PT86322B

PT86322B - Processo para a preparacao duma substancia organoespecifica marcada com tecnecio-99m e de conjuntos para analises e agentes de diagnostico que a contem

Info

Publication number: PT86322B
Application number: PT86322A
Authority: PT
Inventors: Ludwig Kuhlmann; Axel Sfeinstraber; Alexander Schwarz; Karl-Heinz Bremer
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1986-12-10
Filing date: 1987-12-09
Publication date: 1990-11-07
Also published as: DK167851B1; IL84751A; GR3019471T3; NO875138D0; AU8226387A; IE60604B1; EP0271806A2; NO177625B; EP0271806B2; FI875396A0; DE3783745D1; KR880007456A; JP2550481B2; EP0271806A3; PT86322A; FI92075C; NO875138L; JPS63162628A; HUT46025A; PL269331A1

Description

objecto da presente invenção é um processo para a preparação duma substância organoespecífica marcada com tecnécio-99m, para a preparação dum conjunto de análise apropriado para a sua formação e para a preparação de um agente de diagnóstico contendo a referida substância organoespecífica marcada.

Depois dos trabalhos pioneiros de Milstein e KÕher, que em 1975 publicaram um processo no qual fundiram linfócitos B de rato que segregavam anticorpos com células de mieloma de rato dando origem a um produto de fusão das duas células, um híbrido, que possui capacidade de continuar a multiplicar-se e produz anticorpos, é possível isolar a partir dos numerosos híbri dos existentes aquele que produz um anticorpo com uma especifici = 1 M.

dade determinada. Estes anticorpos monoclonais, que só reconhecem um epítopo determinado no antigene correspondente, são hoje utilizados em grande quantidade na imunocintilografia. Os anticorpos monoclonais contra antigenes associados a tumores são apropriados para o diagnóstico de localização de tumores bem como para a detecção de recidivas e de metásteses. Para este fim os anticorpos devem ser marcados com isótopos radioactivos a fim de verificar por meio de técnicas de observação apropriadas usadas em medicina nuclear se se detecta no organismo um tumor que contenha o antigene. De entre os radionuclidos mais frequentemente utilizados em diagnóstico por medicina nuclear os de mais fácil uso para marcação de proteínas são,isótopos de iodo. Nesta linha, o iodo-123 preenche mais completamente as exigências de aplicação prática, como sejam boa sensibilidade e baixo nível de radiação, uma vez que apresenta uma radiação ypura com uma energia favorável 2fde 159 keV, 0 período de semi-desintegração relativamente curto de 13,2 horas e principalmente a prepara ção dum acelerador ligado de partículas por meio da qual também se evita um custo relativamente elevado tornam o emprego do iodo· -123 especialmente adequado à marcação de anticorpos. Muitas vezes a marcação de anticorpos é levada a efeito com iodo-131, ape sar deste não ser um radionuclido ideal para diagnóstico in vivo em virtude de apresentar uma radiação de energia não favorável para câmaras gama e de possuir no espectro de radiação também ra diação y, que é inconveniente. Esta utilização é devida ao facto de o 1-131 poder ser obtido com altas concentrações em actividade e com uma actividade específica bastante elevada a baixo custo, sendo portanto um agente de marcação simples e económico.

A principal desvantagem de todos os anticor pos marcados com iodo reside no facto de que se verificam perdas de iodo radioactivo no anticorpo devido à ocorrência de processos de desiodinação parcial in vivo, ficando o iodo presente no organismo sob a forma de iodeto, que por um lado é armazenado nas glândulas de defesa e por outro lado provoca um aumento da radioactividade de base, uma vez que o iodeto é eliminado do sangue com relativa lentidão. Para a aplicação de anticorpos marcados com iodo torna-se sempre necessário bloquear previamente as

glândulas de defesa da pessoa em observação. Os anticorpos marca dos com iodo apresentam no entanto uma vantagem indubitável devi do à sua acumulação no fígado e nos rins para a duração dos exames habitual nitidamente inferior à de anticorpos semelhantes mas marcados com outros radionuclidos.

Recentemente foi introduzido em muitos casos o uso de Tn-111 para marcação de anticorpos. Sendo um elemento metálico, o índio, ao contrário do que acontece com o iodo, não se liga às proteínas sem operaçães adicionais. Torna-se necessária para esse fim a utilização de agentes quelantes bifuncionais que formem, por um lado, uma ligação covalente com a proteína, e por outro lado que o índio presente sob a forma dum catião se possa ligar ao anticorpo através dum grupo que possa formar complexos fortes. 0 complexão mais usado para este fim 6 o ácido dietilenotriamina-pentaacético (ADTP). 0 ADTP é feito reagir com o anticorpo sob a forma dum anidrido bicíclico. Para este fim forma-se em primeiro lugar uma ligação de amida covalente com grupos amina terminais da proteína e em seguida libertam-se as restantes funçães ácidas por meio de reacção com água. 0 anticor po derivatizado deste modo pode então ligar firmemente o radionu elido adicionado sob a forma de citrato de índio 111. 0 índio de ve ser utilizado sob a forma dum composto lábil, uma vez que dou tro modo seria precipitado aos valores de pH necessários. 0 anidrido bicíclico do ADTP não é um reagente ideal, uma vez que pode participar em reacçães de acoplamento intermoleculares e intramoleculares devido à sua bifuncionalidade.

