FI94093C - Menetelmä elävän herpesvirusrokotteen lyofilisoimiseksi - Google Patents

Description

94093

Menetelmä elävän herpesvirusrokotteen lyofilisoimiseksi

Keksintö koskee menetelmää sellaisen elävän herpes-virusrokotteen lyofilisoimiseksi, joka valinnaisesti yh-5 distetään tuhkarokkorokotteeseen, sikotautirokotteeseen ja vihurirokkorokotteeseen nelitehoisen lyofilisoidun rokotteen muodostamiseksi, jolloin kukin rokote on läsnä määrässä, joka on tehokas immunisoimaan saajan kutakin virusta vastaan.

10 Herpesvirukset muodostavat suuren ryhmän tumansi- säisiä, kaksisäikeisiä DNA:ta sisältäviä viruksia, joilla on huomattava kyky aiheuttaa piilevä tartunta, joka puhkeaa taudiksi monen vuoden kuluttua ensisijaisesta tartunnasta. Herpesvirusten ryhmä aiheuttaa sellaisia tauteja 15 kuin huuliherpes, sarveis- ja sidekalvon tulehdus (Herpes simplex -virus tyyppi 1), sukupuolitauti (Herpes simplex -virus tyypit 1 ja 2), vesirokko (varicella) ja vyöruusu (Herpes zoster), sytomegalovirusmononukleoosi (Cytomegalovirus) , kananpoikien Marekin tauti ja tarttuva rauhaskuume 20 (Epstein-Barr -virus).

Vesirokko (varicella) on yksi yleisimmistä ja helpoimmin leviävistä taudeista ja se esiintyy pääasiassa lapsuusiän aikana. Siihen kuuluu koko kehon kattava ihottuma ja samanaikainen kuumeennousu, jotka alkavat taval-55 lisesti 14 - 17 päivään kestävän itämisajan jälkeen. Taudin kuluessa kehittyy pilkullista ihottumaa, joka saattaa useissa tapauksissa muuttua märkärakkuloiksi ja jättää pahimmissa tapauksissa arpia. Muita ongelmia ja jälkitauteja saattaa ilmetä, esimerkiksi aliravituilla lapsilla 30 voi esiintyä ihon kuolioista haavaumaa. Vesirokon tiedetään aiheuttaneen muitakin jälkitauteja, kuten keskushermoston häiriöitä, selkäytimen tulehdusta ja hermotulehdus-ta.

Elävä vesirokkorokote on tunnettu. Tähän julkaisuun 35 sisällytetään US-patentin 3 985 615 kuvaus siihen viittaa- 2 94093 maila, mikä patentti kuvaa menetelmän elävän vesirokkorokotteen valmistamiseksi, missä vesirokkovirusta jatkovil-jellään marsun primaarisessa alkiokudossolussa 32 - 37° C:n lämpötilassa, kunnes virus on riittävästi heikentynyt.

5 Tiedetään, että elävän virusrokotteen vesiliuokset ovat säilytyksen aikana pysymättömiä. Tavanomainen menetelmä säilytyksen kestokyvyn heikkenemisen vähentämiseksi on poistaa kosteutta kylmäkuivaamalla. Vallitsevan käsityksen mukaan sitä parempi elävän virusrokotteen kestokyky 10 saavutetaan, mitä enemmän kosteutta poistetaan. Yleensä elävää virusta sisältävät rokotteet kylmäkuiva taan vähemmän kuin 1 %:n kosteustasoon.

EP-patenttijulkaisussa 30 199 kuvatan menetelmää sellaisen vesipitoisen viruskoostumuksen lyofilisoimisek-15 si, jonka volyymiä on pienennetty, käyttäen fosfaattisuo-laa. Lisäämällä fosfaattisuolaa menetelmän viimeisessä vaiheessa voidaanvälttää saostusta. Tämä taas mahdollistaa sen, että lähtötuotteina voidaan käyttää konsentroituneem-pia liuoksia, jolloin lyofilisointiaikaa voidaan vähentää.

