JP2942776B2 - 蛋白質の放射標識に関する改良 - Google Patents
蛋白質の放射標識に関する改良Info
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【発明の詳細な説明】 本発明は蛋白質の放射標識に関連しており、特に32P
を用いたモノクロナール抗体、及び他の蛋白質の標識に
関する。本文で使用する“蛋白質”という言葉はポリペ
プチドを含む。薬剤の標的設定に配達ビヒクルとしてモ
ノクロナール抗体、及び他の蛋白質を使用する概念はす
でに確立している。しかし薬剤をモノクロナール抗体、
又は他の配達系に結合させる場合、それは薬剤の活性が
保持され、同時にモノクロナール抗体又は他の配達系の
特異性が保たれる方法で行わなければならないので、そ
こに実際上の困難がある。従来の反応条件の多くは薬剤
の活性及び配達系の特異性のどちらか、あるいは両方を
破壊するので、薬剤と配達系を結合するために理論的に
可能な化学的、及び生物学的方法に実際上はかなりの制
限が加えられる。
を用いたモノクロナール抗体、及び他の蛋白質の標識に
関する。本文で使用する“蛋白質”という言葉はポリペ
プチドを含む。薬剤の標的設定に配達ビヒクルとしてモ
ノクロナール抗体、及び他の蛋白質を使用する概念はす
でに確立している。しかし薬剤をモノクロナール抗体、
又は他の配達系に結合させる場合、それは薬剤の活性が
保持され、同時にモノクロナール抗体又は他の配達系の
特異性が保たれる方法で行わなければならないので、そ
こに実際上の困難がある。従来の反応条件の多くは薬剤
の活性及び配達系の特異性のどちらか、あるいは両方を
破壊するので、薬剤と配達系を結合するために理論的に
可能な化学的、及び生物学的方法に実際上はかなりの制
限が加えられる。
現在、放射線療法はある癌状態のひとつの治療法とし
て十分確立されており、この目的のためにヨウ素、及び
インジウムならびにイットリウムなどの多くの金属の放
射性同位元素の抗体への結合が現在研究されている。32
Pは14日という合理的な短い半減期を持ち、粒子エネル
ギーが1.7MeVの純粋なベータ エミッターなので、放射
性核種32Pは多くの方法において、比較的血液供給の少
ないある種の充実性腫瘍に対して使用するのに特に有利
な放射性核種である。しかし他の放射性同位元素の結合
に以前用いられてきた方法により32Pを抗体に結合させ
ることはできなかった。
て十分確立されており、この目的のためにヨウ素、及び
インジウムならびにイットリウムなどの多くの金属の放
射性同位元素の抗体への結合が現在研究されている。32
Pは14日という合理的な短い半減期を持ち、粒子エネル
ギーが1.7MeVの純粋なベータ エミッターなので、放射
性核種32Pは多くの方法において、比較的血液供給の少
ないある種の充実性腫瘍に対して使用するのに特に有利
な放射性核種である。しかし他の放射性同位元素の結合
に以前用いられてきた方法により32Pを抗体に結合させ
ることはできなかった。
ここで我々は、モノクロナール抗体又は類似標的分子
を構造的に修正し、標的分子の特異性を保持して32P標
識物質を与えることのできる穏やかな反応条件下でそれ
が容易に、及び速やかに32Pに結合できるようにする方
法を見いだした。
を構造的に修正し、標的分子の特異性を保持して32P標
識物質を与えることのできる穏やかな反応条件下でそれ
が容易に、及び速やかに32Pに結合できるようにする方
法を見いだした。
我々の公開UK特許出願GB−Ａ−2186579は蛋白質、糖
脂質、又は炭水化物などの腫瘍に伴う構造と結合する蛋
白質を修正する方法において、ホスホキナーゼの基質と
して働くことができるペプチド領域を結合蛋白質に導入
することを含む方法につき記載している。ここで我々は
得られた修正結合蛋白質を、ホスホキナーゼの存在下
で、ガンマホスフェート基をチオホスフェート基により
置換し、少なくともガンマチオホスフェート基を32P標
識した修正ヌクレオシドトリホスフェートと反応させる
ことにより32P標識することができることを見いだし
た。この方法は32P標識を持つ結合蛋白質（標的分子）
を与える。
脂質、又は炭水化物などの腫瘍に伴う構造と結合する蛋
白質を修正する方法において、ホスホキナーゼの基質と
して働くことができるペプチド領域を結合蛋白質に導入
することを含む方法につき記載している。ここで我々は
得られた修正結合蛋白質を、ホスホキナーゼの存在下
で、ガンマホスフェート基をチオホスフェート基により
置換し、少なくともガンマチオホスフェート基を32P標
識した修正ヌクレオシドトリホスフェートと反応させる
ことにより32P標識することができることを見いだし
た。この方法は32P標識を持つ結合蛋白質（標的分子）
を与える。
我々の発明で使用するチオホスホリル化剤はガンマホ
スフェート基がチオホスフェート基により置換され、ガ
ンマチオホスフェート基に32P標識をしたヌクレオシド
トリホスフェートである。そのようなチオホスホリル化
剤は新規化合物であり、本発明の一部である。できるだ
け多くのガンマＰ原子を標識するのが望ましく、実際は
少なくとも10％、好ましくは少なくとも50％のガンマＰ
原子が32Pとして存在しなければならない。
スフェート基がチオホスフェート基により置換され、ガ
ンマチオホスフェート基に32P標識をしたヌクレオシド
トリホスフェートである。そのようなチオホスホリル化
剤は新規化合物であり、本発明の一部である。できるだ
け多くのガンマＰ原子を標識するのが望ましく、実際は
少なくとも10％、好ましくは少なくとも50％のガンマＰ
原子が32Pとして存在しなければならない。
我々の前述のUK特許出願は、修正結合蛋白質をホスホ
キナーゼの存在下で32P標識ガンマヌクレオシドトリホ
スフェートと反応させることによる、その32P標識につ
き記載している。
キナーゼの存在下で32P標識ガンマヌクレオシドトリホ
スフェートと反応させることによる、その32P標識につ
き記載している。
この方法の欠点は、修正蛋白質のホスホリル化の間に
形成されるホスフェート−セリン（又はトレオニン）結
合は単離した血漿中で比較的安定であるが、インビボに
おける複合体の代謝による分解の後に毒性の32PO4が放
出されることである。ガンマ標識32Pヌクレオシドトリ
ホスフェートを、ガンマホスフェート中のＰ＝Ｏ（すな
わちキナーゼによって移動する末端基）がＰ＝Ｓにより
置換された対応する試薬で置き換えることにより、イン
ビボでより安定であり分解して毒性の代謝物を放出しに
くいチオホスホリル化セリン（又はトレオニン）を形成
する結果となると思われる。
形成されるホスフェート−セリン（又はトレオニン）結
合は単離した血漿中で比較的安定であるが、インビボに
おける複合体の代謝による分解の後に毒性の32PO4が放
出されることである。ガンマ標識32Pヌクレオシドトリ
ホスフェートを、ガンマホスフェート中のＰ＝Ｏ（すな
わちキナーゼによって移動する末端基）がＰ＝Ｓにより
置換された対応する試薬で置き換えることにより、イン
ビボでより安定であり分解して毒性の代謝物を放出しに
くいチオホスホリル化セリン（又はトレオニン）を形成
する結果となると思われる。
本発明に従い、我々は一般式： ［式中、Ａはヌクレオシド残基であり、ガンマ−チオ
ホスフェート基のリンは32Pである］ の化合物を提供する。
ホスフェート基のリンは32Pである］ の化合物を提供する。
本発明の好ましい化合物は、後文では［ガンマ−
32P］ATP−ガンマ Ｓと呼び、式Ｉ を有する［ガンマ−32P］−アデノシン−５′−Ｏ−
（３−チオトリホスフェート）である。
32P］ATP−ガンマ Ｓと呼び、式Ｉ を有する［ガンマ−32P］−アデノシン−５′−Ｏ−
（３−チオトリホスフェート）である。
本発明のヌクレオシド チオトリホスフェートは式 ［式中、Ａは上記と同義である］ のヌクレオシド ジホスフェートを32Pチオホスフェー
トを用いて酵素によりチオホススホリル化することによ
り製造することができる。チオホスフェートは金属チオ
ホスフェート、特にアルカリ金属又はアルカリ土類金属
チオホスフェート、あるいは有機チオホスフェート、例
えばアミンがメチルアミン又はジメチルアミンなどのモ
ノ又はジ置換体であるアミンチオホイフェートであるこ
とができる。ヌクレオシド ジホスフェートと32P標識
チオホスフェートの反応は酵素により、例えばCassidy
and Kerrick,Biochim.et Biophys.Acta,565（1979）,20
9−213に開示された条件下で行うことができる。従って
この反応はグリセルアルデヒド ホスフェート デヒド
ロゲナーゼ、３−ホスホグリセロキナーゼ、及びラクテ
ート デヒドロゲナーゼの混合物の存在下で行うことが
できる。このチオホスホリル化のために適した酵素の選
択に関する案内はさらにWalseth and Johnson,Biochim.
