DK170255B1

DK170255B1 - Analogifremgangsmåde til fremstilling af optisk aktive cephalosporin-analoge

Info

Publication number: DK170255B1
Application number: DK054880A
Authority: DK
Inventors: Tadashi Hirata; Yukio Hashimoto; Takehiro Ogasa; Shigeru Kobayashi; Ikuo Matsukuma; Kazuo Kimura; Shigeo Yoshiie; Kiyoshi Sato; Yoichi Ohashi; Seigo Takasawa
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Kk
Priority date: 1979-02-10
Filing date: 1980-02-08
Publication date: 1995-07-17
Also published as: NO155548B; AU5538280A; NO800315L; DK54880A; CA1171373A; EP0014476B1; DE3064509D1; NO841499L; EP0014476A1; NO155548C

Description

i DK 170255 B1

Den foreliggende opfindelse angår en analogifremgangsmåde til fremstilling af hidtil ukendte optisk aktive cephalo-sporin-analoge forbindelser med den i kravet angivne almene formel (1-1) eller farmaceutisk acceptable salte 5 deraf.

En carbacephem-forbindelse, som er navngivet i overensstemmelse med nomenclaturen i J. Am. Chem. Soc. 96, 7584 (1974), og hvori svovlatomet i cephalosporinmolekylet er 10 erstattet med et carbonatom, og som har en substitueret methylgruppe i 3-stillingen, er beskrevet i ovennævnte litteraturhenvisning og i J. Med. Chem. 20, 551 (1977).

Der er imidlertid ikke rapporteret nogen forbindelse med særlig stærk antibakteriel virkning. I den japanske of-15 fentliggjorte, ikke undersøgte patentansøgning nr.

9296/79 (DE-offentliggørelsesskrift nr. 27 16 707) omtales forbindelser svarende til den ovenfor anførte almene 1 2 formel (I), hvori R og R er hydrogen, X er en 2-amino- 4-diazolyl-2-syn-methoxyiminoacetylgruppe, men i denne 20 reference er ikke beskrevet praktiske udførelsesformer med hensyn til eksempler på fremstilling af forbindelserne og deres antibakterielle virkninger.

Det er tidligere lykkedes for opfinderne at fremstille 25 carbacephem-forbindelser, som har forskellige substituen- ter i 4-, 5- eller 3-stillingerne [nummeringssystemet er det, der er vist i forbindelse med den almene formel (I) ]. Forbindelserne er beskrevet i beskrivelserne til den japanske offentliggjorte, men ikke undersøgte patent-30 ansøgning nr. 128591/79 (DE-offentliggørelsesskrift nr.

29 11 786) og den japanske patentansøgning nr. 162008/78 (DE offentliggørelsesskrift nr. 29 52 413).

Endvidere er det tidligere lykkedes opfinderne at frem-35 stille acylerede carbacephem-forbindelser, der er hidtil ukendte antibiotica med stærke antibakterielle aktiviteter. Forbindelserne er beskrevet i DE offentliggørelses- DK 170255 B1 2 skrifterne nr. 29 11 786, 29 11 787 og 29 52 413.

Blandt disse forbindelser, som repræsenteres ved den almene formel (II) 5 i X'-NH R1'

Al, „ 3'

COOR

hvori Xf betyder en konventionel acylgruppe inden for ce- 15 phalosporinernes og penicillinernes kemi, R1 betyder hy- 2 drogen, lavere alkyl eller lavere acyloxy, R betyder hy- 3' drogen eller halogen, og R betyder hydrogen eller en esterbeskyttende gruppe, som konventionelt anvendt inden for penicillinernes og cephalosporinemes kemi, dvs. en 20 alkylgruppe med 1-5 carbonatomer, såsom methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl og tert.-butyl, en halogeneret alkylgruppe med 1-5 carbonatomer, såsom chlormethyl, 2,2,2-trichlorethyl og 2,2,2-trifluorethyl, en arylmethylgruppe med 7-20 carbonatomer, såsom benzyl, 25 diphenylmethyl og triphenylmethyl, en arylmethylgruppe med 7-20 carbonatomer og med en methoxygruppe, nitrogruppe eller lignende på phenylringen, en substitueret silyl-gruppe, såsom trimethylsilyl eller triphenylsilyl, eller en gruppe, der enzymatisk eller Ikke-enzyroatisk let kan 30 fjernes in vivo, f.eks. en gruppe med den almene formel * ft* -CH0C0R4, »5

Ra 35 5 DK 170255 B1 3 hvori R betyder hydrogen eller lavere alkyl med 1-6 car- 4 bonatomer, og R betyder lavere alkyl med 1-6 carbonatom-er, lavere alkoxy med 1-6 carbonatomer eller phenyl, rapporteres acylforbindelserne med formlen (1) 5 XNH r1 10 Z T"-2 COOR3 1 2 hvori R betyder hydrogen eller lavere alkyl, R betyder 3 15 hydrogen eller halogen, R betyder hydrogen eller en car- boxylbeskyttende gruppe, og X betyder en acylgruppe med 1 1 formlen X CO, hvori X betyder en af følgende to grupper: (1) (A1)--B-CH- 20 «2 hvori B betyder en umættet seksleddet carbocyclisk gruppe valgt blandt cyclohexenyl, cyclohexadienyl og phenyl, eller en fem- eller seksleddet heterocyclisk gruppe, A1 be-25 tyder en eller flere substituenter valgt blandt hydrogen, hydroxy, lavere alkoxy med 1-4 carbonatomer, halogen, nitro, amino, aminomethyl, methylsulfonamido og lavere acyloxy med 1-4 carbonatomer, n er et tal fra 0 til 5, og 2 A betyder amino, hydroxy, carboxyl eller sulfo; 30 (2) (A1)--B-C- 3

NOA

1 3 hvori A , B og n er som defineret ovenfor, og A betyder 35 hydrogen, lavere alkyl med 1-6 carbonatomer, lavere alke- DK 170255 B1 4 nyl med 2-6 carbonatomer, lavere alkynyl med 2-6 carbon-atomer, cycloalkyl med 3-6 carbonatomer eller aryl, idet disse grupper er usubstitueret eller substitueret med en eller flere substituenter valgt blandt carboxyl, cyan, 5 halogen, carbamoyl, lavere alkyloxycarbonyl med 1-5 carbonatomer, cycloalkyl, alkenyl, alkynyl, aryl og acyl med 1-5 carbonatomer, og hvori hydrogenatomerne i 6- og 7-stillingeme har cis-konfiguration, i DE offentliggørel-sesskrifterne nr. 29 11 786 og 29 11 787 at have kraftig 10 antimikrobiel virkning over for Gram-positive og Gramnegative mikroorganismer. Især rapporteres acylforbindel-serne med den carbacephem-ring, der repræsenteres ved den almene formel (1') 15 **2**—^ I (I') H i« CCO-ίΚ yv

L'W

COOH

3 1" hvori A er som defineret ovenfor, R betyder hydrogen 3 eller methyl, og OA har syn-konfigurationen, at have 25 kraftig antimikrobiel virkning over for Gram-positive og Gram-negative mikroorganismer. 1 det efterfølgende vil forbindelser med den almene formel (1), (II), (III), ..... blive betegnet som henholdsvis forbindelse £1], forbindelse [II], forbindelse [III], ....

30

De ovennævnte cephalosporin-analoge fremstilles imidler- * tid ved helt igennem syntetiske fremgangsmåder under anvendelse af optisk inaktive udgangsforbindelser, og de er .

næsten alle optisk inaktive d,l-forbindelser med undta-35 gelse af forbindelser, som har en bestemt optisk aktiv acylgruppe, f.eks. d-phenylglycin etc., som er omtalt i DE offentliggørelsesskrift nr. 29 11 787.

DK 170255 B1 5 Følgelig er der et behov for optisk aktive analoge og fremgangsmåder til fremstilling deraf. Det har nu ifølge opfindelsen vist sig, at der kan fremstilles visse optisk aktive cephalosporin-analoge forbindelser, som har uven-5 tet forhøjet biologisk aktivitet.

Ved en variant af analogifremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstilles optisk aktive acylforbindelser med den i kravets indledning angivne formel (1-1) ud fra optisk in-10 aktive cephalosporin-analoge med den almene formel (111) H2Vn 15 /-Ύ%2 COOR3 20 hvori hydrogenatomerne i 6- og 7-stillingerne har cis- 2 3 konfiguration og R og R er som defineret i kravets indledning.

De optisk inaktive dl-forbindelser med formlen (III) er 25 til stede som en blanding af lige store mængder af optiske isomere (III-l) og (III-2), som er hinandens spejlbilleder (enantiomere).

HH Η H

30

o T 0 I

COOR3 COOR3 35 (III-l) (III-2) DK 170255 B1 6 2 3 hvori R og R er som defineret 1 kravets Indledning.

Ved en anden variant af analogifremgangsmåden Ifølge op- < findelsen fremstilles optisk aktive acylforbindelser med 5 den i kravets indledning angivne almene formel (1-1) ud fra optisk aktive cephalosporin-analoge med den almene formel (111-1).

1 overensstemmelse hermed er fremgangsmåden ifølge opfin-10 delsen særegen ved det i kravets kendetegnende del angivne.

De fremstillede forbindelser har uventet stærkere anti-bakteriel aktivitet, dvs. 2-4 gange stærkere aktivitet, 15 over for forskellige Gram-positive og Gram-negative mikroorganismer end de tilsvarende optisk inaktive d,l-for-bindelser [1].

Fremgangsmåder til fremstilling af optisk aktive forbin-20 delser [lli-l] er detaljeret beskrevet i referenceeksemp-lerae 9-11. Sådanne forbindelser og fremgangsmåder, til fremstilling deraf er genstand for dansk patentansøgning nr. 0549/80.

25 De optisk aktive forbindelser, der er fremstillet ved de i efterfølgende referenceeksempler anviste fremgangsmåder, antages at have den absolutte struktur, som repræsenteres af den ovenfor anførte almene formel (XIX-1), ud fra acylforbindelsemes stærke antimikrobielle virkning 30 sammenlignet med de tilsvarende optisk inaktive d,1-for- * bindeiser samt ud fra forholdet mellem cephalosporinemes absolutte struktur og deres virkninger.

