JPH01503273A - ネコ白血病ウイルス抗原の製造法と用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

朗立張 ネコ白血病ウィルス抗原の製造法と用途関連出願 本願は１９８６年５月３０日付アメリカ出願８６１５８５の継続出願である。 本願はまた同時に出願されたケンシル（Ｋｅｎｓｉｌ）らの「サポニン補助薬」 と題するアメリカ出願　に関連を有するものである。 発明の背景 良吸Δ立」 本発明はネコにおいてネコ白血病ウィルス（ＦｅＬＶ）に対する抗体を誘導する にめのＦｅＬＶ抗原の使用に関する。 背景技術の簡単な記載 ネコ白血病ウィルス（ＦｅＬＶ）は、ネコにおける白血病、再生不良性貧血およ び急性免疫抑制（ネコエイズ）の水平的伝達と疫学的に関連している、複製能を 有するタイプＣレトロウィルスである。 ＦｅＬＶのゲノムは、６Ｏ−７０Ｓ−重鎖ＲＮ　、Ａからなり、このＲＮＡはウ ィルスコア蛋白質をコードするｇａｇ遺伝子、逆転写酵素をコードする匹１遺伝 子およびｇｐ７０とｐ１５Ｅウィルス外膜蛋白質をコードする胆Σ遺伝子とから なっている。 ＦｅＬＶの分離物は、その干渉パターンに基づいて、サブグループＡ、Ｂおよび Ｃに分けられる（Ｓａｒｍａら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　４４：３５２−３５８（１ ９７１））。ＦｅＬＶ−Ａは全ての分離物に認められるのに対し、ＦｅＬ　Ｖ　 −Ｂは全ての分離物の約４０％に認められるに過ぎない。ＦｅＬＶ−Ｃは非常に 希であって、ＦｅＬＶ−Ｂと同様、常１：ＦｅＬＶ−Ａと共に認められる（Ｊａ ｒｒｅｔｔら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃａｎｅ ｅｒ　２１：３３４−３３７（１９７８））。ＦｅＬＶ−Ｃは全ウィルス血症ネ コに対し僅か１％の割合で、しかも貧血症ネコにおいてのみ認められるものであ る（Ｏｎｉｏｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ）　２９６：１５６−ｌ５ ６−１５８（１９゜ネコ白血病ウィルスに対するワクチンを製造しようとする多 くの試みが不成功に終わっていた。これらの試みは、照射、ヒドロキシルアミン またはパラホルムアルデヒドによってウィルスを殺す工程を含むものであり、あ るいはマイトマシンＤ不活化ウィルス使用ワクチン（アメリカ特許第３，９６６ ．９０７号、第４，０３４，０８１号および第４，０８６゜１３４号）であり、 あるいは全土感染細胞や不活化感染細胞の使用に基づくワクチンであった。 より最近になり、興味は純化ＦｅＬＶ分子の使用（Ｏｓｔｅｒｈａｕｓら、Ｊｏ ｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　１３５（１）：５９１−、＋９６（ １９８５））およびＦＯＣＭＡ（Ｆｅｌｉｎｅ　０ｎｃｏｒｎａｖｉｒｕｓ　Ａ ｓ５ｏｃｉａｔｅｄ　Ｃｅ１ｌ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ　Ａｎｔｉｇｅｎネコオンコ ルナウイルス関連細胞膜抗原）製品の使用（アメリカ特許第４．３３１．７９３ 号および第４，４３４，１５７号）に集中しティる。Ｆ　ＯＣＭ　、Ａ製品を利 用するワクチンは市販されている（ネブラスカ州すンコルン在ノルデン・ラボラ ドリース）。しかしながら、このワクチンの効力についての最近の研究によれば 、そのＦｅＬＶ疾病かみネコを保護する能力について、かなりの疑いが持ｆこれ るに至っている（Ｐｅｄｅｒｓｅｎら、Ｆｅ１ｉｎｅ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ　１５ ニア−２０（１９８５））、従って、ネコの免疫系を刺激し、ＦｅＬＶに対する 抗体を誘導することができる抗原製品に対する要望が高まっている。 発明の要約 本発明は、抗原製品に関するものであり、ネコを免疫して、ネコ白血病ウィルス について見出されたエピトープ決定基と反応する抗体を誘導する方法に関するも のである。 本発明の第１の態様において、組換ＤＮＡ技術を使用し、ＦｅＬＶグリコプロテ ィン７０（ｇｐ７０）のポリペプチド部分を含む抗原製品が製造される。他の態 様において、ＦｅＬＶｇｐ７０のポリペプチド部分を、Ｆｅ　ＬＶサブグループ ＡのｐｌＳｅ外膜蛋白質の４０アミノ末端アミノ酸と共に（ｒｒｇｐ７０デルタ 」と言う。）または全アミノ酸配列と共に（ｒｒｇｐ９０ｊと言う。）含んでい る抗原製品が組換Ｄ　Ｎ　、Ａ技術を使用して製造される。これらの組換ポリペ プチド類、すなわちｇｐ　７０Ｒ，ｇｐ　７０Ｒ−デルタおよびｇｐ９０Ｒなら びにそれらの類縁体を、以下包括して７ｇｐ７０−含有蛋白質」と呼ぶ。ｒｇｐ ７０−含有蛋白質」なる語（才、天然ｇｐ７０外膜蛋白質、ｇｐ　７０−デルタ 蛋白質およびｇｐ　９０蛋白質ならびにそれらの類縁体と同じアミノ酸配列を有 するポリペプチドを含むものである。ここに７類縁体コとは、ｇｐ７０、ｇｐ　 ７０−デルタまたはｇｐ　９０と１個もしくはそれ以上のアミノ酸が付加、削除 または置換されている点で異なっている蛋白質またはポリペプチドであって、本 質的にｇＰ　７０蛋白質の生物学的活性を示すものを包含する。これらの抗原性 製品はネコを免疫して抗体を生産せしめるために使用することができる。 本発明の抗原製品および免疫レスポンス上昇性成分を医薬的に適している担体と 共に含む医薬組成物もまた本発明に包含される。 すなわち、本発明はネコ白血病ウィルスのｇｐ７０−含有蛋白質のアミノ酸配列 を含む本質的に純化されたポリペプチド、上記ｇｐ７〇−含有蛋白質をコードす るＤ　Ｎ　、Ａ配列を有する発現ビークル、上記発現ビークルで形質転換された 原核生物、原核生物においてｇｐ７〇−含有蛋白質を生産せしめる方法およびネ コをＦｅ　ＬＶからの組換ｇｐ　７０−含有蛋白質を含む医薬的組成物で免疫す ることからなるネコにおいてＦｅ　ＬＶに対する抗体の生産を誘導する方法を包 含する。 第１図はＦｅ　ＬＶＤＮＡ配列の存在を検出するために用いられるｐ　ＦＵ３プ ローブの構成を示す概括図である。制限エンドヌクレア第２図はクローン３２− ５０に対する制限地図を示す。制限エンドヌクレアーゼ部位はＤＮＡ上において 次のように示される：Ｒ：ＥｃｏＲＩ；　Ｂｇ：　Ｂｇｌ　Ｉｆ；　Ｓ：　Ｓａ ｃ　Ｉ：　Ｈ：　ＨｉｎｄＩ［Ｉ：に：　Ｋｐｎｌ：　Ｂ：　ＢａｍＨＩ。 第３図はＰＵＣ−９にサブクローンされたＦｅ　ＬＶ外膜遺伝子に対する限定的 制限地図を示す。 第４図はウィルスＤＮＡ配列およびｇＰ　７０とｐ１５Ｅの対応するアミノ酸配 列を示す。 