JPH04503809A - 蛋白質の放射標識に関する改良 - Google Patents
蛋白質の放射標識に関する改良Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
蛋白質の放射標識に関する改良
本発明は蛋白質の放射標識に関連しており、特に32pを用いたモノクロナール
抗体、及び他の蛋白質の標識に関する。本文で使用する“蛋白質“という言葉は
ポリペプチドを含む。薬剤の標的設定に配達ビヒクルとしてモノクロナール抗体
、及び他の蛋白質を使用する概念はすでに確立している。しかし薬剤をモノクロ
ナール抗体、又は他の配達系に結合させる場合、それは薬剤の活性が保持され、
同時にモノクロナール抗体又は他の配達系の特異性が保たれる方法で行わなけれ
ばならないので、そこに実際上の困難がある。従来の反応条件の多くは薬剤の活
性及び配達系の特異性のどちらか、あるいは両方を破壊するので、薬剤と配達系
を結合するために理論的に可能な化学的、及び生物学的方法に実際上はかなりの
制限が加えられる。
現在、放射線療法はある癌状態のひとつの治療法として十分確立されており、こ
の目的のためにヨウ素、及びインジウムならびにイツトリウムなどの多くの金属
の放射性同位元素の抗体への結合が現在研究されている。uPは14日という合
理的な短い半減期を持ち、粒子エネルギーが1.7MeVの純粋なベータ エミ
ッターなので、放射性核種32Pは多くの方法において、比較的血液供給の少な
いある種の充実性腫瘍に対して使用するのに特に有利な放射性核種である。しか
し他の放射性同位元素の結合に以前用いられてきた方法により12Pを抗体に結
合させることはできなかった。
ここで我々は、モノクロナール抗体又は類似標的分子を構造的に修正し、標的分
子の特異性を保持して32p標識物質を与えることのできる穏やかな反応条件下
でそれが容易に、及び速やかに31pに結合できるようにする方法を見いだした
。
我々の公開UK特許出願GB−A−2186579は蛋白質、糖脂質、又は炭水
化物などの腫瘍に伴う構造と結合する蛋白質を修正する方法において、ホスホキ
ナーゼの基質として働くことができるペプチド領域を結合蛋白質に導入すること
を含む方法につき記載している。ここで我々は得られた修正結合蛋白質を、ホス
ホキナーゼの存在下で、ガンマホスフェート基をチオホスフェート基により置換
し、少なくともガンマチオホスフェート基をstp標識した修正ヌクレオシドト
リホスフェートと反応させることによりszp標識することができることを見い
だした。この方法は32p標識を持つ結合蛋白質(標的分子)を与える。
我々の発明で使用するチオホスホリル化剤はガンマホスフェート基が標識をした
ヌクレオシドトリホスフェートである。そのようなチオホスホリル化剤は新規化
合物であり、本発明の一部である。できるだけ多くのガンマP原子を標識するの
が望ましく、実際は少なくとも10%、好ましくは少なくとも50%のガンマP
原子がsapとして存在しなければならない。
我々の前述のUK特許出願は、修正結合蛋白質をホスホキナーゼの存在下で32
p標識ガンマヌクレオシドトリホスフエートと反応させることによる、その31
P標識につき記載している。
この方法の欠点は、修正蛋白質のホスホリル化の間に形成されるホスフェート−
セリン(又はトレオニン)結合は単離した血漿中で比較的安定であるが、インビ
ボにおける複合体の代謝による分解の後に毒性の32PO4が放出されることで
ある。ガンマ標識32pヌクレオシドトリホスフエートを、ガンマホスフェート
中のP=O(すなわちキナーゼによって移動する末端基)がP=Sにより置換さ
れた対応する試薬で置き換えることにより、インビボでより安定であり分解して
毒性の代謝物を放出しにくいチオホスホリル化セリン(又はトレオニン)を形成
する結果となると思われる。
本発明に従い、我々は一般式:
%式%
[式中、Aはヌクレオシド残基であり、ガンマ−チオホスフェート基のリンはs
tpである]
の化合物を提供する。
本発明の好ましい化合物は、後文では[ガンマ−”P] ATP−ガンマ Sと
呼び、式I
S OO
(式I)
