PT84976B - Metodo para a producao de antigenios de virus de leucemia felina contendo polipeptideos recombinantes - Google Patents

Description

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Referência a Pedidos Relacionados

Este pedido é uma continuação em parte do pedido de patente dos E.U.A. Ns de Série 868 585, apresentado em 30 de Maio de 1986. Este pedido está também relacionado com um pedido de patente dos E.U.A. , apresentado concorrentemente com este, por Kensil et_, al. e entitulado "Saponin Adjuvante". \

Fundamento do Invento

Campo do Invento 0 presente invento está relacionado com a utilização de antigénios do vírus da Leucemia feli na (FeLV) para induzir num gato anticorpos contra FeLV.

Breve Descrição de Trabalhos Anteriores

Os vírus da leucemia felina (FeLV) sao retrovírus tipo C competentes para a replicação, que estão epidemiológicamente associados á transmissão horizontal de leucemia, anemia aplástica e imuno-supressao aguda (SIDA felina) em gatos. 0 genoma do FeLV consiste num RNA 60-70S de cad eia simples que é constituído por um gene gag codificador das proteínas do núcleo virai, um gene pol co- 4 dificador da transcriptase reversa e um gene env que codifi ca as proteínas do envelope víral gp70 e pl5E.

Os isolados de FeLV podem ser divjl didos nos subgrupos A, B e C com base nos seus padrões de interferência (Sarma et al., Virology 44: 352 - 358 (1971)). FeLV-A encontra-se em todos os isolados enquanto que FeLV-B ocorre em cerca de 40% de todos os isolados. FeLV-C é raro e tal como o FeLV-B encontra-se sempre em combinação com FeLV-A (Jarrett et al., International Journal of Câncer 21: 334 - 337 (1978)). FeLV-C encontra-se em apenas cerca de 1% de todos os gatos com virémia e apenas era gatos com anemia (Onions et al., Nature (London) 296: 156 - 158 (1982)). NUmerosas tentativas para produzir uma vacina contra a leucemia felina falharam. Estas tentatjL vas incluem vacinas contendo vírus morto por irradiaçao, hi droxilamina ou paraformaldeído e vacinas que utilizam vírus inactivado com mitomicina D (Patente U.S. Nos. 3 966 907, 4 034 081 e 4 086 134) ou baseadas na utilização de células vivas totais infectadas e células infectadas inactivadas.

Mais recentemente, tem-se dirigido o interesse para o uso de moléculas de FeLV purificadas (Osterhaus e_t al., , Journal of Immunoloav 135 (1): 591 - 596 (1985)) e no uso de uma preparaçao de F0CMA (Antigênio de Membrana Celular Associado aos Oncornavirus Felinos) (Paten. tes U.S. Nos. 4 331 793 e 4 434 157). Está comercialmente disponível uma vacina que utiliza uma preparaçao de F0CHA (Norden Laboratories, Lincoln, Nebraska). No entanto, um estudo recente sobre a eficácia desta vacina levanta sérias dúvidas quanto á sua capacidade para proteger gatos da doen ça FeLV (Rederson e_t al.. , Felina Practice 15: 7 - 20 (1985). Assim, existe uma necessidade considerável de preparações de antigénios que possam estimular o sistema imune do gato 5 e que induzam anticorpos contra FeLV,

Sumário do Invento 0 presente invento está relacionado com preparações antigénicas e métodos para imunização de um gato para induzir anticorpos que reajam com determinantes epitópicos encontrados no vírus da leucemia felina.

Na execução primária do invento produz-se uma preparaçao antigénica que contem a porção po-lipeptidica da glicoproteína 70 (gp70) do FeLV usando técnjl cas de DNA recombinante. Numa outra execução do invento, pr£ duz-se, usando técnicas de DNA recombinante, numa preparaçao de antigénio que contem uma porção polipeptidica de gp70 do FeLV juntamente com os 40 aminoácidos amino-terminais (designado "rgp70 delta”) ou com toda a sequência de aminoácidos (designado "rgp90”) da proteina pl5 e do invólucro de FeLV subgrupo A. Estes polipeptideos recombinantes, gp70R, gp70R -delta e gp90R e seus análogos, sao daqui em diante colecti^ vamente referidos como proteina(s) contendo gp70. 0 termo proteina contendo gP70 pretende incluir polipeptideos tendo a mesma sequência de aminoácidos da proteina gP70 natural do envólucro, a proteina gp70-delta, a proteina gp90 e seus análogos. 0 termo "análogos” pretende incluir proteínas ou polipeptideos que difiram de gp70, gp70-delta ou gp90 pela adiçao, deleçao ou substituição de um ou mais aminoácidos desde que o referido polipeptídeo apresente substancialmente a actividade biológica da proteína gp7Q. Estas preparações antigénicas podem ser usadas para imunizar um gato de modo a que sejam produzidos anticorpos contra elas. 6

Também estão incluídas neste inven to composiçoes farmacêuticas compreendendo a preparaçao an-tigénica do invento e componentes que aumentam a resposta imune, juntamente com veículos farmacológicamente adequados.

Assim, o invento compreende um po-lipeptídeo substancialmente puro compreendendo a sequência de aminoácidos da proteína contendo gp70 do virus da leucemia felina, veículos de expressão compreendendo uma sequência de DNA codificadora da referida proteína contendo gp70, transformados com o referido veículo de expressão, métodos para a produção da proteína contendo gp70 em procariotas e métodos para induzir a produção de anticorpos num gato contra FeLV compreendendo a imunização do referido gato com uma composição farmacêutica compreendendo a proteína conteji do gp-70 recombinante de FeLV.

Breve Descrição das Figuras

Figura 1 descreve a construção da sonda pFU3 usada para detectar a presença de sequências de DNA de FeLV. Os sitios das endonucleases de restrição estão localizados no DNA conforme apresentado. R: Eco RI; P: Pst I; T: Ta_g_ I.

Figura 2 mostra o mapa de restrição para 32-50 clonado. Os sitios das endonucleases de restrição estão localizados no DNA conforme apresentado. R: Eco RI; Bg: Bgl II; S: Saç I; H; Hind III; K: K^n I; B: Bam Hl. 7

Figura 3 mostra o mapa de restrição limitado para o gene do envólucro de FeLV subclonado em PUC-9.

Figura 4 mostra a sequência de DMA virai e a correspondente sequência de aminoãcidos de gp70 e pl5E.

Figura 5 mostra a subclonagem do fragmento g 70-pl5E para se obter a expressão dos genes virais gh70 ao produzir-se gp70R.

Figura 6 mostra a sequência de DMA, e correspondente sequência de aminoãcidos de gp70R-delta í presente no vector de expressão pJLBOT e produzida por ele.

Figura 7 mostra a sequência de DMA e correspondente sequência de aminoãcidos de gP70R presente no vector de expressão pJLBOT e produzida por ele.

Figura S mostra a sequência de DNA e correspondente sequência de aminoãcidos de gp90R presente no vector de expressão pJLBOT e produzida por ele.

Figura 9 mostra a purificação de fracçoes de sílica de sapominas Quillaja por HPLC de fase reversa.

Figura 10 mostra os resultados da imunização com gp70R-delta.

Figura 11 mostra os resultados de imunização com gp70R-delta alquilada. 8

Breve Descrição das Execuções Preferidas

Nos seus níveis mais fundamentais, o invento compreende preparações antigénicas derivadas do vírus da leucemia felina e métodos para utilização destas preparações antigénicas para estimular o sistema imune de um gato ê induzir a produção de anticorpos contra FeLV e vi^ tos imunológicamente relacionados.

Os inventores projectaram um método para produção da porção polipeptidica da glicoproteina gp70 de FeLV usando técnicas de DNA recombinante. Isto foi feito por clonagem do gene virai para gp70 num vector plas-mídeo que foi então usado para transformar E_j_ coli.. Quando os genes virais de gp70 sao expressos em E. Coli.. o poli-peptideo produzido nao é glicosilado; portanto, o peso mole^ cular é de aproximadamente 45 Iíd em vez de 70 Kd. Assim, a proteína virai produzida em procariotas a partir dos genes virais codificadores de gp70 é designada "gp70R" ou "rec--gp70". Em adiçao, quando um gene codificador da proteína gp70 do envólucro virai de FeLV também codifica os amino-ácidos 1-40 da proteína pl5 e do envólucro de FeLV, o peso molecular do polipeptideo expresso em E. coli e de 55Kd. A proteína virai produzida em procariotas a partir dos genes virais codificadores de gp70 e os 40 resíduos de aminoáci-dos amino-terminais do polipeptideo pl5e é designada "gp70E -delta" ou "rec-gp70-delta". Em adiçao, o gene codificador da proteína gp70 do envólucro e de toda a proteina pl5e do envólucro de FeLV codifica um polipeptideo que tem um peso molecular de 65-70 Kd e é designado "rgp90", "gp90R" ou "rec-gp90". Estas proteínas recombinantes sao colectivamen-te designadas "proteína recombinante contendo gp70". 9

0 termo '‘vírus iraunológicamente re lecionados" pretende significar os vírus com homologia ge-nómica significativa relativamente do FeLV de modo a que os produtos expressos por estes genes apresentem níveis significativos de reactividade imunológica cruzada. Um exemplo de tais vírus imunológicamente relacionados é o vírus do sarcoma felino (FeSV).

FeSV e um retrovirus alatmente relacionado com FeLV. De facto FeSV pode ser isolado de tumores derivados de gatos infectados com FeLV, Ma pratica, FeSV é um vírus defectivo que pode apenas ser propagado na copre. sença de FeLV como vírus auxiliar. Crê-se que inicialmente o genoma do FeLV se integra no DMA felino. No entanto, durante a transformaçao litica, quando o DNA retroviral é removido do DNA felino, leva com ele alguns genes felinos conhjj eidos como oncogenes. 0 retrovirus resultante, FeSV, é muito semelhante ao FeLV e é idêntico em termos das glicoproteí. nas do envólucro presentes em FeLV. De facto, preparações de FeSV isoladas a partir de gatos infectados também contêm FeLV. 0 termo "hospedeiro" como e usado no presente invento pretende incluir nao só procariotas mas também eucariotas como leveduras e fungos filamentosos assim como células vegetais e animais. 0 termo "procariota" pretende incluir todas as bactérias que possam ser transformadas com o gene virai para a expressão da proteína gp70 do envelope de FeLV. contendo

Os genes virais para a proteína 8P70 podem ser derivados de qualquer subgrupo de \ 10

FeLV. Tudo o que é necessário é que a sequência genética da glicoproteína seja expressa no organismo procariota. Ê preferido o gene virai da proteína contendo gp70 de FeLV subgrupo A. Refere-se especialmente o gene virai para gP70 de FeLV subgrupo A produzido pela linha celular 3281. Esta linha celular pode-se adquirir à American Type Culture Collec tion, Rockville, Maryland e tem o Ns de Acesso CRL 9116.

Pode-se usar uma molécula de DNA recombinante codificadora da proteína virai contendo gp70 para transformar um hospedeiro usando qualquer uma das técnicas vulgarmente usadas pelos familiarizados com a matéria. Prefere-se especialmente a utilização de um plasmídeo contendo a sequência codificadora virai de gp70 para a transformação de procariotas. A proteína recombinante contendo gp70 do invento poderá ter mais ou menos aminoácidos nos seus extremos delimitantes comparado com a sequência de aminoácidos de gp70 nativa. Por exemplo, a sequência de amjL noácidos delimitante poderá incluir todo ou parte do pepti-deo pl5E como é o caso dos polipeptideos gp70R-delta e gp90R. Como alternativa a proteína recombinante do invento poderá, por exemplo, possuir menos dois resíduos de arginina no extremo C, como se mostra na Figura 7. 0 termo "forma substancialmente pii ra" quando aplicado ao polipeptideo do invento significa que o polipeptideo está essencialmente livre de outras proteínas virais com as quais o polipeptideo do invento está normalmente associado na natureza. 0 termo "substancialmente puro" quando aplicado a saponinas significa substancialmente livre 11

de compostos do natural e de eluiçao e veis. normalmente associados a saponina no seu esta-apresentando resposta cromatográfica, perfis actividade biológica constantes e reprodutí- 0 termo "substancialmente puro" nao pretende excluir misturas artificiais ou sintéticas da sapo^ nina com outros compostos.

