いて行ってもよい。式
（II）で表される前駆化合物もしくはその塩を準備して
おいて、微生物と接觸させて式（Ｉ）の化合物もしくは
その塩を産生させる。その微生物は、生育培養物、静止
培養物、洗浄菌糸体、固定化細胞もしくは原形質体の形
態であってもよい。

【００３９】式（II）の化合物は、式（III）；

【００４０】

【化６】

【００４１】（式中、Ｘは脱離基、感応基の−ＣＯ
₂Ｈ，−ＯＨおよび−ＮＨ₂は保護されていてもよい）で
表される化合物を環化することによって製造できる。Ｘ
で表される脱離基は、その反応条件下で出発物質から開
裂し、所定の部位で反応を促進する基である。この基Ｘ
は、ヒドロキシ基、または任意にハロゲン原子で置換さ
れた硫酸エステルのようなエステル化されたヒドロキシ
基；臭素、塩素もしくはヨウ素のようなハロゲン基；ｐ
−トルエンスルフォニルオキシ（トシル基）もしくはメ
タンスルフォニルオキシ基（メシル基）のようなアリー
ル−もしくはアルキル−スルホニルオキシ基；またはア
ルキルオキソニウム塩であってもよい。

【００４２】上記の製造法は塩基性条件下で行うのが好
ましい。例えば水酸化ナトリウムもしくは水酸化カリウ
ムまたは水素化ナトリウムもしくは水素化カリウムの存
在下で行われる。環化反応は次のように行うことができ
る。 ａ）Ｘがハロゲン原子、アリール−もしくはアルキル−
スルフォニルオキシまたはアルコールのアルキルオキソ
ニウム塩の場合、例えばジメチルスルフォキシド、ジメ
チルホルムアミド、ヘキサメチルフォスフォルアミド、
ジクロロメタン、アセトニトリルもしくは酢酸エチルの
ような溶媒、またはこれら溶媒の混合物の存在下で行
う、 ｂ）Ｘがハロゲン原子またはクロロサルフェートエステ
ルのようなアルコールのサルフェートエステル基の場
合、テトラブチルアンモニウムバイサルフェートもしく
はテトラブチルアンモニウムハライド、またはベンジル
トリメチルアンモニウムハライドのごとき第四アンモニ
ウム塩の存在下、水性および／または有機溶液中で相転
移触媒法（phase transfer catalysis method）によっ
て行う、 ｃ）Ｘがヒドロキシの場合、（Ｃ₆Ｈ₅）₃Ｐ／Ｃ₂Ｈ₅Ｏ₂
ＣＮ＝ＮＣＯ₂Ｃ₂Ｈ₅のような適切な試薬の存在下で行
なう。

【００４３】式化合物（III）中のアミノ基のＮ−保護
基の適切な例には、ペプチド化学において、この用途で
通常知られている基が含まれる。かような基の例として
次のものが含まれる。アセチル、クロロアセチル、トリ
フルオロアセチル、ブチリル、ベンゾイル、フェニルア
セチル、ピリジンカルボニルのようなカルボン酸基；エ
トキシカルボニル、ベンゾイルオキシカルボニル、ｔ−
ブトキシカルボニル、ビフェニルイソプロポキシカルボ
ニル、ｐ−メチルベンジルオキシカルボニル、ｐ−ニト
ロベンジルオキシカルボニル、ｐ−ブロモベンジルオキ
シカルボニル、ｐ−フェニルアゾベンジルオキシカルボ
ニル、ｐ−（ｐ−メトキシフェニルアゾ）ベンジルオキ
シカルボニル、ｔ−アミルオキシカルボニル基のような
炭酸由来の酸の基；スルフォン酸もしくはｐ−トルエン
スルフォン酸由来の酸の基；またはベンジル、トリチ
ル、ホルミル、フタロイル、ｏ−ニトロフェニルスルフ
ェニル、ベンジリデンまたはニトロ基のような他の基で
ある。好ましいＮ−保護基には、ｔ−ブトキシカルボニ
ルとベンジルオキシカルボニル基が含まれる。ある場
合、窒素原子は、前記基の二つ、例えばベンジル基とベ
ンジルオキシカルボニル基とで置換されてもよい。一方
アミノ基は、アジド基もしくはシアノ基の形態で保護さ
れていてもよく、これは適切な方法、例えば還元反応に
よって生成させることができる。

【００４４】得られた化合物中の保護基の除去は、保護
基の種類にしたがって適切な方法で行うことができる。
いくつかの典型的方法を挙げると次のとおりである。末
端アミノ基を保護する、ベンジルオキシカルボニル、ｐ
−ニトロベンジルオキシカルボニル、ｐ−ブロモベンジ
ルオキシカルボニル、ｐ−フェニルアゾベンジルオキシ
カルボニル、ｐ−（ｐ’−メトキシフェニルアゾ）ベン
ジルオキシカルボニルおよびトリチル基の、パラジウム
触媒（例えばパラジウム炭、パラジウム黒）の存在下で
の水素化反応；末端アミノ基を保護する、ベンジルオキ
シカルボニル、ｐ−ブロモベンジルオキシカルボニル、
ｐ−フェニルアゾベンジルオキシカルボニル、ｔ−ブト
キシカルボニル基の氷酢酸中臭素化水素での処理；末端
アミノ基を保護する、ベンジルオキシカルボニル、ｐ−
ブロモベンジルオキシカルボニルおよびトシル基の、液
体アンモニア中金属ナトリウムでの処理；末端アミノ基
を保護する、トリチル、ｔ−ブトキシカルボニル、ホル
ミルおよびベンジリデン基の、塩酸および／または酢酸
による処理である。代わりに、脱保護（deprotection）
は適切な加水分解酵素、例えばアミダーゼで行うことが
できる 。末端のアジドもしくはシアノ基は、例え
ばパラジウム触媒の存在下での水素添加反応によってア
ミノ基に還元することができる。

【００４５】化合物（III）中の基−ＣＯ₂Ｈについての
カルボキシ基ブロッキング誘導体の適切な例として、こ
のカルボン酸の塩やエステルの誘導体が挙げられる。こ
の誘導体は、反応の後期の段階で容易に開裂できるもの
が好ましい。塩の適切な例には、ナトリウム、カリウム
およびリチウムの塩のような金属、ならびにトリ（Ｃ
_1-6）アルキルアミン、Ｎ−エチルピペリジン、２，６
−ルチジン、ピリジン、Ｎ−メチルピロリジンもしくは
ジメチルピペラジンのような第三アミンの塩のような塩
が含まれる。好ましい塩はトリエチルアミン塩である。

【００４６】化合物（III）中のエステル形成カルボキ
シ保護基の適切な例は、式（Ｉ）と（II）との化合物の
カルボキシ基を保護するのに適していると前記したのと
同様に、通常の条件下で除去できる基である。このヒド
ロキシ基は式（II）の化合物のヒドロキシ基と同様の方
式で保護されていてもよく、例えばシリルエーテルの形
態か、またはエステル誘導体、特に、アセテート誘導体
のようなＣ_1-6アルカノイルであってもよい。

【００４７】式（III）の化合物は、その官能基は遊離
しているかもしくは１以上が保護された形態であるが、
新規化合物でありこの発明の一態様を形成するものであ
る。式（III）の化合物は、下記の、式（IV）の化合物
もしくはそのＮ−アシル化誘導体と式（Ｖ）の化合物も
しくはその誘導体とをカップリングさせてアシル化する
ことによって製造することができる。

【００４８】

【化７】

【００４９】（式中、Ｘは前記定義と同じ、いずれの官
能基も保護されてもよい） この保護基の性質とその除去法は、式（III）について
先に論じたのと同じである。保護された形態の化合物
（III）から保護基を除かずに、環化させて、前記のよ
うな保護された形態の式（II）の化合物を製造するのが
簡便なことは勿論である。

【００５０】アシル化反応を起こさせかつ式（Ｖ）の出
発物質のα−アミノ基に任意に存在する基の適切な例に
は、Ｎ−シリル、Ｎ−スタンニルおよびＮ−燐含有基が
含まれ、例えばトリメチルシリル基のようなトリアルキ
ルシリル基、トリ−ｎ−ブチル錫基のようなトリアルキ
ル錫基、式−ＰＲ^aＲ^bの基（式中Ｒ^aはアルキル、アラ
ルキル、アルコキシ、ハロアルキル、アリール、ハロア
ルコキシ、アリールオキシ、アラルキルオキシもしくは
ジアルキルアミノ基；Ｒ^bはＲ^aと同じもしくはハロゲン
原子；またはＲ^a、Ｒ^bは合して環を形成する）があり、
適切な燐含有基としては、例えば−Ｐ（ＯＣ₂Ｈ₅）₂、
−Ｐ（Ｃ₂Ｈ₅）₂、

【００５１】

【化８】

【００５２】酸（IV）の反応性Ｎ−アシル化誘導体を上
記製造法に用いてもよい。反応性誘導体の選択はその酸
の置換基の化学的性質に影響されることは勿論である。
Ｎ−アシル化誘導体の適切な例は酸ハライドであり、好
ましいのは酸塩化物もしくは酸臭化物である。酸ハライ
ドによるアシル化反応は、次のような酸結合剤の存在下
で行ってもよい。例えばトリエチルアミンもしくはジメ
チルアニリンのような第三アミン、水酸化ナトリウムも
しくは炭酸水素ナトリウムのごとき無機塩基、またはオ
キシランがあり、これらはアシル化反応で放出されるハ
ロゲン化水素と結合する。オキシランとしては、エチレ
ンオキシドもしくはプロピレンオキシドのような（Ｃ
_1-6）−１，２−アルキレンオキシドが好ましい。酸ハ
ライドを用いるアシル化反応は、−５０℃〜＋５０℃の
温度範囲で、次のような水性もしくは非水性媒体中で行
ってもよく、例えば水性アセトン、水性テトラヒドロフ
ラン、酢酸エチル、ジメチルアセタミド、ジメチルホル
ムアミド、アセトニトリル、ジクロロメタン、１，２−
ジクロロエタン、またはこれらの混合物がある。かわり
にこの反応は、水と不混和性の溶媒、特にメチルイソブ
チルケトンもしくは酢酸ブチルのような脂肪族のエステ
ルもしくはケトンの不安定なエマルジン中で行ってもよ
い。

【００５３】式（IV）の酸のＮ−アシル化誘導体の他の
適切な例には、スクシンイミド、フタルイミド、ｐ−ニ
トロフェニルエステルのごとき活性化されたエステル、
または化合物（IV）の無水物もしくは化合物（IV）と他
の酸との混合無水物が含まれる。かわりに式（IV）の化
合物は、脱水試薬を用いて、適切なのはＮ，Ｎ’−ジシ
クロヘキシル−カルボジイミドもしくは（１，３−ジメ
チルアミノプロピル）−３−エチル−カルボジイミドの
ようなカルボジイミド試薬を用いて、式（Ｖ）の化合物
にカップリングさせてもよい。

【００５４】このカルボジイミド・カップリング反応
は、カルボジイミド試薬の性質や化合物（IV）と（Ｖ）
内の保護基にしたがって、水と不混和性の溶媒、水と混
和性の溶媒、二層系溶媒または水と水混和性溶媒との混
合物中で行うことができる。ペプチド合成用に用いられ
る他のカップリング試薬の例えばジピリジルジスフィド
／トリフェニルフォスフィンなども、化合物（IV）と
（Ｖ）とから式（III）の化合物を製造するのに適切な
ものである。

【００５５】また式（III）の化合物は、式（VI）：

【００５６】

【化９】

【００５７】（式中、Ｘは前記定義と同じ）で表される
化合物を還元することによって製造することができる。
この還元反応は、例えばＮａＢＨ₄、Ｚｎ（ＢＨ₄）₂も
しくはＮａＢＨ₃ＣＮのような水素化物の還元剤を用い
て適切な水性もしくは有機の溶媒中で行われる。代わり
に、化合物（VI）を適切な補因子の存在下、適切な酵素
で還元してもよく、または酵母もしくは肝臓細胞のよう
な全細胞を用いて還元してもよい。 式（VI）の化合物
は、式（IV）の化合物もしくはそのアシル化誘導体を式
（VII）：

【００５８】

【化１０】

【００５９】で表される化合物とカップリングさせるこ
とによって製造できる。化合物（VII）のカルボキシ基
およびδアミノ基は適切に保護されていてもよい。保護
基の適切な例には、式（III）の化合物の保護用に前記
した基が含まれる。加うるに、化合物（VII）内のカル
ボニル基は、例えばT. W. Greeneが述べた当該技術分野
で公知の方法（前記文献）で保護してもよい。式（IV）
の化合物を式（Ｖ）の化合物とカップリングさせる前記
方法は、式（IV）の化合物を式（VII）とカップリング
させるのに使用できる。また、式（III）の化合物が製
造されるまでかまたは実際に保護された形態の式（II
I）の化合物が環化してしまうまで、いずれの保護基も
除去しないのが好都合である。

【００６０】式（VII）の化合物は、例えば無水の有機
溶媒中の塩基の存在下で、下記の式（VIII）の化合物も
しくは（IX）の化合物（式中Ｒはエステル形成カルボキ
シブロックキング基）とグリシン（Ｘ）とを縮合結合さ
せることによって製造できる。

【００６１】

【化１１】

【００６２】塩基の適切な例として、水素化ナトリウム
もしくは水素化カリウムのような無機塩基およびリチウ
ムジイソプロピルアミンもしくはリチウムビス（トリメ
チルシリル）アミドのような有機塩基が挙げられる。エ
ステル形成基Ｒは、例えばアルキルもしくはアラルキル
基であってもよい。化合物（VIII）、（IX）および
（Ｘ）のアミノ基およびカルボキシ基は保護されていて
もよい。化合物（IX）との反応中、グリシン（Ｘ）のカ
ルボニル基がエステル形成基で保護されている場合、そ
の基は基Ｒと同じ基が好ましい。

【００６３】適切な保護基には、式（III）の化合物に
ついて先に記載されたものが含まれる。例えば化合物
（VIII）と（IX）のアミノ基はアジドもしくはシアノ基
として保護されてもよく、この基はその後アミノ基に変
換することができる。化合物（Ｘ）におけるアミノ基
は、Ｎ−（ジフェニルメチレン）もしくはイソニトリル
誘導体として保護される。

【００６４】式（Ｖ）の化合物は、類似の方法で製造す
ることができる。例えば、式（XI）： Ｈ₂Ｎ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＣＨＯ （XI） の化合物とグリシン〔式（Ｘ）〕とを縮合結合させるこ
とによって製造できる。グリシン（Ｘ）のカルボキシ
基、およびグリシン（Ｘ）と化合物（XI）とのアミノ基
は、上記保護基によって適切に保護することができる。