を有する[ガンマ−32P]−アデノシン−5’ −0−(3−チオトリホスフ
ェート)である。
本発明のヌクレオシド チオトリホスフェ−1−は式%式%
[式中、Aは上記と同義である]
のヌクレオシド ジホスフェートを32pチオホスフエートを用いて酵素により
チオホスホリル化することにより製造することができる。チオホスフェートは金
属チオホスフェート、特にアルカリ金属又はアルカリ土類金属チオホスフェート
、あるいは有機チオホスフェート、例えばアミンがメチルアミン又はジメチルア
ミンなどのモノ又はジ置換体であるアミンチオホイフェートであることができる
。ヌクレオシド ジホスフェートと32p標識チオホスフエートの反応は酵素に
より、例えばCa5sidy and Kerrick、Bioehim、et
Biop条件下で行うことができる。従ってこの反応はグリセルアルデヒド
ホスフェート デヒドロゲナーゼ、3−ホスホグリセロキナーゼ、及びラクテー
ト デヒドロゲナーゼの混合物の存在下で行うことができる。このチオホスホリ
ル化のために適した酵素の選択に関する案内はさらにWalseth and
Johnson、Biochim、et Bi本発明のチオホスホリル化は所望
のs2Pチオトリホスフェート ヌクレオシド エステルを含む水溶液を与える
。この溶液はさらに精製することなく、下記に記載の方法による結合蛋白質のチ
オホスホリル化に使用することができる。ある場合にはホスホキナーゼの存在下
における結合蛋白質の最終的ホスホリル化の前に、ジホスフェートのチオホスホ
リル化からの残留酵素を例えば60℃にて少なくとも5分間熱処理することによ
り不活性化するのが望ましい。
結合蛋白質は普通、腫瘍に伴う抗原、例えば血液供給が比較的少ない充実性腫瘍
に伴う抗原と結合するモノクロナール抗体であろう。そのような充実性腫瘍には
大腸、卵巣、及び肺に見られる腫瘍が含まれ、そのような腫瘍に伴う抗原に対す
るモノクロナール抗体はすでに周知であり、他の抗−腫瘍剤のための配達ビヒク
ルとしてすでに使用されている。そのような周知の抗体は本発明の方法により3
2pに結合させることができる。
より一般的には、結合蛋白質は腫瘍に伴う蛋白質(又は糖脂質あるいは炭水化物
などの腫瘍に伴う他の構造)と結合するどのような蛋白質であることもでき、そ
の場合腫瘍は高エネルギーベータ粒子を受け入れるものであり、モノクロナール
抗体の他に第1蛋白質は例えばFabフラグメント、又はある種の腫瘍細胞上に
同定される適した受容部位に結合するホルモン又は類似のペプチド、例えばメラ
ニン細胞刺激ホルモン、上皮成長因子、インターフェロン、及びボンベシンなど
の有糸分裂促進ペプチドであることができる。
結合蛋白質の構造の修正によりホスホキナーゼの基質として働くことができるペ
プチド領域が導入され、“蛋白質”/基質複合体とみなすことができる構造的に
修正された“結合蛋白質′がホスホキナーゼの存在下で32p含有チオホスホリ
ル化剤と接触した場合に、酵素はチオホスホリル化剤から複合体の基質の領域へ
の32pの移行を触媒することができる。
本発明の有用性はホスホキナーゼとしてセリン/トレオニンの利用を暗示してい
る。これらの物質は現在Sigma Companyから例えば牛心臓蛋白キナ
ーゼとして商業的に入手可能である。
Leu、Arg、Arg、Ala、ser、Leu、Glyの構造を持ち、ケン
ブチドとして知られるヘプタペプチドは現在商業的に入手可能であり、牛心臓蛋
白キナーゼの良い基質であることが知られている。
ここで我々は驚くべき事にケンブチド構造をモノクロナール抗体にグラフトする
とモノクロナール抗体の特異性が影響を受けないばかりでなくモノクロナール抗
体/ケンブチド複合体のキナーゼに対する基質とじて働く能力も損傷を受けずチ
オホスホリル化を行うこともできるということを見いだした。
我々の新規方法の実際上の利点のひとつは、モノクロナール抗体、又は他の蛋白
質をヘプタペプチドと複合させることにより、部分的にチオホスホリル化の準備
をし、放射標識分子を患者に投与する直前までチオホスホリル化をせずに残して
おくことができる点である。