VI

X det efterfølgende er de optisk aktive forbindelser be-35 skrevet som havende den absolutte konfiguration (6R, 7S), dvs. den konfiguration, der er belyst ved den almene formel (XIX-1), og i de efterfølgende eksempler og referen- DK 170255 B1 7 ceeksempler er forbindelserne betegnet i overensstemmelse med den antagne absolutte strukturformel. De optisk aktive forbindelser er mere anvendelige som lægemidler og som antimikrobielle midler end de optisk inaktive forbindel-5 ser, og de omhandlede forbindelser er således nyttige som antibakterielle midler, som kan anvendes på for fagmanden velkendte måder.

De omhandlede optisk aktive cephalosporin-analoge repræ-10 senteres ved den i kravets indledning angivne almene formel (I-l), hvori symbolerne har følgende betydning: o R betyder halogen, som kan være chlor, brom eller iod.

3 15 R betyder hydrogen eller en af de følgende carboxylbe-skyttende grupper, som anvendes inden for penicillinernes og cephalosporinernes kemi: 1. En ligekædet eller forgrenet alkylgruppe med 1-5 car- 20 bonatomer, såsom methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl og tert.-butyl.

2. En ligekædet eller forgrenet lavere alkoxymethylgruppe med 1-5 carbonatomer, såsom methoxymethyl og ethoxyme- 25 thyl.

3. En ligekædet eller forgrenet halogeneret alkylgruppe med 1-5 carbonatomer, såsom chlormethyl, 2,2,2-tri-chlormethyl og 2,2,2-trifluormethyl.

30 4. En lavere alkylsulfonylethylgruppe, såsom methansulfo-nylethyl og ethylsulfonylethyl.

5. En arylmethylgruppe med 7-12 carbonatomer, såsom ben- 35 zyl, diphenylmethyl, trityl og triphenylmethyl.

DK 170255 B1 8 6. En substitueret silylgruppe, såsom trimethylsilyl og triphenylsilyl.

7. En substitueret arylmethylgruppe med 7-20 carbonatom- 5 er, hvori substituenten er en methoxygruppe eller en nitrogruppe, og hvori antallet af substituenter på phenylringen er fra 1 til 5.

8. En carboxylbeskyttende gruppe med den almene formel 10 (VI) -CH0C0R4 (VI) i5 4 15 hvori R er en ligekædet eller forgrenet lavere alkyl- gruppe med 1-6 carbonatomer, en ligekædet eller forgrenet lavere alkoxygruppe med 1-6 carbonatomer, eller 5 en phenylgruppe, og R betyder hydrogen eller en ligekædet eller forgrenet lavere alkylgruppe med 1-6 car-20 bonatomer.

X1 betyder en af følgende to grupper: (1) en gruppe med formlen: 25 (A1)--B-CH-

n I

Å2 hvori B betyder phenyl eller thiazolyl, A1 betyder 30 ringsubstituenter, valgt blandt hydrogen, hydroxy, lavere alkoxy med 1-4 carbonatomer, halogen, nitro, amino, aminomethyl, methylsulfonamido og lavere acyl- oxy med 1-4 carbonatomer, n er et helt tal fra 0 til 2 5, og A betyder amino, hydroxy, carboxyl eller sul-35 fonsyre, eller DK 170255 B1 9 (2) en gruppe med den almene formel

(A1)--B-C

1 3

NOA

5 1 3 hvori B, A og n er som defineret ovenfor, og A betyder hydrogen, lavere alkyl med 1-6 carbonatomer, lavere alkenyl med 2-6 carbonatomer, lavere alkynyl med 2-6 carbonatomer, cycloalkyl med 3-6 carbonatomer 10 eller aryl.

Det er i almindelighed velkendt, at thiazolylgruppen med formlen

15 H2N"CX

viser reversibel indbyrdes omdannelse med thiazolinyl-gruppen, som vist nedenfor, og begge grupper betragtes 20 normalt som værende identiske. 1 den efterfølgende beskrivelse betragtes begge isomere som beskrevet gennem thiazolylgruppen. Forbindelsen [1-1] Indeholder følgelig begge isomere baseret på den reversible indbyrdes omdannelse: 25

'a*Cl :==: *CX

H

30 thiazolyl thiazolinyl 3

Med hensyn til OA betyder syn-konfigurationen den isomere (A) af de i det følgende anførte stereoisomere.

35 DK 170255 B1 10 ‘O. 'Hl ^ c-co- c-co- 1 3 3 * N-OA"3 a^o-n 5 syn (A) anti (B)

Som farmaceutisk acceptable salte kan nævnes salte med uorganiske eller organiske baser, f.eks. alkalimetalsalte, såsom natriumsalte og kaliumsalte, jordalkalimetal-10 salte, såsom magnesiumsalte, ammoniumsalte, trimethyl-aminsalte, triethylaminsalte, pyridinsalte, procainsalte, purlnsalte, lysinsalte og argininsalte, og salte med uorganiske eller organiske syrer, f.eks. hydrochlorider, sulfater, carbonater, phosphater, formiater, trifluorace-15 tater og malater. De farmaceutisk acceptable salte fremstilles ved for fagmanden velkendte standardmetoder.

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstilles forbindelsen (l-l) ved, at en optisk aktiv forbindelse med den 20 almene formel (111-1)

Η H

I / (III-l) 25 COOR3 2 3 hvori R og R er som defineret ovenfor, eller en funktionelt ækvivalent forbindelse omsættes med en carboxyl-30 syre med den almene formel (Vil) X2C00H (VII) 9 2 hvori X betyder en af følgende to grupper: (1') en gruppe med den almene formel 35 DK 170255 B1 11 (A1')--B-CH- A2' 1 t hvori B og n er som defineret ovenfor, Λ betyder ringsubstituenter valgt blandt hydrogen, hydroxy, 5 beskyttet hydroxy, lavere alkoxy med 1-4 carbonatom- er, halogen, nitro, beskyttet amino, beskyttet aminomethyl, methylsulfonamido og lavere acyloxy med 2' 1-4 carbonatomer, og A betyder beskyttet amino, hydroxy, beskyttet hydroxy, carboxyl, beskyttet carboxyl, sulfonsyre eller beskyttet sulfonsyre, eller (2*) en gruppe med den almene formel 15 (A1');-B-C-

n I

3

NOA

1' 3 hvori B, η, A og A er som defineret ovenfor 20 eller med et reaktivt derivat af carboxylsyren (Vil), hvorpå eventuelle beskyttende grupper i X CO- fjernes, og en dannet ester, hvori R er en af de ovennævnte carbo-xylbeskyttende grupper, om ønsket, omdannes til den tilsvarende frie syre, hvorefter den dannede forbindelse om 25 ønsket overføres i et farmaceutisk acceptabelt salt deraf. En konkret og kendt acyleringsmetode er beskrevet i japansk ikke undersøgt patentansøgning nr. 122402/53 (DE-offentliggørelsesskrift nr. 2911787).

30

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan visse af forbindelserne (1-1) fremstilles under anvendelse af den optisk inaktive forbindelse [III]. I sådanne tilfælde omsættes en optisk inaktiv forbindelse [III] med en carboxylsyre med formlen (VIII) 35 3 DK 170255 B1 12 X3C00H (VIII) hvori X betyder en gruppe med formlen 5 U'> (A1' -B-CH- l2.

1’ 2' hvori B, η, A og A er som defineret ovenfor, eller med et reaktivt derivat af carboxylsyren (VIII), hvorpå 3 10 eventuelle beskyttende grupper i X CO- fjernes, og en 3 dannet ester, hvori R er en af de ovennævnte carboxylbe-skyttende grupper, om ønsket, omdannes til den tilsvarende frie syre, hvorefter den opnåede blanding af diaste-reomere adskilles på konventionel måde til opnåelse af 15 optisk aktive cephalosporin-analoge med formlen (1-1), 2 3 1 hvori R og R er som defineret ovenfor, og X er begrænset til gruppen med formlen (1) {A1)—-B-CH- 20 '2 2 hvori B, η, A og A er som defineret ovenfor, og den opnåede forbindelse, om ønsket, overføres i et farmaceutisk acceptabelt salt deraf.

25

Den ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen anvendte forbindelse [III] fremstilles ved den metode, der er beskrevet i japansk offentliggjort, men ikke undersøgt patentansøgning nr. 128591/79 (DE offentliggørelsesskrift nr.

30 2911786) og japansk patentansøgning nr. 162008/78. En fremgangsmåde til fremstilling af den ikke-offentliggjor- , te forbindelse [III] er anført detaljeret i det efterfølgende referenceeksempel 6. Forbindelse [III-l] fremstilles ifølge den metode, der er beskrevet i de japanske pa-35 tentansøgninger nr. 14533/79 og nr. 146488/79. En frem- DK 170255 B1 13 gangsmåde til fremstilling af forbindelse [ill-l] er beskrevet detaljeret i efterfølgende referenceeksempel.

De ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede 5 forbindelser kan sammensættes i farmaceutiske præparater, der som aktiv bestanddel indeholder en forbindelse [1-1] eller et farmaceutisk acceptabelt salt deraf sammen med et farmaceutisk bærestof eller fortyndingsmiddel. De omhandlede forbindelser indgives parenteralt (intramusku-10 lært, intraperitonealt, intravenøst eller subcutant ved injektion), peroralt eller rektalt, og de kan sammensættes til doseringsformer, der er egnede til en hvilken som helst af disse indgivelsesveje.

15 Præparater af de omhandlede forbindelser til parenteral indgivelse omfatter sterile vandige eller ikke-vandige opløsninger, suspensioner eller emulsioner. Eksempler på ikke-vandige opløsningsmidler eller bærestoffer er propy-lenglycol, polyethylenglycol, vegetabilske olier, såsom 20 olivenolie, samt organiske estere, der er egnet til injektion, såsom ethyloleat. Sådanne doseringsformer kan også indeholde tilsætningsstoffer, såsom konserverings-, befugtnings-, emulgerings- og dispergeringsmidler. De kan steriliseres, f.eks. ved filtrering gennem et filter, der 25 tilbageholder bakterier, ved inkorporering af steriliseringsmidler i præparaterne, ved bestråling af præparaterne eller ved opvarmning af præparaterne. De kan også fremstilles i form af sterile, faste blandinger, som kan opløses i sterilt vand eller i et andet sterilt medium, 30 som egner sig til injektion, umiddelbart før anvendelsen.