第５図はｇｐ　７０ウイルス遺伝子の発現を行ってｇｐ７０Ｒを生産するための ｇｐ７０−ｐ１５Ｅ断片のサブクローニングを示す。 第６図は発現ベクターｐ　ＪＬＢＯＴに存在するＤＮＡ配列ならびにそれによっ て生産されるｇｐ７０Ｒ−デルタの対応するアミノ酸配列を示す。 第７図は発現ベクターｐ　ＪＬＢＯＴに存在するＤＮＡ配列およびそれによって 生産されるｇｐ７０Ｒの対応するアミノ酸配列を示す。 第８図は発現ベクターｐ　ＪＬＢＯＴに存在するＤＮＡ配列およびそれによって 生産されるｇｐ９０Ｒの対応するアミノ酸配列を示す。 第９図は逆相ＨＰＬＣによるキラヤ（Ｑ　ｕｉｌｌａｊａ）サポニンのシリカフ ラクションの精製を示す。 第１０図はｇｐ７０Ｒ−デルタによる免疫結果を示す。 第１１図はアルキル化ｇｐ７０Ｒ−デルタによる免疫結果を示す。 好ましい実施態様の簡単な脱Ｂ この発明は、その最も基本的レベルにおいて、ネコ白血病ウィルスから誘導され た抗原製品並びにこれらの抗原製品を利用してネコの免疫系を刺激し、ＦｅＬＶ および免疫学的に関連性のあるウィルス類に対する抗体を生産させる方法を含む ものである。 発明者らは、組換えＤＮＡ技術の使用によるＦｅＬＶのｇｐ７０グリコプロティ ンのポリペプチド部分の製造方法を考案した。これは、ｇｐ７０のウィルス遺伝 子をクローン化してプラスミド・ベクターに組入れ、次いでこれを用いてエシェ リヒア・コリ（大腸菌）を形質転換することにより行なわれに。ウィルスｇｐ７ ０遺伝子がエシェリヒア・コリにおいて発現されたとき、生成されるポリペプチ ドはグリコジル化されていない。それ故、分子量は７０キロダルトンではなく約 ４５キロダルトンである。すなわち、ｇｐ７０をコードするウィルス遺伝子かる 原核生物において生成されたウィルス蛋白質は、１ｇｐ７０ＲｊまにはＴｒｅｃ −ｇｐ７０　Ｊと言われる。さら１こ、ＦｅＬＶウィルスｇｐ７０外膜蛋白質を コードする遺伝子がまたＦｅＬＶのｐｉ　５ｅ外膜蛋白質のアミノ酸１−４０を コードした場合、エシェリヒア・コリにおいて発現されるポリペプチドの分子量 は５５キロダルトンであるｃｇｐ７０およびｐｉ　５ｅポリペプチドの４０アミ ノ末端アミノ酸残基をコードするウィルス遺伝子から原核生物において生成され たウィルス蛋白質は、ｒｇｐ７０Ｒ−デルタニまたは７ｒｅｃ−ｇｐ７０−デル タ」と言われる。さらに、ＦｅＬＶｇｐ７０外膜および完全ｐｌ　Ｓｅ外膜蛋白 質をコードする遺伝子は分子量６５−７０キロダルトンを有するポリペプチドを コードし、ｒｒｇｐ９０４．、ｒｇｐ９０ＲＪまたはｒｒｅｃ−ｇｐ９（３と言 われる。これらの組換え体蛋白質を、包括してｒｇｐ７０含有組換え蛋白質」と 呼ぶ。 「免疫学的に関連性のあるウィルス（類）ヱの語はＦｅＬＶに対する顕著なゲノ ム相同性を有するウィルス類を包含する。従って、これらの遺伝子により発現さ れた生成物は顕著なレベルの免疫学的交差反応性を示す。かかる免疫学的に関連 性のあるウィルスの一例には、ネコ肉腫ウィルス（ＦｅＳＶ）がある。 Ｆｅ５ＶはＦｅＬＶと非常に関連性のあるレトロウィルスである。 事実、ＦｅＳＶはＦｅＬＶ感染ネコ由来の腫ようから分離され得る。 実際、Ｆｅ５Ｖは、ヘルパーウィルスとしてＦｅＬＶと共存する場合にのみ増殖 され得る欠損ウィルスである。最初にＦｅＬＶゲノムがネコＤＮＡに組込まれる こと力（信じられている。しかしながら、溶菌形質転換中、レトロウィルスＤＮ ＡがネコＤＮＡから除去されると、Ｆｅ５Ｖは腫よう遺伝子として知られている ある種のネコ遺伝子をそれと共に取り込む。生成したレトロウィルスのＦｅ５Ｖ はＦｅＬＶと非常によく似ており、ＦｅＬＶ上に存在する外膜糖蛋白質に関して は同一である。事実、感染ネコから分離されｊ：Ｆｅ５Ｖ製品もまたＦｅＬＶを 含んでいる。 この発明で使用されている「宿主」なる語は、原核生物だけでなく、真核生物、 例えば酵母および糸状菌類、並びに植物および動物細胞を包含するものとする。 「原核生物−する語は、ウィルス遺伝子により形質転換され、ＦｅＬＶのｇｐ７ ０−含有蛋白質を発現させることができる細菌を全て包含する。 ｇｐ７０−含有蛋白質のウィルス遺伝子は、全てのＦｅＬＶのサブグループから 誘導され得る。必要なのは、糖蛋白の遺伝子配列が原核生物において発現される ということだけである。好ましいものは、ＦｅＬＶサブグループＡ由来のｇｐ７ ０−含有蛋白質のウィルス遺伝子である。特に好ましいものは、セルライン３２ ８１により生産されるＦｅＬＶサブグループＡのｇｐ７０ウィルス遺伝子である 。このセルラインは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（口ツク ビル、メリーランド）から入手可能であり、受託番号は第ＣＲＬ９１１６号であ る。 ウィルスｇｐ７０−含有蛋白質をコードする組換えＤ　Ｎ　、４分子の使用によ り、当技術分野の一般的熟練者に周知の技術を用いて宿主を形質転換することが できる。特に好ましいのは、原核生物の形質転換を目的とするウィルスｇｐ７０ コード配列を含むプラスミドの使用である。 この発明のｇｐ７０−含有組換え蛋白質は、天然ｇｐ７０のアミノ酸配列の場合 よりも多いかまたは少ないアミノ酸をその側面に位置する端部に有し得る。例え ば、側面に位置するアミノ酸配列は、ｇｐ７０Ｒ−デルタおよびｇｐ９０Ｒポリ ペプチドの場合と同様、ｐ１５Ｅペプチドの全部または一部を含み得る。他方、 この発明の組換え蛋白質は、第７図に示された通り、例えばＣ−末端に２個少な いアルギニン残基を有し得る。 「実質的純粋形」なる語は、この発明のポリペプチドに適用されている場合、こ の発明のポリペプチドが本来普通は関連している他のウィルス蛋白質をそのポリ ペプチドが本質的に含んでいないことを意味する。 「実質的に純粋な二という語は、サポニン類に適用されている場合、自然状態で は通常サポニンに伴う化合物を実質的に含まず、一定で再現可能なりロマトグラ フィ一応答、溶離プロフィールおよび生物学的活性を示すことを意味する。「実 質的に純粋な−の語は、サポニンと他の化合物との人工または合成混合物を除外 する訳ではない。 操作し易く連結された融合遺伝子の製造方法および細菌におけるそれらの発現方 法は公知であり、例えばアメリカ合衆国特許第４３６６２４６号に示されている 。そこに記載されている遺伝子構造および方法は、原核生物宿主におけるＦｅＬ Ｖ由来のｇｐ７０の発現に利用され得る。 原核生物宿主としては、ゲノム陰性菌並びにゲノム陽性菌、例えばエシェリヒア ・コリ、ニス・チムフィムリウム、セラチア・マルセセンスおよびバチルス・ス ブチリスを挙げることができる。 一般に、挿入されたウィルス遺伝子フラグメントの転写効率を高めるプロモータ ー配列を含む発現ベクターは宿主に合わせて用いられる。