PT87188B

PT87188B - Processo para a preparacao de um tensioactivo pulmonar natural e de composicoes farmaceuticas que o contem

Info

Publication number: PT87188B
Application number: PT87188A
Authority: PT
Inventors: Bengt Robertson; Tore Curstedt
Original assignee: Chiesi Farma Spa
Priority date: 1987-04-08
Filing date: 1988-04-07
Publication date: 1992-07-31
Also published as: ZA882416B; DK190088D0; DE3886970D1; ATE99949T1; FI92905C; HU211950A9; FI881508A; FI92905B; DE3886970T2; ES2004856T3; JP2700323B2; MY103260A; IE881008L; EP0286011A2; JPS6463526A; AU1433788A; IT1203873B; NO174733C; NO881515D0; US5024995A

Description

O objecto da presente invenção é a preparação de um agente tensioactivo pulmonar (PS) de origem animal, com uma toxicidade baixa e características de superfície óptimas, para utilização na prevenção e na terapêutica de IRDS (Sindroma de Dificuldade Respiratória da Criança) e ARDS (Síndroma de Dificuldade Respiratória do adulto) relacionado com HDM (Doença da Membrana Hialina).

funcionamento pulmonar normal depende da presença de uma substância particular, o agente tensioactivo pulmonar, que desempenha a função de estabilizar os alvéolos mediante a redução da tensão superficial, em particular durante a fase de expiração.

A presença de agente tensioactivo pulmonar é de vital importância no momento do nascimento.

A falta de PS constitui um factor-chave na patogénese de IRDS, uma doença que afecta entre 10 e 15% dos bebés recém-nascidos permaturos. Estes requerem ventilação artificial com concentração de oxigénio e pressão de insuflação elevadas. A taxa de mortalidade por IRDS é à volta de 25% e muitos dos sobreviventes permanecem com complicações / / / .

pulmonares crónicas principalmente devidas a uma ventilação artificial prolongada, e com disfunções neurológicas secundárias provenientes de dano por hipóxia cerebral.

A ausência do agente tensioactivo pulmonar é um factor importante também na ARDS. Esta patologia pode desenvolver-se nos casos de trauma múltiplo, aspiração, pancriatite, etc. com uma taxa de mortalidade entre 40 e 70%.

A administração de doses de suporte do agente tensioactivo em falta mostrou-se útil no tratamento destes estados patológicos.

Os agentes tensioactivos pulmonares conhecidos pertencem a três grupos fundamentais:

1. Agente tensioactivo pulmonar artificial

Têm sido descritas em várias patentes de invenção preparações de agentes tensioactivos artificiais com uma base de dipalmitoildifosfocolina ou de mistura de fosfolípidos em concentração e proporções variáveis associadas facultativamente com componentes tais como açúcares, aminoácidos, álcoois ou ácidos gordos: patente de invenção alemã N2 2900300 (Klitzing LV) ; patente de invenção japonesa N2 58222022 (Teijin KK) ; patente de invenção europeia N2 110498; patente de invenção norte-americana N® 4312860 (Universidade da Califórnia); patente de invenção alemã N2 3229169 (Natterman A & Cie GmbH); patente de invenção japonesa N2 1065821 (Tokyo Tanabe KK).

O agente tensioactivo artificial, contudo, a nível clínico-farmacológico, não demonstrou ser muito eficaz .

2. Agente tensioactivo pulmonar humano

Derivado por extracção do líquido amniótico.

Ainda que eficaz, demonstrou ser de pouca utilidade prática devido ao seu elevado teor de proteínas que pode conduzir à sensibilização do indivíduo tratado, e devido a dificuldades de preparação em larga escala, uma vez que são necessários 3 estados de gravidez terminais para se obter uma dose de ingestão de líquido amniótico. Também existe um risco elevado de contaminação por virus com possível transmissão de estados patológicos, tão graves como a SIDA.

3. Agente tensioactivo pulmonar natural

Extraído de pulmão de mamíferos e com uma eficcia comparável ao agente tensioactivo humano, este apresenta a grande vantagem da sua simplicidade de preparação e menor teor de proteínas.

Anteriormente já foram preparados agentes tensioactivos pulmonares de origem natural proveniente de extracção de animais. Por exemplo, a patente de invenção alemã N2 3021006, patente de invenção japonesa Ne 58045299 e a patente de invenção europeia Ns 119056 (Tokyo Tanabe KK), descrevem um método um tanto complexo que; através de uma série de operações, tais como centrifugações repetidas (850 x g a 20 000 x g), liofilização e várias extracções, conduz a um PS natural que contém além de fosfolípidos (75-95,5%) e de proteínas (0,5-5%), também hidratos de carbono (0,1-2%) lípidos neutros (0,3-14%) e colesterol total (0-8%), componentes não utilizáveis na acção farmacológica.