Enquanto que o gálio não apresenta qualquer vantagem em comparação com o índio, já a marcação com o tecnécio-99m apresenta-se favoravelmente como potencial técnica para diagnóstico, uma vez que o Tc-99m se tornou um radionuclido importante para diagnóstico em medicina nuclear em virtude das suas propriedades físicas especialmente favoráveis (ausência duma radiação corpuscular, energia de 140 keV e período de semi-desinte^ gração de 6 horas) e do reduzido nível de radiação associado.

tecnécio-99m, que pode ser obtido em gera- • dores de nuclidos, apresenta-se principalmente sob a forma de * pertecnetato, sendo adequado sob esta forma, por exemplo para

utilização em cintilografia de glândulas de defesa e do cérebro. A cintilografia de outros órgãos por meio de tecnécio-99^m pode ser efectuada mediante a utilização de substâncias de transporte”, que por um lado possuem a capacidade de estabelecer uma ligação com o tecnécio e por outro lado dirigem o radionuclido ao orgão que se pretende atingir com elevada selectividade. Com este objectivo são até agora utilizadas principalmente substâncias que se podem marcar directamente com tecnécio-99m θ que apresentam uma elevada especificidade em relação ao orgão alvo. Para alem destas existe, no entanto, uma série de substâncias que apresentam também uma elevada especificidade em relação aos orgãos a atingir mas que não se podem marcar directamente. Estas substâncias podem ser proteínas (fibrinogénio, albumina do soro humano), enzimas (estreptoquinase, lactato-de-hidrogenase), açúcares (dextrano, glucose) ou também polímeros. A esta categoria pertencem igualmente substâncias de baixo peso molecular, como ácidos gordos, que se concentram nos tecidos do miocárdio em vir tude das altas necessidades de energia do coração.

Para marcação duma substância de transporte” organoespecífica com tecnécio-99m deverá em primeiro lugar transformar-se o pertecnetato eluído do gerador de nuclidos num grau de oxidação mais reduzido. Sob esta forma reduzida o tecnécio constitui compostos mais ou menos estáveis com a substância organoespecífica. Para a cintilografia óssea utilizam-se, por exemplo, compostos de Tc-99^m com derivados de ácidos fosfóricos, principalmente com derivados orgânicos de ácidos fosfóricos. Dejs te modo pode ser considerado como uma substância de transporte organoespecífica o resultado da marcação do sal sódico do ácido 3,3-difosfono-l,2-propanodicarboxílico, descrito na Patente Eur£ peia 2485. Na Patente Europeia 108 253 são descritos ácidos Tc-99m-trifosfóricos e Tc-99m-tetrafosfóricos para a apresentação de RES por cintilografia, especialmente do fígado. 0 complexo de Tc-99m com ácido dietilenotriaminaacético (ADTP) é utilizado para diagnóstico de doenças de rins e de processos patológicos renais.

Uma vez que a marcação directa, por exemplo de anticorpos, com tecnécio não é possível, investigou-se, de mo• do semelhante ao realizado para a marcação com índio, mediante a

utilização de agentes auxiliares bifuncionais de formação de con. plexos, um modo de conseguir uma marcação estável de anticorpos com tecnécio. 0 problema principal na marcação com tecnécio consiste em que normalmente existem na solução de reacção iães estanho-TI. 0 estanho-II é o único agente redutor até agora conhecido que permite uma transformação rápida e quantitativa de tecnetato à temperatura ambiente num estado de oxidação inferior e em consequência mais reactivo. Os iães estanho-TI e estanho-TV presentes em conjunto com o tecnécio reduzido competem em relação aos locais de ligação do complexo ligado ao anticorpo, de mo do que ou terá de se usar o agente de complexação em excesso, po dendo deste modo ser influenciadas as propriedades específicas do anticorpo, ou o tecnécio não ligado e o estanho sob a forma dum colóide conjunto, provocam uma acumulação de radioactividade não desejada em outros orgãos.

Na Patente US 4 479 930 citam-se exemplos de anidridos cíclicos de ATPA e de EDTA como agentes quelantes não apenas para o In-111 e o Ga-67, mas também para o Tc-99m. Na Patente Europeia 35 765 refere-se a utilização de Deferoxamina como agente de complexação para o tecnécio-99m em proteínas. No pe. dido de Patente Internacional WO 85/3063 descreve-se a reacção da ponte de dissulfureto parcialmente reduzida em anticorpos com o sal sádico do tetracloronitridotecnetato, o qual deve ser previamente preparado por reacção do pertecnetato com azida de sódio. No pedido de Patente Europeia 194 853 utiliza-se igualmente, por meio de redução em fragmentos de anticorpos, grupos tiol livres formados para ligação dum complexo quelato que é bastante incómodo para a síntese de ácido (7-Maleiimido-heptil)-imino-bis-(etilenonitrilo)-tetraacético. 0 acoplamento do complexo aos anticorpos é levado a efeito por reacção dos grupos SH com a dupla ligação na fracção de maleiimida do complexo, enquanto o ião metálico radioactivo ó complexado com o resíduo de ácido nitriloacético.