et Biophys.Acta,562，（1979）,11−31に記載されてい
る。
トを用いて酵素によりチオホススホリル化することによ
り製造することができる。チオホスフェートは金属チオ
ホスフェート、特にアルカリ金属又はアルカリ土類金属
チオホスフェート、あるいは有機チオホスフェート、例
えばアミンがメチルアミン又はジメチルアミンなどのモ
ノ又はジ置換体であるアミンチオホイフェートであるこ
とができる。ヌクレオシド ジホスフェートと32P標識
チオホスフェートの反応は酵素により、例えばCassidy
and Kerrick,Biochim.et Biophys.Acta,565（1979）,20
9−213に開示された条件下で行うことができる。従って
この反応はグリセルアルデヒド ホスフェート デヒド
ロゲナーゼ、３−ホスホグリセロキナーゼ、及びラクテ
ート デヒドロゲナーゼの混合物の存在下で行うことが
できる。このチオホスホリル化のために適した酵素の選
択に関する案内はさらにWalseth and Johnson,Biochim.
et Biophys.Acta,562，（1979）,11−31に記載されてい
る。
本発明のチオホスホリル化は所望の32Pチオトリホス
フェート ヌクレオシド エステルを含む水溶液を与え
る。この溶液はさらに精製することなく、下記に記載の
方法による結合蛋白質のチオホスホリル化に使用するこ
とができる。ある場合にはホスホキナーゼの存在下にお
ける結合蛋白質の最終的ホスホリル化の前に、ジホスフ
ェートのチオホスホリル化からの残留酵素を例えば60℃
にて少なくとも５分間熱処理することにより不活性化す
るのが望ましい。
フェート ヌクレオシド エステルを含む水溶液を与え
る。この溶液はさらに精製することなく、下記に記載の
方法による結合蛋白質のチオホスホリル化に使用するこ
とができる。ある場合にはホスホキナーゼの存在下にお
ける結合蛋白質の最終的ホスホリル化の前に、ジホスフ
ェートのチオホスホリル化からの残留酵素を例えば60℃
にて少なくとも５分間熱処理することにより不活性化す
るのが望ましい。
結合蛋白質は普通、腫瘍に伴う抗原、例えば血液供給
が比較的少ない充実性腫瘍に伴う抗原と結合するモノク
ロナール抗体であろう。そのような充実性腫瘍には大
腸、卵巣、及び肺に見られる腫瘍が含まれ、そのような
腫瘍に伴う抗原に対するモノクロナール抗体はすでに周
知であり、他の抗−腫瘍剤のための配達ビヒクルとして
すでに使用されている。そのような周知の抗体は本発明
の方法により32Pに結合させることができる。
が比較的少ない充実性腫瘍に伴う抗原と結合するモノク
ロナール抗体であろう。そのような充実性腫瘍には大
腸、卵巣、及び肺に見られる腫瘍が含まれ、そのような
腫瘍に伴う抗原に対するモノクロナール抗体はすでに周
知であり、他の抗−腫瘍剤のための配達ビヒクルとして
すでに使用されている。そのような周知の抗体は本発明
の方法により32Pに結合させることができる。
より一般的には、結合蛋白質は腫瘍に伴う蛋白質（又
は糖脂質あるいは炭水化物などの腫瘍に伴う他の構造）
と結合するどのような蛋白質であることもでき、その場
合腫瘍は高エネルギーベータ粒子を受け入れるものであ
り、モノクロナール抗体の他に第１蛋白質は例えばFab
フラグメント、又はある種の腫瘍細胞上に同定される適
した受容部位に結合するホルモン又は類似のペプチド、
例えばメラニン細胞刺激ホルモン、上皮成長因子、イン
ターフェロン、及びボンベシンなどの有糸分裂促進ペプ
チドであることができる。
は糖脂質あるいは炭水化物などの腫瘍に伴う他の構造）
と結合するどのような蛋白質であることもでき、その場
合腫瘍は高エネルギーベータ粒子を受け入れるものであ
り、モノクロナール抗体の他に第１蛋白質は例えばFab
フラグメント、又はある種の腫瘍細胞上に同定される適
した受容部位に結合するホルモン又は類似のペプチド、
例えばメラニン細胞刺激ホルモン、上皮成長因子、イン
ターフェロン、及びボンベシンなどの有糸分裂促進ペプ
チドであることができる。
結合蛋白質の構造の修正によりホスホキナーゼの基質
として働くことができるペプチド領域が導入され、“蛋
白質"/基質複合体とみなすことができる構造的に修正さ
れた“結合蛋白質”がホスホキナーゼの存在下で32P含
有チオホスホリル化剤と接触した場合に、酵素はチオホ
スホリル化剤から複合体の基質の領域への32Pの移行を
触媒することができる。
として働くことができるペプチド領域が導入され、“蛋
白質"/基質複合体とみなすことができる構造的に修正さ
れた“結合蛋白質”がホスホキナーゼの存在下で32P含
有チオホスホリル化剤と接触した場合に、酵素はチオホ
スホリル化剤から複合体の基質の領域への32Pの移行を
触媒することができる。
本発明の有用性はホスホキナーゼとしてセリン／トレ
オニンの利用を暗示している。これらの物質は現在Sigm
a Companyから例えば牛心臓蛋白キナーゼとして商業的
に入手可能である。
オニンの利用を暗示している。これらの物質は現在Sigm
a Companyから例えば牛心臓蛋白キナーゼとして商業的
に入手可能である。
Leu.Arg.Arg.Ala.ser.Leu.Glyの構造を持ち、ケンプ
チドとして知られるヘプタペプチドは現在商業的に入手
可能であり、牛心臓蛋白キナーゼの良い基質であること
が知られている。ここで我々は驚くべき事にケンプチド
構造をモノクロナール抗体にグラフトするとモノクロナ
ール抗体の特異性が影響を受けないばかりでなくモノク
ロナール抗体／ケンプチド複合体のキナーゼに対する基
質として働く能力も損傷を受けずチオホスホリル化を行
うこともできるということを見いだした。
チドとして知られるヘプタペプチドは現在商業的に入手
可能であり、牛心臓蛋白キナーゼの良い基質であること
が知られている。ここで我々は驚くべき事にケンプチド
構造をモノクロナール抗体にグラフトするとモノクロナ
ール抗体の特異性が影響を受けないばかりでなくモノク
ロナール抗体／ケンプチド複合体のキナーゼに対する基
質として働く能力も損傷を受けずチオホスホリル化を行
うこともできるということを見いだした。
我々の新規方法の実際上の利点のひとつは、モノクロ