20 Julkaisun mukaan päämääränä on ollut nopeamman ja halvemman lyofilisointimenetelmän kehittäminen eläviä viruskoos-tumuksia varten. Julkaisun selitysosassa korostetaaan nimenomaan sitä, että kuvatulla lyofilisointimenetelmällä kaikki kosteus saadaan poistetuksi. Hakemus ei siis 25 lainkaan liity pienen kosteuspitoisuuden säilyttämiseen rokotteessa sen stabiilisuuden parantamiseksi, mikä on tämän keksinnön päämäärä.

US-patentissa 4 622 222 kuvattu lyofilisointimene-telmä poikkeaa hyvin paljon tässä kuvatusta menetelmästä.

30 Lisäksi siinä mainitaan, että 8 tunnin kuivauksen jälkeen ; tuotteen vesipitoisuus on alle 2 %.

Julkaisussa Cryobiology 18 (1981) 414-419 kuvataan lyofilisoitujen virusrokotteiden veden sitomista. Rokotteiden kosteuspitoisuudeksi on ilmoitettu alle 1 %.

3 94093

Yllätykseksi on nyt havaittu, että kylmäkuivattaes-sa elävää herpesvirusrokotetta siten, että kosteuspitoisuudeksi tulee noin 2 - noin 8 %, seuraa tästä elävän herpesvirusrokotteen säilytyksen kestokyvyn paraneminen.

5 Lisääntynyt säilytyksen kestokyky sallii elävän herpes virusrokotteen säilytyksen 5 °C:ssa, näin ollen jääkaapissa, -20 °C:n sijasta pakastimessa.

Keksintö koskee siten menetelmää elävän herpesvirusrokotteen lyofilisoimiseksi. Keksinnön mukaiselle mene-10 telmälle on tunnusomaista, että rokote lyofilisoidaan kosteuspitoisuuteen 2 - 8 % ja menetelmä käsittää primaarisen kaasuinjektiota sisältävän syklin ja sekundaarisen syklin, syklien kokonaisajän ollessa noin 7 - noin 11 tuntia. Keksinnön mukaisesti voidaan valinnaisesti muodostaa lyofili-15 soitu nelitehoinen tuhka rokko-, sikotauti-, vihurirokkoja vesirokkorokote.

Keksinnön mukaisesti saadaan siis kylmäkuivattu elävä herpesvirusrokote, joka sisältää noin 2 - noin 8 % kosteutta. Edellä olevalla alueella käyttökelpoisia ala-20 alueita ovat noin 2 - noin 5 % ja noin 5 - noin 8 %'. Tällaisten kosteustasojen yllättävänä seurauksena on elävän herpesvirusrokotteen säilytyksen kestokyvyn paraneminen. Tämä parantunut kestokyky sallii rokotteen säilytyksen tapahtuvan 5 °C:ssa, siis normaaleissa jääkaapin olosuh-.2:5 teissä kestokyvyn muuttumatta, sen sijaan että tarvittaisiin pakastusolosuhteita -20 °C:ssa.

Luultavasti minkä tahansa elävän herpesvirusrokotteen säilytyksen kestokykyä voidaan parantaa. Herpesvirus-rokotteista edullinen on vesirokkorokote. Elävä vesirok-30 korokote voidaan valmistaa menetelmällä, joka on kuvattu US-patentissa 3 985 615.

Elävä herpesvirusrokote voidaan sitten kylmäkuiva ta noin 2 - noin 8 % kosteuspitoisuuteen. Käytössä voivat olla kylmäkuivauksessa käytettävät vakiomenetelmät. On 35 kuitenkin tehty havainto, että käyttämällä kylmäkuivausme- 4 94093 netelmän ensimmäisessä syklissä kaasun annostelua, esimerkiksi steriiliä argonia, haluttu tuotteen lämpötila, joka on ominaista ensimmäisen syklin päättymiselle, saavutetaan lyhentyneen ajanjakson kuluessa, esimerkiksi niin lyhyessä 5 ajassa kuin noin viisi tuntia noin 40 tunnin sijaan.

