PT87388B

PT87388B - Processo para a preparacao de uma vacina viva de virus herpes liofilizada e estavel

Info

Publication number: PT87388B
Application number: PT87388A
Authority: PT
Inventors: William J Mcaleer; Henry Z Markus; Robert Z Maigetter
Original assignee: Merck & Co Inc
Priority date: 1987-05-04
Filing date: 1988-05-03
Publication date: 1992-08-31
Also published as: ATE95427T1; CA1324956C; FI882041A; NO881931L; NO881931D0; IL86180A; IE881248L; FI94093B; DK238688A; NO176163B; KR880013575A; FI882041A0; AU622110B2; HK5997A; EP0290197A3; IL86180A0; IE61575B1; DE3884663D1; NZ224419A; DE3884663T2

Description

PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE UMA VACINA VIVA DE VIRUS HERPES LIOFILIZADA E ESTÁVEL ϊ

Α referida vacina pode ainda ser combinada com uma vacina de sarampo, uma vacina de papeira e uma vacina de rubéola de modo a obter-se uma vacina tetra, valente liofilizada com um teor de humidade de cerca de 0,5% a cerca de 8%.

Fundamento do Invento

Os vírus herpes são um grupo extenso de vírus íntranucleares de DNA de cadeia dupla que são capazes de estabelecer uma infecção latente muitos anos após uma infecção primária. 0 grupo dos vírus herpes é responsável “ por doenças tais como febre das bolhas e queratoconjuntivi te (vírus herpes simplex tipo 1), doença venérea (vírus herpes simplex tipos 1 e 2), varicela e zona (herpes zoster), doença das inclusões citomegálicas (Citomegalovírus), doença de . Marek das galinhas e mononucleose infecciosa (vírus Epstein' -Barr).

A varicela é uma das doenças mais comuns e altamente contagiosa surgindo principalmente na infância. Observa-se uma erupção geralmente por todo o corpo juntamente com um ataque de febre que ocorre após um período de incubação geralmente de 14 a 17 dias. A doença resulta numa erupção perulenta que pode, em muitos casos, formar pústulas e, em casos extremos, deixar cicatrizes. Podem surgir outros problemas e complicações, por exemplo, no caso de crianças mal nutridas que podem ter úlceras dérmicas necróticas. Como resultada da varicela podem ocorrer outras complicações | tais como pertubações do sistema nervoso central, mielite e neurite.

E conhecida uma vacina viva da varicela. A Patente U.S. 3 985 615, a divulgação da qual é aqui ) incluída como referência, descreve um vírus da varicela em culturas primárias de células de tecidos embrionários de porquinha da índia a uma temperatura entre 32⁹C e 37⁹C até o vírus estar adequadamente atenuado.

Sabe-se que durante o armazenamento as soluções aquosas de vacinas vivas de vírus são instá-4-

veis. A técnica convencional para reduzir a instabilidade durante o armazenamento é a remoção de humidade por liofilização. Os critérios convencionais sustemtam que quanto mais humidade ê retirada, maior estabilidade da vacina viva de vírus durante o armazenamento. Geralmente as vacinas vivas de vírus são liofilizadas até níveis de humidade inferiores a cerca de 1%.

Surpreendentemente descobriu-se agora que a liofilização de uma vacina viva de vírus herpes de modo a obter-se um teor em humidade dentro da gama de cerca de 0,5% a cerca de 8% resulta num armazenamento de estabilidade durante o armazenamento para a vacina viva de vírus herpes. 0 aumento de estabilidade no armazenamento permite que a vacina viva de vírus herpes seja guardada a 5⁹C, i.e. num frigorifico, em vez de a -20³C, i.e. num congelador.

Sumário do Invento invento compreende uma vacina viva liofilizada de vírus herpes que contem entre cerca de 0,5% e cerca de 8% de humidade. Um outro aspecto do invento relaciona-se com uma vacina liofilizada tetravalente de saram po, papeira, rubéola e varicela.

