JP2004002420A - クラブラン酸の製法 - Google Patents
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Abstract
【課題】新規中間体およびそのクラブラン酸への変換過程における反応。
【解決手段】アルファ−アミノ酸基質が側鎖にアミノ、グアニジノまたはアミジノ基を有する式（ＩＩ）：
【化１】
［式中、Ｒ１は
【化２】
（式中、Ｒ２＝ＨまたはＣ１−６アルキルを意味する）
で示される化合物、アルファ−アミノ酸またはそのＮ−アシル誘導体のベータ−ヒドロキシル化法であって、該基質をカルバミン酸シンターゼと共にインキュベートすることでヒドロキシル化反応を実施することを特徴とする方法。
【選択図】なし
【解決手段】アルファ−アミノ酸基質が側鎖にアミノ、グアニジノまたはアミジノ基を有する式（ＩＩ）：
【化１】
［式中、Ｒ１は
【化２】
（式中、Ｒ２＝ＨまたはＣ１−６アルキルを意味する）
で示される化合物、アルファ−アミノ酸またはそのＮ−アシル誘導体のベータ−ヒドロキシル化法であって、該基質をカルバミン酸シンターゼと共にインキュベートすることでヒドロキシル化反応を実施することを特徴とする方法。
【選択図】なし
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、酵素反応による新規化合物の製法、特に適当な前駆体に対する酵素の作用によるβ−ラクタム類、特にクラブラン酸などのクラバム類の製法における該酵素反応に関する。
【０００２】
【従来の技術】
クラブラン酸はＺ−（２Ｒ，５Ｒ）−３−（β−ヒドロキシエチリデン）−７−オキソ−４−オキサ−１−アザビシクロ［３．２．０］ヘプタン−２−カルボン酸である。
クラブラン酸は、β−ラクタマーゼ反応性β−ラクタム抗生物質を劣化から防御するので、β−ラクタマーゼ酵素の有効な阻害剤であり、臨床的価値の高い化合物である。
イギリス特許明細書第１ ５０８ ９７７号は、クラブラン酸として知られるクラバム誘導体を記載し、これは、ストレプトミセス・クラブリゲルス
（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ）ＡＴＣＣ ２７０６４またはその高産生突然変異体により産生される化合物である。
抗生物質ＡＵＧＭＥＮＴＩＮ（登録商標）の基本成分である重要な生成物クラブラン酸の生合成経路は多くの研究の対象であった。ＥＰ Ａ ０ ２１３ ９１４において、クラブラン酸は前駆体のプロクラバミン酸（Ｆ）：
【化３】
に対する一連の酵素の作用により形成されることが報告されている。
【０００３】
【特許文献１】
英国特許第１５０８９７７号明細書
【特許文献２】
欧州特許出願公開第０２１３９１４号明細書
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
生合成経路における初期の工程は説明するのがより困難であり、正確な工程は未だ解明されていない。クラブラン酸の前駆体としてのアルギニンおよびオルニチンの活用を評価する試験法が、Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， １９８６， ５２（４）， ８９２−７に記載されている。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、今回、新規中間体およびそのクラブラン酸への変換過程を同定した。従って、本発明は、ストレプトミセス属、好ましくは、エス・クラブリゲルス（Ｓ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ）由来の酵素系を用い、Ｓ−アルギニン、式（Ｉ）：
【化４】
［式中、Ｒ１は
【化５】
（式中、Ｒ２＝ＨまたはＣ１−６アルキルを意味する）
で示される基を意味する］
で示される化合物、あるいは式（ＩＩ）：
【化６】
［式中、Ｒ１は
【化７】
（式中、Ｒ２＝ＨまたはＣ１−６アルキルを意味する）
で示される基を意味する］
で示される化合物、あるいは式（ＩＩＩ）：
【化８】
［式中、ＲはＨまたはＯＨ、
およびＲ１は
【化９】
（式中、Ｒ２＝ＨまたはＣ１−６アルキルを意味する）
で示される基を意味する］
で示される化合物のうちいずれか一の化合物からクラブラン酸および他のクラバム誘導体を製法する方法を提供する。
【０００６】
【発明の実施の形態】
「他のクラバム類」なる語により、７−オキソ−４−オキサ−１−アザビシクロ［３．２．０］ヘプタン核を含有する化合物を意味する［ジャーナル・オブ・ケミカル・ソサイエティ（Ｊ．Ｃ．Ｓ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９７９），２８２］。
したがって、本発明は、クラバム類、特にクラブラン酸の製造において有用な新規化合物を提供する。本発明によれば、式（Ｉ）：
【化１０】
［式中、Ｒ１は
【化１１】
（式中、Ｒ２＝ＨまたはＣ１−６アルキルを意味する）
で示される基を意味する］
で示される化合物が得られる。
【０００７】
本発明者らは、今回、化合物（Ｆ）の前駆体が、式（Ｃ）：
【化１２】
の化合物であることを見いだした。
【０００８】
従って、好ましい態様において、化合物（Ｃ）：トレオ−３−ヒドロキシ−５−グアニジノ−２−（２−オキソ−アゼチジン−１−イル）ペンタン酸、好ましくは（２Ｓ−３Ｒ）またはその誘導体が得られる。
化合物［Ｃ］は、ジェイ・イー・ミラーおよびジェイ・ジェイ・ビショフ
（Ｊ Ｅ ＭｉｌｌｅｒおよびＪ Ｊ Ｂｉｓｃｈｏｆｆ），シンセシス（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ），１９８６，７７７の方法または当該分野にて公知の関連した方法にしたがって、
【化１３】
を
【化１４】
と反応させることにより製造できる。
【０００９】
本発明によると、グアニジノ基を有する化合物から尿素を除去できる、アミジノヒドロラーゼ活性を有し、特に適当な条件下で（Ｃ）を（Ｆ）に変換できる酵素も提供される。
適当には、酵素系は、微生物、特にストレプトミセス属由来のものである。好ましくは、酵素は、以下に記載する実施例１に従って、ストレプトミセスから調製される。あるいは、酵素は、組み換え体源から調製してもよい。
酵素は、さらに他の基質、例えば、（２Ｓ）−５−グアニジノ−２−（２−オキソ−アゼチジン−１−イル）ペンタン酸（以下に定義する化合物Ｂ）と反応させた場合に、グアニジノ基をアミノ基に変換するのに有用である。
【００１０】
アミジノヒドロラーゼ活性を有する酵素（以下、アミジノヒドロラーゼという）は、ストレプトミセス属、特にストレプトミセス・クラブリゲルスから得られる。アミジノヒドロラーゼ酵素は、好ましくは精製された形態、有利には実質的に純粋な形態である。
本発明の別の態様において、エス・クラブリゲルス菌糸体を遠心分離および超音波処理に付し、続いてイオン交換クロマトグラフィによる分別により処理することによりアミジノヒドロラーゼを調製する方法が提供される。
本発明のさらに別の態様において、実質的に以下の配列番号１のアミノ酸配列を有するアミジノヒドロラーゼ活性を有する蛋白質が提供される。
【００１１】
配列番号１の配列は、アミジノヒドロラーゼをコードするＤＮＡの遺伝子配列から得られた。遺伝子は、エス・クラブリゲルスから得られるアミジノヒドロラーゼ酵素のＮ末端を配列決定し、ｐＢＲＯＣ４４として公知のベクター上にクローンされた、エス・クラブリゲルス染色体ＤＮＡの一部において見られるオープンリーディングフレームから予想される配列とその配列を適合させることにより同定する。ｐＢＲＯＣ４４の調製は、ＥＰ−Ａ−０３４９１２１の実施例６に記載されている。
【００１２】
さらなる態様において、本発明は、本質的にアミジノヒドロラーゼをコードする遺伝子からなるＤＮＡを提供する。本発明はまたこのようなＤＮＡ、好ましくは適当な宿主生物においてアミジノヒドロラーゼの発現のための発現ベクターからなるベクター（ｐＢＲＯＣ４４以外）を提供する。
ＤＮＡは「自然」の状態（自然界で起こるような）ではなく、単離または実質的に精製された形態であると考えられる。好ましくは、本発明のＤＮＡはエス・クラブリゲルス由来のものであるが、本発明は、他の適当な微生物、特に、好ましくは非常に厳密な条件下で、配列番号２またはアミジノヒドロラーゼ活性を有する酵素をコードするそのサブフラグメントのＤＮＡとハイブリダイゼーションするエス・クラブリゲルス以外のクラブラン酸産生微生物に由来するＤＮＡ配列も包含する。
【００１３】
本発明のＤＮＡおよびこれを含有するベクターは種々の工業的用途がある。これは前記ベクターで形質転換された宿主微生物およびこれが発現する酵素にも適用される。例えば、前記ＤＮＡを含有する組換えベクターは、適当な宿主中に形質転換された場合に、多量のクラブラン酸を合成する遺伝子工学的に修飾された微生物の産生において重要である。
好ましくは、ＤＮＡは、実質的に、以下の配列番号２に示す配列を有するかまたは変性してこの配列になるが、配列番号１のアミノ酸配列をコードする配列を有する。本発明はまた、アミジノヒドロラーゼ活性を有する酵素をコードする突然変異体または関連する配列にも及ぶ。
【００１４】
本発明に従って、式［Ｃ］の化合物またはその塩または保護された形態またはその類似体をアミジノヒドロラーゼ活性を有する酵素と接触させることにより、プロクラバミン酸を調製する方法が提供される。
【００１５】
本発明は、また、式（ＩＩ）：
【化１５】
［式中、Ｒ１は
【化１６】
（式中、Ｒ２＝ＨまたはＣ１−６アルキルを意味する）
で示される基を意味する］
で示される化合物を提供する。
【００１６】
好ましい態様において、（２Ｓ）−５−グアニジノ−２−（２−オキソアゼチジン−１−イル）ペンタン酸（Ｂ）である式（Ｂ）：
【化１７】
の化合物またはその誘導体が提供される。
【００１７】
式［Ｂ］の化合物は、ジェイ・イー・ミラーおよびジェイ・ジェイ・ビショフ（Ｊ Ｅ ＭｉｌｌｅｒおよびＪＪ Ｂｉｓｃｈｏｆｆ），シンセシス（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）１９８６，７７７の方法または当該分野において知られている関連法にしたがって、
【化１８】
を
【化１９】
と反応させることにより調製できる。
【００１８】
本発明にしたがって、式［Ｂ］の化合物またはその塩またはその保護された形態またはその類似体を、ヒドロキシル化活性を有する酵素、特にクラバミン酸シンターゼ活性を有する酵素と接触させることによりＣを製造する方法も提供される。好ましくは、酵素系は、微生物、特にストレプトミセス属由来のものである。別法として、酵素は組換え体源から産生できる。好ましくは、酵素はＥＰ−Ａ−２１３９１４に記載されるクラバミン酸シンターゼ（ＣＡＳ）である。本発明は、通常のクラブラン酸産生株のストレプトミセス・クラブリゲルスから調製されるＣＡＳ、ならびにＥＰ３４９１２１の方法に従って得ることができる、例えば、ＣＡＳ遺伝子を発現ベクター、特にベクターｐＢＲＯＣ４１３［ｐＴ７．７（テイバー・エスおよびリチャードソン・シー・シー（Ｔａｂｏｒ，Ｓ．＆Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｃ．Ｃ．）、（１９８５）プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）ＵＳＡ，８２，１０７４−１０７８）の非伝達性誘導体］内にクローンしたイー・コリから得られる「組換え」ＣＡＳの両方のクラバミン酸シンターゼに関する。
【００１９】
本発明にしたがって、また、式ＩＩＩ：
【化２０】
［式中、ＲはＨまたはＯＨ、および
Ｒ１は
【化２１】
（式中、Ｒ２＝ＨまたはＣ１−６アルキルを意味する）
で示される基を意味する］
で示される化合物が得られる。
【００２０】
好ましい態様において、Ｎ２−（２−カルボキシエチル）−（Ｓ）−アルギニンである化合物（Ａ）：
【化２２】
またはその誘導体、例えば活性化エステルが提供される。
【００２１】
化合物Ａは新規であり、本発明の別の態様である。
化合物Ａは以下の反応スキームにしたがって調製できる。
【化２３】
【００２２】
本発明のさらに別の態様において、Ａまたはその活性化誘導体、好ましくはエステルまたはＣｏＡチオエステルをストレプトミセス由来の酵素系、例えば全細胞または遊離酵素系と接触させることにより、Ｂを調製する方法が提供される。
【００２３】
好ましい態様において、Ｎ２−（２−カルボキシエチル）−３−ヒドロキシ−（Ｓ）−アルギニンである化合物（Ｇ）：
【化２４】
またはその誘導体、たとえば活性化エステルが提供される。
【００２４】
化合物Ｇは新規であり、本発明の別の態様である。
化合物Ｇは以下の反応スキームにしたがって調製できる。
【化２５】
Ｒ３、Ｒ４は保護基であり、Ｒ５＝保護基またはＨである。
【化２６】
Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８は保護基であり、Ｒ９＝保護基またはＨである。
【００２５】
Ｘ型の化合物の調製は、ケイ・エイチ・バガレイ、エス・ダブリュー・エルソン、エヌ・エイチ・ニコルソンおよびジェイ・ティー・サイム（Ｋ．Ｈ．Ｂａｇｇａｌｅｙ，Ｓ．Ｗ．Ｅｌｓｏｎ，Ｎ．Ｈ．ＮｉｃｈｏｌｓｏｎおよびＪ．Ｔ．Ｓｉｍｅ），ジャーナル・オブ・ケミカル・ソサイエティー（Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ Ｉ）１９９０，１５２１に記載されている。
【００２６】
本発明のさらに別の態様において、ＤをＣＡＳと共に培養することからなるプロクラバミン酸（Ｆ）の製法が提供される。
【化２７】
Ｄは（２Ｓ）−５−アミノ−２−（２−オキソ−アゼチジン−１−イル）ペンタン酸である［ジャーナル・オブ・ケミカル・ソサイエティー（Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．Ｉ）１９９０，１５２１］。
【００２７】
本発明のさらに別の態様において、ＤをＣＡＳと共に培養することからなる（Ｅ）の製法が提供される。
【化２８】
Ｅは（２Ｓ）−（５−アミノ−２−（２−オキソ−アゼチジン−１−イル）ペント−２−エン酸であり、これは本発明の別の態様である。
【００２８】
Ａ、Ｂ、ＣおよびＧまたはその保護された形態およびその塩の有用性は、以下に記載するようなクラブラン酸の調製法における中間体として作用する能力に存する。
好ましい態様において、本発明はまた、ストレプトミセス属、好ましくは、エス・クラブリゲルス由来の酵素系を用い、Ｓ−アルギニン、Ａ、Ｂ、ＣまたはＧのいずれかからのクラブラン酸および他のクラバム誘導体の製法を提供する。
【００２９】
さらに別の態様において、本発明は、式（ＩＩ）の化合物、好ましくは、前記した化合物Ｂならびにアルファアミノ酸またはそのＮ−アシル誘導体（ここに、アルファアミノ酸基質は側鎖に塩基性基を有する）のベータ−ヒドロキシル化法であって、ヒドロキシル化反応が、基質をＣＡＳと共に培養することにより行われることを特徴とする方法を提供する。適当には、反応を、必要な補助因子Ｆｅ２＋および酸素および補助基質α−ケトグルタレートと共に実施する。適当な塩基性基は、アミノ、グアニジノおよびアミジノを包含する。
【００３０】
個々の基質は、Ｎ２−アシルアルギニン誘導体、例えば、Ｎ２−アセチルアルギニンおよびＮ２−アシルオルニチン誘導体、例えば、Ｎ２−アセチルオルニチンを包含する。
本発明の化合物は、双性イオン形態または塩形態、例えばナトリウム塩などの金属塩、酸付加塩、アンモニウム塩または置換アンモニウム塩、例えば第三アミン塩の形態であってもよい。
【００３１】
酸付加塩は、末端アミノ基で形成され、例えば塩酸、臭化水素酸、オルトリン酸または硫酸などの無機酸、あるいは例えばメタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、酢酸、プロピオン酸、乳酸、クエン酸、フマル酸、リンゴ酸、コハク酸、サリチル酸またはアセチルサリチル酸などの有機酸との塩であってもよい。
金属塩は、カルボキシル基で形成され、例えば、アルミニウム塩およびアルカリ金属塩およびアルカリ土類金属塩、例えばリチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウムおよびマグネシウム塩であってもよい。
【００３２】
置換アンモニウム塩は、例えば、トリエチルアミンなどのＣ１−６アルキルアミン、２−ヒドロキシエチルアミン、ビス−（２−ヒドロキシエチル）アミンまたはトリ（２−ヒドロキシエチル）アミンなどのヒドロキシ（Ｃ１−６）アルキルアミン、ビシクロヘキシルアミンなどのシクロアルキルアミン、または、プロカインとの塩、ジベンジルピペリジン、Ｎ−ベンジル−β−フェネチルアミン、デヒドロアビエチルアミン、Ｎ，Ｎ’−ビスデヒドロアビエチルアミン、グルカミン、Ｎ−メチルグルカミンまたは例えばピリジン、コリジンまたはキノリンなどのピリジンタイプの塩基との塩であってもよい。
【００３３】
本発明の化合物は、１またはそれ以上の存在する官能基が保護された形態である化合物にも及ぶ。従って、適当な場合には、カルボキシ基を保護するか、グアニジノ、ヒドロキシまたはアミノ基を保護するか、またはカルボキシおよびグアニジノ、ヒドロキシまたはアミノ基の両方を保護してもよい。本明細書に記載する化合物のこのような保護された形態はすべて「保護された形態」という語に包含される。加えて、本明細書に記載の化合物に適用した場合、「保護された形態」なる語は、「マスクした」中間体も包含し、該中間体は、ある官能基を他のものに変換できることが公知の化学的プロセス（ここに、分子の残りの部分は、実質的に影響を受けないままである）により最終化合物に変換できる。例えば、好ましいマスクされた形態のアミンは、還元により所望のアミンに変換できる対応するアジドおよびシアノ類似体を包含する。（対応するシアノ化合物は、側鎖に１個少ない炭素原子を有し、シアノ基の炭素原子を除外したものである。）
【００３４】
適当なエステル形成カルボキシル保護基は、所望により置換されていてもよいＣ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、Ｃ３−７シクロアルキル、アリール、アリールＣ１−６アルキルおよびトリＣ１−６アルキルシリル基を包含する。
【００３５】
本明細書において用いる場合、「アリール」なる語は、フェニルおよびナフチルを含み、各々、所望により５個までのフッ素、塩素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、ハロ（Ｃ１−６）アルキル、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシ、Ｃ１−６アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、Ｃ１−６アルコキシカルボニル（Ｃ１−６）アルキル、ニトロ、アリールオキシカルボニルオキシ、アリールＣ１−６アルキルオキシカルボニルオキシ、Ｃ１−６アルキルオキシカルボニルオキシ、Ｃ１−６アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アリールＣ１−６アルキルカルボニルオキシまたはアリールＣ１−６アルキルオキシカルボニル基で置換されていてもよい。
【００３６】
「ハロゲン」なる語は、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素を意味する。ハロおよびハライドなる語も、それに応じて解釈されるべきである。
本明細書において記載する所望により置換されていてもよい保護基の任意の置換基の例は、ハロゲン、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルチオ、シアノ、ニトロ、カルボキシ、カルボン酸、Ｃ１−６アルキルエステル、カルバモイル、アミノ、モノ（Ｃ１−６）アルキルアミノおよびジ（Ｃ１−６）アルキルアミノから選択される３個までの基（同一または異なっていてもよい）を包含する。
【００３７】
特に適当なエステル形成カルボキシル保護基は、通常の条件下で除去できるものである。このような基は、メチルおよびエチルなどのＣ１−６アルキル、ベンジル、ｐ−メトキシベンジル、ベンゾイルメチル、ｐ−ニトロベンジル、４−ピリジルメチル、２，２，２−トリクロロエチル、２，２，２−トリブロモエチル、ｔ−ブチル、ｔ−アミル、アリル、ジフェニルメチル、トリフェニルメチル、アダマンチル、２−ベンジルオキシフェニル、４−メチルチオフェニル、テトラヒドロフル−２−イル、テトラヒドロピラン−２−イル、ペンタクロロフェニル、アセトニル、ｐ−トルエンスルホニルエチル、メトキシメチル、またはシリル、スズまたはリン含有基を包含する。
【００３８】
カルボキシル基は、特定のエステル基に適切な通常の方法により、前記エステルのいずれから再生してもよい。例えば、分子の残りの部分が実質的に影響を受けない条件下での酸および塩基触媒加水分解、または酵素触媒加水分解、または水添分解による。
本発明の化合物またはその塩またはアミノ保護誘導体における好ましいカルボキシル保護基はベンジルである。
【００３９】
アミノ基に関して適当な保護基は、容易に開裂するものである。アミノ基を保護する方法および得られた保護誘導体の開裂法の考察は、例えば、「有機合成における保護基」（”Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”）（ティー・ダブリュ・グリーンおよびピー・ジー・エム・ワッツ（Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ ＰＧＭ Ｗｕｔｓ）（ウィリー−インターサイエンス（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ），ニューヨーク，１９９１）に記載されている。