【００６５】またこの発明は、式（XIA）： Ｙ−ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨＯ （XIA） （式中、Ｙはハロゲン原子もしくはアミノ基であり、そ
のアミノ基は任意に保護されている）で表される化合物
と、式（XII）：

【００６６】

【化１２】

【００６７】（式中、カルボキシ基は保護されていても
よい）で表される化合物もしくはその塩とを縮合結合さ
せ、次いで必要もしくは所望により下記工程： (i) 基Ｙをアミノ基に変換する、(ii)生成物をその遊離
酸、塩もしくは保護形態に変換する、の１以上を行うこ
とからなる、式（II）の化合物、その塩もしくは保護形
態の化合物の製造法を提供するものである。

【００６８】式（XIA）の化合物としては、前記の式（X
I）の化合物が好ましい。この縮合反応は、化合物（VI
I）の製造について前記した塩基性条件を用いて行うこ
とができる。化合物（XII）のカルボキシ基は適切に保
護されていてもよく化合物（XI）のアミノ基は保護され
ていてもよい。例えばこのアミノ基は、アジド基もしく
はシアノ基として保護されていてもよく、還元によって
生成させてもよい。

【００６９】この発明の他の好ましい態様として、化合
物（XI）の代わりに、出発物質として、式（XI’）： ＣｌＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨＯ （XI’） で表される対応する塩化化合物を用いることができる。
化合物（XII）との縮合反応で製造される化合物は、化
合物（II）に類似するが末端にアジド基を有する化合物
に変換することができる。例えば、ジメチルスルフォキ
シドのような適切な溶媒中、アジ化ナトリウムのような
適切なアジド化合物と反応させることによって行われ
る。次いで、この末端のアジド基を還元することによっ
て化合物（II）を生成させることができる。

【００７０】またこの発明は別の態様として、式（XII
I）：

【００７１】

【化１３】

【００７２】（式中、カルボキシ基とアミノ基は、所望
により前記方法によって保護されていてもよい）で表さ
れる化合物もしくはその塩を還元し、次いで必要に応じ
て(i) いずれの保護基も除去する、(ii)生成物をその遊
離酸、塩もしくは保護された形態に変換することからな
る、式（II）の化合物、その塩もしくはその保護された
形態の化合物の製造法を提供するものである。

【００７３】有用な還元剤の適切な例は、例えば水性も
しくは有機溶媒の媒体中の、ＮａＢＨ₄、ＮａＢＨ₃Ｃ
Ｎ、Ｚｎ（ＢＨ₄）₂のような水素化金属の錯化合物であ
る。代わりに、化合物（XIII）を、適切な補因子の存在
下適切な酵素で還元するか、酵母もしくは肝臓細胞のご
とき全細胞を用いて還元してもよい。式（XIII）の化合
物は、式（VIII）もしくは（IX）の化合物から、例えば
前記の塩基性条件を用いて、式（VII）の化合物と縮合
結合させることによって製造できる。

【００７４】別の方法で、式（II）の化合物は、式（XI
V）：

【００７５】

【化１４】

【００７６】で表される化合物を還元させることによっ
て製造することができる。化合物（XIV）の官能基は上
記のように保護されてもよい。適切な保護基としては、
式（III）の化合物について前に述べた基が挙げられ
る。環化させるために、そのプロピオニル部分のカルボ
キシ基と第二アミンの基は保護しないで残しておくのが
好ましい。化合物（XIV）の環化は脱水剤を用いて行う
ことができる。ペプチド合成に通常用いられる試薬が適
切である。例えばオルボジイミド試薬、もしくはトリフ
ェニルフォスフィンとジピリジルジスルフィドとの混合
物を用いることができる。カルボジイミド試薬は、用い
られる特定の試薬によるが通常水性もしくは有機の溶媒
中で用いられる。トリフェニルフォスフィン／ジピリジ
ルジスルフィド試薬は、例えば有機溶媒中、普通アセト
ニトリル中で適切に用いられる。

【００７７】上記のことから、式（II）の化合物は、式
（XIV）の化合物もしくは前記定義の式（III）の化合物
を環化させることによって製造できることが分かる。し
たがってこの発明は、式（XIVA）：

【００７８】

【化１５】

【００７９】〔式中、Ｚは式ＨＯ₂ＣＣＨ₂ＣＨ₂ＮＨ−
もしくはＸＣＨ₂ＣＨ₂ＣＯＮＨ−（式中Ｘは脱離基）、
およびいずれの反応性基も保護されていてもよい〕で表
される化合物もしくはその塩を環化させ、次いで必要に
応じて下記工程： (i) いずれの保護基も除去する、(ii)生成物をその遊離
酸、塩もしくは保護された形態に変換する、の１以上の
工程を行うことからなる、式（II）：

【００８０】

【化１６】

【００８１】で表される化合物、その塩もしくは保護さ
れた形態の化合物の製造方法を提供するものである。式
（XIV）の化合物は、下記の式（Ｖ）の３−ヒドロキシ
オルニチンと下記の式（XV）の化合物とを反応させるこ
とによって製造できる。

【００８２】

【化１７】

【００８３】化合物（Ｖ）の中のα−カルボキシ基とδ
−アミノ基は保護されていてもよい。例えばδ−アミノ
基はベンジルオキシカルボニル基によって保護すること
ができる。化合物（XV）のカルボキシ基は、遊離形態、
塩の形態、または他の保護された形態であってもよい。
適切な保護基は、例えばエステル基である。かような場
合、トリクロロエチルエステルが通常用いられる。この
エステル基は、通常、反応後、亜鉛／酢酸／テトラヒド
ロフランの混合物を用いて除去される。

【００８４】また式（II）の化合物は、通常のβ−ラク
タム製造技術によって製造できる。例えば式（XVI）：

【００８５】

【化１８】

【００８６】で表される化合物を、例えばフェニルスル
フェニルクロリドを用い、次いで相転移触媒（phase tr
ansfer catalyst）とともに水酸化カリウムを用いる合
成法で式（II）の化合物に変換することができる。この
製造法は、“ワン・ポット”合成法（“one-pot”synth
esis）として行うのが好ましい。別の 方
法で、下記の式（XVII）の化合物と下記式（Ｖ）の化合
物とを、例えば−７０℃より低温、好ましくは−７８℃
で、最初にｔ−Ｃ₄Ｈ₉ＯＣｌを次いで亜硝酸銀を用いる
合成法で反応させることができる。

【００８７】

【化１９】

【００８８】この製造法はワン・ポット合成法として行
うのが好ましい。前記の両方の製造法では、反応に関与
しないいずれの官能基も保護されていてもよく、所望に
よりその保護基はその後に除去されてもよい。上記反応
において、必要もしくは所望により、出発物質の遊離ヒ
ドロキシ基、カルボキシ基またはアミノ基は、前記反応
中の当該技術分野で普通用いられる保護基によって保護
されていてもよい。その保護基は、所望により、製造後
に通常の公知方法によって除去できる。

【００８９】またこの発明は、新規な中間体類を包含す
るものであり、これらは遊離型であっても、またはその
官能基の１以上が保護された形態であってもよい。上記
のことから、この発明は、式（XVIII）：

【００９０】

【化２０】

【００９１】（式中、官能基は保護されていてもよく、
Ｚ¹は水素原子もしくはＣＨ₂＝ＣＨ−ＣＯ−である。）
で表される化合物もしくはその塩を、Ｚ¹ＮＨ−基（式
中、Ｚ¹は上記定義と同じ）を下記式：

【００９２】

【化２１】

【００９３】のβ−ラクタム部に変換しうる当該技術分
野で公知の試薬で処理し、次いで、必要もしくは所望に
より、下記工程： (i) いずれの保護基も除去する (ii)生成物をその遊離酸、塩もしくは保護された形態に
変換する、 の１以上を行うことからなる、式（II）：

【００９４】

【化２２】

【００９５】で表される化合物、その塩もしくはエステ
ルの製造方法を提供するものであることが分かるであろ
う。式（IV）、（VIII）、（IX）、（Ｘ）、（XI）、
（XI’）、（XII）、（XV）、（XVI）および（XVII）の
化合物は、公知の化合物であるか、または公知方法もし
くは公知方法に類似の方法で公知の化合物から製造でき
る。

【００９６】また化合物（II）は、酵素による合成法例
えば無細胞合成法、またはエス・クラブリゲルス、エス
・ジュモンジネンシス、エス・カツラハマヌスもしくは
エス・リップマニーのようなストレプトミセス種の適切
な菌株から単離する方法によって製造できる。化合物
（II）を適切に単離するには、菌糸体を破壊し、その細
胞成分から化合物（II）を単離することが必要である。
精製された形態の化合物（II）を単離するには通常クロ
マトグラフィ処理を要する。

【００９７】代わりに、化合物（II）は、不純かもしく
はある程度純粋な形態で用いてもよい。式（II）の化合
物の塩は、塩の出発物質を用いる前記の方法で製造して
もよい、または製造された遊離型の化合物（II）を次い
で塩に変換してもよいことは理解されるであろう。また
所望により、製造された化合物（II）の塩は、所望によ
り、塩にされていない遊離の化合物に変換してもよい
し、化合物（II）の他の塩に変換してもよい。

【００９８】式（II）の化合物の塩は、例えば式（II）
の化合物を適当な酸もしくは塩基で処理することによっ
て製造してもよい。上記方法で製造された式（II）の化
合物とその塩は、通常の方法で回収することができる。
式（II）の化合物は、所望により、メタノール、酢酸エ
チルもしくはその混合物のような適切な溶媒から分別結
晶することによって、鏡像体（enantiomer）のジアステ
レオ異性体の対（diastereoisomeric p airs）に分離す
ることができる。このようにして得られた鏡像体の対
は、通常の手段で個々の立体異性体に分離することがで
き、例えば分割剤として光学的に活性な塩を用いると
か、またはズブチリシンのごときエステラーゼのような
適切な酵素を用いて保護基を立体選択的に除去すること
によって行われる。式（II）で表されるジアステレオ異
性体の混合物中のジアステレオ異性体の比率は、１，５
−ジアザビシクロ〔４．３．０〕ノネ−５−エンのごと
き非求核性塩基で処理することによって変化させること
ができる。

【００９９】分割剤として用いることができる、適切な
光学的に活性な化合物は、“Topics in Stereochimistr
y" Vol.6, Wiley Interscience, 1971, Allinger, N.
L.and Eliel, W. L., Eds.に記載されている。上記とは
異なり、式（II）の化合物のいずれの鏡像体も、公知の
立体配置を有する光学的に純粋な出発物質を用いる立体
特異合成法で得ることができる。

【０１００】またこの発明は、クラバラン酸の合成に用
いる式（II）の化合物もしくはその塩を包含する。この
発明は、他の態様、式（Ｉ）の化合物もしくはその塩を
酵素系で処理することからなる、クラバラン酸もしくは
その塩の製造方法を提供するものである。またこの発明
によればかような方法で製造されるときはいつも、クラ
バラン酸もしくはその塩が提供される。

【０１０１】利用される酵素系は、微生物の特にストレ
プトミセス種由来のものが好ましい。この方法は無細胞
系で行うのが適切である。クラバラン酸の無細胞合成法
として適切なのは、式（Ｉ）の化合物もしくはその塩
を、ストレプトミセス種の抽出物で処理することからな
る方法である。そのストレプトミセス種としては、クラ
バラン酸産生種が適切である。

【０１０２】ストレプトミセス種からの抽出物は酵素系
を含有している。無細胞抽出物は、ストレプトミセスの
細胞を音波処理もしくは他の破壊方法に付し、任意にそ
の後細胞破片を除去して酵素系を溶液もしくは懸濁液と
して残して製造するのが好ましい。その酵素系は別のソ
ース由来のものであってもよい。例えばその酵素は遺伝
子工学によって適切に製造してもよい。好ましい酵素系
は、ストレプトミセスのクラバラン酸産生種由来のもの
であり、例えばエス・クラブリゲルス、エス・ジュモン
ジネンシスおよびエス・カツラハマヌスもしくはこれら
由来の菌株、例えば変異菌株由来のものである。これら
の微生物の下記菌株は特に適切である。すなわちエス・
クラブリゲルスＡＴＣＣ ２７０６４、エス・ジュモン
ジネンシスＡＴＣＣ ２９８６４およびエス・カツラハ
マカスＴ−２７２である。

【０１０３】無細胞系を用いる代わりに、上記製造法は
健全な微生物を用いて行ってもよい。この場合、式
（Ｉ）で表される前駆化合物もしくはその塩を、その微
生物に接触させクラバラン酸もしくはその塩を産生させ
る。その微生物は、増殖培養物、静止培養物、洗浄菌糸
体、固定化細胞もしくは原形質体の形態であってもよ
い。この酵素系は、通常の方式の、特に適切な液体もし
くは半固体の培地中、好気的条件下で微生物を培養する
ことによって製造できる。一般に、微生物が消化吸収し
うる炭素と窒素のソースと、微生物の生育を促進するの
に通常使用される無機塩栄養は、その培養基中に含有さ
れている。その培養条件は、１０℃〜８０℃の範囲の温
度と３〜１０の範囲のｐＨである。好ましい条件は、２
０℃〜３０℃、ｐＨ５〜９であり、例えばｐＨが約７で
０．５〜５日間である。この酵素系は、単離して純粋な
形態で用いてもよいが、破壊された細胞製剤の濾液もし
くは粗製の細胞のホモジネートのような不純な状態で得
られるある程度精製された形態でもよい。

【０１０４】この酵素系として最も適切なものは、前駆
物質（Ｉ）、酵素もしくは反応生成物の破壊反応を触媒
するかもしれない他の酵素を除去するために少なくとも
ある程度精製されているものである。その酵素は不溶性
担体に固定されていてもよい。この製法は一般に水性媒
体中で行われ、反応混合物はｐＨ４〜９に、より適切に
は例えば６．５〜８．５に保持される。このｐＨは、当
該技術分野で公知の通常の緩衝液を用いて適切に制御さ
れる。一例として、例えば３−（Ｎ−モルフォリノ）プ
ロパンスルフォン酸緩衝液（ｐＨ７）が用いられる。反
応温度は使用酵素に適する温度でなければならないが、
一般に１５℃〜４０℃の範囲にあり、約３０℃が好まし
い。反応時間は、反応体の濃度、温度およびｐＨのよう
な因子に左右される。

【０１０５】式（Ｉ）の化合物もしくはその塩は、例え
ば酵素系と混合される前に緩衝液に溶解するのが適切で
ある。その濃度は式（Ｉ）の化合物もしくはその塩の溶
解度に左右される。式（Ｉ）の化合物もしくはその塩の
溶液の適切な濃度は、５％ｗ／ｖ〜０．００１％ｗ／ｖ
の範囲である。反応完了後、酵素を反応混合物から分離
し、次いでクラバラン酸もしくはその塩を通常の方法で
単離することができる。クラバラン酸もしくはその塩の
初期の精製には、通常クロマトグラフィが必要である。