ナール抗体、又は他の蛋白質をヘプタペプチドと複合さ
せることにより部分的にチオホスホリル化の準備をし、
放射標識分子を患者に投与する直前までチオホスホリル
化をせずに残しておくことができる点である。
ナール抗体、又は他の蛋白質をヘプタペプチドと複合さ
せることにより部分的にチオホスホリル化の準備をし、
放射標識分子を患者に投与する直前までチオホスホリル
化をせずに残しておくことができる点である。
本発明の概念は特別なヘプタペプチド、ケンプチドの
使用に依存しているわけではなく、事実ホスホキナーゼ
の基質として作用することができればどのようなペプチ
ドも使用することができる。ホスホキナーゼが牛の心臓
から誘導したりセリン／トレオニン キナーゼである場
合、基質分子としての主な構造的必要条件は基質中のセ
リン、及び／又はトレオニン残基に近接して例えばアル
ギニン、及び／又はリシン残基から生じるような正電荷
の領域が存在することである。ケンプチドはそのような
基質のひとつであるが、我々は他の類似分子について研
究しており、その分子中でケンプチドのＮ−末端のロイ
シン残基をリシン−チロシンジペプチドに置換し、オク
タペプチドLys.Tyr.Arg.Arg.Ala.Ser.Leu.Gly.を得、フ
ォクスチドＩと名付けた。ケンプチドよりフォクスチド
Ｉが有利な点はＮ−末端にリシン残基があることにより
基質分子の抗体分子への複合が容易となり、一方チロシ
ン分子の存在により基質分子に紫外“可視性”が与えら
れ、精製及び同定が容易となる点である。
使用に依存しているわけではなく、事実ホスホキナーゼ
の基質として作用することができればどのようなペプチ
ドも使用することができる。ホスホキナーゼが牛の心臓
から誘導したりセリン／トレオニン キナーゼである場
合、基質分子としての主な構造的必要条件は基質中のセ
リン、及び／又はトレオニン残基に近接して例えばアル
ギニン、及び／又はリシン残基から生じるような正電荷
の領域が存在することである。ケンプチドはそのような
基質のひとつであるが、我々は他の類似分子について研
究しており、その分子中でケンプチドのＮ−末端のロイ
シン残基をリシン−チロシンジペプチドに置換し、オク
タペプチドLys.Tyr.Arg.Arg.Ala.Ser.Leu.Gly.を得、フ
ォクスチドＩと名付けた。ケンプチドよりフォクスチド
Ｉが有利な点はＮ−末端にリシン残基があることにより
基質分子の抗体分子への複合が容易となり、一方チロシ
ン分子の存在により基質分子に紫外“可視性”が与えら
れ、精製及び同定が容易となる点である。
我々は又、上記の一般的要求を満たす別の基質分子を開
発したが、それはデカペプチド構造である： Cys.Arg.Arg.Lys.Ala.Ser.Gly.Pro.Pro.Val 我々はこのデカペプチドをフォクスチドIIと名付け
た。セリン残基が、他の点では類似の牛心臓蛋白キナー
ゼの存在下における反応条件でケンプチド中のセリン残
基より迅速にチオホスホリル化を行うことができる点
で、フォクスチドIIはケンプチドより我々の目的に有利
である。さらにＮ−末端のシステイン残基が末端残基の
SH結合を通してモノクロナール抗体、又は他の第１蛋白
質との複合を容易にする。フォクスチドＩ及びフォクス
チドIIはMerrifield樹脂上の従来の固相ペプチド合成に
より製造することができる。
発したが、それはデカペプチド構造である： Cys.Arg.Arg.Lys.Ala.Ser.Gly.Pro.Pro.Val 我々はこのデカペプチドをフォクスチドIIと名付け
た。セリン残基が、他の点では類似の牛心臓蛋白キナー
ゼの存在下における反応条件でケンプチド中のセリン残
基より迅速にチオホスホリル化を行うことができる点
で、フォクスチドIIはケンプチドより我々の目的に有利
である。さらにＮ−末端のシステイン残基が末端残基の
SH結合を通してモノクロナール抗体、又は他の第１蛋白
質との複合を容易にする。フォクスチドＩ及びフォクス
チドIIはMerrifield樹脂上の従来の固相ペプチド合成に
より製造することができる。
これまで議論してきた基質分子はすべてセリン／トレ
オニンキナーゼに対する基質であるが他の種類のホスホ
キナーゼも知られており、適した基質と共に使用するこ
とができる。例えばチロシンキナーゼであるホスホキナ
ーゼが周知であり、それらのチロシンキナーゼの基質が
知られており、その基質中で酵素はチロシン残基のチオ
ホスホリル化を行う。そのようなチロシンキナーゼの例
にはCasnellie等、PNAS、1982、79、282−６に記載のリ
ンパ腫細胞抽出物に含まれるものがある。チロシンキナ
ーゼの基質の例は： Ile−Glu−Asp−Asn−Glu−Tyr−Thr−Ala−Arg−Gln
−Glyである。
オニンキナーゼに対する基質であるが他の種類のホスホ
キナーゼも知られており、適した基質と共に使用するこ
とができる。例えばチロシンキナーゼであるホスホキナ
ーゼが周知であり、それらのチロシンキナーゼの基質が
知られており、その基質中で酵素はチロシン残基のチオ
ホスホリル化を行う。そのようなチロシンキナーゼの例
にはCasnellie等、PNAS、1982、79、282−６に記載のリ
ンパ腫細胞抽出物に含まれるものがある。チロシンキナ
ーゼの基質の例は： Ile−Glu−Asp−Asn−Glu−Tyr−Thr−Ala−Arg−Gln
−Glyである。
本発明で使用するキナーゼ基質はどのような大きさの
分子であることもできる。唯一の必要条件がチオホスホ
リル化可能残基、例えばセリン、トレオニン、又はチロ
シンを持つことであり、それは使用する酵素に依存して
正電荷の領域に近接することが必要であるため、できる
だけ小さい基質を使用する傾向がある。従って合成の経
済性、及び精製の容易さなどの実際性から最高約20アミ
ノ酸残基を含む小さいペプチドの使用が示唆されている
が、基質が大きい程最終的第１蛋白質／基質複合体の性
質に抵触し易いことに留意しながら、より大きい基質を
使用することもできる。
分子であることもできる。唯一の必要条件がチオホスホ
リル化可能残基、例えばセリン、トレオニン、又はチロ
シンを持つことであり、それは使用する酵素に依存して