【００４０】
アミノ保護基の適当な例は、前記したマスキング基；所望により置換されていてもよいＣ１−６アルキルカルボニル；アリールカルボニル、アリールＣ１−６アルキルカルボニル；（ヘテロサイクリル）カルボニル（ここに、ヘテロサイクリル基は、酸素、窒素および硫黄から選択される４個までのヘテロ原子を含む５または６員芳香族環である）；またはフェニル環がＣ１−４アルキル、Ｃ１−４アルコキシ、トリフルオロメチル、ハロゲンまたはニトロから選択される１または２個の置換基で所望により置換されていていてもよいベンジルオキシカルボニルなどのカルバメートを与える基；Ｃ１−４アルキルオキシカルボニル、例えば、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル；またはＣ１−４アルコキシ、ハロまたはニトロから選択される３個までの置換基でアルキル基が所望により置換されていていてもよいＣ１−４アルキルオキシカルボニル、例えば、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニルまたは１−クロロエトキシカルボニルがある。
【００４１】
本発明の化合物中に存在するアミノ基の好ましいＮ−保護基の例は、後記するようなペプチド化学のアミノ保護に関して通常公知のものを包含する。
本発明の化合物またはその塩またはそのカルボキシ保護誘導体における特に好ましいアミノ保護基はベンジルオキシカルボニルである。
適当なグアニジノおよびアミジノ保護基は、ニトロ、ベンジルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、トルエンスルホニル、および２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニルを包含する。
【００４２】
望ましくは、化合物は核酸物質を含まない単離された形態である。化合物は、適当には、例えば実質的に純粋であり、より適当には、少なくとも７５％の純度、好ましくは少なくとも８５％の純度、例えば９０〜１００％の純度であるのが好ましい。好ましい単離形態の一例としては、固体形態であり、より好ましくは結晶形態である。しかし、純粋でない形態の化合物を使用してはいけないわけではない。
【００４３】
本発明の化合物を有機溶媒から結晶化または再結晶させる場合、結晶化溶媒が結晶生成物中に存在する場合がある。本発明は、このような溶媒和物も包含する。同様に、本発明の化合物は水を含有する溶媒から結晶化または再結晶してもよい。このような場合、水和水が形成される。本発明は、化学量論的水和物ならびに凍結乾燥などのプロセスにより生じる種々の量の水を含有する化合物も包含する。
【００４４】
本発明に含まれる化合物またはその塩またはその保護形態は以下のものを包含する：
（Ａ）Ｎ２−（２−カルボキシエチル）−Ｓ−アルギニン
（Ｂ）（２Ｓ）−５−グアニジノ−２−（２−オキソ−アゼチジン−１−イル）ペンタン酸
（Ｃ）トレオ−３−ヒドロキシ−５−グアニジノ−２−（２−オキソ−アゼチジン−１−イル）ペンタン酸、好ましくは２Ｓ−３Ｒ
（Ｅ）（２Ｓ）−５−アミノ−２−（２−オキソ−アゼチジン−１−イル）ペント−２−エン酸
（Ｇ）Ｎ２−（２−カルボキシエチル）−３−ヒドロキシ−アルギニン
【００４５】
本明細書において用いる「酵素系」なる語は、１個の酵素または１連の酵素を意味する。系は、適当ならば補助基質および補助因子を含むのが適当である。
不整炭素原子を有する化合物は、立体異性体として存在する。本発明は、本発明の化合物のすべての立体異性体を包含し、他の異性体を含まないかまたは他の異性体と任意の割合で混合されたもののいずれであっても、その使用を包含し、従って、例えばエナンチオマーのラセミ混合物を包含する。本発明の化合物またはその塩の溶媒和物、特に水和物も本発明の範囲に含まれる。
【００４６】
本発明の方法は、適当には、例えば、無細胞系、即ち、生きた細胞の非存在下で行うのが適当である。好ましくは、採用される酵素系は、微生物、特にストレプトミセス属由来のものである。別法として、酵素は遺伝子工学により製造してもよい。
無細胞系を採用した場合、無細胞抽出物は好ましくは、超音波処理または他の微生物の破壊により製造され、所望によりその後細胞片を除去し、溶液中に酵素系を残してもよい。
【００４７】
プロクラバミン酸（Ｆ）またはその塩を産生する酵素系は、例えばアミジノヒドロラーゼ酵素を含むのが適当である。
酵素は、本明細書に記載した実施例にしたがって調製するのが適当である。
【００４８】
基質に加えて、酵素反応混合物は、１またはそれ以上の他の補助因子を含有してもよい。通常、これらの補助因子は、別のマンガンイオン（Ｍｎ２＋）源を含む。
好ましい酵素源は、ストレプトミセス属、例えば、エス・クラブリゲルス
（Ｓ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ）、エス・ジュモンジネンシス（Ｓ．ｊｕｍｏｎｊｉｎｅｎｓｉｓ）、エス・カツスラハマヌス（Ｓ．ｋａｔｕｓｕｒａｈａｍａｎｕｓ）およびエス・リプマニイ（Ｓ．ｌｉｐｍａｎｉｉ）由来の株である。特に、以下の微生物の株が有用である：エス・クラブリゲルス ＡＴＣＣ２７０６４、エス・ジュモンジネンシス ＡＴＣＣ２９８６４、エス・カツラハマヌス Ｔ−２７２およびエス・リプマニイＮＲＲＬ３５８４。
【００４９】
好ましい酵素は、エス・クラブリゲルスＡＴＣＣ２７０６４由来のものである。
酵素は、通常の方法、特に適当な液体または半固体培地中、好気性条件下で微生物を培養することにより調製される。一般に、微生物が同化できる炭素および窒素源および微生物の成長に必須の無機塩栄養素が培養培地中に含まれる。
培地は、金属イオン、例えば鉄イオン源を含む。培養条件は、１０℃〜８０℃の温度、３〜１０の範囲のｐＨである。好ましい条件は、２０℃〜３０℃、ｐＨ５〜９、適当には例えば、約ｐＨ７で０．５〜５日間である。
【００５０】
酵素は、破壊細胞調製物からの濾液または粗細胞ホモジネートなどの不純な状態で得られた場合、精製された形態、部分的に精製された形態で単離され、用いられる。
最適には、酵素は、例えば少なくとも部分的に精製され、前駆体の分解を触媒する他の酵素、酵素、またはクラバム核を除去したものである。酵素は、不溶性ポリマー支持体に付着していてもよい。
【００５１】
本発明のプロセスは、一般に水性培地中で行われ、反応混合物はｐＨ４〜９の範囲に維持されるのが適当であり、より適当には、例えば６．５〜９．０、好ましくは約ｐＨ８．５に維持する。ｐＨは例えば緩衝液、例えば、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ７）を用いて調節するのが適当である。また、ｐＨは適当な酸または塩基を添加することにより調節してもよい。反応温度は、用いた酵素に適したものであり、一般に１５℃〜６０℃、好ましくは約３０℃である。反応時間は反応物の濃度などの因子および補助因子、温度およびｐＨに依存する。
【００５２】
化合物またはその塩は、例えば、酵素と混合する前に緩衝液中に溶解するのが適当である。前駆体溶液の濃度は、前駆体の溶解度に依存し、一般に前駆体溶液の濃度は、５％ｗ／ｖ〜０．００１％ｗ／ｖの範囲である。反応終了後、酵素を反応混合物から分離し、化合物またはその塩を通常の方法により単離する。化合物またはその塩の初期精製はクロマトグラフィー工程を含むのが好都合である。存在するカルボキシルおよび／またはアミノ基が保護された形態で化合物を単離し、所望により、保護基を続いて除去して、純粋な形態の化合物を得る。
【００５３】
無細胞系を採用する代わりに、本発明のプロセスは、完全な微生物を用いて行う。前駆体化合物またはその塩を次に微生物と接触させ、化合物またはその塩を得る。微生物は、増殖培養物、静止培養物、洗浄菌糸体、固定化細胞またはプロトプラストの形態であってもよい。
本発明の化合物は、酵素合成、例えば無細胞合成またはストレプトミセス属の適当な株、例えば、エス・クラブリゲルス、エス・ジュモンジネンシス、エス・カツラハマヌスまたはエス・リプマニイからの単離により調製してもよい。適当には、化合物の単離は、菌糸体の破壊、細胞内容物からの化合物の単離が含まれる。典型的には、化合物の精製された形態での単離は、クロマトグラフィー工程を含む。別法として、化合物は不純な形態または部分的に純粋な形態で用いてもよい。
【００５４】
化合物の塩は、出発物質の塩を用いるか、または調製した遊離化合物を続いて塩に変換する前記方法により調製してもよい。また、所望により、調製した化合物の塩を遊離の塩形態にしていない化合物または化合物の他の塩の形態に変換もよい。
化合物の塩は、例えば、化合物を適当な酸または塩基で処理することにより製造される。前記プロセスにより製造された化合物およびその塩は、通常の方法により回収される。
【００５５】
２個のキラル中心を有する化合物を、所望により、例えば適当な溶媒、例えばメタノールまたは酢酸エチルまたはその混合物からの分別結晶化によりエナンチオマーのジアステレオアイソマー対に分離する。１対のエナンチオマーまたは他のエナンチオマー対を通常の手段、例えば、光学活性な塩を分割剤として用いるかまたは、例えばサブチリシンなどの適当な酵素を用いた保護基の立体選択的除去により個々の立体異性体に分離してもよい。化合物のジアステレオアイソマーの混合物において、ジアステレオアイソマーの割合は、非求核塩基、例えば、１，５−ジアザビシクロ［４．３．０］ノン−５−エンでの処理により変わる。
【００５６】
分割剤として用いられる適当な光学活性な化合物は「トピックス・イン・ステレオケミストリー」（’Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ’，Ｖｏｌ．６，ウィリー−インターサイエンス（Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ），１９７１，アリンジャー・エヌ・エルおよびエリエール・ダブリュ・エル（Ａｌｌｉｎｇｅｒ，Ｎ．Ｌ．およびＥｌｉｅｌ，Ｗ．Ｌ．）編）に記載されている。
また、化合物のいずれのエナンチオマーも立体配置が既知の光学的に純粋な出発物質を用いた立体特異的合成により得られる。
【００５７】
本発明は、またクラブラン酸の合成において用いる化合物またはその塩も含む。
本発明のさらに別の態様において、クラブラン酸またはその塩の調製法が提供され、該方法は、本発明の化合物またはその塩を酵素系で処理することからなる。本発明により、このような方法により調製されたクラブラン酸またはその塩も提供される。
好ましくは、採用した酵素系は、微生物、特にストレプトミセス属由来のものである。適当には、プロセスを無細胞系で行う。適当には、クラブラン酸の無細胞合成法は、化合物またはその塩をストレプトミセス属の抽出物で処理することからなる。
【００５８】
ストレプトミセス属がクラブラン酸産生種であるのが適当である。
ストレプトミセス属からの抽出物は、酵素系を含む。無細胞抽出物は、好ましくは、ストレプトミセス細胞の超音波処理または他の破壊により得られ、所望によりその後、細胞片を除去し、溶液または懸濁液中に酵素系を残してもよい。酵素系は、いずれかの源由来のものである。例えば、酵素は、遺伝子工学により産生されるのが適当である。好ましい酵素系は、ストレプトミセスのクラブラン酸産生種、例えば、エス・クラブリゲヌス、エス．ジュモンジネンシスおよびエス・カツラハマヌスのクラブラン酸産生種またはこれに由来の株、例えば突然変異株由来のものである。特に、これらの微生物の以下の株が適当である：エス・クラブリゲルスＡＴＣＣ２７０６４、エス．ジュモンジネンシスＡＴＣＣ２９８６４およびエス・カツラハマヌスＴ−２７２。
【００５９】
無細胞系を用いる代わりに、前記プロセスは、完全な微生物を用いて行ってもよい。前駆体化合物またはその塩を次に微生物と接触させ、クラブラン酸またはその塩を得る。微生物は、増殖培養物、静止培養物、洗浄菌糸体、固定化細胞またはプロトプラストの形態であってもよい。
酵素系は、微生物を通常の方法、特に適当な液体または半固体培地中で好気性条件下で培養することにより調製する。一般に、微生物が同化できる炭素および窒素源および微生物の成長を促進するために用いられる無機塩栄養素が培養培地中に含まれる。培養条件は、１０℃〜８０℃の温度、３〜１０の範囲のｐＨである。好ましい条件は、２０℃〜３０℃、ｐＨ５〜９、適当には例えば、約ｐＨ７で０．５〜５日間である。酵素系を単離し、破壊細胞調製物からの濾液または粗細胞ホモジネートとして不純な状態で得られた場合、精製された形態、部分的に精製された形態で用いる。
【００６０】
最適には、酵素系は、少なくとも部分的に精製され、前駆体、酵素または反応生成物の分解を触媒する他の酵素を除去したものである。酵素を不溶性支持体に付着させてもよい。
プロセスは、一般に水性培地中で行われ、反応混合物はｐＨ４〜９の範囲に維持されるのが適当であり、より適当には、例えば６．５〜８．５に維持する。ｐＨは、適当には、当該分野にて知られている通常の緩衝液を用いて調節される。一例として、例えば、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ７）を用いる。反応温度は、用いた酵素に適したものであり、一般に１５℃〜４０℃、好ましくは約３０℃である。反応時間は反応物の濃度、温度およびｐＨなどの因子および補助因子に依存する。
【００６１】
化合物またはその塩は、例えば、酵素系と混合する前に緩衝液中に溶解するのが適当である。濃度は、化合物またはその塩の溶解度に依存する。適当には、化合物またはその塩の溶液の濃度は、５％ｗ／ｖ〜０．００１％ｗ／ｖの範囲である。反応終了後、酵素を反応混合物から分離し、クラブラン酸またはその塩を通常の方法により単離する。クラブラン酸またはその塩の初期精製はクロマトグラフィー工程を含むのが好都合である。
本発明の他の具体例において、化合物またはその塩を前記の酵素系で処理することによりクラブラン酸またはその塩に変換する方法が提供される。反応は、化合物またはその塩の中間体を単離せずに、無細胞合成により行うのが適当である。あるいは、化合物のクラブラン酸への変換は、直接完全な微生物を用いて行う。
以下の実施例は、本発明を例示するものである。すべてのパーセンテージは、重量基準であり、すべての割合は、容積基準である。
【００６２】
【実施例】
実施例−新規化合物の調製
化合物Ａ
Ｎ２−（２−カルボキシエチル）アルギニン二塩酸塩
調製例１
５−グアニジノ−２−（２−オキソアゼチジン−１−イル）ペンタン酸（４６ｍｇ、０．１８ミリモル）を１Ｍ ＨＣｌ（５ｍｌ）に溶解し、室温で１時間撹拌する。反応混合物を蒸発乾固させ、水と共沸し、乾燥して、潮解性白色固体のＮ２−（２−カルボキシエチル）アルギニン二塩酸塩を得る。
（Ｃ９Ｈ１８Ｎ４Ｏ４・２ＨＣｌ・Ｈ２Ｏとして、測定値：Ｃ＝３１．６９；Ｈ＝６．５７；Ｎ＝１７．０８；計算値：Ｃ＝３２．０５、Ｈ＝６．５８、Ｎ＝１６．６２％）；ｍ／ｅ（ＦＡＢ、グリセロール）ＭＨ＋ ２４７（Ｃ９Ｈ１８Ｎ４Ｏ４として）計算値２４７；νｍａｘ（ＫＢｒ）３４１０、２９２５、１７２５および１６６１ｃｍ−１；δＨ（２５０ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）１．５５〜１．８３（２Ｈ，ｍ）、１．８５〜２．１５（２Ｈ，ｍ）（３−Ｈ，４−Ｈ）、２．８５（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，２’−Ｈ）、３．２３（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）、３．３４（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ）（５−Ｈ，１’−Ｈ）、３．９３（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２−Ｈ）
【００６３】
調製例２
ａ）Ｎ２−（２−カルボメトキシエチル）−Ｎω−ニトロ−Ｓ−アルギニンベンジルエステルの調製
Ｎω−ニトロ−Ｓ−アルギニンベンジルエステルジトシレート（６．５６ｇ、０．０１モル）（エイチ・オーツカ（Ｈ．Ｏｔｓａｋａ）ら、ビュレティン・オブ・ケミカル・ソサイエティ・ジャパン（Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊａｐ．）３９，８８２，１９６６と同様にして調製）、トリエチルアミン（１３．９ｍｌ、０．１モル）およびアクリル酸メチル（９ｇ、０．１０５モル）のエタノール（１００ｍｌ）中混合物を室温で４日間撹拌する。溶媒を真空下に除去し、残渣をクロロホルム中に溶解し、水で洗浄する。クロロホルム溶液を乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濾過し、蒸発させてガム状物質を得る（８．９ｇ）。この物質を、５％ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３を溶離剤として用いてシリカゲル上クロマトグラフィーに付し、再び５〜１０％ｎ−ＰｒＯＨ／ＣＨＣｌ３で溶出して、標記化合物を得る（２．２４ｇ、６０％）。νｍａｘ（ＫＢｒ）３３１０、１７３８、１６３０、１６００および１２６５ｃｍ−１；δＨ（２５０ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）１．３〜１．９（５Ｈ，ｍ）、２．３（２Ｈ，ｍ）、２．７〜２．８５（１Ｈ，ｍ）、２．８５〜３．０（１Ｈ，ｍ）、３．２〜３．４（３Ｈ，ｍ）、３．６９（３Ｈ，ｓ）、５．１７（２Ｈ，ｓ）、７．３６（５Ｈ，ｍ）、７．６（２Ｈ，ｓ）、８．７５（１Ｈ，ｓ）；ｍ／ｚ（ＮＨ３ Ｃ．Ｉ．）（測定値ＭＨ＋ ３９６ Ｃ１７Ｈ２５Ｎ５Ｏ６としての計算値３９６）
【００６４】
ｂ）Ｎ２−（２−カルボキシエチル）−Ｓ−アルギニン（化合物Ａ）の調製
前記メチルベンジルエステル（前記（ａ）において調製）（２．２ｇ、５．５６ミリモル）、水酸化ナトリウム（０．４５ｇ、１１ミリモル）のＴＨＦ／Ｈ２Ｏ（１：１（２０ｍｌ））中溶液を室温で４時間撹拌する。溶液のｐＨを希ＨＣｌで６にし、溶媒を蒸発させ、その残渣をＨ２Ｏ／ＭｅＯＨ／ＡｃＯＨ（２５ｍｌ：２５ｍｌ；５ｍｌ）中に溶解し、１０％Ｐｄ／Ｃ（５００ｍｇ）上で水素添加する。触媒を濾過により除去し、溶液を蒸発乾固し、残渣を水中に溶解し、凍結乾燥する。メタノールを残渣に添加して、白色固体の標記化合物Ａを得る（６２６．４ｍｇ、４５％）。融点２６０℃分解。
（Ｃ９Ｈ１８Ｎ４Ｏ４・１／２Ｈ２Ｏとして、測定値：Ｃ＝４２．３３、Ｈ＝７．３５、Ｎ＝２０．６；計算値：Ｃ＝４２．３５、Ｈ＝７．５、Ｎ＝２１．９５％；νｍａｘ（ＫＢｒ）２９３９、１６２４、１４０１ｃｍ−１；δＨ（２５０ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）１．３〜１．７５（２Ｈ，ｍ）、１．８〜２．２（２Ｈ，ｍ）、２．５４（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ）、３．１３〜３．２８（４Ｈ，ｍ）、３．６３（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．１Ｈｚ）；ｍ／ｚ（ＦＡＢ、チオグリセロール）測定値：ＭＨ＋２４７、Ｃ９Ｈ１８Ｎ４Ｏ４としての計算値２４７。
【００６５】
化合物Ｂ
５−グアニジノ−２−（２−オキソアゼチジン−２−イル）ペンタン酸
５−アミノ−２−（２−オキソアゼチジン−１−イル）ペンタン酸（３１０ｍｇ、１．５９ミリモル）を水（３０ｍｌ）中に溶解し、炭酸カリウム（２４０ｍｇ、１．７４ミリモル）およびアミノイミノ−メタンスルホン酸（２６９ｍｇ、２．１７ミリモル）で処理し、室温で６時間撹拌する。反応混合物を蒸発乾固させ、水（４．５ｍｌ）中に溶解し、これにエタノール（３０ｍｌ）を添加し、溶液を素早く１５％水性エタノール中シリカ６０のカラム上クロマトグラフィーに付し、５−グアニジノ−２−（２−オキソアゼチジン−１−イル）ペンタン酸（２２０ｍｇ、５４％）を得る。
（Ｃ９Ｈ１６Ｎ４Ｏ３・１．５Ｈ２Ｏとして、測定値：Ｃ＝４２．５６、Ｈ＝７．５２、Ｎ＝２２．１５；計算値：Ｃ＝４２．３４、Ｈ＝７．５０、Ｎ＝２１．９５％）；νｍａｘ（ＫＢｒ）３４２３、１７２０、１６５８、１６３７ｃｍ−１；δＨ（２５０ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）１．４５〜１．６３（２Ｈ，ｍ）、１．６３〜１．９４（２Ｈ，ｍ）（３−Ｈおよび４−Ｈ）、２．８０〜３．００（２Ｈ，ｍ，３’−Ｈ）、３．１７（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，５−Ｈ）、３．２６〜３．４６（２Ｈ，ｍ，４’−Ｈ）、４．０３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．１および９．５Ｈｚ，２−Ｈ）および５−アミノ−２−（２−オキソアゼチジン−１−イル）ペンタン酸（９０ｍｇ、２９％）を得る。
【００６６】
化合物Ｃ
３−ヒドロキシ−５−グアニジノ−２−（２−オキソアゼチジン−１−イル）ペンタン酸