Keksinnön toinen etu on se, että keksinnön kosteus-tasojen saavuttamiseksi tarvittava kylroäkuivausaika on paljon lyhyempi kuin mitä alle 2 %:n kosteustasojen saavuttamiseksi tarvitaan. Tämä johtuu siitä, että elävään 10 herpesvirusrokotteeseen jäävä kosteuspitoisuus määräytyy kylmäkuivausmenetelmän toisen syklin mukaan. Keksinnön kosteuspitoisuuden saavuttamiseksi tarvitaan lyhyempi toinen sykli kuin mitä tarvitaan alle 2 %:n kosteuspitoisuuden saavuttamiseksi. Jotta keksinnön kannalta suositelta-15 vin kosteuspitoisuus saavutettaisiin, toisen syklin kesto voi jäädä noin 3-5 tuntiin.

Keksinnön toisena sovellusmuotona muodostetaan kylmäkuivattu nelitehoinen rokote, jossa on vähintään 20, mutta mieluummin vähintään noin 1000 TCIDJ0-yksikköä tuh-20 karokkorokotetta, vähintään noin 317, mutta mieluummin vähintään noin 5000 TCIDS0-yksikköä sikotautirokotetta, vähintään noin 40, mutta mieluummin vähintään noin 1000 TCID50-yksikköä vihurirokkorokotetta ja vähintään 53, mutta mieluummin vähintään noin 1000 plakkia muodostavaa yksik-.2'5 köä (pfu) vesirokkorokotetta annosta kohti. Tällainen ne-litehoinen rokote tehoaa jokaiseen neljästä viruksesta, keskinäiset häiritsevät vaikutukset ovat vähäisiä. Seuraa-vat esimerkit valaisevat keksintöä kuitenkaan rajoittamatta sitä näihin.

30 Esimerkki I

• —

Noin 100 lääkepulloa elävää vesirokkovirusrokotetta valmistettiin US-patentissa 3 985 615 kuvatun menetelmän mukaisesti ja pakastettiin sitten nestetyppeä käyttämällä.

Nämä 100 lääkepulloa, jotka eivät olleet suljettu-33 na, vaan peitettynä kaksivaiheisesti sulkeutuvalla kumi- • « 5 94093 korkilla, asetettiin esijäähdytetylle kylmäkuivaajän hyllylle (Usifroid-kylmäkuivaaja), hyllyn alkulämpötilan ollessa -45 °C. Ensimmäisessä syklissä lääkepullot lämmitettiin -45 °C:sta 30 °C:seen kahdeksan tunnin ajanjakson 5 kuluessa. Hyllyn lämpenemisnopeus oli 9,4 °C/tunti. Ensimmäisen syklin paineen asetus oli 0,1 - 0,18 mbar (75 - 150 micronia), mitä säädettiin annostelemalla kuivaa, steriiliä argonia. Ensimmäisen syklin jälkeen katkaistiin kaasun annostelu ja kytkettiin täysi tyhjiö. Sitten suoritettiin 10 toinen sykli yhdeksässä tunnissa 30 °C:ssa hyllyn lopullisen lämpötilan ollessa 30 °C.

Paine kammiossa nostettiin kuivalla steriilillä argonilla noin 0,2:sta noin 0,27:ään baariin. Lääkepullot suljettiin sitten kumikorkeilla, jotka peittivät jokaista 15 lääkepulloa ja kammion paine nostettiin nyt ilmakehän paineeseen kuivalla steriilillä argonilla.

Sitten kammio avattiin, lääkepullot poistettiin ja jokainen pullo suljettiin alumiinipannalla.

Lopullisen tuotteen kosteuspitoisuus, joka määri- ® .

20 tettun Dupont Aqua Test :11a, oli 2,2 %. Tämä oli tuotan-toerä I.

Yllä oleva menetelmä toistettiin toisen tuotanto-erän valmistamiseksi (tuotantoerä II), mutta ensimmäisen syklin aikana hyllyn lämpenemisnopeus oli 21,4 °C/tunti .25 3,5 tunnin ajan, paine säädettiin alueelle 0,45 - 0,5 mbar ja toinen sykli oli neljä tuntia pitkä. Tämän tuotantoerän kosteuspitoisuus oli 7,7 %. Sama menetelmä uusittiin kolmannen tuotantoerän valmistamiseksi (tuotantoerä III) ja tämän tuloksena saatu kosteuspitoisuus oli 6,4 %.