Na Patente Europeia 5638 e na Patente US 4 478 815 descrevem-se métodos mais simples de marcação de anticorpos ou de fragmentos de anticorpos com Tc-99m. Para esse fim • utilizam-se sais de estanho-II em excesso para simultaneamente

efectuar a cisão redutiva das pontes de dissulfureto e a redução do pertecnetato Tc-99m adicionado. Em geral, para a cisão de. ligação —S—S— é necessário um período de incubação superior (24 h), enquanto que os fragmentos F(ab*)₂ são cindidos parcialmente dando origem a fragmentos F(ab‘). Dados recentes da literatura (p. ex Journal of Nuclear Medicine 27 (1986), pág. 685 - 93 e 1315 - 20 e Znternational Journal of Nuclear Medicine Biology 12 (1985), pág. 3-θ) mostram que a proporção entre os dois fragmentos é função da reacção de estanhagem” e que a proporção dos dois componentes depois da marcação com Tc-99m já não varia significativamente, sendo o principal componente o fragmento F(ab’) marcado com Tc-99m. Em todos os casos torna-se necessária uma purificação adicional do fragmento F(ab‘) marcado, uma vez que apesar de se utilizar um tempo de reacção de 30 minutos no mínimo não se consegue uma transformação quantitativa do pertecnetato.

Até agora não era possível, de acordo com os processos de marcação acima mencionados, obter preparados que pu dessem ser utilizados em rotina sem fases processuais incómodas.

Descobriu-se agora um processo para a preparação duma substância organoespecífica marcada com tecnécio-99m de acordo com o qual se faz reagir uma substância organoespecífi ca previamente tratada ou acoplada ao agente complexante para tecnécio-99m com pertecnetato-99m e com um agente redutor que tenha a capacidade de estabilizar complexos.

Deste modo as referidas substâncias organoes pecíficas (substâncias suporte) são marcadas com tecnécio-99m, contendo na respectiva molécula pelo menos um grupo funcional com propriedades complexantes. Na maioria dos casos trata-se de grupos de átomos ou de iães com função dadora de pares de electrães (bases de Lewis). São exemplos destes grupos funcionais com propriedades complexantes os seguintes grupos

-SCN-, -NH₂-, -NHR-, -NR₂-, -COO-, -OH-, =S-, -SH-, -N0-.

Como representantes das referidas substâncias com grupos funcionais capazes de formar complexos podem,

por exemplo, referir-se:

proteínas (grupos -NH-, -NHg- ou -COO), enzimas (grupos -NH^-, -OH- e -P«o), açúcares (grupos -OH) ou polímeros contendo os coi respondentes grupos funcionais nas cadeias laterais.

Quando o composto a marcar não contém um grç po funcional como os definidos, tornaese necessário antes da mai cação levar a efeito um tratamento prévio da substância ou acoplá-la a um agente complexante adequado.

Por tratamento prévio”, no sentido dado na presente invenção, entendem-se as medidas que conduzem a dotar as moléculas que se pretendem marcar de grupos funcionais com propriedades complexantes. Como exemplo podem referir-se as pontes de dissulfureto presentes em anticorpos. Os dois átomos de enxofre ligados entre si por ligaçSes covalentes não possuem, no entanto, a capacidade sob essa forma de formar complexos com teç nécio-99m. Contudo, quando se reduzem as pontes de dissulfureto, obtêm-se dois grupos -SH, os quais são óptimos ligantes de complexação para o tecnécio-99»n permitindo uma ligação deste com bom rendimento.

Uma outra possibilidade de promover a ligação de tecnécio-99^m a substâncias organoespecíficas que não possuem quaisquer grupos funcionais com propriedades complexantes baseia-se na formação dum grupo funcional adequado na molécula ou na ligação à molécula dum agente de complexação.

Um aspecto essencial da invenção reside no facto de que a substância a marcar não entra em contacto directo com o agente redutor, de preferência um sal de estanho-II. 0 sal de estanho-II é previamente separado do meio por reacção com um reagente apropriado, formando-se um agente redutor estabiliza do em relação aos complexos. 0 reagente pode ser um composto de fósforo, como por exemplo um fosforato ou um pirofosfato, um bom complexante geral, como seja o ácido etilenodiaminatetraacético, ou outro reagente que reaja com o estanho-II de tal modo que o estanho-II se conserve em solução a um valor de pH fisiológico (6 a 8) e deste modo o redutor se mantenha funcional (agente redutor estabilizado em relação aos complexos).