Os métodos para a preparaçao de ge^ nes fundidos operacionalmente ligados e sua expressão em bactérias sao conhecidos e estão apresentados, por exemplo, na Patente U.S. N2 4 366 246. As construções genéticas e métodos aqui descritos podem ser utilizados para a expressão de gp70 de FeLV em hospedeiros procariéticos. incluir ba positivas, marcescens

Os hospedeiros procariéticos podem ctérias Gram negativas assim como bactérias Gram como sejam coli, S, Tymphimurium, Serratia e Bacillus subtilis.

Em geral, os vectores de expressão contendo sequências promotoras que facilitem a transcrição eficaz do fragmento de gene virai inserido sao usados em ligaçao com o hospedeiro. 0 vector de expressão contem típi. camente uma origem de replicação, promotor(es), termina-dor(es) assim como genes, específicos que sao capazes de proporcionar selecçao, fenotípica em células transformadas. Os hospedeiros transformados podem ser fermentados e cultivados de acordo com meios conhecidos de modo a conseguir-se um crescimento celular óptimo.

Sao exemplos dem ser usados no invento: rec A, trp de promotores lac, tac e pn Iv que ou ou

po- pL 12 do bacteriófago lambda. Em Maniatis et al,, Molecular Clo-nina, Cold Spring Karbor Laboratories, 1982 está apresentada uma lista de plasmídeos que podem usados no invento. 0 invento inclui qualquer hospedei, ro modificado de acordo com os métodos descritos ou modificado por quaisquer outros métodos, normalmente conhecidos das familiarizados com a matéria, como seja, por exemplo, por transferência de material genético usando um fago liso-génico e que originem um procariota expressando o gene de FeLV para proteína contendo gp70.

Os hospedeiros, de preferência pr£ cariotas, transformados com o genoma virai de FeLV para pr_o teína contendo g|>70 sao particularmente úteis para a produção dos polipeptídeos gp70R, gp70R-delta e gp90R que podem ser usados para a imunização de um gato. Conforme aqui foi dito, quando genoma virai para a proteína contendo gp70 é expresso em bactérias nao se dá glicosilaçao. Portanto a gp70 recombinante tem um peso molecular de 45 Kd em vez de 70 Kd como quando o genoma é expresso pelo vírus. A gp70-delta compreende toda a se-quêcia de aminoácidos da proteína gp70 do envólucro virai de FeLV e os 40 resíduos de aminoácidos amino-trminais da proteína do envelope pl5e e FeLV subgrupo A da linha celular 3281. A sequência derivada de pl5-e está situada no extremo carboxílo do polipeptídeo recombinante. 0 peso molecu lar do polipeptídeo gp70R-delta expresso em E. coli é 55 Kd. A proteína virai produzida em procariotas a partir dos genes virais codificadores de gp70 e do polipeptídeo pl5e (gp70R--delta) é mais hidrofóbica do que gp70R devido à natureza hidrofóbica da sequência derivada de pl5e. No entanto em ambas as formas natural (gp70) e recombinante (g'p70R, gp70R -delta e gp90R), a sequência de aminoácidos da porção gp70 13 «

\ da molécula é essencialmente a mesma. Um gato imunizado com proteína gp70 recombinante produzirá anticorpos que se liga rao a epitopos presentes nos polipeptídeos gp70R, gp70I?-del. ta, gp90R e gp70. Deste modo pode ser efectuada a produção comercial de proteínas recombinantes contendo gp70 de FeLV. 0 termo "quantidade imunogénicamen. te eficaz" como é usado no invento, pretende significar uma quantidade de antigénio de FeLV que é necessária para induzir a produção num gato de anticorpos que se ligarao a epitopos de FeLV.

As proteínas recombinantes contendo gp70 do invento sao particularmente úteis na sensibiliza. ttm çao do sistema imune de um gato de modo a que, como resultado dela, sejam produzidos anticorpos reactivos com epitopos presentes em FeLV, Sao preferidas proteínas gp70E e gp-70R-delta derivadas de linhas celulares produtoras de FeLV subgrupo A. Ê especialmente preferida a linha 3281, produtora de FeLV subgrupo A.

As proteínas recombinantes contendo gp70 podem ser administradas parenteralmente por injecçao, infusão rápida, absorção nasofaringica, absorçao dérmica e oralmente. As preparações para administração parenteral incluem soluçoes estéreis aquosas ou nao aquosas, suspensões e emulsões. Sao exemplos de solventes nao aquosos propile-noglicol, óleos vegetais tais como azeite e esteres orgânicos injectãveis como seja oleato de etilo. Podem ser usados veículos para revestimentos oclusivos de modo a aumentar a permeabilidade da pele e aumentar a absorçao de antigénio. As formas de dosagem líquidas para administraçao oral podem de um modo geral compreender uma solução de lipossoma contendo a forma de dosagem liquida. Formas adequadas â suspen. « 14

sao de lipossomas incluem emulsões, suspensões, soluçoes, xaropes e elixiras contendo diluentes inertes vulgarmente usados na especialidade, como seja água purificada. Além dos diluentes inertes, tais composiçoes podem incluir também adjuvantes, agentes molhantes, agentes emulsionantes e sus-pensores e agentes edulcorantes, aromatizantes e perfuman-tes.

Para as preparações antigénicas coii tendo proteínas recombinantes contendo gp70 do invento é também possível incluir um adjuvante. Os adjuvantes sao subs^ tâncias que podem ser usadas para aumentar inespecíficamen-te uma resposta imune especifica. Normalmente, o adjuvante e o antigénio sao misturados antes da apresentaçao ao sistema imune ou apresentados separadamente mas no mesmo local do animal a ser imunizado. Os adjuvantes podem ser livremeii te divididos em vários grupos baseados na sua composição. Estes grupos incluem adjuvantes do tipo óleo (por exemplo, Completo e Incompleto de Freund) sais minerais (por exemplo, A1K(S0^)2» AlNaíSO^^, AINH^(SO^), silica, alum, AIÍOH)^, Ca^íPO^^» caulino e carbono), polinucleotídeos (por exemplo ácidos poli IC e poli AU) e determinadas substâncias naturais (por exemplo, cera D de Hycobacterium tu-berculosis, assim como substâncias encontradas em Corynebac-terium parvurn, Bordetella pertussis e membros do género Bru-cella). Entre as substâncias particularmente úteis como adjuvantes estão misturas brutas de saponinas tais como, por exemplo Quil A (Superfos A/S, Dinamarca) ou suas fracçoes altamente purificadas. 0 termo ,5saponina" como aqui é usado inclui compostos triterpenóides glicosídicos que produzem espuma em solução aquosa, têm actividade hemolitica e possuem actividade deadjuvante imune. 0 invento engloba a 15

saponina per se assim como sais naturais e farmacêuticamente aceitáveis e derivados farmacêuticamente aceitáveis, 0 termo "saponina" também inclui os seus fragmentos biologicamente activos.

As saponinas sáo uma mistura de gli cosídeos triterpénicos extraídos da casca da arvore Quilla-ia saponaria. As saponinas têm sido extensivamente empregues como adjuvantes em vacinas contra a febre afetosa e na amplificação da imunidade protectora conferida por vacinas ex perimentais contra parasitas protozoários tais como o plas-médio Trypanosoma cruzi e também da resposta humoral contra glóbulos vermelhos de carneiro (SRBC). (Bomford, Int. Arch, Allerg, appl. Immunol,, 67: 127 (1982)), Recentemente, adjuvantes saponinas de Quil-A, uma mistura bruta de saponji nas, foram purificados por cromatografia líquida de alta pressão (HPLC). A fracçao purificada foi preparada conforme descrito no pedido de patente dos E.U.A. copendente , entregue concorrentemente com este, por Kensil et al e en-titulado "Adjuvantes Saponinas" aqui incluído como referência. Estas fracçÕes purificadas (saponinas substancialmen-te puras) e suas misturas sao particularmente uteis no presente invento. A forma física do antigénio recom-binante contendo gp70 que é usada para imunizar um gato pode ser agregada ou nao agregada. Os estudos até agora efec-tuados sugerem que a imunização cora a forma agregada de gp-70R em inclusões bacterianas é mais eficaz no melhoramento do efeito deletério de posterior exposição á infecçao virai. No entanto, este resultado não impede a produção de gp70R agregada a partir da forma nao agregada de gp70R por técnicas conhecidas, como seja, por exemplo, tratamento com glu-taraldeído ou outros agentes que façam interligações cruza- das. A gp70R agregada assim derivada poderá então ser usada para fins de produção de uma composição que melhore a infe_ç ção virai, eficaz na indução de uma reacçao imune activa pa, ra proteger contra posterior exposição a FeLV ou vírus inu-mológicamente relacionados.

No entanto, independentemente do animal ser imunizado com gp70R agregada ou nao agregada, am bas as formas de gp70R provocarão a produção de anticorpos contra ela. Assim, é possivel usar estes anticorpos anti--gp70R em diagnóstico por exemplo num "Kit” para detectar a presença de gh70 num animal.

As preparações antigénicas de FeLV do invento podem ser usadas num gato para induzir a produção de anticorpos que se ligarão a determinantes epitópicos de FeLV. Um método particularmente útil para aumentar a produção de anticorpos contra FeLV em gatos é primeiro imunizar um gato com uma preparaçao antigénica de FeLV do invento seguido de uma outra imunização posterior.

Se bem que a idade do gato na altti ra da imunização inicial não seja critica é preferível que o animal tenha pelo menos oito semanas de idade, uma vez que tipicamente os gatos são desmamados aproximadamente às quatro semanas e ao esperar-se até às oito semanas de idade a interferência devida aos anticorpos circulantes da mae t£ rá diminuído.

Uma maneira de determinar quando um gato deve vantajosamente ser imunizado é através da determinação do estado imune do gato relativaraente a gp70. Es, ta avaliaçao pode ser feita usando as proteínas recombinan-tes contendo gp70 do invento num imunoensaio, como seja, por 17

exemplo um ensaio de ELISA, para detectar anticorpos de gato contra gp70R. Ao fazer-se isto é possível determinar quando o título de anticorpos do gato contra gp70R é suficientemente baixo para aumentar a imunização e proteger con tra a infecçao por FeLV e vírus imunologicamente relacionados . stem muitas técnicas diferentes as imunizações quando se usa um oes. Ê possível usar a prepara-ez para aumentar os níveis e gama de imunoglobulinas expres-icamente, se se administrarem erao espaçadas com um ou dois

Exi para estabelecer o horário d regime de múltiplas imunizaç çao do invento mais de uma v diversidade da expressão da sas pelo gato imunizado. Tip múltiplas imunizações elas s meses.

Geralmente a dosagem de proteína recombinante contendo gp70 administrada a um gato variará dependendo de factores tais como idade, estado, sexo e grau da doença, se existir, e de outras variáveis que podem ser ajustadas pelos familiarizados como assunto.

As preparações antigénicas do invento podem ser administradas como dosagens simples ou múltiplas e podem variar entre 10-1000 ug/ml para o antigénio gp70R ou gp70R-delta de FeLV por dose, mais preferencialmeii te 100-700 jug/ml de antigénio gp70R ou gp70R-delta por dose ainda mais preferido 100-300 ^ig/ml de antigénio gp70R ou gp70R-delta por dose. Sao considerados níveis de dosagem semelhantes para proteína recombinante contendo gp70.