30 Tässä kuvatuissa tutkimuksissa näitä kolmea tuotan- • « toerää verrattiin kontrolliin, joka valmistettiin tavanomaisella kylmäkuivauksella, missä ensimmäinen sykli oli 40 tuntia ja toinen sykli oli kahdeksan tuntia pitkä, syklien kokonaiskestoaika oli noin 56 tuntia. Ensimmäinen 35 kuivaus suoritettiin -28 °C:ssa 40 tunnin ajan 1,3 x 10'3 6 94093 mbar:ssa (1 mikroni); toinen sykli pidettiin 26 °C:ssa. Ensimmäisen ja toisen syklin välinen aika oli noin kahdeksan tuntia lämpötilan noustessa tänä aikana 6,75 °C/tunti. Tämän erän kosteuspitoisuus oli 0,6 %.

5 Erät säilytettiin 5 °C:ssa. Elävän vesirokkovirus- rokotteen säilytyksen kestokyky määritettiin plakkeja muodostavina yksikköinä (PFU) suorittamalla plakkimääritys.

Arvioitu puoliintumisaika esitetään seuraavassa taulukossa:

10 Arvioitu puoliintumisaika lämpötilassa 2 - 8 °C

vesirokkovirusrokotteen Ar-annosteluerissä

Erä Kylmäkuivaus Kosteus-% Arvioitu puo liintumisaika _(kuukautta)

Erä I GI 2,2 4,6

Erä II GI 7,7 5,8 15 Erä III GI 6,4 6,4

Kontrolli 0,6 1,6 GI = kaasun annostelu kylmäkuivattaessa, kontrolli = 48 tunnin sykli, ei kaasun annostelua.

20

Voidaan siten havaita, että säilytysajan pidentyessä ne erät, joiden kosteuspitoisuus on korkeampi, ovat kestokyvyltään parempia kuin pienemmän kosteuspitoisuuden omaavat kontrollierät.

25 Esimerkki II

Yhdistelmä-MMRV-rokotteen valmistaminen Pakastetut erät tuhkarokko-, sikotauti-, vihurirokko- ja vesirokkorokotteita sulatettiin lämpimässä vesihau-• teessä (30 °C).

t 30 Tuhkarokko-osa: Käytettiin 100 ml tuhkarokkorokotetta, Edmondston, heikennetympi kanta, jonka tartuttavuustiitteri oli 4,95 log10 TCIDso/0,l ml.

7 94093

Sikotautiosa: Käytettiin 500 ml sikotautirokotetta, Jerryl Lynn -kanta (US-patentti 3 555 149), jonka tartuttavuustiitteri oli 5,4 log]0 TCID50/0,1 ml.

5 Vihurirokko-osa: Käytettiin 100 ml vihurirokkorokotetta; RA 27/3 -kanta Wistar, jonka tartuttavuustiitteri oli 4,65 log,0 TCIDjo/0,1 ml.

Vesirokko-osa: 10 150 ml vesirokkorokotetta, Oka-kanta, jonka tartut tavuustiitteri oli 320 000 pfu/ml.

Sulatuksen jälkeen osat yhdistettiin steriilissä 4 litran pullossa. Tähän 850 ml:n erään yhdistettyjä viruksia lisättiin seuraavat laimentimet: 15 50 ml - Minimum Essential Medium 0,0565 %, sorbitoli 4,291 %, gelatiini 4,985 %, natriumbikarbonaatti 0,354 %, albumiini 2,4 %.

525 ml - muunnettu gelatiini, Medium 0, sorbitoli-laimennin, joka sisälsi: Medium 199 6,82 %, sorbitoli 20 3,9725 %, gelatiini 3,9725 %, natriumbikarbonaatti 0,225 %.

225 ml - l-molaarinen fosfaattipuskuriliuos (kak-siemäksinen kaliumfosfaatti 5,72 %, yksiemäksinen kalium-fosfaatti 8,239 %).

« •55 1350 ml - SPGA/(sakkaroosi 7,46 %, kaksiemäksinen kaliumfosfaatti 0,135 %, yksiemäksinen kaliumfosfaatti 0,045 %, mononatriumglutamaatti 0,0956 %, albumiini 10 %).

Virusten ja laimentimien seos sekoitettiin pulloa pyörittämällä huoneen lämmössä. Sen jälkeen seos pidettiin 20 4 °C:ssa jäähauteessa täyttöä ja kylmäkuivausta varten.