【０１０６】この発明は、他の態様として、式（II）で
表される前駆体もしくはその塩を、前記のごとき酵素系
で処理することによって、クラバラン酸もしくはその塩
に変換する方法を提供するものである。この反応は、化
合物（Ｉ）もしくはその塩を中間で単離せずに無細胞合
成法で行うのが適切である。代りに、式（II）の化合物
のクラバラン酸への変換は、健全な微生物を直接用いて
行われる。

【０１０７】この発明を下記実施例で説明する。そこに
引用された百分率はすべて重量基準であり、比率はすべ
て容量基準で与えられている。¹ＨＮＭＲスペクトルに
ついて、“交換しうる”と記載されているプロトンはＤ
₂Ｏとともに振盪すると重水素と交換する。

【０１０８】実施例１ ベンジル ５−アジド−３−ヒドロキシ−２−（２−オ
キソアゼチジン−１−イル）−バレレート 乾燥窒素雰囲気下、ベンジル２−（２−オキソアゼチジ
ン−１−イル）アセテート（３．２８ｇ，１５mmol）の
乾燥テトラヒドロフラン（５ml）溶液を、あらかじめ−
７０℃に冷却したリチウムビス（トリメチルシリル）ア
ミド（１モル濃度のテトラヒドロフラン溶液１５ml）に
加えた。添加速度はその溶液の温度が−６０℃以上にな
らないようにし、添加完了后、反応混合物を−７０℃で
１５分間撹拌した。反応液に３−アジドプロピオンアル
デヒド（１８mmol）のテトラヒドロフラン（５ml）溶液
を温度を−６０℃以下に維持しながら加えた。−７０℃
で更に２時間撹拌后反応混合物を酢酸（０．８６ml，１
５mmol）の水（２ml）溶液で処理し、常温になるまで放
置した。

【０１０９】生成物を酢酸エチル中に抽出し、水，重炭
酸ソーダの飽和溶液及び水で順次洗浄し、硫酸マグネシ
ウムで乾燥し、蒸発してオレンジ色の油状物を得た。こ
の油状物を酢酸エチル／ヘキサン（２：１）を溶離剤と
するシリカゲル（メルク番号９３８５）のクロマトグラ
フィに付してベンジル ５−アジド−３−ヒドロキシ−
２−（２−オキソアゼチジン−１−イル）バレレートを
淡黄色油状物（２．７２ｇ，３６％）を得た。

【０１１０】この物はジクロロメタン／酢酸エチル／エ
タノール（６０：１０：１）混合物を溶離剤とするシリ
カゲルプレート（メルク番号５７１９）の薄層クロマト
グラフィーに付し、よう素蒸気で可視化処理した結果Ｒ
ｆが夫々０．４４と０．４０であるジアステレオ異性体
の１：２の混合物であることが判った。 ＩＲ：ν max（ＫＢｒ）3107,2100および1733cm^-1 ＮＭＲ：δＨppm （CDCl₃；250MHz）1.76 (1H, m), 1.9
6 (1H, m), 3.02 (2H, m), 3.32 (2H, m), 3.49 (2H,
m), 4.03 (1H, d, J 3.3Hz), 4.28 (1H, m), 4.51(1H,
d, J 5Hz, 交換可能）5.23 (2H, s)および7.34 (5H,
s).

【０１１１】実施例２ ベンジル ５−アジド−３−ヒドロキシ−２−（２−オ
キソアゼチジン−１−イル）−バレレートのエピマー化 実施例１と同様にして作ったベンジル ５−アジド−３
−ヒドロキシ−２−（２−オキソアゼチジン−１−イ
ル）バレレート（４．１ｇ，１２．８mmol）のジクロロ
メタン（４００ml）溶液に、１，５−ジアザビシクロ
〔４．３．０〕ノネ−５−エン（１．８６ｇ，１４．９
mmol）を加えて室温で１時間撹拌した。減圧下で溶媒を
除去し残った油状物の１／２を、ジクロロメタン、酢酸
エチル及びエタノール（６０：１０：１）混合物を用い
るシリカゲル（メルク番号９３８５）のカラム（４５×
４．５ｃｍ）のクロマトグラフィーに付して、ベンジル
５−アジド−３−ヒドロキシ−２−（２−オキソアゼチ
ジン−１−イル）バレレートの速く移動するジアステレ
オ異性体の油状物（１．１ｇ）（これは放置すると結晶
化する）および速く移動するジアステレオ異性体と遅く
移動するジアステレオ異性体との３０：７０混合物の油
状物（５８mg）を得た。反応混合物の残りの１／２を同
じ条件でクロマトグラフィーに付し、同様量の、速く移
動するジアステレオ異性体および二つのジアステレオ異
性体の混合物とを得た。

【０１１２】速く移動するジアステレオ異性体をヘキサ
ンから再結晶して白色針状結晶を得、その物性は次のと
おりであった。 融点：６３〜６４℃ ＩＲ：ν max（ＫＢｒ）3400, 2101, 1725, 1263, 752,
699cm^-1 ＮＭＲ：δＨppm （CDCl₃，400MHz），1.7 (1H, m), 1.
84 (1H, m) 3.03 (2H, m), 3.35 (1H, m), 3.43 (1H,
m), 3.51 (2H, m), 4.04 (1H, d, J 3Hz), 4.32 (2H,
m), 5.23および5.26 (2H, ABq, J 12Hz),および7.37 (5
H, s). 元素分析 Ｃ₁₅Ｈ₁₈Ｎ₄Ｏ₄ Ｃ Ｈ Ｎ 実測値 ５６．６３ ５．６４ １７．５０（％） Ｃ Ｈ Ｎ 計算値 ５６．５９ ５．７０ １７．６０（％）

【０１１３】ベンジル ５−アジド−３−ヒドロキシ−
２−（２−オキソアゼチジン−１−イル）バレレートの
遅く移動するジアステレオ異性体はこのジアステレオ異
性体を或割合で含んでいる試料を同じ方式でクロマトグ
ラフィーに付して油状物として得られた。物性は次のと
おり。 ＮＭＲ：δＨｐｐｍ（ＣＨＣｌ₃，２５０ＭＨｚ），
１．７８（１Ｈ，ｍ），１．９７（１Ｈ，ｍ），２．９
９（２Ｈ，ｔ，Ｊ ４．５Ｈｚ），３．３３（２Ｈ，
ｍ），３．５（２Ｈ，ｍ），４．０４（１Ｈ，ｄ，Ｊ
４．５Ｈｚ），４．２７（１Ｈ，ｍ），４．５２（１
Ｈ，ｄ，Ｊ ５Ｈｚ），５．２２（２Ｈ，ｍ）および
７．３６（５Ｈ，ｓ）． 低速移動（遅く移動する）ジアステレオ異性体は前記の
如く１，５−ジアサビシクロ〔４．３．０〕ノネ−５−
エンで処理することによって、高速移動（速く移動す
る）ジアステレオ異性体と低速移動ジアステレオ異性体
を夫々３：１の比で含有する混合物に異性化される。

【０１１４】２つのジアステレオ異性体は、アクリロニ
トリル、酢酸及びジクロロメタンの８：０．１：９１．
９の比の混合物を溶離剤とするスフェリソーブ（Ｓｐｈ
ｅｒｉｓｏｒｂ）のシリカカラムで構成される高速液体
クロマトグラフィ（ｈｐｌｃ）システムを用い、２５４
ｎｍの紫外光による検出で容易に分析できる。

【０１１５】実施例３ベンジル ５−アジド−３−ヒドロキシ−２−（２−オ
キソアゼチジン−１−イル）バレレートの高速移動ジア
ステレオ異性体の分割 ベンジル ５−アジド−３−ヒドロキシ−２−（２−オ
キソアゼチジン−１−イル）バレレートの高速移動ジア
ステレオ異性体（３００mg，０．９４mmol）をアセトン
（５．５ml）と０．１モル濃度のりん酸緩衝液（２５m
l）に溶解し３７℃で撹拌した。シグマ・ケミカル社
（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．Ｌｔｄ．）の
ズブチリシン・カールスバーグ（Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ
Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ）（５０ml）を加え、メトローム
ｐＨスタット（Ｍｅｔｒｏｈｍ ｐＨＳｔａｔ）を使い
反応混合物を水酸化ナトリウムの１モル濃度溶液で、ｐ
Ｈ７．６に維持した。追加の水酸化ナトリウムが使われ
なくなってから約５時間半后に、溶液のｐＨを９．５に
調整し、次いでその溶液を酢酸エチルで抽出した。その
有機相を水で洗浄しＭｇＳＯ₄で乾燥し加水分解してな
いエステル（１４２mg）を得た。水相を希塩酸でｐＨ
３．０に酸性化し、そして酢酸エチルで抽出した。不安
定な油状物を乾燥し（ＭｇＳＯ₄）、５−アジド−３−
ヒドロキシ−２−（２−オキソアゼチジン−１−イル）
吉草酸（８３mg）を得た。 加水分解してないエステル
の試料を酢酸エチル／ヘキサン／エタノール（４０：６
０：２）を溶離剤とするシリカゲル（メルク番号９３８
５）のカラム・クロマトグラフィーに付して鏡像体とし
て純粋なベンジル ５−アジド−３−ヒドロキシ−２−
（２−オキソアゼチジン−１−イル）バレレートを得
た。 〔α〕²⁰ _D＋３１．８°（Ｃ２．０％；ＣＨＣｌ₃） １ＨのＮＭＲスペクトルは出発物質と同一であった。

【０１１６】実施例４エチル ５−アジド−３−ヒドロキシ−２−（２−オキ
ソアゼチジン−１−イル）バレレート エチル ５−クロロ−３−ヒドロキシ−２−（２−オキ
ソアゼチジン−１−イル）バレレート（３．４５ｇ，１
３．８mmol）とアジ化ナトリウム（１．１０ｇ，１７mm
ol）の乾燥ジメチルスルホキサイド（２０ml）溶液を５
５〜６５℃で５時間撹拌した。反応混合物をジクロロメ
タンで稀繹し、その有機相を３回水で洗浄し乾燥（Ｍｇ
ＳＯ₄）し蒸発した。残渣を酢酸エチル／ヘキサン
（２：１）を溶離剤とするシリカゲル（メルク番号９３
８５）のクロマトグラフィーに付しエチル ５−アジド
−３−ヒドロキシ−２−（２−オキソアゼチジン−１−
イル）バレレートを淡黄色油状物として収率７３％
（２．５９ｇ）で得た。０．２ｍｍＨｇ，１８５〜１９
５℃でバルブ・ツウ・バルブ蒸溜法（ｂｕｌｂ ｔｏｂ
ｕｌｂ ｄｉｓｔｉｌｌａｔｉｏｎ）に付して更に精製
して無色油状物が得られた。 ＩＲ：ν max（ＫＢｒ）3405, 2102および1733cm^-1． ＮＭＲ：δppm （CHCl₃，250MHz）1.31 (3H, t, J 7H
z), 1.81 (1H, m), 1.87 (1H, m), 3.03 (2H, t, J 3H
z), 3.40 (2H, m), 3.53 (2H, m), 4.00 (1H, d, J3.5
Hz), 4.25 (3H, m)および4.53 (1H, d, J 4.5Hz, 交換
可能）．

【０１１７】実施例５５−アジド−３−ヒドロキシ−２−（２−オキソアゼチ
ジン−１−イル）吉草酸 ５−アジド−３−ヒドロキシ−２−（２−オキソアゼチ
ジン−１−イル）バレレート（０．７７ｇ，３mmol）の
テトラヒドロフラン（１３ml）と水（１３ml）混合物の
溶液を炭酸カリウム（０．４４５ｇ，３．２mmol）の水
（２．５ml）溶液で、反応混合物のｐＨが１１．５以上
に上がらないようにしながら処理した。溶媒を蒸発后、
生成物をエタノール中に抽出し、濾過し、エタノールを
溶離剤とするシリカゲル（メルク番号９３８５）のクロ
マトグラフィーに付して白色固体（３９６mg）を得た。
この物質（２００mg）を水に溶解し、ＩＲ１２０（Ｈ）
イオン変換樹脂のカラムを通して、５−アジド−３−ヒ
ドロキシ−２−（２−オキソアゼチジン−１−イル）吉
草酸（９２mg）を油状物として得た。この油状物は徐々
に白色固体に代る。この化合物は更に精製しないで使用
された。 ＮＭＲ：δＨppm ［(CD₃)₂SO＋D₂O］1.69 (2H, m), 2.8
9 (2H, t, J 3Hz), 3.40(4H, m), 3.89 (1H, m) および
4.10 (1H, d, J 6.6Hz).