Considera-se especialmente interessante o processo para a marcação de anticorpos por tecnécio-99ra. Uma re dução parcial das ligações -S-S- do anticorpo ou dum fragmento F(ab*)2 do anticorpo pode ser levada a efeito à temperatura ambiente por acção de redutores durante períodos curtos (tratamen to prévio da substância organoespecífica). Constituem redutores especialmente adequados os monotióis, como 2-mercaptoetanol ou 2-mercaptoetilamina (cisteamina). Nestas condições obtêm-se moléculas de anticorpos reactivas que nem perderam a respectiva reactividade imunológica nem foram fragmentadas em pequenas fracções. Basicamente qualquer redutor é adequado para a redução parcial de anticorpos ou de fragmentos F(ab’)g de anticorpos, mesmo os que apenas provocam a cisão de uma parte das ligações -S-S- após longo tempo de acção e que não conduzem a qualquer fragmentação dos componentes dos anticorpos. 0 período de acção dum redutor como estes sobre os componentes dos anticorpos não deverá ser superior a uma hora. Em geral, após 10 a 30 minutos já foram obtidos tantos grupos -SH que se consegue ligar uma quantidade suficiente de tecnécio-99m* Nesse momento elimina-se o excesso de agente e recolhe-se o anticorpo parcialmente reduzido numa solução tamponizada (p. ex. solução de fosfato 0,02 M a pH 7,2) e liofiliza-se imediatamente. Nesta operação deve-se evitar uma reoxidação dos grupos tiol livres nos anticorpos por meio do oxigénio do ar. Os anticorpos liofilizados, que não contém qualquer aditivo para além dos sais do tampão e que estão sob uma camada gasosa protectora de azoto, podem ser conservados sem alteração durante semanas à. temperatura normal dum frigorífi co (-5 a +5° C); podem ser completamente dissolvidos de novo por adição de solução isotónica de cloreto de sódio.

Os componentes de anticorpos parcialmente re duzidos obtidos deste modo (substâncias organoespecíficas submetidas a tratamento prévio) podem agora ser marcadas sem dificuldades com tecnócio-99m por adição duma mistura de pertecnetato e de fosfonato ou de pirofosfato de estanho-II. É especialmente vantajoso utilizar para fosfonato d.e estanho-II um difosfonato, trifosfonato ou tetrafosfonato. Consideram-se especialmente preferidos os sais de estanho-II dos ácidos metanodifosfónico, ami nometanodifosfónico, 3,3-difosfonopropiónico, 3,3-difosfono-1,2-propanodicarboxilico ou propano-1,1,3,3-tetrafosfónico. Ejs tes fosfonatos complexos contendo estanho já foram descritos nas Patentes Europeias 24 85 e 108 253 © podem ter ampla utilização como agentes de marcação por tecnécio para a cintilografis. do esqueleto e do fígado. È igualmente adequado o pirofosfato de estanho-II, enquanto que o dietilenotriaminapentaacetato de estanho-II não é apropriado.

Para a preparação dum meio de diagnóstico pronto a usar pode-se proceder de modo a se dissolver em primeiro lugar o componente que contém o anticorpo liofilizado numa solução de pertecnetato contendo tecnécio-99m e em seguida provocando a redução e a ligação do tecnécio ao anticorpo por adição duma solução do componente contendo o estanho-II.

Também se pode, no entanto, preparar um meio de diagnóstico dissolvendo em primeiro lugar o componente conter, do o anticorpo na solução que contém o estanho-II e em seguida adicionando a solução de pertecnetato com tecnécio-99m a fim de marcar o anticorpo com tecnécio.

Para a preparação dum meio de diagnóstico contendo uma substância organoespecífica contendo tecnécio-99m é possível, caso se pretenda reunir os componentes num conjunto de análise pronto a utilizar (”test kit), incluir dois componentes separados, de preferência liofilizados, dos quais um componente contém a substância organoespecífica, eventualmente submetida a um tratamento prévio, ou a substância organoespecífica acoplada a um complexante para o Tc-99m, eventualmente misturada com um tampão, e o outro componente contém o agente redutor estabilizado perante complexos, de preferência o sal de estanho-II estabilizado, necessário para a redução e para a ligação do tecnécio à substância organoespecífica. Constatou-se ser especialmente adequado um conjunto de análise no qual a substância organoespecífica liofilizada e eventualmente pré-tratada se encontra em mistura com uma substância tampão constituída por hidrogenofosfato dissódico (pH 7,2). Deste modo obtém-se após um tempo de reacção curto, p. ex. apenas 5 minutos, uma marcação da substância com tecnécio-99m quase quantitativa, contendo como dite

impurezas menos de 1$ de pertecnetato livre e apenas quantidades muito reduzidas do componente de estanho-II marcado com Tc-99m, de modo que deixa de ser necessário levar-se a efeito o processo final de purificação.

