NO177625B - Diagnostisk hjelpemiddel samt testkit omfattende hjelpemiddelet - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår et diagnostisk hjelpmiddel som benytter et technetium-99m-markert stoff.

Oppfinnelsen angår også et testkit som omfatter det technetium-99m-markerte stoff.

Ifølge de banebrytende arbeider av Milstein og Kohler, som 1975 publiserte en fremgangsmåte hvor antistoffer av serzer-nerende mus-B-lymfocytter sammensmeltes med mus-myelom-celler, og fusjonsproduktet av begge celler, hybridet vokser videre og frembringer antistoffer, er det mulig fra det store antall dannede hybrider å isolere det som produserer et antistoff av bestemt spesifitet. Disse monoklonale antistoffer som bare erkjenner en bestemt epitop på det tilsvarende antigen, står idag i stor mengde til disposisjon for immun-scintigrafi. Monoklonale antistoffer mot tumor-assosierte antigener egner seg for tumor-lokaliseringsdiagnostikk samt for påvisning av residiver og metastaser. Hertil må antistoffet før injeksjonen markeres radioaktivt for ved egnede nuklearmedisinske registreringsteknikker å fastslå om det befinner seg en antigen-holdig tumor i organismen. Av de i dag hyppigst benyttede radionukleider i den nukleærmedisinske diagnostikk er jodisotoper de som er enklest å anvende for markering av proteiner. Derved oppfyller jod-123 i første rekke de i praksis stilte krav til god påvisningsfølsomhet og liten strålebelastning da det er en ren 'y-stråle og har en gunstig 'y-energi på 159keV. Den relativt korte halveringstid for jod-123 på 13,2 timer og fremfor alt fremstillingen som er bundet til partikkelakselleratorer, noe som er ansvarlig for den relativt høye pris, begrenser imidlertid anvendelsen av jod-123 for antistoff-markering.

På grunn av at jod-131 på grunn av en for -y-kameraer energetisk ugunstig -y-stråling og den på grunn av strålebelastning uønskede e-stråling ikke er noe ideelt radio-nukleid for in vivo diagnostikk gjennomføres det ofte antistoff-markeringer fordi jod-131 kan oppnås til rimelig pris i høy aktivitetskonsentrasjon med tilstrekkelig høy spesifikk aktivitet og fordi man derved kan nå en relativt enkel og rimelig markering.

Den avgjørende mangel ved alle jodmarkerte antistoffer består i at det radioaktive jod in vivo delvis spaltes ut av antistoffet igjen på grunn av dejoderingsprosesser og derved foreligger som jodid i organismen, et jodid som på den ene side lagres i skjoldbrukskjertelen og som på den annen side øker bakgrunnsaktiviteten fordi jod elimineres fra blodet relativt langsomt. Ved anvendelse av jodmarkerte antistoffer må i ethvert tilfelle skjoldbruskkjertelen hos personen som skal undersøkes, blokkeres på forhånd. En viss fordel med jodmarkerte antistoffer viser seg i at deres akkumulering i lever og nyrer til det vanlige undersøkelsestidspunkt er tydelig lavere enn ved tilsvarende, men med andre radionukleider markerte antistoffer.

In-111 anvendes i den senere tid ofte i antistoffmarkeringer. Som metallisk element lar indium seg i motsetning til jod ikke uten videre binde til proteiner. Det kreves her bifunksjonelle chelatdannere som på den ene side kan inngå en kovalent binding med proteinet og som på den annen side via en sterk kompleksdannende gruppe kan binde det som kation foreliggende indium til antistoffet. Det til nu hyppigst benyttede kompleks er dietylentriaminpentaeddiksyre (DTPA). DTPA omsettes som bicyklisk anhydrid med antistoffet. Derved inngår det i første rekke en kovalent amidbinding med endeplasserte aminogrupper av proteinet, mens dets gjenværende syrefunksjon derefter frigjøres ved reaksjon med vann. Det således derivatiserte antistoff kan nu fast binde radionukleidet som tilsettes som In-lll-citrat. Indiumet må anvendes som labil kompleksforbindelse da det ellers ville falle ut ved nødvendig pH-verdi. Det bicykliske anhydrid av DTPA er intet ideelt reagens, da det på grunn av sin bifunksjonalitet kan inngå inter- og intra-molekylare koblingsreaksjoner.