一般に発現ベクターは 、複製開始点、プロモーター（複数もあり得る）、ターミネータ−１および形質 転換された細胞において表現型選択性を与え得る特異的遺伝子を有する。形質転 換された宿主を当技術分野において周知の手法に従い発酵および培養することに より、最適な細胞成長を達成することができる。 この発明で使用され得るプロモーターの例としては、ｒｅｃＡ、　ｔｒｐ。 ’ａＣｓ　ｔａｃおよびバクテリオファージ・ラムダＰ　またはＰｌ、がめる。 この発明で使用され得るプラスミドの例は、マニアチス等、「モレキュラー・ク ローニング」（コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリーズ、１９８２年 ）に列挙されている。 この発明は、この明細書に記載された方法に従い修飾された宿主、または当技術 分野の一般的熟練者に通常知られている他の方法、例えば溶原性ファージを用い た遺伝子材料の感染により修飾された宿主であって、ｇｐ７０−含有蛋白質のＦ ｅＬＶ遺伝子を発現する原核生物を生じる宿主を全て包含する。 ｇｐ７０−含有蛋白質のＦｅＬＶウィルスゲノムにより形質転換された宿主、好 ましくは原核生物は、ネコの免疫に使用され得るｇｐ７０Ｒ，ｇｐ７０Ｒ−デル タおよびｇｐ９０Ｒポリペプチドの生産に特に有用である。前述した通り、ｇｐ ７０−含有蛋白質のウィルスゲノムが細菌において発現される場合、グリコジル 化は行なわれない。それ故、組換え体ｇｐ７０の分子量は、ゲノムがウィルスに より発現される場合と同様、７０キロダルトンではなく４５キロダルトンである 。 ｇｐ７０Ｒ−デルタは、セルライン３２８１がら分離されたＦｅＬＶサブグルー プＡのＦｅＬＶウィルスｇｐ７０外膜蛋白質の全アミノ酸配列およびｐｉ　５ｅ 外膜蛋白質の４ｏアミノ末端アミノ酸残基を含む。ｐｉ　５ｅ由来の配列は組換 えポリペプチドのカルボキシル末端に位置する。エシェリヒア・コリにおいて発 現されたｇｐ７０Ｒ−デルタポリペプチドの分子量は５５キロダルトンである。 ｇｐ７０およびｐｉ　５ｅポリペプチドをコードするウィルス遺伝子がら原核生 物において生産されたウィルス蛋白５ｉ（ｇｐ７０Ｒ−デルタ）は、ｐｉ　５ｅ −由来の配列の疎水性故にｇｐ７０Ｒよりも疎水性が強い。しかしながら、天然 （ｇｐ７０）および組換え体（ｇｐ７０　Ｒ，ｇｐ７０　Ｒ−デルタおよびｇｐ ９ＯＲ）の両形態において、分子のｇｐ７０部分のアミノ酸配列は本質的に同じ である。ｇｐ７０組換え蛋白質により免疫されたネコは、ｇｐ７０　Ｒ，ｇｐ７ ０　Ｒ−デルタ、ｇｐ９０Ｒおよびｇｐ７０ポリペプチドに存在するエピトープ に結合する抗体を産生する。すなわち、ＦｅＬＶｇｐ７０−含有組換え蛋白質の 商業的生産が実施され得る。 この発明で使用されている「免疫原有効量二なる語は、ＦｅＬＶエピトープに結 合する抗体のネコにおける生産を誘導するのに必要なＦｅＬＶ抗原の量を意味す る。 この発明のｇｐ７０−含有組換え蛋白質は、ネコの免疫系の感作に特に有用であ り、その−結果としてＦｅＬＶに存在するエピトープとの反応性を有する抗体を 生産させるものである。好ましいのは、ＦｅＬＶサブグループＡを生産するセル ラインから誘導されたｇｐ’７ＯＲおよびｇｐ７０Ｒ−デルタ蛋白質である。特 に好ましいものはＦｅＬＶサブグループ八−生へセルライン３２８１である。 ｇｐ７０−含有組換え蛋白質は、注射、急速注入、鼻咽喉吸収、皮膚吸収により 非経口的および経口的に投与され得る。非経口投与用製品には、滅菌または水性 または非水性溶液、懸濁液および乳液がある。非水性溶媒の例としては、プロピ レングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（例、オリーブ油）および注 射可能な有機エステル（例、エチルオレエート）がある。吸収性ドレッシング用 担体を用いることにより、皮膚透過性を高め、抗原吸収性を向上させることがで きる。経口投与用液体用量形態は、一般に液体用量形態を含むリポソーム溶液を 含み得る。リポソームの懸濁に適した形態には、当技術分野で常用される不活性 希釈剤、例えば精製水を含む乳液、懸濁液、溶液、シロップおよびエリキシルが ある。不活性希釈剤以外に、かかる組成物はまたアジュバント、湿潤剤、乳化お よび懸濁剤、並びに甘味、風味および着香剤を含有し得る。 この発明のｇｐ７０−含有組換え蛋白質を含有する抗原製品は、アジュバントを 含有することも可能である。アジュバントは、特異的免疫応答を非特異的に増強 するのに使用され得る物質である。通常、アジュバントおよび抗原は、免疫系に 供する前に混合されるか、または別々ではあるが免疫される動物の同じ部位に供 される。アジュバントは、それらの組成に基づいて幾つかの群に大まかに分類さ れ得る。これらの群には、油性アジュバント（例えば、フロイント完全および不 完全アジュバント）、無機塩類（例えば、ＡＩＫ（ＳＯ，）、、Ａ　ＩＮ　ａ（ Ｓ　０４）２、ＡＩＮＨ，（ＳＯ４）、シリカ、明ばん、Ａｌ（ＯＨ）３、Ｃａ ５（Ｐ　０ａ）ｚ、カオリンおよび炭素）、ポリヌクレオチド類（例えば、ポリ ＩＣおよびポリＡＵ酸）およびある種の天然物質（例えば、マイコバクテリウム ・ラベルクロシスから得られるろうＤｌ並びにコリネバクテリウム・バルブム、 ボルデテラ・ベルツシスおよびプルセラ類に属するものおいて見出される物質） がある。それらの物質中でアジュバントとして特に有用なのは、サポニン類、例 えばクィリＡ（スペルフォス・アクチセル・スカベット、デンマーク）の粗混合 物またはそれらの高度精製フラクションである。 ここに使用されている「サボニンニする語は、水溶液中で泡を生じ、溶血活性を 有し、免疫補助活性を有するグリコシド・トリテルペノイド化合物を包含する。 この発明は、サポニンそれ自体並びに天然の医薬的に許容し得る塩類および医薬 的に許容し得る誘導体を包含する。また「サポニン」なる語は、その生物学的活 性フラグメントを包含する。 サポニンは、３種のキラヤ・サボナリアの樹皮から抽出されたトリテルペングリ コシドの混合物である。サポニンは、足および口の疾病に対するワクチン、並び に原生動物寄生虫、例えばトリパノゾーマ・クルジに対する実験ワクチンにより 与えられた保護免疫性およびヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）に対する上腕骨応答の増 幅におけるアジュバントとして多く使用されている。１ボンフオード、「インド 。 アーク、アレーギ、アプル、イミュン、」、６７：１２７、（１９８２年）コ。 最近、クィリＡ、サポニンの粗混合物から得られたサポニン・アジュバントが高 圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により精製された。