Também o agente tensioactivo preparado de acor4 do com a patente de invenção europeia Ne 145005 (Veb

Arzneimittel Dresden) contém, numa percentagem ainda maior, a 40%, uma fracção lípídica apoiar, não utilizável na actividade biológica e contém em substituição baixo teor de fosfolípidos (40-70%) que representam, pelo contrário, o componente fisiológico mais importante.

Finalmente, as patentes de invenção europeia

Ne 55041, japonesa N2 58183620, japonesa N2 58183621, japonesa N2 58164513 (Teijin KK) descrevem agentes tensioactivos naturais artificiais ou semi-naturais, isto é, aditivados de fosfolipidos sintéticos, totalmente desproteinizados. Nos estudos mais recentes foi atribuído à presença de proteínas um considerável significado funcional.

Após prolongados e aprofundados estudos, iniciados há vários anos, preparou-se um novo agente tensioacti vo pulmonar, assunto da presente invenção, cuja composição é óptima para uma actividade farmacológica equilibrada.

processo de preparação deste agente tensioactivo foi também desenvolvido, compreendendo a utilização de pulmões de animais, o que permite obter, om poucas operações de separação, a fracção requerida.

primeiro aspecto da presente invenção refere-se, portanto, a agentes tensioactivos pulmonares animais que apresentam as características seguintes:

a) relativamente a outras preparações, a concentração mais elevada de lípidos polares (99%), principalmente em fosfolípidos,

b) ausência total de componentes sem actividade tensioactiva, de hidratos de carbono livres, colesterol, triglice-

ridos e ésteres do colesterol (Suzuki Y., J. Lipid Res.

23, 62 - 69, 1982) e de outros lípidos neutros ineficazes sob o ponto de vista farmacológico (Nohara K., Eur.

J. Resp. Pis. 69 , 321 - 335, 1986);

c) a presença dum componente proteico cuja concentração máxima é menor do que 1 a 1,5%, caracterizado pela presença particularmente elevada de aminoácidos hidrofóbicos. A parte proteica é constituída exclusivamente por proteínas hidrofílicas de peso molecular compreendido entre 3 e 4 K (K = quilodaltons), que são importantes para a absorção dos fosfolipidos ao nível da interfase ar-líquido.

Um segundo aspacto da presente invenção refere-se a um método de preparação que através dum processo simples, reprodutível e praticável à escala industrial, permite a obtenção dum agente tensioactivo com as caracteristicas indicadas .

Os pulmões de animais triturados são lavados numa solução fisiológica. Em seguida, são filtrados e centrifugados com velocidades entre 1 000 e 5 000 x g durante um período compreendido entre 1 e 3 horas, conforme a velocidade .

A extracção do agente tensioactivo realiza-se em seguida com um dissolvente orgânico, de preferência constituído por uma mistura de álcool metilico/clorofórmio a 1:2. A fase orgânica é lavada com água e evaporada, obtendo-se deste modo uma fracção lipídica impura que é recuperada com um dissolvente orgânico, de preferência constituído por

uma mistura de 1,2-dicloroetano/diclorometano numa proporção de 1:4. Subsequentemente, o componente lipídico polar, constituído por fosfolípidos, é separado mediante cromatografia em gel do componente apoiar constituído por trigliceridos, colesterol e ésteres do colesterol.

A fracção fosfolípídica, a que tem utilidade clínica, é esterilizada por ultra-filtração e conservada a o uma temperatura de pelo menos -20 C. Alternativamente, esta o pode ser liofilizada e conservada a temperatura de -20 C.

A preparação do agente tensioactivo da presente invenção é exemplificada pormenorizadamente, em seguida sem limitação em qualquer sentido.