Mens gallium ikke har noen fordeler sammenlignet i indium, tilstrebes det en technetium-99m-markering av potensielle diagnostika, da Tc-99m på grunn av sine gunstige fysikalske egenskaper (mangel på korpuskular strål ing, "y-energi på 140 keV og halveringstid på 6 timer), og den dermed forbundne lille strålebelastning, er blitt til det viktigste radio-nukleid i den nuklearmedisinske diagnostikk.

Technetium-99m som lar seg utvinne ved hjelp av nukleid-generatorer, foreligger i første rekke som pertechnetat, som i denne form for eksempel er egnet for skjoldbruskkjertel- og hjernescintigrafi. Scintigrafien av andre organer ved hjelp av technetium 99m lykkes ved hjelp av bestemte "transport-stoffer" som på den ene side er istand til å binde technetium, og på den annen side anrike radionukleidet i det målrettede organ med høy selektivitet. For dette forhold er det hittil overveiende blitt anvendt stoffer som er direkte markerbare med technetium 99m, og har en høy organspesifitet. Det finnes imidlertid også en rekke stoffer som riktignok har høy organspesifitet men som ikke er direkte markerbare. Dette kan være proteiner (fibrinogen, humanserum og albumin), enzymer (streptokinase, laktatdehydrdogenase ), sukker (dextran, glukose) eller også polymerer. Til disse hører også lavmolekylære stoffer som fettsyrer, som ved hjertets høye energibehov anriker seg i myokardvevet.

Til markering av det organspesifike "transportstoff" med technetium 99m overføres først det fra nukleidgenereatoren eluerte pertechnetat til et lavere oksydasjonstrinn. I denne reduserte form danner technetium mer eller mindre stabile forbindelser med det organspesifike stoff. For benscinti-grafi anvendes for eksempel Tc-99m fosforsyrederivater, fremfor alt av organiske fosfonsyrer. Således foreligger den i EP-PS 2485 omtalte markeringsenhet, natriumsaltet av 3,3-difosfono-1,2-propandikarboksylsyre som organspesifik "transportstoff". I EP-PS 108.253 omtales Tc-99m tri- og tetrafosfonsyrer for scintigrafisk illustrasjon av RES, spesielt i leveren. Tc-99m-komplekset med dietylentriaminpentaeddiksyre (DTPA) finner anvendelse ved diagnostikk av nyresykdommer og patologiske hjerneprosesser. Da en direkte markering av for eksempel antistoffer med technetium ikke er mulig, har man, på samme måte som ved indium-marker ingen, ved hjelp av bifunksjonelle kompieksdannere forsøkt å oppnå en stabil technetiummarkering av antistoffet. Det spesielle problem ved markering med technetium består i at tinn-(II)-ionene normalt er tilstede i reaksjonsoppløsningen. Tinn-(II) er hittil det eneste reduksjonsmiddel som muliggjør en hurtig og kvantitativ overføring av pertechnetatet ved romtemperatur til et lavere og derved reaksjonsdyktig oksydasjonstrinn. De ved siden av det reduserte technetium foreliggende tinn-(II)- og -(IV)-ioner konkurrerer om bindingssetene på det til antistoffet koblede kompleks, slik at kompleksdanneren enten må anvendes i overskudd, hvorved de spesifikke egenskaper hos antistoffet kan påvirkes, eller ubundet technetium og tinn fører til uønsket radioaktivitets-akkumulering i andre organer som felles kolloid.

I US-PS 4.479.930 anføres de cykliske anhydrider av DTPA og EDTA som et chelateringsmiddel, ikke bare for In-111 og Ga-67, men også for Tc-99m. I EP-PS 35765 nevnes anvendelsen av deferoksamin som kompleksdannelsesmidlet for technetium 99m til proteiner. I W0 85/3063 omsettes de partielt reduserte disulfidbroer i antistoffet med natriumsaltet av tetraklor-nitridotechnetat som på forhånd må fremstilles ved reaksjon av tertechnetat med natriumazid. I EP-søknad 194853 benytter man likeledes de ved reduksjon av antistoff-fragmentene frem-bragte frie tiolgrupper til binding av et chelatkompleks som er en vanskelig syntetiserbar [(7-maleimidoheptyl)imino-bis(etylennitrilo)]tetraeddiksyre. Koblingen av komplekset til antistoffet foregår via reaksjonen mellom SH-grupper og dobbeltbindingen i maleinimiddelen av kompleksforbindelsen, mens det radioaktive metallion komplekseres over nitrilo-eddiksyreresten.