【０１１８】実施例６エチル ５−クロロ−３−ヒドロキシ−２−（２−オキ
ソアゼチジン−１−イル）バレレート 乾燥窒素雰囲気下、エチル ２−（２−オキソアゼチジ
ン−１−イル）アセテート（８．４５ｇ，５４mmol）の
乾燥テトラヒドロフラン（２０ml）溶液を、−７０℃に
冷却したリチウムビス（トリメチルシリル）アミド（テ
トラヒドロフラン中１モル濃度溶液５５ml）に加えた。
添加速度はその溶液の温度が−６０℃以上に上がらない
ように行った。添加完了後反応混合物は−７０℃で１５
分間撹拌した。３−クロロプロピオンアルデヒド（６５
mmol）のエーテル（９０ml）溶液を−６０℃以下に保持
しながら反応混合物へ加えた。−７０℃でさらに２時間
撹拌后、反応混合物を酢酸（３．５ml）の水（３ml）溶
液で処理し、常温になるまで放置した。

【０１１９】生成物は酢酸エチル中に抽出し、水，飽和
重炭酸ナトリウム溶液及び水で順次洗浄し、乾燥（Ｍｇ
ＳＯ₄）し、蒸発して油状物を得た。この油状物を酢酸
エチル／ヘキサン（２：１）で溶離するシリカゲル（メ
ルク番号９３８５）のクロマトグラフィーに付して、エ
チル ５−クロロ−３−ヒドロキシ−２−（２−オキソ
アゼチジン−１−イル）バレレートを油状物として収率
２９％（３．９０ｇ）で得て、エチル２−（２−オキソ
アゼチジン−１−イル）アセテートを５％回収した。

【０１２０】生成物は更に０．３ｍｍＨｇ，１７０〜１
８０℃でバルブ・ツウ・バルブ蒸溜で精製することがで
きた。 ＩＲ：ν max（ＫＢｒ）3383及び1734cm^-1． ＮＭＲ：δＨppm （CDCl₃，60MHz）1.31 (3H, t, J 6H
z), 2.09 (2H, m), 3.03(2H, m), 3.39 (2H, m), 3.70
(2H, m)及び4.25 (5H, m,プロトン１ケ交換可能）．

【０１２１】実施例７ベンジルＮ⁵−ベンジルオキシカルボニル−３−ヒドロ
キシオルニチネート塩酸塩 ベンジルＮ−（ジフェニルメチレン）グリシネート
（３．６ｇ，１１mmol）の乾燥テトラヒドロフラン（１
５ml）溶液を乾燥窒素雰囲気下、−７０℃に冷却し撹拌
しながら、これにリチウムビス（トリメチルシリル）ア
ミド（１モルＴＨＦ溶液の１１ml）を約２０分間かけて
滴下し、反応混合物の温度が−６０℃以上に上昇しない
ようにした。反応混合物を−７０℃で２０分間撹拌し、
次いで再び温度を−６０℃以下に保ちながら、Ｎ−ベン
ジルオキシカルボニル−３−アミノプロピオンアルデヒ
ド（３ｇ，１４．５mmol）の乾燥テトラヒドロフラン
（１５ml）溶液を滴下した。反応物を更に−７０℃で７
分間撹拌した。反応混合物が自然に−２０℃になってか
ら、良く撹拌されているエーテル（１００ml）とｐＨ
７．０のりん酸緩衝液（１００ml）との混合物中に注ぎ
込んだ。エーテル相を分離し、水相をエーテルで抽出し
た（２×５０ml）。有機抽出物を合わせて水で洗浄し、
乾燥（ＭｇＳＯ₄）して蒸発し油状物（７．２ｇ）を得
た。この物の¹ＨＮＭＲスペクトルはこれが実質的に純
粋なベンジルＮ²−ジフェニルメチレン−Ｎ⁵−ベンジル
オキシカルボニル−３−ヒドロキシオルニチネートであ
ることを示した。この化合物をエーテル（２５ml）に溶
解し、２規定塩酸（２５ml）を加え、室温で２時間激し
く攪拌した。反応混合物を濾過してベンジルＮ⁵−ベン
ジルオキシカルボニル−３−ヒドロキシオルニチネート
塩酸塩のジアステレオ異性体混合物を淡黄色の固体とし
て得た（２．４ｇ）。この物３００mgをエタノールから
再結晶して溶解度の小さいジアステレオ異性体（１１０
mg）を得た。この生成物の物性は次のとおり。

【０１２２】融点 １９５〜１９７℃ ＩＲ：ν max（ＫＢｒ）3300, 1708, 1691, 1272c
m^-1 ． ＮＭＲ：δＨppm ［(CD₃)₂SO］1.69 (2H, m), 3.1 (2H,
m), 3.98 (1H, m), 4.11 (1H, d, J 2.5Hz), 5.0 (2H,
s), 5.18 (1H, d, J 12.5Hz), 5.28 (1H, d, J12.5H
z), 5.77 (1H, d, J 5Hz), 7.36 (10H, m), 8.53 (3H,
br. s). 元素分析 Ｃ₂₀ Ｈ₂₅ Ｃｌ Ｎ₂ Ｏ₅ Ｃ Ｈ Ｎ Ｃｌ 実測値 58.67 5.96 6.67 8.76 （％） 計算値 58.74 6.16 6.85 8.76 （％） 濾液からエタノールを蒸発し、残渣を酢酸エチルで研和
して、濾過后溶解度の小さいジアステレオ異性体をさら
に得た（１００mg）。濾液を蒸発してベンジルＮ⁵−ベ
ンジルオキシカルボニル−３−ヒドロキシオルニチネー
ト塩酸塩の溶解度の大きいジアステレオ異性体をガム状
物として得た。 ＮＭＲ：δＨppm 〔(CD₃)₂SO〕1.67 (H, m), 3.14 (2H,
m), 4.10 (2H, m), 4.99 (2H, s), 5.20 (1H, d, J 1
2.5Hz), 5.30 (1H, d, J 12.5Hz), 5.80 (1H, d,J 5H
z), 7.38 (10H, m) 及び8.44 (3H, br.s). これは溶解度の小さいジアステレオ異性体の少量を不純
物として含んでいた。

【０１２３】ベンジルＮ²−ジフェニルメチレン−Ｎ⁵−
ベンジルオキシカルボニル−３−ヒドロキシオルニチネ
ートの加水分解后残った酸溶液からジアステレオ異性体
混合物をさらに回収した。酸溶液をエーテル相から分離
し、ｐＨを６．０に調整し、水を蒸発で除去した。ガム
状残渣にエタノールを加え、蒸発させてガム状物（１．
５ｇ）を得た。ガム状物をアセトンで研和し固体を濾過
し、濾液からアセトンを蒸発させて、ベンジルＮ⁵−ベ
ンジルオキシカルボニル−３−ヒドロキシオルニチネー
ト塩酸塩の溶解度の大きいジアステレオ異性体を主体と
するジアステレオ異性体混合物（５００mg）を得た。ジ
アステレオ異性体の分離はエチルアセテートでの研和で
達成できる。ベンジルＮ⁵−ベンジルオキシカルボニル
−３−ヒドロキシ−オルニチネート塩酸塩の全収量は
２．９ｇ（６５％）であった。

【０１２４】実施例８ベンジルＮ²−（β−カルボキシエチル）−Ｎ⁵−ベンジ
ルオキシカルボニル−３−ヒドロキシオルニチネート 約９０％の溶解度の小さいジアステレオ異性体と約１０
％の溶解度の大きいジアステレオ異性体を含むベンジル
Ｎ⁵−ベンジルオキシカルボニル−３−ヒドロキシオル
ニチネート塩酸塩（１．０ｇ，２．４mmol）の水（１５
ml）溶液を、酢酸エチル（１５０ml）とともに撹拌し、
水酸化ナトリウムの稀薄溶液でｐＨを７．７５に調整し
た。水性相を分液し酢酸エチルで抽出した（３×１００
ml）。有機相を集めて乾燥（ＭｇＳＯ₄）し、蒸発して
ベンジルＮ⁵−ベンジルオキシカルボニル−３−ヒドロ
キシオルニチネート（０．５７ｇ）を部分的に結晶化し
た油状物として得た。この物（４３０mg，１．１５mmo
l）をアクリル酸（０．７８８ml，１１．５mmol）を含
む蒸留したアセトニトリル（１５ml）に溶解し、３日間
室温で撹拌した。得られた白色沈澱を濾別し、数ミリリ
ットルのアセトニトリルで洗浄してベンジルＮ²−（β
−カルボキシエチル）Ｎ⁵−ベンジルオキシカルボニル
−３−ヒドロキシオルニチネート（３９０mg，７６％）
を得た。 融点 153.5−154.5℃（アセトニトリル） ＩＲ：ν max (ＫＢｒ） 3336, 1740, 1691, 1633, 153
3, 750および698cm^-1. ＮＭＲ：δＨppm [(CD₃)₂SO ；250MHz〕1.45 (1H, m),
1.73 (1H, m), 2.31 (2H, t, J 6.6Hz), 2.56 (1H, m),
2.74 (1H, m), 3.06 (3H, m), 3.37 (2H, br s), 3.63
(1H, m), 5.00 (2H, s), 5.12 (2H, s), 7.19 (1H, t,
J 5.3Hz）および7.35 (10H, m). 元素分析 C₂₃ H₂₈ N₂ O₇ Ｃ Ｈ Ｎ ＭＨ⁺ （p. i. F. A. 実測値 61.86 6.18 6.21 445 Ｂ．チオグ 計算値 62.15 6.35 6.30 444 リセロール）

【０１２５】実施例９ベンジル ５−ベンジルオキシカルボニルアミノ−３−
ヒドロキシ−２−（２−オキソアゼチジン−１−イル）
バレレート ベンジルＮ²−（β−カルボキシエチル）−Ｎ⁵−ベンジ
ルオキシカルボニル−３−ヒドロキシオルニチネート
（２２７mg，０．５１mmol）含有の蒸留アセトニトリル
（５０ml）を、再結晶した２，２’ジピリジル ジサル
ファイド（１３５mg，０．６１mmol）とトリフェニルホ
スフィン（１６０mg，０．６１mmol）と共に８時間還流
下で加熱した。減圧下でアセトニトリルを除去し、残渣
をエーテル／エタノール（４９：１）、酢酸エチル／イ
ソプロピルアルコール（１９：１）及びヘキサン／アセ
トン／イソプロピルアルコール（８：８：１）を溶離剤
として繰返して使用するシリカゲル（メルク番号９３８
５）のクロマトグラフィーに付し、題記化合物の低速移
動ジアステレオ異性体を油状物（２１７mg，６４％）と
して得た。この油状物は徐々に結晶化した。 融点 ６６〜６８℃（酢酸エチル／ヘキサン） 〔Ｒｆ０．２２ シリカゲルプレート（メルク番号５７
１９）の薄層クロマトグラフィー，溶離剤はジクロロメ
タン／酢酸エチル／エタノール（６０：１０：１）〕 ＩＲ：ν max (ＫＢｒ） 1725, 742, および698cm^-1 ＮＭＲ：δＨppm （CDCl₃, 250MHz), 1.85 (2H, m), 2.
98 (2H, t, J 4.2Hz), 3.40 (4H, m), 4.09 (1H, d, J
3.3H), 4.17 (1H, m), 4.69 (1H, d, J 4.1Hz) (D₂O で
交換）, 5.10 (2H, s), 5.22 (3H, m)および7.36 (10H,
m). 元素分析 C₂₃ H₂₆ N₂ O₇ Ｃ Ｈ Ｎ ＭＮ⁺ （p. i. F. A. 実測値 64.81 6.12 6.55(%) 427 Ｂ．チオグ 計算値 64.77 6.15 6.57(%) 426 リセロール）

【０１２６】実施例１０ベンジル ５−ベンジルオキシカルボニルアミノ−３−
ヒドロキシ−２−（２−オキソアゼチジン−１−イル）
バレレートのエピマー化 実施例９に記載したのと同様にして製造した題記化合物
の低速移動ジアステレオ異性体（０．７mg，１．６μmo
lを、実施例２と同様に１，５−ジアザビシクロ〔４．
３．０〕ノネ−５−エン（０．２５μｌ，２．０μmo
l）含有のジクロロメタン（３５０μｌ）で処理した。
９０分後反応混合物を高速液体クロマトグラフィーに付
した。クロマトグラフィーの条件は下記の通り。

【０１２７】カラム：スフェリソーブ（Spherisorb）５
μＭシリカ 溶離剤：酢酸エチル−ヘキサン−酢酸（５０：４９．８
５：０．１５）混合物 流速：１．５ml／min. 検出：２５４nm紫外線 その結果、高速移動ジアステレオ異性体（保持時間９．
７分）と低速移動ジアステレオ異性体（保持時間１１．
１分）との７１：２９の混合物に変化したことが分かっ
た。高速移動ジアステレオ異性体は、両ジアステレオ異
性体の混合物からジクロロメタン／酢酸エチル／エタノ
ール（６０：１０：１）を溶離剤とするシリカゲル（メ
ルク番号９３８５）のクロマトグラフィーで分離でき
る。シリカプレート（メルク番号５７１９）を使用した
薄層クロマトグラフィーにおいて、同じ溶媒系で、高速
移動ジアステレオ異性体はＲｂ ０．２５、低速移動ジ
アステレオ異性体はＲｂ ０．２２であった。高速ジア
ステレオ異性体は次のスペクトル特性値を示す。

【０１２８】 ＩＲ：ν max (ＫＢｒ） 1725, 1527, 752および698； ＮＭＲ：δＨppm （CDCl₃, 250MHz) 1.70 (2H, m), 3.01 (2H, t. J4Hz), 3.37 (4H, m), 4.
34 (1H, d, J 3Hz), 4.28 (1H, m) 4.49 (1H, d, 8.4H
z), 5.10 (3H, m), 5.21 (2H, m)および7.35 (10H, m).

【０１２９】実施例１１ベンジル ５−ベンジルオキシカルボニルアミノ−３−
オキソ−２−（２−オキソアゼチジン−１−イル）バレ
レート ベンジル ２−（２−オキソアゼチジン−１−イル（ア
セテート（１．２５ｇ，５．７mmol）を乾燥テトラヒド
ロフラン（４０ml）に溶解し、乾燥窒素雰囲気下−６０
℃に冷却した。リチウムビス（トリメチルシリル）アミ
ド（１．０モルヘキサン溶液６．２７ml）を１０分間か
けて滴下し、混合物を更に１５分間−６０℃で撹拌し
た。β−ベンジル−オキシカルボニルアミノプロオニル
クロライド（２．４１ｇ，１０mmol）の乾燥テトラヒド
ロフラン（１０ml）溶液を１５分間かけて添加し、混合
物は−６０℃で更に２時間撹拌した。

【０１３０】酢酸（０．５ml）と酢酸エチル（４００m
l）とを反応混合物に加え、次いで水（５０ml）、ブラ
イン（５０ml）および飽和重炭酸ナトリウム溶液（５０
ml）で洗浄し、乾燥した（ＭｇＳＯ₄）。溶媒は減圧下
低温で蒸発し、得られた粗生成物を酢酸エチルを溶離剤
とするシリカゲル（メルク番号９３８５）のカラムクロ
マトグラフィーで精製して、ベンジル ５−ベンジルオ
キシカルボニルアミノ−３−オキソ−２−（２−オキソ
アゼチジン−１−イル）バレレート（０．４１５ｇ，１
７．１％）をガム状物として得た。 ＩＲ：ν max (ＫＢｒ） 3382, 1760, 1719, 1522およ
び1247； ＮＭＲ：δ（CDCl₃, 250MHz) 2.58 (1H, t, 7Hz), 2.9
(2H, m), 3.1 (1H, m),3.4 (3H, m), 4.0 (1H, m), 5.0
7 (2H, s), 5.20 (2H, s ）および7.35 (10H, m).