Tendo descrito de um modo geral o invento, pode-se conseguir uma compreensão mais completa por referência aos exemplos específicos que se seguem. Es- 18

Λ

tes exemplos sao dados com fins ilustrativos apenas e nao se pretendem como limitantes a menos que seja especificado. EXEMPLO 1

ISOLAMENTO DE UM CLONE GENOHICO PO SUBGRUPO A

Preparou-se DNA genómico de alto peso molecular a partir de células 3281, cortou-se totalmente com a endonuclease Eco RI e isolaram-se os fragmentos de 8-20 Kilobases (Kb) num gradiente de sacarose. Com estes fragmentos preparou-se uma biblioteca em fago lambda usando braços Eco RI Charon 4A. Esta biblioteca foi testada com uma sonda contendo a região U3 do clone genómico do FeLV Gardner-Arnstein subgrupo B conforme descrito por Mullins et_ al_. , Journal of Virology 38; 688-703, 1981. Hibridaçoes com DNA usando esta região da repetição terminal longa (LTR) de FeLV verificou-se serem específicas para sequências de DMA de FeLV transmitido horizontalmente (Casey e_t al. , Proceedings of the National Academy of Sciences, U.S.A. 78 7778 (1981)). Esta sonda U3 exógena nao dá hibridaçao cruzada com sequências endógenas de FeLV encontradas em DNA de células de gato não infectadas. A construção da sonda U3 está esquematizada na Figura 1.

Resumidamente, construiu-se o pias. mídeo pFGB por subclonagem de um fragmento Eco RI de 9,1 Kb do clone genómico lambda-HF60 contendo DNA de FeLV (Mullins et al., supra) em pBR322. Este plasmídeo contem 4 sítios Κρη I, dois nas regiões internas do genoma virai e uma na região de cada repetição terminal longa (LTR). A digestão m \ LΎ

19 de pFGB com Κρη I seguido de religaçao resulta num clone (pFLTR) contendo sequências delimitantes celulares e uma LTR, mas sem outras sequências virais. Em seguida, pFLTR foi digerido com endonuclease Tag I e isolado um fragmento de 550 pb. Este fragmento foi então subclonado no sitio de restrição Cia I do pBR 322. Este clone, pFU3, foi sujeito a "nick-translation" directa e usado como a sonda de hibri-daçao.

Fez-se a selecçao de fagos recombi nantes com base em hibridaçao de DNA com a sonda pFU3 torna, da radioactiva por "nick-translation". Deste modo, selecci£ naram-se e isolaram-se 42 fagos recombinantes e preparou-se o seu DNA. Digeriram-se estes clones genómicos com enzimas de restrição e analizaram-se por hibridaçao Southern usando a sonda pFU3, urna sonda do envólucro de FeLV (pFGB-env) do clone molecular Garnder-Arnstein e uma sonda adicional (pFGB) contendo todo o genoma de FeLV Garnder-Arnsteia. Com base nesta análise identificaram-se 28 clones distintos. Destes 28 clones encontraram-se 24 defectivos devido a uma deleçao importante nas regiões dos genes gag/pol. Os quatro clones restantes nao possuíam esta deleçao e pareciam ter o tamanho completo.

Escolheu-se para posterior análise um clone de tamanho completo (32-50) cujo mapa de restrição está apresentado na Figura 2. Um fragmento Pst I de 2,0 Kb contendo o gene do envólucro de FeLV foi subclonado em pUC--9 e determinado um mapa de restrição limitado (Figura 3). Vários fragmentos foram ainda subclonados em M13 e determinadas as sequências de DNA (também apresentadas na Figura 4). 20 EXEMPLO 2

EXPRESSÃO EM E. COLI de gp70 e gp70-DELTA de FeLV

Existem dois sitios de restrição Bal I no gene do envólucro do clone genómico 32-50 de FeLV subgrupo A. Um destes sítios está situado no nucleotideo 161 (Figura 4), o qual está muito perto da junção entre a sequência condutora e a sequência codificadora do extremo amino de gp70 nativa. 0 outro sítio de restrição está apro-ximadamente 120 nucleotídeos para lá da junção gp70/pl5E. Isolou-se o fragmento Bal I, adicionaram-se adaptadores Bam Hl e o fragmento modificado foi clonado no sítio Bam Hl de pUC-9 (penv-1) como se mostra na Figura 5. Este fragmento Bam III foi também subclonado no vector de expressão baseado em PL,, pJLBOT, o subclone resultante foi designado R16-38 é induzida a expressão proteica. Esta proteína de 55 Kd designada "gp70R-delta" é também conhecida por "rec--gp70-delta'! ou nrgp70-delta". Na Figura 6 estão apresentadas a sequência de DNA completa e a correspondente sequência de aminoácidos. E, coli estirpe R16-38, contendo a sequência genémica virai para gp70-delta no plasmideo pJLBOT foi depositada em 22 Maio, 1987, na American Type Culture Collection, Rockville, Maryland e dado o Ns de Aces_ so 67411. A construção do plasmideo de expre_s sao pJLBOT foi obtida por modificação do plasmideo PJLA16. A construção do plasmideo pJLAlô está descrita em Lautenbejr ger e_t a_l. , Gene Anal. Tech. 1_: 63-66 (1984). 0 plasmideo pJLAlô contem o promotor Pj do bacteriofago lambda (P^) e a sequência de Shine-Dalgarno e a sequência condutora do gene Cjj do bacteriófago lambda. Inicialmente preparou-se o pias. mideo de expressão pJLBO por digestão de pJLA16 com a endo-nuclease de restrição Nru I. Após digestão ligou-se um adajj tador Bam Hl ao plasmideo cortado. Este processo coloca um sítio de restrição Bam Hl no extremo do condutor bacteriano Cjj na grelha de leitura para traduçao adequada a expressão de gp70R. Em seguida, um oligonucleotideo sintético, contendo terminadores da traduçao nas três grelhas de leitura foi clonado no plasmideo pBR322 que foi então inserido em pJLBO atrás do sítio de clonagem Bam Hl. 0 plasmideo resultante foi designado pJLBOT, de ext rat os d um ant i-s or 0 estar pre se nt Kd. Es ta pi ot ami noá cid os d A análise de transferências Western e proteína total das culturas induzidas usando de coelho de título alto contra gp70 indicou e uma proteína de FeLV de aproximadamente 55 eína contem práticamente todos a gp70 e os e pl5E.

Para se obter clones que produzam sequências gp70 sem as derivadas de pl5E, penv-1 foi primei, ro linearizado com Eco RI. Removeu-se aproximadamente 100 pb de cada extremo com a exonuclease Bal 31, adicionaram-se adaptadores Bgl II e recircularizaram-se os fragmentos de DNA com DNA ligase. Seleccionaran-se clones recombinantes e determinou-se o grau de digestão com nucleases e a posição dos adaptadores Bgl II dentro do gene do envelope 32-50 de FeLV por sequenciaçao do DNA usando o método didesoxi Ml3/ /Sanger e um "Kit" comercial (Amersham), Encontrou-se que o clone pUC-Rló-12 possuia as sequências de FeLV que termi- nam dentro de cinco nucleotideos codificadora de gp70. A situaçao de extremo 3' da região deste extremo 3' está aprçj sentado na Figura 4. 22 %

Λ

Ο fragmento Bam HI/Bgl II de pUC--R6-12 foi isolado e subclonado no vector de expressão pL pLJBOT, Quando da indução produziu-se uma proteína de apro-ximadamente 45 Kd que reagiu com o anti-soro contra gp70. A sequência de aminoácidos completa desta proteína está apresentada na Figura 7. 0 clone resultante foi designado R16—12. E. coli estirpe R16-12, contendo a sequência genómica virai para gp70 no plasmídeo pJLBOT foi depositado em 22 de Maio, 1986, na American Type Culture Collection, Rockville, Maryland e dado o N9 de Acesso 67119. EXEMPLO 3

EXPRESSÃO DE GP90 DE FeLV EM E. COLI

Construiu-se um clone de DNA re-combinante expressando gp90 de FeLV partindo do plasmídeo FEA-3281. Construiu-se FEA-3281 por subclonagem do fragmento Pst I de 2 Kb do clone genómico 32-50 em PUC-9 e contem as sequências codificadoras do gene do envelope de FeLV. Ma Figura 3 está apresentado um mapa de restrição de FEA-3281 a sequência da porção derivada de FeLV do plasmídeo esta apresentada na Figura 4. FEA-3281 foi também usado como material de partida para a obtenção de plasmideos que expressem gp70R e gp70R-delta. foi cortado com Hind III de DNA de 3,3 e 5,5 Kb. e recircularizado usando FEA-3281 para dar origem a dois fragmentos 0 fragmento de 3,3 Kb foi isolado 23 23

% DNA ligase de T4. 0 plasmideo resultante foi designado FEA--env-5'. FEA-env-5* foi cortado com Bal I. Adicionaram-se adaptadores Bam Kl e recircularizou-se o pias. mideo. Este plasmideo foi designado FEA-env-5*-BH. FEA-env-5*-BH foi cortado com Hind III e o fragmento Hind III de 1,5 Kb obtido a partir de FEA-3281 foi subclonado neste sítio na orientação original. Este plasmideo foi designado ENV-Lt.

Cortou-se ENV-L- com Pst I e digeriu-se rapidamente com a exonuclease Bal 31. Adicionaram-se adaptadores Bgl II e recircularizou-se o plasmideo. 0 plasmideo resultante foi designado PUC-gp9G. A situaçao do sítio Bgl II no gene do envólucro de FeLV foi determinada por se-quênciaçao de DNA.

Isolou-se o fragmento Bam Iíl/Bgl II de 2,0 Kb a partir de pUC-gp90 e subclonou-se no sítio Bam Hl de pLCBCOO. pLCBCOO e idêntico a pJLBOT com excepçao de pLCBCOO possuir um sítio de restrição Pvu II entre as sequências de DNA derivadas de pL do bacteriófago lambda e CII de bacteriófago. Este plasmideo foi designado pCBCOO gp90. A expressão foi induzida de um modo idêntico ao de a» gp70R e gp70R-delta. Quando da indução foi produzida uma proteína de 65-70 Kd reactiva com anti-soro de coelho anti--gp70. Esta proteína foi designada gp90R. Na Figura 8 está apresentada a sequência completa de DNA codificador de gp90R e a correspondente sequência de aminoácidos. E_. coli estirpe R16-12, contendo a 24

Λ sequência genómica virai para gp90 no plasmideo pLCBCOO, £oi depositada era 28 de Maio, 1987 na American Type Culture Collection, Rockville, Maryland e dado o Ns de Acesso 67412. EXEMPLO 4

PURIFICAÇÃO DE gp70 RECOMBIKANTE DE FeLV 0 clone R16-12 de E. coli recombi-nante foi crescido em meio LB suplementado com 1% de glucose e 0,1% de casaminoácidos a 32°C até uma densidade óptica (560 nm) de 0,4-0,6, A cultura foi então transferida para 42°C e incubada durante raais 2 horas. Ao fira deste tempo as células foram colhidas por centrifugação a 4000 g durante 30 minutos, lavadas com 50 mM tris-HCl, pH 7,5, contendo 5o mM EDTA e 50 mM NaCl e lisadas por digestão enzimática com lisozima (5 mg/g de células) em 25 mM tris HC1, pK 7,5, con tendo 0,5% de triton x -100. 0 lisado celular foi então fraccionado por sedimentação durante 30 minutos a 30 000 g. 0 sedimento celular foi ressuspenso em 50 mM tris KC1, pH 7,5, contendo 50 mM MgC^ e Mase I (0,1 mg/g de células). Após incubaçao à temperatura ambiente durante 30 minutos com agitaçao ocasional a suspensão foi centrifugada a 6 000 g durante 30 minutos e o sedimento lavado duas vezes com 25 mM tris HC1, pH 7,5, contendo 0,5 M NaCl, 0,5% de triton X-100, 25 mM EDTA e 1% beta-mercaptoetanol. Este tratamento foi seguido de duas lavagens com 4 M ureia em 25 mM Tris KC1, pH 7,5, contendo 0,5 M NaCl e 25 mM EDTA. 0 sedimento resultante deste processo continha mais de 90% da proteína recombinante expressa em JU coli R16-12. A analise por ele_ç troforese em gel mostrou qua a proteína gp70R parcialmente 25

purificada e presente nos corpos de inclusão bacterianos es, tá na forma agregada. Este material é composto por 60-80% de proteína gp70R com o restante material presente como pro. teínas bacterianas. Este material foi designado Preparaçao I.