Enklere metoder for Tc-99m-markering av antistoff eller antistoff-fragmenter er omtalt i EP-PS 5638, og US-PS 4.478.815. Her benyttes tinn-(II)-salter i overskudd for samtidig reduktiv spaltning av disulfidbroer og for reduksjon av tilsatt Tc-99m-pertechnetat. Vanligvis trenger man lengre inkubasjonstider (24 timer), for spaltning av -S-S-bindingen, idet F(abl^-fragmenter partielt spaltes til F(ab')2~ fragmenter. Nyere litteraturangivelser (for eksempel "Journal of Nuclear Medicine" 27 (1986), side 685-93 og 1315-20, samt "International Journal of Nuclear Medicine Biology" 12(1985) side 3-8), viser at forholdet av de to fragmenter er avhengig av "betinningsreaksjon" og at forholdet av de to komponenter efter Tc-99m-markeringen ikke mere endrer seg nevneverdig, idet hovedkomponenten er Tc-99m-markert F(ab'). I alle tilfeller må det markerte F(ab')-fragment efterrenses da det på tross av minst 30 minutters reaksjonstid ikke ble oppnådd noen kvantitativ omsetning av pertechnetatet.

Det var ved de ovenfor nevnte markeringsfremgangsmåter tidligere ikke mulig å fremstille preparater som kunne anvendes rutinemessig uten omstendelige fremgangsmåtetrinn.

Foreliggende oppfinnelse tar sikte på å forbedre den kjente teknikk og angår således et diagnostisk hjelpemiddel som karakteriseres ved at det er fremstilt ved oppløsning av en organospesifikk substans valgt blant et antistoff, et F(ab')2~anti stoff-fragment, et protein, et enzym, sukker eller en for diagnostiske forhold egnet polymer, som eventuelt er forbehandlet eller koblet til et kompleksdannende middel for technetium-99m, og efterfølgende tilsetning av en technetium-99m-pertechnetat-oppløsning og derefter å tilveiebringe reduksjon og binding av technetium til den organospesifikke substans ved tilsetning av tinn-(II)-fosfonat eller tinn-(II)-pyrofosfat som kompleksstabilisert reduksjonsmiddel.

På denne måte kan slike organspesifikke stoffer ("bærere") markeres med technetium-99m som i sitt molekyl minst har en funksjonell gruppe med komplekserende egenskaper. For det meste dreier det seg ved slike grupper om atomer eller ioner med elektronpar-donor-funksjon (Lewis-baser). En slik funksjonell gruppe med komplekserende egenskaper er for eksempel en SCH-, NH2-, NHR-, NR2-, C00-, 0H-, S-, SH- eller

-NO-gruppe.

Som representanter for slike stoffer med funksjonelle komplekserende grupper, skal for eksempel nevnes: proteiner (-NH-, -NH2- eller COO-grupper), enzymer (-NH2-, -0H-, -P=0-grupper), sukkere (-OH-grupper) eller polymerer som har sidekjeder med tilsvarende funksjonelle grupper.

Har forbindelsen som skal markeres ikke en slik funksjonell gruppe, så må stoffet før markeringen "forbehandles" eller kobles til en egnet kompleksdanner.

Med "forbehandles" menes innen oppfinnelsens ramme slike forholdsregler som fører til at en funksjonell gruppe med kompleksdannede egenskaper oppstår i molekylet som skal markeres. For eksempel inneholder antistoff disulfid-broer. De begge kovalent med hverandre sammenknyttede svovelatomer er imidlertid i denne form ikke istand til å kompleksbinde technetium 99m. Reduserer man imidlertid disulfid-broen, så oppstår to SH-grupper som nu på sin side er utmerkede kompleksligander for technetium 99m- og også binder dette i gode utbytter.

En annen mulighet for å binde technetium 99m til organspesifikke stoffer som ikke har funksjonelle grupper med komplekserende egenskaper består i å bygge inn en slik funksjonell gruppe i molekylet eller kjemisk å binde et komplekserings-reagens til molekylet.

Et vesentlig punkt ved oppfinnelsen ligger i at stoffet som skal markeres ikke kommer i direkte kontakt med reduksjons-midlet, fortrinnsvis et tinn-(11 )-salt. I første rekke blandes tinn-(II )-saltet separat med en egnet reaksjons-partner idet det dannes et kompleksstabilisert reduksjonsmiddel. Reaksjonspartneren kan være en fosforforbindelse som et fosfonat eller et pyrofosfat, en generelt god kompleksdanner som etylendiamintetraeddiksyre eller et annet reagens, som reagerer med tinn-(II) således at det holder tinn-(II) i oppløsning ved en fysiologisk pH-verdi (6-8) og således gir reduksjonsmidler i funksjonsdyktig tilstand (kompleksstabilisert reduksjonsmiddel).