A embalagem separada da substância organoejs pecífica e do componente de estanho-II garante uma conservação sem alterações do preparado liofilizado. Deste modo garante-se uma marcação da substância organoespecífica correcta, rápida e sem problemas. A quantidade de estanho-II necessária para a redução do pertecnetato é naturalmente pequena, da ordem de grandeza de alguns microgramas. Quando se usam fosfonatos ou pirofosfatos são necessários 1 a 100 micrograma, de preferência 5 a 10 micrograma, referido a estanho-II, a fim de se obter uma marcação estável com tecnécio-99m.

Os fosfonatos ou pirofosfatos de estanho-II utilizados de acordo com o processo da presente invenção são especialmente adequados para a marcação de anticorpos reduzidos ou de fragmentos de anticorpos reduzidos, em virtude de formarem um complexo estável a um valor de pH neutro, como é requerido para a marcação, apesar de ligar o catião de tecnécio reduzido apenas de modo frouxo, de tal modo que é possível permutar aquele catião facilmente com um grupo tiol do anticorpo ou dum fragmento .

estabilizador existente na maioria dos agentes de marcação resulta também vantajoso na marcação de anticorpos, uma vez que garante uma conservação mais duradoura da solução injectável.

Com os ácidos N-(4-aminobenzoíl)-glutâmicos descritos ne pedido de Patente Europeia 141 100, que podem ser empregues como componentes de estabilização nos difosfonatos utilizados na cintilografia do esqueleto, é possível conseguir uma conservação extraordinária dos anticorpos marcados com tecnécio.

Os anticorpos marcados com tecnécio-99in preparados de acordo com o processo da presente invenção ou os respectivos fragmentos de anticorpos FÍab*^ são adequados para uma utilização preferencial para detecção in vivo de tumores. De pre ferência utiliza-se um anticorpo monoclonal ou respectivo fragmento F(ab’)g que reage com os antigenes associados ao tumor.

Exemplo 1 mg do anticorpo monoclonal BW 431/31 dirigido contra o antigene carcino-embrional (CEA), o qual é utiliza do para o diagnóstico do carcinoma do colo do recto, foram purificados por diálise à temperatura ambiente a fim de obter um anticorpo isento de aditivos como a sucrose, sendo em seguida torre, do isotónico com solução de cloreto de sódio. Este anticorpo é descrito na publicação de pedido de Patente Alemã 34 16 774 e por Bosslet et al., Int. J. of Câncer 36, 75-θ4 (19θ5)· anticorpo, numa concentração final de cerca de 5 mg por ml, foi feito reagir com um total de 20 mg de 2-mercaptoetanol à temperatura ambiente (30 minutos) e em seguida foi separado do redutor em excesso por filtração em gel em Bio-Gel P-2, um gel de poliacrilamida da firma Bio Rad. 0 anticorpo dissolvido em tampão de fosfato 0,02 M (pH 7,2) foi imediatamente recolhido e liofilizado. As amostras liofilizadas continham 2 mg do anticorpo por cada frasco e cerca de 1,4 mg de hidrogenofosfa to dissódico.

Para marcação com tecnécio-99m, cada amostra foi tratada com 7,5 ml de solução de pertecnetato com um máximo de 3000 MBq (cerca de 80 mCi). Como componente de estanho-II foi utilizada uma unidade de marcação liofilizada constituída por 5 mg do sal sódico do ácido 3,3-difosfonopropiónico, 0,1 mg de catiães de estanho-II e 0,5 mg de ácido N—(4-aminobenzoíl)-L—gluta mico. Esta mistura foi dissolvida em 5 ml de solução fisiológica de cloreto de sódio e logo em seguida (depois de 1 minuto) adicionaram-se 0,5 ml desta solução à solução do anticorpo, obtendo^ -se um volume final de 8 ml. Após um período de reacção de 10 mi nutos determinou-se o rendimento de marcação por cromatografia em camada fina, filtração em gel através de Biogel P-10 e cromatografia líquida de alta pressão através de Zorbax GF 250 da fir ma DuPont.

Mais de 95$ da actividade do tecnécio-99m estava ligada a proteínas, cerca de 1$ situava-se na fracção de fosfonato, enquanto que menos de 1$ estava sob a forma de pertecnetato. A fracção sob a forma de pertecnetato aumentava novamente por um período de repouso prolongado; após 6 horas já era cerca de 2$, enquanto que a fracção ligada a fosfonato se conser vava invariável em cerca de 1$.

A determinação da fracção imunorreactiva em diferentes anticorpos marcados com tecnécio-99m por medida da li gação a células tumorais deu valores para a imunorreactividade em boa concordância com os valores correspondentes determinados com anticorpos de CEA marcados com iodo-131 e com índio-111 (Qua dro 1).

Quadro 1:

Comparação da imunorreactividade ($) de anticorpos monoclonais marcados com os radionuclidos 1-131, In-111 e Tc-99m.