ケンシルらにより同 時に出願された「サポニン補助薬」と題するアメリカ合衆国特許出願第　号（出 願中、その内容を引用して説明の一部とする）の記載に従い精製フラクションが 製造された。これらの精製フラクション（実質的に純粋なサポニン類）およびそ れらの混合物はこの発明に特に有用である。 ネコの免疫に使用されるｇｐ７０−含有組換え体抗原の物理的形状は、アグリゲ ートまたは非アグリゲート状であり得る。これまでの研究結果は、細菌含有物中 にｇｐ７０Ｒを含むアグリゲート形態による免疫が、後のウィルス感染に対する 暴露による心身に有害な作用の改良には最も効果的であるということを示唆して いる。しかしながら、この発見は、常套技術、例えばグルタルアルデヒドまＬは 他の架橋剤を用いｆ；処理によるｇｐ７０Ｒの非アグリゲート形態からのアグリ ゲート状ｇｐ７０Ｒの製造を除外してはいない。次いで、こうして誘導されたア グリゲート状ｇｐ７０Ｒは、活性免疫反応を誘発することにより後のＦｅＬＶま たは免疫学的に関連性のあるウィルスに対する暴露からの保護に有効なウィルス 感染改良組成物の製造用途に使用され得る。 しかしながら、動物がアグリゲートおよび非アグリゲートｇｐ７０Ｒのいずれの 形態により免疫されるかという点に：よ関係無く、ｇＰ７０Ｒのこれら両形態は それるに対する抗体の生産を誘導する。すなわち、これらの抗ｇｐ７０Ｒ抗体は 、診断用途、例えば試料中におけるｇｐ７０の存在検出用キットにおいて使用さ れ得る。 この発明のＦｅＬＶ抗原製品をネコにおいて使用することにより、ＦｅＬＶのエ ピトープ決定基に結合する抗体の生産が誘導され得る。 ＦｅＬＶに対するネコ抗体の生産促進に関する特に有用な方法は、まずこの発明 のＦｅＬＶ抗原製品によりネコを免疫し、次いでその後免疫化を行うことである 。 免疫化開始時点でのネコの年令は厳密ではないが、動物が少なくとも８週令であ るのが最も好ましい。その理由は、一般的にネコは約４週間で離乳するが、８週 令まで待つことにより、循環する母性抗体による干渉が減少するからである。 いつネコが最も有利に免疫化されるかを決定する一手段は、ｇｐ７０に関するネ コの免疫状態を測定することによる方法である。この評価は、免疫測定法、例え ばＥＬＩＳＡ検定法にこの発明のｇｐ７０−含有組換え蛋白質を用いてｇｐ７０ Ｒに対するネコ抗体を検出することにより行なわれ得る。その際、いつｇｐ７０ Ｒに対するネコの抗体力価が充分低くなって、ＦｅＬＶおよび免疫学的に関連性 のあるウィルスによる感染に対する免疫化および保護を増強させ得るかを測定す ることが可能である。 多重免疫領域を利用する場合には、免疫化のタイミングに関する多くの相異なる 技術が存在する。１回より多くこの発明の抗原製品を用いることにより、免疫さ れたネコにより発現された免疫グロブリン・レパートリ−の発現のレベルおよび 多様性を増加させることが可能である。一般的に、多数の免疫化を実施する場合 、それらは１〜２箇月間隔をあけて行なわれる。 一般的に、ネコに投与されるｇｐ７０−含有組換え蛋白質の用量は、年令、状態 、性別および病気の程度といった要因および、あるとすれば、当技術分野の一般 熟練者により調節され得る他の可変要因により異なる。 この発明の抗原製品は、単一または複数用量として投与され得、１用量当たりＦ ｅＬＶｇｐ７０Ｒまたはｇｐ７０Ｒ−デルタ抗原に関して１０−１００００μ９ ／’ＩＱ、さらに好ましくは１用量当たり１００−７００μ９／仄Ｃのｇｐ７０ Ｒま几はｇｐ７０Ｒ−デルタ抗原、最も好ましくは１用量当たり１００−３００ ｕ９／ＩＶ））ｇｐ７　ＯＲまたはｇｐ７０Ｒ−デルタ抗原の範囲で変動し得る 。ｇｐ７０−含有組換え蛋白質に関する類似した用量レベルが考えられる。 この発明に関する総括的な説明を行ったが、以下、具体的な実施例によりさらに 完全な理解を得ることが可能である。これらの実施例は単に説明を目的としてい るだけであって、特記しない限り限定を意図するものではない。 高分子量ゲノムＤＮＡを３２８１細胞から生産し、エンドヌクレアーゼＥｃｏＲ Ｉにより完全に制限処理し、８〜２０キロ塩基（ｋｂ）の断片をショ糖勾配で単 離した。ラムダ・ファージ・ライブラリィをこれらの断片からシャロン４ＡＥｃ ｏＲＩアームを用いて調製した。このライブラリィをガードナー−アルンスティ ンＦｅＬＶサブグループＢゲノム・クローンのＵ３域含有プローブでスクリーニ ングしｎ〔マリンズら、ジャーナル・オブ・パイロロジイ、３８巻６８８〜７０ ３頁１５８１年参照二。ＦｅＬＶ長末端反復配列（Ｌ　Ｔ　Ｒ）のこの域を用い るＤＮＡハイブリダイゼーションは水平的伝播ＦｅＬＶＤＮＡ配列に対し特異的 であることを示した　〔カーゼイら、プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル ・アカデミイ・オブ・サイエンス、ＵＳＡ、７８巻７７７８頁１９８１年参照瓦 この外因性のＵ３ブローベは未感染ネコ細胞にみられる外因性ＦｅＬＶ配列と交 差−ハイブリダイゼーションしない。Ｕ３ブローベの構成は第１図にその概略を 示す。 概説すれば、プラスミドｐＦＧＢは、ｐＢＲ３２２にゲノムクローン・ラムダ− ＨＦ６０〔ｖリンら、前掲〕含有Ｆ　ｅＬ　Ｖ−ＤＩＡからＥｃｏＲＩ断片９　 、１　ｋｂをサブクローニングすることにより構成しｆこ。このプラスミドは４ つのＫｐｎ１部位、すなわちウィルスゲノム内部域の２つおよび各長末端反復配 列（ＬＴＲ）域の１つを含有する。Ｋｐｎ■によるｐＦＧＢの消化およびその後 の再結合はフランキング細胞遺伝子配列と１つのＬＴＲを含有するが他のウィル ス配列を全く含まないクローン（ｐＦＬＴＲ）をもたらす。次に、ｐｌ”　Ｌ　 Ｔ　ＲをエンドヌクレアーゼＴａｇｌで消化させ、５５０ｂｐの断片を単離した 。この断片を次いでサブクローニングしてｐＢＲ３２２のＣ１ａｌ制限部位を得 た。このクローン、ｐＦＵ３を直接ニック−翻訳し、ハイブリダイゼーション・ プローブとして用いた。 組換えファージの選択は放射性ニック−翻訳ｐＦＵ３プローブに対するＤＮＡハ イブリダイゼーションに基づき行なった。この方法において、４２個の組換えフ ァージを選択、単離し、それらのＤＮＡを生産しに。これらゲノムクローンをサ ザン・ハイブリダイゼーン１ン法ロｐＦＵ３ブローベ、ガードナー・アルンステ ィン分子クローンのＦｅＬＶ外被ブローベ（＋）ＦＧＢ−ｅｎｖ）およびＦｅＬ Ｖガードナーアルンスティン・ゲノム全体を含有する付加的なブローベ（ｐＦＧ Ｂ）を用いるサザン・ハイブリダイゼーション〕により、制限消化させ、分析し た。 この分析に基づき、２８個の別々のクローンを同定した。これら２８個のクロー ンのうち、２４個はｇａｇ／ｐｏ１遺伝子域の主要な欠失により欠損しているこ とが判明した。残りの４つのクローンはこの欠失を受けず、完全な長さのようで あった。 １つの完全な鎖長さのクローン（３２〜５０）（その制限地図は第２図に示す） を選択し、さらに分析した。ＦｅＬＶ外被遺伝子含有Ｐｓｔｌ断片２　、０　ｋ ｂをＰＵＣ−９にサブクローニングし、限定した制限地図を決定した（第３図） 。種々の断片をさらにＭ２Ｓにサブクローニングし、ＤＮＡ配列を決定した（同 様に第４図に示す）。 実施例２ ＦｅＬＶｇｐ７０およびｇｐ７０−デルタのエシェリキア・コリにおける発現 ＦｅＬＶサブグループＡゲノムクローン３２〜５０の外被遺伝子には２つのＢａ １ｌ制限部位がある。これらの部位の１つはヌクレオチド１６１に位置しく第４ 図）、これは先導配列と天然ｇｐ７ｏのアミノ末端をコードする配列の間の接合 点に非常に近い。他の制限部位はｇｐ７０／ｐ１５Ｅ接合点を超えるほぼ１２０ のヌクレオチドである。ＢａＩＩ断片を単離し、ＢａｍＨＩリンカ−を加え、修 飾断片を第５図に示すようにＰＵＣ−９（ｐｅｎｖ−１）のＢａｍＨ１部位にク ローニングした。 ＢＯＴにサブクローニングしく得られたこのサブクローンをＲ１６−３８と呼ぶ ）、蛋白質発現を誘発した。この５５ｋｄの蛋白質はｒｇｐ７０Ｒ−デルタ」と 呼ばれ、またｒｒｅｃ−ｇｐ−デルタ」またはｒｒｇｐ７０−デルタ」として知 られている。完全なりＮＡ配列および対応するアミノ酸配列を第６図に示す。 プラスミドｐＪＬＢＯＴ中のｇｐ７０−デルタに対するウィルス・ゲノム配列を 含有するエシェリキア・コリ抹Ｒ１６−３８は１９８７年５月２２日付でアメリ カン・タイプ・カルチャー・コレクション（ロックビル、メリーランド州）に寄 託し、寄託番号６７４１１を得た。 発現プラスミドｐＪＬＢＯＴの構成はプラスミドｐＪＬＡ１６の修飾により得ら れる。プラスミドｐＪＬＡ１６の構成はラウテンバーガーら（ジーン・アナル・ チック、１巻、６３〜６６頁、１９８４年）により記載されている。ｐＪＬＡ１ ６プラスミドはバクテリオファージ・ラムダＰ　プロモーター（Ｐ　）、および バクテリオファージＬ　Ｌ ・ラムダＣｎ遺伝子のシャインーダルガルノ配列および先導配列を含有する。ま ず制限エンドヌクレアーゼＮｒｕｌによるｐＪＬＡ１６の消化により発現プラス ミドｐＪＬＢｏを生産した。消化後、ＢａａＨｌリンカ−を切断プラスミドに結 合させた。この処理はＢａｍＨＩ制限部位をｇｐ７０Ｒの発現に適当な翻訳読み 取りフレームにおけるＣ　バクテリア・リーダーの末端に置く。次に、全ての３ つの読み■ 取りフレームの翻訳ターミネータ−を含有する合成オリゴヌクレオチドをプラス ミドｐＢＲ３２２にクローニングし、次いでこれをＢａｍＨＩクローング部位背 後のｐＪＬＢｏにシャトル処理する。得られたプラスミドをｐＪＬＢＯＴと呼ぶ 。 ｇｐ７０に対し高い力価のウサギ抗血清を用いる誘導培養物の全ての蛋白質抽出 物のウェスタン・プロット法は約５５ｋｄのＦｅＬＶ蛋白質の存在を示した。こ の蛋白質はほぼ全てのｇｐ７０およびアミノ酸４０のｐ１５Ｅを含有する。 ｐ１５Ｅ由来のものを含まずにｇｐ７０配列を生成するクローンを発生させるに は、ｐｅｎｖ−１をまずＥｃｏＲＩで直線処理する。はぼ１ｏｏｂｐを各末端か らＢａ１３１エキソヌクレアーゼで除き、Ｂａ１ＩＩリンカ−を加え、ＤＮＡ断 片をＤＮＡリガーゼで再環状化した。組み換えクローンを選択し、ヌクレアーゼ 消化の程度およびＦｅＬＶ３２〜５０外被遺伝子内のＢ９１１１リンカ−の位置 を、Ｍ−１３／サンガー・ジデオキシ法および市販のキット（アメルシャム）を 用いるＤＮＡ配列決定により測定した。クローンｐＵｃ−Ｒ１６−１２はｇｐ７ ０コード域における５つのヌクレオチドの３゛末端で終結するＦｅＬ〜′配列を 有することが判明した。この３°末端の位置を第４図に示す。 ｐＵｃ−Ｒ６−１２のＢａｍＨ１／　Ｂｇｌｌｌ断片を単離し、ＰＬ発現ベクタ ーｐＪＬＢＯＴにサブクローニングし几。誘導により、ｇｐ７０に対する抗血清 と反応した約４５ｋｄの蛋白質を生産した。この蛋白質の完全なアミノ酸配列を 第７図に示す。得られたクローンをＲ１６−１２と呼ぶ。 プラスミドｐＪＬＢＯＴ中のｇｐ７０に対するウィルスゲノム配列を含有するエ シェリキア・コリ株Ｒ１６−１２を１９８６年５月２２日にアメリカン・タイプ ・カルチャー・コレクション（ロックビル、メリーランド州）に寄託し、寄託番 号６７１１９を得た。 エシェリキア・コリにおけるＦｅＬＶｇｐ９０の発現ＦｅＬＶｇｐ９０発現組換 えＤＮ発現口−ンの構成をプラスミドＦＥＡ−３２８１で開始した。ＦＥＡ−３ ２８１は、ゲノムクローン３２〜５０のＰｓｔＩ断片２ｋｂをＰ　ｔＪ　Ｃ−９ にサブクローニングすることで構成され、ＦｅＬＶ外被遺伝子のコード配列を有 する。ＦＥＡ−３２８１の制限地図を第３図に示し、プラスミドのＦｅＬＶ由来 部分の配列を第４図に示す。またＰＥＡ−３２８１をｇｐ７０Ｒおよびｇｐ７０ Ｒ−デルタ発現プラスミド生産用の出発物質として用いた。 ＦＥＡ−３２８１をＨｉｎｄＩＩ［で制限処理して３．３および５　、５　ｋｂ の２つのＤＮＡ断片を調製した。３　、３　ｋｂ断片を単離し、Ｔ　４　ＤＮＡ リガーゼを用いて再環状化した。得られたプラスミドをＰＥＡ−ｅｎｖ−５’と 命名した。 Ｆ　Ｅ　Ａ　−ｅｎｖ−５°をＢａ１Ｉで制限処理した。ＢａｍＨＩリンカ−を 加え、プラスミドを再環状化し１；。このプラスミドをＦ　Ｅ　Ａ　−ｅｎｖ− ５゜−ＢＨと命名した。 Ｆ　Ｅ　Ａ　−ｅｎｖ−５’　−Ｂ　ＨはＨｉｎｄｎｌで切断し、ＦＥＡ−３２ ８１から生成し？＝１．５ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ断片を当初の配向てこの部位に サブクローニングした。このプラスミドはＥＮＶ−Ｌ−と命名した。 Ｅ　Ｎ　Ｖ−Ｌ−をＰｓｔｌで制限処理し、Ｂａ１３１！キソヌクレアーゼで短 かく消化させた。ＢｇＩＩｌリンカ−を加え、プラスミドを再環状化した。得ら れたプラスミドをＰＵＣ−ｇｐ９０と命名した。ＦｅＬＶ外被遺伝子におけるＢ ｇ１１１部位の位置はＤＮＡ配列決で測定した。 ＰＬ；Ｃ−ｇｐ９０のＢａｍＨＩ／ＢｇｌＩＩ断片２　、０　ｋｂを単離し、Ｌ ＣＢＣＯＯのＢａｍＨ１部位ｐにサブクローニングした。ｐＬｃＢｃＯＯはｐＪ ＬＢＯＴと同じである。ただし、ｐＬｃＢｃＯＯはバクテリオファージ・ラムダ ルＬ由来のＤＮＡ配列とバクテリオファージｃＩＩ由来のＤＮＡ配列の間のｐｖ ｕＩ［制限部位を含有する。このプラスミドをｐｃＢｃ。 Ｏｇｐ９０と命名した。発現はｇｐ７０Ｒおよびｇｐ７０Ｒ−デルタについてと 同じ方法で誘導した。ウサギ抗−ｇｐ７０抗血清と反応性の６５〜７０ｋｄの蛋 白質は誘導により生産した。この蛋白質はｇｐ９０Ｒと命名した６ｇｐ９０Ｒを コードする完全なりＮＡ配列および対応するアミノ酸配列は第８図に示した。 