Descrição Detalhada do Invento invento compreende uma vacina viva liofilizada de vírus herpes que contem entre cerca de 0,5% e cerca de 8% de humidade. Dentro da gama referida pode. -se estabelecer subséries úteis entre cerca de 0,5% e cerca ' de 2%, entre cerca de 2% e cerca de 5% e entre cerca de 5% e cerca de 8%. Surpreendentemente, tais como níveis de humidade resultam num aumentam de estabilidade no armazenamento da vacina viva de vírus herpes. Este aumento de estabilidade permite que a vacina seja guardada a 5⁸C, i.e. condições normais de frigorífico, mantendo ao mesmo tempo a estabilidade, em vez de a -20^eC, condições de congelador.

Pensamos que é possível aumentar a estabilidade no armazenamento de qualquer vacina viva de vírus herpes. Uma vacina viva preferida de vírus herpes é a da varicela. Uma vacina viva da varicela pode ser produzida pela técnica descrita na Patente US 3 989 615.

A vacina viva de vírus herpes pode então ser liofilizada para um teor em humidade entre cerca de 0,5% e cerca de 8%. Podem ser utilizadas técnicas de lioI filização convencionais. No entanto, observou-se que utilizan do injecção de gás, e.g. argon estéril, durante o ciclo primário do processo de liofilização, a temperatura pretendida do produto, que caracteriza a terminação do ciclo primário, é obtida num período de tempo mais certo, e.g. cerca de cinco horas em vez de cerca de 10 horas.

Uma outra vantagem do invento é que o tempo de liofilização necessário para se conseguir os níveis de humidade do invento ê muito inferior ao tempo de liofilização necessário para se conseguir níveis de humidade abaixo de 0,5%. Isto é devido ao facto de o ciclo secundário do processo de liofilização controlar o teor em humidade re6-

sultante da vacina viva de vírus herpes. Para se conseguir o teor em humidade do invento é necessário um ciclo secundária mais curto do que para se conseguir níveis de humidade abaixo de 0,5%. Para se conseguir o teor em humidade preferido do invento o secundário pode ser efectuado entre cerca de três e cerca de cinco horas.

Assim, num outro aspecto do invento existe um processo de liofilização para uma vacina viva de vírus herpes que compreende um ciclo primário com injecção de gás e um ciclo secundário em que o tempo do ciclo primário | mais o do ciclo secundário vai de cerca de 7 horas atê cerca de 11 horas.

Um outro aspecto do invento relaciona-se com uma vacina tetravalente liofilizada compreendendo pelo menos cerca de 20, de preferência pelo menos cerca de 1000 unidades TCID_5Q de vacina do sarampo pelo menos cerca de 317, de preferência pelo menos cerca de 5000 unidades TCID^q de vacina de papeira, pelo menos cerca de 40, de preferência pelo menos cerca de 1000 unidades TCID^q de vacina da rubêola e pelo menos 53, de preferência pelo menos cerca de 1000 pfu de vacina da varicela por dose. Tal com vacina tetravalente ê eficaz contra os quatro vírus; verificou-se I para interferência.

Os exemplos que se seguem ilustram o invento sem no entanto limitar o mesmo.

I

Aproximadamente 100 frascos de vacina viva de vírus da varicela foram preparados de acordo com o método descrito na Patente U.S. 3 985 615 e foram então congelados usando azoto líquida.

Os 100 frascos que não foram selados mas antes tapados com uma rolha de borracha com duas posições, foram colocadas numaprateleira de liofilizador pré-arrefecido (um liofilizador Usifroid) com uma temperatura de prateleira de partida de -45²C. Para o ciclo primário, as ampolas foram aquecidas de -45^SC até 30^sC durante um período de 8 horas. A temperatura de prateleira subiu a uma velocidade de 9,4^sC/hora. 0 controle da pressão para o ciclo primário foi de 0,10 a 0,18 mbares (entre 75 e 150 microns), que foi controlado por injecção de argon seco estéril. Após o ciclo primário, parou-se a injecção de gás e aplicou-se vácuo total. 0 ciclo secundário foi então efectuada durante 9 horas a 3OSC, resultando numa temperatura final de prateleira de 30^sC.

Aumentou-se a pressão na câmara com argon seco estéril até entre cerca de 0,2 e de cerca de 0,27 bares. Os frascos foram então fechados com a rolha de borracha que cobria cada um dos frascos e a pressão da câmara levada até à pressão atmosférica com argon seco estéril.