Exemplo 1

Trituraram-se pulmões de suino num misturador e os fragmentos de tecido foram lavados com uma solução fisiológica. A mistura foi filtrada e submetida a uma centrifugação preliminar a 1 000 x g à temperatura de 20°C durante 15 minutos para eliminar os fragmentos celulares. O líquido sobrenadante foi depois recentrifugado a 300 x g à temperatura de 4°C durante 2 horas.

agente tensioactivo sólido impuro foi retirado e extraído com uma mistura de clorofórmio/álcool metílico a 2:1, (v/v), filtrado, lavado com água para se obter um extracto lipídico impuro. O extracto da fracção lipídica (1 a 1,5 g) foi recuperado com 20 ml de uma mistura de 1,2-dicloroetano/álcool metílico a 1:4 (v/v) e separado por cromatografia de fase inversa numa coluna LIPIDEX -5 000 /

w (4 χ 21,5 cm; Packard Instruments Co.) utilizando uma mistura de 1,2-dicloroetano/álcool metílico a 1:4 (V/V) como eluente e a um caudal de 60-90 ml/h. A fracção 1 (0-270 ml) contém apenas fosfolípidos, a fracção 2 (270-405 ml) contém poucos fosfolípidos e outros lípidos polares, enquanto os lípidos apoiares (trigliceridos , colesterol e seus ésteres) ficam retidos na coluna.

A fracção 1 pode ser utilizada tal qual.

É possível recuperar os fosfolípidos contidos na fracção 2 de acordo com o processo seguinte. A fracção 2 é recromatografada na mesma coluna e a primeira fracção obtida (0-270 ml) é adicionada à fracção 1 proveniente da primeira cromatografia. As duas fracções reunidas são secas, a temperaturas inferiores a 40°C, dissolvidas numa mistura de cloro fórmio/álcool metílico a 98:2 (V/V), esterilizadas por filtração, com um pré-filtro de 0,45 jim e filtro de 0 ,2 yim e conservadas no congelador à temperatura de -20°C.

Exemplo 2

A fracção fosfolipídica obtida com o método descrito no Exemplo 1 é descongelada, sempre sob condições de esterilização, seca e re-suspensa numa solução fisiológica por meio de ultra-sons a uma frequência apropriada, isto é, a 45-50 quilohertz, com uma energia de 50 Watts. Esta é uma fase bastante crítica no processo de obtenção dum produto activo, uma vez que foi verificado experimentalmente que em certos casos, ainda que com variações moderadas da frequência sónica, ainda que permanecendo o produto inalterado nas suas características químicas e físico-químicas, pode influenciar

consideravelmente a actividade biológica.

A suspensão obtida deste modo é distribuída em ampolas para utilização terapêutica subsequente com uma concentração de 80 mg de fosfolípidos/ml da solução salina.

De acordo com o método descrito nos Exemplos 1 e 2 é possível isolar dos pulmões de um suíno adulto cerca de 200 mg de agente tensioactivo pulmonar, aproximadamente a quantidade de uma dose de produto para o tratamento de IRDS . Para o tratamento da ARDS são necessárias doses mais elevadas.

Para cada lote do produto realiza-se de cada vez a determinação da concentração em fosfolípidos e da composição e da quan tidade de outros componentes. 0 teor de proteína foi avaliado por meio da análise de aminoácidos.

O Quadro I representa a composição duma fracção fosfolipídica duma preparação obtida de acordo com o método descrito no Exemplo 1.

Quadro I: Composição em fosfolípidos de preparações tensioactivas. Os valores são fornecidos sob a forma média + D.P. para 6 lotes.

Fosfolípidos	mole	%
Fosfatidilcolina	75,1	+	3,3
Fosfatidiletanolamina	7,5	+	2,7
Fosfatidilserina	1,2	+	1,1
Fosfatidilinositol	7,2	+	1,7
Fosfatidilglicerol	3,5	+	1,3
Lisofosfatidilcolina	0,7	+	0,5
Esfingomielina	4,7	+	1,7

Com o objectivo de simplificação, na descrição que se segue, é feita apenas a referência à fracção fosfolipídica como o componente essencial e predominante do produto terapêutico .

As propriedades tensioactivas de cada lote também foram avaliadas à temperatura de 37°C com a técnica de bolha pulsante (Surfactometer International,

Toronto, Canada) (Enhorning G., J. Appl. Physiol. 43, 198

203, 1977).

Para uma concentração de mg/ml a preparação apresenta uma tensão superficial mínima compressão superficial numa pulsação de nN/m a 50% de minutos.

A esterilidade da preparação foi confirmada por análise bacteriológica.

A eficácia desta preparação foi ensaiada em animais, em casos de coelhos recém-nascidos prematuros com

IRDS expontânea e com ARDS induzida por lavagens pulmonares repetidas em cobaias.

Testes em animais

Para estes testes, realizados de acordo com o método descrito por Lachmann B. et al. Pediatr .__Res., 15,

833 - 838, 1981) utilizaram-se coelhos nascidos prematuramente por cesariana no 27² dia de gravidez, traqueotomizados e entubados imediatamente.