Uma segunda preparaçao de gp70R (Preparaçao II) foi desenvolvida a partir da Preparaçao I. 0 sedimento de proteína recombinante da Preparaçao I foi solubilizado por ressuspensão do sedimento lavado em 50 mM Tris HC1, pH 9,0 na presença de 6 M ureia e 1% beta-mercap-toetanol. A suspensão foi clarificada por centrifugação a 10^ g durante 30 minutos.

Para purificar a Preparaçao II de gp70R, o sobrenadante da centrifugação foi aplicado a uma coluna de Sepharose CL-4B equilibrada com 50 mM tris HC1, pH 9,0, contendo 6 H ureia e 1 mM beta-mercaptoetanol. A coluna foi eluida com o mesmo tampao à temperatura ambiente. Colheram-se fracçoes que se examinaram por electroforese em gel com SDS relativamente a presença de gp70R. As fracçoes contendo o antigénio foram reunidas e dializadas contra uma série de tampões a 4°C: primeiro, 10 volumes de 50 mM Tris HC1, pH 7,7, contendo 4 M ureia; segundo 10 volumes de tampao contendo 2 M ureia; terceiro, 10 volumes de tampao contendo 1 M ureia; quarto, 100 volumes de tampao sem ureia. Após diálise completa cerca de 50% da gp70R permaneceu solúvel em 50 mM Tris HC1, pH 7,5. Ao contrário de gp70R na Preparaçao I, a gp70R da Preparaçao II nao existe na forma agregada. A forrna agregada de gp70R presente na Preparação I assim como a gp70R solúvel nao agregada da Preparaçao II foram usadas em gatos para produzir anticor- 26

pos contra FeLV, EXEMPLO 5

PURIFICAÇÃO DE GP70R-DELTA RECOKBINAMTE DE FeLV

Preparaçao de corpos de inclusão 0 clone R16-38 de E. coli recombi-nante foi cultivado em meio LB suplementado com 1% de glucose e 0,1% de casaminoácidos a 32°C até uma densidade ópti^ ca (560 nm) de 0,4-0,6. A cultura foi então transferida para 42°C e incubada durante mais 2 horas. Ao fim deste tempo colheram-se as células por centrifugação a 4000 g durante 30 minutos, lavaram-se com 50 mM Tris HC1, prl 7,5 e finalmente ressuspenderam-se em 200 ml de 50 mM Tris KC1 ao qual se adicionou 1 ml de 0,1 M fenilmetilsulfonilfluororeto em isopropanol (concentração final = 0,5 mM) e 0,4 ml de 5 mg/ /ml de aprotimina (concentração final = 10,0 pg/ml). As células foram lisadas por digestão enzimática com lisozima (concentração final «= 0,5 mg/ml) na presença de 0,2% de Triton X-100. Após agitaçao durante 30 minutos, adicionaram -se 2 ml de MgClj (0,5 M), 5 ml de DNase I (1 mg/ml) e 1 ml de 0,1 M fenilmetilsulfonilfluoreto. Após agitaçao durante mais 30 minutos, adicionaram-se mais 40 ml de EBTA (0,25 M, pH 7,5) e 4 ml de Triton X-100 (10% p/v). A preparaçao foi centrifugada a 10000 X g durante 30 minutos e 4°C e o sedimento ressuspenso em 50 ml de 50 mM Tris HC1, pH 7,5. 0 sedimento foi homogeneizado a baixa velocidade durante 15 segundos. Adicionou-se lisozima para uma concentração de 0,5 27

mg/ml e 0,6 ml de 10% Triton X-100. Após agitaçao durante 15 minutos, adicionaram-se 10 ml de MgC^ (0,5 H) e 1 ml de DNase I (1 mg/ml) e continuou-se a agitaçao durante mais 15 minutos. Após prefazer o volume para 300 ml com 50 mH Tris, pH 9,0, foram adicionados 40 ml de 10% Triton X-100 e 51,2 ml de EDTA (0,25 M, pE 7,5) e o volume final ajustado a 400 ml com 50 mM Tris, pH 9,0. Após agitaçao durante 30 minutos, a suspensão foi centrifugada a 10000 X g durante 30 minutos a 4°C e o sedimento foi ressuspenso era 400 ml de 50mM Tris HC1, pH 7,5, contendo 4 M ureia, 50 M EDTA e 1% Triton X-100. Após agitaçao durante 15 minutos a suspensão foi centrifugada a 10000 X g durante 30 minutos a 4°C e o sedimento ressuspenso em 400 ml de 50 mM Tris HC1, pH 7,5, contendo 1,0 M NaCl. Após agitaçao durante 15 minutos, a suspensão foi centrifugada a 10000 X g durante 30 minutos a 4°C e o sedimento foi ressuspenso em 400 ml de 50 mH Tris HC1, pH 7,5, contendo 6 M ureia e 5 mM EDTA. Após agitaçao durante 15 minutos a suspensão foi centrifugada a 100000 X g durante 30 minutos a 4°C. Neste ponto o sedimento de cor pos de inclusão foi congelado para uso futuro ou solubiliza. do em 50 mM Tris HCl, pH 9,5, contendo 6 M guanidlna EC1, 50 mM EDTA e 0,5% beta-mercaptoetanol. 0 polipeptídeo gp703í -delta foi então purificado por qualquer um dos métodos do Exemplo 6 abaixo. EXEMPLO 6

PURIFICAÇÃO DE GP70R-DELTA RECOMBINANTE DE FeLV Processo I A proteina solubilizada do Exemplo 28 28

% 5 foi dializada contra 6 M ureia, 50 mM Tris-KCl, pfí 8,0, 5 mM EDTA e 1 mM ditiotreitol (DTT). Aproximadamente 120 mg da proteína foi aplicado a uma coluna CM-TSK (E M Science, Dl 1,5 cm x 4 cm) equilibrada com o mesmo tampao. A proteína foi eluida com um gradiente linear de NaCl (0 - 1,0 M em 150 ml) no mesmo tampao. Colheram-se as fracçoes e anali. zaram-se por electroforese em géis de SDS - 10% poliacrila-mida. A coloraçao do gel com azul Coomassie foi usada para identificar a proteína gp70R-delta. Reuniram-se as fracçoes 25 - 31, eluidas a aproximadamente 0,1 M NaCl, e usaram-se para imunização.

Processo II

Para diminuir a hidrofobicidade de gp70R-delta os grupos sulfidrilo foram alquilados com iodo-acetamida e os residuos lisina foram N-acetilados com ani-drido citracÓnico. A proteína preparada como no Exemplo 5 foi solubilizada em 6 M guanidina-HCl em 50 mM borato, pH 9,0, 0,5% beta-mercaptoetanol (v/v). Adicionou-se iodoaceta_ mida numa proporção molar de 1:1 (iodoacetamida: grupos suJL fidrilo totais). A alquilaçao foi efectuada no escuro duraii te 1 hora â temperatura ambiente. A alquilaçao de todos os grupos sulfidrilo (na proteína e β-niercaptoetanol} foi con. trolada com DTNB (reagente de Ellman) para assegurar alquilaçao total. A concentração de proteína foi ajustada a 2 mg/ml. zes A proteína foi citraconilada no escuro pela adição de anidrido citracÓnico (0,0022 ml por mg de proteína; aproximadamente um excesso de 50 molar sobre as lisinas livres). A preparaçao foi dializada várias ve no escuro contra 50 mH borato pH 9,0. A totalidade de 29 «

Λ

acilaçao dos grupos lisina da proteína foi determinada por reacçao com ácido trinitrobenzonossulfonico (THBS) que mede os grupos lisina livres residuais. TNBS (200 ul de 10 mH) foi adicionado a 200 ug de gp70R-delta alquilada, citraconi. lada e dializada em 1 ml de 50 mM borato de sódio, pH 9,0. A mistura foi incubada durante 2 horas no escuro a 40°C, a reacçao foi parada com 0,5 ml de IN HC1 e 0,5 ml de 1% SDS e lida a absorvância a 340 nm. 0 coeficiente de extinção mo, lar a 340 nm para TNP-lisina é de 10.400. A purificação de gp70R-delta alquilada e citraconilada foi efectuada a pH 9,0 para evitar o desbloqueamento de grupos lisina. Adicionou-se à proteína modificada ureia para uma concentração final de 1 Μ. A proteína foi concentrada para 3 mg/ml por ultrafiltraçao e aplicada a uma coluna de Sepharose 6B-C1 (1,5 x 86 cm). A proteína gp70R-delta foi eluida a um fluxo de 6,6 ml/h com 4 M ureia, 50 mM borato de sódio, pK 9,0. Colheram-se frac-çôes (5,3 ml/fracçao) e determinou-se pelo ensaio de prote£ nas e electroforese em SDS-poliacrilamida a posição de gp70R-delta nas fracçoes 13 - 15.

Reverteu-se a citraconilaçao de gp70R-delta por diálise de 5 ml de gp70E-delta alquilada e citraconilada (1,0 mg/ml) contra 6 M ureia em 50 mM citrato de sódio, pH 5,5 durante 48 horas ã temperatura ambiente. A gp70R-delta foi dializada contra 6 M ureia em 100 mM bicarbonato de sódio, pH 8,0 e a concentração proteica ajustada a 0,8 mg/ml antes da absorçao a hidróxido de alumínio.