【０１３１】実施例１２ベンジル ５−ベンジルオキシカルボニルアミノ−３−
ヒドロキシ−２−（２−オキソアゼチジン−１−イル）
バレレート ベンジル−５−ベンジルオキシカルボニルアミノ−３−
オキソ−２−（２−オキソアゼチジン−１−イル）バレ
レート（６．９mg，１６μmol）のテトラヒドロフラン
（１．５ml）溶液を水素化ほう素ナトリウム（２．２m
g，５８μmol）で処理した。１時間後反応混合物を実施
例１０と同様の条件で高速液体クロマトグラフィーに付
して分析した。反応混合物は、題記化合物の高速移動ジ
アステレオ異性体と同化合物の低速移動ジアステレオ異
性体とを５５：４５の比で含有しまた未反応出発物質も
含んでいた。

【０１３２】実施例１３５−アミノ−３−ヒドロキシ−２−（２−オキソ−アゼ
チジン−１−イル）吉草酸の製造 実施例１と同様にして製造したジアステレオ異性体混合
物としての、ベンジル５−アジド−３−ヒドロキシ−２
−（２−オキソ−アゼチジン−１−イル）−バレレート
（１．６ｇ，５mmol）を、エタノール（４５ml）及び水
（７ml）中で、炭素にパラジウム５％担持した触媒（９
００mg）により常圧で水素添加した。水素を吸収しなく
なった時に反応混合物を濾過し、濾液を蒸発してガム状
物を得た。エーテルで研和して個体を得、これを濾別
し、真空乾燥して碎け易い泡状物を得た。この泡状物メ
タノールで研和して白色固体と淡黄色の溶液を得た。そ
の固体を濾別、乾燥し、題記化合物の難溶成ジアステレ
オ異性体（２４９mg）を白色粉末として得た。

【０１３３】融点 152−153℃ ＩＲ：ν max (ＫＢｒ） 3422, 1709, 1637, 1578, 137
6, 1333, 1248, 1228および1151； ＮＭＲ：ppm （D₂O, 250MHz), 1.93 (2H, m), 3.03 (2
H, t, J 4Hz), 3.21 (2H,m), 3.55 (2H, m）及び4.21
(2H, m)； δＣppm （D₂O, 100MHz) 31.06, 36.23, 37.99, 41.03,
62.49, 69.54, 172.40および174.74. 淡黄色のメタノール溶液を蒸発させ、難溶性の上記ジア
ステレオ異性体と、良溶解性のジアステレオ異性体の混
合物を粉末（５７４．２mg）として得た。２Ｄ炭素−プ
ロトンＮＭＲ相関実験（２Ｄ carbon-proton ＮＭＲ c
orrelation experiment）の結果は次のとおりであっ
た。 （δＣ：δＨ）； 30.9, 1.90 ； 31.5, 1.84 ； 36.2,
2.95 ； 37.8, 3.15 ；41.0, 3.44 ； 41.0, 3.56 ；
62.39, 4.18 ； 62.89, 4.13 ； 69.47, 4.16および6
9.47, 4.26.

【０１３４】実施例１４５−アミノ−３−ヒドロキシ−２−（２−オキソアゼチ
ジン−１−イル）吉草酸の製造 ベンジル ５−アジド−３−ヒドロキシ−２−（２−オ
キソアゼチジン−１−イル）バレレートの高速移動ジア
ステレオ異性体（０．７６ｇ，２３．９mmol）を、エタ
ノール（２０ml）と水（５ml）との混合物中、炭素に５
％担持させたパラジウムの触媒で１時間水素添加した。
触媒を濾別し、濾液を蒸発した。残ったガム状物をエー
テルで研和し、濾過して題記化合物を淡黄色固体（４５
６mg，９７％）として得た。黄色に着色した不純物は酢
酸エチルで研和して除去した。題記化合物（４００mg）
は水／エタノール（１５：８５）を溶離剤とするシリカ
ゲル（メルク番号９３８５）のカラムクロマトグラフィ
ーによって更に精製して、題記化合物（２９０mg）を、
１／７モル当量のエタノールを含む白色固体として得
た。 ＮＭＲ：δＨppm （D₂O, 400MHz) 1.16 (t, CH₃ CH₂ O
H), 1.84 (2H, m), 3.00(2H, t, J 3.9Hz), 3.15 (2H,
m), 3.50 (1H, m), 3.58 (1H, m), 3.63 (q, CH₃CH₂ O
H), 4.07 (1H, d, J 5.4Hz), 4.19 (1H, m), δＣ（D₂
O, 100MHz), 31.66, 36.12, 37.61, 40.99, 63.19, 69.
54, 174.79および174.97. 試料を水性メタノールで再結晶して白色角柱状結晶を得
た。 融点 130−135℃ ＩＲ：ν max (ＫＢｒ） 3349, 1723, 1653, 1611, 139
0, 918および769.

【０１３５】実施例１５鏡像体として純粋なベンジル ５−アジド−３−ヒドロ
キシ−２−（２−オキソ−アゼチジン−１−イル）バレ
レートからの ５−アミノ−３−ヒドロキシ−２−（２
−オキソアゼチジン−１−イル） 吉草酸 実施例３に記載したように高速移動ジアステレオ異性体
をズブチリシン・カールスバーグ（subtilisin Carlsbe
rg）により処理して得た鏡像体として純粋なベンジル
５−アジド−３−ヒドロキシ−２−（２−オキソ−アゼ
チジン−１−イル）バレレート（１４０mg）（〔α〕²⁰
_D＋３１．８°（Ｃ ２．０、ＣＨＣｌ₃））をエタノー
ル（７ml）−水（２ml）中で炭素に５％担持させたパラ
ジウムの触媒を使って水素添加した。濾過後、溶液を蒸
発させ油状物を得た。この油状物をメタノールに溶解
し、濾過し、濾液を蒸発して ５−アミノ−３−ヒドロ
キシ−２−（２−オキソアゼチジン−１−イル）吉草酸
を白色（６１mg）として得た。 〔α〕²⁰ _D＋７．００（Ｃ ０．５％、Ｈ₂Ｏ）¹ Ｈ ＮＭＲは、実施例１４で製造した化合物と一致し
た。

【０１３６】実施例１６ベンジル ２−（２−オキソ−〔２−¹³Ｃ〕アゼチジン
−１−イル）−〔１，２−¹³Ｃ₂〕アセテートａ）ベン
ジル〔１，２−¹³Ｃ₂〕グリシネートのトシレート塩 各位の Ｃが９９．５原子％である〔１，２−¹³Ｃ₂〕
−グリシン（１．１ｇ、１４．３mmol）含有のベンジル
アルコール（７ml、６７．６mmol）＋トルエン（２０m
l）混合物を、ディーン・スターク（Dean and Stark）
装置を使い、ｐ−トルエンスルホン酸（３．１ｇ、１
６．３mmol）と還流下３時間加熱した。反応混合物を冷
却し、撹拌エーテル（１５０ml）中に注ぎ込んだ。生成
した結晶性固体を濾別し、エーテル（１５ml）で洗浄
し、乾燥してベンジル〔１，２−¹³Ｃ₂〕グリシネート
のトシレート塩（４．５１ｇ、９３％）を得た。 融点 130−132℃（標識されていない化合物は132〜134
℃） ＩＲ：ν max (ＫＢｒ） 1707, 1223, 1183および687cm
^-1 ＮＭＲ：δＨppm 〔(CD₃)₂SO, 250MHz〕2.30 (3H, s),
3.90 (2H, dd, J 144.8および6.5HZ), 5.25 (2H, d, J
3.5Hz), 7.30 (4H, dd, J 92および8.0Hz), 7.40 (5H,
m)および8.25 (3H, br s). δＣ〔(CD₃)₂SO, 100MHz〕39.7 (d, J 62.1Hz), 167.5
(d, J 62.1Hz) ．

【０１３７】この物質は、その¹³ＣＮＭＲスペクトルか
らみて、そのグリシン部分の第１位と２位において９
９．５原子％¹³Ｃであると判断した。 ｂ）ベンジルＮ−（３−ブロモ−〔１−¹³Ｃ〕プロピオ
ニル）−〔１，２−¹³Ｃ ₂〕−グリシネート 上記のようにして製造されたベンジル〔１，２−
¹³Ｃ₂〕グリシネート（３．２３ｇ，９．５２mmol）の
トシレート塩を、水（１５ml）とテトラヒドロフラン
（１５ml）との混合物中に入れ４℃で激しく撹拌した。
その間に標準的な方法で作られた３−ブロモ−〔１−¹³
Ｃ〕−プロピニルクロライド（１．６４ｇ，９．５１mm
ol，９１原子％の¹³Ｃ〕のテトラヒドロフラン（５ml）
溶液を１０分間かけて滴下した。反応混合物のｐＨを、
水酸ナトリウム稀薄溶液によって、その添加中及び更に
４５分間５．５〜６．５に保った。反応混合物を酢酸エ
チル（１５０ml）で稀繹し、有機相を分離し飽和ブライ
ンで洗浄し乾燥した（ＭｇＳＯ₄）。乾燥した溶液を蒸
発して白色固体を得、これをヘキサン（３０ml）で研和
してベンジルＮ−（３−ブロモ−〔１−¹³Ｃ〕プロピオ
ニル）−〔１，２−¹³Ｃ₂〕−グリシネート（２．７
ｇ，９４％）を得た。その物性は次のとおりであった。

【０１３８】融点６２．５−６４．０℃； ＩＲ：ν max (ＫＢｒ） 3309, 1694, 1611, 1537, 755
および701cm^-1； ＮＭＲ：δＨppm 〔(CDCl₃), 250MHz〕2.83 (2H, m),
3.63 (2H, m), 4.13 (2H,dddd, J 141.5, 7.9, 5.4およ
び2.8Hz), 5.20 (2H, d, J 3.2Hz), 6.10 (1H, br s)お
よび7.36 (5H, s)；δCppm (CDCl₃, 100MHz) 41.5 (d,
61.6Hz), 169.6 (dd, J 61.8 および2Hz)および169.7
(d, J 2Hz). 元素分析 C₉ ¹³C₃ H₁₄ NO₃ Br C H N M⁺ 実測値 48.26 4.65 4.62(％) 302.0254 計算値 48.53 4.65 4.62(％) 302.0259

【０１３９】ｃ）ベンジル２−（２−オキソ−〔２−¹³
Ｃ〕アゼチジン−１−イル）−〔１，２−¹³Ｃ₂〕アセ
テート 水酸化カリウム粉末（１．０５ｇ，１８．７mmol）とテ
トラブチルアンモニウムブロマイド（０．７８ｇ，２．
４mmol）を１００℃で２時間真空乾燥し、冷却し、ジク
ロロメタンとアセトニトリルの（１９：１）混合物（３
００ml）中に懸濁させた。この混合物を激しく撹拌し３
０〜４０℃で超音波処理をし、ベンジルＮ−（３−ブロ
モ−〔１−¹³Ｃ〕−プロピオニル）−〔１，２−
¹³Ｃ₂〕グリシネート（２．５ｇ，８．２mmol）含有の
ジクロロメタン／アセトニトリル（１９：１）混合物
（３００ml）を５時間かけて添加した。反応混合物を撹
拌し更に１５分間超音波処理をし、不溶解物質は濾別
し、濾液を蒸発乾固した。得られた油状物はエーテルで
完全に抽出し（２×８０ml）、エーテル相を合わせて蒸
発した。残渣は酢酸エチル／ヘキサン（１：１）を用い
るシリカゲル（メルク番号９３８５）のクロマトグラフ
ィーに付して、出発物質であるベンジルＮ−（３−ブロ
モ−〔１−¹³Ｃ〕−プロピオニル）−〔１，２−
¹³Ｃ₂）グリシネート（０．８４ｇ，３３％）とベンジ
ル ２−（２−オキソ〔２−¹³Ｃ〕アゼチジン−１−イ
ル）−〔１，２−¹³Ｃ₂〕アセテートを油状物（０．３
６ｇ，２０％）として得た。

【０１４０】ＩＲ：ν max (ＫＢｒ） 1700, 742および
700cm^-1； ＮＭＲ：δＨppm (CDCl₃, 250MHz) 3.04 (2H, dt, J 6
および4.1Hz), 3.43 (2H, m), 3.75 (1H, m), 4.31 (1
H, m), 5.18 (2H, d, J 3.1Hz)および7.37 (5H, m)；δ
Cppm (CDCl₃, 100MHz) 43.12 (dd, J 62.1および0.9H
z), 167.84 (m)および168.1((dd, J62.3 および1.2Hz) 実測値 222.0996 計算値 222.0996

【０１４１】実施例１７ベンジル ５−アジド−３−ヒドロキシ−２−（２−オ
キソ−〔２−¹³Ｃ〕アゼチジン−１−イル）−〔１，２
−¹³Ｃ₂〕バレレート 題記化合物を、ベンジル ２−（２−オキソ−〔２−¹³
Ｃ〕アゼチジン−１−イル）−〔１，２−¹³Ｃ₂〕アセ
テートと３−アジドプロピオンアルデヒドとを実施例と
同様にして反応させ、得られた生成物を実施例２に記載
した如くにして１，５−ジアザビシクロ〔４．３．０〕
ノネ−５−エンでエピマー化し、クロマトグラフィーで
高速移動ジアステレオ異性体を分離した。クロマトグラ
フィーにカラムから回収した高速及び低速移動ジアステ
レオ異性体の混合物を更に異性化して、追加量の題記化
合物の純粋な高速移動ジアステレオ異性体を得た。題記
化合物の高速移動ジアステレオ異性体の合計収率は３６
％であった。 ＩＲ：ν max (ＫＢｒ） 2102, 1696, 1668, 761および
704cm^-1； ＮＭＲ：δＨppm （CDCl₃, 400MHz), 1.71 (1H, m), 1.
83 (1H, m), 3.03 (2H,m), 3.34 (1H, m), 3.43 (1H,
m), 3.51 (2H, m), 3.87 (1/2H, m), 4.22 (1/2H, m),
4.26 (1H, m), 4.34 (1H, m), 5.23 (2H, m)および7.36
(5H, m)；δppm(CDCl₃, 100mHz) 63.4 (d, J 61.3Hz),
168.1 (d, J 61.2Hz）および169.3. マススペクトル C₁₂ ¹³C₃ H₁₈ N₄ O₄ M⁺ 実測値 322.1506 計算値 322.1508

【０１４２】実施例１８５−アミノ−３−ヒドロキシ−２−（２−オキソ−〔２
−¹³Ｃ〕アゼチジン−１−イル）−〔１，２−¹³Ｃ₂〕
吉草酸 ベンジル ５−アジド−３−ヒドロキシ−２−（２−オ
キソ〔２−¹³Ｃ〕アゼチジン−１−イル）−〔１，２−
¹³Ｃ₂〕バレレートを実施例１４と同様に炭素に５％担
持したパラジウム触媒の存在下水素で還元し、題記化合
物を吸湿性の粉末として得た。 ＩＲ：ν max (ＫＢｒ） 3424, 1678, 1544 および1355
cm^-1； ＮＭＲ：δＨppm （D₂O, 250Mz) 1.85 (2H, m), 3.0 (2
H, m), 3.15 (2H, m), 3.55 (2H, m), 3.80 (1/2 H,
m), 4.19 (1H, m ）および4.34 (1/2H, m)；δC (D ₂O,
100MHz) 63.20 (d, J 54Hz), 172.6および174.97 (d, J
53Hz)。 マススペクトル C₅ ¹³C₃ H₁₄ N₂ O₄ MH⁺ (p. i. F. A.
B. チリオリセロール） 実測値 206 計算値 205¹³ ＣのＮＭＲスペクトルから判定される¹³Ｃの濃縮度
（degree of enrichment）吉草酸部分の１位と２位では
９９．５％でアゼチジン−１−イル部分の２位も同等で
あった。