本発明の概念は特別なヘプタペプチド、ケンプチドの使用に依存しているわけで
はなく、事実ホスホキナーゼの基質として作用することができればどのようなペ
プチドも使用することができる。ホスホキナーゼが牛ノ心臓から誘導したセリン
/トレオニン キナーゼである場合、基質分子としての主な構造的必要条件は基
質中のセリン、及び/又はトレオニン残基に近接して例えばアルギニン、及び/
又はリシン残基から生じるような正電荷の領域が存在することである。ケンプチ
ドはそのような基質のひとつであるが、我々は池の類似分子について研究してお
り、その分子中でケンブチドのN−末端のロイシン残基をリシン−チロシンジペ
プチドに置換し、オクタペプチドLys、Tyr、Arg、Arg。
Ala、Ser、Leu、Gly、を得、フオクスチドIと名付けた。
ケンブチドよりフォクスチドIが有利な点はN−末端にリシン残基があることに
より基質分子の抗体分子への複合が容易となり、一方チロジン分子の存在により
基質分子に紫外“可視性”が与えられ、精製及び同定が容易となる点である。
我々は又、上記の一般的要求を満たす別の基質分子を開発したが、それはデカペ
プチド構造である。
Cys、 A、rg、 Arg、 Lys、 Ala、 Ser、 Gly、
Pro。
Pro、Val
我々はこのデカペプチドをフォクスチドIIと名付けた。セリン残基が、他の点
では類似の牛心臓蛋白キナーゼの存在下における反応条件でケンブチド中のセリ
ン残基より迅速にチオホスホリル化を行うことができる点で、フォクスチドII
はケンプチドより我々の目的に有利である。さらにN−末端のシスティン残基が
末端残基のSH結合を通してモノクロナール抗体、又は他の第1蛋白質との複合
を容易にする。フオクスチド■及びフォクスチドIIはMerrifield樹
脂上の従来の固相ペプチド合成により製造することができる。
これまで議論してきた基質分子はすべてセリン/トレオニンキナーゼに対する基
質であるが他の種類のホスホキナーゼも知られており、適した基質と共に使用す
ることができる。例えばチロシンキナーゼであるホスホキナーゼが周知であり、
それらのチロシンキナーゼの基質が知られており、その基質中で酵素はチロシン
残基のチオホスホリル化を行う。
そのようなチロシンキナーゼの例にはCa5nellie等、PNAS。
1982.79.282−6に記載のリンパ腫細胞抽出物に含まれるものがある
。チロシンキナーゼの基質の例は:Ice−Glu−Asp−Asn−Glu−
Tyr−Thr−Ala−Arg−Gln−Glyである。
本発明で使用するキナーゼ基質はどのような大きさの分子であることもできる。
唯一の必要条件がチオホスホリル化可能残基、例えばセリン、トレオニン、又は
チロシンを持つことであり、それは使用する酵素に依存して正電荷の領域に近接
することが必要であるため、できるだけ小さい基質を使用する傾向がある。従っ
て合成の経済性、及び精製の容易さなどの実際性から最高約20アミノ酸残基を
含む小さいペプチドの使用が示唆されているが、基質が大きい程最終的第1蛋白
質/基質複合体の性質に抵触し易いことに留意しながら、より大きい基質を使用
すること基質分子のモノクロナール抗体、又は他の結合蛋白質への複合に化学的
方法を使用することができる。基本的に第1蛋白質、及び基質分子の活性基を適
度に活性化して複合を起こすために必要な結合を形成し、同時に腫瘍に伴う蛋白
質に関連した第1蛋白質の特異性、及びその後のホスホキナーゼ チオホスホリ
ル化の間の基質として作用する基質分子の容量を変化させたりする反応条件を避
けることが必要である。
“ 基質分子の標的分子(結合蛋白質)への十分な結合は適した複素二官能基性
蛋白質架橋剤を用いて行うことができることを見いだした。例えば標的分子はN
−コハク酸イミジル−3−(2−ピリジルジチオ)プロピオネ−) (SPDP
)と反応させ、続いてジチオトレイトールと反応させることができる。5PDP
との反応により標的分子のりシン残基の側鎖アミノ基上にジチオプロピオニル基
が導入され、続く反応段階によリンチオ基が末端チオール基に変換される。この
末端チオール基が基質分子の導入のための活性部位となる。