Processo III

Desenvolveu-se uma modificação da purificação descrita de gp70R-delta alquilada e citraco-nilada. Resumidamente, gp70R-delta alquilada e citraconila-da foi modificada e dializada contra 50 mM borato de sódio, pH 9,0 conforme descrito atrás. Adicionou-se ureia para uma concentração final de 8,0 M. Concentrou-se a proteína por ultrafiltraçao com uma membrana PH-30 para dar 2,5 mg de proteína/ml. A solução de proteína foi aplicada a uma co luna de Sephacryl S-400 (1,5 x 90 cm) em tampao 50 mil borato de sódio, pH 9,0 contendo 8 M ureia e eluida com o mesmo tampão. Colheram-se fracçoes (2,9 ml/fracçao) e as fracçoes 34 - 37 contendo gp70R-delta foram reunidas. Vinte e uma mg da proteína destas fracçoes foi diluido para uma concentração final de ureia 4 M com 50 mM borato de sódio, pH 9,0 e aplicado a uma coluna de DEAE-TSIC( 1,5 x 11 cm). A proteina foi eluida com um gradiente linear de NaCl (0,0 - 0,5 M) em 50 mM borato de sódio, pH 9,0 contendo ureia 4 lí. Colheram--se fracçoes de 3 ml. As fracçoes 89 - 95 contendo gp70R--delta foram reunidas e recuperou-se 15 mg de gp70R-delta. EXEMPLO 7

PREPARAÇÃO DE SAPONINAS PURIFICADAS

Resumidamente, extratos aquosos da casca de Quillaja saponaria foram dializados contra água. 0 extrato dializado foi extraído com metanol e o extrato so 31

\

lúvel em metanol foi ainda fracçionado por cromatografia era gel de sílica e por cromatografia líquida de alta pressão em fase reversa (RP-HPLC). As saponinas individuais foram separadas por IiPLC era fase reversa. Separaram-se pelo menos 22 picos detectaveis pelo índice de refracçao (denominado QA-1 a QA-22). Cada pico correspondia a ura pico de açúcar e apresentava apenas uma única banda por cromatografia em camada fina de fase reversa. Os componentes individuais foram identificados pelo tempo de retenção numa coluna de HPCLC Vydac como se segue:

Pico Tempo de Retenção (minutos QA-1 frente solvente QA-2 4,6 QA-3 5,6 QA-4 6,4 QA-5 7,2 QA-6 9,2 QA-7 9,6 QA-8 10,6 QA-9 13,0 QA-10 17,2 QA-11 19,0 QA-12 21,2 QA-13 22,6 QA-14 24,0 QA-15 25,6 QA-16 28,6 QA-17 35,2 QA-18 38,2 QA-19 43,6 QA-20 47,6 QA-21 51,6 QA-22 61,0 32

As fracçoes contendo actividade he molítica, indicadora da actividade saponina, foram croiaato-grafadas de novo por RP-HPLC. A actividade do adjuvante imu ne foi testada medindo a capacidade das saponinas modificadas para aumentar a resposta imune em ratinhos contra anti-génios administrados exógenamente. As saponinas purificadas apresentaram efeitos adjuvantes em doses inferiores aos extratos brutos. Particularmente, as saponinas predominantes no extrato de casca (QA-7, QA-17 e OA-18) apresentaram actividade adjuvante em doses de 4,5 jug de açúcar ou menos (testado por antrona). As saponinas modificadas foram ainda caracterizadas pelo conteúdo em açúcar TLC de fase reversa e TLC de fase normal, espectros de UV e de infra-vermelhos. QA-17 e QA-18 f 0 -A pel 0 proces so penso em 75 ml d tos e fi ltrado * segund a vez com trados f oram eva librou -s e uma co ence, Dl 25 mm X mM áci do aceti co /v).

Quantidades de miligramas de QA-7, ram purificadas a partir de Superfos Quil-descrito abaixo. Um g de "Quil-A" foi sus-e metanol e aquecido a 60°C durante 15 min_u 0 material nao dissolvido foi extraído uma 50 ml de metanol a 60°C e filtrado. Os fil-porados até secagem num rotavapor. Pré-equji luna de LiChroprep Silica Si 60 (E. M. Sci-310 mm, tamanho de partícula 40-63) em 40 em clorofórmio/metanol/água (62/32/6, v/v/ "Quil-A" seco foi dissolvido em 5 ml de solvente de coluna e eluido através da sílica iso-cráticamente neste solvente a um fluxo de 1 ml/min. Análise de açucares, cromatografia em camada fina e HPLC foram usados para controlar as fracçoes relativamente a QA-7, QA-17 e QA-18. As fracçoes 60-90 estavam grandemente enriquecidas em QA-8 e QA-18 enquanto que as 150-190 estavam enriquecidas em QA-7 e QA-17. Estas fracçoes foram reunidas e evapo- 33

radas para (Figura 9) adjuvantes posterior usando um puros. purificação por EP-HPLC num Vydac gradiente de metanol para eluir os EXEMPLO 8

IMUNIZAÇÃO DE GATINHOS COM gp70E

Dez gatinhos, de seis a oito semanas de idade, foram usados nas experiências de imunização. Antes da imunização todos os animais foram testados e verificou-se serem negativos relativamente a anticorpos contra FeLV.

Os animais foram divididos em dois grupos e imunizados com a Preparaçao I de gp70R ou com a Preparaçao II de gp70R produzidas conforme descrito no Exem pio 3. Ambos os grupos de animais foram imunizados com 100 jug da preparaçao de gp70R adequada emulsionada em adjuvante de Freund completo. Os animais foram imunizados parenteral-mente três vezes com intervalos de 21 dias. Vinte e um dias após a última imunização ambos os grupos de animais foram testados com 400 partículas do vírus do sarcoma felino (FeSV por animal.

Apos cada uma das imunizações, mediu-se em cada animal os níveis de anticorpos contra FeLV e os niveis de anticorpos neutralizantes contra FeLV. Qua-torze a vinte e um dias após o teste com FeSV, além de se testarem os anticorpos, os animais foram examinados quanto a presença do virus no soro e formaçao de tumores. A presen 34 -

\

ça de vírus no soro foi medida por titulaçao do vírus (De Noronha e_t a_l. , Journal of the National Câncer INstitute 58; 129-130 (1977)} e ELISA usando anticorpos específicos para o antigénio de grupo (p27) de FeLV o qual também é comum ao FeSV. Os resultados desta experiência estão apresentados na Tabela 1.

Se bem que os nove animais em ambos os grupos, que estiveram vivos ao longo do estudo, produzissem anticorpos contra gp70E, apenas os animais do Grupo I que foram imunizados com a Preparaçao I mostraram algum grau aparente de resistência a vírus com FeSV. A capacjl dade de um animal para produzir anticorpos capazes de neutrçi lizarem FeLV está relacionado directamente com a capacidade de um animal para mostrar resistência ao desenvolvimento de tumores e virémia. 35 -

ο I ra ο ra N •ri

CO u 4-1 Zj <D T~I CO u •H > O CN rri o m o\ co o cn o o m o σ' o σ> o o o

i o o o I I

1 o o o I I ca o Γ". o. cí ra M •H > ra θ’ c o co o

< co M J M + + Ί- 1 + + + i-l O 0 0 3 οΊ 1 CO co co

CO O rH 3 +J •H o o o o o o l σ\ o o co o 1 o o CO CO 1 <N i—i M < w P3 <' C O u o i co υ> co N •H C 3 0) 03 /CO CO c •H rH CD ti ra 4-> CO o (3 co CD Pi ra θ’ c CD Cj CO o (D S U 3 P-. e-<: + O O O + + O H Cí o + + + 03 o c, Cl o o •H 4J c ra o •H CD T3 ra CD o CD !—f 03 d 1 4-1 c CD •ri ί H α co o o

o +J ra CD ra c •H o ra > o o o o 1 o o o o o o o o 1 o o o ‘<M CN 00 co o 1 00 Ht co rH I CD Γ-Η w co ra u o o raJ ί CO e ο vf in CN CN CO rH co r—1 s CD co CN CN co rH rH CN CN cn ί 00 ο ra c Ή •U 13 3 co G o CD o i ra M Ι u> H M CO Ο •H *a o, 3 CL, ÍX •H rH w m c s •H ca Pi 13) G r—‘ fX 0- co rQ u - 36

EXEMPLO 9

IMUNIZAÇÃO COM GP7QR-DELTA ABSORVIDA A HIDRÓXIDO PE

ALUMÍNIO O hidroxido de alumínio que se verificou possuir um efeito adjuvante para muitas proteínas e é vulgarmente usado em vacinas foi usado como veículo para gp70K-delta preparado pelo processo I do Exemplo 6 acima absorve fortemente a 10% de hidróxido de alumínio na pre^ sença de 50 mM Tris-IICl, pH 8,0 contendo 6 H ureia. Absorveram-se aproximadamente 3 jug de gp70R-delta por 100 jig de hidróxido de alumínio. A gp70P.-delta absorvida ao hidróxido de alumínio foi lavada com tampão fosfato salino (PES), ressuspensa em PBS e usada para imunização de animais.

Ratinhos CD-I (8-10 semanas de idade) foram imunizados intradérmicamente com gp70E-delta absorvida a AlvOH)^ num volume total de 200 jul de PBS na presença ou ausência das saponinas 0A-17 e QA-18 purificadas por HPLC ou uma mistura de QA-17 e QA-18. Injectaram-se vin te a vinte cinco jug de gp70E-delta por dose. As saponinas QA-17 ou QA-18 purificadas por HPLC ou uma mistura de QA-17 e QA-18 foram usadas numa dose de peso seco de 10 jug. Injeç^ taram-se dois ratinhos para cada formulação. Deu-se aos ratinhos uma injecçao de memória de gp70R-delta/hidróxido de alumínio seis semanas após a injecçao inicial. Os soros de ratinho foram analizados quanto à reactividade contra FEA, um FeLV subgrupo A, às 2,4 e 8 semanas pós-imunizaçao por um imunoensaio de ELISA. Quatro semanas após a imunização observou-se uma resposta anti-FeLV induzida por gp70R-delta. 0s adjuvantes QA-17 e OA-18 de saponina purificada por HPLC amplificaram esta resposta. A resposta foi duas ordens de grandeza superior às quatro semanas pós-imunizaçao na pre- 37

sença de QA-17 comparado com a inunizaçao na ausência dos adjuvantes saponinas. Os resultados desta experiência estão apresentados na Figura 10. en-20 em minutos à bode anti- 000 em PBS com 0,05% foi determi-trametilben-de placas ΐύ\

Testou-se IgG anti-FEA por ura ensaio de ELISA. 0 vírus FEA (10 jug/ml era PBS) foi absorvido a placas Iramulon II durante a noite a 4°C (100 jul/poço). As placas foram lavadas com PBS e a ligaçao inespecífica de IgG foi bloqueada por incubaçao durante 1 hora com 10% de soro normal de bode em PBS (100 ^ug/poço) à temperatura ambiente. As placas foram então lavadas com 0,05% Tween-20 era água destilada. Diluiram-se os soros em 10% de soro normal bode em PBS e incubou-se 1 hora à temperatura ambiente na placa com diluições de soro de 10, 10 , 10° e 104 (100 ul/poço). Após lavagem das placas cora 0,05% Twe gua destilada elas foram incubadas durante 30 temperatura ambiente com 100 yul./poço de IgG de -ratinho conjugado com peroxidase diluído a 1/5 (Boehringer-líannheim). Após lavagem das placas Tween-20 em água destilada a quantidade de IgG nada por reacçao da peroxidase com 3,3',5,5'-te zidina e lida a absorvância a 450 nm num leitor de microtitulaçao Dynatech. EXEMPLO 10

IMUNIZAÇÃO COM GP70R-DELTA ABSORVIDO A KIDRÕXIDQ

DE ALUMÍNIO

Ratinhos CD-I (8-10 semanas de ida_ de) foram imunizados intradérmicamente com 15 jug/dose de / 36 Λ gp70R-delta alquilada purificada pelo processo II do Exemplo 6 (absorvido o hidróxido de alumínio como descrito no Exemplo 6) em 200 ul de PBS. Os adjuvantes QA-7, QA-17 e QA-18 purificados por HPLC e misturas dos três adjuvantes foram usados numa dose de peso seco de 10 jug. Injectaran-se três ratinhos para cada formulação. Os soros de ratinho foram analizados por ELISA às 2 e 4 semanas pós-imunizaçao quanto à reactividade contra FEA conforme descrito no Exemplo 9. Tal como com a imunização com gp70R-delta nao modifi. cada mostrada no Exemplo 9, a imunização com gp70R-delta al_ quilada induz uma resposta anti-FeLV às quatro semanas pós--imunizaçao. Os adjuvantes QA-7, QA-17 e QA-18 purificados por HPLC aumentara todos a resposta imune quando comparado com a imunização na ausência dos adjuvantes saponinas. QA--17 e misturas de QA-17 e QA-18 induziram a resposta mais alta, induzindo títulos por diluição limite quase de duas ordens de grandeza superiores à imunização na ausência dos adjuvantes saponinas. Os resultados destas experiências estão resumidos na Figura 11.