プロクラバミン酸（８４．５ｍｇ、０．４２ミリモル）を、５−グアニジノ−２−（２−オキソアゼチジン−１−イル）ペンタン酸（化合物Ｂ）に関して前記したようにアミノイミノメタンスルホン酸で処理して、白色固体の３−ヒドロキシ−５−グアニジノ−２−（２−オキソアゼチジン−１−イル）ペンタン酸を得る（６２ｍｇ、５３％）（Ｃ９Ｈ１６Ｎ４Ｏ４・２Ｈ２Ｏとして、測定値：Ｃ＝３８．７６、Ｈ＝６．８３、Ｎ＝１９．５４；計算値：Ｃ＝３８．５７、Ｈ＝７．１９、Ｎ＝１９．９９％）；ｍ／ｅ（ＦＡＢ、チオグリセロール）ＭＨ＋２４５、Ｃ９Ｈ１６Ｎ４Ｏ４としての計算値２４５；νｍａｘ（ＫＢｒ）３３６３、１７１９、１６７３、１６００ｃｍ−１；δＨ（４００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）１．７３〜１．９３（２Ｈ，ｍ，４−Ｈ）、３．０７（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，３’−Ｈ）、３．４１（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，５−Ｈ）、３．４２〜３．６０（１Ｈ，ｍ）、３．６０〜３．６８（１Ｈ，ｍ）（４’−Ｈ）、４．１２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，２−Ｈ）、４．２２（１Ｈ，ｍ，３−Ｈ）。
【００６７】
（２ＳＲ，３ＲＳ）−１，２，３’−［１３Ｃ３］−［Ｎ２−（２−カルボキシエチル）−３−ヒドロキシ−５−グアニジノ−ペンタン酸の調製
（１３Ｃで標識したＧ）
不純な（２ＳＲ，３ＲＳ）−１，２，３’−［１３Ｃ３］−３−ヒドロキシ−５−グアニジノ−（２−オキソ−アゼチジン−１−イル）−ペンタン酸（２７０ｍｇ）を１Ｍ ＨＣｌ（５ｍｌ）中に溶解し、室温で２時間静置する。溶液を蒸発させ、水（１．５ｍｌ）中に溶解し、ダウエクス（Ｄｏｗｅｘ）５０Ｗｘ８イオン交換樹脂（Ｈ＋型）のカラム（３ｘ１．５ｃｍ）に付す。カラムを水（２０ｍｌ）で洗浄し、水酸化アンモニウム（０．４Ｍ）で溶出し、５ｍｌフラクションを集める。サカグチ反応に陽性を示すフラクションを冷却し、凍結乾燥して、吸湿性固体の標記化合物を得る（９９．２ｍｇ）。１３Ｃ３Ｃ６Ｈ１８Ｎ４Ｏ５・１．５Ｈ２Ｏとして、測定値：Ｃ＝３６．８６、Ｈ＝６．０４、Ｎ＝１９．８８％；計算値：Ｃ＝３７．３６、Ｈ＝７．３、Ｎ＝１９．３７％；δＨ（４００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）１．５〜１．９５（１Ｈ，ｍ）、１．９５〜２．１５（１Ｈ，ｍ）、２．６５（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．１Ｈｚ）、３．１〜３．２８（ｍ）、３．３〜３．４（ｍ）および３．４〜３．５（４Ｈ）、３．７２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．５および４．５Ｈｚ）、４．０（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ）；δＣ（１００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）６８．２９（ｄ，Ｊ＝５２Ｈｚ，Ｃ−２）、７２．５２（ｄ，Ｊ＝５２Ｈｚ，Ｃ−１）、１７９．６４（ｓ，Ｃ−２’）
【００６８】
実施例１
アミジノヒドロラーゼ酵素
１．１ アミジノヒドロラーゼ酵素の調製および反応
酵素の粗調製物を、エス・クラブリゲルスＡＴＣＣ２７０６４菌糸体（ＥＰ−Ａ−０３４９１２１参照）からの４８時間再単離物より、遠心分離および５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．０）中超音波処理に付して調製する。
酵素調製物による（Ｃ）から（Ｆ）の加水分解は、１当量の尿素の産生と定量的である。
酵素調製物を５０ｍＭトリス、５０μＭ ＭｎＣｌ２、２５０μｇ／ｍｌ化合物ＢまたはＣおよび５ｍＭアセトヒドロキサミン酸と一緒に培養する。アセトヒドロキサミン酸を加え、抽出物内のウレアーゼ活性を阻害する。混合物をｐＨ８．５、２８℃で１５分以上培養する。
【００６９】
反応を停止させ、産生された尿素を「シグマ（Ｓｉｇｍａ）」キット５３５Ｂを用いて測定する。２種の化合物ＣおよびＢを個々に酵素調製物と共に培養し（２８℃）、あるならばその喪失をｈｐｌｃによりモニターする。
誘導体ＣおよびＢを加水分解してそれぞれＦおよびＤにし、反応は酵素により媒介される。
Ｃの加水分解の速度は、ｈｐｌｃおよび、プロクラバミン酸（Ｆ）およびデヒドロキシプロクラバミン酸（Ｄ）の産生で測定するとＢよりも著しく速い（＞１００）。
ＣからＦへの加水分解は、１当量の尿素の産生と定量的である。Ｂの加水分解は完了しないが、尿素の産生は生成したＤの量と当量である。
【００７０】
条件を最適化する実験から以下のものが明らかになる：
ａ） 前記定義の式Ｃの化合物またはその塩を前記定義のプロクラバミン酸またはその塩に変換する能力；
ｂ） 酵素活性は、Ｍｎ２＋の存在下に向上し、最適のＭｎ２＋濃度は約５０μＭである；
ｃ） 緩衝液のｐＨプロフィルは燐酸およびホウ酸に基づく緩衝液がＴＲＩＳ、炭酸塩／炭酸水素塩またはグリシン緩衝液と比べた場合、酵素活性を阻害することを示す
ｄ） 緩衝液の塩基性がｐＨ９．０に向かって強くなるほど酵素活性は強くなると思われる。しかし、種々の緩衝液のｐＨでの化合物の安定性の研究により、化合物は、ｐＨ９．０以上で不安定になることがわかる。Ｃのプロクラバミン酸への酵素の最大変換率は、５０ｍＭ ＴＲＩＳ中ｐＨ８．５で起きる。
ｅ） 有機溶媒（例えば、メタノール、アセトニトリル）を添加して、酵素反応を停止することは、尿素またはｈｐｌｃ分析のいずれかと干渉する。したがって、サンプルをアセトン／ドライアイス（−７０℃）浴中に入れることにより反応を停止し、ただちに検定の直前まで−２０℃の冷凍庫に移す。
この酵素は、アルギニンを開裂しない（検出できる割合で）が、（２Ｓ）−５−グアニジノ−２−（２−オキソ−アゼチジン−１−イル）ペンタン酸を開裂することが判明した。
アルギナーゼ活性は、精製（以下の１．２）の間に、アミジノヒドロラーゼ活性から区別される。
【００７１】
１．２ アミジノヒドロラーゼ精製
実験
エス・クラブリゲルス細胞を標準的炭水化物培地中で成長させ、収穫し、以下の緩衝液中で超音波処理する：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−酢酸（Ｔｒｉｓ−Ａｃ）、５０μＭＭｎＣｌ２、１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、１ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）、ｐＨ８．０。前記緩衝液に対して透析した後、超音波処理物をイオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥ−セファロース・ファースト・フロー（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ）、ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））を用いて、０〜１Ｍ ＮａＣｌ勾配溶出で分別する。酵素尿素産生をシグマ尿素キット５３５Ｂを用い、ウレアーゼ活性を阻害するのに５ｍＭアセトヒドロキサミン酸を添加して評価する。各フラクションを各基質としてＳ−アルギニンおよび化合物Ｃで２回分析し、アルギナーゼおよびアミジノヒドロラーゼ活性を測定する。両活性は、約０．５Ｍ ＮａＣｌ（カラム頂上部）で溶出し、特異性活性は、各々、１．９倍および２．４倍に増加する。
この方法から得た活性フラクションを金属キレートアフィニティーカラムに付す前に５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ａｃ／０．５Ｍ ＮａＣｌ／ｐＨ８．０に対して透析する。これをＣｕＳＯ４７５％容量イミノ二酢酸−アガロース（シグマ）を用いて調製し、前記緩衝液中平衡化する。カラムを０〜２００ｍＭグリシン勾配で溶出し、鋭いアミジノヒドロラーゼ活性のピークを得る。このピークはアルギナーゼ活性も示すが、弱い。
【００７２】
活性フラクションをプールし、リシン−アガロースアフィニティーカラムにかける前にファーマシア（Ｐｈａａｒｍａｃｉａ）ＰＤ１０カラム上で脱塩する。リシンは、多くのアルギナーゼを阻害することが知られているので、有用なアフィニティーリガンドであることが予想される。しかし、アミジノヒドロラーゼ活性は、カラム処理により保持されない。（恐らく、カラムに強く結合するため、アガロース活性はこのカラム処理後に失われる）。洗浄フラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析およびリス−アガロースカラムからの溶出液は洗浄フラクション中３３ｋＤで強いバンドを示す。これは、もっともよく知られているアルギナーゼである。しかし、アミジノヒドロラーゼおよびアルギナーゼが同じ酵素であるかどうかを決定するためには、さらに精製することが必要である。
【００７３】
これは、ＨＰＬＣゲル濾過（ＴＳＫ Ｇ３０００ ＳＷ ＸＬカラム ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ａｃ／５０μＭ ＭｎＣｌ２ ｐＨ７．２、流速０．２ｍｌ／分）を用いて達成される。リシン−アガロースカラムからの洗浄フラクションを凍結乾燥し、カラムに注入する前に少量の緩衝液中に再懸濁する。フラクションを集め、アミジノヒドロラーゼおよびアルギナーゼ活性に関して分析する。アミジノヒドロラーゼ活性はすべて、１つのフラクション中に存在するが、アルギナーゼ活性はどのフラクションにおいても検出されず、６時間の反応後、アミジノヒドロラーゼフラクションは依然として検出可能なアルギナーゼ活性を示さない。
【００７４】
ゲル濾過カラムをタンパク標準を用いて使用前に校正し、測定値をもとのアミジノヒドロラーゼのＭｒにする。これを３５０＋／−５０ｋＤで計算する。これはＳＤＳ−ＰＡＧＥによるとサブユニットＭｒより約１０倍大きい。このことは、非変性タンパク質が複数の状態で存在することを示す。
フラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析から、アミジノヒドロラーゼを含有するフラクションは３３ｋＤで強いバンドを有することがわかる。
【００７５】
活性サンプルからのウェスタンブロットを標準的タンパク配列技術により配列決定する。得られた配列は以下のとおりである：
タンパク質配列：ＩＤＳＨＶＳＰＲＹＡＱＩＰＴＦＭ
ｐＢＲＯＣ４４（ＥＰ−Ａ−０３４９１２１参照）の配列決定から判明したオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の予想されるアミノ配列を、前記で得られたＮ−末端配列と比較すると、以下のとおりである：
遺伝子配列（予想されるアミノ酸配列）：ＭＥＲ／ＩＤＳＨＶＳＰＲＹＡＱＩＰＴＦＭ
配列を並べると、完全に一致する（１６／１６）。最初の３個のアミノ酸がもとのタンパク質の遺伝子配列に存在しないことは、翻訳後修飾が行われたことを示す。
【００７６】
実施例２
クラバミン酸シンターゼ
２．１ クラバミン酸シンターゼ精製
クラバミン酸シンターゼ（ＣＡＳ）をエス・クラブリゲルスからＥＰ Ａ０２１３９１４に記載された方法を用いて精製する。凍結乾燥した、部分的に精製した酵素（２５０ｍｇ）をＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，ウプサラ，スウェーデン）カラム（３０ｘ２．４ｃｍ）に付し、１００ｍｌの５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄し、５０から５００ｍＭの勾配のトリス緩衝液（ｐＨ７．０）で溶出する。ＣＡＳ陽性フラクションをプールし、固体硫酸アンモニウムで８０％飽和にする。懸濁液を氷上に１時間保持し、２４０００ｘｇで６０分間遠心分離する。沈殿を１ｍｌの５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．０）＋０．５ｍｌの３０％シュークロース溶液（同じ緩衝液で構成）中に再懸濁し、セファデクスＧ７５スーパーファイン（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラム（６３．５ｘ３．５ｃｍ）に付し、５０ｍＭトリス緩衝液で溶出する。ＣＡＳ陽性フラクションをプールし、固体硫酸アンモニウムで８０％飽和にし、得られた沈殿を遠心分離により除去し、−２０℃で貯蔵する。この段階でＣＡＳ酵素は、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動で調べた場合、分子量約４８０００ダルトンに相当する１つのバンドを生成する。等電点を等電点分画電気泳動法により測定するとｐＩ＝５．６５であった。
精製した酵素を以下の分析法を用いてＢからＣへの変換に関して分析する。
【００７７】
２．２ クラバミン酸シンターゼヒドロキシル化分析
すべての試薬は、特記しないかぎり、５０ｍＭトリス、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２および１０ｍＭ ＫＣｌからなり、５Ｍ ＨＣｌを添加してｐＨ７．５にする。１００ｍｌについて、トリス（０．６０６ｇ）、ＭｇＣｌ２（０．２０３ｇ）、ＫＣｌ（０．０７４ｇ）が必要である。可能ならば、酵素精製に用いたのと同じ緩衝液を用いる。以下の溶液が必要である：Ｈ２Ｏ中、補助因子ＦｅＳＯ４１０ｍＭ（２．７８ｍｇ／ｍｌ）；Ｈ２Ｏ中、Ｂ１００ｍＭ（２０ｍｇ／ｍｌ）；ジチオトレイトール（ＤＴＴ）１０ｍＭ（１．５ｍｇ／ｍｌ）および補助基質α−ケトグルタレート５０ｍＭ（二ナトリウム塩９．５ｍｇ／ｍｌ）。
【００７８】
前記溶液の混合物を調製し、得られた溶液の４０μｌを１．５ｍｌのエッペンドルフ管に移し、次に６０μｌのタンパク抽出物で処理して反応を開始する。反応物を周囲温度で５分間酸素の存在下で振盪せずに培養し、試験管の蓋を閉める。反応混合物を６０ｗ電子オーブン中で１５秒間パワー４でのフラッシュ加熱により急冷する。１〜２ｍｇ／ｍｌ以上のタンパク質濃度で沈殿が形成し、溶液が白濁する。サンプルをミクロ遠心分離器中で１３０００ｒｐｍで１０秒間回転させ、サンプルをドライアイス上で貯蔵する。２５マイクロリットルアリコートを、ＯＤＳカラム（２５０ｘ４．６ｍｍ、ミリＱ Ｈ２中１ｍｌ／分で平衡化、０．２ＡＵＦＳ、ラムダ＝２１８ｎｍ、１ｃｍ／分）上に注入する。生成物Ｃは約４．５分、基質Ｂは約８分で溶出する。
【００７９】
２．３ 化合物のＣＡＳおよび組換えＣＡＳとの培養
一般的方法
「ＣＡＳ」は通常のクラブラン酸産生株ストレプトミセス・クラブリゲルスから調製されるクラバミン酸シンターゼを意味し、「組換えＣＡＳ」は例えばＥＰ３４９１２１（ビーチャム・グループ・パブリック・リミテッド・カンパニー
（Ｂｅｅｃｈａｍ Ｇｒｏｕｐ ｐｌｃ））にしたがって調製されたクラバミン酸シンターゼを意味する。
【００８０】
反応生成物の単離が必要な場合、ＣＡＳ（または組換えＣＡＳ）を１０ｍＭ炭酸水素アンモニウム緩衝液＋１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＫＣｌおよび１ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）（ｐＨ７．５）中ＰＤ−１０またはＮＡＰ−５ Ｇ−２５セファデクスゲル濾過カラムのいずれかを用いて交換する。ＰＤ−１０カラムの場合、２ｍｌ酵素溶液を緩衝液で平衡化したカラムに付し、３．５ｍｌの緩衝液で溶出する。ＮＡＰ−５カラムの場合、０．５ｍｌの酵素をカラムに付し、１ｍｌの同じ緩衝液で溶出させる。
【００８１】
酵素溶液（１．２ｍｌ）を１０ｍｌガラスバイアル中２００μｌの１０ｍＭ硫酸鉄（ＩＩ）、２００μｌの１０ｍＭ ＤＴＴおよび２００μｌの５０ｍＭ α−ケトグルタレート（１０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ（ｐＨ７．５）で構成）と混合する。２００μｌの基質（特記しないかぎり、１０ｍｇ／ｍｌ水溶液）を添加することにより、反応を開始する。混合物を２７℃、２５０ｒｐｍでニュー・ブランズウィック・サイエンティフィック（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）Ｇ２４環境インキュベーター振盪器中で培養する。２０分後、さらに５０μｌアリコートのＤＴＴおよび硫酸鉄（ＩＩ）ストック溶液を添加する。合計４５分後、５ｍｌのアセトンを添加することにより反応を停止し、４℃で２５０００ｘｇで２分間（１４０００ｒｐｍ）ベックマンＪＡ−２０遠心分離ローターに付すことにより蛋白質を除去する。上清を次に１０ｍｌ洋ナシ型フラスコ中に移し、アセトンをロータリーエバポレーターで真空下に除去する。培養混合物を注意してドライアイス上に維持し、遠心分離後の操作間で起こりえる不安定な生成物の分解を避ける。残存する水性液体を４〜５滴の１％（ｖ／ｖ）水中水性ギ酸で約ｐＨ５．０に滴定し、少なくとも５時間凍結乾燥して水および残存する微量のアセトンを除去する。ＨＰＬＣにより生成物を単離する前に、粗混合物を５００ＭＨｚの１Ｈ ＮＭＲにより通常どおり分析する。以下の実験において、基質の変換の程度は、５００ＭＨｚの１Ｈ ＮＭＲスペクトルの適当なピークの積分にもとづく。収率は特に記載しないかぎり、精製された生成物に関する。
【００８２】
（２Ｓ ） −５−アミノ−２− （ ２−オキソアゼチジン−１−イル ） ペンタン酸
（Ｄ）の培養
化合物ＤをＣＡＳ（１．２ｍｇ、０．３４ ＩＵｍｇ−１）と共に前記の標準的方法にしたがって培養する。約７％のＥ−（２Ｓ）−５−アミノ−２−（２−オキソアゼチジン−１−イル）ペント−３，４−エノエート（Ｅ）への変換率が観察される（５００ＭＨｚの１Ｈ ＮＭＲスペクトルの積分により判定）。ＨＰＬＣ精製［ＯＤＳカラム（２５０ｘ７ｃｍ）２５ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３で１．５ｍｌ／分で平衡化］により保持容量９．１５ｍｌのＥ（９６μｇ）が単離される：δＨ（５００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）２．９５〜３．０（２Ｈ，ｍ，Ｈ−３’）、３．４〜３．５（２Ｈ，ｍ，Ｈ−４’）、３．５〜３．６（２Ｈ，ｍ，Ｈ−５）、５．８〜５．９（１Ｈ，ｍ，Ｈ−４）、５．９〜６．０（１Ｈ，ｍ，Ｈ−３）。Ａ ２Ｄ ＣＯＳＹ相関スペクトルは、提案されたＥの構造と一致し、約４．６ｐｐｍで残存するＨＯＤピーク下でシグナルを示す。ｍ／ｚ（電子照射）＝１８５（ＭＨ＋、１００％）。
【００８３】
化合物Ｄを粗組換えＣＡＳ（６ｍｇ、０．０３４ ＩＵ／ｍｇ−１）と共に標準的方法にしたがって培養する。約３０％のＥへの変換および＜５％のＦへの変換が観察される（５００ＭＨｚの１Ｈ ＮＭＲスペクトルの積分により判断）。ＨＰＬＣ精製［ＯＤＳ（２５０ｘ７ｃｍ）２５ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３で１．５ｍｌ／分で平衡化］により保持容量９．１５ｍｌのＥ（２００μｇ）、保持容量６．９ｍｌのＦ（＜＜５μｇ）が単離される。Ｅに関する分光分析データは部分的に精製したＣＡＳと共に培養することにより得られたものと一致する。Ｆの１Ｈ ＮＭＲスペクトル（５００ＭＨｚ）を完全に記録することはできないが、共鳴は提案される構造と一致する。ｍ／ｚ（電子照射）＝２０３（ＭＨ＋、１００％）。トレオ−５−アミノ−３−ヒドロキシ−２−（２−オキソアゼチジン−１−イル）ペンタン酸Ｆの場合、ｍ／ｚ（電子照射）＝２０３（ＭＨ＋、１００％）。粗培養混合物のＨＰＬＣ分析［ＯＤＳカラム（２５０ｘ４．６ｃｍ）、２５ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３、１ｍｌ／分］は２サンプルを混合した場合、Ｆが真のプロカルバミン酸Ｆ（３．１ｍｌ）と同一の保持容量を有することが示され、一方２サンプルを混合した場合、Ｆは合成エリスロ−５−アミノ−３−ヒドロキシ−２−（２−オキソアゼチジン−１−イル）ペンタン酸（即ち、エリスロ−プロカルバミン酸）（保持容量３．４ｍｌ）と明確に区別される。
【００８４】
（２Ｓ）−５−グアニジノ−２−（２−オキソアゼチジン−１−イル）ペンタン酸（Ｂ）の培養
化合物Ｂを部分的に精製したＣＡＳ（２ｍｇ、０．３ ＩＵｍｇ−１）と共に前記の標準的方法にしたがって培養する。８５％より大きな５−グアニジノ−３−ヒドロキシ−２−（２−オキソアゼチジン−１−イル）ペンタン酸Ｃへの変換が観察される（１Ｈ ＮＭＲスペクトル（５００ＭＨｚ）の積分により判断）。ＨＰＬＣ精製［ＯＤＳ（２５０ｘ４．６ｍｍ）、Ｈ２Ｏ、１ｍｌ／分］により保持容量７．５ｍｌの（Ｃ）（３４０μｇ）が単離される：δＨ（５００ＭＨｚ Ｄ２Ｏ）１．７〜１．８（１Ｈ，ｍ，Ｈ−４）、１．８〜１．９（１Ｈ，ｍ，Ｈ−４）、３．０（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝４Ｈｚ，Ｈ−３’）、３．３６（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，Ｈ−５）、３．５〜３．５５（１Ｈ，ｍ，Ｈ−４’）、３．５９〜３．６１（１Ｈ，ｍ，Ｈ−４’）、４．１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，Ｈ−２）、４．１５〜４．２（１Ｈ，ｍ，Ｈ−３）。２Ｄ ＣＯＳＹ相関スペクトルは、提案されたＣの構造と一致する。ｍ／ｚ（電子照射）＝２４５（ＭＨ＋、１００％）。この反応から残存するＢは回収されなかった。