例えばケンプチドの末端ロイシン残基のアルファーアミノ基を対応するN−ヒド
ロキシコハク酸イミジルエステルと反応させて例えばヨードアセトアミド又はフ
ェニルマレイミドを得ることにより標的分子への複合のために基質分子を活性化
することができ、それが標的分子上に導入されたチオプロピオンアミド残基のチ
オール基と反応し、基質分子がチオ結合を含む短い架橋基を通じて標的分子と結
合することができる。
フォクスチドIIなどの活性チオール基を有する基質分子との複合のために第1
蛋白質は、例えばSMPB [コハク酸イミジル−4−(p −マレイミドフェ
ニル)ブチレートコなどと反応させることにより活性化することができる。この
目的のために使用することができる他の試薬にはMBS(m−マレイミドベンゾ
イル−N−ヒドロキシ コハク酸イミドエステル) 、SMCC[コハク酸イミ
ジル] −4−(N−マレイミドメチル)−シクロヘキサン−1−カルボキシレ
ート]、及び5IAB[N−コハク酸イミジル−(4−ヨードアセチル)アミノ
ベンゾエート]が含まれ、これらはすべて商業的に入手できる。
蛋白質/基質複合体の製造のための上記の従来の合成法の他に、遺伝子工学法を
用いて第1蛋白質の1次構造内の適した位置に適した基質の配列を組み込むこと
ができる。
標的分子/基質分子複合体は安定な素材であり、室温かそれより少し低温で、す
なわち0−20℃で長期間保存することができる。複素二官能基性蛋白質架橋剤
を用いて標的分子を基質分子と複合させた後、標的分子の特異性、及び基質分子
の基質容量は最初、及び0−20℃における長期保存の後も保持されることを見
いだした。
本発明の利点のひとつは標的分子/基質分子複合体をこの形態で、使用前に長期
間保存することができ、患者に使用する直前にチオホスホリル化して32p官能
基を容易に導入することができることである。チオホスホリル化そのものは、従
来のいずれのホスホキナーゼ/チオホスホリル化剤系を用いても行うことができ
、牛心臓蛋白キナーゼ、及び複合体の基質部分のチオホスホリル化可能なセリン
又はトレオニン残基を用いて満足すべき結果を容易に得ることができることを見
いだした。5tp−ガンマ−ATP−ガンマ Sの代わりに32P−ガンマ−グ
アニジン5’ −〇−(3−チオトリホスフェート)などの他のヌクレオシドに
基づいたチオホスフェートを、適したホスホキナーゼと共にチオホスホリル化剤
として使用することができる。これらのチオホスホリル化剤は適したホスホキナ
ーゼと共に使用して、基質部分にチロシン残基を持つ複合体中のチロシン上に3
2Pを導入することもできる。
本発明は最初、複合体の基質部分のチオホスホリル化可能アミノ酸残基の酵素に
よるチオホスホリル化を容易にするために計画したものであるが、化学的チオホ
スホリル化も可能である。
標的分子/基質分子複合体のチオホスホリル化が一度完了すると、32P標識材
料は例えばリン酸塩緩衝食塩水で平衡化した5ephadexカラム上のゲル濾
過、又は例えばプロティン−Aカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィ
ーなどの標準的クロマトグラフ法により精製することができる。このようにして
得た0p複合体溶液はその後濾過(0,22μ)することができ、投薬に適した
形態となる。
本発明の別の特徴により、製薬上許容できる希釈剤、及び腫瘍に伴う構造に結合
する12P標識チオホスホリル化蛋白質から成る、特に非経口的適用のための製
薬配合物を提供する。
一度微量の放射標識結合蛋白質が正常の組織と比較して腫瘍を標的とすることが
示されたら、32p−標識チオホスホリル化結合蛋白質を静脈注射により、又は
例えば腹膜内、胸膜内、あるいは動脈内拡散により体の種々の領域に与えること
ができる。適した治療的投薬量は1回の治療において患者1人当たり10 50
mC1、好ましくは約30mC1から成る。
本発明の0p−標識チオホスホリル化結合蛋白質を使用すると、放射活性生成物
の取り扱い及び製造の間の保護手順が簡単であること、医員への外部放射線量が
少ないこと、及び物質が非揮発性であるため廃棄問題が単純であることなどの利