Anticorpos monoclonais

BW 431/31

BW 431/26

BW 494/32

:-131	In-111	Tc-99m
85	75	90
85	70	95
65	45	70

anticorpo BW 431/26 referido no Quadro é conhecido da publicação de pedido de Patente Alemã 34 16 774, na qual foi designado por ΜΑΚ VIII. 0 anticorpo monoclonal BW 494/32 está descrito no pedido de Patente Alemã P 35 31 301.3·

Exemplo 2 (Exemplo de comparação) anticorpo monoclonal BW 431/31 foi tratado de modo semelhante ao descrito no Exemplo 1 mas sem tratamento com 2-mercaptoetanol. 0 anticorpo obtido, que em virtude daquela alteração no procedimento não possuía qualquer grupo tiol livre, deu na reacção com pertecnetato na presença duma quantidade igual de difosfonato de estanho, levada a efeito como no Exemplo 1, um produto no qual apenas cerca de 1$ do tecnécio-99*ⁿ estava ligado à proteína, enquanto que a maior parte (mais de 50$) esta w-τ

va sob a forma de difosfonato de tecnécio-99m, e além de tecnócio reduzido não ligado (31%) ainda existia uma fracção considerável de pertecnetato livre (15%).

Exemplo 3

Para marcação com tecnécio-99m dum anticorpo monoclonal BW 494/32 dirigido contra um antigene de muco associado ao carcinoma do pâncreas, incubaram-se durante 20 minutos à temperatura ambiente 20 mg desta substância, dissolvida em 2 ml de solução de cloreto de sódio isotónica, com 0,5 ml duma solução aquosa a 1% de cloridrato de cisteamina. 0 anticorpo modi ficado purificado por cromatografia em coluna e dissolvido em so lução tampão de NagHPO^ 0,02 M foi liofilizada em porçães de 2 mg cada. 0 componente de estanho-II para a marcação do anticorpo com tecnécio foi um conjunto de marcação â base de pirofos fato contendo 7>2 mg de NagPgO^ e 1,03 mg de cloreto de estanho-II por unidade. 0 conteúdo duma embalagem foi dissolvido em 10 ml de solução fisiológica de cloreto de sódio e adicionaram-se

2-h

0,25 ml, correspondentes a cerca de 14 μg de Sn , desta solução de anticorpo que previamente tinha sido dissolvido em cerca de 8 ml de solução de pertecnetato (cerca de 2000 MBq). Após um perío do de reacção de 10 minutos aplicaram-se alíquotas de 0,1 ml cada da solução com a seguinte constituição e

cerca de

5	PS	do ame
2,25	PS	de Na^PgO?
0,175	PS	de estanho-II
,8	ps	de tampão de Na^HPO^

a ratazanas saudáveis por via iv.. A repartição pelos orgãos 24 horas após a injecção é apresentada no Quadro 2. A partir destes valores verifica-se que a acumulação nos ossos, nas glândulas de defesa e no estômago é mais reduzida e nos restantes orgãos é comparável com a do anticorpo marcado com iodo-131» Para a imunorreactividade (ver Quadro 1) foi medido, no que respeita ao an ticorpo BW 494/32 marcado com tecnécio-99m, um valor mais elevado do que o determinado na marcação com iodo-131 ou com índio-111.

Quadro 2¾

Repartição pelos orgãos de Tc-99m-amc 494/32 e de Ι-131-amc 494/32 em ratazanas Wistar normais 24 horas após a injecção (em % da dose aplicada por orgão ou por grama de tecido).

Orgão____________________________Tc-99m____________1-131

Fígado %/g	0,49	0,23
Pulmão	0,82	0,48
Baço	0,65	0,30
Rins	4,25	0,70
Esqueleto	o,57	0,20
Sangue	1,97	0,92
Músculo	0,12	0,08
Estômago % global	0,38	2,50
Glândulas de defesa	0,05	4,85
Intestinos	3,83	4,62
Urina	24,5	49,3

Exemplo 4

Reduziram-se parcialmente 50 mg de anticorpo monoclonal BW 431/26 dirigido igualmente contra CEA por tratamen to com 2-mercaptoetanol, purificou-se e liofilizou-se em ampolas de 2 mg na presença de tampão de fosfato (pH 7,2).

A marcação com Tc-99m foi levada a efeito por meio duma unidade de marcação cuja utilização é já conhecida da cintilografia do fígado, constituída por 13,5 mg de 1,1,3,3-propanotetrafosfonato tetrassódico e 0,6 mg de cloreto de estanho-II x 2H₉0. Adicionaram-se 0,5 ml, correspondentes a 15 #ig de 2+ z

Sn , do conteúdo duma unidade de marcação, dissolvida em 10 ml duma solução isotónica de NaCl, ao anticorpo liofilizado. Em seguida adicionou-se uma solução de pertecnetato (3000 MBq) à solu ção límpida do sal de Sn-II do anticorpo e o anticorpo marcado = 14 = com Tc-99^m foi aplicado por via iv. a ratos pelados com um carcd noma do cólon humano implantado. Após 24 horas a partir da aplicação já era distintamente observável o tumor por cintilografia. 0 Quadro 3 mostra que, no que se refere à acumulação nos tumores e à distribuição pelos orgãos deste anticorpo nos ratos pelados, as preparações marcadas com 1-131, In-111 e Tc-99m são comparáveis .