【００８５】
化合物Ｂを粗組換えＣＡＳ（５．５ｍｇ、０．０Ｉ４ ＩＵ／ｍｇ）と共に標準的方法にしたがって培養する。８５％より大きなＣへの変換が観察される（１ＨＮＭＲスペクトル（５００ＭＨｚ）の積分により判断）。ＨＰＬＣ精製［ＯＤＳ（２５０ｘ４．６ｍｍ）、Ｈ２Ｏ、１ｍｌ／分］により保持容量７．５ｍｌのＣ（３６９μｇ）が単離される。Ｃに関する分光分析データは部分的に精製したＣＡＳと共に培養することにより得られたＣと一致する。
化合物Ｂを粗組み換えＣＡＳ（０．１８ｍｇ、０．３７ ＩＵ／ｍｇ）と共に標準的方法にしたがって培養する。８５％より大きなＣへの変換が観察される（１Ｈ ＮＭＲスペクトル（５００ＭＨｚ）の積分により判断）。ＨＰＬＣ精製［ＯＤＳ（２５０ｘ４．６ｍｍ）、Ｈ２Ｏ、１ｍｌ／分］により保持容量７．５ｍｌのＣ（３５０μｇ）が単離される。Ｃに関する分光分析データは部分的に精製したＣＡＳと共に培養することにより得られたＣと一致する。
【００８６】
Ｎ ２ −アセチル−Ｌ−オルニチンの培養
Ｎ２−アセチル−Ｌ−オルニチンを粗組換えＣＡＳ（６ｍｇ、０．０３５ ＩＵｍｇ−１）と共に標準的方法にしたがって培養する。約１７％の（２Ｓ）−２−アセトアミド−５−アミノ−３−ヒドロキシペンタン酸（Ｘ）への変換および約５％のＥ−（２Ｓ）−５−アミノ−２−アセトアミドペント−３，４−エン酸（Ｙ）への変換が観察される（１Ｈ ＮＭＲスペクトル（５００ＭＨｚ）の積分により判断）。ＨＰＬＣ精製［ボンダパクアミン（ｂｏｎｄａｐａｋａｍｉｎｅ）（２５０ｘ７ｍｍ）、ＯＤＳガードカラム、０．０１５Ｍ ＨＣＯ２Ｈ、２ｍｌ／分］により保持容量９．４〜１０．０ｍｌのＹ（３０μｇ）が単離される。さらに８〜９ｍｌののフラクションをＨＰＬＣ精製［ＯＤＳ（２５０ｘ４．６ｍｍ）、０．０５％水性ＨＣＯ２Ｈ、１ｍｌ／分］に付し、保持容量５．５〜９．０ｍｌのＸ（９９μｇ）を単離する。
【００８７】
Ｅ−（２Ｓ）−５−アミノ−２−アセトアミドペント−３，４−エノエート（Ｙ）の場合：δＨ（５００ＭＨｚ Ｄ２Ｏ）２．０（３Ｈ，ｓ，ＣＨ３−）、２．３３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝５Ｈｚ，Ｈ−５）、３．５５（１Ｈ，ｍ，Ｈ−２）、５．６５〜５．７５（１Ｈ，ｍ，Ｈ−４）、５．９〜６．０（１Ｈ，ｍ，Ｈ−３）。２Ｄ ＣＯＳＹ相関スペクトルは、Ｘの結合と一致する。ホモニュークレアデカップリング実験によるとＪ＝３Ｈ、４Ｈ＝１５．２Ｈｚで、これは二重結合がＥ立体化学を有することを示す。ｍ／ｚ（電子照射）＝１７３（ＭＨ＋、１００％）。
【００８８】
（２Ｓ）−２−アセトアミド−５−アミノ−３−ヒドロキシペンタン酸（Ｘ）の場合：δＨ（５００ＭＨｚ Ｄ２Ｏ）１．７５〜１．８５（２Ｈ，ｍ，Ｈ−４）、２．１（３Ｈ，ｓ，ＣＨ３−）、３．１５（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５Ｈｚ，Ｈ−５）、４．２〜４．２５（１Ｈ，ｍ，Ｈ−３）、４．３０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．５Ｈｚ，Ｈ−２）。２Ｄ ＣＯＳＹ相関スペクトルは、Ｙの結合と一致する。ｍ／ｚ（電子照射）＝１９１（ＭＨ＋、１００％）。
【００８９】
Ｎ ２ −アセチル−Ｌ−アルギニンの培養
Ｎ２−アセチル−Ｌ−アルギニンを粗組換えＣＡＳ（６ｍｇ、０．０３５ ＩＵｍｇ−１）と共に標準的方法にしたがって培養する。８５％より大きな（２Ｓ）−２−アセトアミド−５−グアニジノ−３−ヒドロキシ−ペンタン酸（Ｋ）への変換が観察される（１Ｈ ＮＭＲスペクトル（５００ＭＨｚ）の積分により判断）。ＨＰＬＣ精製［ＯＤＳ（２５０ｘ４．６ｍｍ） Ｈ２Ｏ １ｍｌ／分］により保持容量４．５ｍｌのＫ（３２０μｇ）が単離される。δＨ（５００ＭＨｚ Ｄ２Ｏ）１．８〜２．０（２Ｈ，ｍ，Ｈ−４）、２．１（３Ｈ，ｓ，ＣＨ３−）、３．１５（２Ｈ，ｍ，Ｈ−５）、４．２０〜４．２２（１Ｈ，ｍ，Ｈ−３）、４．２５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．５Ｈｚ，Ｈ−２）。２Ｄ ＣＯＳＹ相関スペクトルは（Ｋ）の結合と一致する。
ｍ／ｚ（電子照射）＝２３３（ＭＨ＋、１００％）。
【００９０】
Ｎ−α−アセチル−Ｄ−アルギニンをＣＡＳと共に培養すると、あるとしてもわずかな（５％未満）ヒドロキシル化生成物が得られる。このことは、ＣＡＳが（２Ｓ）立体化学特性を有する基質を変換することを示す。Ｎ−α−ベンゾイル−Ｄ−アルギニンをＣＡＳと共に培養してもＮ−α−ベンゾイル−Ｄ−アルギニンの変換は観察されない。これらの結果は、ＣＡＳがオルニチンおよびアルギニンの単純な誘導体を非活性化位置で酸化できることを示す。
【００９１】
クラバミン酸シンターゼ触媒反応の立体特異性の研究
（２Ｓ，３Ｓ）−５−グアニジノ−２，３−［２Ｈ２］−２−（２−オキソアゼチジン−１−イル）ペンタン酸および（２Ｓ，３Ｒ）−５−グアニジノ−３−［２Ｈ］−２−（２−オキソアゼチジン−１−イル）ペンタン酸をクラバミン酸シンターゼと共に培養すると、Ｃ−３で高度に立体特異的なヒドロキシル化が起こり、各々、プロ−Ｒプロトンまたは重陽子が除去される。
これらの結果は、ＣＡＳにより触媒された場合、Ｂのヒドロキシル化がＣ−３の立体配置を保持しながら優勢に進行することを示す。
【００９２】
実施例３−実験
３．１ 実験１ クラブラン酸の前駆体としてのアルギニンの測定
１４Ｃ−アルギニンを、各々、オルニチントランスカルバモイラーゼおよびアルギニンスクシネートシンセターゼで遮断されていることがわかっている２つのエス・クラブリゲルスの突然変異体培養物に供給する（これらはオルニチンからアルギニンへの変換に関与する酵素である）。標識をクラブラン酸に導入する。
１４Ｃ−オルニチン標識を同様に２つの突然変異体培養物に供給した場合、クラブラン酸に標識は取り込まれない。以下に記載の文字および数字を用いて図１および２に言及する。
【００９３】
３．２ 実験２−２個の新規アルギニン誘導体（Ａ）および（Ｇ）
実験１はアルギニンが生合成経路でクラブラン酸にされるアミノ酸であることを示す。該経路での次の公知の中間体はモノサイクリックβ−ラクタムプロクラバミン酸１である。したがって、β−ラクタムはアルギニン炭素骨格のＮ２位置に導入されなければならず、ヒドロキシル基を、Ｃ−３に導入し、Ｎ５グアニジノ官能基を加水分解する。
【００９４】
モノサイクリックβ−ラクタム（Ｂ）および（Ｃ）を、各々、親アミンであるプロクラバミン酸（２）１およびデヒドロキシプロクラバミン酸１をアミノイミノメタンスルホン酸２と反応させることにより調製する。β−アミノ酸２Ｓ−（Ａ）は以下に示す経路により得られ、β−アミノ酸（Ｇ）はβ−ラクタム（Ｃ）の酸加水分解により得られる。
【００９５】
【化２９】
試薬および条件：ｉ．Ｅｔ３Ｎ／アクリル酸メチル；ｉｉ．ＮａＯＨ／ＴＨＦ：Ｈ２Ｏ（１：１）；ｉｉｉ．Ｈ２、Ｐｄ−Ｃ（１０％）
【００９６】
これらの推定される代謝物のうちエス・クラブリゲルスからの培養上清中容易に検出可能なものはない。したがって、プロクラバミン酸およびクラブラン酸の産生において遮断されたエス・クラブリゲルスの突然変異体を試験する。これらの変異体のうちフェニルイソシアネート３での誘導体合成により示されるようなアミン基を含有する化合物を蓄積するものもある。このような変異体の選択した物を発酵させ、培養ブロスをサカグチ着色反応４によりグアニジノ基を有する化合物の存在に関してスクリーンする。変異株エス・クラブリゲルスｄｃｌＨ６５は着色試験に良好な応答を示す。したがって、培養濾液をダウエクス−５０、ファーマシアＨＲ５／５モノＳおよびパーティシル１０ＳＣＸカチオン交換マトリックスを用いて分別し、グアニジノ含有物質の精製につづいてサカグチ試験方法の変法を行う（サカグチ反応において形成される色相の強度を５１５ｎｍで測定する）。
【００９７】
２つの化合物を約１０：１の割合で単離し、その分光学的性質（両方の化合物に関して１Ｈ ｎ．ｍ．ｒ．およびｆ．ａ．ｂ．／ｍ．ｓ．、主要成分に関して１３Ｃ）を推論的中間体として調製された化合物の性質と比較して、その構造体を（Ａ）および（Ｇ）とする。
【００９８】
エス・クラブリゲルスｄｃｌＨ６５培養ブロスのクロマトグラフィーによる精製法は酸性培地を含むため、新しい培養濾液の分析的ｈ．ｐ．ｌ．ｃ．は閉環物質の存在を示さないが、（Ａ）および（Ｇ）は対応するβ−ラクタム誘導体（Ｂ）および（Ｃ）の開環体である可能性がある。したがって、培養ブロスの分別はほぼ中性条件を保って、β−ラクタム化合物の加水分解を避けながら行う。ｄｃｌＨ６５の新しい培養ブロスを遠心分離し、凍結乾燥し、エタノール／水（１：１）で処理し、高分子量化合物を除去し、可溶性フラクションを濃縮する。濃縮物を次に、溶出液のｐＨを４と７．５の間に維持しながらアンバーライトＩＲＡ６８アニオン交換樹脂、セファデクスバイオゲルＰ２およびシリカゲル上クロマトグラフィーに付す。サカグチ−陽性物質を各段階で収集する。主要サカグチ陽性物質を単離し、１Ｈ−ｎ．ｍ．ｒ．、ｉ．ｒ．、ｃ．ｄ．、重量スペクトルにより分析する。これらのデータから主要生成物の構造がＳ−（Ａ）であることが確認される。副サカグチ−陽性化合物は単離するのに十分な量で存在しないが、合成（Ｇ）と共に溶出される物質はｈ．ｐ．ｌ．ｃ．およびキャピラリーゾーン電気泳動で検出される。
【００９９】
結論
２つの新規アルギニン誘導体、Ｎ２−（２−カルボキシエチル）−アルギニン（Ａ）およびＮ２−（２−カルボキシエチル）−３−ヒドロキシ−アルギニン（Ｇ）はクラブラン酸生合成において遮断されているストレプトミセス・クラブリゲルスｄｃｌＨ６５の変異体により産生される。これらの化合物はクラブラン酸合成において有用である。
さらにこれらの化合物のクラブラン酸生合成経路の中間体としての役割に関するデータを実験３．３に示す。
【０１００】
３．３−実験３ クラブラン酸生合成の中間体としての（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｇ）および（８）の役割に関する標識実験
プロクラバミン酸に先立つ可能な生合成配列を第１図に示す。
（Ａ）から始めて、少なくとも３つの生化学工程、即ち、ヒドロキシル基の導入（工程ａ）、β−ラクタム環の形成（工程ｂ）およびグアニジノ基のアミノ基への加水分解（工程ｃ）が、プロクラバミン酸の生成に必要である。どの化合物（Ａ）、（Ｇ）、（Ｂ）、（Ｃ）および（８）が実際経路に存在するかを調べるために、供給実験についてこれらを１３Ｃで三重に標識して合成する。各場合において、５個の炭素鎖を１および２−位で標識し（９９％１３Ｃ）、さらに３個の炭素単位のカルボニル基を標識する（９１％１３Ｃ）。３個の標識炭素のすべてが結合が切れることなく取り込まれた場合、クラブラン酸の７、３および１０の炭素間にスピン−スピンカップリングが１３Ｃ−ｎ．ｍ．ｒ．において観察されることがわかっているので５、この標識手順を採用する。
【０１０１】
ＤＬ−トレオ−［１，２，２’−１３Ｃ３］−プロクラバミン酸５をアミノイミノメタンスルホン酸２で処理して［１，２，２’−１３Ｃ３］−（Ｃ）を得、これを酸加水分解に付して［１，２，３’−１３Ｃ３］−（Ｇ）を得る。［１，２，２’−１３Ｃ３］−（Ｆ）の酸加水分解により、［１，２，３’−１３Ｃ３］−（８）を得る。［１，２，３’−１３Ｃ３］−（Ａ）および［１，２，２’−１３Ｃ３］−（Ｂ）の合成は第２図にしたがう。第２図において、試薬および条件は以下のとおりである：Ｚ＝ＰｈＣＨ２ＯＣＯ−；ｉ，ＥｔＯＨ、ＨＣｌ、Δ；ｉｉ，ＰｈＣＨＯ、ＭｇＳＯ４、Ｅｔ３Ｎ；ｉｉｉ，ＬＤＡ、ＨＭＰＡ、ＩＣＨ２ＣＨ２ＮＨＺ；ｉｖ，１Ｍ ＨＣｌ；ｖ，ＮａＯＨ、ＢｒＣＨ２ＣＨ２ １３ＣＯＣｌ；ｖｉ，粉末ＫＯＨ、ＴＢＡＢ、Ｈ２Ｏ、超音波処理物；ｖｉｉ，Ｎａ２ＣＯ３、４０％ＥｔＯＨ水溶液；１６ ｖｉｉｉ，Ｈ２、Ｐｄ−Ｃ（１０％）；ｉｘ，Ｋ２ＣＯ３、アミノイミノメタンスルホン酸；ｘ，１Ｍ ＨＣｌ
【０１０２】
ストーク（Ｓｔｏｒｋ）らの方法６にしたがって、１３Ｃ２−グリシン（９９％１，２−１３Ｃ）を保護した［１，２−１３Ｃ２］−オルニチン誘導体（１０）にベンジリデングリシンエステル（９）を経由して導入する。（１０）の穏やかな酸加水分解によりアミノエステルを得、これを［１−１３Ｃ］−３−ブロモプロピオニルクロリド（９１％１−１３Ｃ）５でアシル化して、（１１）を得る。（１１）の塩基処理により、β−ラクタム（１２）を得る。カルボキシおよびアミノ保護基の開裂により［１，２，２’−１３Ｃ３］−（Ｄ）１を得、これをアミノイミノメタンスルホン酸２で目的とするグアニジノ酸［１，２，２’−１３Ｃ３］−（Ｂ）に変換する。
［１，２，２’−１３Ｃ３］−（Ｂ）の酸処理により、［１，２，３’−１３Ｃ３］−（Ａ）を得る。この反応スキームの工程の平均収率は８７％である。
【０１０３】
５個のラセミ１３Ｃ３−標識化合物（Ａ）、（Ｇ）、（Ｂ）、（Ｃ）および（８）を、各々、クラブラン酸産生期にある、エス・クラブリゲルスＡＴＣＣ２７０６４発酵に供給し、産生されたクラブラン酸サンプルをベンジルエステルとして単離する。投与された化合物の取り込みのレベルを１３Ｃ−ｎ．ｍ．ｒ．により測定し、シリル化後、９−Ｏ−シリル化誘導体のｇ．ｃ／ｍ．ｓ．を測定する。観察される１３Ｃ−取り込みを以下の第１表にまとめる：
【０１０４】
【表１】
ＮＤ＝どの炭素中心でも濃縮が検出されない。計算は用いた１エナンチオマーに基づく。
【０１０５】
３サンプルにおいて、１３Ｃ−濃縮が観察され［化合物（Ａ）、（Ｂ）＆（Ｃ）］、濃縮はクラブラン酸塩の炭素３、７および１０に特異的であり、すべての３個の標識された中心間で１３Ｃ−１３Ｃスピン−スピンカップリングが観察される（第３図 Ｂの供給からのクラブラン酸ベンジルの炭素７、１０および３の１３Ｃ−ｎ．ｍ．ｒ．スペクトル、Ｊ７，１０ ３．８、Ｊ３，７ １．９およびＪ３，１０ ６７．２Ｈｚ）。このことは、取り込み中、結合の破壊が起こらなかったことを示す。
【０１０６】
これらの結果から、（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）がプロクラバミン酸の生合成における前駆体、したがって、クラブラン酸であり、経路中、この順番に論理的に起こることが結論できる。
Ｇおよび８の場合、これらの実験条件下では、濃縮は起こらない。しかし、当該分野で周知のβ−ラクタム環形成の方法を用いて（例えば、文献１）、Ｇおよび８（またはその保護誘導体）を、各々、Ｃおよびプロクラバミン酸に変換することにより、これらの化合物は、クラバム類、例えばクラバミン酸の産生に関して、例えば合成または半合成プロセスにおいて有用である。
【０１０７】
（Ｃ）のプロクラバミン酸への形質転換は、アルギナーゼ型酵素により媒介される。したがって、この酵素活性の証拠を調べる。エス・クラブリゲルスＡＴＣＣ２７０６４の無細胞調製物はラセミ体の（Ｃ）の１個のエナンチオマーを定量的にプロクラバミン酸（５）および尿素に変換できる。活性は、Ｍｎ２＋の存在下に向上し、この現象は、バチルス・アンスラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）７およびスタフィロコッカス７ ’ ８源からのアルギナーゼに関して報告されている。対応する（２Ｓ）−アミノ誘導体１から調製される（２Ｓ）−（Ｂ）も、これらの条件下で加水分解するが、（Ｃ）より迅速でなく、（Ａ）または（Ｇ）について、加水分解は検出されない。明らかに、この酵素はこれらの初期生合成前駆体のグアニジノ基の間を有効に区別できる。天然のプロクラバミン酸の絶対的立体化学は（２Ｓ，３Ｒ）であるので、アミジノヒドロラーゼの基質である（Ｃ）のエナンチオマーも恐らく（２Ｓ，３Ｒ）立体化学を有する。
【０１０８】
アミジノヒドロラーゼを前記１．２項にしたがって精製する。純粋な酵素は、アルギニンをオルニチンに加水分解せず、したがって、すでにエス・クラブリゲルス９において報告されているアルギナーゼとは異なる。アミジノヒドロラーゼのＮ−末端アミノ酸配列はクラブラン酸遺伝子クラスター中のアミジノヒドロラーゼ関連遺伝子のオープンリーディングフレームと関連がある。ＤＮＡ配列から計算されるアミジノヒドロラーゼについてのＭｒは３３，３７４である。前記データから、（２Ｓ，３Ｒ）−（Ｃ）はおそらくクラブラン酸への生合成パスにおいて（２Ｓ，３Ｒ）−プロクラバミン酸に直接変換されると結論できる。
【０１０９】
（Ｂ）および（Ｃ）に比べて１３Ｃ−標識（Ａ）化合物の取り込みのレベルが低いことは、化合物が細胞中に有効に輸送されていないか、真の中間体が（Ａ）の誘導体、例えば閉環に都合よい補酵素Ａチオエステルであることを示す。（Ａ）に関する結果は、（Ｂ）のβ−ラクタムの生成が、生化学的に先例のないプロセス、即ち、アミド結合形成によることを示すが、文献では、他のモノサイクリックβ−ラクタムの前駆体、ノカルジシン１０およびおそらくモノバクタム１０ ’ １１が閉環の前に形成されたアミド結合を有することを示している。これらの化合物において、閉環はセリルヒドロキシル官能基のＳＮ２置換による。
【０１１０】
先の標識研究は、クラブラン酸のβ−ラクタム炭素が解糖経路由来のものであり、ピルビン酸エステル１２がβ−ラクタム環中に特異的に取り込まれることを示す。本発明者らは、乳酸エステルもβ−ラクタム環中に特異的に取り込まれることを見いだした。
【０１１１】
したがって、（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）のＣ３基は同じ経路由来のものである。ピルビン酸エステルおよび乳酸エステルは、生化学的に、アクリル酸エステル１３およびマロン酸セミアルデヒド１４に変換できることは公知である。酵素で触媒されたアルギニンのアクリル酸エステルへのミカエル添加、またはマロン酸セミアルデヒドに関するシッフ塩基添加と、それに続く還元により、いずれの場合においても前駆体（Ａ）が得られる。アルギニンのマロン酸セミアルデヒドとの反応からの可能な（Ａ）の誘導は、シッフ塩基形成およびそれに続く還元が起こるオピン代謝物の生合成と強い類似性を示すので、特に興味深い。
【０１１２】
得られた証拠から、プロクラバミン酸のβ−ラクタム環はアミド形成反応を含む新しい方法で構築されることがわかる。アルギニン誘導体（２Ｓ）−（Ｂ）および（２Ｓ，３Ｒ）−（Ｃ）はプロクラバミン酸の生合成前駆体であり、（２Ｓ）−（Ｂ）はヒドロキシル化されて（２Ｓ，３Ｒ）−（Ｃ）になり、酵素アミジノヒドロラーゼは（２Ｓ，３Ｒ）−（Ｃ）を加水分解してプロクラバミン酸にする新規酵素である（プロクラバミン酸アミジノヒドロラーゼと命名する）。
【０１１３】
結論
実験１および３は、アルギニンの、Ａ、ＢおよびＣが、プロクラバミン酸、かくしてクラブラン酸への経路上にあることを示し、アルギニンはオルニチンに比べて、クラブラン酸のより直接の前駆体であることを示す。
【０１１４】
文献
１．ケイ・エイチ・バガレイ、エス・ダブリュー・エルソン、エヌ・エイチ・ニコルソンおよびジェイ・ティー・サイム（Ｋ．Ｈ．Ｂａｇｇａｌｅｙ，Ｓ．Ｗ．Ｅｌｓｏｎ，Ｎ．Ｈ．ＮｉｃｈｏｌｓｏｎおよびＪ．Ｔ．Ｓｉｍｅ）、ジャーナル・オブ・ケミカル・ソサイエティー（Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｉ ）１９９０ １５２１およびそこに記載されている引例
２．エイ・イー・ミラーおよびジェイ・ジェイ・ビショフ（Ａ．Ｅ．ＭｉｌｌｅｒおよびＪ．Ｊ．Ｂｉｓｃｈｏｆｆ）シンセシス（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ），１９８６，７７７、ケイ・キム、ワイ−ティー・リンおよびエイチ・エス・モシャー（Ｋ．Ｋｉｍ，Ｙ−Ｔ ＬｉｎおよびＨ．Ｓ．Ｍｏｓｈｅｒ）、テトラヘドロン・レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．），１９８８，２９，３１８３
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【０１１５】
【配列表】
配列一覧表
（１）一般情報
（ｉ）出願人
（Ａ）名称：スミスクライン・ビーチャム・パブリック・リミテッド・カンパニー
（Ｂ）通り名：ニュー・ホライズンズ・コート
（Ｃ）都市名：ブレンフォード
（Ｄ）州名：ミドルセックス
（Ｅ）国名：イギリス国
（Ｆ）郵便番号（ＺＩＰ）：ＴＷ８ ９ＥＰ
（Ｇ）電話番号：０７３７ ３６４１４７
（Ｈ）テレファックス：０７３７ ３６４００６
（Ｉ）テレックス：９１１４１５
（ｉｉ）発明の名称：新規化合物
（ｉｉｉ）配列数：２
（ｉｖ）コンピューター・リーダブル・フォーム：
（Ａ）媒体形態：フロッピーディスク
（Ｂ）コンピューター：互換性ＩＢＭ ＰＣ
（Ｃ）操作システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウェアー：パテントイン・リリース（ＰａｔｅｎｔＩｎ Ｒｅｌｅａｓｅ）
＃１．０，バージョン＃１．２５（ＥＰＯ）
（２）配列番号１に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：３１３アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）トポロジー：不明
（ｉｉ）分子の型：蛋白質
（ｉｉｉ）仮定性：イエス