A câmara foi então aberta, os fras. cos removidos e cada um dos frascos selado com um selo de alumínio.

teor em humidade do produto fiTM nal, que foi determinado pelo Dupont Aqua Test , foi de 2,2%. Isto constitui o Lote I.

processo acima foi repetido para um segundo lote (Lote II) mas, durante o ciclo primário a velocidade de subida da temperatura da prateleira foi de 21,4 ²C/hora durante 3,5 horas, o controlo de pressão foi de 0,45 a 0,5 mbar e o ciclo secundário decorreu durante quatro horas. 0 teor em humidade para este lote foi de 7,7%. Este mesmo pro cesso foi repetido para um terceira lote (Lote III) e o teôr em humidade resultante foi de 6,4%. Para estes estudos comparam-se os três lotes com uma testemunha que foi preparada por liofilização convencional em que o ciclo primário foi de 40 horas e o ciclo secundário de 8 horas, o tempo total do ciclo foi de aproximadamente 50 horas. A secagem primária foi q efectuada a -28⁹C durante 40 horas a 1,3 χ 10 mbar (1 micron); o ciclo secundário foi mantido a +26⁹C. 0 intervalo de tempo entre cerca do ciclo primário e secundário foi de cerca de 8 horas com um aumento da temperatura de 6,75⁹C/hora durante aquele tempo. 0 teôr em humidade para este lote foi de 0,6%.

Os lotes foram guardados a 5⁹C. A estabilidade no armazenamento da vacina viva do vírus da varicela foi determinada pelo número de unidades formadoras de placa (PFU) determinado pelo ensaio de placas.

A semi-vida calculada está apresentada na tabela que se segue:

Semi-vida a 2-8^eC calculada para lotes de vacina viva do vírus da varicela com injecção de ar

Precentagem de Semi-vida calculada

Lote 1 iof i 1 ização Humidade(meses)

Lote I	GI	2,2%	4,6
Lote II	GI	7,7%	5,8
Lote III	GI	6,4%	6,4
Testemunha		0,6%	1,6
GI =	liofilização com	injecção de gás,	testemunha

de 48 horas sem injecção de gás.

Assim, como se pode observar ao longo do tempo os lotes com maior teôr em humidade são mais estáveis do que os lotes testemunha com menor humidade.

EXEMPLO II

Preparação da vacina combinada MMRV

Num banho-maria (30²C) descongelaram-se amostras congeladas de vacinas de sarampo, rubêola e varicela.

Componente do sarampo:

Usou-se 100 ml da Vacina do Sarampo, Edmondston, Estirpe Mais Atenuada com um título de infec-

ciosidade de 4,95 log₁₀ TCID_5Q/O,1 ml.

Componente da papeira:

Usou-se 500 ml de Vacina da Papeira. Estirpe Jerryl Lynn (Patente 3 555 149) com um título de infecciosidade de 5,4 log_1Q TCID_5Q/0,1 ml.

Componente Rubéola:

Usou-se 100 ml de Vacina da Rubéola, RA 27/3 Estirpe Wistar, com um título de infecciosidade de 4,65 log_1Q TCID_5Q/0,1 ml.

Componente Varicela:

150 ml de Vacina da Varicela, Estirpe Oka, com um título de infecciosidade de 320 000 PFU/ ml.

Após descongelação os componentes foram reunidos numa garrafa estéril de 4 1. Aos 850 ml de vírus reunido adicionaram-se os seguintes diluentes:

I 50 ml - Meio Mínimo Essencial 0,0565%, Sorbitol 4,291%, Gelatina 4,985%, Bicarbonato de Sódio 0,354%, Albumina 2,4%.

525 ml- Gelatina Modificada, Meio 0, Diluente Sorbitol conteii ' do: Meio 199 6,28%, Sorbitol 3,9725%; Gelatina 3,9725%

Bicarbonato de Sódio 0,225%.

225 ml- Solução de Tampão Fosfato 1 Molar (Fosfato de Potássio Dibásico 5,72%, Fosfato de Potássio Monobásico 8,239%).

1350 ml - SPGA/(Sucrose 7,46%; Fosfata de Potássio Dibásico 0,135%, Fosfata de Potássio Monobásico 0,045%, Glutamato Monossódico 0,0956%, Albumina 10%).