点がある。32pは131■などの他の放射性同位元素と比較して、標的に地線
量を与えるのに必要な相対的放射能濃度が131■の場合より少ないので、32
P−標識結合蛋白質を用いると患者が高い線量率を受けることができるという点
で有利であるニリン−標識標的分子を用いて特定の標的組織に与えられる単位線
量は、例えば1311標識標的分子を用いて与えられる量の約2倍である。さら
に透過ガンマ線がないために、この放射線療法の無関係な組織への影響は非常に
少ない。
sxp @識結合蛋白質を用いた治療の後数週間、Up−オルトホスフ二−ト塩
を投与することにより無関係な組織への損傷を最小にすることができる。Eth
yol (WR2721)などの放射線保護剤の使用も有利である。
最も敏感な正常組織は骨髄であり、非常に高い放射線量の32p−標識チオホス
ホリル化結合蛋白質の使用を可能にするための骨髄移植も本発明の範囲内に含ま
れる。さらに顆粒球/マクロファージ−コロニー賦活因子(GM−C5F)など
のサイトキニン、及びインターリューキンも損傷骨髄の回復の賦活に使用するこ
とができる。
5zp−標識チオホスホリル化結合蛋白質は、例えば卵巣腫瘍、肝臓への大腸転
移、悪性胸膜滲出、及び脳腫瘍の治療において興味深い。
以下の実施例は、標的分子としてマウスに移植した充実性腫瘍に結合するモノク
ロナール抗体を用いて本発明を実現する方法を説明するもの乾燥ジメチルホルム
アミド(DMF、62.5μm)中のN−コハク酸イミジルー2−ヨードアセテ
ート(0,75mg、2当量)を、最初にメタノール(40μl)で希釈した水
(60μ)中の“ケンプチド“(1,5mg)の溶液に加えた。室温で1時間イ
ンキュベートした後、薄層クロマトグラフィー(TLC)(6065セルロース
プレート、Eastman、1−ブタノール:水:酢酸:ビリジンを50 :
40 :2+32v/vの割合で用いて溶離)−ニンヒドリン染色により試料を
分析し、遊離第17ミノ基が完全に除去されていることが示され、反応の完了が
分かった。その後反応混合物を実施例2に記載するチオプロピル化抗体へのカッ
プリングに直接使用した。
N−コハク酸イミジル−3−(2−ピリジルチオ)プロピオネート(SPDP)
の溶液(乾燥DMF中の3.1ng/mlの保存溶液44μm)をOX7モノク
ロナール抗体の溶液(1,0mlのほう酸塩緩衝液(0,1Mの塩化ナトリウム
及び0.5%V / Vの1−ブタノールを含む105Mのほう酸ナトリウム、
pH9,0)中の7. 8mg) ニ加えた。OX7はマウスAKRリンパ腫を
認識するマウスの抗体である。
免疫グロブリンに対する5PDPのモル比は8:1である。室温で1時間インキ
ュベートした後、アセトン緩衝液(0,1モルの塩化ナトリウム及び1ミリモル
のエチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)を含む0゜1モルの酢酸ナトリウム
;pH4,5)中で平衡化したG50’ 5ephadex’ カラム(60m
l)上で反応混合物を脱塩した。Carlsson等、(Biochem J、
1978.173.723)の標準的方法により溶離蛋白質を分析し、IgG分
子分子1赴当平均4.6個のジチオプロピル基が導入されたことが明らかになっ
た。その後蛋白質溶液(5,6m1)をジチオトレイトール(1モル保存溶液2
75μmで最終濃度50ミリモルを与える)と共に室温で1時間インキュベート
し、窒素を吹き込んだリン酸塩緩衝液(0,1モルの塩化ナトリウム及び1ミリ
モルのEDTAを含む0.1Mのリン酸水素二ナトリウム緩衝液(pH7,5)
中で平衡化したG50’ 5ephadex’ カラム(60ml)上で脱塩し
た。溶離蛋白質を直接’Am1con’遠心により1.0mlに再度濃縮し、D
MF (200μl)で希釈し、ヨードアセチル化ケンプチド溶液(30μl、
実施例1の要領で製造)で処理した。最終的比率はチオプロピル基1個当たり2
.5個のヨードアセチル残基となる。反応混合物を室温で24時間インキュベー
トし、DMF(100μm)中のN−エチルマレイミド(5mg)の溶液を加え