Præparaterne til peroral indgivelse kan foreligge i en form, der er egnet til absorption gennem mavetarmkanalen. Tabletter eller kapsler til peroral indgivelse kan fore-35 ligge i en enhedsdoseringsform, og de kan indeholde konventionelle excipienter, såsom bindemidler, f.eks. sirup, acaciagummi, gelatine, sorbitol, tragacanthgummi eller DK 170255 B1 14 polyvinylpyrrolidon; fyldstoffer, f.eks. lactose, sukker, majsstivelse, calciumphosphat, sorbitol eller glycin; glittemidler, f.eks. magnesiumstearat, talkum, polyethy-lenglycol, silica; sprængmidler, f.eks. kartoffelstivel-5 se, eller acceptable befugtningsmidler, såsom natriumlau-rylsulfat. Tabletterne kan overtrækkes i overensstemmelse med for fagmanden velkendte metoder. Flydende præparater til peroral anvendelse kan f.eks. foreligge i form af vandige eller oliesuspensioner, opløsninger, emulsioner 10 eller sirupper, eller de kan foreligge som et tørt produkt, som kan rekombineres med vand eller et andet egnet medium før anvendelsen. Sådanne flydende præparater kan indeholde konventionelle tilsætningsstoffer, såsom suspensionsmidler, f.eks. sorbitolsirup, methylcellulose, 15 glucosesukkersirup, gelatine, hydroxyethylcellulose, car- boxymethylcellulose, aluminiumstearatgel, emulgeringsmidler, f.eks. lecitin eller sorbitanmonooleat; ikke-vandige bæremedier, som kan omfatte spiselige olier, f.eks. mandelolie, kokosolie, propylenglycol eller ethylalkohol; 20 konserveringsmidler, f.eks. methyl- eller propyl-p-hydro- xybenzoater eller sorbinsyre.

Præparater til rectal ingivelse er fortrinsvis suppositorier, som udover aktive bestanddele kan indeholde excipi-25 enter, såsom kakaosmør eller en suppositorievoks.

Doseringen af aktiv ingrediens i præparaterne fremstillet med de omhandlede forbindelser kan varieres; det er imid-lertid nødvendigt, at mængden af aktiv ingrediens er så 30 stor, at man opnår en egnet doseringsform. Den valgte dosering afhænger af den ønskede terapeutiske virkning og indgivelsesvejen og af behandlingens varighed. 1 almindelighed indgives doseringsniveauer på mellem 5 og 350 mg/kg legemsvægt pr. dag til pattedyrpatienter for at op-35 nå en antibiotisk virkning.

DK 170255 B1 15

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen og fremstillingen af udgangsmaterialer belyses nærmere i de efterfølgende eksempler og referenceeksempler.

5 EKSEMPEL 1

Fremstilling af (+)-cis-7-[2-(2-amlno-4-thlazolyl)-2-syn- methoxyiminoacetamido]-l-azabicyclo[4,2,0]oct-2-en-8-on- carboxylsyre [den optisk aktive forbindelse af den for- 10 bindelse, der repræsenteres af den almene formel (I'), 3 1 hvori Ά er CHg, R er H, cis angiver stereokemien i forbindelse med 6- og 7-stillingerne, og dette vil være gældende i det følgende].

VW TrtHA Η H -H

/7 noch, Γ 20 ° T 3>JVi

COOH O

COOH

Η2ΝΛ J

Τϊ^Χ\ Η Η H

25 -> CCON. : ! ^

'W

COOH

30 131, 3 mg (0,30 mmll) 2-(2-tritylamino-4-thiazol-2-synme-thoxyiminoeddikesyre opløses i 1 ml vandfrit ch1ormethan, og til opløsningsmidlet sættes 4,1 ul triethylamin ved en 35 temperatur på -20 °C.

DK 170255 B1 16

Efter tilsætning af 61,7 mg phosphorpentachlorid omrøres blandingen ved en temperatur på -20 °C i 30 minutter. Reaktionsblandingen inddampes under vakuum, og inddamp-ningsresten opløses i 1 ml vandfrit tetrahydrofuran til 5 dannelse af en syrechloridopløsning.

Separat opløses 40,2 mg (0,17 mmol) af monohydratet af hydrogenchloridsaltet af (+)-cis-7-amino-l-azabicyclo- [4,2,0]oct-2-en-8-on-2-carboxylsyre, der er fremstillet 10 som i referenceeksempel 2, i en blanding af 1 ml tetrahydrofuran og 1 ml vand, og 116,2 *il triethylamin sættes hertil.

Under omrøring og under isafkøling sættes den ovenfor 15 fremstillede syrechloridopløsning dråbevis til opløsningen, og blandingen får lov at reagere i en time. Reaktionsopløsningen reguleres til en pH-værdi på 2,0 med 5% saltsyre og ekstraheres tre gange med 10 ml ethylacetat. Ethylacetatlaget vaskes med 10 ml mættet saltopløsning, 20 tørres med natriumhydrogencarbonat og inddampes under vakuum til opnåelse af 93 mg af en rå acylforbindelse (den optisk aktive forbindelse af forbindelsen repræsenteret 3 1 ved den almene formel (I'), hvori A er CHg, R er H, og et hydrogenatom i Nl^ er erstattet med Trt). Denne for-25 bindelse opløses i 10 ml 50%. eddikesyre, og opløsningen omrøres ved en temperatur på 50°C i 30 minutter. Efter afkøling til stuetemperatur og fjernelse af et udfældet hvidt bundfald ved filtrering inddampes reaktionsopløsningen, og inddampningsresten opløses i en lille mængde 30 dimethylsulfoxid. Opløsningen påføres en søjle pakket med 10 ml "HP-10". Eluering udføres med vand op til en blanding af vand og methanol (1:2). De fraktioner, der viser en Rf-værdi på 0,3 ved silicagel-tyndtlagskromatografi [plade: Merck Art. 5719 (fremstillet af E. Merck & Co.), 35 opløsningsmiddel: butanol/eddikesyre/vand - 4:1:1], kombineres og inddampes under vakuum til opnåelse af 13,5 mg (udbytte 22,4 %) hvide krystaller af den ønskede forbin- 17 DK 170255 Bl delse.

Forbindelsens egenskaber er som følger: 5 Smeltepunkt: 172°C (dekomponering) [«]15° -32,6° (DMSO, c-0,5)

D

10 cm”^ IR (KBr) i> 1765, 1-60, 1630, 1545 max

Proton-NMR (DMS0-dg)6: 9,26 (IH, d) 7,19 (2H, s) 15 6,75 (IH, s) 6,28 (IH, t) 5,50 (IH, d-d, J-8,9, 4,7) 3,83 (3H, s) 2,5 - 1,0 (4H, m) 20

Disse værdier stemmer godt overens med dem, der opnås for den tilsvarende d,l-forbindelse. Ud fra den kraftige an-timikrobielle virkning antages denne forbindelses absolutte konfiguration at være (6R, 7S).

25 EKSEMPEL 2

Fremstilling af (-)-cis-70-[2-(2-amino-4-thiazolyl)-2-synmethoxyiminoacetamidol-4g-methyl-l-azabocyclo[4,2,0]-oct-2“en-8-on-2-carboxylsyre [den optisk aktive forbin-delsé af den forbindelse, der repræsenteres af den almene formel (I'), hvori A3 og R1 betyder CH3].

35 DK 170255 B1 18

H Η Η /X

TrT-Ni i 5 PO * N TH>VH:

o I noch3 I

COOH g-

COOH

•><x

Η Η H

CCON. ‘ ί ,-CH-,

__ il S—rY

> NOCH3 j I

15 o*

COOH

20 76 mg (0,17 mmol) 2-(2-tritylamino-4-thiazolyl)-2-synme- thoxyiminoeddikesyre opløses 1 1,52 ml vandfrit dichlor-methan, og 17,3 mg (0,17 mmol) triethylamin tilsættes ved .en temperatur på -15 °C. Efter tilsætning af 35,7 mg (0,17 mmol) phosphorpentachlorid omrøres blandingen ved 25 en temperatur på -15 °C i 30 minutter. Reaktionsblandingen inddampes under vakuum, og inddampningsresten opløses i 2 ml vandfrit tetrahydrofuran til opnåelse af en syrechloridopløsning.

30 Separat suspenderes 28 mg (0,10 mmol) af dihydratet af kaliumsaltet af (-)-cis-7i-amino-4e-methyl-l-azabicyclo- [4,2,0]oct-2-en-8-on-2-carboxylsyre, der er fremstillet som i referenceeksempel 4, 1 en blanding af 1,5 ml tetrahydrofuran og vand (1:1), og hertil sættes 36,3 mg (0,36 35 mmol) triethylamin til dannelse af en homogen opløsning.

Under omrøring og under isafkøling sættes syrechloridop-løsningen dråbevis til opløsningen, og blandingen får lov 19 DK 170255 B1 at reagere i 45 minutter. Reaktionsblandingen ekstraheres fire gange med 3 ml ethylacetat, og ethylacetatlaget vaskes med 5 ml mættet saltopløsning. Det vaskede materiale tørres med natriumhydrogencarbonat og inddampes under va-5 kuum til opnåelse af 7,1 mg af en rå acylforbindelse (den optisk aktive forbindelse af den forbindelse, der repræ- 3 1 senteres af den almene formel (1'), hvori A og R er CHg, og et hydrogenatom i NH2 er erstattet med Trt). Denne forbindelse opløses i 4,5 ml 50% eddikesyre, og opløs-10 ningen omrøres ved en temperatur på 50-55 °C i 45 minutter. Opløsningen afkøles til stuetemperatur, og det udfældede hvide bundfald fjernes ved filtrering. Filterkagen vaskes med 2 ml 50% eddikesyre. Filtratet og vaskevandet kombineres og inddampes under vakuum, inddamp-15 ningsresten opløses i en lille mængde dimethylsulfoxid og påføres en søjle pakket med 10 ml "HP-10". Elueringen udføres med en blanding af vand og methanol (5:1-2:1). De fraktioner, der viser en Rf-værdi på 0,54 ved silicagel-tyndtlagskromatografi (under anvendelse af de tidligere 20 anvendte betingelser), kombineres og inddampes under vakuum til opnåelse af 12,9 mg (udbytte 23,8%) hvide krystaller af den ønskede forbindelse.