Onze desses coelhos foram tratados por administração através de sonda com o agente tensioactivo pulmonar preparado como se descreve na presente invenção, enquanto outros 15 não receberam qualquer tratamento e constituíam o grupo de controlo.

Todos os animais, os animais tratados e de controlo, foram ligados paralelamente a um respirador artificial, mantidos sob ventilação artificial com uma pressão constante de 100% de oxigénio com 40 acções/minuto e submetidos a uma sequência padronizada de pressão de insuflação. De facto os pulmões foram primeiramente expandidos por ventilação durante 1 minuto com uma pressão de 35 cm de H^O.

A pressão foi diminuída gradualmente em momentos diferentes para 15 cm de H^O. Finalmente, foi novamente aumentada até 25 cm de H^O durante 5 minutos. Determinou-se o volume tidal de 5 em 5 minutos.

Os resultados estão representados no Quadro II.

Quadro II: Valores médios obtidos em 11 animais tratados com agente tensioactivo e em 15 animais de controlo. Volume tidal (TV) em coelhos recém-nascidos prematuros ventilados durante 30 minutos com uma sequência padronizada de pressões de insuflação (P ).

Tempo	^pi	TV (Tratados)	TV (Controlo
(min)	(cm H₂O)	(ml/kg)	(ml/kg)
5	25	34,5	2,2
10	25	34,0	2,0
15	25	34,5	2,2
20	20	25,0	1,3
25	15	8,1	1,0
30	25	40,0	3,0

A	comparação dos animais tratados com os ani-
mais de controlo	evidenciou um aumento notável do volume ti-

dal.

A	análise histológica de cortes de pulmão em
parafina corados	com hematoxilina e eosina, examinados ao mi-

croscópio, mostrou um aumento notável do volume do compartimento alveolar no grupo de animais tratados.

Obtiveram-se resultados similares por meio de administração do agente tensioactivo, objecto da presente invenção, em cobaias com insuficiência respiratória induzida de acordo com o método descrito por Berggren P. et al., Acta Anesthesiol. Scand. 3 0 , 321 - 328, 1986.

Nos casos tratados, como se mostra no Quadro

III, houve uma recuperação mais rápida para os valores nor mais das trocas de gás em comparação com os casos de contro lo .

Quadro III: Gases sanguíneos de cobaias adultas com insuficiência respiratória induzida por lavagem repetida dos pulmões (valores médios). A experiência foi realizada num total de 41 cobaias adultas submetidas a lavagem repetida dos pulmões com solução de cloreto de sódio normal tépida (37°). Os animais que apresentaram os níveis menores de PaO₂ (média: 5,6 KPa) foram utilizados para a determinação do efeito de substituição de agente tensioactivo; os restantes animais (média: PaO^: 8,1 KPa), não foram tratados e foram utilizados em controlo.

Tempo		Tratados			Controlos
(min)	paO₂		paC0₂
		(Kpa)			(Kpa)
0*	7,5		8,2	8,0	6,8
15	47		5,9	9,0	7,0
30	48		5,5	10,0	7,2
45*	50		5,3	10,1	7,0
60	55		5,0	10,3	6,9

* Tempo de instilação duma dose de PS nos animais tratados.

Testes Clínicos

Os exames clínicos foram realizados em centros especializados para bebés recém-nascidos prematuros com a

Doença da Membrana Hialina que revelaram grande insuficiência respiratória e, apesar de ventilação mecânica intermitente com uma pressão positiva com uma percentagem de oxigénio su perior a 60%, apresentaram hipóxia, hipercapnia e acidose.

Os resultados obtidos com estudos controlados realizados num grupo de 10 bebés recém-nascidos, tratados com o agente tensioactivo da presente invenção e tratados com terapêutica convencional constituindo o controlo, são referidos a seguir.

No momento do tratamento, os doentes foram des ligados do respirador e o agente tensioactivo foi injectado no tubo endotraqueal com uma dose de 2,5 ml/kg, igual a 200 mg de fosfolípidos/kg.

Após a administração, os bebés foram ventilados manualmente com uma bolha durante um minuto e com uma frequência de 40 a 60 acções/minuto com a mesma gasosa previamente utilizada.

Os doentes foram, em seguida, ligados outra vez ao respirador, como anteriormente; as variações subsequentes foram feitas de acordo com a resposta e modificação clínicas dos gases sanguíneos.

Os bebés que constituem os grupos de controlo também foram desligados do ventilador e ventilados manualmente durante 2 minutos nas msmas condições utilizadas para os doentes tratados com o agente tensioactivo.