【０１４３】実施例１９ストレプトミセス・クラブリゲルスとストレプトミセス
・リップマニイーの培地の製造 実施例の実験に使用した微生物はストレプトミセス・ク
ラブリゲルスＡＴＣＣ２７０６４、ストレプトミセス・
リップマニーＮＲＲＬ３５８４、ストレプトミセス・ジ
ュモンジネンシスＡＴＣＣ２９８６４及びストレプトミ
セス・カツラハマヌスＴ−２７２を再分離したものであ
る。培養は固体又は液体培地の上で行った。

【０１４４】固体培地 下記の寒天が適切である。 加水分解した澱粉 （デキストリン、コーンプロダクツ社、トラフォードパーク、 マンチェスター） １０ｇ ＫＨ₂ ＰＯ₄ １ｇ ＭＧＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ １ｇ ＮａＣｌ １ｇ ＣａＣＯ₃ ４ｇ （ＮＨ₄)₂ ＳＯ₄ １ｇ 微量元素溶液＊ １ml 寒天〔オクソイド（oxide)第３号〕 ２０ｇ 脱イオン水を加えて１ｌにする。

【０１４５】＊微量元素溶液の組成は下記の通りであ
る。 ＦｅＳＯ₄ ７Ｈ₂ Ｏ ０．１ｇ ＭｎＳＯ₄ ・Ｈ₂ Ｏ ０．１ｇ ＺｎＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ ０．１ｇ 脱イオンを加えて１００μｌにする。液体培地 適当な液体培地は下記の通りである。

【０１４６】種培地Ａ 大豆粉〔アーカソイ５０（Arkasoy50)、ブリティシュ・ アーカディ社アーカディ・ソーヤ・ミル，オールドトラフォード、 マンチェスター〕 ２０ｇ 加水分解澱粉 （デキストリン、コーンプロダクツ社） １０ｇ ＫＨ₂ ＰＯ₄ ０．６ｇ グリセリントリオレエート〔エストール（Estol 1434）、 プライシーズ（Price's)ケミカル会社、ベビントン、 ヴィラメルシーサイド） ５．０ｇ 水道水を加えて１ｌとしＮａＯＨ溶液でｐＨを７．０とした。種培地Ｂ 麦芽エキス（オクソイド社バシングストーク、ハンツ） １０ｇ 細菌学的ペプトン（オクソイド社） １０ｇ グリセロール ２０ｇ 水道水を加えて１ｌとし、ｐＨは７．０に調整した。増殖培地Ａ 大豆粉（アーカソイ５０） ３５ｇ 加水分解澱粉（デキストリン） ５０ｇ ＫＨ₂ ＰＯ₄ ０．７ｇ グリセロール ５．０ｇ 微量元素溶液＊ １０ml 水道水を加えて１ｌとし、ｐＨは７．０に調整。

【０１４７】＊微量元素溶液は次のようにして作製し
た。 ＣａＣｌ₂ ・６Ｈ₂ Ｏ １４．９ｇ ＭｇＣｌ₂ ・６Ｈ₂ Ｏ １０．０ｇ ＮａＣｌ １０．０ｇ ＦｅＣｌ₃ ３．０ｇ ＺｎＣｌ₂ ０．５ｇ ＣａＣｌ₂ ０．３９ｇ ＭｎＳＯ₄ ・Ｈ₂ Ｏ ０．３８ｇ 蒸溜水を加えて１ｌとする。

【０１４８】増殖培地Ｂ 加水分解澱粉（デキストリン、コーンプロダクツ社） ２０ｇ 大豆粉（アーカソイ５０） １０ｇ ディスティラーズ・ソルブルス〔スコッタファーム（Scotaferm) トス・ボルトビック、（グラスコー）社、６０ウェリントン通り、 グラスゴー〕 ０．１ｇ ＦｅＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ ０．１ｇ 脱イオン水を加えて１ｌとし、ｐＨを７．０に調節した。種及び増殖培地Ｃ グリセリントリオレエート （エストール１４３４） １０ｇ 大豆粉（アーカソイ５０） １５ｇ ＫＨ₂ ＰＯ₄ １．０ｇ 脱イオン水を加えて１ｌとし、ｐＨを７．０に調節した。種及び増殖培地Ｄ 大豆粉（アーカソイ５０） ２２．５ｇ ＫＨ₂ ＰＯ₄ １．０ｇ グリセリントリオレエート（エストール１４３４） １５．０ｇ 加水分解澱粉（デキストリン、コーンプロダクツ社） ８．０ｇ 脱イオン水を加えて１ｌとしｐＨは７．０に調節した。

【０１４９】実施例２０粉砕（破壊）用ストレプトミセス・クラブリゲルス細胞
の増殖 種フラスコ（５０mlの種培地Ａを入れた２５０mlコニカ
ルフラスコ）に、エス・クラブリゲルスの固体培地培養
物からの白金耳量の胞子を接種し２６℃において２４０
ｒ．ｐ．ｍで４８時間振盪した。得られた培養物（１m
l）を、増殖フラスコ（３０mlの増殖培地Ａを入れた２
５０mlコニカルフラスコ）へ無菌状態で移し、２６℃で
４８時間２４０ｒ．ｐ．ｍ振盪した。次いでフラスコの
内容物を４℃、１０分間１５，０００×ｇで遠心分離
し、上澄液を棄て、菌糸体ペレットを４℃の冷水中に再
分散して元の容積とし再び４℃１０分間１５，０００×
ｇで遠心分離した。上澄液を棄て、菌糸体ペレットを以
下の実施例に記載したように酵素の製造に使用した。

【０１５０】実施例２１超音波によるエス・クラブリゲルスの粗製の細胞ホモジ
ネートの製造 実施例２０と同様にして作った菌糸体ペレット５０ｍＭ
のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（以下トリ
スと略す）のｐＨ７．０の緩衝液に緩衝液２．０ml当り
１．０ｇの湿量（wet weight）の濃度で再分散した。こ
の分散液を２０mlづつに分け、菌糸体を、氷水バス上で
冷却しながら２５ＫＨｚの超音波〔ＭＳＥソニプレプ
（Soniprep），フィソンスplc,クラウレイ，サセック
ス、英国(Fisons plc, Crawley, Sussex, UK）〕によっ
て、１０秒間隔で４×１０秒のバースト（burst)をかけ
て粉砕した。

【０１５１】実施例２２Ｘプレス粉砕法によるエス・クラブリゲルスの粗製細胞
ホモジネートの製造 実施例２０と同様にして作った菌糸体ペレット（６ｇ湿
量）を予め−３５℃に冷却したＸプレス機（ＡＢビオッ
クス（Biox）、ジャリエラ、（Jarealla）スウェーデ
ン）のシリンダー中に置いた。細胞はＸプレスのオリフ
ィスから約１２トンの圧力を２回加えて粉砕した。破壊
された細胞は再び５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．０）
の１２ml中に再分散させた。

【０１５２】実施例２３アルミナでの磨碎によるエス・クラブリゲルスの粗製細
胞ホモジナートの製造 実施例２０と同様にして作った菌糸体ペレット（４ｇ湿
重量）を予め４℃に冷却した乳鉢中に置きアルミナ１ｇ
と共に磨碎した。粉砕された細胞はｐＨ７．０の５０ｍ
Ｍトリス緩衝液８ml中に再分散した。

【０１５３】実施例２４エス・クラブリゲルスから細胞を含まない清澄な抽出物
の製造 実施例２１，２２，２３もしくは２４と同様にして作ら
れた粗製細胞ホモジナートを４℃で１２．５分間３８，
０００×ｇの遠心分離に付して固形の細胞片を除去し
た。清澄な上澄液を静かに傾瀉し、細胞を含まない抽出
物として使用した。

【０１５４】実施例２５ジオキシゲナーゼ活性の評価 ジオキシナーゼ活性は常法通りに５ｍＭ ５−アミノ−
３−ヒドロキシ−２−（２−オキソアゼチジン−１−イ
ル）バレレート＋１ｍＭ硫酸第一鉄、５ｍＭα−ケトグ
ルタレート及び問題の酵素サンプルとを含む１ml反応液
で評価した。全試薬をｐＨ７．０の５０ｍＭ３−（Ｎ−
モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）緩衝液中
で調合した。反応液は２８℃で１０分間空気を通じ振盪
しながら培養した。反応を同量の氷冷メタノールを加え
て停止させ、２分間１６，０００×ｇの遠心分離にかけ
た。得られた上澄液の２００μｌづつをイミダゾール試
薬（２０６ｇのイミダゾールを１ｌの水に溶解し塩酸で
ｐＨ６．８に調整したもの）の１００μｌづつと混合し
た。３０分間室温で放置した後ＨＰＬＣカラム上に注入
した。ＨＰＬＣ条件は次の通りである。 カラム：μボンダパック（Bondapak）Ｃ₁₈〔ミリポア・
ウォータース、ハロー、ミドルセックス、英国（Millip
ore Waters, Harrow, Middlesex, UK)〕 移動相：０．１Ｍりん酸ナトリウム緩衝液ｐＨ３．２＋
６％メタノール 流速：２ml／分 検出波長；３１３ｎｍ 反応は、保持時間２．１分の化合物Ｉのイミダゾールア
ダクトの生成についてモニターされた。上記のイミダゾ
ールプレカラム・デリバティゼーション（precolumn de
rivatisation）ＨＰＬＣシステムはクラバラン酸（保持
時間：５分間）の検出にも用いることができる。

【０１５５】実施例２６エス・クラブリゲルスから部分的に精製したジオキシゲ
ナーゼ酵素の試料の生成 実施例２０と同様にして作った菌糸体ペレット（１２５
ｇ湿重量）をｐＨ７．０で１，ｍＭエチレンジアミンテ
トラ酢酸の水溶液２５０ml中に再分散し、実施例２１に
記載したのと同様にして超音波処理した。粉砕された細
胞の分散液を１５分間２１，０００×ｇの遠心分離にか
け、上澄液を傾瀉した。ストレプト、マイシン硫酸塩を
最終濃度が１％ｗ／ｖになるよう上澄液に加えた。上澄
液を氷上に３０分間放置し２４，０００×ｇで２０分間
遠心分離にかけた。上澄液を傾瀉し、固形硫酸アンモニ
ウムを加えて５０％飽和液とした。その分散液を氷上で
１時間放置し、再び遠心分離した。上澄液に固形の硫酸
アンモニウムを加えて８０％飽和とし、氷上で１時間放
置し、６０分間２４，０００×ｇで遠心分離した。得ら
れたペレットをｐＨ７．０の５０ｍＭトリス緩衝液２０
ml中に再分散し、同じ緩衝液の３ｌに対して一夜透析し
た。次いで透析物を凍結乾燥した。凍結乾燥抽出物であ
るジオキシゲナーゼ酵素は−２０℃で数ケ月間安定であ
る。この酵素の比活性度は０．０１７３単位／mg蛋白質
であった。１単位は、化合物IIから１分間当り１μmmol
の化合物Ｉを、２８℃ｐＨ７．０で産生する酵素の量で
ある。ジオキシゲナーゼ活性は実施例２５に記載した方
法で評価した。

【０１５６】実施例２７エス・クラブリゲルスからジオキシゲナーゼ酵素の実質
的に純粋な試料の生成 実施例２６に記載た方法により作られ、凍結乾燥され
た、不充分に精製された酵素（２５０mg）をＤＥＡＥセ
ファローズ（Sepharose)ＣＬ−６Ｂ〔ファーマシア、ア
プサラ、スウェーデン（Pharmacia, Uppsala, Swede
n）〕カラム（３０×２．４cm）にかけてｐＨ７．０の
５０ｍＭトリス緩衝液１００mlで洗浄し、ｐＨ７．０の
５０〜５００ｍＭトリス緩衝液で傾斜溶離した。

【０１５７】ジオキシゲナーゼ陽性フラクションをプー
ルし固形の硫酸アンモニウムで８０％飽和にした。分散
液を氷上で１時間保持し、６０分間２４，０００×ｇで
遠心分離した。沈澱分をｐＨ７．０の５０Ｍトリス緩衝
液１mlとスクロース３０％溶液（同じ緩衝液中で作った
もの）０．５mlとの混合物中へ再分散させ、セファデッ
クス（Sephadex）スーパーファイン（superfine)〔ファ
ーマシア（Pharmacia)〕カラム（６３．５×３．５cm）
にかけ５０ｍＭトリス緩衝液で溶離した。ジオキシゲナ
ーゼ陽性フラクションをプールし、固形硫酸アンモニウ
ムで８０％飽和し、生成した沈澱を遠心分離で除去し、
−２０℃で貯蔵した。この段階でジオキシゲナーゼ酵素
はドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気
泳動法で測定したところ、約４８，０００ダルトン（da
lton）の分子量に相当する単一バンドを形成した。等電
点を等電点電気泳動法で測定しＰＩ＝５．６５の値を得
た。 ジオキシゲナーゼ活性は実施例２５に記載した方
法で測定した。

【０１５８】実施例２８ストレプトミセス・クラブリゲルスから ５−アミノ−
３−ヒドロキシ−２−（２−オキソ−アゼチジン−１−
イル）吉草酸（化合物II）の単離 ８ １／２インチの円板羽根を備えた３００ｌの醗酵槽
に入れた、増殖培地Ａ（実施例１９で得られたのと同
じ）１５０ｌに、種培地Ａ（実施例１９で得られたのと
同じ）中で４８時間培養したストレプトミセス・クラブ
リゲルスの培養物１．５ｌを接種した。この槽を５７０
ｒ．ｐ．ｍ．で撹拌し、毎分１５０ｌの無菌空気を吹き
こんだ（sparge）。プルロニック（Pluronic）Ｌ８１
〔ブラッデン−キャンベル・ケミカル社、クロイドン、
英国（Blagden-Campbell Chemical Co., Croydon, U
K）〕消胞剤を培地に入れて発泡をおさえた。槽を４８
時間２６℃に保った。次いで培養物を５℃に冷却し、連
続遠心分離で細胞を除去した。細胞ペーストを１〜５℃
の水７５ｌに再分散させ、その細胞を、マントン−ガウ
リン（Manton-Gaulin)ホモジナイザー〔モデル１５Ｍ−
８ＢＡ，Ａ，ＡＰＶ、クラウレエ−、サセックス、英国
（Crawley, Sussex, UK)〕に３，０００〜５，０００ｐ
ｓｉの圧力で通過させて粉砕した。細胞片を連続遠心分
離で除去し、上澄液を、公称の分子量カットオフ値が１
０，０００ダルトンのＰＭ１０ポリスルホン膜１０m²を
備えたアルファ・ラベル（Alfa Laval）ＶＦＳ−４限外
濾過機で限外濾過した。低分子量フラクションは逆浸透
法で６リットルに濃縮した。これを凍結乾燥して化合物
IIを含有する固体（バッチ１）４７４ｇを得た。（化合
物IIはジオキシゲナーゼ製剤で化合物Ｉに変換し、実施
例２５に記載したプレカラムイミダゾール・デリバティ
ゼーションＨＰＬ法で生成した化合物Ｉの量をモニター
して、分析した。化合物IIのＩへの変換は必ずしも定量
的とは言えないので、この分析法は化合物IIを含むフラ
クションの選別の定性的指針として使った。第２の醗酵
および単離を同様の方法で行って化合物（II）を含有す
る凍結乾燥固体（バッチ２）５４４ｇを得た。