Denne forbindelses egenskaber er som følger: 25

Smeltepunkt: 180 °C (dekomponering) [e]15° -270 (DMSO, c-0,5)

30 D

cm”1 IR (KBr)*> 1770, 1672, 1733, 1540 max 35 DK 170255 B1 20

Proton-NMR (DMS0-dg)6: 9,26 (IH, d, J=8,3) 7,18 (2H, s) 6,75 (IH, s) 6,28 (IH, t) 5 6,31 (IH, dr J=5,l) 5,51 (IH, d-d, J-8,3, 5,0) 3,83 (3H, s) 1,67 (2H, m) 1,07 (3H, d, J-7,3).

10

Disse værdier stemmer godt overens med dem, der opnås for den tilsvarende d,l-forbindelse. Ud fra den kraftige an-timikrobielle virkning formodes den absolutte konfiguration af denne forbindelse at være (4S, 6R, 7S).

15 EKSEMPEL 3

Fremstilling af tert.-butylester af (+)-cis-7-(2-phenyl- 2-t-butyloxycarbonyl-aminoacetamido)-3-chlor-l-azabicy-20 clo[4,2,0]oct-2-en-8-on-2-carboxylsyre ©-f-V^s HHBOC I I ] 25 X— 0 Xv 150 mg (0,55 mol) (+)-cis-7-amino-3-chlor-2-tert.-butyl-oxycarbonyl-l-azabicyclo[4,2,0]oct-2-en-8-on opløses i 3 30 ml vandfrit methylenchlorid. 166 mg (0,66 mmol) (R)-N-tert.-butyloxycarbonylphenylglycin opløses i 5 ml vandfrit tetrahydrofuran, og opløsningen afkøles til -15 til -10 °C. 0,66 ml (0,66 mmol) 1 n N-methylmorpholin i tetrahydrofuran og 0,66 ml (0,66 mmol) 1 n isobutylchlor-35 formiat i tetrahydrofuran tilsættes dråbevis, og blandingen omrøres ved den samme temperatur i 20 minutter. Den ovenfor fremstillede aminopløsning sættes dråbevis til 21 DK 170255 B1 blandingen, idet man holder den samme temperatur, og blandingens temperatur får lov tila t stige gradvis til stuetemperatur. Blandingen omrøres ved stuetemperatur natten over. 10 ml methylenchlorid sættes til reaktions-5 blandingen, og blandingen vaskes med 10% citronsyre, med mættet vandig natriumhydrogencarbonat og med mættet vandig natriumchlorid i denne rækkefølge, og der tørres med vandfrit natriumsulfat. Blandingen inddampes under vakuum og renses ved silicagelkromatografi (silicagel: 20 g "C-10 200" fremstillet af Wako Junyaku Co., Ltd., Japan; opløsningsmiddel: ethylacetat/n-hexan « 1:5 efter rumfang, dette er gældende i det følgende) til opnåelse af 124 mg (udbytte 44,6%) af den ønskede forbindelse (en blanding af diastereoisomere), som har følgende egenskaber: 15 cm”* IR (KBr) p : 1780, 1730, 1680, 1550. max NMR (CDClg) 6 (ppm): 7,34 (5/2 H, s) 20 7,31 (5/2 H, s) 6,93 (IH, m) 5,63 (IH, m) 5,30 (1/2 H, dd, J=5,4, 6,8 Hz) 5,11-5,22 (3/2 H, m) 25 3,76-3,91 (IH, m) 2,33-2,66 (2H, m) 1,52 (9H, s) 1,41 (9H, S) 0,92-1,97 (2H, m) 30 35 DK 170255 Bl EKSEMPEL 4 22

Fremstilling af (6R,7S)-7-(R)-phenylglycinamido-3-chlor- l-azabicyclo[4,2,0]oct-2-en-8-on-2-carboxylsyre (C) og 5 (6S,7R)-7-(R)-phenylglycinamido-3-chlor-l-azabicyclo- [4,2,0]oct-2-en-8-on-2-carboxylsyre (D)

/ \ (R) Η Η /~”\ (R) Η H

(o con (o>c«c°nh\Lj/\ 10 ' UH, I Γ I I 1

C02H C02B

15 (C) (D) 1 ml methylenchlorid og 1 ml trifluoreddikesyre sættes til 128,4 mg (0,25 ramol) tert-butylester af (+)-cis-7-(2-phenyl-2-tert.-butyloxycarbonylaminoacetamido)-3-chlor-l-20 azabicyclo[4,2,0]oct-2-en-8-on-2-carboxylsyre under isaf køling, og blandingen omrøres ved stuetemperatur i 1,5 timer. Opløsningsmidlet afdestilleres, og det resulterende olieagtige materiale underkastes hurtigtgående væskekromatografi [søjle: Microbondapak C18 (fremstillet af 25 Waters Co.); opløsningsmiddel: 7% methanol og 0,2 n KH2PO4] til adskillelse af diastereoisomere. Hver af de adskilte eluatfraktioner inddampes under vakuum, og saltet fjernes under anvendelse af 10 ml "Diaion HP-10" harpiks (opløsningsmiddel: methanol/vand * 1:1) til dannelse 30 af 9,4 mg af den mere polære isomere (D) og 7,6 mg af den mindre polære isomere (C) (totalt udbytte 19,1%).

Mere polære isomere (D) 35 21° [«] -75,8° (c-0,4, H,0) D Δ 23 DK 170255 B1

Smeltepunkt: 300 °C eller højere (brunfarvning) cm”1 IR (KBr) » : 1765, 1700, 1550 max 5 NMR (D20) β (ppm): 7,49 (5H, s) 5,16 (IH, d, J=4,7 Hz) 5,05 (IH, s) 3,78-4,03 (IH, m) 10 2,53-2,67 (2H, m) 1,26-2,09 (2H, m)

Mere polære isomere (C) 15 ° [a] +34,0° (c*=0,35, H.,0) D Δ

Smeltepunkt: 300 °C eller højere (brunfarvning) 20 -1 cm IR (KBr) v : 1770, 1700, 1620 max NMR (D20) 6 (ppm): 7,51 (5H, s) 25 5,36 (IH, d, J«4,6 Hz) 5,19 (IH, s) 3,83-4,00 (IH, m) 2,41-2,56 (2H, m) 1,49-1,76 (IH, m) 30 1,14-1,45 (IH, m)

Som nedenfor beskrevet udviser den mindre polære isomere (C) kraftigere antimikrobiel aktivitet, og den formodes at have (6R,7S) som absolut konfiguration.

35 EKSEMPEL 5 DK 170255 B1 24

Fremstilling af (+)-cis-7-phenylacetamido-3-chlor-l-aza-bicyclo[4, 2,0]oct-2-en-8-on-2-carboxylsyre 5 o i YSi

10 COOH

150 mg (0,45 mmol) af trifluoracetatet af (+)-cis-7-ami-no-3-chlor-l-azabicyclo[4,2,0]oct-2-en-8-on-2-carboxylsy-re bringes i suspension i et blandet opløsningsmiddel af 15 2 ml vand og 2 ml acetone, dertil sættes 134 mg (1,5 mmol) natriumhydrogencarbonat til dannelse af en homogen opløsning. Til opløsninge4n sættes dråbevir en opløsning af 84,2 mg (0,54 mmol) phenylacetylchlorid i 0,5 ml acetone under isafkøling i løbet af 1 time* Blandingen omrø-20 res i 3 timer, justeres til pH 2 med 1 n saltsyre og eks-traheres 5 gange med 2 ml ethylacetat. Ekstrakten inddampes under vakuum, og inddampningsresten tørres til opnåelse af 80 mg (55,0%) af den ønskede forbindelse.

25 cm”1 IR (KBr) » : 1790, 1705, 1630, 1560.

max NMR (CD30D) δ (ppm): 7,25 (5H, s) 5,36 (IH, d, J « 5 Hz) 30 3,79-3,99 (IH, m) 2,56-2,75 (2H, m) 1,17-2,02 (2H, m) 35 EKSEMPEL 6 DK 170255 B1 25

Fremstilling af (6R,7S)-7-(R)-p-hydroxyphenylglycinamido- 3-chlor-l-azabicyclo[4,2,03oct-2-en-8-on-2-carboxylsyre 5 /7Λ (R) H0 C J VCHCONH _ 10 C1

COOH

1 ml methylenchlorid og 1 ml trifluoreddikesyre tilsættes 15 under isafkling 104,3 mg (20 mmol) tert.-butylester af (+)-cis-7-[2-(p-hydroxyphenyl)-2-t-butyloxycarbonylamino-acetamido]-3-chlor-l-azabicyclo[4,2,0]oct-2-en-8-on-2-carboxylsyre (blanding af de diastereoisomere), der er syntetiseret på samme måde som i eksempel 3 ud fra den 20 tertiære butylester af (+)-cis-7-amino-3-chlor-l-azabicy-clo[4,2,0]oct-2-en-8-on-2-carboxylsyre og N-tert.-butyl-oxycarbonyl-(R)-p-hydroxyphenylglycin. Blandingen omrøres .ved denne temperatur i 1,5 timer og inddampes under vakuum. Det resulterende olieagtige materiale underkastes 25 hurtig væskekromatografi (søjle: Mikrobondapak C-18; opløsningsmiddel: 7% methanol-0,2n kaliumdihydrogenphos- phat] til adskillelse af de diastereoisomere. Fraktionerne, der indeholder den mindre polære isomere, inddampes under vakuum, og saltet fjernes med 10 ml "HP-10"-harpiks 30 (opløsningsmiddel: methanol/vand * 1:1) til dannelse af 10,5 mg (28,7%) af den ønskede forbindelse.