（ｖ）フラグメントの型：Ｎ−末端
（ｖｉ）起源：
（Ａ）微生物：ストレプトミセス・クラブリゲルス
（Ｂ）菌株：エス・クラブリゲルスＡＴＣＣ２７０６４の再単離体
（ｘｉ）配列の記載：配列番号１：
【化３０】
（２）配列番号２に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：９４２塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：不明
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｉｉｉ）仮定性：ノー
（ｖｉ）起源：
（Ａ）微生物：ストレプトミセス・クラブリゲルス
（Ｂ）菌株：エス・クラブリゲルスＡＴＣＣ２７０６４の再単離体
（ｘｉ）配列記載：配列番号２：
【化３１】
【図面の簡単な説明】
【図１】クラブラン酸の生成工程を示すスキームである。
【図２】化合物Ａの生成工程を示すスキームである。
【図３】１３Ｃ３−標識した化合物Ｂをエス・クラブリゲルスＡＴＣＣ２７０６４発酵に供給したときの産生したクラブラン酸ベンジルの炭素７、１０および３の１３Ｃ−ｎ．ｍ．ｒ．スペクトルである。
【発明の属する技術分野】
本発明は、酵素反応による新規化合物の製法、特に適当な前駆体に対する酵素の作用によるβ−ラクタム類、特にクラブラン酸などのクラバム類の製法における該酵素反応に関する。
【０００２】
【従来の技術】
クラブラン酸はＺ−（２Ｒ，５Ｒ）−３−（β−ヒドロキシエチリデン）−７−オキソ−４−オキサ−１−アザビシクロ［３．２．０］ヘプタン−２−カルボン酸である。
クラブラン酸は、β−ラクタマーゼ反応性β−ラクタム抗生物質を劣化から防御するので、β−ラクタマーゼ酵素の有効な阻害剤であり、臨床的価値の高い化合物である。
イギリス特許明細書第１ ５０８ ９７７号は、クラブラン酸として知られるクラバム誘導体を記載し、これは、ストレプトミセス・クラブリゲルス
（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ）ＡＴＣＣ ２７０６４またはその高産生突然変異体により産生される化合物である。
抗生物質ＡＵＧＭＥＮＴＩＮ（登録商標）の基本成分である重要な生成物クラブラン酸の生合成経路は多くの研究の対象であった。ＥＰ Ａ ０ ２１３ ９１４において、クラブラン酸は前駆体のプロクラバミン酸（Ｆ）：
【化３】
【０００３】
【特許文献１】
英国特許第１５０８９７７号明細書
【特許文献２】
欧州特許出願公開第０２１３９１４号明細書
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
生合成経路における初期の工程は説明するのがより困難であり、正確な工程は未だ解明されていない。クラブラン酸の前駆体としてのアルギニンおよびオルニチンの活用を評価する試験法が、Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， １９８６， ５２（４）， ８９２−７に記載されている。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、今回、新規中間体およびそのクラブラン酸への変換過程を同定した。従って、本発明は、ストレプトミセス属、好ましくは、エス・クラブリゲルス（Ｓ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ）由来の酵素系を用い、Ｓ−アルギニン、式（Ｉ）：
【化４】
【化５】
で示される基を意味する］
で示される化合物、あるいは式（ＩＩ）：
【化６】
【化７】
で示される基を意味する］
で示される化合物、あるいは式（ＩＩＩ）：
【化８】
およびＲ１は
【化９】
で示される基を意味する］
で示される化合物のうちいずれか一の化合物からクラブラン酸および他のクラバム誘導体を製法する方法を提供する。
【０００６】
【発明の実施の形態】
「他のクラバム類」なる語により、７−オキソ−４−オキサ−１−アザビシクロ［３．２．０］ヘプタン核を含有する化合物を意味する［ジャーナル・オブ・ケミカル・ソサイエティ（Ｊ．Ｃ．Ｓ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９７９），２８２］。
したがって、本発明は、クラバム類、特にクラブラン酸の製造において有用な新規化合物を提供する。本発明によれば、式（Ｉ）：
【化１０】
【化１１】
で示される基を意味する］
で示される化合物が得られる。
【０００７】
本発明者らは、今回、化合物（Ｆ）の前駆体が、式（Ｃ）：
【化１２】
【０００８】
従って、好ましい態様において、化合物（Ｃ）：トレオ−３−ヒドロキシ−５−グアニジノ−２−（２−オキソ−アゼチジン−１−イル）ペンタン酸、好ましくは（２Ｓ−３Ｒ）またはその誘導体が得られる。
化合物［Ｃ］は、ジェイ・イー・ミラーおよびジェイ・ジェイ・ビショフ
（Ｊ Ｅ ＭｉｌｌｅｒおよびＪ Ｊ Ｂｉｓｃｈｏｆｆ），シンセシス（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ），１９８６，７７７の方法または当該分野にて公知の関連した方法にしたがって、
【化１３】
【化１４】
【０００９】
本発明によると、グアニジノ基を有する化合物から尿素を除去できる、アミジノヒドロラーゼ活性を有し、特に適当な条件下で（Ｃ）を（Ｆ）に変換できる酵素も提供される。
適当には、酵素系は、微生物、特にストレプトミセス属由来のものである。好ましくは、酵素は、以下に記載する実施例１に従って、ストレプトミセスから調製される。あるいは、酵素は、組み換え体源から調製してもよい。
酵素は、さらに他の基質、例えば、（２Ｓ）−５−グアニジノ−２−（２−オキソ−アゼチジン−１−イル）ペンタン酸（以下に定義する化合物Ｂ）と反応させた場合に、グアニジノ基をアミノ基に変換するのに有用である。
【００１０】
アミジノヒドロラーゼ活性を有する酵素（以下、アミジノヒドロラーゼという）は、ストレプトミセス属、特にストレプトミセス・クラブリゲルスから得られる。アミジノヒドロラーゼ酵素は、好ましくは精製された形態、有利には実質的に純粋な形態である。
本発明の別の態様において、エス・クラブリゲルス菌糸体を遠心分離および超音波処理に付し、続いてイオン交換クロマトグラフィによる分別により処理することによりアミジノヒドロラーゼを調製する方法が提供される。
本発明のさらに別の態様において、実質的に以下の配列番号１のアミノ酸配列を有するアミジノヒドロラーゼ活性を有する蛋白質が提供される。
【００１１】
配列番号１の配列は、アミジノヒドロラーゼをコードするＤＮＡの遺伝子配列から得られた。遺伝子は、エス・クラブリゲルスから得られるアミジノヒドロラーゼ酵素のＮ末端を配列決定し、ｐＢＲＯＣ４４として公知のベクター上にクローンされた、エス・クラブリゲルス染色体ＤＮＡの一部において見られるオープンリーディングフレームから予想される配列とその配列を適合させることにより同定する。ｐＢＲＯＣ４４の調製は、ＥＰ−Ａ−０３４９１２１の実施例６に記載されている。
【００１２】
さらなる態様において、本発明は、本質的にアミジノヒドロラーゼをコードする遺伝子からなるＤＮＡを提供する。本発明はまたこのようなＤＮＡ、好ましくは適当な宿主生物においてアミジノヒドロラーゼの発現のための発現ベクターからなるベクター（ｐＢＲＯＣ４４以外）を提供する。
ＤＮＡは「自然」の状態（自然界で起こるような）ではなく、単離または実質的に精製された形態であると考えられる。好ましくは、本発明のＤＮＡはエス・クラブリゲルス由来のものであるが、本発明は、他の適当な微生物、特に、好ましくは非常に厳密な条件下で、配列番号２またはアミジノヒドロラーゼ活性を有する酵素をコードするそのサブフラグメントのＤＮＡとハイブリダイゼーションするエス・クラブリゲルス以外のクラブラン酸産生微生物に由来するＤＮＡ配列も包含する。
【００１３】
本発明のＤＮＡおよびこれを含有するベクターは種々の工業的用途がある。これは前記ベクターで形質転換された宿主微生物およびこれが発現する酵素にも適用される。例えば、前記ＤＮＡを含有する組換えベクターは、適当な宿主中に形質転換された場合に、多量のクラブラン酸を合成する遺伝子工学的に修飾された微生物の産生において重要である。
好ましくは、ＤＮＡは、実質的に、以下の配列番号２に示す配列を有するかまたは変性してこの配列になるが、配列番号１のアミノ酸配列をコードする配列を有する。本発明はまた、アミジノヒドロラーゼ活性を有する酵素をコードする突然変異体または関連する配列にも及ぶ。
【００１４】
本発明に従って、式［Ｃ］の化合物またはその塩または保護された形態またはその類似体をアミジノヒドロラーゼ活性を有する酵素と接触させることにより、プロクラバミン酸を調製する方法が提供される。
【００１５】
本発明は、また、式（ＩＩ）：
【化１５】
【化１６】
で示される基を意味する］
で示される化合物を提供する。
【００１６】
好ましい態様において、（２Ｓ）−５−グアニジノ−２−（２−オキソアゼチジン−１−イル）ペンタン酸（Ｂ）である式（Ｂ）：
【化１７】
【００１７】
式［Ｂ］の化合物は、ジェイ・イー・ミラーおよびジェイ・ジェイ・ビショフ（Ｊ Ｅ ＭｉｌｌｅｒおよびＪＪ Ｂｉｓｃｈｏｆｆ），シンセシス（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）１９８６，７７７の方法または当該分野において知られている関連法にしたがって、
【化１８】
【化１９】
【００１８】
本発明にしたがって、式［Ｂ］の化合物またはその塩またはその保護された形態またはその類似体を、ヒドロキシル化活性を有する酵素、特にクラバミン酸シンターゼ活性を有する酵素と接触させることによりＣを製造する方法も提供される。好ましくは、酵素系は、微生物、特にストレプトミセス属由来のものである。別法として、酵素は組換え体源から産生できる。好ましくは、酵素はＥＰ−Ａ−２１３９１４に記載されるクラバミン酸シンターゼ（ＣＡＳ）である。本発明は、通常のクラブラン酸産生株のストレプトミセス・クラブリゲルスから調製されるＣＡＳ、ならびにＥＰ３４９１２１の方法に従って得ることができる、例えば、ＣＡＳ遺伝子を発現ベクター、特にベクターｐＢＲＯＣ４１３［ｐＴ７．７（テイバー・エスおよびリチャードソン・シー・シー（Ｔａｂｏｒ，Ｓ．＆Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｃ．Ｃ．）、（１９８５）プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）ＵＳＡ，８２，１０７４−１０７８）の非伝達性誘導体］内にクローンしたイー・コリから得られる「組換え」ＣＡＳの両方のクラバミン酸シンターゼに関する。
【００１９】
本発明にしたがって、また、式ＩＩＩ：
【化２０】
Ｒ１は
【化２１】
で示される基を意味する］
で示される化合物が得られる。
【００２０】
好ましい態様において、Ｎ２−（２−カルボキシエチル）−（Ｓ）−アルギニンである化合物（Ａ）：
【化２２】
【００２１】
化合物Ａは新規であり、本発明の別の態様である。
化合物Ａは以下の反応スキームにしたがって調製できる。
【化２３】
本発明のさらに別の態様において、Ａまたはその活性化誘導体、好ましくはエステルまたはＣｏＡチオエステルをストレプトミセス由来の酵素系、例えば全細胞または遊離酵素系と接触させることにより、Ｂを調製する方法が提供される。
【００２３】
好ましい態様において、Ｎ２−（２−カルボキシエチル）−３−ヒドロキシ−（Ｓ）−アルギニンである化合物（Ｇ）：
【化２４】
【００２４】
化合物Ｇは新規であり、本発明の別の態様である。
化合物Ｇは以下の反応スキームにしたがって調製できる。
【化２５】
【化２６】
【００２５】
Ｘ型の化合物の調製は、ケイ・エイチ・バガレイ、エス・ダブリュー・エルソン、エヌ・エイチ・ニコルソンおよびジェイ・ティー・サイム（Ｋ．Ｈ．Ｂａｇｇａｌｅｙ，Ｓ．Ｗ．Ｅｌｓｏｎ，Ｎ．Ｈ．ＮｉｃｈｏｌｓｏｎおよびＪ．Ｔ．Ｓｉｍｅ），ジャーナル・オブ・ケミカル・ソサイエティー（Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ Ｉ）１９９０，１５２１に記載されている。
【００２６】
本発明のさらに別の態様において、ＤをＣＡＳと共に培養することからなるプロクラバミン酸（Ｆ）の製法が提供される。
【化２７】
【００２７】
本発明のさらに別の態様において、ＤをＣＡＳと共に培養することからなる（Ｅ）の製法が提供される。
【化２８】
【００２８】
Ａ、Ｂ、ＣおよびＧまたはその保護された形態およびその塩の有用性は、以下に記載するようなクラブラン酸の調製法における中間体として作用する能力に存する。
好ましい態様において、本発明はまた、ストレプトミセス属、好ましくは、エス・クラブリゲルス由来の酵素系を用い、Ｓ−アルギニン、Ａ、Ｂ、ＣまたはＧのいずれかからのクラブラン酸および他のクラバム誘導体の製法を提供する。
【００２９】
さらに別の態様において、本発明は、式（ＩＩ）の化合物、好ましくは、前記した化合物Ｂならびにアルファアミノ酸またはそのＮ−アシル誘導体（ここに、アルファアミノ酸基質は側鎖に塩基性基を有する）のベータ−ヒドロキシル化法であって、ヒドロキシル化反応が、基質をＣＡＳと共に培養することにより行われることを特徴とする方法を提供する。適当には、反応を、必要な補助因子Ｆｅ２＋および酸素および補助基質α−ケトグルタレートと共に実施する。適当な塩基性基は、アミノ、グアニジノおよびアミジノを包含する。
【００３０】
個々の基質は、Ｎ２−アシルアルギニン誘導体、例えば、Ｎ２−アセチルアルギニンおよびＮ２−アシルオルニチン誘導体、例えば、Ｎ２−アセチルオルニチンを包含する。
本発明の化合物は、双性イオン形態または塩形態、例えばナトリウム塩などの金属塩、酸付加塩、アンモニウム塩または置換アンモニウム塩、例えば第三アミン塩の形態であってもよい。
【００３１】
酸付加塩は、末端アミノ基で形成され、例えば塩酸、臭化水素酸、オルトリン酸または硫酸などの無機酸、あるいは例えばメタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、酢酸、プロピオン酸、乳酸、クエン酸、フマル酸、リンゴ酸、コハク酸、サリチル酸またはアセチルサリチル酸などの有機酸との塩であってもよい。
金属塩は、カルボキシル基で形成され、例えば、アルミニウム塩およびアルカリ金属塩およびアルカリ土類金属塩、例えばリチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウムおよびマグネシウム塩であってもよい。
【００３２】
置換アンモニウム塩は、例えば、トリエチルアミンなどのＣ１−６アルキルアミン、２−ヒドロキシエチルアミン、ビス−（２−ヒドロキシエチル）アミンまたはトリ（２−ヒドロキシエチル）アミンなどのヒドロキシ（Ｃ１−６）アルキルアミン、ビシクロヘキシルアミンなどのシクロアルキルアミン、または、プロカインとの塩、ジベンジルピペリジン、Ｎ−ベンジル−β−フェネチルアミン、デヒドロアビエチルアミン、Ｎ，Ｎ’−ビスデヒドロアビエチルアミン、グルカミン、Ｎ−メチルグルカミンまたは例えばピリジン、コリジンまたはキノリンなどのピリジンタイプの塩基との塩であってもよい。
【００３３】
本発明の化合物は、１またはそれ以上の存在する官能基が保護された形態である化合物にも及ぶ。従って、適当な場合には、カルボキシ基を保護するか、グアニジノ、ヒドロキシまたはアミノ基を保護するか、またはカルボキシおよびグアニジノ、ヒドロキシまたはアミノ基の両方を保護してもよい。本明細書に記載する化合物のこのような保護された形態はすべて「保護された形態」という語に包含される。加えて、本明細書に記載の化合物に適用した場合、「保護された形態」なる語は、「マスクした」中間体も包含し、該中間体は、ある官能基を他のものに変換できることが公知の化学的プロセス（ここに、分子の残りの部分は、実質的に影響を受けないままである）により最終化合物に変換できる。例えば、好ましいマスクされた形態のアミンは、還元により所望のアミンに変換できる対応するアジドおよびシアノ類似体を包含する。（対応するシアノ化合物は、側鎖に１個少ない炭素原子を有し、シアノ基の炭素原子を除外したものである。）
【００３４】
適当なエステル形成カルボキシル保護基は、所望により置換されていてもよいＣ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、Ｃ３−７シクロアルキル、アリール、アリールＣ１−６アルキルおよびトリＣ１−６アルキルシリル基を包含する。
【００３５】
本明細書において用いる場合、「アリール」なる語は、フェニルおよびナフチルを含み、各々、所望により５個までのフッ素、塩素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、ハロ（Ｃ１−６）アルキル、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシ、Ｃ１−６アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、Ｃ１−６アルコキシカルボニル（Ｃ１−６）アルキル、ニトロ、アリールオキシカルボニルオキシ、アリールＣ１−６アルキルオキシカルボニルオキシ、Ｃ１−６アルキルオキシカルボニルオキシ、Ｃ１−６アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アリールＣ１−６アルキルカルボニルオキシまたはアリールＣ１−６アルキルオキシカルボニル基で置換されていてもよい。
【００３６】
「ハロゲン」なる語は、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素を意味する。ハロおよびハライドなる語も、それに応じて解釈されるべきである。
本明細書において記載する所望により置換されていてもよい保護基の任意の置換基の例は、ハロゲン、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルチオ、シアノ、ニトロ、カルボキシ、カルボン酸、Ｃ１−６アルキルエステル、カルバモイル、アミノ、モノ（Ｃ１−６）アルキルアミノおよびジ（Ｃ１−６）アルキルアミノから選択される３個までの基（同一または異なっていてもよい）を包含する。
【００３７】
特に適当なエステル形成カルボキシル保護基は、通常の条件下で除去できるものである。このような基は、メチルおよびエチルなどのＣ１−６アルキル、ベンジル、ｐ−メトキシベンジル、ベンゾイルメチル、ｐ−ニトロベンジル、４−ピリジルメチル、２，２，２−トリクロロエチル、２，２，２−トリブロモエチル、ｔ−ブチル、ｔ−アミル、アリル、ジフェニルメチル、トリフェニルメチル、アダマンチル、２−ベンジルオキシフェニル、４−メチルチオフェニル、テトラヒドロフル−２−イル、テトラヒドロピラン−２−イル、ペンタクロロフェニル、アセトニル、ｐ−トルエンスルホニルエチル、メトキシメチル、またはシリル、スズまたはリン含有基を包含する。
【００３８】
カルボキシル基は、特定のエステル基に適切な通常の方法により、前記エステルのいずれから再生してもよい。例えば、分子の残りの部分が実質的に影響を受けない条件下での酸および塩基触媒加水分解、または酵素触媒加水分解、または水添分解による。
本発明の化合物またはその塩またはアミノ保護誘導体における好ましいカルボキシル保護基はベンジルである。
【００３９】
アミノ基に関して適当な保護基は、容易に開裂するものである。アミノ基を保護する方法および得られた保護誘導体の開裂法の考察は、例えば、「有機合成における保護基」（”Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”）（ティー・ダブリュ・グリーンおよびピー・ジー・エム・ワッツ（Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ ＰＧＭ Ｗｕｔｓ）（ウィリー−インターサイエンス（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ），ニューヨーク，１９９１）に記載されている。
【００４０】
アミノ保護基の適当な例は、前記したマスキング基；所望により置換されていてもよいＣ１−６アルキルカルボニル；アリールカルボニル、アリールＣ１−６アルキルカルボニル；（ヘテロサイクリル）カルボニル（ここに、ヘテロサイクリル基は、酸素、窒素および硫黄から選択される４個までのヘテロ原子を含む５または６員芳香族環である）；またはフェニル環がＣ１−４アルキル、Ｃ１−４アルコキシ、トリフルオロメチル、ハロゲンまたはニトロから選択される１または２個の置換基で所望により置換されていていてもよいベンジルオキシカルボニルなどのカルバメートを与える基；Ｃ１−４アルキルオキシカルボニル、例えば、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル；またはＣ１−４アルコキシ、ハロまたはニトロから選択される３個までの置換基でアルキル基が所望により置換されていていてもよいＣ１−４アルキルオキシカルボニル、例えば、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニルまたは１−クロロエトキシカルボニルがある。
【００４１】
本発明の化合物中に存在するアミノ基の好ましいＮ−保護基の例は、後記するようなペプチド化学のアミノ保護に関して通常公知のものを包含する。