Estando neste momento o invento to. talmente descrito, será óbvio para os especialistas que podem ser feitas muitas alterações e modificações sem afastamento do espirito ou âmbito do invento conforme estabelecido abaixo. !

Claims (3)

1. R Ε I V I NDICAÇOES 1-. - Processo para a preparaçao de um polipeptideo recombinante caracterizado por se incluir no referido polipeptideo a sequência de amino-ácidos da pr£ teina contendo gp70 de vírus de leucemia felina (FeLV). 2a. - Processo para a preparaçao de um polipeptideo, caracterizado por se incluir no referido polipeptideo a sequência de amino-ácidos da proteína con tendo gp70 do vírus de leucemia felina (FeLV) substancialmente livre de glicosilação nativa. 3a. - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por se preparar um polipeptjl deo na forma substancialmente pura. 4a. - Processo de acordo com as reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizado por se preparar um polipeptideo tendo um peso molecular de cerca de 45 Kd. 5a. - Processo de acordo com as reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizado por se preparar um polipeptideo tendo um peso molecular de cerca de 55 Kd. 6a. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizado por se preparar um polipeptideo tendo um peso molecular de cerca !

   65-70 Kd. I 7a. - Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado por a referida proteína contendo gp70 ser do sub grupo A de FeLV. 8a. - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por o referido sub-grupo A de FeLV ser codificado por genes isolados da linha celular 3281. 9a. - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por a referida sequência de amino-ácidos ser codificada pela sequência de ácidos nu-cleicos 776-2004 apresentada a seguir: \ - 41