A mistura de vírus e diluentes foi misturada por agitação à temperatura ambiente. A mistura foi então mantida a 4⁹C num banho de gelo para distribuição e liofilização.

A vacina combinada MNRV foi distrj_ buída em unidades de 0,7 ml por frascos de vidro. Os frascos cheios foram congelados em azoto líquido e liofilizados até aproximadamente 1% de humidade. Após liofilização taparam-se os frascos, selaram-se com um selo de alumínio e guardaram-se a -20⁹C.

As amostras liofilizadas foram submetidas a ensaios de infecciosidade de acordo com processos convencionais de ensaio. Resultados finais dos ensaios:

Sarampo = 3,3	Log,₀	TCID₅₀/0,1	ml = 2000	tcid_5O/o,i	ml
Papeira = 4,2	Log,₀	TCID₅₀/0,1	ml = 16000	TCID₅₀/0,1	ml
Rubéola =3,1	LogjO	TCID₅₀/0,1	ml = 16000	TCID₅₀/0,1	ml

Varicela = 5170 PFU/ml.

EXEMPLO III

Aproximadamente 50 frascos da vacina MMRV foram preparados como o descrito no Exemplo I mas

-12liofilizados como se segue:

Os frascos que não foram selados mas antes cobertos com uma tampa de borracha de duas posições foram colocadas numa prateleira de liofilização pré-arrefecido (um 1iofi1izador Usifroid) com uma temperatura de prateie/, ra inicial de -45^SC. Para o ciclo primário e ciclo secundário assim como todos os outros parâmetros, o liofilizado foi regulado para condições semelhantes às descritas para o Lote II e III do vírus da Varicela sózinho; i.e. Exemplo I, que foi designado Lote IV.

Quando os frascos foram testados para potência de sarampo, papeira, rubêola e varicela, mostrou-se claramente que as amostras de injecção de gás possuíam potência semelhante às amostras que foram liofilizados sem injecção de gás (i.e. menor humidade). Ver Exemplo II.

Os resultados foram os seguintes:

Ensaias da Potência de MMRV na Vacina de Injecção com Gás

Varicela Papeira Rubêola Sarampo

Lote (PFU/ml) (TCID₅₍₎/0,1 ml) TCID_5Q/O,1 ml TCID_5Q/0,1 ml Humidade

Lote IV 4,89 3,2 3,4 3,36

Claims

1^a. - Processo de liofilização para uma vacina viva de vírus herpes caracterizado por compreender a injecção de gâs durante a liofilização e a continuação da liofilização até que o teor de humidade da vacina viva de vírus herpes esteja entre cerca de 0,5% e cerca de 8%.

2^a. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se obter uma vacina viva de vírus herpes liofilizada em que o referido teor em humidade ê de cerca de 0,5% a cerca de 2%.

3^a. - Processo de acordo com a rej_ vindicação 1, caracterizado por se obter uma vacina viva de vírus herpes liofilizada em que o referido teor em humidade é de cerca de 2% a cerca de 5%.

4^a. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se obter uma vacina viva de vírus herpes liofilizada em que 0 referida teor em humidade é de cerca de 5% a cerca de 8%.

5^a. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se obter uma vacina viva de vírus herpes liofilizada em que o referido vírus herpes é de varicela.

6^a. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a vacina viva de vírus her

-14pes liofilizada ser combinada com uma vacina do sarampo, uma vacina da papeira e uma vacina da rubêola para formar uma vacina tetravalente liofilizada tendo um teor em humidade de cerca de 0,5% a cerca de 8% em que cada uma das vacinas estâ presente numa quantidade que é eficaz para imunizar um receptor contra cada um dos referidos vírus.

7⁵. - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por a vacina liofilizada compreender entre cerca de 0,5% e cerca de 2% de humidade.

8^á. - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por a vacina liofilizada compreender entre cerca de 2% e cerca de 5% de humidade.

9^â. - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por a vacina liofilizada comI preender entre cerca de 5% e cerca de 8% de humidade.

10⁵. - Processo de liofilização para uma vacina viva de vírus herpes, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por compreender um ciclo primá

-15rio com injecção de gás e um ciclo secundário, em que o tempo total do referido ciclo primário mais o referido ciclo secundário é de cerca de 7 a cerca de 11 horas.