Spesielt interessant synes fremgangsmåten for technetium 99m-markering av antistoffer å være. En partiell reduksjon av S-S-bindingen av antistoffet eller et F(ab' )2~antistoff-fragment lar seg oppnå ved romtemperatur ved korttidig innvirkning av milde reduksjonsmidler (forbehandling av det organiske stoff). Spesielt egnede reduksjonsmidler er monotioler som 2-merkaptoetanol eller 2-merkaptoetylamin (cysteamin). Derved får man reaksjonsdyktige antistoff-molekyler som hverken har tapt sin immunologiske reaktivitet eller er blitt fragmentert til mindre bruddstykker. Prinsip-pielt er, for den partielle reaksjon av antistoffer eller av F(ab')-antistoff-fragment, alle reduksjonsmidler egnet som også ved lengre innvirkningstid bare spalter en del av S-S-bindingene og fører til en fragmentering av antistoffkomponenten. Innvirkningstiden av et slikt reduksjonsmiddel på antistoffkomponenten behøver ikke å overstige 1 time. Vanligvis er det allerede efter 10-30 minutter dannet så mange SH-grupper at det bindes tilstrekkelige mengder av technetium 99m kationer. Derefter separeres det overskytende reduksjonsmiddel og det partielt reduserte antistoff oppdeles i en bufret oppløsning (for eksempel 0,02 M fosfat-oppløsning på 7,2) og lyofiliseres omgående. Derved må en reoksydasjon av de frie tiolgrupper i antistoff-form på grunn av luft-oksygen forhindres. Det lyofiliserte antistoff, som foruten buffersaltene ikke inneholder ytterligere tilsetninger og som holdes under nitrogen som beskyttelsesgass,

er uendret holdbare i uker ved kjøleskapstemperatur, (-5 til +5°C). Det oppløser seg igjen uten videre ved tilsetning av isotonisk natriumkloridoppløsning.

De således fremstilte partielt reduserte antistoffkomponenter (forbehandlede organspesifikt stoff) kan nu lett markeres med technetium 99m når man tilsetter en blanding av pertechnetat-

og tinn-(II)-fosfonat eller -pyrofosfat. Spesielt fordel-aktig er det når man som tinn-(II)-fosfonat anvender difosfonater, trifosfonater eller tetrafosfonater. Helt spesielt egnet er tinn-(II)-saltene av metandifosfonsyre, av amino-metandifosfonsyre, av 3,3-difosfonopropionsyre, av 3,3-difosfono-1,2-propandikarboksylsyre eller av propan-1,1,3,3-tetrafosfonsyre. Disse tinnholdige fosfonatkomplekser er allerede omtalt i EP-PS 24 85 og 108 253, og finner allerede anvendelse som technetium-markerings-bestikk for skjelett-

og lever-scintigrafi. Likeledes egnet er tinn-(II)-holdig pyrofosfat, mens tinn-(II)-saltet av dietylentriaminpentaeddiksyre er uegnet.

I en alternativ utførelse av oppfinnelsen karakteriseres det diagnostiske hjelpemiddel ved at det er fremstilt ved først å oppløse en organospesifikk substans valgt blant et antistoff,

et F(ab')2 antistoff-fragment, et protein, et enzym, sukker eller en for diagnostiske forhold egnet polymer, i en oppløsning av tinn-(II)-fosfonat eller tinn-(II)-pyrofosfat og derefter å merke den organospesifikke substans med technetium ved tilsetning av en technetium-99m-pertechnetat-oppløsning.

Oppfinnelsen angår som nevnt innledningsvis også et testkit

som karakteriseres ved at den omfatter to separate, fryse-tørkede komponenter hvorav en inneholder en organspesifikk substans valgt blant et antistoff, et F(ab')2 antistoff-fragment, et protein, et enzym, sukker eller en for diag-

nostiske forhold egnet polymer, og den andre inneholder tinn-(II)-fosfonat eller tinn-(II)-pyrofosfat som reduksjonsmiddel som er nødvendig for reduksjon og binding av technetium til den organspesifike substans.