【０１５９】凍結乾燥した固体（バッチ１ １６６ｇ＋
バッチ２ ３４４ｇ）の１００ｇづつの試料５つを下記
のようにして更に精製した。各１００ｇの試料を水１４
０mlに溶解し、エタノール１４０mlを加え、分散液を１
０，０００ｇで１５分間遠心分離した。沈澱を棄て、化
合物IIを含有する上澄液をシリカ６０（２３０〜４００
メッシュ)(Ｅ．メルク、ダムスタッド、西独）の、工業
用メタノール変性アルコール（ＩＭＳ）でパックされた
カラム（１８×１９．５cm）のクロマトグラフィーに付
しＩＭＳ８５％／水１５％の溶離剤で４５ml／分の流速
で溶離した。５つの試料を処理して得た化合物IIを含有
するフラクション全部を集めロータリーエバポレーター
で蒸発乾固し固体６６．５ｇを得た。この重量は、この
物質を上記の同じサイズのシリカ６０カラムを使って再
度処理すると２５ｇに減少した。試料を、ダイヤインＨ
Ｐ２０ＳＳ（三菱化成工業（株）の水でパックされたカ
ラム（８×５０cm）で２回クロマトグラフィーに付し、
水で溶離した（７ml／分）。化合物IIを含むフラクショ
ンをプールし、ロータリエバポレータで蒸発乾固し（１
０．０ｇ）、水（３４ml）に再度溶解し、水でパックさ
れたバイオゲル（Biogel）Ｐ２カラム（８×５７．５c
m）〔バイオ−ラド・ラボラトリーズ・ワットフォー
ド、ハートフォードシャー、英国（Bio-Rad Laboratori
es, Watford, Hertfordshire, UK）〕に注入した。化合
物を水５ml／分の流速で溶離した。化合物IIを含有する
フラクションを集めロータリーエバポレータで乾燥して
固体５．２５ｇを得た。これらを水６mlに溶解し、次い
でエタノール６mlを加え、得られた溶液を、エタノール
８５％水１５％でパックされたメルクシリカ６０（２３
０〜４００メッシュ）カラム（５×２１cm）に流速２ml
／分で注入した。陽性フラクションをもう一度同様のカ
ラムを通過させた後、水でパックされたバイオゲルＰ２
カラム２．７×１１７cmを用い、水で溶離する（流速
０．８ml／分）カラムクロマトグラフィに付して、試料
（２．１５ｇ）を更に精製した。化合物IIを含有する溶
離フラクションを集めロータリーエバポレーターで蒸発
乾固して、ＮＭＲ法で純度が６０〜７０％と判定された
試料５８０mgを得た。

【０１６０】この試料の少量を逆相（reverse-phase)シ
ステムを使う高速液体クロマトグラフィーによって均質
体に精製した〔ミリポア・ウォータース μ−ボンダパ
ックＣＮ カラム（Millipore Waters μ−Bondapak C
N column〕３．９×３０cmを使用し０．７ml／分の流速
の水で溶離した〕。試料（２１．８５mg）を水に１０mg
／mlで溶解しその１５μｌづつをカラム上に注入した。
主ピーク（２０５nm紫外光で検出）を一つの別個のフラ
クションとして集め、濃縮し、上記と同様にして再びク
ロマトグラフィーに付し、次いでロータリーエバポレー
ターで乾固し７．３mgの化合物IIを無色ガラス状固体と
して得た。

【０１６１】ＩＲν max (ＫＢｒ） 3400, 2900, 1720
および1600cm^-1 ＮＭＲδＨppm （D₂O, 250MHz), 1.89 (2H, m), 3.02
(2H, t), 3.18 (2H,dt), 3.52 (1H, m), 3.60 (1H, m),
4.08 (1H, d),および4.22 (1H, m)． マススペクトル〔C₈ H₁₄ N₂ O₄〕H⁺ MH⁺ (p. i. F. A.
B.） 実測値 203.1028 計算値 203.1032

【０１６２】実施例２９ストレプトミセス種の細胞を含まない抽出物による ５
−アミノ−３−ヒドロキシ−２（２−オキソアゼチジン
−１−イル）吉草酸（化合物II）の、Ｚ−（２Ｓ，５
Ｓ）−３−（β−アミノエチリデン）−７−オキソ−４
−オキサ−１−アザビシクロ〔３．２．０〕−ヘプタン
−２−カルボン酸（化合物Ｉ）への変換 エス．リップマニーＮＲＲＬ３５８４の細胞を含まない
抽出物を、実施例２１でエス・クラブリゲルスについて
記載したのと同様にして作製した。

【０１６３】５００μｌの上記抽出物、２００μｌの５
０ｍＭの３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸緩
衝液（ｐＨ７．０）、１００μｌの１０ｍＭのＦｅＳＯ
₄（水で作製）及び１００μｌの１０mg／mlの化合物II
（ジアステレオ異性体の分離を行わないこと以外は実施
例１３と同様にして製造した）を含有する反応混合物を
作製した。この反応混合物を通気及び撹拌をしながら２
８℃で６０分間培養した。６０分後、イミダゾール プ
レカラム イミダゾール デリバティゼイション ＨＰ
ＬＣ分析法（実施例２５に記載）によって、化合物IIが
環化して化合物Ｉが生成したことが分かった。細胞を含
まない酵素抽出物は実施例２１でエス・クラブリゲルス
について記載したのと同様にしてエス・ジュモンジネン
シスＡＴＣＣ ２９８６４及びエス・カツラハマヌス
Ｔ−２７２からも作製した。各抽出物は、１ｍＭのα−
ケトグルタレートおよび１ｍＭの硫酸第一鉄とともに５
０ｍＭのＭＯＰＳ緩衝液中で２８℃で培養した。反応混
合物はＨＰＬＣで試験し、抽出物中に内在する化合物II
は１時間の間に化合物Ｉに変換されたことが分かった。

【０１６４】実施例３０５−アミノ−３−ヒドロキシ−２−（２−オキシアゼチ
ジン−１−イル）吉草酸（化合物II）の、ストレプトミ
セス・クラブリゲルスからの部分精製ジオキシゲナーゼ
製剤による、Ｚ−（２Ｓ，５Ｓ）−３−（β−アミノエ
チリデン）−７−オキソ−４−オキサ−１−アザビシク
ロ〔３．２．０〕−ヘプタン−２−カルボン酸（化合物
Ｉ）への変換 １５mg／mlの凍結乾燥したジオキシゲナーゼ製剤（実施
例２６と同様にして作った）、１ｍＭの硫酸第一鉄、５
ｍＭのα−ケトグルタレート、５ｍＭの化合物II（実施
例１４と同様にして作った一つのジアステレオ異性体）
及び５０ｍＭの３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホ
ン酸（ｐＨ７．０）を含有する反応混合物を作製した。
この反応混合物を２８℃で連続的に振盪した（大気中の
酸素の充分な移行を確実に行わせるため）。６０分後反
応混合物を実施例２５に記載したプレカラムイミダゾー
ルデリバティゼイション法で試験し、その結果化合物II
の４２％（すなわち自然の立体化学構造を有する鏡像体
の８４％）が化合物Ｉに変換したことが分かった。

【０１６５】実施例３１５−アミノ−３−ヒドロキシ−２−（２−オキソアゼチ
ジン−１−イル）吉草酸（化合物II）からＺ−（２Ｓ，
５Ｓ）−３−（β−アミノエチリデン）−７−オキソ−
４−オキサ−１−アザビシクロ〔３．２．０〕−ヘプタ
ン−２−カルボン酸（化合物Ｉ）への酵素による大規模
変換及びその後のデリバティゼイションによる単離 下記の実験に於いて、化合物IIとジオキシゲナーゼ酵素
の両方が、ストレプトミセス・クラブリゲルス中に存在
するという事実が、エス・クラブリゲルス細胞を粉砕
し、内在する酵素に内在する化合物を変換させて化合物
Ｉを得ることに利用された。粉砕された細胞を作る方法
は実施例２８で記載したのと実質的に同じである。

【０１６６】４８時間培養のストレプトミセス・クラブ
リゲルス１５０ｌを遠心分離し、その菌糸体を５℃の水
９０ｌ中に再分散した。細胞を、マントン−ガウリン
（Manton-Gaulin)ホモジナイザーで３，０００〜５，０
００ｐｓｉで操作して粉砕した。α−ケトグルタレート
と硫酸第一鉄とを粉砕した細胞分散液に加え最終濃度を
１ｍＭとした。その混合物中の化合物IIの濃度は１６μ
ｇ／mlであった。混合物に、２５℃、ｐＨ７．０で３０
分間通気した。細胞屑は遠心分離で除去し、化合物Ｉを
含んだ上澄液を限外濾過した。濾過を逆浸透法で６．２
リットル（約６００mgの化合物Ｉを含む）に濃縮した。
化合物Ｉは下記の方法でＮ⁵−ベンジルオキシカルボニ
ル（ＣＢＺ）誘導体に変換した。

【０１６７】濃縮物にアセトン６．２ｌを加え、次いで
ｐＨ７．５〜８．０（５℃）に保持しながら１０分間か
けて５０％ベンジルクロロホルメートのアセトン溶液６
００mlを加えた。反応液は更に３０分間ｐＨ７．５に保
ちその後ｐＨを７．０に戻した。アセトンをロータリー
エバポレーターで除き濃縮物４．７５ｌを得た。溶液を
１／２容と１／４容の酢酸エチルでｐＨ２．０，５℃で
抽出した。１／２容と１／４容の酢酸エチルを使って抽
出物を集めｐＨ７．０で水で逆抽出した。

【０１６８】集めた逆抽出物を水で５ｌにしＩＲＡアニ
オン交換カラムに吸着させ（アセテートサイクル，２２
×５cm，流速２５ml／分）そして１ＭＮａＣｌで脱着し
た。生成物は上記の酢酸エチル抽出法によって脱塩し
た。水による逆抽出のあと凍結乾燥しＩの粗ＣＢＺ誘導
体を得た。この生成物の一部は下記の方法でベンジルエ
ステルに変換した。

【０１６９】凍結乾燥した誘導体１００ｇをジメチルホ
ルムアミド１２０mlに溶解し、６０mlのベンジルブロマ
イドを加えた。この反応液を７時間室温で撹拌し、５℃
で一夜放置した。酢酸エチル（５℃）１ｌを加え、生じ
た沈殿を遠心分離で除去した。上澄液を３００mlまでロ
ータリーエバポレーターで蒸発し、ｐＨ７．０で４ＭＮ
ａＣｌ（２００mlで、次いで１００mlで）洗浄した。次
いでロータリーエバポレーターで乾燥してシロップ（１
００ml）を得、シクロヘキサン（２００ml）で洗浄し
た。このシロップをシリカカラム（メルク シリカ番号
７７３４）９．５×１７cmにかけ、石油エーテル／酢酸
エチルの６：１から１：１に傾斜させた溶離剤で溶離し
た。

【０１７０】生成物はシリカの薄層クロマトグラフィの
石油エーテル／酢酸エチル〔２：１〕で同定した。Ｒｆ
０．４で、実施例３３に記載のトリフェニルテトラゾリ
ウム・スプレー試薬を用いて赤色スポットとして検出さ
れた。陽性フラクションを集め、ロータリーエバポレー
ターで乾燥し油状物３．９ｇを得た。これを５×１４cm
のシリカカラム〔シリカ「Ｓ」２３０−４００−メッシ
ュ、レイデル−デヘーン社、シールズ（Reidel-de Haen
AG, Seelze)西独〕、流速８ml／分、溶離剤エタノール
濃度を２から５％へと傾斜させたエタノール／クロロホ
ルムのクロマトグラフィーに付した。陽性フラクション
をロータリーエバポレーターで乾燥して５９０mgのガム
状物（純度約２０％）を得た。この生成物を、セファデ
ックスＬＨ２０カラム（１８×３cm）、ファーマシア
社、アプサラ、スエーデン）流速２ml／分、溶離剤クロ
ロホルム／シクロヘキサン（１：１）のカラムクロマト
グラフィに付して、２３０mg（純度約３０％）を得た。
これを更にシリカカラム（シリカ“Ｓ”、２３０〜４０
０メッシュ、１９×３．５cm、流速３ml／分）、溶離
剤：５％酢酸エチル含有のクロロホルムにかけて精製し
た。得られた物は実質的に純粋な化合物ＩのＮ⁵−ＣＢ
Ｚベンジルエステル（６３mg）であった。

【０１７１】ＩＲ：ν max (ＫＢｒ） 3300, 1800, 173
0 および1690cm^-1 ＮＭＲ：δＨppm （CDCl₃, 90MHz) 2.98 (1H, d, J 16
Hz), 3.42 (1H, dd,J 16 および3Hz), 3.81 (2H, t, J
7Hz), 4.68 (2H, m), 5.0 (1H, s), 5.07 (2H, s), 5.1
4 (2H, s), 5.61 (1H, d, J 3Hz), 7.30 (10H, s) δＣ（CDCl₃, 63MHz) 36.66 (C-6), 46.33 (C-10), 60.
47 (C-2), 66.71 (Ar-CH₂), 67.77 (Ar-CH₂), 87.93 (C
-5), 97.51 (C-9), 128.12（アリール-C), 128.40 （ア
リール-C), 136.51 （アリール-C), 152.51 (C-3), 15
6.14 (CH₂NHCO), 166.87 (C-8), 174.42 (C-7) マススペクトル(C₂₃ H₂₄ N₂ O₆) H⁺ MH⁺(F. A. B.) 実測値 423.1561 計算値 423.1556 化合物ＩのＮ⁵−ＣＢＺベンジルエステルはＣＤスペク
トルにおける２４２nmで最小の陰性コットン効果を示し
た。

【０１７２】この物の５０mgを下記の如くにして脱保護
された（deprotect)。この試料を酢酸エチル／エタノー
ル（７０：３０）１５ml中に溶解し、１０％パラジウム
−炭触媒５０mgに加えた。この混合物は大気圧下で１５
分間水素化した。薄層クロマトグラフィ（tlc)の試験に
よれば、脱保護が不完全なことを示した〔シリカ メル
ク番号５７１９，エタノール／水（９０：１０）、Ｒｆ
０．２〕。触媒を濾過して除去し、保存する。新しい触
媒で水素添加を繰返した。反応完了時最初の触媒を反応
混合物に加え、その分散液をロータリーエバポレーター
で蒸発乾固した。生成物に水を加えて溶解し、遠心分離
で触媒を除去した。水性生成物を１．５mlに濃縮した。
これを、ダイヤイオンＨＰ２０ＳＳカラム（１．５×２
０cm，流速１．５ml／分）に注入し、水で溶離した。陽
性フラクションはｔｌｃで同定し、集めて凍結乾燥し化
合物Ｉ５．７mgを得た。