正電荷の領域に近接することが必要であるため、できる
だけ小さい基質を使用する傾向がある。従って合成の経
済性、及び精製の容易さなどの実際性から最高約20アミ
ノ酸残基を含む小さいペプチドの使用が示唆されている
が、基質が大きい程最終的第１蛋白質／基質複合体の性
質に抵触し易いことに留意しながら、より大きい基質を
使用することもできる。
基質分子のモノクロナール抗体、又は他の結合蛋白質
への複合に化学的方法を使用することができる。基本的
に第１蛋白質、及び基質分子の活性基を適度に活性化し
て複合を起こすために必要な結合を形成し、同時に腫瘍
に伴う蛋白質に関連した第１蛋白質の特異性、及びその
後のホスホキナーゼ チオホスホリル化の間の基質とし
て作用する基質分子の容量を変化させたりする反応条件
を避けることが必要である。
への複合に化学的方法を使用することができる。基本的
に第１蛋白質、及び基質分子の活性基を適度に活性化し
て複合を起こすために必要な結合を形成し、同時に腫瘍
に伴う蛋白質に関連した第１蛋白質の特異性、及びその
後のホスホキナーゼ チオホスホリル化の間の基質とし
て作用する基質分子の容量を変化させたりする反応条件
を避けることが必要である。
基質分子の標的分子（結合蛋白質）への十分な結合は
適した複素二官能基性蛋白質架橋剤を用いて行うことが
できることを見いだした。例えば標的分子はＮ−コハク
酸イミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネー
ト（SPDP）と反応させ、続いてジチオトレイトールと反
応させることができる。SPDPとの反応により標的分子の
リシン残基の側鎖アミノ基上にジチオプロピオニル基が
導入され、続く反応段階によりジチオ基が末端チオール
基に変換される。この末端チオール基が基質分子の導入
のための活性部位となる。
適した複素二官能基性蛋白質架橋剤を用いて行うことが
できることを見いだした。例えば標的分子はＮ−コハク
酸イミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネー
ト（SPDP）と反応させ、続いてジチオトレイトールと反
応させることができる。SPDPとの反応により標的分子の
リシン残基の側鎖アミノ基上にジチオプロピオニル基が
導入され、続く反応段階によりジチオ基が末端チオール
基に変換される。この末端チオール基が基質分子の導入
のための活性部位となる。
例えばケンプチドの末端ロイシン残基のアルファ−ア
ミノ基を対応するＮ−ヒドロキシコハク酸イミジルエス
テルと反応させて例えばヨードアセトアミド又はフェニ
ルマレイミドを得ることにより標的分子への複合のため
に基質分子を活性化することができ、それが標的分子上
に導入されたチオプロピオンアミド残基のチオール基と
反応し、基質分子がチオ結合を含む短い架橋基を通じて
標的分子と結合することができる。
ミノ基を対応するＮ−ヒドロキシコハク酸イミジルエス
テルと反応させて例えばヨードアセトアミド又はフェニ
ルマレイミドを得ることにより標的分子への複合のため
に基質分子を活性化することができ、それが標的分子上
に導入されたチオプロピオンアミド残基のチオール基と
反応し、基質分子がチオ結合を含む短い架橋基を通じて
標的分子と結合することができる。
フォクスチドIIなどの活性チオール基を有する基質分
子との複合のために第１蛋白質は、例えばSMPB［コハク
酸イミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレー
ト］などと反応させることにより活性化することができ
る。この目的のために使用することができる他の試薬に
はMBS（ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシ
コハク酸イミドエステル）、SMCC［コハク酸イミジル］
−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１
−カルボキシレート］、及びSIAB［Ｎ−コハク酸イミジ
ル−（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート］が含
まれ、これらはすべて商業的に入手できる。
子との複合のために第１蛋白質は、例えばSMPB［コハク
酸イミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレー
ト］などと反応させることにより活性化することができ
る。この目的のために使用することができる他の試薬に
はMBS（ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシ
コハク酸イミドエステル）、SMCC［コハク酸イミジル］
−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１
−カルボキシレート］、及びSIAB［Ｎ−コハク酸イミジ
ル−（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート］が含
まれ、これらはすべて商業的に入手できる。
蛋白質／基質複合体の製造のための上記の従来の合成
法の他に、遺伝子工学法を用いて第１蛋白質の１次構造
内の適した位置に適した基質の配列を組み込むことがで
きる。
法の他に、遺伝子工学法を用いて第１蛋白質の１次構造
内の適した位置に適した基質の配列を組み込むことがで
きる。
標的分子／基質分子複合体は安定な素材であり、室温
かそれより少し低温で、すなわち０−20℃で長期間保存
することができる。複素二官能基性蛋白質架橋剤を用い
て標的分子を基質分子と複合させた後、標的分子の特異
性、及び基質分子の基質容量は最初、及び０−20℃にお
ける長期保存の後も保持されることを見いだした。
かそれより少し低温で、すなわち０−20℃で長期間保存
することができる。複素二官能基性蛋白質架橋剤を用い
て標的分子を基質分子と複合させた後、標的分子の特異
性、及び基質分子の基質容量は最初、及び０−20℃にお
ける長期保存の後も保持されることを見いだした。
本発明の利点のひとつは標的分子／基質分子複合体を