プラスミドｐＬＣＢＣＯＯ中○ｇｐ７０に対するウィルスゲノム配列を含有する エシェリキア・コリ株Ｒ１６−１２を１９８７年５月２８日付でアメリカン・タ イプ・カルチャー・コレクション（ロックビル、メリーランド州）に寄託し、寄 託番号６７４１２を得た。 組換えエシェリキア・コリ・クローンＲ１６−１２を、３２℃にて１％グルコー スおよび０．１％カサミノ酸で捕捉したＬＢ媒体中で増殖させて、０，４〜０． ６の光学密度（５６０ｎｍ）にし乙。次いで培養物を４２℃に移し、付加的に２ 時間インキュベーション後　この期間の終了時、細胞を４０００９ｘ３０分の遠 心分離で集め、５０ｍＭＥＤＴＡおよび５０ｒｒ、ＭＮａＣＱ含有５０ｔｎＭト リスＨＣｆｆ（ｐＨ７）で洗浄し、０．５％トリトンＸ−１００含有２５ｍＭ） リスＨＣｆｆ（ｐＨ７，５）中リゾチーム（ａ胞の５η／９）での酵素消化によ り溶解した。 細胞リゼイトを次いで３０分ｘｓｏｏｏｏ９の沈降法で分別した。 細胞ペレットを５０ｍＭ＼４ｇＣ（ｂおよびｐＮａｓｅＩ（細胞０　、１２９／ ９）含有５０ｍＭトリスＨＣｌ２（ｐＨ７，５）中に再９濁しｎ０時々かく拌し ながら３０分間の室温でのインキュベーション後、懸濁液を６０００９Ｘ３０分 の遠心処理し、ペレットを０．５ＭＮａＣｌ２．０．５％トリトンＸ１００．２ ５ｍ＼４　ＥＤＴＡおよび１％ベーターメルカプトエタノール含有２５ｍＭトリ スＨＣｆｆ（ｐＨ７，５）で２回洗浄した。この処理ののち、０．５ＭＮａＣ＜ ’および２５ｍＭＥＤＴＡ含有２％５１１１ＭトリスＨＣρ（ｐＨ７，５）中４ Ｍ尿素で２回洗浄した。この過程で得られたペレットは９０％以上のエシェリキ ア・コリＲ１６−１２発現組換え蛋白質を含んでいた。ゲル電気泳動による分析 は、ｇｐ？’ＯＲ蛋白質が部分的に精製され凝集形でバクテリア封入体中に存在 することを示した。この物質は６０〜８０％のｇｐ７０Ｒ蛋白質からなり、該物 質の残りはバクテリア蛋白質として存在した。この物質をプリバレイジョン■と 命名した。 ｇｐ７０Ｒの第２の調製（プリバレイジョン■）をプリバレイジョンＩで始め、 増殖した。組換え蛋白質ペレットのプリバレイジョンＩを、６Ｍ尿素および１％ ベーターメルカプトエタノールの存在下に５０１１１Ｍ）リスＨＣρ（ｐＨ９， ０）中に洗浄ペレットを再懸濁させることで、溶液にした。懸濁液を１０’９Ｘ ３０分の遠心分離で清浄化した。 遠心分離後の上澄みをセファローズＣＬ−４Ｂカラム（６Ｍ尿素および１ｍＭベ ーターメルカプトエタノール含有５０ｍＭ）リスＨＣ（（ｐＨ９，０）で平衡） に適用して、ｇｐ７０Ｒブリバレイジョン■を精製した。室温にて同じ緩衝液で カラムを溶出させた。フラクションを集め、５ＤＳ−ゲル電気泳動によりｇｐ７ ０Ｒの存在について調べた。 抗原含有フラクションをプールし、一連の緩衝液に対し４℃で透析した：第１； ４Ｍ尿素含有５０ｍＭ）リスＨＣＮ（ｐＨ７，７）１０容量、第２：２Ｍ尿素含 有緩衝液ｌＯ容量、第３　、１　Ｍ尿素含有緩衝液ｌＯ容量および第４；尿素非 含有の緩衝液１００容量。透析の完了後、約５０％のｇｐ７０Ｒが５０ｍＭトリ スＨＣ（（ｐＨ７，５）中に溶けたままであった。プリバレイジョンＩのｇｐ７ ０Ｒとは異なり、プリバレイジョン■のｇｐ７０Ｒは凝集形では存在しないこと が判明した。 プリバレイジョン■に存在する凝集形のｇｐ７０Ｒと、プリバレイジョン■の可 溶性、非凝集形のｇｐ７０Ｒをネコに用いてＦｅＬＶに対する抗体を生産した。 組換えエシェリキア・コリ・クローンＲ１６−３８を１％グルコースおよび０． １％カサミノ酸添加ＬＢ媒体中、３２℃で増殖させて０．４〜０．６の光学密度 （５６０ｎｍ）にした。次いで培養物を４２℃に移し、付加的に２時間インキュ ベートした。この期間の終了後、細胞を４０００９Ｘ３０分の遠心分離で集め、 ５０ｍＭ）リスＨｃＱ（ｐＨ７，５）で洗浄し、最後に、イソプロパツール中０ ．１Ｍフェニルメチルスルホニルフルオライド１ｇ（（最終濃度０．５ｍＭ）お よび５ｘｇ／πｇアプロチニン０．４πＱ（最終濃度１Ｏ００μｇ／ｘ（１）を 添加した５０ｍＭ）リスＨＣｌ２２００ｘＱ中に、再懸濁させた。０．２％トリ トンＸ−１００の存在下のリゾチーム（最終濃度０　、５　ｊ１ｇ／　１１２） による酵素消化により、細胞を溶解した。３０分の撹拌後、０　、５　ＭＭｇＣ （ｉｔ　２ｘ（ｌＳＩＫ９／ｚｆｆＤＮａｓｅＩ　５２１２および０．ｌＬｙ工 ＝ルメチルスルホニルフルオライド１１ＩＣを加えた。３０分の付加的な撹拌後 、ＥＤＴＡ（０゜２５Ｍ％ｐＨ７，５）４０好およびトリトンＸ−１００（１０ 容量／重量％）４ｙ、ｆｆを加えん。調製物の１０００１００Ｏ０分の遠心分離 を４℃で行ない、ベレットを５０ｍＭ）リスＭＣＩ（ｐＨ７，５）５０ｍｌ！中 に再懸濁した。ベレットを低速で１５分間均一にした。リゾチームを濃度０　、 ５　ｗｇ／ｘＱに加え、１０％トリトンＸ−１００（０，６ｘＩ２）を加えた。 １５分の撹拌後、ＭｇＣ（！ｔ（０、５Ｍ）　１０　ｚｏおよびｌ）　Ｎ　ａｓ ｅｌ　（１１Ｒｇ／１１２）　１　ｘＯを加え、撹拌を付加的に１５分間続けｙ ：０５０ｍＭトリス（ｐＨ９、０）で３００Ｈの容量に調節後、ｌＯ％トリトン Ｘ−１００（４０ｘＱ）およびＥＤＴＡ（０，２５Ｍ％ｐＨ７，５）５１．２π Ｑを加えて最終容量を５０ｍＭ）リス（ｐＨ９、０）で４００Ｚ１２に調節した 。撹拌３０分後、懸濁液を１００００９ｘ３０分、４℃で遠心分離し、ベレット を４Ｍ尿素、５０ｆｌｉＭＥＤＴＡおよび１％トリトンＸ−１００含有５０ｍＭ ）リスＨＣ（！（ｐＨ７，５）４００ｘ（ｌに再懸濁した。１５分の撹拌後、上 澄液を１００００９Ｘ３０分、４℃で遠心分離し、ベレットを１．０Ｍ　ＮａＣ （含有５０ａＭ）リスＨＣｆｆ（ｐＨ７。 ５）４００ばに再懸濁し几、１５分の撹拌後、懸濁液を１００００９×３０分、 ４℃で遠心分離し、ベレットを６Ｍ尿素および５ｍＭＥＤＴＡ含有５０ｍＭトリ スＨ（Ｊ！（ｐＨ７，５）４００πｇに再懸濁した。１５分の撹拌後、懸濁液を １００００９Ｘ３０分、４℃で遠心分離しベレットを６Ｍ尿素および５ＩｒｉＭ ＥＤＴＡ含有５０１Ｍ　トリスＨＣＩ（ｐＨ７，５）４００πＱ中に再懸濁した 。１５分の撹拌後、懸濁液を１００００９ｘ３０分、４℃で遠心分離し几。この 時点で、包接体のベレットを将来の使用のために凍結するかまたは６Ｍグアニジ ンＨＣＱ、　５０ｉＭ　ＥＤＴＡおよび０．５％ベーターメルカプトエタノール 含有３０ｍＭ）リスＨＣ（中に溶解しに。ｇｐ７０Ｒ−デルタポリペプチドを次 いて実施例６まｋは以下の方法で精製した。 実施例５の可溶化蛋白質を６Ｍ尿素、５０ｍＭトリス−０ｆｆ（ｐＨ８。 ０）、５０＋ｎＭ　ＥＤＴＡおよび１ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）に対し 透析した。約１２０Ｈの蛋白質をＣＭ−ＴＳＫカラム（ＥＭサイエンス、１　、 ５　ｃｔｂ　Ｉ　Ｄ　Ｘ　４１．