本発明の化合物またはその塩またはそのカルボキシ保護誘導体における特に好ましいアミノ保護基はベンジルオキシカルボニルである。
適当なグアニジノおよびアミジノ保護基は、ニトロ、ベンジルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、トルエンスルホニル、および２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニルを包含する。
【００４２】
望ましくは、化合物は核酸物質を含まない単離された形態である。化合物は、適当には、例えば実質的に純粋であり、より適当には、少なくとも７５％の純度、好ましくは少なくとも８５％の純度、例えば９０〜１００％の純度であるのが好ましい。好ましい単離形態の一例としては、固体形態であり、より好ましくは結晶形態である。しかし、純粋でない形態の化合物を使用してはいけないわけではない。
【００４３】
本発明の化合物を有機溶媒から結晶化または再結晶させる場合、結晶化溶媒が結晶生成物中に存在する場合がある。本発明は、このような溶媒和物も包含する。同様に、本発明の化合物は水を含有する溶媒から結晶化または再結晶してもよい。このような場合、水和水が形成される。本発明は、化学量論的水和物ならびに凍結乾燥などのプロセスにより生じる種々の量の水を含有する化合物も包含する。
【００４４】
本発明に含まれる化合物またはその塩またはその保護形態は以下のものを包含する：
（Ａ）Ｎ２−（２−カルボキシエチル）−Ｓ−アルギニン
（Ｂ）（２Ｓ）−５−グアニジノ−２−（２−オキソ−アゼチジン−１−イル）ペンタン酸
（Ｃ）トレオ−３−ヒドロキシ−５−グアニジノ−２−（２−オキソ−アゼチジン−１−イル）ペンタン酸、好ましくは２Ｓ−３Ｒ
（Ｅ）（２Ｓ）−５−アミノ−２−（２−オキソ−アゼチジン−１−イル）ペント−２−エン酸
（Ｇ）Ｎ２−（２−カルボキシエチル）−３−ヒドロキシ−アルギニン
【００４５】
本明細書において用いる「酵素系」なる語は、１個の酵素または１連の酵素を意味する。系は、適当ならば補助基質および補助因子を含むのが適当である。
不整炭素原子を有する化合物は、立体異性体として存在する。本発明は、本発明の化合物のすべての立体異性体を包含し、他の異性体を含まないかまたは他の異性体と任意の割合で混合されたもののいずれであっても、その使用を包含し、従って、例えばエナンチオマーのラセミ混合物を包含する。本発明の化合物またはその塩の溶媒和物、特に水和物も本発明の範囲に含まれる。
【００４６】
本発明の方法は、適当には、例えば、無細胞系、即ち、生きた細胞の非存在下で行うのが適当である。好ましくは、採用される酵素系は、微生物、特にストレプトミセス属由来のものである。別法として、酵素は遺伝子工学により製造してもよい。
無細胞系を採用した場合、無細胞抽出物は好ましくは、超音波処理または他の微生物の破壊により製造され、所望によりその後細胞片を除去し、溶液中に酵素系を残してもよい。
【００４７】
プロクラバミン酸（Ｆ）またはその塩を産生する酵素系は、例えばアミジノヒドロラーゼ酵素を含むのが適当である。
酵素は、本明細書に記載した実施例にしたがって調製するのが適当である。
【００４８】
基質に加えて、酵素反応混合物は、１またはそれ以上の他の補助因子を含有してもよい。通常、これらの補助因子は、別のマンガンイオン（Ｍｎ２＋）源を含む。
好ましい酵素源は、ストレプトミセス属、例えば、エス・クラブリゲルス
（Ｓ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ）、エス・ジュモンジネンシス（Ｓ．ｊｕｍｏｎｊｉｎｅｎｓｉｓ）、エス・カツスラハマヌス（Ｓ．ｋａｔｕｓｕｒａｈａｍａｎｕｓ）およびエス・リプマニイ（Ｓ．ｌｉｐｍａｎｉｉ）由来の株である。特に、以下の微生物の株が有用である：エス・クラブリゲルス ＡＴＣＣ２７０６４、エス・ジュモンジネンシス ＡＴＣＣ２９８６４、エス・カツラハマヌス Ｔ−２７２およびエス・リプマニイＮＲＲＬ３５８４。
【００４９】
好ましい酵素は、エス・クラブリゲルスＡＴＣＣ２７０６４由来のものである。
酵素は、通常の方法、特に適当な液体または半固体培地中、好気性条件下で微生物を培養することにより調製される。一般に、微生物が同化できる炭素および窒素源および微生物の成長に必須の無機塩栄養素が培養培地中に含まれる。
培地は、金属イオン、例えば鉄イオン源を含む。培養条件は、１０℃〜８０℃の温度、３〜１０の範囲のｐＨである。好ましい条件は、２０℃〜３０℃、ｐＨ５〜９、適当には例えば、約ｐＨ７で０．５〜５日間である。
【００５０】
酵素は、破壊細胞調製物からの濾液または粗細胞ホモジネートなどの不純な状態で得られた場合、精製された形態、部分的に精製された形態で単離され、用いられる。
最適には、酵素は、例えば少なくとも部分的に精製され、前駆体の分解を触媒する他の酵素、酵素、またはクラバム核を除去したものである。酵素は、不溶性ポリマー支持体に付着していてもよい。
【００５１】
本発明のプロセスは、一般に水性培地中で行われ、反応混合物はｐＨ４〜９の範囲に維持されるのが適当であり、より適当には、例えば６．５〜９．０、好ましくは約ｐＨ８．５に維持する。ｐＨは例えば緩衝液、例えば、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ７）を用いて調節するのが適当である。また、ｐＨは適当な酸または塩基を添加することにより調節してもよい。反応温度は、用いた酵素に適したものであり、一般に１５℃〜６０℃、好ましくは約３０℃である。反応時間は反応物の濃度などの因子および補助因子、温度およびｐＨに依存する。
【００５２】
化合物またはその塩は、例えば、酵素と混合する前に緩衝液中に溶解するのが適当である。前駆体溶液の濃度は、前駆体の溶解度に依存し、一般に前駆体溶液の濃度は、５％ｗ／ｖ〜０．００１％ｗ／ｖの範囲である。反応終了後、酵素を反応混合物から分離し、化合物またはその塩を通常の方法により単離する。化合物またはその塩の初期精製はクロマトグラフィー工程を含むのが好都合である。存在するカルボキシルおよび／またはアミノ基が保護された形態で化合物を単離し、所望により、保護基を続いて除去して、純粋な形態の化合物を得る。
【００５３】
無細胞系を採用する代わりに、本発明のプロセスは、完全な微生物を用いて行う。前駆体化合物またはその塩を次に微生物と接触させ、化合物またはその塩を得る。微生物は、増殖培養物、静止培養物、洗浄菌糸体、固定化細胞またはプロトプラストの形態であってもよい。
本発明の化合物は、酵素合成、例えば無細胞合成またはストレプトミセス属の適当な株、例えば、エス・クラブリゲルス、エス・ジュモンジネンシス、エス・カツラハマヌスまたはエス・リプマニイからの単離により調製してもよい。適当には、化合物の単離は、菌糸体の破壊、細胞内容物からの化合物の単離が含まれる。典型的には、化合物の精製された形態での単離は、クロマトグラフィー工程を含む。別法として、化合物は不純な形態または部分的に純粋な形態で用いてもよい。
【００５４】
化合物の塩は、出発物質の塩を用いるか、または調製した遊離化合物を続いて塩に変換する前記方法により調製してもよい。また、所望により、調製した化合物の塩を遊離の塩形態にしていない化合物または化合物の他の塩の形態に変換もよい。
化合物の塩は、例えば、化合物を適当な酸または塩基で処理することにより製造される。前記プロセスにより製造された化合物およびその塩は、通常の方法により回収される。
【００５５】
２個のキラル中心を有する化合物を、所望により、例えば適当な溶媒、例えばメタノールまたは酢酸エチルまたはその混合物からの分別結晶化によりエナンチオマーのジアステレオアイソマー対に分離する。１対のエナンチオマーまたは他のエナンチオマー対を通常の手段、例えば、光学活性な塩を分割剤として用いるかまたは、例えばサブチリシンなどの適当な酵素を用いた保護基の立体選択的除去により個々の立体異性体に分離してもよい。化合物のジアステレオアイソマーの混合物において、ジアステレオアイソマーの割合は、非求核塩基、例えば、１，５−ジアザビシクロ［４．３．０］ノン−５−エンでの処理により変わる。
【００５６】
分割剤として用いられる適当な光学活性な化合物は「トピックス・イン・ステレオケミストリー」（’Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ’，Ｖｏｌ．６，ウィリー−インターサイエンス（Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ），１９７１，アリンジャー・エヌ・エルおよびエリエール・ダブリュ・エル（Ａｌｌｉｎｇｅｒ，Ｎ．Ｌ．およびＥｌｉｅｌ，Ｗ．Ｌ．）編）に記載されている。
また、化合物のいずれのエナンチオマーも立体配置が既知の光学的に純粋な出発物質を用いた立体特異的合成により得られる。
【００５７】
本発明は、またクラブラン酸の合成において用いる化合物またはその塩も含む。
本発明のさらに別の態様において、クラブラン酸またはその塩の調製法が提供され、該方法は、本発明の化合物またはその塩を酵素系で処理することからなる。本発明により、このような方法により調製されたクラブラン酸またはその塩も提供される。
好ましくは、採用した酵素系は、微生物、特にストレプトミセス属由来のものである。適当には、プロセスを無細胞系で行う。適当には、クラブラン酸の無細胞合成法は、化合物またはその塩をストレプトミセス属の抽出物で処理することからなる。
【００５８】
ストレプトミセス属がクラブラン酸産生種であるのが適当である。
ストレプトミセス属からの抽出物は、酵素系を含む。無細胞抽出物は、好ましくは、ストレプトミセス細胞の超音波処理または他の破壊により得られ、所望によりその後、細胞片を除去し、溶液または懸濁液中に酵素系を残してもよい。酵素系は、いずれかの源由来のものである。例えば、酵素は、遺伝子工学により産生されるのが適当である。好ましい酵素系は、ストレプトミセスのクラブラン酸産生種、例えば、エス・クラブリゲヌス、エス．ジュモンジネンシスおよびエス・カツラハマヌスのクラブラン酸産生種またはこれに由来の株、例えば突然変異株由来のものである。特に、これらの微生物の以下の株が適当である：エス・クラブリゲルスＡＴＣＣ２７０６４、エス．ジュモンジネンシスＡＴＣＣ２９８６４およびエス・カツラハマヌスＴ−２７２。
【００５９】
無細胞系を用いる代わりに、前記プロセスは、完全な微生物を用いて行ってもよい。前駆体化合物またはその塩を次に微生物と接触させ、クラブラン酸またはその塩を得る。微生物は、増殖培養物、静止培養物、洗浄菌糸体、固定化細胞またはプロトプラストの形態であってもよい。
酵素系は、微生物を通常の方法、特に適当な液体または半固体培地中で好気性条件下で培養することにより調製する。一般に、微生物が同化できる炭素および窒素源および微生物の成長を促進するために用いられる無機塩栄養素が培養培地中に含まれる。培養条件は、１０℃〜８０℃の温度、３〜１０の範囲のｐＨである。好ましい条件は、２０℃〜３０℃、ｐＨ５〜９、適当には例えば、約ｐＨ７で０．５〜５日間である。酵素系を単離し、破壊細胞調製物からの濾液または粗細胞ホモジネートとして不純な状態で得られた場合、精製された形態、部分的に精製された形態で用いる。
【００６０】
最適には、酵素系は、少なくとも部分的に精製され、前駆体、酵素または反応生成物の分解を触媒する他の酵素を除去したものである。酵素を不溶性支持体に付着させてもよい。
プロセスは、一般に水性培地中で行われ、反応混合物はｐＨ４〜９の範囲に維持されるのが適当であり、より適当には、例えば６．５〜８．５に維持する。ｐＨは、適当には、当該分野にて知られている通常の緩衝液を用いて調節される。一例として、例えば、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ７）を用いる。反応温度は、用いた酵素に適したものであり、一般に１５℃〜４０℃、好ましくは約３０℃である。反応時間は反応物の濃度、温度およびｐＨなどの因子および補助因子に依存する。
【００６１】
化合物またはその塩は、例えば、酵素系と混合する前に緩衝液中に溶解するのが適当である。濃度は、化合物またはその塩の溶解度に依存する。適当には、化合物またはその塩の溶液の濃度は、５％ｗ／ｖ〜０．００１％ｗ／ｖの範囲である。反応終了後、酵素を反応混合物から分離し、クラブラン酸またはその塩を通常の方法により単離する。クラブラン酸またはその塩の初期精製はクロマトグラフィー工程を含むのが好都合である。
本発明の他の具体例において、化合物またはその塩を前記の酵素系で処理することによりクラブラン酸またはその塩に変換する方法が提供される。反応は、化合物またはその塩の中間体を単離せずに、無細胞合成により行うのが適当である。あるいは、化合物のクラブラン酸への変換は、直接完全な微生物を用いて行う。
以下の実施例は、本発明を例示するものである。すべてのパーセンテージは、重量基準であり、すべての割合は、容積基準である。
【００６２】
【実施例】
実施例−新規化合物の調製
化合物Ａ
Ｎ２−（２−カルボキシエチル）アルギニン二塩酸塩
調製例１
５−グアニジノ−２−（２−オキソアゼチジン−１−イル）ペンタン酸（４６ｍｇ、０．１８ミリモル）を１Ｍ ＨＣｌ（５ｍｌ）に溶解し、室温で１時間撹拌する。反応混合物を蒸発乾固させ、水と共沸し、乾燥して、潮解性白色固体のＮ２−（２−カルボキシエチル）アルギニン二塩酸塩を得る。
（Ｃ９Ｈ１８Ｎ４Ｏ４・２ＨＣｌ・Ｈ２Ｏとして、測定値：Ｃ＝３１．６９；Ｈ＝６．５７；Ｎ＝１７．０８；計算値：Ｃ＝３２．０５、Ｈ＝６．５８、Ｎ＝１６．６２％）；ｍ／ｅ（ＦＡＢ、グリセロール）ＭＨ＋ ２４７（Ｃ９Ｈ１８Ｎ４Ｏ４として）計算値２４７；νｍａｘ（ＫＢｒ）３４１０、２９２５、１７２５および１６６１ｃｍ−１；δＨ（２５０ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）１．５５〜１．８３（２Ｈ，ｍ）、１．８５〜２．１５（２Ｈ，ｍ）（３−Ｈ，４−Ｈ）、２．８５（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，２’−Ｈ）、３．２３（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）、３．３４（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ）（５−Ｈ，１’−Ｈ）、３．９３（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２−Ｈ）
【００６３】
調製例２
ａ）Ｎ２−（２−カルボメトキシエチル）−Ｎω−ニトロ−Ｓ−アルギニンベンジルエステルの調製
Ｎω−ニトロ−Ｓ−アルギニンベンジルエステルジトシレート（６．５６ｇ、０．０１モル）（エイチ・オーツカ（Ｈ．Ｏｔｓａｋａ）ら、ビュレティン・オブ・ケミカル・ソサイエティ・ジャパン（Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊａｐ．）３９，８８２，１９６６と同様にして調製）、トリエチルアミン（１３．９ｍｌ、０．１モル）およびアクリル酸メチル（９ｇ、０．１０５モル）のエタノール（１００ｍｌ）中混合物を室温で４日間撹拌する。溶媒を真空下に除去し、残渣をクロロホルム中に溶解し、水で洗浄する。クロロホルム溶液を乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濾過し、蒸発させてガム状物質を得る（８．９ｇ）。この物質を、５％ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３を溶離剤として用いてシリカゲル上クロマトグラフィーに付し、再び５〜１０％ｎ−ＰｒＯＨ／ＣＨＣｌ３で溶出して、標記化合物を得る（２．２４ｇ、６０％）。νｍａｘ（ＫＢｒ）３３１０、１７３８、１６３０、１６００および１２６５ｃｍ−１；δＨ（２５０ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）１．３〜１．９（５Ｈ，ｍ）、２．３（２Ｈ，ｍ）、２．７〜２．８５（１Ｈ，ｍ）、２．８５〜３．０（１Ｈ，ｍ）、３．２〜３．４（３Ｈ，ｍ）、３．６９（３Ｈ，ｓ）、５．１７（２Ｈ，ｓ）、７．３６（５Ｈ，ｍ）、７．６（２Ｈ，ｓ）、８．７５（１Ｈ，ｓ）；ｍ／ｚ（ＮＨ３ Ｃ．Ｉ．）（測定値ＭＨ＋ ３９６ Ｃ１７Ｈ２５Ｎ５Ｏ６としての計算値３９６）
【００６４】
ｂ）Ｎ２−（２−カルボキシエチル）−Ｓ−アルギニン（化合物Ａ）の調製
前記メチルベンジルエステル（前記（ａ）において調製）（２．２ｇ、５．５６ミリモル）、水酸化ナトリウム（０．４５ｇ、１１ミリモル）のＴＨＦ／Ｈ２Ｏ（１：１（２０ｍｌ））中溶液を室温で４時間撹拌する。溶液のｐＨを希ＨＣｌで６にし、溶媒を蒸発させ、その残渣をＨ２Ｏ／ＭｅＯＨ／ＡｃＯＨ（２５ｍｌ：２５ｍｌ；５ｍｌ）中に溶解し、１０％Ｐｄ／Ｃ（５００ｍｇ）上で水素添加する。触媒を濾過により除去し、溶液を蒸発乾固し、残渣を水中に溶解し、凍結乾燥する。メタノールを残渣に添加して、白色固体の標記化合物Ａを得る（６２６．４ｍｇ、４５％）。融点２６０℃分解。
（Ｃ９Ｈ１８Ｎ４Ｏ４・１／２Ｈ２Ｏとして、測定値：Ｃ＝４２．３３、Ｈ＝７．３５、Ｎ＝２０．６；計算値：Ｃ＝４２．３５、Ｈ＝７．５、Ｎ＝２１．９５％；νｍａｘ（ＫＢｒ）２９３９、１６２４、１４０１ｃｍ−１；δＨ（２５０ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）１．３〜１．７５（２Ｈ，ｍ）、１．８〜２．２（２Ｈ，ｍ）、２．５４（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ）、３．１３〜３．２８（４Ｈ，ｍ）、３．６３（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．１Ｈｚ）；ｍ／ｚ（ＦＡＢ、チオグリセロール）測定値：ＭＨ＋２４７、Ｃ９Ｈ１８Ｎ４Ｏ４としての計算値２４７。
【００６５】
化合物Ｂ
５−グアニジノ−２−（２−オキソアゼチジン−２−イル）ペンタン酸
５−アミノ−２−（２−オキソアゼチジン−１−イル）ペンタン酸（３１０ｍｇ、１．５９ミリモル）を水（３０ｍｌ）中に溶解し、炭酸カリウム（２４０ｍｇ、１．７４ミリモル）およびアミノイミノ−メタンスルホン酸（２６９ｍｇ、２．１７ミリモル）で処理し、室温で６時間撹拌する。反応混合物を蒸発乾固させ、水（４．５ｍｌ）中に溶解し、これにエタノール（３０ｍｌ）を添加し、溶液を素早く１５％水性エタノール中シリカ６０のカラム上クロマトグラフィーに付し、５−グアニジノ−２−（２−オキソアゼチジン−１−イル）ペンタン酸（２２０ｍｇ、５４％）を得る。
（Ｃ９Ｈ１６Ｎ４Ｏ３・１．５Ｈ２Ｏとして、測定値：Ｃ＝４２．５６、Ｈ＝７．５２、Ｎ＝２２．１５；計算値：Ｃ＝４２．３４、Ｈ＝７．５０、Ｎ＝２１．９５％）；νｍａｘ（ＫＢｒ）３４２３、１７２０、１６５８、１６３７ｃｍ−１；δＨ（２５０ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）１．４５〜１．６３（２Ｈ，ｍ）、１．６３〜１．９４（２Ｈ，ｍ）（３−Ｈおよび４−Ｈ）、２．８０〜３．００（２Ｈ，ｍ，３’−Ｈ）、３．１７（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，５−Ｈ）、３．２６〜３．４６（２Ｈ，ｍ，４’−Ｈ）、４．０３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．１および９．５Ｈｚ，２−Ｈ）および５−アミノ−２−（２−オキソアゼチジン−１−イル）ペンタン酸（９０ｍｇ、２９％）を得る。
【００６６】
化合物Ｃ
３−ヒドロキシ−５−グアニジノ−２−（２−オキソアゼチジン−１−イル）ペンタン酸
プロクラバミン酸（８４．５ｍｇ、０．４２ミリモル）を、５−グアニジノ−２−（２−オキソアゼチジン−１−イル）ペンタン酸（化合物Ｂ）に関して前記したようにアミノイミノメタンスルホン酸で処理して、白色固体の３−ヒドロキシ−５−グアニジノ−２−（２−オキソアゼチジン−１−イル）ペンタン酸を得る（６２ｍｇ、５３％）（Ｃ９Ｈ１６Ｎ４Ｏ４・２Ｈ２Ｏとして、測定値：Ｃ＝３８．７６、Ｈ＝６．８３、Ｎ＝１９．５４；計算値：Ｃ＝３８．５７、Ｈ＝７．１９、Ｎ＝１９．９９％）；ｍ／ｅ（ＦＡＢ、チオグリセロール）ＭＨ＋２４５、Ｃ９Ｈ１６Ｎ４Ｏ４としての計算値２４５；νｍａｘ（ＫＢｒ）３３６３、１７１９、１６７３、１６００ｃｍ−１；δＨ（４００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）１．７３〜１．９３（２Ｈ，ｍ，４−Ｈ）、３．０７（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，３’−Ｈ）、３．４１（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，５−Ｈ）、３．４２〜３．６０（１Ｈ，ｍ）、３．６０〜３．６８（１Ｈ，ｍ）（４’−Ｈ）、４．１２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，２−Ｈ）、４．２２（１Ｈ，ｍ，３−Ｈ）。
【００６７】
（２ＳＲ，３ＲＳ）−１，２，３’−［１３Ｃ３］−［Ｎ２−（２−カルボキシエチル）−３−ヒドロキシ−５−グアニジノ−ペンタン酸の調製
（１３Ｃで標識したＧ）