Til fremstilling av et diagnostikum som inneholder et technetium 99m-markert organspesifikt stoff, sammenstilles hensiktsmessig et analysesett som inneholder to adskilte, fortrinnsvis lyofiliserte komponenter, hvorav en inneholder det organspesifikke stoff respektivt det forbehandlede organspesifikke stoff eller det med en kompleksdanner for det Tc-99m koblede organspesifikke stoff, eventuelt i blanding med en buffer, og det andre ved kompleksstabiliserte reduksjonsmiddel, fortrinnsvis det kompleks-stabiliserte tinn-(II)-salt, som kreves til reduksjon og binding av technetium til det organspesifikke stoff. Spesielt gunstig er analysesett hvor det lyofiliserte eventuelt forbehandlede organspesifikke stoff foreligger i blanding med dinatriumhydrogenfosfat (pH 7,2) som buffer. Man får således, efter kort reaksjonstid for eksempel allerede efter 5 minutter, en omtrent kvantitativ technetium 99m-markering av et stoff som inneholder mindre enn 1$ fritt pertechnetat, og bare meget små mengder av den Tc-99m markerte tinn-(II)-komponent som forurensninger, slik at efterfølgende rensing ikke mere er nødvendig.

Den adskilte avfylling av det organspesifikke stoff og tinn-(II)-komponenten sikrer en uendret holdbarhet for det lyofiliserte preparat. Dermed er det sikret en hurtig, uproblematisk og enkel markering av det organspesifikke stoff. Den for reduksjon av pertechnetatet nødvendige mengde av tinn-(II) er selvsagt liten og i størrelsesorden noen mikrogram. Tinnholdig fosfonat eller pyrofosfat tilsettes, beregnet på tinn-(II), i en mengde av 1 til 100 mikrogram, fortrinnsvis 5 til 10 mikrogram pr. 1 mg av den organspesifikke komponent for å oppnå en stabil markering med technetium 99m.

De ifølge oppfinnelsen anvendbare tinn-(II)-fosfonater eller -pyrofosfater, er spesielt godt egnet for markering av reduserte antistoffer eller reduserte antistoff-fragmenter, fordi de ved den for markeringen nødvendige nøytrale pH-verdi danner et stabilt kompleks som imidlertid bare løst binder reduserte technetiumkationer slik at disse lett kan byttes ut med tiolgruppene i antistoffet eller dettes fragment.

Den i mange markeringssett tilstedeværende stabilisator er også av fordel ved antistoffmarkering, da den garanterer lengre holdbarhet for injeksjonsoppløsningen.

"Ved den i EP-søknad 141.100 omtalte N-(4-aminobenzoyl )-glutaminsyre, som kan anvendes i de for skjelettscintigrafi anvendte difosfonater som stabiliserende komponent, for det seg oppnå en utmerket holdbarhet av det med technetium 99m markerte antistoff.

Det ifølge oppfinnelsen fremstilte technetium 99m-markerte antistoff eller dets F(ab'^-antistoff-fragment, finner fortrinnsvis anvendelse i in vivo påvisning av tumorer. Fortrinnsvis anvender man et monoklonalt antistoff eller dets F(ab')£-fragment som reagerer med tumorassosierte antigener.

Eksempel 1.

20 mg av det mot det carcino-embryonale antigen (CEA) rettede monoklonale antistoff BW 431/31, som finner anvendelse ved diagnostisk påvisning av kolorektale carcinomer, ble ved dialyse ved romtemperatur befridd for tilsetninger av sukrose, og overført i isotonisk natriumkloridoppløsning. Dette antistoff er omtalt i DE-PS 3416774 og av Bosslet et al., "Int.J.of Cancer" 36, 75-84 (1985).

Det derefter i en konsentrasjon på ca. 5 mg/ml foreliggende antistoff ble omsatt med tilsammen 20 mg 2-merkaptoetanol ved romtemperatur (30 minutter) og derefter ved gelfiltrering på Bio-gel P-2, en polyakrylamidgel fra firma Bio Rad, adskilt fra overskytende reaksjonsmiddel. Det i 0,02 M fosfatbuffer (pH 7,2) oppløste antistoff ble derefter omgående separert og lyofilisert. De frysetørkede prøver inneholdt pr. fylling 2 mg av antistoffet og ca. 1,4 mg dinatriumhydrogenfosfat.