この形態で、使用前に長期間保存することができ、患者
に使用する直前にチオホスホリル化して32P官能基を容
易に導入することができることである。チオホスホリル
化そのものは、従来のいずれのホスホキナーゼ／チオホ
スホリル化剤系を用いても行うことができ、牛心臓蛋白
キナーゼ、及び複合体の基質部分のチオホスホリル化可
能なセリン又はトレオニン残基を用いて満足すべき結果
を容易に得ることができることを見いだした。32P−ガ
ンマ−ATP−ガンマ Ｓの代わりに32P−ガンマ−グアニ
ジン ５′−Ｏ−（３−チオトリホスフェート）などの
他のヌクレオシドに基づいたチオホスフェートを、適し
たホスホキナーゼと共にチオホスホリル化剤として使用
することができる。これらのチオホスホリル化剤は適し
たホスホキナーゼと共に使用して、基質部分にチロシン
残基を持つ複合体中のチロシン上に32Pを導入すること
もできる。
この形態で、使用前に長期間保存することができ、患者
に使用する直前にチオホスホリル化して32P官能基を容
易に導入することができることである。チオホスホリル
化そのものは、従来のいずれのホスホキナーゼ／チオホ
スホリル化剤系を用いても行うことができ、牛心臓蛋白
キナーゼ、及び複合体の基質部分のチオホスホリル化可
能なセリン又はトレオニン残基を用いて満足すべき結果
を容易に得ることができることを見いだした。32P−ガ
ンマ−ATP−ガンマ Ｓの代わりに32P−ガンマ−グアニ
ジン ５′−Ｏ−（３−チオトリホスフェート）などの
他のヌクレオシドに基づいたチオホスフェートを、適し
たホスホキナーゼと共にチオホスホリル化剤として使用
することができる。これらのチオホスホリル化剤は適し
たホスホキナーゼと共に使用して、基質部分にチロシン
残基を持つ複合体中のチロシン上に32Pを導入すること
もできる。
本発明は最初、複合体の基質部分のチオホスホリル化
可能アミノ酸残基の酵素によるチオホスホリル化を容易
にするために計画したものであるが、化学的チオホスホ
リル化も可能である。
可能アミノ酸残基の酵素によるチオホスホリル化を容易
にするために計画したものであるが、化学的チオホスホ
リル化も可能である。
標的分子／基質分子複合体のチオホスホリル化が一度
完了すると、32P標識材料は例えばリン酸塩緩衝食塩水
で平衡化したSephadexカラム上のゲル濾過、又は例えば
プロテイン−Ａカラムを用いたアフィニティークロマト
グラフィーなどの標準的クロマトグラフ法により精製す
ることができる。このようにして得た32P複合体溶液は
その後濾過（0.22μ）することができ、投薬に適した形
態となる。
完了すると、32P標識材料は例えばリン酸塩緩衝食塩水
で平衡化したSephadexカラム上のゲル濾過、又は例えば
プロテイン−Ａカラムを用いたアフィニティークロマト
グラフィーなどの標準的クロマトグラフ法により精製す
ることができる。このようにして得た32P複合体溶液は
その後濾過（0.22μ）することができ、投薬に適した形
態となる。
本発明の別の特徴により、製薬上許容できる希釈剤、
及び腫瘍に伴う構造に結合する32P標識チオホスホリル
化蛋白質から成る、特に非経口的適用のための製薬配合
物を提供する。
及び腫瘍に伴う構造に結合する32P標識チオホスホリル
化蛋白質から成る、特に非経口的適用のための製薬配合
物を提供する。
一度微量の放射標識結合蛋白質が正常の組織と比較し
て腫瘍を標的とすることが示されたら、32P−標識チオ
ホスホリル化結合蛋白質を静脈注射により、又は例えば
腹膜内、胸膜内、あるいは動脈内拡散により体の種々の
領域に与えることができる。適した治療的投薬量は１回
の治療において患者１人当たり10−50mCi、好ましくは
約30mCiから成る。
て腫瘍を標的とすることが示されたら、32P−標識チオ
ホスホリル化結合蛋白質を静脈注射により、又は例えば
腹膜内、胸膜内、あるいは動脈内拡散により体の種々の
領域に与えることができる。適した治療的投薬量は１回
の治療において患者１人当たり10−50mCi、好ましくは
約30mCiから成る。
本発明の32P−標識チオホスホリル化結合蛋白質を使
用すると、放射活性生成物の取り扱い及び製造の間の保
護手順が簡単であること、医員への外部放射線量が少な
いこと、及び物質が非揮発性であるため廃棄問題が単純
であることなどの利点がある。32Pは131Iなどの他の放
射性同位元素と比較して、標的に比線量を与えるのに必
要な相対的放射能濃度が131Iの場合より少ないので、32
P−標識結合蛋白質を用いると患者が高い線量率を受け
ることができるという点で有利である；リン−標識標的
分子を用いて特定の標的組織に与えられる単位線量は、
例えば131I標識標的分子を用いて与えられる量の約２倍
である。さらに透過ガンマ線がないために、この放射線
療法の無関係な組織への影響は非常に少ない。
用すると、放射活性生成物の取り扱い及び製造の間の保
護手順が簡単であること、医員への外部放射線量が少な
いこと、及び物質が非揮発性であるため廃棄問題が単純
であることなどの利点がある。32Pは131Iなどの他の放
射性同位元素と比較して、標的に比線量を与えるのに必
要な相対的放射能濃度が131Iの場合より少ないので、32
P−標識結合蛋白質を用いると患者が高い線量率を受け
ることができるという点で有利である；リン−標識標的
分子を用いて特定の標的組織に与えられる単位線量は、
例えば131I標識標的分子を用いて与えられる量の約２倍
である。さらに透過ガンマ線がないために、この放射線
療法の無関係な組織への影響は非常に少ない。
32P−標識結合蛋白質を用いた治療の後数週間、31P−
オルトホスフェート塩を投与することにより無関係な組
織への損傷を最小にすることができる。Ethyol（WR272
1）などの放射線保護剤の使用も有利である。
オルトホスフェート塩を投与することにより無関係な組
織への損傷を最小にすることができる。Ethyol（WR272
1）などの放射線保護剤の使用も有利である。
最も敏感な正常組織は骨髄であり、非常に高い放射線
量の32P−標識チオホスホリル化結合蛋白質の使用を可
能にするための骨髄移植も本発明の範囲内に含まれる。
さらに顆粒球／マクロファージ−コロニー賦活因子（GM