   Λ

   730 7<t» ?5» 74* 7?· 7Μ • # * * ♦ * ΑΤΟ ΒΤΤ COT SCA AAC AAA CBC AAC ΒΑΒ BCT CTA CBA ATC BCB ΒΑΤ CCC BCC ΑΑΤ CCT AÍJt n«t Vai Arg Ala Α·η Ly» Are Α·η Blu AI* Lau Arg 11« Ala Aap Pro Ala Aan Are Bar 770 BBB *1* M· BI* ·*· a a * # # * CCA CAC CAA ΑΤΑ TAT ΑΑΤ ΘΤΑ ACT Τββ BTA ATA ACC ΑΑΤ BTA CAA ACT AAC ACC CAA BCT Pro Hl* Bln IU Tyr Aan V*1 Thr Trp Vai II* Tfir A*n Vai Bln Thr A*n Thp ·1η Ala §90 g*0 B7« BB0 390 7M « · * # · * AAT BCC ACC TCT ATB TTA BSA ACC TTA ACC BAT BCC TAC CCT ACC CTA CAT BTT BAC CTA A*n Ala Thr Bar Hat Lau Oly Thr Lau Thr Aap Ala Tyr Pr* Thr Lau Hla Vai Aap Lau 71· 080 71« n» TB· 7*· a * * · 0 t TGT SAE CTA STB BBA AAC ACC ΤΒΒ BAA CCT ATA 8TC CTA OAT CCA ACC ΑΑΤ ·ΤΑ AAA CAC Cya Aap Lau Vai Bly A*n Thr Trp Blu Pr* 11* Vai Lau Aap Pra Thr Aan Vai Ly* Hl* 070 080 79· 1··· 1*1* 1M· « « * * * · BBS OCA CBT TAC TCC TCC TCA AA3 TAT BBA TflT AAA ACT ACA BAT ABA AAA AAA CAB CAA Bly Ala Arg Tyr «ar Bar lar Ly* Tyr Bly Cy* Ly* Thr Thr Aap Arg Ly* Lya Bln Bln 103« 10*0 IBS» lia· 1·?* 1M· • * « # * * CAA ACA TAC CCC TrT TAC 6TC TBC CCC BBA CAT BCC BCC TCB CTB BBB CCA AAB MA ACA Bln Thr Tyr Pro Pha Tyr Vai Cy* Pro Bly Hl* AU Pro B*r L*u Bly Pr* Ly* Bly Thr 1090 1100 111» liBB UM H7B • * a a * * CAC TBT BSA 333 BCA CAA BAT BBS TTT TBT BCC 8CA TOO BBA TBT OAB ACC ACC BBA BAA Hl* Cy* Bly Bly Ala 8ln A»p Bly Ph* Cy» AI* Al* Trp Bly Cy* Blu Thr Thr Bly Blu 1180 1160 Η?· Πβ· Π70 IBM • a * a a * BCT TOS T6S AAB CCC TCC TCC TCA TBS BAC TAT ATC ACA BTA AAA ABA 030 ABT ABT CAB Ala Trp Trp Ly* Pre Bar Btr Mr Trp Aip Tyr 11« Thr Vâl Ly» Are Bly Itr Mr Bln leie íee» í··· i·*· ‘**7 l**· a a a a « * BAC AAT ABC TBT BAS BOA AAA TBC AAC CCC CTB ATT TTB CAB TTC ACC CAO AAB BBA ABA A»p A»n Bar Cy* Blu Bly Ly* Cy* Aan Pra L»U 1It.Liu Bln Ph* Thr Bln Lya Bly Arg ll?( 1880 187» 1BB· »*1» >*** 0 0 0 * A B CAA BCC TCT TflB BAC BBA CCT AAB ATB TBB DBA TTB CBA CTA TAC CBT ACA MA TAT BAC Bln Ala S*r Trp Aap Bly Pro Ly* Hat Trp Bly Lau Arg Lau Tyr Arg Thr Bly Tyr A*p 1330 1340 198· 136· 137· i*M # # # # · * CCT ATC BCC TTA TTC ACO 0T0 TCC coo CAB βτβ TCA acc ÁTT ΛΒΛ CM MT í*l JM ATI pro Hl Ala Lau Pha Thr vai 8*r Arg Bln Vai Bar Tnr lia Thr Pro Pra Bln Ala na* 139· 14·· 141· 178· 173· 177# # # # # # B BBA CCC AAC CTA BTC TTA CCT BAT CAA AAA BCC CCA TCC CBA CAA TCC CAA ACA 000 TCe Bly Pro Aen Ltu v*l Ltu Pre Atp Bln Lyt Pre Pro Mor Arç Bln 8or Bln Thr Bly mmr 42 1*50 1460 U7· 14Bf 1*7# 1B00 * * • • * • AAA 3TB GCQ ACC CAB A8Q CTC CAA ACB AAT BAA ABC BCC TCA ABB TCT BTT BCC CCC ACC Ly· V*l Al· Thr βΐη Arç Lau B}n Thr Aon Blu lar Ala Bar Arg lar Vai AU Pre Thr 191» 1BB0 1930 ISA* 199· 186* • * * • # • ACC 0TB OTT CCC AAA COO ATT βθβ ACC BOA ΒΑΤ ABB TTA ATA AAT TTA BTA CAA BBS ACA Thr val V*} Pro Lya Arg 11a Bly Thr Bly Aap Are Lau Ua Aan Lau Vai Bln Bly Thr 1970 1980 1990 1600 161* Ut* * « * 0 « « TAC CTA BCC TTA AAT BCC ACC BAC CCC AAC AAA ACT AAA BAC TflT TBS CTC TBC CTB BTT Tyr Lau AU Lau A»n AU Thr Aap Pro Aon Ly» Thr Ly* Aap Cy· Trp Lau Cy* Lau Vai 1*3® 1640 1690 1660 1670 1680 • • • • • a TCT COA CCA CCC TAT TAC ΘΑΑ OBB ATT BCA ATC TTA BBT AAC TAC ABC AAC CAA ACA AAC 8*r ΑΓς Pro Pro Tyr Tyr Blu Bly Ua AU Ua Lau Bly A»n Tyr Bar Aan Bln Thr Aan 1690 1700 171* 1710 1730 17<*0 * # * • a t ccc ccc CCA TCC TBC CTA TCT ACT CCB CAA CAC AAA CTB ACC ATA TCT BAA BTA TCA BBB Aro Prp Pro •ar Cy· Lau Bar Thr Pro Bln Hia Ly* Lau Thr Ua •ar Blu Val Bar Bly 1750 17*0 1770 1700 179* 1B00 * * # • • * CAA 33A CT8 TBC ATA BBS ACT BTT CCT AAS ACC CAC CAB BCT TTfl TBC AAT OAB ACA BAA Bln aiy Lau Cy· Ua Bly Thr Vai Pro Lya Thr Hl* Bln AU Lau Cya Aan Blu Thr. Bln 1310 1880 1030 1*40 1B90 1B6B • • # • a • CAO 00A CAT ACA BG9 BCB CAC TAT CTA BCC BCC CCC AAT BOC ACC TAT TBS BCC TBT AAC Qln Oly Him Thr Bly AU Hl* Tyr Lau Al« AU Pro A»n Bly Thr Tyr Trp AU Cya Aan 1870 1800 1090 19*0 191* 19M • • • * # * ACT BOA CTQ ACC CCA TBC ATT TCC ATB BCB BTB CTC AAT TBB ACC TCT ΘΑΤ TTT TBT BTC Tnr Bly Lau Thr Pro Cy· 11* Bar Hat AU Vai L»u Aan Trp Thr Bar Aap Pha Cya Val 1930 1940 1980 1960 1970 19·· • • • • * • TTA ATC QAA TTA TBS CCC ABA BTB ACT TAC CAT CAA CCC BAA TAT BTB TAC ACA CAT TTT Lau 11* aiu Lau Trp Pro Arg Vai Thr Tyr Hl* Gin Pro Blu Tyr V*1 Tyr Thr Hia Pha 1990 M00 0010 • « • BCC AAA BCT BTC A9B TTC CCA GAT CCT ABO TAA AI* Ly· Al* Val Arg Pha Pro A·* Pro Ari ·»**» 10^ reivindicação 2, eidos ser representada na ϋ\ caracterizad codificada p reivindicação . - Processo de o por a referida ela sequência de 9. acordo com a sequência de aniino ácidos 43 43 acordo com a sequência de ácidos nuclejL reivindicação amino-ãcidos cos 776-2046 11a. - Processo de 2, caracterizado por a referida ser codificada pela sequência de representada a seguir: I _ I Muclaotldeoa# 162 Sequências de vector |Sequências | fea-3281 ATG GTT CGT GCA AAC AAA CGC AAC GAG GCT CTA CGA ATC GCG Ide ddaDtadorl7«| 1 GAT CCC G 1 tc AAT CCT AGT 786 Met Val Arg Ala Asn Lys Arg Asn Glu Ala Leu Arg lie Ala 1 Asp Pro 1 Ala Asn Pro Sor CCA CAC CAA ATA TAT AAT GTA ACT TGG GTA ATA ACC AAT GTA CAA ACT AAC ACC CAA GCT 846 Pro His Gin Ui Tyr Asn Val Thr Trp Val llt Thr Asn Val Gin Thr Asn Thr Gin Ala AAT GCC ACC TCT ATG TTA GGA ACC TTA ACC GAT GCC TAC CCT ACC CTA CAT GTT GAC CTA 906 Asn Ai* Thr Ser Met Leu Gly Thr Leu Thr Asp Ala Tyr Pro Thr Leu His Val Asp Leu T6T GAC CTA GTG GGA AAC ACC TGG GAA CCT ATA GTC CTA GAT CCA ACC AAT GTA AAA CAC 966 Cys Asp Leu V*1 Gly Asn Thr Trp Glu Pro Ile Val Leu Asp Pro Thr Asn Val Lys His GGG GCA CGT TAC TCC TCC TCA AAG TAT GGA TGT AAA ACT ACA GAT AGA AAA AAA CAG CAA 1026 Gly Ala Arg Tyr Sar Ser Ser Lys Tyr Gly Cys Lys Thr Thr Asp Arg Lys Lys Gin Gin CAA ACA TAC CCC TTT TAC GTG TGC CCC GGA CAT GCC CCC TCG CTG GGG CCA AAG GGA ACA 1086 Gin Thr Tyr Pro Pha Tyr Val Cys Pro Gly His Ala Pro Ser Leu Gly Pro ty· Gly Thr CAC TGT GGA GGG GCA CAA GAT GGG TTT TGT GCC GCA TGG GGA TGT GAG ACC ACC GGA GAA 1146 His Cys Gly Gly Al« Gin Asp Gly Phe Cys Ala AU Trp Gly Cys Glu Thr Thr Gly Glu GCT TGG TGG AAG CCC TCC TCC TCA TGG GAC TAT ATC ACA GTA AAA AGA GGG AGT AGT CAG 1206 AI* Trp Trp Lys Pro Ser Ser Ser Trp Asp Tyr Ile Thr Val Lys Arg Gly Ser Ser Gin GAC AAT AGC TGT GAG GGA AAA TGC AAC CCC CTG Air TTG CAG TTC ACC CAG AAG GGA AGA 1266 Asp Asn Sar Cys Glu Gly Lys Cys Asn Pro Leu I le Leu Gin Phe Thr 61n Lys 61y Arg CAA GCC TCT TGG GAC GGA CCT AAG ATG TGG GGA TTG CGA CTA TAC CGT ACA GGA TAT GAC 1326 Gin Ala Ser Trp Asp Gly Pro Lys Met Trp Gly Leu Arg Leu Tyr Arg Thr Gly Tyr Asp CCT ATC GCC TTA TTC ACG GTG TCC CGG CAG GTG TCA ACC ATT ACG CCG CCT CAG GCA ATG 1386 Pro Ile Ala Leu Phe Thr Val Ser Arg Gin Val Ser Thr 1 le Thr Pro Pro Gin Ala Met GGA CCC AAC CTA GTC TTA CCT GAT CAA AAA CCC CCA TCC CGA CAA TCC CAA ACA GGG TCC 1446 Gly Pro Asn Leu Val Leu Pro Asp Gin Lys Pro Pro Ser Arg Gin Ser Gin Thr Gly Ser AAA GTG GCG ACC CAG AGG CTC CAA ACG AAT GAA AGC GCC TCA AGG TCT GTT GCC CCC ACC 1506 Lys Val Ala Thr Gin Arg Leu Gin Thr Asn Glu Ser Ala Ser Arg Ser Val Ala Pro Thr ACC GTG GTT CCC AAA CGG ATT GGG ACC GGA GAT AGG TTA ATA AAT TTA GTA CAA GGG ACA 1566 Thr Val Val Pro Lys Arg Ile Gly Thr Gly Asp Arg Leu Ile Asn Leu Val Gin Gly Thr TAC CTA GCC TTA AAT GCC ACC GAC CCC AAC AAA ACT AAA GAC TGT TGG CTC TGC CTG GTT 1626 Tyr Leu Ala Leu Asn Ala Thr Asp Pro Asn Lys Thr Lys Asp Cys Trp Lau Cys Lau Val TCT CGA CCA CCC TAT TAC GAA GGG ATT GCA ATC TTA GGT AAC TAC AGC AAC CAA ACA AAC 1686 Ser Arg Pro Pro Tyr Tyr Glu Gly Ile Ala Ile Leu Gly Asn Tyr Ser Asn Gin Thr Asn CCC CCC CCA TCC TGC CTA TCT ACT CCG CAA CAC AAA CTG ACC ATA TCT GAA GTA TCA GGG 1746 Pro Pro Pro Ser Cys Leu Ser Thr Pro Gin His Lys Leu Thr Ile Ser Glu Val Ser Gly CAA GGA CTG TGC ATA GGG ACT GTT CCT AAG ACC CAC CAG GCT TTG TGC AAT GAG ACA CAA 1806 Gin Gly Lau Cys Ue Gly Thr Val Pro Lys Thr His Gin Ala Leu Cys Asn Glu Thr Gin CAG GGA CAT ACA GGG GCG CAC TAT CTA GCC GCC CCC AAT GGC ACC TAT TGG GCC TGT AAC 1866 Gin Gly His Thr Gly Ala His Tyr Leu Ala Ala Pro Asn Gly Thr Tyr Trp Ala Cys Asn ACT GGA CTG ACC CCA TGC ATT TCC ATG GCG GTG CTC AAT TGG ACC TCT GAT TTT TGT GTC 1926 Thr Gly Leu Thr Pro Cys lie Ser Met Ala Val Leu Asn Trp Thr Ser Asp Phe Cys Val TTA ATC GAA TTA TGG CCC AGA GTG ACT TAC CAT CAA CCC GAA TAT GTG TAC ACA CAT TTT 1986 Leu Ue Glu Leu Trp Pro Arg Val Thr Tyr His Gin Pro Glu Tyr Val Tyr Thr His Phe 44 gp70 I pl5E 2QA6 2106 ΓΓΓ OAA GCT GTC AGG TTC CGA AGA I GAA CCA ATA TCA CTA ACT GTT GCC CTC ATG TTG GGA m* ml V-l Arg Ph. Arg Arg I Glu Pro II. Ser Leu Thr Vai Ala L.u Ktt L.u Gly rrA ΡΤΓ ACT GTA GGG GGC ATA GCC GCG GGG GTC GGA ACA GGG ACT AAA GCC CTC CTT GAA Gly Leu Thr Vai Gly Gly Ile AU Ala Gly Vai Gly Thr Gly Thr Lye Ala Leu Leu Glu ACA GCC CAG TTC AGA CAA CTA CAA ÃTG "G CG GGA TCC TAG AU Gin Ph. Arg Gin Leu Gin het AU Gly Ser — Nucleotideo #152021ttJ 1 Sequências de 1 adaptador e vector 12a. - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por a referida sequência de amino ácidos ser codificada pela sequência de ácidos nuclei. cos representada na reivindicação 11, acordo com sequência ácidos nuc a de lei 13a. - Processo de reivindicação 2, caracterizado por a referida amino ácidos ser codificada pela sequência de cos representada a seguir: ATG GTT CGT GCA AAC Sequências AAA CGC AAC de vector GAG GCT CTA CGA ATC GCG 1 Sequências • de adaptad 1 GAT CCC 1 or 1 1 G 1 Nucleotídeo # 1 de FEA - 3281 1 CC AAT CCT AGT Met Vai Arg AU Asn Lys Arg Asn Glu Ala Leu Arg I le Ala 1 Asp Pro 1 Ala Asn Pro Ser CCA CAC CAA ATA TAT AAT GTA ACT TGG GTA ATA ACC AAT GTA CAA ACT AAC ACC CAA GCT 846 Pro His Gin Ile Tyr Asn Vai Thr Trp Vai Ile Thr Asn Vai Gin Thr Asn Thr Gin Ala AAT GCC ACC TCT ATG TTA GGA ACC TTA ACC GAT GCC TAC CCT ACC CTA CAT GTT GAC CTA 906 Asn AU Thr Ser Met Leu Gly Thr Leu Thr Asp AU Tyr Pro Thr Leu His Vai Asp Leu TGT GAC CTA GTG GGA AAC ACC TGG GAA CCT ATA GTC CTA GAT CCA ACC AAT GTA AAA CAC 966 Cys Asp Leu Vai Gly Asn Thr Trp Glu Pro Ile Vai Leu Asp Pro Thr Asn Vai r < • z * GGG GCA CGT TAC TCC TCC TCA AAG TAT GGA TGT AAA ACT ACA GAT AGA AAA AAA CAG CAA 1026 Gly AU Arg Tyr Ser Ser Ser Lys Tyr Gly Cys Lys Thr Thr Asp Arg Lys Lys Gin Gin CAA ACA TAC CCC TTT TAC GTC TGC CCC GGA CAT GCC CCC TCG CTG GGG CCA AAG GGA ACA 1086 Gin Thr Tyr Pro Phe Tyr Vai Cys Pro Gly His Ala Pro Ser Leu Gly Pro Lys Gly Thr CAC TGT GGA GGG GCA CAA GAT GGG TTT TGT GCC GCA TGG GGA TGT GAG ACC ACC GGA GAA 1146 His Cvs Gly Gly AU Gin Asp Gly Phe Cys Ala Ala Trp Gly Cys Glu Thr Thr Gly Glu GCT TGG TGG AAG CCC TCC TCC TCA TGG GAC TAT ATC ACA GTA AAA AGA GGG AGT AGT CAG 1206 AU Trp Trp Ly· Pro Ser Ser Ser Trp Asp Tyr Ile Thr Vai Lys Arg Gly Ser Ser Gin GAC AAT AGC TGT GAG GGA AAA TGC AAC CCC CTG ATT TTG CAG TTC ACC CAG AAG GGA AGA 1266 Asp Asn Ser Cys Glu Gly Lys Cys Asn Pro Leu 1U Leu Gin Phe Thr Gin Lys Gly Arg CAA GCC TCT TGG GAC GGA CCT AAG ATG TGG GGA TTG CGA CTA TAC CGT ACA GGA TAT GAC 1326 Gin AU Ser Trp Asp Gly Pro Lys Met Trp Gly Leu Arg Leu Tyr Arg Thr Gly Tyr Asp 1386 1386 1446 1506 1566 1626 1686 1746 1806 1866 1926 1986 2016 CCT ATC GCC TTA TTC ACG GTG TCC CGG CAG GTG TCA ACC ATT ACG CCG CCT CAG GCA ATG Pro 11* Ala Leu Phe Thr Vai Ser Arg Gin Vai Ser Ttir Ile Thr Pro Pro Gin Ala Met GGA CCC AAC CTA GTC TTA CCT GAT CAA AAA CCC CCA TCC CGA CAA TCC CAA ACA GGG TCC Gly Pro A*n Leu Vai Leu Pro Asp Gin Lys Pro Pro Ser Arg Gin Ser Gin Thr Gly Ser AAA GTG GCG ACC CAG AGG CTC CAA ACG AAT GAA AGC GCC TCA AGG TCT GTT GCC CCC ACC Lys Vai Ala Thr Gin Arg Leu Gin Thr Asn Glu Ser Ala Ser Arg Ser Vai Ala Pro Thr ACC GTG GTT CCC AAA CGG ATT GGG ACC GGA GAT AGG TTA ATA AAT TTA GTA CAA GGG ACA Thr Vai Vai Pro Lys Arg Ile Gly Thr Gly Asp Arg Leu Ile Asn Leu Vai Gin Gly Thr TAC CTA GCC TTA AAT GCC ACC GAC CCC AAC AAA ACT AAA GAC TGT TGG CTC TGC CTG GTT Tyr Leu Ala Leu Asn Ala Thr Asp Pro Asn Lys Thr Lys Asp Cys Trp Leu Cys Leu Vai TCT CGA CCA CCC TAT TAC GAA GGG ATT GCA ATC TTA GGT AAC TAC AGC AAC CAA ACA AAC Ser Arg Pro Pro Tyr Tyr Glu Gly Ile Ala Ile Leu Gly Asn Tyr Ser Asn Gin Thr Asn CCC CCC CCA TCC TGC CTA TCT ACT CCG CAA CAC AAA CTG ACC ATA TCT GAA GTA TCA 6GG Pro Pro Pro Ser Cys Leu Ser Thr Pro Gin His Lys Leu Thr Ile Ser Glu Vai Ser Gly CAA GGA CTG TGC ATA GGG ACT GTT CCT AAG ACC CAC CAG GCT TTG TGC AAT GAG ACA CAA Gin Gly Leu Cys Ile Gly Thr Vai Pro Lys Thr His Gin Ala Leu Cys Asn Glu Thr Gin CAG GGA CAT ACA GGG GCG CAC TAT CTA GCC GCC CCC AAT GGC ACC TAT TGG GCC TGT AAC Gin Gly His Thr Gly Ala His Tyr Leu Ala Ala Pro Asn Gly Thr Tyr Trp Ala Cys Asn ACT GGA CTG ACC CCA TGC ATT TCC ATG GCG GTG CTC AAT TGG ACC TCT GAT TTT TGT GTC Thr Gly Leu Thr Pro Cys Ile Ser Met Ala Vai Leu Asn Trp Thr Ser Asp Phe Cys Vai TTA ATC GAA TTA TGG CCC AGA GTG ACT TAC CAT CAA CCC GAA TAT GTG TAC ACA CAT TTT Leu lie Glu Leu Trp Pro Arg Vai Thr Tyr His Gin Pro Glu Tyr Vai Tyr Thr His Phe gp70 | plSE I GCC AAA GCT GTC AGG TTC CGA AGA I GAA CCA ATA TCA CTA ACT GTT GCC CTC ATG TTG GGA Ala Lys Ala Vai Arg Phe Arg Arg I Glu Pro Ile Ser Leu Thr Vai Ala Leu Met Leu Gly GGA CTC ACT GTA GGG GGC ATA GCC GCG GGG GTC GGA ACA GGG ACT AAA GCC CTC CTT GAA 2106 Gly Leu Thr Vai Gly Gly Ile Ala Ala Gly Vai Gly Thr Gly Thr Lys Ala Leu Leu Glu ACA GCC CAG TTC AGA CAA CTA CAA ATG GCC ATG CAC ACA GAC ATC CAG GCC CTA GAA GAG 2166 Thr Ala Gin Phe Arg Gin Leu Gin liet Ala Met His Thr Asp lie Gin Ala Leu Glu Glu TCA ATT AGT GCC TTA GAA AAG TCC CTG ACC TCC CTT TCT GAA GTA GTC TTA CAA AAC AGA 2226 Ser Ul Ser Ala Leu Glu Lys Ser Leu Thr Ser Leu Ser Glu Vai Vai Leu Gin Asn Arg CGG GGC CTA GAT ATT CTA TTC TTA CAA GAG GGA GGG CTC TGT GCC GCA TTA AAA GAA GAA 2286 Arg Gly Leu Asp Ile Leu Phe Leu Gin Glu Gly Gly Leu Cys Ata Ala Leu Lys Glu Glu TGT TGC TTC TAT GCG GAT CAC ACC GGA ctc GTC CGA GAC AAT ATG GCT AAA TTA AGA GAA 2346 Cys Cys Phe Tyr Ala Asp His Thr Gly Leu Vai Arg Asp Asn Met Ala Lys Leu Arg Glu AGA CTA AAA CAG CGG CAA CAA CTA TTT GAC TCC CAA CAG GGA TGG TTT GAA GGA TGG TTC 2406 Arg Leu Lys Gin Arg Gin Gin Leu Phe Asp Ser Gin Gin Gly Trp Phe Glu Gly Trp Phe AAC AAG TCC CCC TGG TTC ACA ACC CTA ATT TCC TCC ATT ATG GGC CCC TTA CTA ATC CTA 2466 Asn Lys Ser Pro Trp Phe Thr Thr Leu Ile Ser Ser lie Met Gly Pro Leu Leu lie Leu CTC CTA ATT CTC CTC TTC GGC CCA TGC ATC CTT AAC AGA TTA GTA CAA TTC GTA AAA GAC .2526 Leu Leu Ile Leu Leu Phe Gly Pro Cys Ile Leu Asn Arg Leu Vai Gin Phe Vai Lys Asp AGA ATA TCT GTG GTA CAA GCC TTA ATT TTA ACC CAA CAG TAC CAA CA6 ATA AAG CAA TAC 2586 Arg lie Ser Vai Vai Gin Ala Leu Ile Leu Thr Gin Gin Tyr Gin Gin Ile Lys Gin Tyr 2601 Nucleotideo # 1990 I I ds ΓΕΑ -3281 GAT CCG GAC CGA CCA TGA Asp Pro Asp Arg Pro -— 46 14a, - Processo de acordo com a reivindicação 2, caeacterizado por a referida sequência de amino-ácidos ser codificada pela .sequência de ácidos nuclei-cos 776-2601 representada na reivindicação 13. 15a. - Veículo de expressão, carac-terizado por compreender uma sequência de DNA codificadora da proteina contendo gp70 de FeLV. 16a. - Veículo de expressão de acojr do com a reivindicação 15, caracterizado por o referido veículo de expressão ser um plasmideo capaz de replicaçao num hospedeiro que compreende, numa ligaçao operável: a) uma origem de replicaçao b) um promotor; e c) uma sequência de DNA codificadora da proteina contendo gp70 de vírus de leucemia felina. 17a, - Veículo de expressão de acor do com a reivindicação 16, caracterizado por o referido veí- «Μ M culo de expressão ser um plasmideo capaz de replicaçao num hospedeiro procariótico que compreende, numa ligaçao operável: a) uma origem procariótica de replicaçao; b) um promotor procariotíco; e 47