同じ緩衝液で平衡）に適用した。 蛋白質を同じ緩衝液中ＮａＣｆｆ（０〜１　、０　Ｍ、１５０ｍ［）の直線こう 配で溶出した。フラクションを集め、１０％ＳＤＳ・ポリアクリルアミドゲルに よる電気泳動で透析した。ゲルのクーマツシー・ブルー染色をｇｐ７０Ｒ−デル タ蛋白質の同定に用いた。約０．ＩＭ　ＮａＣｆｆで溶出するフラクション２５ 〜３１をプールし、免疫に用いた。 万歳１ ｇｐ７０Ｒ−デルタの疎水性の減少のために、スルヒドリル基をインドアセトア ミドでアルキル化し、リジン残基をシトラコン酸無水物でＮ−アルキル化した。 実施例５で調製した蛋白質を５０ｍＭボレー）　（ｐＨ９、０＞および０．５％ ベーターメルカプトエタノール（Ｖ／Ｖ）含有６ＭグアジニンーＨＣｆｆ中に溶 解した。インドアセトアミドをモル比１：１（インドアセトアミ臼全てのスルフ ヒドリル基）で加えた。アルキル化を暗室に２１時間、室温で行った。蛋白質お よびベーターメルカプトエタノールにおける全てのスルフィドリル基のアルキル 化をＤＴＮＢ（エリマンの試薬）でモニターして完全なアルキル化を確実にした 。蛋白質濃度を２ｍｇ／ｍｊに調節した。 蛋白質を暗所にて、シトラコン酸無水物（０，００２２ｍ１２／蛋白質Ｉ　Ｂ、 遊離リジンよりも約５０モル過剰）でシトラコニル化した。 調製物を数回、暗所にて５０ｍＭボレート（ｐＨ９，０）で透析した。 蛋白質リジン基のアシル化の完了を残りの遊離リジン基を測定するトリニトロベ ンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）との反応により測定し１こ。 ＴＮＢＳ（２００ｕＱ１１０ｍＭ）を５０ｍＭホウ酸ナトリウム（ｐＨ９。 ０　）　Ｉ　ｍＱ中アルキル化しシトラコニル化し透析し？＝ｇｐ７０Ｒ−デル タ２００μｇに加えた。混合物を暗所にて４０℃で２時間インキュベートし、反 応を０　、５　ｍＱのＩＮ　ＨＣＣおよび０．５ｍＱの１％ＳＤＳでクエンチン グし、３４０ｎｍの吸光度を読み取った。ＴＮＰ−リジンのモル吸光度係数（３ ４０ｎｍ）は１０４０００である。 アルキル化しシトラコニル化したｇｐ７０Ｒ−デルタの精製はリジン基の脱ブロ ツク化を防止すべくｐＨ９，０にて行った。最終濃度４Ｍの尿素を修飾蛋白質に 加えた。蛋白質を３ｍｇ／ｍρに、限外ろ過により濃縮し、セファローズ６Ｂ− Ｏｆｆカラム（１，５Ｘ８６ｃｍ）に適用した。ｇｐ７０Ｒ−デルタ蛋白質を流 速６．６ｍａＺ時にて４Ｍ尿素、５０ｍＭホウ酸ナトリウム（ｐＨ９，０）で溶 出した。５　、３　ｍＱの各フラクションを集め、フラクション１３〜１５中の ｇｐ７０Ｒ−デルタをたん自分析および５ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動に より測定した。 ｇｐ７０Ｒ−デルタのシトラコニル化を、アルキル化しシトラコニル化したｇｐ ７０Ｒ−デルタ（１，０ｍｇ／ｍＱ）５ｍ（を５０＋ｃＭクエン酸ナトリウム（ ｐＨ５、５）中６Ｍ尿素に対し４８時間室温で透析することにより逆転させた。 ｇｐ７０Ｒ−デルタを１００ｍＭ重炭酸ナトリウム（ｐＨ８，０）中６Ｍ尿素に 対し透析し、蛋白製置を水酸化アルミニウムへの吸収前に０　、８　ｍｇ／　ｍ ＱＩ＝　Ａ節した。 方法■ アルキル化しシトラコニル化しｙ：ｇｐ７０Ｒ−デルタの前記精製の変法を開発 した。概説すれば、アルキル化しシトラコニル化したｇｐ７０Ｒ−デルタを前記 したように修飾し、５０ｍＭホウ酸ナトリウム（ｐＨ９，０）に対し透析した。 尿素を加えて最終濃度８．０Ｍにした。蛋白質をＰＭ−３０膜の限外ろ過により 濃縮して蛋白質２．５ｍｇ／ｍ０を得乙。蛋白質溶液をセファクリルＳ−４００ カラム（１，５ｘ　９０　ａｍ）に８Ｍ尿素含有５０＋ｎＭホウ酸ナトリウム緩 衝液（ｐＨ９。 ０）中にて適用し、同じ緩衝液で溶出した。２　、９　ｍＱの各フラクションを 集め、ｇｐ７０Ｒ−デルタ含有フラクション３４〜３７をプールした。これらの フラクションの蛋白質２１ｍｇを最終濃Ｉｆ　４　Ｍ尿素に５０ｍＭホウ酸ナト リウム（ｐＨ９，０）で希釈し、ＤＥＡＥ−ＴＳＫカラム（１，５Ｘ　１１ｃｍ ）に適用しｊ：ｃ４Ｍ尿素含有５０ｍＭホウ酸ナトリウム（ｐＨ９，０）中５ａ Ｃ（（ ０〜０．５Ｍ）の直線こう配で溶出しｆ二。３ｍ１２のフラクションを集めにｅ ｇｐ７０　Ｒ−デルタ含有フラクション８９〜９５をプールし、ｇｐ７０Ｒ−デ ルタ１５Ｂを回収しに。 概説すれば、キラヤ・サボニカ・モリナ樹皮の水性抽出物を水で透析しｆこ。透 析した抽出物をメタノールで抽出し、メタノール可溶性抽出物をさらにシリカゲ ル・クロマトグラフィおよび逆相高圧液体クロマトグラフィ（ＲＰ−ＨＰＬＣ） により分別した。個々のサポニンは逆相ＨＰＣＬで９雌した。屈折率により検出 可能な少なくとも２２のピーク（ＱＡ−１〜ＱＡ−２２と呼ぶ）がわかれた。各 ピークは炭水化物ピークに相当し、逆相薄層クロマトグラフィ上に単一のバンド だけを示した。各成分はｖｙｄａＣＣ４ＨＰＬＣカラム上の保持時間により以下 のように同定した。 ピーク　保持時間（分） ＱＡ−１溶媒前線 ＱＡ−７９，６ ＱＡ−８１０，６ ＱＡ−９１３，０ ＱＡ−１０１７，２ ＱＡ−１１１９，０ ＱＡ−１２２１，２ ＱＡ−１３２２，６ ＱＡ−１４２４，０ ＱＡ−１５２５，６ ＱＡ−１６２８，６ ＱＡ−１７３５，２ ＱＡ−１８３８，２ ＱＡ−１９４３，６ ＱＡ−２０４７，６ ＱＡ−２１５１，６ ＱＡ−２２６１，０ サポニン活性を示す溶血活性のフラクションをＲＰ−ＨＰＬＣにより再度クロマ トグラフィに付した。免疫アジュバント活性を精製サポニンの活性測定によりテ ストして、外因性投与抗原に対するネズミにおける免疫応答を向上させた。精製 サポニンは粗製抽出物よりも低い用量でアジュバント効果が証明された。とくに 、樹皮抽出物中の主要なサポニン（ＱＡ−７、ＱＡ−１７およびＱＡ−１８）は 炭水化物４．５μｇ以下の用量でアジュバント活性を示した（アンスロンにより 分析）ｅ精製サポニンはさろに炭水化物含量、逆相および正常相ＴＬＣＳＵＶお よび赤外スペクトルにより特徴付けろれた。 ミリグラム容量のＱＡ−７、ＱＡ−１７およびＱＡ−１８は以下に記載の方法に よりスーパーホス（Ｓ　ｕｐｅｒｆｏｓ）Ｑｕｉ１２−　Ａから精製しｒ：０１ ｇ＋７）Ｑｕｉｆｆ−Ａをメタノール７５＋ｎｆｆに懸濁し、６０℃で１５分間 加熱し、ろ過した。未溶解物質を２回、６０℃のメタノール５０ｍ１２で抽出し 、ろ過した。３液をロータエバポレイターで蒸発乾固した。リクロブレプ・シリ カ５ｉ６０カラム（イー・エム、サイエンス、Ｉ　Ｄ　２５ｍｍＸＬ　３１０ｍ ｍ、粒径４０〜６３μｍ）をクロロホルム／メタノール／水（６２／３２／６、 ｖ／ｖ／ｖ）中４０ｍＭ酢酸で予め平衡にした。 