For technetium 99m-markering ble prøvene omsatt med 7,5 ml pertechnetatoppløsning med tilsammen inntil 3000 MBq, (ca. 80 mCi). Som tinn-(II)-komponent ble det anvendt en lyofilisert markeringsenhet bestående av 5 mg av natriumsaltet av 3,3-difosfonopropionsyre, 0,1 mg tinn-(II)-kationer og 0,5 mg N-(4-aminobenzoyl)-L-glutaminsyre. Denne blandingen ble oppløst i 5 ml fysiologisk natriumkloridoppløsning og direkte derefter (efter 1 minutt) ble 0,5 ml av denne oppløsningen satt til antistoffoppløsningen slik at det samlede volum utgjorde 8 ml. Efter 10 minutters reaksjonstid ble markeringsutbyttet undersøkt ved tynnsjiktkromatografi, gelfiltrering på Biogel P-10 og høytrykk væskekromatografi på ZorbaxGF 250 fra firma DuPont.

Over 95% av technetium 99m-aktiviteten var proteinbundet, ca. 1$ forelå som fosfonatbundet del, mens mindre enn 1% var pertechnetat. Pertechnetatdelen øker først ved lengre henstand igjen, efter 6 timer lå den ved rundt 2%, mens fosfonatbundet del uforandret lå ved 1%.

Bestemmelsen av den immunreaktive del i forskjellige technetium 99m-markerte antistoffer, ga ved måling av bindingen til tumorceller godt . overensstemmende verdier for immunreaktiviteten med tilsvarende, med jod 133 og indium 111 markerte CEA-antistoffer (tabell 1).

Tabell 1:

Sammenligning av immunreaktiviteten (%) av monoklonale antistoffer som ble markert med radionukleoidene J-131, In-111 og Tc-99m.

Det i tabellen nevnte monoklonale antistoff BW 431/26, er kjent fra DE-OS 34 16 774 og betegnes der som MAK VIII. Det monoklonale antistoff BW 494/32 er omtalt i DE-PS P 35 31 301.3.

Eksempel 2 (sammenligningseksempel).

Det monoklonale antistoff BW 431/31 ble behandlet på samme måte som i eksempel 1, imidlertid ikke omsatt med 2-merkapto-metanol. Antistoffet som derfor ikke inneholdt frie tiolgrupper ga da ved reaksjonene med pertechnetat, i nærvær av en tilsvarende mengde tinndifosfonat, gjennomført som i eksempel 1, et produkt der bare ca. 196 av det foreliggende technetium 99m var protein-bundet, mens den største del (mer enn 50$) forelå som technetium 99m-difosfonat, og det ved siden av redusert ubundet technetium (31$) også var tilstede en betraktelig del av fritt pertechnetat (15$).

Eksempel 3.

For technetium 99m-markering av et mot en pancreascarsinom-assosiert mucus-antigen rettet monoklonalat antistoff BW 494/32 ble 20 ml av dette stoff oppløst i 2 ml isotonlsk natriumkloridoppløsning, inkubert med 0,5 ml av en 1% vandig cysteamin-hydroklorid-oppløsning i 20 minutter ved romtemperatur. i Det søylekromatografisk rensede, modifiserte antistoff oppløst i 0,02 M Na2HP04 bufferoppløsning, ble lyofilisert i porsjoner på hver 2 mg. Som tinn-(II)-komponent for technetium-markering av antistoffet, ble det benyttet et pyrofosfat- markeringssett som inneholddt 7,2 mg Na4P207 og 1,03 mg tinn-(II )-klorid pr. sett. Innholdet av en fylling ble oppløst i 10 ml fysiologisk natriumklorid, og 0,25 ml tilsvarende ca. jjg Sn<2+> ble satt til denne oppløsning av antistoffet som på forhånd var blitt oppløst i ca. 8 ml pertechnetat oppløsning (ca. 200 MBq). Efter 10 minutters reaksjonstid ble 0,1 ml av oppløsningen med følgende sammensetning

25 pg mab

2,25 >jg Na2P207

0,175 pg tinn-(II)

og ca.18 pg Na2EP04-buffer,

applisert i.v. på sunne rotter. Organfordelingen 24 timer post injeksjonem (p.i.) er vist i tabell 2. Derav fremgår at akkumuleringen i knokler, skjoldbruskkjertel og mage er meget liten, og i de øvre organer er sammenlignbar med det med jod 131 markerte antistoff. For immunreaktiviteten (sammenlign tabell 1) ble det ved technetium-99m-markerte antistoffer BW 494/32 målt en høyere verdi enn ved markering med jod 131 eller indium 111.

Eksempel 4.