20° [e] +44° (c=0,25, 1 molær phosphatbuf- D fer, pH 7,0) 35 26 DK 170255 B1 cm ^ IR (KBr) » : 1765, 1695, 1615, 1520.

max NMR (D20) 6 (ppm): 7,36 (2H, d, J-8,8 Hz) 5 6,96 (2H, d, J*8,8 Hz) 5,36 (IH, d, J«4,6 Hz) 5,11 (IH, s) 3,81-4,00 (IH, m) 2,42-2,58 (2H, m) 10 1,59-1,77 (IH, m)

Den antibakterielle virkning af de forbindelser, der er fremstillet i eksemplerne 4 og 6, er vist i efterfølgende tabel. Aktiviteten er fastlagt ved hjælp af hjerteinfu-sionsagarfortyndingsmetoden (pH * 7,2). Cephalexin og ce-fazolin er anvendt som referenceforbindelser. Ud fra den antimikrobielle aktivitet antages den absolutte konfiguration af denne forbindelse at være (6R,7S).

20 25 30 35 TABEL 2 DK 170255 Bl 27 MIC Ug/ml) 5 Mikroorganisme a b c d

Staphylococcus aureus 209-p 0,1 0,4 0,2 0,05

Staphylococcus aureus Smith 1,56 1,56 3,12 0,4

Staphylococcus epidemidis 1,56 1,56 3,12 0,78 10 Escherichia coli NIHJC-2 1,56 1,56 12,5 1,56

Escherichia coli Juhl 1,56 1,56 12,5 1,56

Klebsiella pneumoniae 8045 0,2 0,78 3,12 0,78

Klebsiella pneumoniae Y-60 6,25 12,5 50 3,12

Serratia marcescens T-55 6,25 6,25 50 50 15 Proteus mirabilis 1287 3,12 3,12 25 12,5

Proteus vulgaris 6897 100 100 25 12,5

Proteus morganii KY4298 100 100 100 100

Pseudomonas putida F264 100 100 100 25 20 a: Forbindelsen (C) fremstillet i eksempel 4 b: Forbindelsen fremstillet i eksempel 6 c: Cephalexin d: Cefazolin 25 REFERENCEEKSEMPEL 1

De antimikrobielle aktiviteter af de forbindelser, der er fremstillet i eksemplerne 1 og 2, er som anført i det 30 følgende. Der anvendes hjerteinfusionsagarfortyndingerne-toden (pH 7,2). Som reference anvendes den cephalosporin-forbindelse, som har den samme acylsidekæde svarende til d,1-forbindelsen.

35 A: Forbindelsen fremstillet i eksempel 1 A': d,l-forbindelsen svarende til forbindelsen fremstillet i eksempel 1 28 DK 170255 B1 B: Forbindelsen fremstillet i eksempel 2 B': d,1-forbindelsen svarende til forbindelsen fremstillet i eksempel 2 C: Cephalosporin-forbindelsen, der har følgende formel: 5 H « CCONfe. < « » Ι^ΥΤΊ

Cr Y ^CH2OCOCH3 co2h 15 20 25 30 35 DK 170255 B1 29 co*£>vo in ifi ri ι/i o m ri m H tn

Γ-ininrHOOOOr-rriOOOOCM r-J

r) .Kks<»»V'>·'·····*··' *

OHrriOOOOOOOOOOOVDOO

VJ VJ V| ^ in I/INI/Irlinoo ,rlri rri -· tNiminooooor'MOOi-io ni m - - - - v » * » " - - - - k _ **

VDCNCMOOOOOOOOOOOOOO

rri H ^ O

*“X

«Η tn liinniNrlNrlN in ri ri N ri in

ry. inOJrriOOOOO^OOOOO O

w rQ ** • rriiomoooooooooooinoo

u VI VI VI vi V| ™ H

a a

^ ΙΟ VD

j m m o m co ni h o S _ m oorrioor^HooHo CQ «. *“ S cMintnooooooooooomoo fri Η N N V| VJ 01 10

lo %D vD

m in n ri n o n no «-i o t n o m

*—iminooooocMOOOoocN H

miomoooooooooooiooo rH yj Vj V| 10 PM Λ i +) in in o ih m oi ri -H in 'r co o E Ό ni i oiiom ω <n s* h (Ί W ri I ri 00 >1 N ΙΠ O) «> . _ g u ri Ilt" ni <N sj cd ri1

Ulllllb^H(l)ll)^tlOOIN,!l'^ WlQVD SSHIBNiU«! cn σι 0 O ni 0) ΦΌΗ2 3 ri ri tn MrriC0>j>J G G Μ M ri & O ^ G G G G «> SU W 'H ^ 5 330. OOCDQJM &> t7> Ό

ίΰίοω-ΗΉ-ΗΕβϋϋΉω-ΗΉ 3 ί ri HHHSSWCOrri-H-HH MVl-P fl) t0WWOOOQ)CQ)<D*H5jCøa)Q)P

• S aaaoociCOOOÆcenJDiiccCft Μ Οϋϋ dl Cl iri H «0- Ο» Ο» +J ^ •h uoo<dnJ«J tirtUriuJJWMtt) c OOOririri«lllgEriSO(llJ«5 ti ΟΟΟΛΛΛΗΗ β>β^βββ

Gi OOOOOOHrriienJ 0 0 0

U HriririririHJdlririllieillllllgÉE

O N^rhUHH-H-H^-PgSgPOOO

O jCjijiCDCUCDloaocdrtCDCUlDO'O'O’O

J3 ffifffooolBohkp oppeg«

j 4j+)4Jinmwrrit-i<Da)}-i}-iirii-iwwM

DK 170255 B1 30 REFERENCEEKSEMPEL 2

Fremstilling af (+)-cis-7-amino-l-azabicyclo[4,2,0]oct-2-en-8-on-2-carboxylsyre 5 2-1) Fremstilling af en suspension af brudte celler 1) Dyrkning af en mikroorganisme med evne til optisk selektiv deacylering 10

Som podestammen anvendes Kluyvera citrophila ATCC 21285 [biologiske egenskaber er beskrevet i J. General Applied Microbiology 3, 28-31 (1957)].

15 Som podemedium anvendes en vandig opløsning indeholdende 1% polypepton, 1% gærekstrakt, 0,5% kødekstrakt, 0,5% na-triumglutamat og 0,25% natriumchlorid og reguleret til en pH-værdi på 7,0 med 5n NaOH. En øjefuld af podestammen podes i 10 ml af podemediet i et 50 ml reagensglas, og 20 dyrkningen udføres ved en temperatur på 30 °C i 24 timer. Hele podevæsken podes i 300 ml af dyrkningsmediet i en 2 liter Erlenmeyer-kolbe, og dyrkningen udføres ved en temperatur på 40 °C under rystning. Sammensætningen af dyrkningsmediet er den samme som sammensætningen af podemedi-25 et.

(2) Fremstilling af en suspension af brudte celler

Efter dyrkning i 24 timer underkastes dyrkningsvæsken 30 centrifugering til opnåelse af cellelegemerne. Cellerne vaskes to gange med 50 ml 0,9% saltopløsning og bringes i suspension i en koncentration på 40 mg/ml beregnet på tørstof i 1/30 molær phosphatpufferopløsning. Derpå anbringes 10 ml af cellesuspensionen i et 50 ml stort rea-35 gensglas og underkastes ultasonisk nedbrydning ved 200 W

i 2 minutter til dannelse af en suspension af brudte celler. Ved behandlingen anvendes en ultrasonisk desintegra- DK 170255 B1 31 tor, model UR200P (fremstillet af Tomy Seiko Co., Ltd.).

2-2) Fremstilling af substratopløsning 5 200 mg (+)-cis-7-phenylacetamid-l-azabicyclo[4,2,0]oct-2- en-8-on-2-carboxylsyre, der er fremstillet som i DE offentliggørelsesskrift nr. 2911787, sættes til 9 ml 1/30 molær phosphatbuffer (pH 6,5). Eftersom forbindelsen ikke opløses, tilsættes 2n NaOH i små mængder, og blandingen 10 justeres atter til en pH-værdi på 6,5 til opløsning af forbindelsen. Endelig tilsættes ionbyttet vand til dannelse af 10 ml opløsning.

2-3) Enzymreaktion 15 10 ml af den ovennævnte suspension af brudte celler sættes til 10 ml af substratopløsningen, og enzymreaktionen udføres ved en tempratur på 30 °C i 80 minutter. Det tidsmæssige forløb af reaktionen belyses i tabel 5.

20 TABEL 5 Mængden af fremstillet

Reaktionstid forbindelse (XII-1) Udbytte 25 (minutter) (mg/ml) (Molforhold, %) 10 2,0 33 20 2,6 43 40 2,9 48 30 60 3,0 50 80 3,0 50

Som det fremgår af tabel 5, er reaktionen og udbyttet stationære, når omdannelsesgraden af blandingen af de op-35 tisk aktive isomere når 50% (molforhold).

DK 170255 Bl 32 2-4) Isolering og rensning af den ønskede forbindelse

Efter afslutningen af reaktionen fjernes cellerne fra reaktionsopløsningen ved centrifugering. Supematanten re-5 guleres til en pH-værdi på 3,0 med 2n saltsyre og påføres en søjle (2,6 cm bred, 51 cm høj) pakket med 270 ml "Diaion HP-10".

Elueringen udføres med ionbyttet vand, og eluatet opsam-10 les i fraktioner på 5 ml. Den ønskede forbindelse elueres fra fraktionerne 280 til 315 ml. Fraktionerne inddampes under vakuum, lyofiliseres og opløses i en lille mængde af en blanding af vand og methanol (50:50 efter rumfang, hvilket vil gælde i det følgende). Opløsningen påføres en 15 søjle (1,6 cm bred, 64,5 cm høj), der er pakket med 130 ml "Sephadex® LH-20" (Pharmacia Fine Chemicals Inc.). Elueringen udføres med en blanding af vand og methanol (50:50). Eluatet opsamles i fraktioner på 5 ml. Fraktionerne fra 65 ml til 85 ml kombineres og inddampes under 20 vakuum til fjernelse af methanol. Derpå lyofiliseres ind-dampningsresten til dannelse af 48 mg af et hvidt pulver. Reaktionsproduktets egenskaber er som følger: cm”1 IR (KBr) v : 1800, 1790, 1775, 1640, 1620 max NMR (100M D20-DDS)5: 6,46 (IH, dd, J-3,5, 4,7 Hz) 4,88 (IH, d, J-5,2 Hz) 4,06 (IH, m) 30 2,5-1,5 (4H, m)

Det fremgår heraf, at forbindelsen har et mol hydrogen-chlorid og vand. Forbindelsens egenskaber stemmer godt overens med egenskaberne for den tilsvarende dl-forbin-33 delse. Værdien for optisk rotation er 15° 33 DK 170255 B1 [o] +48° [c=0,5 i 1 molær phosphatbufferopløsning

D

(pH 7,9)], hvilket stemmer godt overens med værdien i referenceeksempel 3 nedenfor 5 15o [«] 48,5° [c«0,5 i 1 molær phosphatbufferopløsning

D

(PH 7,0)].