−CSF）などのサイトキニン、及びインターリューキン
も損傷骨髄の回復の賦活に使用することができる。
量の32P−標識チオホスホリル化結合蛋白質の使用を可
能にするための骨髄移植も本発明の範囲内に含まれる。
さらに顆粒球／マクロファージ−コロニー賦活因子（GM
−CSF）などのサイトキニン、及びインターリューキン
も損傷骨髄の回復の賦活に使用することができる。
32P−標識チオホスホリル化結合蛋白質は、例えば卵
巣腫瘍、肝臓への大腸転移、悪性胸膜滲出、及び脳腫瘍
の治療において興味深い。
巣腫瘍、肝臓への大腸転移、悪性胸膜滲出、及び脳腫瘍
の治療において興味深い。
以下の実施例は、標的分子としてマウスに移植した充
実性腫瘍に結合するモノクロナール抗体を用いて本発明
を実現する方法を説明するものである。
実性腫瘍に結合するモノクロナール抗体を用いて本発明
を実現する方法を説明するものである。
実施例１ ペプチド受容分子“ケンプチド”（Leu.Arg.Arg.Ala.Se
r.Leu.Gly）へのヨードアセチル基の導入 乾燥ジメチルホルムアミド（DMF、62.5μｌ）中のＮ
−コハク酸イミジル−２−ヨードアセテート（0.75mg、
２当量）を、最初にメタノール（40μｌ）で希釈した水
（60μ）中の“ケンプチド”（1.5mg）の溶液に加え
た。室温で１時間インキュベートした後、薄層クロマト
グラフィー（TLC）（6065セルロースプレート、Eastma
n、１−ブタノール：水：酢酸：ピリジンを50:40:2:32v
/vの割合で用いて溶離）−ニンヒドリン染色により試料
を分析し、遊離第１アミノ基が完全に除去されているこ
とが示され、反応の完了が分かった。その後反応混合物
を実施例２に記載するチオプロピル化抗体へのカップリ
ングに直接使用した。
r.Leu.Gly）へのヨードアセチル基の導入 乾燥ジメチルホルムアミド（DMF、62.5μｌ）中のＮ
−コハク酸イミジル−２−ヨードアセテート（0.75mg、
２当量）を、最初にメタノール（40μｌ）で希釈した水
（60μ）中の“ケンプチド”（1.5mg）の溶液に加え
た。室温で１時間インキュベートした後、薄層クロマト
グラフィー（TLC）（6065セルロースプレート、Eastma
n、１−ブタノール：水：酢酸：ピリジンを50:40:2:32v
/vの割合で用いて溶離）−ニンヒドリン染色により試料
を分析し、遊離第１アミノ基が完全に除去されているこ
とが示され、反応の完了が分かった。その後反応混合物
を実施例２に記載するチオプロピル化抗体へのカップリ
ングに直接使用した。
実施例２ OX7抗体へのチオ基の導入、及び続くヨードアセチル
“ケンプチド”とのカップリング Ｎ−コハク酸イミジル−３−（２−ピリジルチオ）プ
ロピオネート（SPDP）の溶液（乾燥DMF中の3.1ng/mlの
保存溶液44μｌ）をOX7モノクロナール抗体の溶液（1.0
mlのほう酸塩緩衝液（0.1Mの塩化ナトリウム及び0.5％v
/vの１−ブタノールを含む0.05Mのほう酸ナトリウム;pH
9.0）中の7.8mg）に加えた。OX7はマウスAKRリンパ腫を
認識するマウスの抗体である。免疫グロブリンに対する
SPDPのモル比は8:1である。室温で１時間インキュベー
トした後、アセトン緩衝液（0.1モルの塩化ナトリウム
及び１ミリモルのエチレンジアミンテトラ酢酸（EDTA）
を含む0.1モルの酢酸ナトリウム;pH4.5）中で平衡化し
たG50′Sephadex′カラム（60ml）上で反応混合物を脱
塩した。Carlsson等、（Biochem J.1978、173、723）の
標準的方法により溶離蛋白質を分析し、IgG分子１個当
たり平均4.6個のジチオプロピル基が導入されたことが
明らかになった。その後蛋白質溶液（5.6ml）をジチオ
トレイトール（１モル保存溶液275μｌで最終濃度50ミ
リモルを与える）と共に室温で１時間インキュベート
し、窒素を吹き込んだリン酸塩緩衝液（0.1モルの塩化
ナトリウム及び１ミリモルのEDTAを含む0.1Mのリン酸水
素二ナトリウム緩衝液（pH7.5）中で平衡化したG50′Se
phadex′カラム（60ml）上で脱塩した。溶離蛋白質を直
接′Amicon′遠心により1.0mlに再度濃縮し、DMF（200
μｌ）で希釈し、ヨードアセチル化ケンプチド溶液（30
μｌ、実施例１の要領で製造）で処理した。最終的比率
はチオプロピル基１個当たり2.5個のヨードアセチル残
基となる。反応混合物を室温で24時間インキュベート
し、DMF（100μｌ）中のＮ−エチルマレイミド（5mg）
の溶液を加えることにより残留未反応チオール基を完全
にブロックした。さらに１時間後、“酵素緩衝液”（５
ミリモルの塩化マグネシウム及び0.25ミリモルのEGTA
［エチレングリコール−ビス−（ベータ−アミノエチル
エーテル）−N,N,N1，N1−テトラ酢酸］を含む50ミリ
モルのリン酸水素カリウム（pH7.0）中で平衡化させたG
50′Sephadex′カラム（60ml）に反応混合物を適用し、
溶離蛋白質を′Amicon′遠心により1mg/mlに濃縮し、濾
過し（0.22μ）、４℃で保存した。
“ケンプチド”とのカップリング Ｎ−コハク酸イミジル−３−（２−ピリジルチオ）プ
ロピオネート（SPDP）の溶液（乾燥DMF中の3.1ng/mlの
保存溶液44μｌ）をOX7モノクロナール抗体の溶液（1.0
mlのほう酸塩緩衝液（0.1Mの塩化ナトリウム及び0.5％v
/vの１−ブタノールを含む0.05Mのほう酸ナトリウム;pH
9.0）中の7.8mg）に加えた。OX7はマウスAKRリンパ腫を
認識するマウスの抗体である。免疫グロブリンに対する
SPDPのモル比は8:1である。室温で１時間インキュベー
トした後、アセトン緩衝液（0.1モルの塩化ナトリウム
及び１ミリモルのエチレンジアミンテトラ酢酸（EDTA）
を含む0.1モルの酢酸ナトリウム;pH4.5）中で平衡化し
たG50′Sephadex′カラム（60ml）上で反応混合物を脱
塩した。Carlsson等、（Biochem J.1978、173、723）の
標準的方法により溶離蛋白質を分析し、IgG分子１個当
たり平均4.6個のジチオプロピル基が導入されたことが