ることにより残留未反応チオール基を完全にブロックした。さらに1時間後、“
酵素緩衝液” (5ミリモルの塩化マグネシウム及び0.25ミリモルのEGT
A [エチレングリコール−ビス−(ベーターアミノエチル エーテル) −N
、 N、 N1. Nl−テトラ酢酸]を含む50ミリモルのリン酸水素カリウ
ム(pH7,0))中で平衡化させたG50’ 5ephadex’カラム(6
0ml)に反応混合物を適用し、溶離蛋白質を′Am1con’遠心により1m
g/mlに濃縮し、濾過しく0.22u)、4℃で保存した。
種々の濃度の0X7−ケンプチド複合体(50μ11実施例2に記載の方法で製
造)を、牛血清アルブミン(BSA)(2mg/ml)及びナトリウムアジド(
0,05%)を含むリン酸塩緩衝食塩水(PBS)中のAKR−Aマウスのリン
パ腫細胞のアリコート(106細胞/mlT1m1)i:加えた。37℃で30
分間インキュベートした後、細胞をPBS溶液で2回洗浄し、得られた細胞ペレ
ットを保存溶液から1=32で希釈したフルオレセイン イソチオシアナート−
標識兎抗−マウス抗体(Miles Lab、)で処理した。37℃で30分間
インキュベートした後、細胞をPBS/BSA/アジド溶液で洗浄し、最終的に
1mlの緩衝液に懸濁した。各濃度につき少なくとも104細胞の流動細胞計測
分析により、複合体、及び本来のOX7が同一の結合特性を持つことが示され、
複合OX7の親和性の減少の証拠はなかった。約60ng/mlのOX7、又は
0X7−’ ケンプチド′により結合部位の50%が飽和した。
実施例4
ヨードアセチル′ケンブチド′及びH17E2からの複合体の形成H17E2は
ヒト アルファー胎盤アルカリホスファターゼに対して生ずるモノクロナール抗
体であり、通常胎盤に見られるが卵巣、精巣、子宮、及び神経膠腫瘍組織にも発
現する。この複合体は基本的に実施例2と同様の方法で製造したが、817E2
(10mg) 、5PDP (170μg)、ジチオトレイトール(1モル溶
液65μm)、及びヨードアセチル−′ケンプチド′ (実施例1に記載の方法
で製造した溶液67μl)を使用した。この方法により7個のチオール基を抗体
に導入し、カップリングを最大にするために3倍過剰量のヨードアセチルーケン
ブチドを使用した。残留未反応チオールはDMF(120μl)中のN−エチル
マレイミド(6mg)を用いてブロックした。
実施例5
ヨードアセチル′ フォクスチド′及びモノクロナール抗体OX7からの複合体
の形成
乾燥DMF(14μm)中のN−コハク酸イミジルー2−ヨード酢酸(0,28
mg、1当量)をメタノール(60μりで希釈した水(40μl)中の′フォク
スチド!’ (Lys、Tyr、Arg、Arg。
Ala、Ser、Leu、Gly)(1mg)の溶液に加え、100μMの水酸
化ナトリウム(14μm)で処理してpH6,4とした。室温で1時間インキュ
ベートした後、TLC及びニンヒドリン染色により反応の完了が示された。この
反応混合物(60μl)の試料をチオール化OX7モノクロナール抗体の溶液(
650μl、実施例2に記載の方法で製造)に加え、4℃にて72時間インキュ
ベートした。未反応チオール基(もしあれば)をDMF(53μl)中のN−エ
チルマレイミド(5mg)を加えることによりブロックし、1時間インキュベー
トした後複合体を単離し、実施例2に記載の方法で酵素緩衝液中に保存した。
実施例6
[ガンマ−32P]−アデノシン−5’ −0−(3−チオトリホスフェート)
の合成
以下の試薬を150m1のフラスコ中に導入したニドリス緩衝液、pH8,0,
50ミリモルMgC]2.12ミリモル
ジチオトレイトール、6ミリモル
DL−グリセルアルデヒド 3−ホスフェート、8ミリモルβ−NAD、0.5
ミリモル
アデノシン ジホスフェート、8,6ミリモルビルビン酸ナトリウム、20ミリ
モル
52p−リン酸ナトリウム、1.7ミリモルー1mci活性エチレンジアミンテ
トラ酢酸二ナトリウム塩、0.1ミリモルグリセルアルデヒドホスフェートデヒ
ドロゲナーゼ、1.6単位/m1
3−ホスホグリセロキナーゼ、1単位/mlラクテートデヒドロゲナーゼ、2.