Forbindelsen udviser en ninhydrin-positiv enkelt plet ved en Rf-værdi på 0,22 ved silicagel-tyndtlagskromatografi [tyndtlagsplade Merck Art 5721 (fremstillet af E. Merck & Co.), opløsningsmiddel til udvikling: 2-propanol/eddike-syre/vand = 4:1:1]. Rf-værdien stemmer overens med værdi-en for den optisk inaktive dl-forbindelse.

10 REFERENCEEKSEMPEL 3

Fremstilling af (+)-cis-7-amino-l-azabicyclo[4,2,0]oct-2-2q en-8-on-2-carboxylsyre (alternativ fremgangsmåde) 3-1) Fremstilling af en suspension af brudte celler

Man gentager en procedure mage til den i referenceeksem-25 3-2) Fremstilling af en substratopløsning 100 mg (+)-cis-7-[(R)-2-phenyl-2-aminoacetamido]-1-azabi-cyclo[4,2,0]oct-2-en-8-on-2-carboxylsyre fremstillet som i DE offentliggørelsesskrift nr. 2911787 opløses i 5 ml 1/30 molær phosphatbufferopløsning (pH 6,5).

35 34 DK 170255 B1 3-3) Enzymreaktion 5 ml af den ovennævnte suspension af brudte celler sættes til 5 ml af substratopløsningen, og enzymreaktionen udfø-5 res ved 30 °C i 24 timer.

3- 4) Isolering og rensning

Der opnås 46 mg af et hvidt pulver ved en fremgangsmåde 10 mage til den i referenceeksempel 2-4). Forbindelsens egenskaber stemmer godt overens med egenskaberne af den forbindelse, der er fremstillet i referenceeksempel 2.

15° [a] 48,5° [c=0,5 i 1 molær phosphatbufferopløsning

15 D

(pH 7,0)] REFERENCEEKSEMPEL 4 20

Fremstilling af (-)-cis-70-amino-4a-methyl-l-azabicyclo- [4,2,0]oct-2-en-8-on-2-carboxylsyre: 4- 1) Fremstilling af en suspension af brudte celler 25

Man gentager en procedure mage til den i referenceeksempel 2-1).

4-2) Fremstilling af en substratopløsning 30 En procedure mage til den i referenceeksempel 2-2) gentages med undtagelse af, at man anvender (+)-cis-70-phenyl-acetamid-4e-methyl-l-azabicyclo[4,2,0]oct-2-en-8-on-2-carboxylsyre fremstillet som i DE offentliggørelsesskrift nr. 2911787.

35 35 DK 170255 B1 4-3) Enzymreaktion

En procedure mage til den i referenceeksempel 2-3) gentages med undtagelse af, at man anvender den i 4-1) og 4-2) 5 fremstillede suspension af brudte celler og substratopløsning. Omsætningsforholdet bliver stationært i løbet af 1 time. Reaktionen fortsættes i 120 minutter. Udbyttet er 50% (molforhold) af blandingen af de optisk aktive forbindelser.

10 4-4) isolering og rensning af den ønskede forbindelse

Man gentager en procedure næsten mage til den i referenceeksempel 2-4). Efter afslutning af reaktionen fjernes 15 cellerne fra reaktionsopløsningen ved centrifugering. Su-pernatanten påføres en søjle (2,5 cm bred, 46 cm høj) pakket med 220 ml "Diaion HP-10". Elueringen udføres med ionbyttet vand, og eluatet opsamles i fraktioner på 5 ml.

Den ønskede forbindelse elueres i fraktionerne 200 til 20 270 ml. Fraktionerne inddampes under vakuum, lyofiliseres og opløses i en lille mængde vand og methanol (50:50). Opløsningen påføres en søjle (1,6 cm bred, 64,5 cm høj) pakket med 130 ml "Sephadex© LH-20", og elueringen udføres med en blanding af vand og methanol (50:50). Eluatet 25 opsamles i fraktioner på 5 ml. Fraktionerne 65 ml til 80 ml forenes og inddampes til fjernelse af methanol. Derpå lyofiliseres inddampningsresten til opnåelse af 30,5 mg af et hvidt pulver. Forbindelsens egenskaber er som følger: 30 cm-1 IR (KBr) t> : 1800, 1770 (sh), 1760 (sh), 1740, 1680, max 1630 35 DK 170255 B1 36 NMR (100M D20-DSS): 6,16 (IH, d, J-5,1 Hz) 4,52 (IH, d, J«4,9 Hz) 3,86 (IH, m) 2,64 (IH, m) 5 1,9-14, (2H, m) 1,10 (3H, d, J-7,3 Hz)

Det afsløres, at forbindelsen er et kaliumsalt med to mol vand. De ovenstående egenskaber stemmer godt overens med 10 egenskaberne af den tilsvarende dl-forbindelse. Forbin delsen udviser en ninhydrin-positiv enkelt plet ved Rf = 0,33 ved silicagel-tyndtlagskromatografi (der anvendes samme silicagel som i eksempel 1). Rf-værdien stemmer overens med værdien for den optisk inaktive dl-forbindel-15 se.

Optisk rotation 15° C«) -30° [00,5, i 1 molær phosphatbufferopløsning].

zu 13 Værdien stemmer godt overens med værdien i referenceeksempel 4: 15° [e] -30,8° [00,5, i 1 molær phosphatbuffer- 25 D opløsning (pH 7,0)].

REFERENCEEKSEMPEL 5

Fremstilling af (-)-cis-7g-amino-4a-methyl-l-azabicyclo- [4,2,0]oct-2-en-8-on-2-carboxylsyre (alternativ frem gangsmåde ) 5-1) Fremstilling af suspension af brudte celler 35 37 DK 170255 B1

En procedure mage til den i referenceeksempel 4-1) genta ges.

5-2) Fremstilling af en substratopløsning 5 100 mg (+)-cis-70-[(R)-2-phenyl-2-aminoacetamido]-4«-me-thyl-l-azabicyclo[4,2,0]oct-2-en-8-on-2-carboxylsyre fremstillet som i DE offentliggørelsesskrift nr. 2811787 opløses i 5 ml 1/30 molær phosphatbufferopløsning.

10 5-3) Enzymreaktion 5 ml af den ovenfor beskrevne suspension af brudte celler sættes til 5 ml af substratopløsningen, og enzymreaktion-15 en udføres ved en temperatur på 30 °C i 24 timer.

5-4) Isolering og rensning af det ønskede produkt

En procedure mage til den i referenceeksepel 4-4) genta-20 ges, hvorved man opnår 55 g af et hvidt pulver. Forbindelsens egenskaber stemmer godt overens med dem, der er angivet i referenceeksempel 4.

Optisk rotation 25 15° [a] -30,8° [c=0,5, i 1 molær phosphatbufferopløs- D ning (pH 7,0)].

30 35 DK 170255 B1 38 REFERENCEEKSEMPEL 6

Fremstilling af (+)-cis-7-azldo-3-chlor-2-tert.-butyloxy-carbonyl-l-azabicyclo Γ 4,2,03oct-2-en-8-on 5 /-N Ύ^\01 10 I fcBu co2

Den ovenstående forbindelse fremstilles ved de efterfølgende processer (a), (b), (c) og (d).

15 6-a) Fremstilling af (-)-cis-7-azido-3-phenylthio-l-aza-bicyclo[4,2,0]octan-8-2-carboxylsyre, tert.-butyl- ester:

HH -HH

20 « · i T

^3 -j-K3-^j 0 I 0 I SPh 25 C02tBu CO^Bu 528 mg (2 mmol) (+)-cis-7-azido-l-azabicyclo[4,2,0]oct-2-en-8-on-2-carboxylsyre, tert.-butylester, fremstillet ved den metode, der er beskrevet i japansk offent-30 liggjort, men ikke undersøgt patentansøgning nr. 128591/79, opløses i 15 ml vandfrit benzen, og der tilsættes 0,2 ml (2 romol) thiophenol og 0,2 ml (2 mmol) pi-peridin. Blandingen omrøres ved stuetemperatur i 2 timer. Efter afslutning af reaktionen vaskes reaktionsopløsnin-35 gen med 10% citronsyre og med mættet saltopløsning, og den tørres med vandfrit natriumsulfat. Opløsningsmidlet fjernes ved destillation under vakuum, og den resulteren- DK 170255 Bl 39 de olieagtige inddampningsrest renses ved silicagelsøj lekromatografi under anvendelse af 30 g silicagel og et opløsningsmiddel bestående af ethylacetat og n-hexan (1:4) til opnåelse af 720 mg (96,3%) af den ønskede forbindel-5 se.

Smeltepunkt: 77,5-78,0 °C

cm ^ IR (KBr) v : 2110, 1765, 1745.

max NMR (CDC13) 6: 7,28-7,60 (5H, m) 4,78 (IH, d, J-5 Hz) 4,33 (IH, s) 15 3,78-3,98 (IH, m) 3,81 (IH, s) 1,50-2,34 (4H, m) 1,42 (9H, s) ^ 6-b) Fremstilling af (+)-cis-7-azido-3-phenylsulfinyl-l- azabicyclo[4,2,0]octan-8-on-2-carboxylsyre, tert.-butylester: ? ? ft} 25 ”3Ί~0 _* H-p1 o 0Ρ\η. ry'' k ctpBu C02 Bu 2 480 mg (1,28 mmol) 3-phenylthioforbindelse fremstillet som i referenceeksempel 6-a), opløses i 50 ml vandfrit chloroform og 240 mg (1,41 mmol) m-chlorperbenzoesyre under isafkøling. Blandingen får lov at reagere under omrøring og under isafkøling i 30 minutter. Reaktionsblandin- oc gen vaskes med mættet natriumchlorid og tørres med vandfrit natriumsulfat. Opløsningsmidlet fjernes ved destil DK 170255 B1 40 lation under vakuum til opnåelse af 500 mg (99,9%) af den ønskede forbindelse.