不純な（２ＳＲ，３ＲＳ）−１，２，３’−［１３Ｃ３］−３−ヒドロキシ−５−グアニジノ−（２−オキソ−アゼチジン−１−イル）−ペンタン酸（２７０ｍｇ）を１Ｍ ＨＣｌ（５ｍｌ）中に溶解し、室温で２時間静置する。溶液を蒸発させ、水（１．５ｍｌ）中に溶解し、ダウエクス（Ｄｏｗｅｘ）５０Ｗｘ８イオン交換樹脂（Ｈ＋型）のカラム（３ｘ１．５ｃｍ）に付す。カラムを水（２０ｍｌ）で洗浄し、水酸化アンモニウム（０．４Ｍ）で溶出し、５ｍｌフラクションを集める。サカグチ反応に陽性を示すフラクションを冷却し、凍結乾燥して、吸湿性固体の標記化合物を得る（９９．２ｍｇ）。１３Ｃ３Ｃ６Ｈ１８Ｎ４Ｏ５・１．５Ｈ２Ｏとして、測定値：Ｃ＝３６．８６、Ｈ＝６．０４、Ｎ＝１９．８８％；計算値：Ｃ＝３７．３６、Ｈ＝７．３、Ｎ＝１９．３７％；δＨ（４００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）１．５〜１．９５（１Ｈ，ｍ）、１．９５〜２．１５（１Ｈ，ｍ）、２．６５（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．１Ｈｚ）、３．１〜３．２８（ｍ）、３．３〜３．４（ｍ）および３．４〜３．５（４Ｈ）、３．７２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．５および４．５Ｈｚ）、４．０（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ）；δＣ（１００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）６８．２９（ｄ，Ｊ＝５２Ｈｚ，Ｃ−２）、７２．５２（ｄ，Ｊ＝５２Ｈｚ，Ｃ−１）、１７９．６４（ｓ，Ｃ−２’）
【００６８】
実施例１
アミジノヒドロラーゼ酵素
１．１ アミジノヒドロラーゼ酵素の調製および反応
酵素の粗調製物を、エス・クラブリゲルスＡＴＣＣ２７０６４菌糸体（ＥＰ−Ａ−０３４９１２１参照）からの４８時間再単離物より、遠心分離および５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．０）中超音波処理に付して調製する。
酵素調製物による（Ｃ）から（Ｆ）の加水分解は、１当量の尿素の産生と定量的である。
酵素調製物を５０ｍＭトリス、５０μＭ ＭｎＣｌ２、２５０μｇ／ｍｌ化合物ＢまたはＣおよび５ｍＭアセトヒドロキサミン酸と一緒に培養する。アセトヒドロキサミン酸を加え、抽出物内のウレアーゼ活性を阻害する。混合物をｐＨ８．５、２８℃で１５分以上培養する。
【００６９】
反応を停止させ、産生された尿素を「シグマ（Ｓｉｇｍａ）」キット５３５Ｂを用いて測定する。２種の化合物ＣおよびＢを個々に酵素調製物と共に培養し（２８℃）、あるならばその喪失をｈｐｌｃによりモニターする。
誘導体ＣおよびＢを加水分解してそれぞれＦおよびＤにし、反応は酵素により媒介される。
Ｃの加水分解の速度は、ｈｐｌｃおよび、プロクラバミン酸（Ｆ）およびデヒドロキシプロクラバミン酸（Ｄ）の産生で測定するとＢよりも著しく速い（＞１００）。
ＣからＦへの加水分解は、１当量の尿素の産生と定量的である。Ｂの加水分解は完了しないが、尿素の産生は生成したＤの量と当量である。
【００７０】
条件を最適化する実験から以下のものが明らかになる：
ａ） 前記定義の式Ｃの化合物またはその塩を前記定義のプロクラバミン酸またはその塩に変換する能力；
ｂ） 酵素活性は、Ｍｎ２＋の存在下に向上し、最適のＭｎ２＋濃度は約５０μＭである；
ｃ） 緩衝液のｐＨプロフィルは燐酸およびホウ酸に基づく緩衝液がＴＲＩＳ、炭酸塩／炭酸水素塩またはグリシン緩衝液と比べた場合、酵素活性を阻害することを示す
ｄ） 緩衝液の塩基性がｐＨ９．０に向かって強くなるほど酵素活性は強くなると思われる。しかし、種々の緩衝液のｐＨでの化合物の安定性の研究により、化合物は、ｐＨ９．０以上で不安定になることがわかる。Ｃのプロクラバミン酸への酵素の最大変換率は、５０ｍＭ ＴＲＩＳ中ｐＨ８．５で起きる。
ｅ） 有機溶媒（例えば、メタノール、アセトニトリル）を添加して、酵素反応を停止することは、尿素またはｈｐｌｃ分析のいずれかと干渉する。したがって、サンプルをアセトン／ドライアイス（−７０℃）浴中に入れることにより反応を停止し、ただちに検定の直前まで−２０℃の冷凍庫に移す。
この酵素は、アルギニンを開裂しない（検出できる割合で）が、（２Ｓ）−５−グアニジノ−２−（２−オキソ−アゼチジン−１−イル）ペンタン酸を開裂することが判明した。
アルギナーゼ活性は、精製（以下の１．２）の間に、アミジノヒドロラーゼ活性から区別される。
【００７１】
１．２ アミジノヒドロラーゼ精製
実験
エス・クラブリゲルス細胞を標準的炭水化物培地中で成長させ、収穫し、以下の緩衝液中で超音波処理する：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−酢酸（Ｔｒｉｓ−Ａｃ）、５０μＭＭｎＣｌ２、１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、１ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）、ｐＨ８．０。前記緩衝液に対して透析した後、超音波処理物をイオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥ−セファロース・ファースト・フロー（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ）、ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））を用いて、０〜１Ｍ ＮａＣｌ勾配溶出で分別する。酵素尿素産生をシグマ尿素キット５３５Ｂを用い、ウレアーゼ活性を阻害するのに５ｍＭアセトヒドロキサミン酸を添加して評価する。各フラクションを各基質としてＳ−アルギニンおよび化合物Ｃで２回分析し、アルギナーゼおよびアミジノヒドロラーゼ活性を測定する。両活性は、約０．５Ｍ ＮａＣｌ（カラム頂上部）で溶出し、特異性活性は、各々、１．９倍および２．４倍に増加する。
この方法から得た活性フラクションを金属キレートアフィニティーカラムに付す前に５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ａｃ／０．５Ｍ ＮａＣｌ／ｐＨ８．０に対して透析する。これをＣｕＳＯ４７５％容量イミノ二酢酸−アガロース（シグマ）を用いて調製し、前記緩衝液中平衡化する。カラムを０〜２００ｍＭグリシン勾配で溶出し、鋭いアミジノヒドロラーゼ活性のピークを得る。このピークはアルギナーゼ活性も示すが、弱い。
【００７２】
活性フラクションをプールし、リシン−アガロースアフィニティーカラムにかける前にファーマシア（Ｐｈａａｒｍａｃｉａ）ＰＤ１０カラム上で脱塩する。リシンは、多くのアルギナーゼを阻害することが知られているので、有用なアフィニティーリガンドであることが予想される。しかし、アミジノヒドロラーゼ活性は、カラム処理により保持されない。（恐らく、カラムに強く結合するため、アガロース活性はこのカラム処理後に失われる）。洗浄フラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析およびリス−アガロースカラムからの溶出液は洗浄フラクション中３３ｋＤで強いバンドを示す。これは、もっともよく知られているアルギナーゼである。しかし、アミジノヒドロラーゼおよびアルギナーゼが同じ酵素であるかどうかを決定するためには、さらに精製することが必要である。
【００７３】
これは、ＨＰＬＣゲル濾過（ＴＳＫ Ｇ３０００ ＳＷ ＸＬカラム ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ａｃ／５０μＭ ＭｎＣｌ２ ｐＨ７．２、流速０．２ｍｌ／分）を用いて達成される。リシン−アガロースカラムからの洗浄フラクションを凍結乾燥し、カラムに注入する前に少量の緩衝液中に再懸濁する。フラクションを集め、アミジノヒドロラーゼおよびアルギナーゼ活性に関して分析する。アミジノヒドロラーゼ活性はすべて、１つのフラクション中に存在するが、アルギナーゼ活性はどのフラクションにおいても検出されず、６時間の反応後、アミジノヒドロラーゼフラクションは依然として検出可能なアルギナーゼ活性を示さない。
【００７４】
ゲル濾過カラムをタンパク標準を用いて使用前に校正し、測定値をもとのアミジノヒドロラーゼのＭｒにする。これを３５０＋／−５０ｋＤで計算する。これはＳＤＳ−ＰＡＧＥによるとサブユニットＭｒより約１０倍大きい。このことは、非変性タンパク質が複数の状態で存在することを示す。
フラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析から、アミジノヒドロラーゼを含有するフラクションは３３ｋＤで強いバンドを有することがわかる。
【００７５】
活性サンプルからのウェスタンブロットを標準的タンパク配列技術により配列決定する。得られた配列は以下のとおりである：
タンパク質配列：ＩＤＳＨＶＳＰＲＹＡＱＩＰＴＦＭ
ｐＢＲＯＣ４４（ＥＰ−Ａ−０３４９１２１参照）の配列決定から判明したオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の予想されるアミノ配列を、前記で得られたＮ−末端配列と比較すると、以下のとおりである：
遺伝子配列（予想されるアミノ酸配列）：ＭＥＲ／ＩＤＳＨＶＳＰＲＹＡＱＩＰＴＦＭ
配列を並べると、完全に一致する（１６／１６）。最初の３個のアミノ酸がもとのタンパク質の遺伝子配列に存在しないことは、翻訳後修飾が行われたことを示す。
【００７６】
実施例２
クラバミン酸シンターゼ
２．１ クラバミン酸シンターゼ精製
クラバミン酸シンターゼ（ＣＡＳ）をエス・クラブリゲルスからＥＰ Ａ０２１３９１４に記載された方法を用いて精製する。凍結乾燥した、部分的に精製した酵素（２５０ｍｇ）をＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，ウプサラ，スウェーデン）カラム（３０ｘ２．４ｃｍ）に付し、１００ｍｌの５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄し、５０から５００ｍＭの勾配のトリス緩衝液（ｐＨ７．０）で溶出する。ＣＡＳ陽性フラクションをプールし、固体硫酸アンモニウムで８０％飽和にする。懸濁液を氷上に１時間保持し、２４０００ｘｇで６０分間遠心分離する。沈殿を１ｍｌの５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．０）＋０．５ｍｌの３０％シュークロース溶液（同じ緩衝液で構成）中に再懸濁し、セファデクスＧ７５スーパーファイン（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラム（６３．５ｘ３．５ｃｍ）に付し、５０ｍＭトリス緩衝液で溶出する。ＣＡＳ陽性フラクションをプールし、固体硫酸アンモニウムで８０％飽和にし、得られた沈殿を遠心分離により除去し、−２０℃で貯蔵する。この段階でＣＡＳ酵素は、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動で調べた場合、分子量約４８０００ダルトンに相当する１つのバンドを生成する。等電点を等電点分画電気泳動法により測定するとｐＩ＝５．６５であった。
精製した酵素を以下の分析法を用いてＢからＣへの変換に関して分析する。
【００７７】
２．２ クラバミン酸シンターゼヒドロキシル化分析
すべての試薬は、特記しないかぎり、５０ｍＭトリス、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２および１０ｍＭ ＫＣｌからなり、５Ｍ ＨＣｌを添加してｐＨ７．５にする。１００ｍｌについて、トリス（０．６０６ｇ）、ＭｇＣｌ２（０．２０３ｇ）、ＫＣｌ（０．０７４ｇ）が必要である。可能ならば、酵素精製に用いたのと同じ緩衝液を用いる。以下の溶液が必要である：Ｈ２Ｏ中、補助因子ＦｅＳＯ４１０ｍＭ（２．７８ｍｇ／ｍｌ）；Ｈ２Ｏ中、Ｂ１００ｍＭ（２０ｍｇ／ｍｌ）；ジチオトレイトール（ＤＴＴ）１０ｍＭ（１．５ｍｇ／ｍｌ）および補助基質α−ケトグルタレート５０ｍＭ（二ナトリウム塩９．５ｍｇ／ｍｌ）。
【００７８】
前記溶液の混合物を調製し、得られた溶液の４０μｌを１．５ｍｌのエッペンドルフ管に移し、次に６０μｌのタンパク抽出物で処理して反応を開始する。反応物を周囲温度で５分間酸素の存在下で振盪せずに培養し、試験管の蓋を閉める。反応混合物を６０ｗ電子オーブン中で１５秒間パワー４でのフラッシュ加熱により急冷する。１〜２ｍｇ／ｍｌ以上のタンパク質濃度で沈殿が形成し、溶液が白濁する。サンプルをミクロ遠心分離器中で１３０００ｒｐｍで１０秒間回転させ、サンプルをドライアイス上で貯蔵する。２５マイクロリットルアリコートを、ＯＤＳカラム（２５０ｘ４．６ｍｍ、ミリＱ Ｈ２中１ｍｌ／分で平衡化、０．２ＡＵＦＳ、ラムダ＝２１８ｎｍ、１ｃｍ／分）上に注入する。生成物Ｃは約４．５分、基質Ｂは約８分で溶出する。
【００７９】
２．３ 化合物のＣＡＳおよび組換えＣＡＳとの培養
一般的方法
「ＣＡＳ」は通常のクラブラン酸産生株ストレプトミセス・クラブリゲルスから調製されるクラバミン酸シンターゼを意味し、「組換えＣＡＳ」は例えばＥＰ３４９１２１（ビーチャム・グループ・パブリック・リミテッド・カンパニー
（Ｂｅｅｃｈａｍ Ｇｒｏｕｐ ｐｌｃ））にしたがって調製されたクラバミン酸シンターゼを意味する。
【００８０】
反応生成物の単離が必要な場合、ＣＡＳ（または組換えＣＡＳ）を１０ｍＭ炭酸水素アンモニウム緩衝液＋１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＫＣｌおよび１ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）（ｐＨ７．５）中ＰＤ−１０またはＮＡＰ−５ Ｇ−２５セファデクスゲル濾過カラムのいずれかを用いて交換する。ＰＤ−１０カラムの場合、２ｍｌ酵素溶液を緩衝液で平衡化したカラムに付し、３．５ｍｌの緩衝液で溶出する。ＮＡＰ−５カラムの場合、０．５ｍｌの酵素をカラムに付し、１ｍｌの同じ緩衝液で溶出させる。
【００８１】
酵素溶液（１．２ｍｌ）を１０ｍｌガラスバイアル中２００μｌの１０ｍＭ硫酸鉄（ＩＩ）、２００μｌの１０ｍＭ ＤＴＴおよび２００μｌの５０ｍＭ α−ケトグルタレート（１０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ（ｐＨ７．５）で構成）と混合する。２００μｌの基質（特記しないかぎり、１０ｍｇ／ｍｌ水溶液）を添加することにより、反応を開始する。混合物を２７℃、２５０ｒｐｍでニュー・ブランズウィック・サイエンティフィック（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）Ｇ２４環境インキュベーター振盪器中で培養する。２０分後、さらに５０μｌアリコートのＤＴＴおよび硫酸鉄（ＩＩ）ストック溶液を添加する。合計４５分後、５ｍｌのアセトンを添加することにより反応を停止し、４℃で２５０００ｘｇで２分間（１４０００ｒｐｍ）ベックマンＪＡ−２０遠心分離ローターに付すことにより蛋白質を除去する。上清を次に１０ｍｌ洋ナシ型フラスコ中に移し、アセトンをロータリーエバポレーターで真空下に除去する。培養混合物を注意してドライアイス上に維持し、遠心分離後の操作間で起こりえる不安定な生成物の分解を避ける。残存する水性液体を４〜５滴の１％（ｖ／ｖ）水中水性ギ酸で約ｐＨ５．０に滴定し、少なくとも５時間凍結乾燥して水および残存する微量のアセトンを除去する。ＨＰＬＣにより生成物を単離する前に、粗混合物を５００ＭＨｚの１Ｈ ＮＭＲにより通常どおり分析する。以下の実験において、基質の変換の程度は、５００ＭＨｚの１Ｈ ＮＭＲスペクトルの適当なピークの積分にもとづく。収率は特に記載しないかぎり、精製された生成物に関する。
【００８２】
（２Ｓ ） −５−アミノ−２− （ ２−オキソアゼチジン−１−イル ） ペンタン酸
（Ｄ）の培養
化合物ＤをＣＡＳ（１．２ｍｇ、０．３４ ＩＵｍｇ−１）と共に前記の標準的方法にしたがって培養する。約７％のＥ−（２Ｓ）−５−アミノ−２−（２−オキソアゼチジン−１−イル）ペント−３，４−エノエート（Ｅ）への変換率が観察される（５００ＭＨｚの１Ｈ ＮＭＲスペクトルの積分により判定）。ＨＰＬＣ精製［ＯＤＳカラム（２５０ｘ７ｃｍ）２５ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３で１．５ｍｌ／分で平衡化］により保持容量９．１５ｍｌのＥ（９６μｇ）が単離される：δＨ（５００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）２．９５〜３．０（２Ｈ，ｍ，Ｈ−３’）、３．４〜３．５（２Ｈ，ｍ，Ｈ−４’）、３．５〜３．６（２Ｈ，ｍ，Ｈ−５）、５．８〜５．９（１Ｈ，ｍ，Ｈ−４）、５．９〜６．０（１Ｈ，ｍ，Ｈ−３）。Ａ ２Ｄ ＣＯＳＹ相関スペクトルは、提案されたＥの構造と一致し、約４．６ｐｐｍで残存するＨＯＤピーク下でシグナルを示す。ｍ／ｚ（電子照射）＝１８５（ＭＨ＋、１００％）。
【００８３】
化合物Ｄを粗組換えＣＡＳ（６ｍｇ、０．０３４ ＩＵ／ｍｇ−１）と共に標準的方法にしたがって培養する。約３０％のＥへの変換および＜５％のＦへの変換が観察される（５００ＭＨｚの１Ｈ ＮＭＲスペクトルの積分により判断）。ＨＰＬＣ精製［ＯＤＳ（２５０ｘ７ｃｍ）２５ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３で１．５ｍｌ／分で平衡化］により保持容量９．１５ｍｌのＥ（２００μｇ）、保持容量６．９ｍｌのＦ（＜＜５μｇ）が単離される。Ｅに関する分光分析データは部分的に精製したＣＡＳと共に培養することにより得られたものと一致する。Ｆの１Ｈ ＮＭＲスペクトル（５００ＭＨｚ）を完全に記録することはできないが、共鳴は提案される構造と一致する。ｍ／ｚ（電子照射）＝２０３（ＭＨ＋、１００％）。トレオ−５−アミノ−３−ヒドロキシ−２−（２−オキソアゼチジン−１−イル）ペンタン酸Ｆの場合、ｍ／ｚ（電子照射）＝２０３（ＭＨ＋、１００％）。粗培養混合物のＨＰＬＣ分析［ＯＤＳカラム（２５０ｘ４．６ｃｍ）、２５ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３、１ｍｌ／分］は２サンプルを混合した場合、Ｆが真のプロカルバミン酸Ｆ（３．１ｍｌ）と同一の保持容量を有することが示され、一方２サンプルを混合した場合、Ｆは合成エリスロ−５−アミノ−３−ヒドロキシ−２−（２−オキソアゼチジン−１−イル）ペンタン酸（即ち、エリスロ−プロカルバミン酸）（保持容量３．４ｍｌ）と明確に区別される。
【００８４】
（２Ｓ）−５−グアニジノ−２−（２−オキソアゼチジン−１−イル）ペンタン酸（Ｂ）の培養
化合物Ｂを部分的に精製したＣＡＳ（２ｍｇ、０．３ ＩＵｍｇ−１）と共に前記の標準的方法にしたがって培養する。８５％より大きな５−グアニジノ−３−ヒドロキシ−２−（２−オキソアゼチジン−１−イル）ペンタン酸Ｃへの変換が観察される（１Ｈ ＮＭＲスペクトル（５００ＭＨｚ）の積分により判断）。ＨＰＬＣ精製［ＯＤＳ（２５０ｘ４．６ｍｍ）、Ｈ２Ｏ、１ｍｌ／分］により保持容量７．５ｍｌの（Ｃ）（３４０μｇ）が単離される：δＨ（５００ＭＨｚ Ｄ２Ｏ）１．７〜１．８（１Ｈ，ｍ，Ｈ−４）、１．８〜１．９（１Ｈ，ｍ，Ｈ−４）、３．０（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝４Ｈｚ，Ｈ−３’）、３．３６（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，Ｈ−５）、３．５〜３．５５（１Ｈ，ｍ，Ｈ−４’）、３．５９〜３．６１（１Ｈ，ｍ，Ｈ−４’）、４．１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，Ｈ−２）、４．１５〜４．２（１Ｈ，ｍ，Ｈ−３）。２Ｄ ＣＯＳＹ相関スペクトルは、提案されたＣの構造と一致する。ｍ／ｚ（電子照射）＝２４５（ＭＨ＋、１００％）。この反応から残存するＢは回収されなかった。
【００８５】
化合物Ｂを粗組換えＣＡＳ（５．５ｍｇ、０．０Ｉ４ ＩＵ／ｍｇ）と共に標準的方法にしたがって培養する。８５％より大きなＣへの変換が観察される（１ＨＮＭＲスペクトル（５００ＭＨｚ）の積分により判断）。ＨＰＬＣ精製［ＯＤＳ（２５０ｘ４．６ｍｍ）、Ｈ２Ｏ、１ｍｌ／分］により保持容量７．５ｍｌのＣ（３６９μｇ）が単離される。Ｃに関する分光分析データは部分的に精製したＣＡＳと共に培養することにより得られたＣと一致する。
化合物Ｂを粗組み換えＣＡＳ（０．１８ｍｇ、０．３７ ＩＵ／ｍｇ）と共に標準的方法にしたがって培養する。８５％より大きなＣへの変換が観察される（１Ｈ ＮＭＲスペクトル（５００ＭＨｚ）の積分により判断）。ＨＰＬＣ精製［ＯＤＳ（２５０ｘ４．６ｍｍ）、Ｈ２Ｏ、１ｍｌ／分］により保持容量７．５ｍｌのＣ（３５０μｇ）が単離される。Ｃに関する分光分析データは部分的に精製したＣＡＳと共に培養することにより得られたＣと一致する。
【００８６】
Ｎ ２ −アセチル−Ｌ−オルニチンの培養