Av likeledes mot CEA rettede monoklonale antistoffer BW 431/26 ble 50 mg redusert partielt ved behandling med 2-merkaptoetanol, renset og lyofilisert i 2 mg avfyllinger i nærvær av fosfatbuffer (pH 7,2).

Tc-99m markeringen ble gjennomført ved hjelp av en ellers for leverscintigrafi benyttet markeringsenhet bestående av 13,5 mg 1,1,3,3-propantetrafosfonsyretetranatriumsalt og 0,6 mg tinn-( II )-klorid x 2E2O. Av det i 10 ml isotonisk NaCl oppløsning oppløste innhold av en markeringsenhet, ble 0,5 ml tilsvarende 15 jjg Sn<2+> satt til det lyofiliserte antistoff. Derefter ble pertechnetat-oppløsningen (3000 MBq) satt til den klare antistoff-Sn-(II )-salt-oppløsning og det Tc-99m-markerte antistoff applisert iv i nakne mus med en implantert human koloncarcinom. Scintigrafisk var tumoren godt synlig allerede 24 timer p.i. Tabell 3 viser ved hjelp av tumor-akkumulering organfordeling av dette antistoff i nakne mus, at de med J 131, In-111 og Tc-99m markerte preparater er sammenlignbare.

Eksempel 5.

20 mg av F(ab'^-fragment av det monoklonaleantistoff 431/31 ble ved 4°C inkubert 15 minutter med 1 ml av 1% cysteamin hydrokloridoppløsning. Det for overskytende reduksjonsmiddel befridde antistoff-fragment ble lyofilisert sammen med fosfatbuffer. For markering av technetium ble det anvendt en markeringsenhet beståendeav 13,0 mg 3,3-difosfono-l,2-propan dikarboksylsyre tetranatriumsalt, 0,23 mg tinn-(II)-oksyd og 1,0 mg N-(4-aminobenzoyl)-L-glutaminsyre-mononatriumsalt, hvorav det ble anvendt 1/20 i 0,5 ml fysiologisk koksalt-oppløsning. Det med en spesifikk aktivitet på 1000 MBq/mg markerte antistoff-fragment inneholdt praktisk talt ikke pertechnetat, imidlertid en litt høyere (ca. 3$) del av Tc-99m difosfonat. Immunreaktiviteten lå ved 60$.

Eksempel 6.

Tc-99m-markering av et protein.

250 mg IgG ble oppløst i en konsentrasjon på 10 mg/ml i isotonisk natriumkloridoppløsning. Denne oppløsning ble efter tilsetning av 0,5 - 1 ml 2-merkaptoetanol inkubert ca. 30 minutter ved 4-25 °C. Derefter ble det reduserte immuno-globulin renset ved gelfiltrering over en polyakrylamidgel-søyle (Bio-Gel P-2 fra Fa. Bio Rad), idet det ble levert med 0,02 M dinatriumhydrogenfosfatoppløsning (pH 7,2). Den separerte rene fraksjon av IgG ble ved fortynning med den samme fosfatbuffer innstilt til en konsentrasjon på 4 mg IgG/ml (ca. 3 mg Na2HP04/ml), og 0,5 ml av denne oppløsning ble avfylt og lyofilisert.

Til Tc-99m markering av en prøve (2 mg IgG) ble lyofilisatet oppløst i 1 ml av en tinn-(II)-metan difosfonatoppløsning (pH 7), som ble dannet ved oppløsning av en markeringsenhet bestående av

2,6 mg metandifosfonsyre, natriumsalt og

0,4 mg tinn-(II )-klorid,

i 5 ml isotonisk natriumkloridoppløsning. Derefter ble det tilsatt 4-9 ml Tc-99m-pertechnetatoppløsning (ca. 1000 MBq).

Efter en reaksjonstid på 5 minutter fikk man Tc-99m-markert IgG hvori over 9556 av det tilstedeværende technetium forelå proteinbundet, mens mindre enn 1% fosfatbundet del og mindre enn 1% fri pertechnetat var tilstede. Det markerte IgG var stabilt inntil 3 timer efter preparering. Først ved lengre henstand var det igjen påvisbart fritt pertechnetat i oppløsningen.

Eksempel 7.