Smeltepunkt: 95,6 - 96,5 °C

5 vor IR (cm Α)ϊ 2120, 2100, 1780, 1735, 1035

1U3X

NMR (CDClg) 6 : 7,55 - 7,91 (5H, m) 10 4,87 (IH, d, J»4,6 Hz) 4,05 (IH, s) 3,90 - 4,10 (IH, m) 3,10 (IH, s) 1,70 - 2,84 (4H, m) 15 1/30 (9H, s) 6-c) Fremstilling af (+)-cis-7-azido-3-chlor-3-phenylsul-finyl-1-azabicyclo[4,2,0]octan-8-on-2-carboxylsyre, tert.-butylester:

20 ψ H HH

»Vi,» °'uy> 25 C02 tBu tBuOOC 0 109 mg sulfoxidforbindelse fremstillet som i referenceeksempel 6-b) opløses i 1 ml vandfrit methylenchlorid, og der tilsættes 23,5 mg (0,42 mmol) calciumoxid. Efter til-sætning af 27 ag (0,34 mmol) sulfinylchlorid får blandingen lov at reagere under omrøring og isafkøling i 1 time. Reaktionsblandingen vaskes med 10% citronsyre, mættet na-triumhydrogencarbonatopløsning og mættet natriumchlorid-opløsning og tørres over vandfrit natriumsulfat. Opløsningsmidlet fjernes ved destillation, og den resulterende olieagtige inddampningsrest underkastes silicagelkromato-grafi under anvendelse af 5 g silicagel og et opløsnings- 41 DK 170255 B1 middel af ethylacetat og n-hexan (1:5) til opnåelse af 66,5 mg (56,1%) af den rensede ønskede olieagtige forbindelse.

5 IR "max3"3 (cm”1): 2120' 1770' 1735' 1035 NMR (CDClg) 6 : 7,53 - 8,00 (5H, m) 4,90 (IH, d, J«5 Hz) 10 4,43 (IH, s) 4,15 - 4,35 (IH, m) 1,83 - 2,85 (4H, m) 1,38 )9H, s) 6-d) Fremstilling af (+)-cis-7-azido-3-chlor-l-azabicy- 15 clo[4,2,0]oct-2-en-8-on-2-carboxylsyre, tert.-butyl-ester: ? ·! v ? - » /-NY<|Ph

SuOOC 0 C02tBu 0_ 1,3 g (3,06 mmol) 3-chlor-3-phenylsulfonyl-forbindelse fremstillet som i referenceeksempel 6-c) opvarmes under tilbagesvaling sammen med 100 ml carbontetrachlorid i 6 timer. Efter afslutning af reaktionen underkastes reaktionsopløsningen destillation under vakuum til fjernelse af opløsningsmidlet. Den opnåede inddampningsrest under-

wU

kastes oprensning ved silicagelkromatografi tinder anvendelse af 100 g silicagel og et opløsningsmiddel bestående af ethylacetat og n-hexan (1:5) til opnåelse af 596 mg (65,2%) af den ønskede forbindelse.

Smeltepunkt: 96 - 97 °C.

35 DK 170255 B1 42 IR vmax (cm x): 2120, 1765, 1735, 1630.

Proton-NMR (CDClg) fi: 4,94 (IH, d, J-5 Hz) 5 3,72 - 3,92 (IH, m) 2,56 - 2,70 (IH, m) 1,86 - 2,32 (2H, m) 1,55 (9H, s) 10 Carbon-NMR (CDClg) e: 127,7, 125,0.

REFERENCEEKSEMPEL 7

Fremstilling af 6-b) (+)-cis-7-amino-3-chlor-l-azabicy-clo[4,2,0]-oct-2-en-8-on-carboxylsyre, tert.-butylester:

H » HH

20 CX

CO^Bu C02tBu 350 ml (1,17 mmol) af den i referenceeksempel 6 fremstillede azido-forbindelse opløses i 20 ml ethanol samt 1,2 2g ml 1 n saltsyre og 70 mg og 10% palladium-på-kulstof. Gasformigt hydrogen bobles igennem blandingen ved stuetemperatur og atmosfæretryk i 3 timer, og palladium-på-kulstof fjernes ved filtrering. Filtratet inddampes under vakuum til opnåelse af et fast stof. Det faste stof opløses i vand og vaskes med ether. Efter tilsætning af na- wv triumhydrogencarbonat til svagt alkalisk reaktion ekstra-heres vandlaget med ethylacetat. Ethylacetatlaget vaskes med mættet saltopløsning og tørres med vandigt natriumsulfat. Opløsningsmidlet fjernes ved destillation under vakuum til opnåelse af 218,4 mg (68,4%) af et pulver be-35 stående af den ønskede forbindelse.

DK 170255 Bl 43

Smeltepunkt: 102,5 - 104,5 °C

IR vmax 1770' 1720> 1620 · 5 NMR (CDC13) 6 : 4,43 (IH, d, J»5 Hz) 3.52 - 3,90 (IH, m) 2.52 - 2,72 (2H, m) 2,22 (2H, br) 10 1/87 - 2,17 (2H, m) 1,55 (9H, s) REFERENCEEKSEMPEL 8

Fremstilling af trifluoracetatet af (+)-cis-8-amino-3-chlor-l-azabicyclo[4,2,0]oct-2-en-8-on-2-carboxylsyre:

Η H

HH : i j , H9N ! · _ 20 Cl

CC^Bu C02H

Til 102,2 mg (0,31 mmol) af den i referenceeksempel 7 2g fremstillede amino-esterforbindelse sættes 1 ml trifluor- eddikesyre under isafkøling. Blandingen omrøres ved stuetemperatur i 30 minutter. Opløsningsmidlet fjernes ved destillation under vakuum til opnåelse af en olieagtig inddampningsrest. Til inddampningsresten sættes ether, og det resulterende pulver isoleres ved filtrering. Pulveret lyofilisere til opnåelse af 95,5 mg (60,9%) af den ønskede forbindelse.

Smeltepunkt: 208 - 220 °C

35 IR *max icm~1>: 1795' 1630· 44 DK 170255 B1 REFERENCEEKSEMPEL 9

Fremstilling af (-)-cis-7-amino-3-chlor-l-azabicyclo- [4,2,0]oct-2-en-8-on-2-carboxylsyre: 5 9-1) Fremstilling af en suspension af brudte celler.

1) Dyrkning af en mikroorganisme med evne til optisk aktiv deacylering.

10

Som podestamme anvendes Kluyvera citrophila ATCC 21285 [biologiske egenskaber er beskrevet i J. General Applied Microbiology 3, 28-31 (1957)].

15 Som podemedium anvendes en vandig opløsning indeholdende 1% polypepton, 1% gærekstrakt, 0,5% kødekstrakt, 0,5% na-triumglutamat og 0,25% natriumchlorid justeret til en pH-værdi på 7,0 med 5n NaOH. En øjefuld podestamme podes ind i 10 ml af podemediet i et 50 ml reagensglas, og dyrk-20 ningen udføres ved en temperatur på 30 °C i 24 timer. Hele podevæsken podes ind i 300 ml dyrkningsmedium i en 2 liter Erlenraeyer-kolbe, og dyrkningen udføres ved en temperatur på 30 °C under omrystning. Sammensætningen af dyrkningsmediet er den samme som af podemediet.

25 2) Fremstilling af en suspension af brudte celler

Efter dyrkning i 24 timer underkastes dyrkningsvæsken centrifugering til opsamling af cellelegemer. Cellerne 30 vaskes to gange med 50 ml 0,9% saltopløsning, og de bringes i suspension i en koncentration på 40 mg/ml beregnet på tørstof i 1/30 molær phosphatbufferopløsning (pH * 8,0).

35 DK 170255 B1 45 9-2) Fremstilling af en substratopløsning 200 mg ( + ) cis-7-phenylacetamido-3-chlor-l-azabicyclo- [4,2,0]oct-2-en-8-on-2-carboxylsyre fremstillet som i 5 eksempel 13 sættes til 9 ml 1/30 molær phosphatbuffer (pH * 8,0). Eftersom forbindelsen ikke opløses, tilsættes 2n NaOH i små mængder, og blandingen reguleres igen til en pH-værdi på 8,0 til opløsning af forbindelsen. Endelig tilsættes ionbyttet vand til dannelse af 10 ml opløsning.

10 9-3) Enzymreaktion 10 ml af den ovennævnte suspension af brudte celler sættes til 10 ml af substratopløsningen, og enzymreaktionen 15 udføres ved en temperatur på 40 °C i 80 minutter. Tidsforløbet af reaktionen er belyst i tabel 6.

TABEL 6 20 Dannet mængde af

Reaktionstid forbindelse (III-l) Udbytte (minutter) (ml/ml) (Molforhold, %) 10 1,3 20 20 1,8 28 25 40 2,0 31 60 2,3 36 80 2,4 37 9-4) Isolering og rensning af den ønskede forbindelse 30

Efter afslutning af reaktionen fjernes cellerne fra reaktionsopløsningen ved centrifugering. Supernatanten koncentreres under vakuum til dannelse af 5 ml opløsning. Denne opløsning påføres en søjle (1,75 cm bred, 42 cm 35 høj) pakket med "Diaion HP-10N. Eluering udføres med ionbyttet vand. Den ønskede forbindelse elueres med fraktio- DK 170255 B1 46 nerne fra 90 ml til 120 ml. Disse fraktioner koncentreres under vakuum til 2 ml opløsning, og denne opløsning justeres til pH 3,5 med 1 n saltsyre til udskillelse af krystaller. Krystallerne udvindes ved filtrering, vaskes 5 med en lille mængde methanol og tørres til opnåelse af 38 mg af et hvidt pulver. Produktets egenskaber er som følger: -i cro IR(KBr) v : 3200, 1800, 1790 (sh), 1640 (sh), max 1630. 1555.