明らかになった。その後蛋白質溶液（5.6ml）をジチオ
トレイトール（１モル保存溶液275μｌで最終濃度50ミ
リモルを与える）と共に室温で１時間インキュベート
し、窒素を吹き込んだリン酸塩緩衝液（0.1モルの塩化
ナトリウム及び１ミリモルのEDTAを含む0.1Mのリン酸水
素二ナトリウム緩衝液（pH7.5）中で平衡化したG50′Se
phadex′カラム（60ml）上で脱塩した。溶離蛋白質を直
接′Amicon′遠心により1.0mlに再度濃縮し、DMF（200
μｌ）で希釈し、ヨードアセチル化ケンプチド溶液（30
μｌ、実施例１の要領で製造）で処理した。最終的比率
はチオプロピル基１個当たり2.5個のヨードアセチル残
基となる。反応混合物を室温で24時間インキュベート
し、DMF（100μｌ）中のＮ−エチルマレイミド（5mg）
の溶液を加えることにより残留未反応チオール基を完全
にブロックした。さらに１時間後、“酵素緩衝液”（５
ミリモルの塩化マグネシウム及び0.25ミリモルのEGTA
［エチレングリコール−ビス−（ベータ−アミノエチル
エーテル）−N,N,N1，N1−テトラ酢酸］を含む50ミリ
モルのリン酸水素カリウム（pH7.0）中で平衡化させたG
50′Sephadex′カラム（60ml）に反応混合物を適用し、
溶離蛋白質を′Amicon′遠心により1mg/mlに濃縮し、濾
過し（0.22μ）、４℃で保存した。
実施例３ OX7−′ケンプチド′複合による抗体の機能の保持 種々の濃度のOX7−ケンプチド複合体（50μｌ、実施
例２に記載の方法で製造）を、牛血清アルブミン（BS
A）（2mg/ml）及びナトリウムアジド（0.05％）を含む
リン酸塩緩衝食塩水（PBS）中のAKR−Ａマウスのリンパ
腫細胞のアリコート（106細胞/mlで1ml）に加えた。37
℃で30分間インキュベートした後、細胞をPBS溶液で２
回洗浄し、得られた細胞ペレットを保存溶液から1:32で
希釈したフルオレセイン イソチオシアナート−標識兎
抗−マウス抗体（Miles Lab.）で処理した。37℃で30分
間インキュベートした後、細胞をPBS/BSA/アジド溶液で
洗浄し、最終的に1mlの緩衝液に懸濁した。各濃度につ
き少なくとも104細胞の流動細胞計測分析により、複合
体、及び本来のOX7が同一の結合特性を持つことが示さ
れ、複合OX7の親和性の減少の証拠はなかった。約60ng/
mlのOX7、又はOX7−′ケンプチド′により結合部位の50
％が飽和した。
例２に記載の方法で製造）を、牛血清アルブミン（BS
A）（2mg/ml）及びナトリウムアジド（0.05％）を含む
リン酸塩緩衝食塩水（PBS）中のAKR−Ａマウスのリンパ
腫細胞のアリコート（106細胞/mlで1ml）に加えた。37
℃で30分間インキュベートした後、細胞をPBS溶液で２
回洗浄し、得られた細胞ペレットを保存溶液から1:32で
希釈したフルオレセイン イソチオシアナート−標識兎
抗−マウス抗体（Miles Lab.）で処理した。37℃で30分
間インキュベートした後、細胞をPBS/BSA/アジド溶液で
洗浄し、最終的に1mlの緩衝液に懸濁した。各濃度につ
き少なくとも104細胞の流動細胞計測分析により、複合
体、及び本来のOX7が同一の結合特性を持つことが示さ
れ、複合OX7の親和性の減少の証拠はなかった。約60ng/
mlのOX7、又はOX7−′ケンプチド′により結合部位の50
％が飽和した。
実施例４ ヨードアセチル′ケンプチド′及びH17E2からの複合体
の形成 H17E2はヒト アルファー胎盤アルカリホスファター
ゼに対して生ずるモノクロナール抗体であり、通常胎盤
に見られるが卵巣、精巣、子宮、及び神経膠腫瘍組織に
も発現する。この複合体は基本的に実施例２と同様の方
法で製造したが、H17E2（10mg）、SPDP（170μｇ）、ジ
チオトレイトール（１モル溶液65μｌ）、及びヨードア
セチル′ケンプチド′（実施例１に記載の方法で製造し
た溶液67μｌ）を使用した。この方法により７個のチオ
ール基を抗体に導入し、カップリングを最大にするため
に３倍過剰量のヨードアセチル−ケンプチドを使用し
た。残留未反応チオールはDMF（120μｌ）中のＮ−エチ
ルマレイミド（6mg）を用いてブロックした。
の形成 H17E2はヒト アルファー胎盤アルカリホスファター
ゼに対して生ずるモノクロナール抗体であり、通常胎盤
に見られるが卵巣、精巣、子宮、及び神経膠腫瘍組織に
も発現する。この複合体は基本的に実施例２と同様の方
法で製造したが、H17E2（10mg）、SPDP（170μｇ）、ジ
チオトレイトール（１モル溶液65μｌ）、及びヨードア
セチル′ケンプチド′（実施例１に記載の方法で製造し
た溶液67μｌ）を使用した。この方法により７個のチオ
ール基を抗体に導入し、カップリングを最大にするため
に３倍過剰量のヨードアセチル−ケンプチドを使用し
た。残留未反応チオールはDMF（120μｌ）中のＮ−エチ
ルマレイミド（6mg）を用いてブロックした。
実施例５ ヨードアセチル′フォクスチド′及びモノクロナール抗
体OX7からの複合体の形成 乾燥DMF（14μｌ）中のＮ−コハク酸イミジル−２−
ヨード酢酸（0.28mg、１当量）をメタノール（60μｌ）
で希釈した水（40μｌ）中の′フォクスチドＩ′（Lys.
Tyr.Arg.Arg.Ala.ser.Leu.Gly）（1mg）の溶液に加え、
100μＭの水酸化ナトリウム（14μｌ）で処理してpH6.4
とした。室温で１時間インキュベートした後、TLC及び
ニンヒドリン染色により反応の完了が示された。この反
応混合物（60μｌ）の試料をチオール化OX7モノクロナ
ール抗体の溶液（650μｌ、実施例２に記載の方法で製
造）に加え、４℃にて72時間インキュベートした。未反
応チオール基（もしあれば）をDMF（50μｌ）中のＮ−
エチルマレイミド（5mg）を加えることによりブロック
し、１時間インキュベートした後複合体を単離し、実施
例２に記載の方法で酵素緩衝液中に保存した。
体OX7からの複合体の形成 乾燥DMF（14μｌ）中のＮ−コハク酸イミジル−２−
ヨード酢酸（0.28mg、１当量）をメタノール（60μｌ）
で希釈した水（40μｌ）中の′フォクスチドＩ′（Lys.