Quadro 3:

Acumulação nos tumores e distribuição pelos orgãos de Ι-131-amc 431/26, In-lll-amc 431/26 e Tc-99m-amc 431/26 em ratos pelados (η « 2) com carcinomas do cólon humano em função do tempo.

Tempo depois da injecção (h)	I—131	In-111	Tc-99^m
17	48	17	48	17	30
Tumor %/g	14,9	8,8	9,8	13,0	11,0	14,9
Fígado %/g	4,6	3,0	8,5	8,4	7,2	5,4
Rins %/g	3,4	1,9	12,2	16,4	10,6	7,7
Músculos %/g	1,3	0,84	1,4	1,2	0,9	1,0
Sangue %/ml	14,6	13,0	20,5	9,2	17,0	15,0
Esqueleto % glo bal -	1,8	1,7			2,4	2,1

Exemplo 5

Incubaram-se 20 mg do fragmento FÍab*^ do an ticorpo monoclonal 431/31 a 4^o C durante 15 minutos com 1 ml duma solução de cloridrato de cisteamina a 1%. 0 fragmento do anti corpo foi liofilizado juntamente com tampão de fosfato. Para mar cação com tecnécio usou-se uma unidade de marcação constituída por 13,0 mg de 3,3-difosfono-l,2-propanodicarboxilato tetrassódi co, 0,23 mg de óxido de estanho-II e 1,0 mg de N-(4-aminobenzoíl)-L-glutamato monossódico, da qual se utilizou 1/20 em solução fisiológica de cloreto de sódio. 0 fragmento do anticorpo marcado com uma actividade específica de 1000 MBq/mg não continha praticamente pertecnetato, mas continha uma quantidade insig

nificante (cerca de y%) de difosfonato de Tc-99m. A imunorreactividade era de 60$.

Exemplo 6

Marcação com Tc-99m duma proteína

Dissolveram-se 250 mg de IgG em solução isotónica de cloreto de sódio numa concentração de 10 mg/ml. Esta solução foi incubada durante cerca de 30 minutos a uma temperatura entre 4 e 25° C após adição de 0,5 a 1 ml de 2-mercaptoeta nol. Em seguida purificou-se a imunoglobulina reduzida por filtração em gel através duma coluna de gel de poliacrilamida (Bio-Gel P-2 da firma Bio Rad), eluindo-se com solução de hidrogenofosfato dissódico 0,02 M (pH 7,2). A fracção pura separada da IgG foi ajustada a uma concentração de 4 mg IgG/ml (cerca de 3 mg de NagHPO^/ml) por diluição com o mesmo tampão de fosfato, se pararam-se alíquotas de 0,5 ml desta solução e liofilizaram-se.

Para marcação com Tc-99m duma amostra (2 mg de IgG) dissolveu-se o produto liofilizado em 1 ml duma solução de metanodifosfonato de estanho-II (pH 7) que tinha sido obtida por dissolução duma unidade de marcação composta de

2,6 mg de metanodifosfonato de sódio e 0,04 mg de cloreto de estanho-II em 5 ml de solução isotónica de cloreto de sódio. Em seguida adi cionaram-se 4 a 9 ml de solução de perteenetato com Tc-99m (cerca de 1000 MBq) . Depois dum período de reacção de 5 minutos obte ve-se IgG marcada com Tc-99m na qual mais de 95$ do tecnócio se encontrava sob a forma ligada à proteína, enquanto que menos de 1$ se encontrava na fracção ligada a fosfonato e menos de 1$ sob a forma de pertecnetato livre. A IgG marcada era estável até 3 horas depois da preparação. Só depois de períodos mais longos foi possível detectar na solução novamente pertecnetato livre.

Exemplo 7

Marcação com Tc-99m de 1,4,8,11-tetraazaciclotetradecano (ciclami

Dissolveram-se 8 mg de ciciam em 0,5 ml de so = 16 =

lução salina isotónica e ajustou-se o valor do pH a 11 com soda cáustica 0,1 N. A esta solução adicionou-se 1 ml de uma solução de 1,1,3,3-propanotetrafosfonato de estanho-II (pH ss 6), a qual tinha sido obtida por dissolução duma unidade de marcação constituída por

2,9 mg de 1,1,3,3-propanotetrafosfonato de sódio e 0,12 mg de cloreto de estanho-II, di—hidrato em 5 ml de solução isotónica de cloreto de sódio. Em seguida jun tou-se uma solução de pertecnetato com Tc-99m de cerca de 590 MBq (cerca de 0,3 ml) e deixou-se a mistura em repouso à tempera tura ambiente. 0 rendimento de ciciam marcado foi superior a 9θ$ encontrando-se menos de 1$ tanto sob a forma de pertecnetato livre como de tecnécio ligado a fosfonato. A solução marcada era estável durante várias horas.