NMR (100M D20-DSS) 6 : 4,47 (IH, d, J-5,1 Hz) 3,88 (IH, m) 2,64 (2H, m) 15 1,93 (2H, m).

25

Optisk rotation [a]D » -2,7° [c=0,24, 1 molær phosphat-buffer, pH 7,01].

20 REFERENCEEKSEMPEL 10

Fremstilling af (-)-7Æ-amino-4a-methyl-l-azabicyclo- [4,2,0]oct-2-en-8-on-2-carboxylsyre: 25 10-1) Fremstilling af en suspension af brudte celler

En procedure mage til den i referenceeksempel 2-1) genta ges.

30 10-2) Fremstilling af en substratopløsning

En procedure mage til den i referenceeksempel 2-2) gentages med undtagelse af, at man anvender (+)-cis-70-phenyl-acetamino-4«-methyl-l-azabicyclo[4,2,0] oct-2-en-8-on-car-35 boxylsyre fremstillet som i DE offentliggørelsesskrift 47 DK 170255 B1 nr. 2911787.

10-3) Enzymreaktion 5 En procedure mage til den 1 referenceeksempel 2-3) gentages med undtagelse af, at man anvender den 1 10-1) og 10- 2) fremstillede suspension af brudte celler og substratopløsning. Omsætningsforholdet bliver stationært i løbet af en time. Reaktionen fortsættes i 120 minutter. Udbyt-10 tet er 50% (molforhold) af blandingen af optisk aktive forbindelser.

10-4) Isolering og rensning af den Ønskede forbindelse 15 En procedure næsten mage til den i referenceeksempel 2-4) gentages. Efter afslutningen af reaktionen fjernes cellerne fra reaktionsopløsningen ved centrifugering. Super-natanten påføres en søjle (2,5 cm bred, 46 cm høj) pakket med 220 ml "Diaion HP-10", Eluering udføres med ionbyttet 20 vand, og eluatet opsamles i fraktioner på 5 ml. Den Ønskede forbindelse elueres i fraktionerne 200 ml til. 270 ml. Fraktionerne inddampes under vakuum, lyofiliseres og opløses i en lille mængde vand og methanol (50:50). Opløsningen påføres en kolonne (1,6 cm bred, 64,5 cm høj) 25 pakket med 130 ml "Sephadex LH-20", og elueringen udføres med en blanding af vand og methanol (50:50). Eluatet opsamles i fraktioner på 5 ml. Fraktionerne 65 ml til 80 ml kombineres og inddampes til fjernelse af methanolet. Derpå lyofiliseres inddampningsresten til opnåelse af 30 30,5 mg af et hvidt pulver. Denne forbindelse egenskaber er som følger: cm-1 IR(KBr) * : 1800, 1770 (sh), 1760 (sh), 1740, max 1680, 1630 35 DK 170255 B1 48 NMR (100M D20-DSS) 6 : 6,16 (IH, d, J=5,l Hz) 4,52 (IH, d, J=4,9 Hz) 3,86 (IH, m) 2,64 (IH, m) 5 1,9 - 1,4 (2H, m) 1,10 (3H, d, J=7,3 Hz)

Det afsløres, at forbindelsen er et kaliumsalt med to molekyler vand. De ovenfor anførte egenskaber er i god 10 overensstemmelse med egenskaberne for den tilsvarende dl-forbindelse. Forbindelsen viser en nlnhydrln-posltlv enkelt plet ved Rf « 0,33 ved silicagel-tyndtlagskromato-grafl (man anvender samme silicagel som 1 referenceeksempel 2-4)). Rf-værdien stemmer overens med den for den op-15 tisk Inaktive dl-forblndelse.

15°

Optisk rotation [o]D » -30 °C [c=0,5, 1 molær phosphat- bufferopløsning). Værdien stammer godt overens med den, 15° der er angivet i referenceeksempel 11: [a] « -30° [c-0,5, i 1 molær phosphatbufferopløsning (pH 7,0)].

REFERENCEEKSEMPEL 11 25

Fremstilling af (-)-7i-amino-4o-methyl-l-azabicyclo- [4,2,0]oct-l-en-8-on-2-carboxylsyre (alternativ frem gangsmåde).

11-1) Fremstilling af suspension af brudte celler.

En procedure mage til den i referenceeksempel 10-1) gentages.

11-2) Fremstilling af en substratopløsning 35 DK 170255 Bl 49 100 mg (+)-cis-70-[(R)-2-phenyl-2~aminoacetamido]-4a-me-thyl-l-azabicyclo[4,2,0]oct-2-en-8-on-carboxylsyre fremstillet som i DE offentliggørelsesskrift nr. 2911787 opløses i 5 ml 1/30 molær phosphatbufferopløsning (pH 6,5).

5 11-3) Enzymreaktion

Som i referenceeksempel 2-3) sættes 5 ml af den ovenfor beskrevne suspension af brudte celler til 5 ml af sub-10 stratopløsningen, og enzymreaktionen udføres ved en temperatur på 30 °C i 24 timer.

11-1) Isolering og rensning af det ønskede produkt 15 En procedure mage til den i referenceeksempel 10-4) gentages til opnåelse af 55 mg af et hvidt pulver. Forbindelsens egenskaber stemmer godt overens med dem, der er angivet i referenceeksempel 10.

15° 20 Optisk rotation [α]β » -30° [c=0,5, i 1 molær phosphatbuf feropløsning (pH 7,0).

25 30 35

Claims

50 DK 170255 B1 Patentkrav : Analogifremgangsmåde til fremstilling af optisk aktive 5 cephalosporin-analoge med den almene formel: Η H X1-C-NH^‘. \ I irrir^ 4) (Ι-D 10 0 COOR3 med (6R,7S)-konfiguration, i c 2 3 hvori R betyder halogen, R betyder hydrogen eller en carboxylbeskyttende gruppe valgt blandt alkyl med 1-5 carbonatomer, alkoxymethyl med 1-5 carbonatomer, halogeneret alkyl med 1-5 carbonatomer, lavere alkylsulfonyl-ethyl, arylmethyl med 7-12 carbonatomer, substitueret arylmethyl med 7-20 carbonatomer indeholdende 1-5 substi-tuenter valgt blandt methoxy og nitro, trimethyl- eller triphenylsubstitueret silyl og grupper med formlen -CH0C0R4
25 L (II) RS 4 hvor R betyder lavere alkyl roed 1-6 carbonatomer, lavere . 5 alkoxy med 1-6 carbonatomer eller phenyl, og R betyder gg hydrogen eller lavere alkyl med 1-6 carbonatomer, og X1 betyder en af følgende to grupper: (1) (A1)--B-CH- I2 35 51 DK 170255 B1 hvor B betyder phenyl eller thiazolyl, A1 betyder ring- substltuenter valgt blandt hydrogen, hydroxy, alkoxy med 1-4 carbonatorner, halogen, nitro, amlno, aminomethyl, me- thylsulfonamido og acyloxy med 1-4 carbonatomer, n er et 2 5 helt tal fra 0 til 5, og A betyder amino, hydroxy, carboxyl eller sulfonsyre, eller (2) (A1)--B-0- 1 3 NOA 10 1 3 hvor B, A og n er som defineret ovenfor, og A betyder hydrogen, alkyl med 1-6 carbonatomer, alkenyl med 2-6 carbonatomer, alkynyl med 2-6 carbonatomer, cycloalkyl med 3-6 carbonatomer eller aryl, 15 eller farmaceutisk acceptable salte deraf, kendetegnet ved, (a) at en optisk aktiv cephalosporin-analog med formlen: 20 ? « » P-f'/ COOR 35 1 » DK 170255 B1 52 (1' ) < A1^)-B-CH- i2' hvor B og n er som defineret ovenfor, A betyder ring-3 substituenter valgt blandt hydrogen, hydroxy, beskyttet hydroxy, alkoxy med 1-4 carbonatomer, halogen, nitro, beskyttet amino, beskyttet aminomethyl, methylsulfonamido 2' og acyloxy med 1-4 carbonatomer, og A betyder beskyttet amino, hydroxy, beskyttet hydroxy, carboxyl, beskyttet *0 carboxyl, sulfonsyre eller beskyttet sulfonsyre, eller (2') (A1')--B—C— 1 3 N0A° 15 11 o hvor B, η, A og A er som defineret ovenfor, eller med et reaktivt derivat af carboxylsyren (VII), hvorpå eventuelle beskyttende grupper i X CO- fjernes, og 3 en dannet ester, hvori R er en af de ovennævnte carbo- 20 xylbeskyttende grupper, om Ønsket, omdannes til den til- 3 svarende frie syre (R « H), eller (b) at en optisk inaktiv forbindelse med formlen: 25 "^VQ
30 COOR3 35 53 DK 170255 B1 hvori hydrogenatomerne i 6- og 7-stillingen har cis-kon- 2 3 figuration, og R og R er som defineret ovenfor, acyleres med en carboxylsyre med formlen:
5 X3C00H (VIII) 3 hvori X betyder en gruppe med formlen: (A1*)--B-CH- n I 10 la· 1' 2' hvori B, η, A og A er som defineret ovenfor, eller med et reaktivt derivat af carboxylsyren (VIII), i c 3 hvorpå eventuelle beskyttende grupper i X CO- fjernes, og 3 en dannet ester, hvori R er en af de ovennævnte carb-oxylbeskyttende grupper, om ønsket, omdannes til den til- 3 svarende frie syre (R * H), hvorefter den opnåede di-astereomere blanding adskilles på konventionel måde til 20 opnåelse af optisk aktive cephalosporin-analoge med form- 2 3 1 len (1-1), hvori R og R er som defineret ovenfor, og.X er begrænset til gruppen med formlen (A1)--B—CH— 25 >2 PT 2 hvori B, n og A er som defineret ovenfor, 3Q hvorefter, om ønsket, en under (a) eller (b) dannet forbindelse overføres i et farmaceutisk acceptabelt salt deraf. 35