Tyr.Arg.Arg.Ala.ser.Leu.Gly）（1mg）の溶液に加え、
100μＭの水酸化ナトリウム（14μｌ）で処理してpH6.4
とした。室温で１時間インキュベートした後、TLC及び
ニンヒドリン染色により反応の完了が示された。この反
応混合物（60μｌ）の試料をチオール化OX7モノクロナ
ール抗体の溶液（650μｌ、実施例２に記載の方法で製
造）に加え、４℃にて72時間インキュベートした。未反
応チオール基（もしあれば）をDMF（50μｌ）中のＮ−
エチルマレイミド（5mg）を加えることによりブロック
し、１時間インキュベートした後複合体を単離し、実施
例２に記載の方法で酵素緩衝液中に保存した。
実施例６ ［ガンマ−32P］−アデノシン−５′−Ｏ−（３−チオ
トリホスフェート）の合成 以下の試薬を150mlのフラスコ中に導入した： トリス緩衝液、pH8.0、50ミリモル MgCl2、12ミリモル ジチオトレイトール、６ミリモル DL−グリセルアルデヒド ３−ホスフェート、８ミリ
モル β−NAD、0.5ミリモル アデノシン ジホスフェート、8.6ミリモル ピルビン酸ナトリウム、20ミリモル 32P−チオリン酸ナトリウム、1.7ミリモル−1mCi活性 エチレンジアミンテトラ酢酸二ナトリウム塩、0.1ミ
リモル グリセルアルデヒドホスフェートデヒドロゲナーゼ、 1.6単位/ml ３−ホスホグリセロキナーゼ、１単位/ml ラクテートデヒドロゲナーゼ、2.75単位/ml この混合物の合計容量は50mlであり、ピルビン酸の添
加後に水酸化ナトリウムを用いてpHを7.5に調節した。
室温で終夜反応させ、所望の［ガンマ−32P］−アデノ
シン５′−Ｏ−（３−チオトリホスフェート）を含む水
溶液を得た。
トリホスフェート）の合成 以下の試薬を150mlのフラスコ中に導入した： トリス緩衝液、pH8.0、50ミリモル MgCl2、12ミリモル ジチオトレイトール、６ミリモル DL−グリセルアルデヒド ３−ホスフェート、８ミリ
モル β−NAD、0.5ミリモル アデノシン ジホスフェート、8.6ミリモル ピルビン酸ナトリウム、20ミリモル 32P−チオリン酸ナトリウム、1.7ミリモル−1mCi活性 エチレンジアミンテトラ酢酸二ナトリウム塩、0.1ミ
リモル グリセルアルデヒドホスフェートデヒドロゲナーゼ、 1.6単位/ml ３−ホスホグリセロキナーゼ、１単位/ml ラクテートデヒドロゲナーゼ、2.75単位/ml この混合物の合計容量は50mlであり、ピルビン酸の添
加後に水酸化ナトリウムを用いてpHを7.5に調節した。
室温で終夜反応させ、所望の［ガンマ−32P］−アデノ
シン５′−Ｏ−（３−チオトリホスフェート）を含む水
溶液を得た。
実施例７ OX7−ケンプチドのチオホスホリル化 OX7−ケンプチド保存溶液（1mg/mlで70μｌ、実施例
２に記載の方法で製造）、＋５“酵素緩衝液”（30μ
ｌ）、25ミリモルの塩化マグネシウム及び1.25ミリモル
のEGTAを含むリン酸水素二カリウム250ミリモル（pH7.
0）の実施例６に記載の1mCiの標識チオトリホスフェー
トに加え、続いて牛心臓蛋白キナーゼ（５μｌ、50単
位、Sigma）を加えた。反応混合物を37℃で30分インキ
ュベートし、牛血清アルブミン（2mg/ml）を含む緩衝食
塩水中で予備洗浄し、リン酸塩緩衝食塩水で平衡化した
G50 Sephadexカラム（10ml）を用いて蛋白質を脱塩し
た。カラムから溶離する物質は32P標識OX7−ケンプチド
であった。
２に記載の方法で製造）、＋５“酵素緩衝液”（30μ
ｌ）、25ミリモルの塩化マグネシウム及び1.25ミリモル
のEGTAを含むリン酸水素二カリウム250ミリモル（pH7.
0）の実施例６に記載の1mCiの標識チオトリホスフェー
トに加え、続いて牛心臓蛋白キナーゼ（５μｌ、50単
位、Sigma）を加えた。反応混合物を37℃で30分インキ
ュベートし、牛血清アルブミン（2mg/ml）を含む緩衝食
塩水中で予備洗浄し、リン酸塩緩衝食塩水で平衡化した
G50 Sephadexカラム（10ml）を用いて蛋白質を脱塩し
た。カラムから溶離する物質は32P標識OX7−ケンプチド
であった。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｔ 51/00 ＡＤＵ 43/00 ＡＤＵ (72)発明者 クレイトン，アンドルー・マルコム イギリス国ロンドン エヌダブリユー73 キユーワイ・ミルヒル・ミルウエイ68 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C07H 19/20 C07K 16/30 C12P 19/32 C12P 21/08 ＣＡ（ＳＴＮ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (18)
- 【請求項１】一般式： ［式中、Ａはヌクレオシド残基であり、ガンマ−チオホ
スフェート基のリンが32Pである］ の化合物。 - 【請求項２】第１項に記載の化合物において、Ａがアデ
ノシン残基であることを特徴とする化合物。 - 【請求項３】次式： ［式中、Ａはヌクレオシド残基であり、ガンマ−チオホ
スフェート基のリンが32Pである］ の化合物の製造法において、式： ［式中、Ａは上記と同義である］ のヌクレオシド−５′−Ｏ−ジホスフェートを、32Pチ
オホスフェートを用いて酵素によりチオホスホリル化す
ることから成ることを特徴とする方法。 - 【請求項４】第３項に記載の方法において、32Pチオホ
スフェートがナトリウム32Pチオホスフェートであるこ
とを特徴とする方法。 - 【請求項５】第３又は４項に記載の方法において、酵素
がグリセルアルデヒドホスフェートデヒドロゲナーゼ、
３−ホスホグリセロキナーゼ、及びラクテートデヒドロ
ゲナーゼの混合物であることを特徴とする方法。 - 【請求項６】第３−５項のいずれかに記載の方法におい
て、Ａがアデノシン残基であることを特徴とする方法。 - 【請求項７】腫瘍に伴う構造と結合する32Pチオホスホ
リル化結合蛋白質。 - 【請求項８】第７項に記載の蛋白質において、腫瘍に伴
う構造が蛋白質であることを特徴とする蛋白質。 - 【請求項９】第７又は８項に記載の蛋白質において、結
合蛋白質が抗体、あるいはそのフラグメントであること
を特徴とする蛋白質。 - 【請求項１０】第７−９項のいずれかに記載の蛋白質に
おいて、結合蛋白質がケンプチド又はフォクスチドＩあ
るいはフォクスチドIIのアミノ酸配列を挿入したモノク
ロナール抗体、又はそのフラグメントであることを特徴
とする蛋白質。 - 【請求項１１】32Pチオホスホリル化結合蛋白質の製造
法において、第１又は２項に記載の化合物を、ホスホキ
ナーゼの存在下で、ホスホキナーゼの基質として作用す
ることができるペプチド領域を含む結合蛋白質と反応さ
せることから成ることを特徴とする方法。 - 【請求項１２】第11項に記載の方法において、ホスホキ
ナーゼがセリン、又はトレオニンであり、結合蛋白質に
おけるホスホキナーゼの基質がケンプチド、フォクスチ
ドＩ又はフォクスチドIIであることを特徴とする方法。 - 【請求項１３】第11又は12項に記載の方法において、結
合蛋白質が抗体又はそのフラグメントであることを特徴
とする方法。 - 【請求項１４】第13項に記載の方法において、抗体がモ
ノクロナール抗体又はそのフラグメントであることを特
徴とする方法。 - 【請求項１５】第12−14項のいずれかに記載の方法にお
いて、結合蛋白質が腫瘍に伴う蛋白質と結合することを
特徴とする方法。 - 【請求項１６】第７−10項のいずれかに記載の32Pチオ
ホスホリル化結合蛋白質を、非径口的に許容できる希釈
剤と共に含む製楽配合物。 - 【請求項１７】ヒト又は動物の体に行われる治療法にお
いて使用するための、第７−10項に定着しいた32Pチオ
ホスホリル化結合蛋白質。 - 【請求項１８】腫瘍の退行を促進する方法において、そ
のような治療の必要な患者への第７−10項に記載の32P
チオホスホリル化結合蛋白質の投与を含むことを特徴と
する方法。
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