   c) uma sequência de DNA codificadora da proteína contendo gp70 de vírus de leucemia felina. de acoj: da se-ucemia 18a. ~ Veículo de expressão do com a reivindicação 17, caracterizado por a referi quência de DNA codificador gp70R-delta do vírus de le felina. 19a. - Veículo de expressão de acor_ do com a reivindicação 17, caracterizado por a referida sequência de DNA codificador gp70R do vírus de leucemia felina. 20a. - Veículo de expressão de acor do com a reivindicação 17, caracterizado por a referida sequência de DNA codificador gp90R do vírus de leucemia felina. 21a. - Método para produzir proteína contendo gp70, caracterizado por compreender: a) transformaçao de um hospedeiro com uma sequência de DNA que codifica a proteína contendo gp70 de FeLV; b) expressão do referido gene; e c) recuperação da referida proteina contendo gp70. 22a. - Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizado por o referido hospedeiro ser um procariota. I 48 23a. - Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizado por a referida sequência de DNA ser derivada do subgrupo A de FeLV. 24a. - Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizado por a referida sequência de DM ser derivada da linha celular 3281. 25a. - Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizado por se produzir a proteína contendo gp70 da reivindicação 2 codificada pela sequência de DNA do subgrupo A de FeLV. 26a. - Método de acordo com a reivindicação 25, caracterizado por se produzir uma proteína contendo gp70 em que a sequência do referido subgrupo A de FeLV é isolada a partir da linha celular 3281. 27a. - Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado por se produzir uma proteina contendo gp7Q em que a referida sequência de DNA compreende a sequência 776-2004 representada na reivindicação 9. 28a. - Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado por se produzir uma proteina contendo gp70 em que a referida sequência de DNA compreende a sequência 776-2134 representada na reivindicação 11. 49 49 * L
2. 29- Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado por se produzir uma proteina contendo gp70 da reivindicação 22, em que a referida sequência de DNA compreende a sequência 776-2601 representada na reivindicação 13, 30a. - Plasmídeo caracterizado por compreender uma sequência de DNA codificadora da proteina contendo gp70. 31a, - Plasmídeo de acordo com a reivindicação 30, caracterizado por a referida sequência de DNA compreender a sequência de ácidos nucleicos representada na reivindicação 9. 32a. - Plasmídeo de acordo com a reivindicação 30, caracterizado por a referida sequência de DNA compreender a sequência de ácidos nucleicos representada na reivindicação 11. 33a. - Plasmídeo de acordo com a reivindicação 30, caracterizado por a referida sequência de DNA compreender a sequência de ácidos nucleicos representada na reivindicação 13. 34a. - Plasmídeo de acordo com a reivindicação 30, caracterizado por o referido plasmídeo ser o plasmídeo R16-38 tendo o número de acesso ATCC 67411. 50

   %
3. 353. - Plasmídeo de acordo com a reivindicação 30, caracterizado por o referido plasmídeo ser o plasmídeo R16-12 tendo o número de acesso ATCC 67119. 36a. - Plasmídeo de acordo com a reivindicação 30, caracterizado por o referido plasmídeo ser o plasmídeo pRgp90 tendo o número de acesso ATCC 67412. 37a. - Hospedeiro transformado com uma molécula de DNA recombinante caracterizado por a referida molécula de DNA recombinante compreender uma sequência de DNA que codifica a proteína contendo gp70 de FeLV. 38a. - Hospedeiro de acordo com a reivindicação 37, caracterizado por ser um procariota. 39a. - Hospedeiro de acordo com a reivindicação 37, caracterizado por a referida sequência de DNA derivar do sub grupo A de FeLV. acordo com a sequência reivindicação 38, de DNA derivar da 40a. - Hospedeiro de caracterizado por a referida linha celular 3281. - Hospedeiro de acordo com a por a referida sequência ge~ de ácidos nucleicos represen- 41a. reivindicação 37, caracterizado nética compreender a sequência tada na reivindicação 9. 51

   42-. - Hospedeiro de acordo com a reivindicação 37, caracterizado por a referida proteína contendo gp70 ser codificada pela sequência de ácidos nucleicos 776-2004, representada na reivindicação 9. reivindicação compreender a reivindicação reivindicação compreender a reivindicação 43a. - Hospedeiro de acordo com a 37, caracterizado por a sequência genética sequência de ácidos nucleicos representada na 11. 44a. - Hospedeiro de acordo com a 37, caracterizado por a sequência genética sequência de ácidos nucleicos representada na 13. 45a. - Hospedeiro de acordo com qualquer das reivindicações 37-44, caracterizado por a referida molécula de DNA recombinante ser um plasmídeo. 46a. - Hospedeiro de acordo com a reivindicação 37, caracterizado por ser E.coli. 47a. - Processo para a preparaçao de uma composição farmacêutica utilizada para induzir a produção num gato de anticorpos contra FeLV, caracterizado por se incluir na referida composição uma quantidade imunogeni-camente eficaz de um polipeptideo obtido de acordo com a reivindicação 2 juntamente com um veículo farmaceuticamente acejL tável. 52

   48a. - Processo de acordo com a reivindicação 47, caracterizado por o referido polipeptideo ser agregado. 49a. - Processo de acordo com a qualquer das reivindicações 47 ou 48, caracterizado por o veículo farmacêutico conter um adjuvante. 50a. - Processo de acordo com a reivindicação 49, caracterizado por o referido adjuvante ser uma saponina. 51a. - Processo de acordo com a reivindicação 50, caracterizado por a referida saponina ser derivada de Quil-A. 52a. - Processo de acordo com a reivindicação 50, caracterizado por a referida saponina estar na forma substancialmente pura. 53a. - Processo de acordo com a reivindicação 52, caracterizado por a referida saponina ser QA-7. 54a. - Processo de acordo com a reivindicação 52, caracterizado por a referida saponina ser QA-17. 53 55a. - Processo de acordo com a reivindicação 52, caracterizado por a referida saponina ser QA-18. 56a. - Processo de acordo com a reivindicação 49, caracterizado por o referido adjuvante ser um sal mineral. reivindicação 56, ser A1(0H)3. 57a. - Processo de acordo com a caracterizado por o referido sal mineral 58a. - Processo de acordo com a reivindicação 49, caracterizado por o referido adjuvante compreender um sal mineral e uma saponina. 59a. - Método de induzir a produção de anticorpos em gatos contra FeLV, caracterizado por compreender a imunização do referido gato com a composição farmacêutica obtida de acordo com qualquer das reivindicações 47, 48 ou 49, sendo a gama de dosagem de composto activo de 10 a 1000 /ig/ml por dose, de preferência de 100 a 700 jug/ml por dose. Lisboa, 29 de Maio de 1987

   J. PEREIBA DA CR Assflts Oficial da Proprieèds bàaírid RUA VICTOR OGRDON. 10-A, 1.· 1200 LISS0A