Tc-99m-markering av 1,4,8,11-tetraazacyklotetradekan (cyclam). 8 mg cyclam ble oppløst i 0,5 ml isotonisk koksaltoppløsning og pH-verdien innstilt til 11 med 0,1 ml n natronlut. Til denne oppløsning ble det satt 1 ml av en tinn-(II)-l,1,3,3-propantetrafosfonat-oppløsning (pH = 6), som var oppnådd ved oppløsning av en markeringsenhet bestående av 2,9 mg 1,1,3,3-propantetrafosfonsyre, natriumsalt og 0,12 mg tinn-(II)-klorid-dihydrat i 5 ml isotonisk natriumkloridoppløsning. Derefter ble det tilsatt ca. 590 MBq Tc-99m-pertechnetat-oppløsning (ca. 0,3 ml), og blandingen hensatt 5 minutter ved romtemperatur. Utbyttet av markert cyclam var større enn 98%, idet det foreligger mindre enn 1% fritt pertechnetat eller fosfonatbundet technetium. Den markerte oppløsning var holdbar i flere timer.

Eksempel 8.

Tc-99m-markering av pyrofosfat.

10 mg pyrofosfoat ble oppløst i 1 ml 0, 9% kokesaltoppløsning og 1 ml av tinn-(11 )-l,1,3,3-propantetrafosfonatoppløsning (se eksemel 7) ble tilsatt. Til oppløsningen ble det satt 1 ml pertechnetatoppløsning (ca. 300 MBq) som ble hensatt 5 minutter ved romtemperatur. Pyrofosfatet var til 50% markert med Tc-99m. Mengden av markert fosfonat lå under 10$.

Claims (9)

1. Diagnostisk hjelpemiddel, karakterisert ved at det er fremstilt ved oppløsning av en organospesifikk substans valgt blant et antistoff, et F(ab')2~ antistoff-fragment, et protein, et enzym, sukker eller en for diagnostiske forhold egnet polymer, som eventuelt er forbehandlet eller koblet til et kompieksdannende middel for technetium-99m, efterfølgende tilsetning av en technetium-99m-pertechnetat-oppløsning og derefter å tilveiebringe reduksjon og binding av technetium til den organospesifikke substans ved tilsetning av tinn-(II )-fosfonat eller tinn-(II)-pyrofosfat som kompleksstabilisert reduksjonsmiddel.

2. Diagnostisk hjelpemiddel, karakterisert ved at det er fremstilt ved først å oppløse en organospesifikk substans valgt blant et antistoff, et F(ab')2 antistoff-fragment, et protein, et enzym, sukker eller en for diagnostiske forhold egnet polymer, i en oppløsning av tinn-(II)-fosfonat eller tinn-(II)-pyrofosfat og derefter å merke den organospesifikke substans med technetium ved tilsetning av en technetium-99m-pertechnetat-oppløsning.

3. Diagnostisk hjelpemiddel ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at det i hvert tilfelle inneholder 1 til 100 mikrogram og fortrinnsvis 5 til 10 mikrogram, beregnet på tinn-(II), i det kompleksstabiliserte reduksjonsmiddel, pr. mg organspesifik substans for å merke den sistnevnte stabilt med technetium-99m.

4 . Diagnostisk hjelpemiddel ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 3, karakterisert ved at det anvendes tinn-(II)-salter av metandifosfonsyre, aminometan-difosfonsyre, 3,3-difosfonopropoinsyre, 3,3-difosfon-1,2-propandikarboksylsyre eller propan-1,1,3,3-tetrafosfonsyre.

5 . Diagnostisk hjelpemiddel ifølge krav 1 og 2, karakterisert ved at det anvendes et monoklonalt antistoff eller dets F(ab'^-fragment.

6. Diagnostisk hjelpemiddel ifølge krav 4, karakterisert ved at det anvendes et antistoff eller dets F(ab' )g-fragment mot tumorassosierte antigener.

7. Test-kit, karakterisert ved at den omfatter to separate, frysetørkede komponenter hvorav en inneholder en organspesifikk substans valgt blant et antistoff, et F(ab')2 antistoff-fragment, et protein, et enzym, sukker eller en for diagnostiske forhold egnet polymer, og den andre inneholder tinn-(II)-fosfonat eller tinn-(II)-pyrofosfat som reduksjonsmiddel som er nødvendig for reduksjon og binding av technetium til den organspesifike substans.

8. Kit ifølge krav 7, karakterisert ved at den organspesifike substans er et partielt redusert antistoff eller dets F(ab')2~fragment.

9. Kit ifølge krav 8, karakterisert ved at den frysetørkede antistoff-komponent blandes med dinatriumhydrogenfosfat som buffersubstans.