Exemplo 8

Marcação com Tc-99m de pirofosfato

Dissolveram-se 10 mg de pirofosfato em 1 ml de solução de cloreto de sódio a 0,9$ e adicionou-se 1 ml de solução de 1,1,3,3-propanotetrafosfonato de estanho-II (ver Exemplo 7). A esta solução foi adicionado 1 ml de solução de pertecnetato ( 300 MBq) e em seguida deixou-se a solução em repouso durante 5 minutos à temperatura ambiente. 0 pirofosfato ficou marcado com Tc-99^m numa fracção de 50$. A fracção de fosfonato marcado era inferior a 10$.

Claims

REIVINDICAÇÕES

- 1» Processo para a preparação duma substância or ganoespecífica marcada com tecnécio-99m caracterizado por se fazer reagir uma substância organoespecífica, uma substância organoespecífica previamente tratada ou acoplada com uma substância que forme um complexo com tecnécio-99m, com um pertecnetato-99m « 17 « e com um agente redutor de estabilização do complexo.

Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por se usar como substância organoespecífica um anticorpo, um fragmento de anticorpo F (ab’)2, uma proteína, uma enzima, um açúcar ou um polímero apropriado para fins de diagnóstico.

Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por se usar como agente redutor de estabilização do complexo um fosfonato ou um pirofosfato de estanho-II.

- 4» -

Processo de acordo com a reivindicação 3 caracterizado por se usar como fosfonato de estanho-II o difosfonato, o trifosfonato ou o tetrafosfonato.

_M 5* —

Processo de acordo com a reivindicação 4 caracterizado por se usar o sal de estanho-II do ácido metanodifosfónico, do ácido aminometanodifosfónico, do ácido 3,3-difosfonopropiánico, do ácido 3,3-difosfono-l,2-propanodicarboxílico ou do ácido propano-l,l,3,3-tetrafosfónico.

Processo de acordo com a reivindicação 2 caracterizado por se usar um anticorpo monoclonal ou o respectivo fragmento F (ab·)2.

„ 7* _

Processo de acordo com a reivindicação 6 caracterizado por se usar um anticorpo ou o respectivo fragmento F (ab’)2 contra antigenes associados a tumores.

- 8» -

Processo para a preparação dum conjunto para análise caracterizado por dar uma forma de utilização apropriada a dois componentes separados liofilizados dos quais um contém uma substância organoespecífica e o outro contem o agente redutor necessário para redução e ligação do tecnécio à substância organoespecífica.

- 9» -

Processo para a preparação dum conjunto para análise de acordo com a reivindicação 8 caracterizado por a substância organoespecífica ser um anticorpo parcialmente reduzido ou um fragmento F (ab’)2 de anticorpo parcialmente reduzido .

h 10- —

Processo para a preparação dum conjunto de análise de acordo com a reivindicação 9 caracterizado por o com ponente contendo um anticorpo liofilizado estar misturado com uma substância tampão constituída por hidrogenofosfato dissódico.

- 11 s -

Processo para a preparação dum agente de dia£; nóstico caracterizado por se dissolver em primeiro lugar o componente que contém a substância organoespecífica numa solução dum pertecnetato com tecnécio-99^rn ® em seguida efectuar a redução e a ligação do tecnécio à substância organoespecífica por adição dum agente de redução estabilizador de complexos.

- 12* -

Processo para a preparação dum agente de diagnóstico caracterizado por se dissolver em primeiro lugar o componente que contém a substância organoespecífica na solução do agente de redução estabilizador de complexos e em seguida marcar a substância organoespecífica com tecnécio por adição duma solução dum pertecnetato com tecnécio-99m·

- 13- Processo para a preparação dum agente de diagnóstico de acordo com qualquer das reivindicações 11 ou 12 = 19 = caracterizado por o agente de redução estabilizador de complexos ser um fosfonato ou um pirofosfato contendo estanho, adicionando-se à substância organoespecífica, a fim de marcar esta de forma estável com tecnécio-99m, entre 1 e 100 microgramas, de preferência entre 5 e 10 microgramas, do agente de redução ref£ rido a estanho-II.

A requerente declara que os primeiros pedidos desta patente foram apresentados na República Federal Alemã em 10 de Dezembro de 1986 e em 27 de Agosto de 19θ7, sob os n^s P 36 42 173.1 e P 37 28 599·θ, respectivamente.

Lisboa, 9 de Dezembro de 19θ7

RESUMO «PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DUMA SUBSTÂNCIA ORGANOESPECÍFICA MARCADA COM TECNÊCIO-99m E DE CONJUNTOS PARA ANÁLISES E AGENTES DE DIAGNÓSTICO QUE A CONTÊM

A invenção refere-se a um processo para a preparação duma substância organoespecxfxca marcada com tecnécio-99m que compreende fazer-se reagir uma substância organoespecxfica, uma substância organoespecxfica previamente tratada ou acoplada com uma substância que forme um complexo com tecnécio-99¹, com um pertecnetato-99m e com um agente redutor de estabilização do complexo.