【０１７３】 ＩＲ：ν max (ＫＢｒ） 3430, 1780および1640cm^-1 ＮＭＲ：δＨ（D₂O, 250MHz) 3.15 (1H, d, J 17Hz),
3.57 (1H, dd, J 17および2.6Hz), 3.67 (2H, t, J 7.5
Hz), 4.84 (1H, dt, J 7.5および1Hz), 5.01(1H, d, J
1Hz), 5.77 (1H, d, J 2.6Hz)

【０１７４】実施例３２３−ヒドロキシ−５−アミノ−２−（２−オキソ〔２−
¹³Ｃ〕アゼチジン−１−イル）（１，２−¹³Ｃ₂〕吉草
酸（〔¹³Ｃ₃〕−化合物II）から〔２，７，８−¹³Ｃ₃〕
−Ｚ−（２Ｓ，５Ｓ）−３−（β−アミノエチリデン）
−７−オキソ−４−オキサ−１−アザビシクロ〔３．
２．０〕ヘプタン−２−カルボン酸（〔¹³Ｃ ₃〕−化合
物Ｉ）への酵素による変換 〔¹³Ｃ₃〕−化合物II（実施例１８と同様にして製造、
１１６．４mg）を凍結乾燥したジオキシゲナーゼ酵素
（実施例２６と同様にして製造）１．７４ｇを、９７．
５mlの３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸緩衝
液（ｐＨ７．０）に溶解した反応混合物に加え、これに
５０ｍＭの硫酸第一鉄溶液２．３３mlと５０ｍＭα−ケ
トグルタレート溶液１１．６４mlとを加えた。この反応
混合物を、５００mlのコニカルフラスコ中で２８℃で、
連続的に振盪して大気中の酸素の充分な移行を確実に行
った。７０分後、プレカラム・イミダゾールデリバティ
ゼイションＨＰＬＣ法（実施例２６に記載）によると、
化合物Ｉが５５．２mg生成していることが分かった（生
物学に活性鏡像体の９５％が変換）。〔¹³Ｃ₃〕−化合
物Ｉを〔¹³Ｃ〕−化合物IIの不活性鏡像体から下記の方
法により分離した。反応液の容積をロータリエバポレー
ターで１７mlに減らし、下記の如くバイオゲルＰ２〔バ
イオ−ラド研究所（Bio-Rad Laboratories）〕カラムク
ロマトグラフィーに付して脱蛋白を行った。試料をバイ
オゲルＰ２（５．２×１３．５cm、水でパック）カラム
にかけ、４℃にて水で１ml／分の流速で溶離した。化合
物Ｉを含むフラクションをプールしロータリーエバポレ
ーションで蒸発乾固し、水５mlに溶解し、４℃でメルク
シリカ６０カラム（３×１６cm、エタノール８５％−水
１５％でパック）のクロマトグラフィーに付し、同じ溶
剤で０．６ml／分で溶離した。化合物Ｉを含有し化合物
IIを含有しないフラクションを集め蒸発乾固した。試料
の¹³Ｃ ＮＭＲ分析の結果、存在する〔¹³Ｃ₃〕でラベ
ルされた唯一の化合物が本質的に〔¹³Ｃ₃〕−化合物Ｉ
であることを示した。少量の〔¹³Ｃ₃〕−化合物IIがま
た検出されるが、〔¹³Ｃ₃〕−化合物IIの活性な鏡像体
の量はラベルされたもの全体の０．５％にすぎなかっ
た。この生成物のプレカラム・イミダゾール・デリバテ
ィゼイション・ＨＰＬＣ法による分析の結果化合物Ｉ１
８．５ｇを含むことが分かった。

【０１７５】下記のＨＰＬＣ法でカラムフラクション中
に化合物IIの存在を検出するのに用いた。 カラム：Ｃ₁₈μボンダパック（ミリポア・ウォーター
ズ） 溶媒：０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ３．０ 流速：１．５ml／分 検出波長：２０５nm これらの条件下、化合物IIの保持時間は２．５５分であ
った。

【０１７６】実施例３３ストレプトミセス・クラブリゲルスの細胞を培養するこ
とにより、〔２，７，８−¹³Ｃ₃〕−Ｚ−（２Ｓ，５
Ｓ）−３−（β−アミノ−エチリデン）−７−オキソ−
４−オキサ−１−アザビシクロ〔３．２．０〕ヘプタン
−２−カルボン酸（〔¹³Ｃ₃〕−化合物Ｉ）の、〔２，
７，８−¹³Ｃ₃〕−クラバラン酸への変換 培地Ｄ（実施例１９）３０mlを入れた２５０mlのコニカ
ルフラスコに白金耳量のエス・クラブリゲルスの胞子を
接種した。このフラスコを２６℃で６５時間振盪し、得
られた培養物の１mlづつを、培地Ｄ３０mlを入れた３つ
のフラスコに移した。２６℃で３１時間振盪後、クラバ
ラン酸の力値は１２９μｇ／mlに達し、（¹³Ｃ₃〕−化
合物Ｉ６．２mgを各フラスコに加えた。更に１６．５時
間培養後、培養物を遠心分離で収穫し上澄液を凍結乾燥
した。上澄液中のクラバラン酸の力値は実施例２５で示
したプレカラム・イミダゾール・デリバティゼイション
法より測定したところ３５４μｇ／mlであった。

【０１７７】凍結乾燥した固体をベンジルブロマイド
（０．８ml）を含むジメチルホルムアミド（１５ml）で
スラリーにし、常温（約２０℃）で６．５時間放置し
た。得られたベンジルクラバラネートを酢酸エチルで抽
出し、ロータリーエバポレーターにかけて褐色油状物を
得た。これを、シリカ（シリカ「Ｓ」２３０〜４００メ
ッシュ、リーデル−デハーエン）のシクロヘキサン／酢
酸エチル（６：１）でパックしたカラム（１．５cm×
８．５cm）にかけて、シクロヘキサン／酢酸エチル
（６：１から１：１に傾斜した）で溶離した。フラクシ
ョンは、酢酸エチル／シクロヘキサン（２：１）で展開
し、トリフェニルテトラゾリウムクロライド・スプレー
試薬（４％トリフェニルテトラゾリウムクロライドのメ
タノール溶液を同量の１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液で希
釈したもの）で可視化（Ｒｆ約０．６で赤色スポット）
して、ベンジルクラバラネートの存在をモニターされ
た。ベンジル・クラバラネートを含むフラクションを集
め、ロータリーエバポレーターにかけガム状物を得た。
これをシクロヘキサン／クロロホルム（１：１）でパッ
クしたセファデックスＬＨ２０（ファーマシア）カラム
（１．５×１０cm）にかけて、同じ溶剤で溶離した。ベ
ンジルクラバラネートを含むフラクションを集め蒸発さ
せて無色のガム状物（１４．２mg）を得た。これを〔¹³
Ｃ〕−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ）で試験し、〔¹³Ｃ〕の濃
縮原子％をナチュラル・アバンダンス・スペクトル（na
tural abundance spectrum）を参照して計算した。２，
７および８の炭素原子にのみ有意の濃縮（enrichment）
が検出され各〔¹³Ｃ〕でラベルされたもののクラバラン
酸中への導入度は約４．３％に等しかった。長いレンジ
の¹³Ｃ−¹³Ｃスピン−スピンカプリングが炭素原子の
７，２および８の付随する濃縮によって検出され、炭素
原子７，２および８間の結合は前記導入中、そのままで
残ったことを示している。

【０１７８】ラベルされたベンジルクラバラネートを¹
ＨＮＭＲ分析した結果、〔¹³Ｃ₃〕−化合物Ｉまたはそ
の誘導体による汚染よりもクラバラン酸内にラベルが存
在していることが確認された。４００ＭＨＺ¹ＨＮＭＲ
スペクトルは、１０−アミノデオキシクラバラネート種
の存在に基づく信号を全く示さなかった。この点を再確
認するために、〔¹³Ｃ₃〕−ベンジルクラバラネートの
試料を下記の方法で１０−メチルエーテルに変換した。
すなわち〔２，７，８¹³Ｃ₃〕−ベンジルクラバラネー
ト（８．５mg，２９mmol）をジクロロメタン（３．５m
l）に溶解し、硫酸マグネシウム（３０mg，２５０μmo
l,１７０℃で２４時間乾燥したもの）と酸化銀（Ｉ）
（２３mg，１００μmol,１７０℃で３．５時間乾燥した
もの）で処理した。得られた分散液を常温で暗所でヨー
化メチル（０．２ml，３．２mmol）とともに３日間撹拌
した。

【０１７９】反応混合物を蒸発乾固して、酢酸エチル／
ヘキサン（１：２）を用いるシリカゲル（メルク番号９
３８５）のクロマトグラフィーに付し、ベンジル１０−
Ｏ−メチルクラバラネートを油状物（４．２mg，４７
％）として得た。 ＩＲ：ν max (ＫＢｒ） 1804, 1751, 1695, 743および
699cm^-1 ＮＭＲ：δＨppm （CDCl₃；250MHz) 3.08 (1H, dd, J 1
6.7 および0.5Hz),3.28 (3H, s), 3.49 (1H, dd, J 2.8
および16.8Hz), 4.00 Hz (2H, m), 4.82 (1H, dt, J 7.
1および1.3Hz), 5.10 (1H, d, 0.9Hz), 5.20 (2H, s),
5.70 (1H, dd, J 2.7および0.5Hz)および7.37(5H, m) δＣ（CDCl₃；100MHz) 46.39, 57.74, 60.60 (dd, J 6
7.4 および2.0Hz), 60.61, 66.36, 67.85, 87.89, 97.6
6, 128.67, 134.70, 153.11, 166.91 (dd, J67.5 およ
び3.5Hz), 166.87および174.25 (m) マススペクトル C₁₆ H₁₇ NO₅＋NH₄ ⁺ M⁺＋NH₄ 実測値 ３２１ 計算値 ３２１ ベンジル〔¹³Ｃ₃〕−クラバラネートのメチルエーテル
およびラベルされていないベンジルクラバラネートのメ
チルエーテルの試料を、ガスクロマトグラフィー（カラ
ム：２５メートルＢＰＩキャピラリー：キャリアーガ
ス：ヘリウム；温度プログラム：１２０℃２分間、その
後８℃／分の速度で２８０℃に昇温）で試験したとこ
ろ、同じ保持時間（１９．５分）を示すことが分かっ
た。ベンジルクラバラネートメチルエーテルの保持時間
に於ける溶離ピークをマススペクトルで測定した。繰返
しスキャン（repeat scan)のデータを電算機で集積して
平均した。ラベルされた試料とラベルしていない試料と
のマススペクトルを比較すると、ラベルされた試料は４
％のトリプル〔¹³Ｃ〕でラベルされた種を含むことが分
かった。その結果〔２，７，８−¹³Ｃ₃〕−化合物Ｉ
が、エス・クラブリゲルスの細胞を培養することにより
〔２，７，８−¹³Ｃ₃〕−クラバラン酸に変換されたこ
とが確認された。

【０１８０】実施例３４エス・クラブリゲルスの部分的に精製された酵素抽出物
による、Ｚ−（２Ｓ，５Ｓ）−３−（β−アミノエチリ
デン）−７−オキソ−４−オキサ−１−アザビシクロ
〔３，２，０〕−ヘプタン−２−カルボン酸（化合物
Ｉ）の、クラバラン酸への変換 エス・クラブリゲルスの細胞を含まない清澄な抽出物を
実施例２１および２４と同様にして作った。ストレプト
マイシン硫酸塩（１％ｗ／ｖ）を０℃で加え、１時間放
置した。得られた分散液を４℃で３０分間３５，０００
×ｇで遠心分離し、上澄み液をとり、硫酸アンモニウム
を８０％飽和の濃度まで加え、分散液を４℃で１８時間
放置した。その分散液を４℃で１時間３５，０００×ｇ
で遠心分離した。上澄液を棄て、ペレットを５０ｍＭト
リス緩衝液（ｐＨ７．０）中に再分散した。その溶液
を、上記緩衝液中に２×１時間透析し〔ヴィスキング
（Visking)膜、サイズ１メディセル・インターナショナ
ル（Medicell International）〕、凍結乾燥して部分精
製酵素抽出物を粉末で得た。

【０１８１】上記酵素抽出物（４０mg／ml）、化合物Ｉ
（１ｍＭ）、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）、ピリド
キサール−５−フォスフェート（１ｍＭ）、およびβ−
ニコチン酸アミドジヌクレオチドフォスフェート（還元
型、１ｍＭ）をすべて５０ｍＭの３−（Ｎ−モルホリ
ノ）プロパンスルホン酸ｐＨ７．０中に溶解した反応混
合物は２８℃で１時間培養した。その間にクラバラン酸
の力値は０．１μｇ／ml以下から０．６μｇ／mlまで上
がった。上記反応を、ピルビン酸ナトリウムの代わりに
ナトリウムグリオキシレートまたはナトリウムケトブチ
レートを用いて繰返した。どちらの場合もクラバラン酸
の力値は０．１μｇ／ml以下から０．８μｇ／mlに上が
った。クラバラン酸の力値は実施例２５に記載したプレ
カラム・イミダゾール・デリバティゼイションＨＰＬＣ
法で測定した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 スティフン・ウイリアム・エルスン イギリス国、サリー アールエイチ３ ７エイジェイ、ベツチウオース、ブロク ハム・パーク（無番地） ビーチャム・ ファーマシューティカルズ，リサーチ ディビィジョン内 (72)発明者 ステファーン・ローランド・ウォロニキ ィ イギリス国、サリー アールエイチ３ ７エイジェイ、ベツチウオース、ブロク ハム・パーク（無番地） ビーチャム・ ファーマシューティカルズ，リサーチ ディビィジョン内 (72)発明者 キース・ハワード・バガリィ イギリス国、サリー アールエイチ３ ７エイジェイ、ベツチウオース、ブロク ハム・パーク（無番地） ビーチャム・ ファーマシューティカルズ，リサーチ ディビィジョン内

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記特性： （ａ）式（II）： 【化１】 で表される化合物もしくはその塩を、式（Ｉ）： 【化２】 で表される化合物もしくはその塩に変換する機能、
   （ｂ）ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル
   電気泳動法による測定で約４８０００ダルトンの分子量
   のシングルバンド、（ｃ）等電点電気泳動法による測定
   で５．６５の等電点、を示すエス・クラブリゲルス Ａ
   ＴＣＣ 27064由来のジオキシゲナーゼ酵素。