Yhdistetty MMRV-rokote täytettiin 0,7 ml:n erissä lasisiin lääkepulloihin. Täytetyt pullot pakastettiin nes-tetypellä ja kylmäkuivattiin noin 1 %:n kosteuteen. Kylmä-kuivauksen jälkeen pullot korkitettiin ja suljettiin alu-35 miinipannoilla ja varastoitiin -20 °C:ssa.

8 94093

Kylmäkuivatuista näytteistä tehtiin tartuttavuuden määritys vakiomääritysmenetelmien mukaan. Lopulliset mää-ritystulokset:

Tuhkarokko = 3,3 log10 TCID50/0,1 ml = 2000 TCIDS0/ 5 0,1 ml sikotauti = 4,2 logl0 TCID50/0,1 ml = 16000 TCIDJ0/ 0,1 ml

Vihurirokko = 3,1 log,0 TCID50/0,1 ml = 16000 TCIDS0/ 0,1 ml 10 Vesirokko = 5170 PFU/ml.

Esimerkki III

Noin 50 pulloa MMRV-rokotetta valmistettiin esimerkissä II esitetyllä tavalla, mutta ne kylmäkuivattiin seuraavasti: 15 Pullot, joita ei oltu suljettu, mutta joiden päälle oli asetettu kaksivaiheisesti sulkeutuva kumikorkki, asetettiin esi jäähdytetylle kylmäkuivaajan (Usifroidkylmäkui-vaaja) hyllylle käyttäen hyllyn alkulämpötilana -45 °C. Ensimmäisen syklin ja toisen syklin sekä kaikkien muiden 20 muuttujien suhteen kylmäkuivaajaa käytettiin olosuhteissa, jotka olivat samanlaiset kuin mitä kuvattiin pelkän vesirokkoviruksen tuotantoerien II ja III valmistamiseksi, so. esimerkki I, ja tämä erä nimettiin tuotantoerä IV:ksi.

Kun pulloista testattiin tuhkarokko-, sikotauti-, 25 vihurirokko- ja vesirokkotehokkuus, oli selvää, että kaa-suannostelunäytteissä oleva tehokkuus vastasi tehokkuutta näytteissä, jotka oli kylmäkuivattu ilman kaasuannostelua (siis alempaan kosteuspitoisuuteen). Katso esimerkki II. Tulokset olivat seuraavat: 30 MMRV-tehokkuusmääritys kaasuannostelurokotteesta

Erä Vesi- Siko- Vihuri- Tuhka- Kosteus rokko tauti rokko rokko PFU/ml TCIDjo/ TCID50/ TCID50/ _0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml_

Erä IV 4,89 3,9 3,2 3,4 3,36

Claims (2)

1. 94093 Patentt ivaat imus Menetelmä sellaisen elävän herpesvirusrokotteen lyofilisoimiseksi, joka valinnaisesti yhdistetään tuhka-5 rokkorokotteeseen, sikotautirokotteeseen ja vihurirokkoro-kotteeseen nelitehoisen lyofilisoidun rokotteen muodostamiseksi, jolloin kukin rokote on läsnä määrässä, joka on tehokas immunisoimaan saajan kutakin virusta vastaan, tunnettu siitä, että rokote lyofilisoidaan kos-10 teuspitoisuuteen 2 - 8 % ja menetelmä käsittää primaarisen kaasuinjektiota sisältävän syklin ja sekundaarisen syklin, syklien kokonaisajän ollessa noin 7 - noin 11 tuntia.
2. 15 Patentkrav Förfarande för lyofilisering av ett levande herpes-virusvaccin, som valbart kombineras med ett mässlings-, pässjuka- och röda hund -vaccin för att bilda ett tetrava-20 lent lyofiliserat vaccin, varvid varje vaccin föreligger i en mängd effektiv att immunicera mottagaren mot viruset i fräga, kännetecknat därav, att vaccinet lyo-filiseras tili en fukthalt av 2 - 8 % och förfarandet om-fattar en primär cykel innehällande gasinjektion samt en 25 sekundär cykel, varvid cyklernas totala tid uppgär tili ca ·· 7. ca 11 timmar. • »· * - ♦' • - » ♦