A eficácia do tratamento foi documentada pelo movimento dos diversos índices do funcionamento respiratório

Em particular, durante cerca de 5 minutos, os valores de (P^ressão parcial de oxigénio arterial) começaram a diminuir rápida e dramática, de modo que a relação pa/AC^ (relação entre as pressões parciais de oxigénio a nível arterial e nível alveolar) alcançou aos 15 minutos um valor médio vezes superior ao inicial (30,6 contra 10,4;

p <0,001) , estabilizando em seguida após uma ligeira diminuição entre a primeira e a segunda hora, em valores aproximadamente duplos dos valores iniciais

Pelo contrário, no grupo de controlo a relação pa/AC^ não mostrou alteração notável no valor médio inicial de 7,62.

Também os achados pulmonares radiológicos documentavam uma melhoria da patologia nos indivíduos tratados com uma diminuição da retenção de líquidos do parenquima e na descontracção dos bronquíolos

As determinações radiológicas nos bebés do grupo de controlo, por seu lado,, não revelaram qualquer alteração significativa durante as primeiras 48 a 72 horas de observação.

É importante sublinhar finalmente que nos casos tratados com o agente tensioactivo pulmonar da presente invenção se obervou uma redução significativa no tempo de tratamento com a ventilação artificial para pressão positiva e na duração da terapêutica com oxigénio.

Estes factos permitiram uma redução da duração da terapêutica intensiva, altamente dispendiosa, e dos riscos relacionados com tratamentos invasivos. Diversos autores, de r

/ (_____ / ,

facto, reconhecem que a lesão pulmonar consequente de IRDS está associada também à terapêutica de ressuscitação e em particular à exposição prolongada a concentrações de oxigénio elevadas.

Além disso, não existe prova de complicações imunológicas nos doentes sobreviventes, o que confirma a baixa antigenicidade do agente tensioactivo da presente invenção .

A utilização de agentes tensioactivos exógenos adquir uma importância considerável na prevenção e na terapêutica das sindromas de doenças respiratórias.

Para a utilização terapêutica prevista, mostrou-se particularmente apropriado as suspensões de fosfolípidos em solução fisiológica com uma concentração de 80 mg/ml instiladas em doses de 2,5 mg/kg equivalente a cerca de 200 mg de fosfolípidos/kg de massa corporal. O tratamento é realizado, normalmente, por instilação endotraqueal directa da suspensão. Outra possibilidade de administração é a nebulisação.

Claims

1,- Processo para a preparação de um tensioactivo pulmonar de origem animal, constituído por uma fracção proteica e por uma fracção lipídica polar, presente pelo menos em 98 %, em peso, constituída, por sua vez, por uma mistura de, pelo menos 95 %, de fosfolípidos, caracterizado pelo facto:

a) de se triturarem os pulmões de animais, de se lavarem com soluçào de cloreto de sódio e de se separar o tensioactivo in toto mediante subsequente filtração, centrifugação e extracção com um dissolvente orgânico;

b) de se recolher a fracção lipídica bruta por evaporação do dissolvente; e

c) de se separar finalmente o componente lipídico polar, constituído principalmente por fosfolípidos, do componente apoiar, mediante cromatografia sobre gel.

2.- Processo de acordo com a reivindicação 1, para a prepa ração de um tensioactivo pulmonar caracterizado pelo facto de a fracçao fosfolípidica ser constituída por pelo menos 70-75 %, em peso, de fosfatidilcolina e de esta ser constituída pelo menos por 40 a 45 %, em peso, de dipalmitoildifosfatidilcolina.

3. - Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de um tensioactivo pulmonar, caracterizado pelo facto de o componente proteico, ser constituído exclusivamente por proteínas de baixo peso molecular, compreendido entre 3 e 14 quilodaltons.

4. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se separar o extracto lipídico bruto por meio de cromatografia de fase inversa com uma coluna de Lipidex-5000 com uma mistura de 1,2-dicloroetano/metanol a 1:4, V/V.

5.- Processo para a preparação de composições farmacêuticas em frascos-ampola para inalação ou administração endotraqueal, para a prevenção e cura da síndroma de depressão respiratória na criança e da síndroma de depressão respiratória no adulto e para patologias pulmonares de etiologia diversa com condição de insuficiência respiratória grave, caracterizado pelo facto de se preparar uma suspensão contendo, como ingrediente activo, uma quantidade eficaz de tensioactivo pulmonar preparado de acordo com uma qualquer das reivindicações de 1 a 4, em uma solução fisiológica com uma concentração tal que corresponda a uma quantidade de fos18 folípidos compreendida entre 50 e 100 mg/ml,