Ｎ２−アセチル−Ｌ−オルニチンを粗組換えＣＡＳ（６ｍｇ、０．０３５ ＩＵｍｇ−１）と共に標準的方法にしたがって培養する。約１７％の（２Ｓ）−２−アセトアミド−５−アミノ−３−ヒドロキシペンタン酸（Ｘ）への変換および約５％のＥ−（２Ｓ）−５−アミノ−２−アセトアミドペント−３，４−エン酸（Ｙ）への変換が観察される（１Ｈ ＮＭＲスペクトル（５００ＭＨｚ）の積分により判断）。ＨＰＬＣ精製［ボンダパクアミン（ｂｏｎｄａｐａｋａｍｉｎｅ）（２５０ｘ７ｍｍ）、ＯＤＳガードカラム、０．０１５Ｍ ＨＣＯ２Ｈ、２ｍｌ／分］により保持容量９．４〜１０．０ｍｌのＹ（３０μｇ）が単離される。さらに８〜９ｍｌののフラクションをＨＰＬＣ精製［ＯＤＳ（２５０ｘ４．６ｍｍ）、０．０５％水性ＨＣＯ２Ｈ、１ｍｌ／分］に付し、保持容量５．５〜９．０ｍｌのＸ（９９μｇ）を単離する。
【００８７】
Ｅ−（２Ｓ）−５−アミノ−２−アセトアミドペント−３，４−エノエート（Ｙ）の場合：δＨ（５００ＭＨｚ Ｄ２Ｏ）２．０（３Ｈ，ｓ，ＣＨ３−）、２．３３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝５Ｈｚ，Ｈ−５）、３．５５（１Ｈ，ｍ，Ｈ−２）、５．６５〜５．７５（１Ｈ，ｍ，Ｈ−４）、５．９〜６．０（１Ｈ，ｍ，Ｈ−３）。２Ｄ ＣＯＳＹ相関スペクトルは、Ｘの結合と一致する。ホモニュークレアデカップリング実験によるとＪ＝３Ｈ、４Ｈ＝１５．２Ｈｚで、これは二重結合がＥ立体化学を有することを示す。ｍ／ｚ（電子照射）＝１７３（ＭＨ＋、１００％）。
【００８８】
（２Ｓ）−２−アセトアミド−５−アミノ−３−ヒドロキシペンタン酸（Ｘ）の場合：δＨ（５００ＭＨｚ Ｄ２Ｏ）１．７５〜１．８５（２Ｈ，ｍ，Ｈ−４）、２．１（３Ｈ，ｓ，ＣＨ３−）、３．１５（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５Ｈｚ，Ｈ−５）、４．２〜４．２５（１Ｈ，ｍ，Ｈ−３）、４．３０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．５Ｈｚ，Ｈ−２）。２Ｄ ＣＯＳＹ相関スペクトルは、Ｙの結合と一致する。ｍ／ｚ（電子照射）＝１９１（ＭＨ＋、１００％）。
【００８９】
Ｎ ２ −アセチル−Ｌ−アルギニンの培養
Ｎ２−アセチル−Ｌ−アルギニンを粗組換えＣＡＳ（６ｍｇ、０．０３５ ＩＵｍｇ−１）と共に標準的方法にしたがって培養する。８５％より大きな（２Ｓ）−２−アセトアミド−５−グアニジノ−３−ヒドロキシ−ペンタン酸（Ｋ）への変換が観察される（１Ｈ ＮＭＲスペクトル（５００ＭＨｚ）の積分により判断）。ＨＰＬＣ精製［ＯＤＳ（２５０ｘ４．６ｍｍ） Ｈ２Ｏ １ｍｌ／分］により保持容量４．５ｍｌのＫ（３２０μｇ）が単離される。δＨ（５００ＭＨｚ Ｄ２Ｏ）１．８〜２．０（２Ｈ，ｍ，Ｈ−４）、２．１（３Ｈ，ｓ，ＣＨ３−）、３．１５（２Ｈ，ｍ，Ｈ−５）、４．２０〜４．２２（１Ｈ，ｍ，Ｈ−３）、４．２５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．５Ｈｚ，Ｈ−２）。２Ｄ ＣＯＳＹ相関スペクトルは（Ｋ）の結合と一致する。
ｍ／ｚ（電子照射）＝２３３（ＭＨ＋、１００％）。
【００９０】
Ｎ−α−アセチル−Ｄ−アルギニンをＣＡＳと共に培養すると、あるとしてもわずかな（５％未満）ヒドロキシル化生成物が得られる。このことは、ＣＡＳが（２Ｓ）立体化学特性を有する基質を変換することを示す。Ｎ−α−ベンゾイル−Ｄ−アルギニンをＣＡＳと共に培養してもＮ−α−ベンゾイル−Ｄ−アルギニンの変換は観察されない。これらの結果は、ＣＡＳがオルニチンおよびアルギニンの単純な誘導体を非活性化位置で酸化できることを示す。
【００９１】
クラバミン酸シンターゼ触媒反応の立体特異性の研究
（２Ｓ，３Ｓ）−５−グアニジノ−２，３−［２Ｈ２］−２−（２−オキソアゼチジン−１−イル）ペンタン酸および（２Ｓ，３Ｒ）−５−グアニジノ−３−［２Ｈ］−２−（２−オキソアゼチジン−１−イル）ペンタン酸をクラバミン酸シンターゼと共に培養すると、Ｃ−３で高度に立体特異的なヒドロキシル化が起こり、各々、プロ−Ｒプロトンまたは重陽子が除去される。
これらの結果は、ＣＡＳにより触媒された場合、Ｂのヒドロキシル化がＣ−３の立体配置を保持しながら優勢に進行することを示す。
【００９２】
実施例３−実験
３．１ 実験１ クラブラン酸の前駆体としてのアルギニンの測定
１４Ｃ−アルギニンを、各々、オルニチントランスカルバモイラーゼおよびアルギニンスクシネートシンセターゼで遮断されていることがわかっている２つのエス・クラブリゲルスの突然変異体培養物に供給する（これらはオルニチンからアルギニンへの変換に関与する酵素である）。標識をクラブラン酸に導入する。
１４Ｃ−オルニチン標識を同様に２つの突然変異体培養物に供給した場合、クラブラン酸に標識は取り込まれない。以下に記載の文字および数字を用いて図１および２に言及する。
【００９３】
３．２ 実験２−２個の新規アルギニン誘導体（Ａ）および（Ｇ）
実験１はアルギニンが生合成経路でクラブラン酸にされるアミノ酸であることを示す。該経路での次の公知の中間体はモノサイクリックβ−ラクタムプロクラバミン酸１である。したがって、β−ラクタムはアルギニン炭素骨格のＮ２位置に導入されなければならず、ヒドロキシル基を、Ｃ−３に導入し、Ｎ５グアニジノ官能基を加水分解する。
【００９４】
モノサイクリックβ−ラクタム（Ｂ）および（Ｃ）を、各々、親アミンであるプロクラバミン酸（２）１およびデヒドロキシプロクラバミン酸１をアミノイミノメタンスルホン酸２と反応させることにより調製する。β−アミノ酸２Ｓ−（Ａ）は以下に示す経路により得られ、β−アミノ酸（Ｇ）はβ−ラクタム（Ｃ）の酸加水分解により得られる。
【００９５】
【化２９】
【００９６】
これらの推定される代謝物のうちエス・クラブリゲルスからの培養上清中容易に検出可能なものはない。したがって、プロクラバミン酸およびクラブラン酸の産生において遮断されたエス・クラブリゲルスの突然変異体を試験する。これらの変異体のうちフェニルイソシアネート３での誘導体合成により示されるようなアミン基を含有する化合物を蓄積するものもある。このような変異体の選択した物を発酵させ、培養ブロスをサカグチ着色反応４によりグアニジノ基を有する化合物の存在に関してスクリーンする。変異株エス・クラブリゲルスｄｃｌＨ６５は着色試験に良好な応答を示す。したがって、培養濾液をダウエクス−５０、ファーマシアＨＲ５／５モノＳおよびパーティシル１０ＳＣＸカチオン交換マトリックスを用いて分別し、グアニジノ含有物質の精製につづいてサカグチ試験方法の変法を行う（サカグチ反応において形成される色相の強度を５１５ｎｍで測定する）。
【００９７】
２つの化合物を約１０：１の割合で単離し、その分光学的性質（両方の化合物に関して１Ｈ ｎ．ｍ．ｒ．およびｆ．ａ．ｂ．／ｍ．ｓ．、主要成分に関して１３Ｃ）を推論的中間体として調製された化合物の性質と比較して、その構造体を（Ａ）および（Ｇ）とする。
【００９８】
エス・クラブリゲルスｄｃｌＨ６５培養ブロスのクロマトグラフィーによる精製法は酸性培地を含むため、新しい培養濾液の分析的ｈ．ｐ．ｌ．ｃ．は閉環物質の存在を示さないが、（Ａ）および（Ｇ）は対応するβ−ラクタム誘導体（Ｂ）および（Ｃ）の開環体である可能性がある。したがって、培養ブロスの分別はほぼ中性条件を保って、β−ラクタム化合物の加水分解を避けながら行う。ｄｃｌＨ６５の新しい培養ブロスを遠心分離し、凍結乾燥し、エタノール／水（１：１）で処理し、高分子量化合物を除去し、可溶性フラクションを濃縮する。濃縮物を次に、溶出液のｐＨを４と７．５の間に維持しながらアンバーライトＩＲＡ６８アニオン交換樹脂、セファデクスバイオゲルＰ２およびシリカゲル上クロマトグラフィーに付す。サカグチ−陽性物質を各段階で収集する。主要サカグチ陽性物質を単離し、１Ｈ−ｎ．ｍ．ｒ．、ｉ．ｒ．、ｃ．ｄ．、重量スペクトルにより分析する。これらのデータから主要生成物の構造がＳ−（Ａ）であることが確認される。副サカグチ−陽性化合物は単離するのに十分な量で存在しないが、合成（Ｇ）と共に溶出される物質はｈ．ｐ．ｌ．ｃ．およびキャピラリーゾーン電気泳動で検出される。
【００９９】
結論
２つの新規アルギニン誘導体、Ｎ２−（２−カルボキシエチル）−アルギニン（Ａ）およびＮ２−（２−カルボキシエチル）−３−ヒドロキシ−アルギニン（Ｇ）はクラブラン酸生合成において遮断されているストレプトミセス・クラブリゲルスｄｃｌＨ６５の変異体により産生される。これらの化合物はクラブラン酸合成において有用である。
さらにこれらの化合物のクラブラン酸生合成経路の中間体としての役割に関するデータを実験３．３に示す。
【０１００】
３．３−実験３ クラブラン酸生合成の中間体としての（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｇ）および（８）の役割に関する標識実験
プロクラバミン酸に先立つ可能な生合成配列を第１図に示す。
（Ａ）から始めて、少なくとも３つの生化学工程、即ち、ヒドロキシル基の導入（工程ａ）、β−ラクタム環の形成（工程ｂ）およびグアニジノ基のアミノ基への加水分解（工程ｃ）が、プロクラバミン酸の生成に必要である。どの化合物（Ａ）、（Ｇ）、（Ｂ）、（Ｃ）および（８）が実際経路に存在するかを調べるために、供給実験についてこれらを１３Ｃで三重に標識して合成する。各場合において、５個の炭素鎖を１および２−位で標識し（９９％１３Ｃ）、さらに３個の炭素単位のカルボニル基を標識する（９１％１３Ｃ）。３個の標識炭素のすべてが結合が切れることなく取り込まれた場合、クラブラン酸の７、３および１０の炭素間にスピン−スピンカップリングが１３Ｃ−ｎ．ｍ．ｒ．において観察されることがわかっているので５、この標識手順を採用する。
【０１０１】
ＤＬ−トレオ−［１，２，２’−１３Ｃ３］−プロクラバミン酸５をアミノイミノメタンスルホン酸２で処理して［１，２，２’−１３Ｃ３］−（Ｃ）を得、これを酸加水分解に付して［１，２，３’−１３Ｃ３］−（Ｇ）を得る。［１，２，２’−１３Ｃ３］−（Ｆ）の酸加水分解により、［１，２，３’−１３Ｃ３］−（８）を得る。［１，２，３’−１３Ｃ３］−（Ａ）および［１，２，２’−１３Ｃ３］−（Ｂ）の合成は第２図にしたがう。第２図において、試薬および条件は以下のとおりである：Ｚ＝ＰｈＣＨ２ＯＣＯ−；ｉ，ＥｔＯＨ、ＨＣｌ、Δ；ｉｉ，ＰｈＣＨＯ、ＭｇＳＯ４、Ｅｔ３Ｎ；ｉｉｉ，ＬＤＡ、ＨＭＰＡ、ＩＣＨ２ＣＨ２ＮＨＺ；ｉｖ，１Ｍ ＨＣｌ；ｖ，ＮａＯＨ、ＢｒＣＨ２ＣＨ２ １３ＣＯＣｌ；ｖｉ，粉末ＫＯＨ、ＴＢＡＢ、Ｈ２Ｏ、超音波処理物；ｖｉｉ，Ｎａ２ＣＯ３、４０％ＥｔＯＨ水溶液；１６ ｖｉｉｉ，Ｈ２、Ｐｄ−Ｃ（１０％）；ｉｘ，Ｋ２ＣＯ３、アミノイミノメタンスルホン酸；ｘ，１Ｍ ＨＣｌ
【０１０２】
ストーク（Ｓｔｏｒｋ）らの方法６にしたがって、１３Ｃ２−グリシン（９９％１，２−１３Ｃ）を保護した［１，２−１３Ｃ２］−オルニチン誘導体（１０）にベンジリデングリシンエステル（９）を経由して導入する。（１０）の穏やかな酸加水分解によりアミノエステルを得、これを［１−１３Ｃ］−３−ブロモプロピオニルクロリド（９１％１−１３Ｃ）５でアシル化して、（１１）を得る。（１１）の塩基処理により、β−ラクタム（１２）を得る。カルボキシおよびアミノ保護基の開裂により［１，２，２’−１３Ｃ３］−（Ｄ）１を得、これをアミノイミノメタンスルホン酸２で目的とするグアニジノ酸［１，２，２’−１３Ｃ３］−（Ｂ）に変換する。
［１，２，２’−１３Ｃ３］−（Ｂ）の酸処理により、［１，２，３’−１３Ｃ３］−（Ａ）を得る。この反応スキームの工程の平均収率は８７％である。
【０１０３】
５個のラセミ１３Ｃ３−標識化合物（Ａ）、（Ｇ）、（Ｂ）、（Ｃ）および（８）を、各々、クラブラン酸産生期にある、エス・クラブリゲルスＡＴＣＣ２７０６４発酵に供給し、産生されたクラブラン酸サンプルをベンジルエステルとして単離する。投与された化合物の取り込みのレベルを１３Ｃ−ｎ．ｍ．ｒ．により測定し、シリル化後、９−Ｏ−シリル化誘導体のｇ．ｃ／ｍ．ｓ．を測定する。観察される１３Ｃ−取り込みを以下の第１表にまとめる：
【０１０４】
【表１】
【０１０５】
３サンプルにおいて、１３Ｃ−濃縮が観察され［化合物（Ａ）、（Ｂ）＆（Ｃ）］、濃縮はクラブラン酸塩の炭素３、７および１０に特異的であり、すべての３個の標識された中心間で１３Ｃ−１３Ｃスピン−スピンカップリングが観察される（第３図 Ｂの供給からのクラブラン酸ベンジルの炭素７、１０および３の１３Ｃ−ｎ．ｍ．ｒ．スペクトル、Ｊ７，１０ ３．８、Ｊ３，７ １．９およびＪ３，１０ ６７．２Ｈｚ）。このことは、取り込み中、結合の破壊が起こらなかったことを示す。
【０１０６】
これらの結果から、（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）がプロクラバミン酸の生合成における前駆体、したがって、クラブラン酸であり、経路中、この順番に論理的に起こることが結論できる。
Ｇおよび８の場合、これらの実験条件下では、濃縮は起こらない。しかし、当該分野で周知のβ−ラクタム環形成の方法を用いて（例えば、文献１）、Ｇおよび８（またはその保護誘導体）を、各々、Ｃおよびプロクラバミン酸に変換することにより、これらの化合物は、クラバム類、例えばクラバミン酸の産生に関して、例えば合成または半合成プロセスにおいて有用である。
【０１０７】
（Ｃ）のプロクラバミン酸への形質転換は、アルギナーゼ型酵素により媒介される。したがって、この酵素活性の証拠を調べる。エス・クラブリゲルスＡＴＣＣ２７０６４の無細胞調製物はラセミ体の（Ｃ）の１個のエナンチオマーを定量的にプロクラバミン酸（５）および尿素に変換できる。活性は、Ｍｎ２＋の存在下に向上し、この現象は、バチルス・アンスラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）７およびスタフィロコッカス７ ’ ８源からのアルギナーゼに関して報告されている。対応する（２Ｓ）−アミノ誘導体１から調製される（２Ｓ）−（Ｂ）も、これらの条件下で加水分解するが、（Ｃ）より迅速でなく、（Ａ）または（Ｇ）について、加水分解は検出されない。明らかに、この酵素はこれらの初期生合成前駆体のグアニジノ基の間を有効に区別できる。天然のプロクラバミン酸の絶対的立体化学は（２Ｓ，３Ｒ）であるので、アミジノヒドロラーゼの基質である（Ｃ）のエナンチオマーも恐らく（２Ｓ，３Ｒ）立体化学を有する。
【０１０８】
アミジノヒドロラーゼを前記１．２項にしたがって精製する。純粋な酵素は、アルギニンをオルニチンに加水分解せず、したがって、すでにエス・クラブリゲルス９において報告されているアルギナーゼとは異なる。アミジノヒドロラーゼのＮ−末端アミノ酸配列はクラブラン酸遺伝子クラスター中のアミジノヒドロラーゼ関連遺伝子のオープンリーディングフレームと関連がある。ＤＮＡ配列から計算されるアミジノヒドロラーゼについてのＭｒは３３，３７４である。前記データから、（２Ｓ，３Ｒ）−（Ｃ）はおそらくクラブラン酸への生合成パスにおいて（２Ｓ，３Ｒ）−プロクラバミン酸に直接変換されると結論できる。
【０１０９】
（Ｂ）および（Ｃ）に比べて１３Ｃ−標識（Ａ）化合物の取り込みのレベルが低いことは、化合物が細胞中に有効に輸送されていないか、真の中間体が（Ａ）の誘導体、例えば閉環に都合よい補酵素Ａチオエステルであることを示す。（Ａ）に関する結果は、（Ｂ）のβ−ラクタムの生成が、生化学的に先例のないプロセス、即ち、アミド結合形成によることを示すが、文献では、他のモノサイクリックβ−ラクタムの前駆体、ノカルジシン１０およびおそらくモノバクタム１０ ’ １１が閉環の前に形成されたアミド結合を有することを示している。これらの化合物において、閉環はセリルヒドロキシル官能基のＳＮ２置換による。
【０１１０】
先の標識研究は、クラブラン酸のβ−ラクタム炭素が解糖経路由来のものであり、ピルビン酸エステル１２がβ−ラクタム環中に特異的に取り込まれることを示す。本発明者らは、乳酸エステルもβ−ラクタム環中に特異的に取り込まれることを見いだした。
【０１１１】
したがって、（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）のＣ３基は同じ経路由来のものである。ピルビン酸エステルおよび乳酸エステルは、生化学的に、アクリル酸エステル１３およびマロン酸セミアルデヒド１４に変換できることは公知である。酵素で触媒されたアルギニンのアクリル酸エステルへのミカエル添加、またはマロン酸セミアルデヒドに関するシッフ塩基添加と、それに続く還元により、いずれの場合においても前駆体（Ａ）が得られる。アルギニンのマロン酸セミアルデヒドとの反応からの可能な（Ａ）の誘導は、シッフ塩基形成およびそれに続く還元が起こるオピン代謝物の生合成と強い類似性を示すので、特に興味深い。
【０１１２】
得られた証拠から、プロクラバミン酸のβ−ラクタム環はアミド形成反応を含む新しい方法で構築されることがわかる。アルギニン誘導体（２Ｓ）−（Ｂ）および（２Ｓ，３Ｒ）−（Ｃ）はプロクラバミン酸の生合成前駆体であり、（２Ｓ）−（Ｂ）はヒドロキシル化されて（２Ｓ，３Ｒ）−（Ｃ）になり、酵素アミジノヒドロラーゼは（２Ｓ，３Ｒ）−（Ｃ）を加水分解してプロクラバミン酸にする新規酵素である（プロクラバミン酸アミジノヒドロラーゼと命名する）。
【０１１３】
結論
実験１および３は、アルギニンの、Ａ、ＢおよびＣが、プロクラバミン酸、かくしてクラブラン酸への経路上にあることを示し、アルギニンはオルニチンに比べて、クラブラン酸のより直接の前駆体であることを示す。
【０１１４】
文献
１．ケイ・エイチ・バガレイ、エス・ダブリュー・エルソン、エヌ・エイチ・ニコルソンおよびジェイ・ティー・サイム（Ｋ．Ｈ．Ｂａｇｇａｌｅｙ，Ｓ．Ｗ．Ｅｌｓｏｎ，Ｎ．Ｈ．ＮｉｃｈｏｌｓｏｎおよびＪ．Ｔ．Ｓｉｍｅ）、ジャーナル・オブ・ケミカル・ソサイエティー（Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｉ ）１９９０ １５２１およびそこに記載されている引例
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１６．ケイ・エル・ケスル、エム・ケイ・アンワー、ティー・ケイ・オージャおよびジー・ゴールドスタイン（Ｋ．Ｌ．Ｋａｅｓｔｌｅ，Ｍ．Ｋ．Ａｎｗｅｒ，Ｔ．Ｋ．ＡｕｄｈｙａおよびＧ．Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ）、テトラヘドロン・レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ），１９９１，３２，３２７．
【０１１５】
【配列表】
配列一覧表
（１）一般情報
（ｉ）出願人
（Ａ）名称：スミスクライン・ビーチャム・パブリック・リミテッド・カンパニー
（Ｂ）通り名：ニュー・ホライズンズ・コート
（Ｃ）都市名：ブレンフォード
（Ｄ）州名：ミドルセックス
（Ｅ）国名：イギリス国
（Ｆ）郵便番号（ＺＩＰ）：ＴＷ８ ９ＥＰ
（Ｇ）電話番号：０７３７ ３６４１４７
（Ｈ）テレファックス：０７３７ ３６４００６
（Ｉ）テレックス：９１１４１５
（ｉｉ）発明の名称：新規化合物
（ｉｉｉ）配列数：２
（ｉｖ）コンピューター・リーダブル・フォーム：
（Ａ）媒体形態：フロッピーディスク
（Ｂ）コンピューター：互換性ＩＢＭ ＰＣ
（Ｃ）操作システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウェアー：パテントイン・リリース（ＰａｔｅｎｔＩｎ Ｒｅｌｅａｓｅ）
＃１．０，バージョン＃１．２５（ＥＰＯ）
（２）配列番号１に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：３１３アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）トポロジー：不明
（ｉｉ）分子の型：蛋白質
（ｉｉｉ）仮定性：イエス
（ｖ）フラグメントの型：Ｎ−末端
（ｖｉ）起源：
（Ａ）微生物：ストレプトミセス・クラブリゲルス
（Ｂ）菌株：エス・クラブリゲルスＡＴＣＣ２７０６４の再単離体
（ｘｉ）配列の記載：配列番号１：
【化３０】
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：９４２塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：不明
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｉｉｉ）仮定性：ノー
（ｖｉ）起源：
（Ａ）微生物：ストレプトミセス・クラブリゲルス
（Ｂ）菌株：エス・クラブリゲルスＡＴＣＣ２７０６４の再単離体
（ｘｉ）配列記載：配列番号２：
【化３１】
【図面の簡単な説明】
【図１】クラブラン酸の生成工程を示すスキームである。
【図２】化合物Ａの生成工程を示すスキームである。
【図３】１３Ｃ３−標識した化合物Ｂをエス・クラブリゲルスＡＴＣＣ２７０６４発酵に供給したときの産生したクラブラン酸ベンジルの炭素７、１０および３の１３Ｃ−ｎ．ｍ．ｒ．スペクトルである。
Claims (3)
- アルファ−アミノ酸基質が側鎖にアミノ、グアニジノまたはアミジノ基を有する式（ＩＩ）：
で示される化合物、アルファ−アミノ酸またはそのＮ−アシル誘導体のベータ−ヒドロキシル化法であって、該基質をクラバミン酸シンターゼと共にインキュベートすることでヒドロキシル化反応を実施することを特徴とする方法。 - Ｎ−アシルアミノ酸がＮ−アセチルアルギニンまたはＮ−アセチルオルニチンである請求項１記載の方法。
- ５−アミノ−２Ｓ−（２−オキソ−アゼチジン−１−イル）ペンタン酸をクラバミン酸シンターゼと共にインキュベートすることにより得られる５−アミノ−２Ｓ−（２−オキソ−アゼチジン−１−イル）ペント−２−エン酸。
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