75単位/m+この混合物の合計容量は5Qmlであり、ピルビン酸の添加後に
水酸化ナトリウムを用いてpHを7.5に調節した。室温で終夜反応さ也所望の
[ガンマ−32P]−アデノシン 5’ −0−(3−チオトリホスフェート)
を含む水溶液を得た。
実施例7
0X7−ケンプチドのチオホスホリル化0X7−ケンプチド保存溶液(1mg/
mlで70μm、実施例2に記載の方法で製造)、+5“酵素緩衝液“ (30
μI)、25ミリモルの塩化マグネシウム及び1.25ミリモルのEGTAを含
むリン酸水素二カリウム250ミリモル(pH7,0)を実施例6に記載の1m
ciの標識チオトリホスフェートに加え、続いて牛心臓蛋白キナーゼ(5μl、
50単位、S i gma)を加えた。反応混合物を37℃で30分インキュベ
ートし、牛血清アルブミン(2mg/ml)を含む緩衝食塩水中で予備洗浄し、
リン酸塩緩衝食塩水で平衡化したG5゜5ephadexカラム(10ml)を
用いて蛋白質を脱塩した。カラムから溶離する物質は32p標識0X7−ケンプ
チドであった。
補正音の写しく翻訳文)提出書 (特許法第184条の8)平成3年9月21日
Claims (18)
- 1.一般式: ▲数式、化学式、表等があります▼ [式中、Aはヌクレオシド残基であり、ガンマーチオホスフェート基のリンが3 2Pである] の化合物。
- 2.第1項に記載の化合物において、Aがアデニン残基であることを特徴とする 化合物。
- 3.次式: ▲数式、化学式、表等があります▼ [式中、Aはヌクレオシド残基であり、ガンマーチオホスフェート基のリンが3 2Pである] の化合物の製造法において、式: ▲数式、化学式、表等があります▼ [式中、Aは上記と同義である] のヌクレオシド−5′−O−ジホスフェートを、32Pチオホスフェートを用い て酵素によりチオホスホリル化することから成ることを特徴とする方法。
- 4.第3項に記載の方法において、32Pチオホスフェートがナトリウム32P チオホスフェートであることを特徴とする方法。
- 5.第3又は4項に記載の方法において、酵素がグリセルアルデヒドホスフェー トデヒドロゲナーゼ、3−ホスホグリセロキナーゼ、及びラクテートデヒドロゲ ナーゼの混合物であることを特徴とする方法。
- 6.第3−5項のいずれかに記載の方法において、Aがアデニン残基であること を特徴とする方法。
- 7.腫瘍に伴う構造と結合する32Pチオホスホリル化結合蛋白質。
- 8.第7項に記載の蛋白質において、腫瘍に伴う構造が蛋白質であることを特徴 とする蛋白質。
- 9.第7又は8項に記載の蛋白質において、結合蛋白質が抗体、あるいはそのフ ラグメントであることを特徴とする蛋白質。
- 10.第7−9項のいずれかに記載の蛋白質において、結合蛋白質がケンプチド 又はフォクスチドIあるいはフォクスチドIIのアミノ酸配列を挿入したモノク ロナール抗体、又はそのフラグメントであることを特徴とする蛋白質。
- 11.32Pチオホスホリル化結合蛋白質の製造法において、第1又は2項に記 載の化合物を、ホスホキナーゼの存在下で、ホスホキナーゼの基質として作用す ることができるペプチド領域を含む結合蛋白質と反応させることから成ることを 特徴とする方法。
- 12.第11項に記載の方法において、ホスホキナーゼがセリン、又はトレオニ ンであり、結合蛋白質におけるホスホキナーゼの基質がケンプチド、フォクスチ ドI又はフォクスチドIIであることを特徴とする方法。
- 13.第11又は12項に記載の方法において、結合蛋白質が抗体又はそのフラ グメントであることを特徴とする方法。
- 14.第13項に記載の方法において、抗体がモノクロナール抗体又はそのフラ グメントであることを特徴とする方法。
- 15.第12−14項のいずれかに記載の方法において、結合蛋白質が腫瘍に伴 う蛋白質と結合することを特徴とする方法。
- 16.第7−10項のいずれかに記載の32Pチオホスホリル化結合蛋白質を、 非経口的に許容できる希釈剤と共に含む製薬配合物。
- 17.ヒト又は動物の体に行われる治療法において使用するための、第7−10 項に定義した32Pチオホスホリル化結合蛋白質。
- 18.腫瘍の退行を促進する方法において、そのような治療の必要な患者への第 7−10項に記載の32Pチオホスホリル化結合蛋白質の投与を含むことを特徴 とする方法。
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