乾燥したＱｕｉ（−、Ａを５ｍ（のカラム溶媒に溶解し、シリカを介し均等にこ の溶媒システム中に流速１＋＋＋ｆ／分て溶出させた。炭水化物分析、薄層クロ マトグラフィおよびＨＰＬＣを用いてＱＡ−７、ＱＡ−１７およびＱＡ−１８に ついてフラクションをモニターした。 フラクション６０〜９０はＱＡ−８およびＱＡ−１８か非常に豊富で、他方１５ ０〜１９０はＱＡ−７およびＱＡ−１７か豊富であった。ここ口のフラクション をプールし、フラリシュ蒸発させ、その後メタノールこう配を用いｖｙｄａｃ　 Ｃ４上のＲＰ−ＨＰＬＣにより純粋なアジュバントを溶出させる付加的な精製を 行った。 年齢６〜８週の１０匹の子ネコを免疫化実験に用い１；。免疫化前に、全ての動 物をＦｅＬＶ抗体についてテストし、陰性であることかわかった。 動物を２つの群に分け、実施例３記載のように調製したｇｐ７０Ｒプリバレイジ ョンＩまたはｇｐ７０プリバレイジョンＨのいずれかで免疫化した。両群の動物 をフロイント完全アジュバント中に乳化した適当なｇｐ７０Ｒ調製物１００μｇ で免疫化した。動物を２１日間隔で３回の非経口投与により免疫化した。最後の 免疫化ののち２１日経過後、両群の動物を該動物−匹当りネコ・サルコマ・ウィ ルス（ＰｅＳＶ）４００で抗原投与した。 各免疫の後、各動物をＦｅＬＶに対する抗体レベルおよびＦｅＬＶに対する中和 抗体について測定した。Ｆｅ５Ｖの抗原投与ののち１４〜２１日経過後、抗体テ ストに加え、動物を血清中のウィルスの存在および腫瘍形成について調べた。血 清中ウィルスの存在はウィルス滴定（デノロンハら、ジャーナル・オブ・ザ・ナ ショナル・キャンサー・インスティチュート、５８巻、１２９〜１３０頁、１９ ７７年）およびＦｅＬＶの抗原群（ｐ２７）に対し特異的な抗体（これはまたＦ ｅ５Ｖに対し正常である）を用いるＥＬ　Ｉ　ＳＡにより測定した。 この実験結果を第１表に示す。 実験を通して生存していた両群の７匹全ての動物がｇｐ７０Ｒに対する抗体を生 成したが、プリバレイジョンｌで免疫化した群１の動物だけがＦｅ５Ｖによるウ ィルス抗原投与に対し、明白な程度の抵抗性を示しｉ＝、ＦｅＬＶ中相可能な抗 体を生産する動物の能力は、腫瘍およびウィルス血症の発病、進行に対し抵抗性 を示す動物の能力に直接関係する。 ウィルス　ウィルス 抗原抗与前腫瘍の　の存在　中和（ｂ）ワクチン　ネコ抗体力価　存在　力価（ ａ）　ＥＬＩＳＡ　１：２（ｃ）　１：４ＰＲＥＰＩ　１１　４００　０　１＋ 　０　０２２　４００　０　Ｑ　０　５０　５ ２５　８００　０　０　０　９９　９Ｂ３２　８００　◆　３３０３◆　００ ＰＲＥＰＩＩ　１２　１６００　◆　３００　３＋ＯＯ１３−死亡　−−ｍ− ２１８００９３＋　ＯＯ ２：（４００＋　２００　３＋　０　０３１　８００　＋　１００　３−　０　 ０注）ａ：フォーカス形成単位 ｂ：　％ ｃ：：血清希釈 実施例９ 多数の蛋白質に対しアジュバント効果を示すことが知られ通常ワクチンに使用さ れている水酸化アルミニウムをｇｐ７０Ｒ−デルタの担体として使用し几。前記 実施例６の方法■により調製し几ｇｐ７０Ｒ−デルタは６Ｍ尿素含有５０ｍＭ） リス−Ｃａの存在下の１０％水酸化アルミニウムに緊密に吸収し乙。水酸化アル ミニウム１００μｇに対し約３μｇのｇｐ７０Ｒ−デルタが吸収した。水酸化ア ルミニウムに吸収しにｇｐ７０Ｒ−デルタをリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ） で洗浄し、ＰＢＳに再懸濁し、動物の免疫化に用いに。 ＣＤ−１マウス（８〜１０週令）をＨＰＬＣ−精製サポニンＱＡ−１７もしくは ＱＡ−１８まにはＱＡ−１７とＱＡ−１８の混合物の存在下まには不存在下、全 容量２００μＣのＰＢＳ中Ａ＜！（ＯＨ）３に吸収しｙ：ｇｐ７０Ｒ−デルタて 経皮的に免疫化した。各用量当り２０〜２５μｇのｇｐ７０Ｒ−デルタを注入し 几。ＨＰＬＣ精製サポニすＱＡ−１７もしくはＱＡ−１８またはＱＡ−１７とＱ Ａ−１８０混合物は乾燥型１１０μｇで用いに。各処法について２匹のマウスに 注入した。初期の注入後６週目にてｇｐ７０Ｒ−デルタ／水酸化アルミニウムの 追加抗原刺激注入を２匹のマウスに行っ１ニ。免疫後２．４および８週目におい て、マウスの血清をＦＥＡ、ＦｅＬＶサブグループＡに対する活性についてＥＬ ＩＳ、Ａイムノアッセイにより分析した。免疫後４週目において、ｇｐ７０Ｒ− デルタにより引き起こされｆ二抗−ＦｅＬＶ応答が観察されに。ＨＰＬＣ精製サ ポニン・アジュバントＱＡ−１７およびＱＡ−１８はこの応答を増加させた。 応答はサポニン不存在下の免疫化と比較してＱ、Ａ−１７の存在下、免疫後６週 の時点でより大きい２ケタのオーダーであった。この実験の結果を第１０図に示 す。 抗−ＦＥ、Ａ　ＩｇＧはＥＬＩＳＡアッセイで分析しに。ＦＥＡウィルス（ＰＢ Ｓ中１０μｇ／　ｍ□をイムロン■プレートを一夜４℃で吸収させた（１００μ Ｃ／ウエル）。プレートをＰＢＳで洗浄し、非特異的ＩｇＧ結合を、室温にてＰ ＢＳ中１０％正常ヤギ血清で１時間インキュベートすることにより（１００μＣ ／ウエル）遮断した。次いでプレートを蒸留水中０．０５％ツイーン−２０で洗 浄した。血清をＰＢＳ中ｌＯ％正常ヤギ血清で希釈し、血清希釈１０，１０’、 １０３および１０４にてプレート上室温で１時間インキュベートした（１００μ ｇ／ウェル）。蒸留水中０．０５％ツイーン−２０でプレートを洗浄した後、こ れらを３０分間室温にて、ＰＢＳ中に１１５０００で希釈したペルオキシダーゼ 接合ヤギ抗−マウスＩｇＧ１００μａ／ウェル（ボーエリンガー・マンハイム） でインキュベートした。蒸留水中０．０５％ツイーン−２０でプレートを洗浄し た後、ＩｇＧの量を、３．３°、５，５°−テトラメチルベンジジンとのペルオ キシダーゼ反応によるグイナテック・マイクロタイター・プレート・リーダー測 定の吸光度（４５０ｎｍ）から測定した。 実施例１０ 水酸化アルミニウム吸収Ｇｐ７０Ｒ−デルタによる免疫化ＣＤ−１マウス（８〜 １０週令）をＰＢＳ　２００μＣ中、実施例６の方法Ｈにより精製し１ニアルキ ル化ｇｐ７０Ｒ−デルタ（実施例６記載の水酸化アルミニウムに吸収）１５μｇ ／用量で経皮的に免疫化した。ＨＰＬＣ精製アジュバントＱＡ−７、ＱＡ−１７ 、ＱＡ−１８およびこれら３つのアジュバント混合物は乾燥重量１０μｇで用い た。各処法について３匹のマウスに注入した。免疫後２および３週目において、 マウスの血清を実施例９記載のようにＦＥＡに対する活性についてＥＬＩ　ＳＡ により分析しに。第９図に示した非修飾ｇｐ７０Ｒ−デルタによる免疫化と同様 に、アルキル化ｇｐ７０Ｒ−デルタによる免疫化は４週後の免疫により抗−Ｆｅ ＬＶウィルス応答を増加させた。ＨＰＬＣ精製アジュバントＱＡ−７、ＱＡ−１ ７、ＱＡ−１８は、全てサポニンアジュバント不存在下の免疫化と比較して免疫 応答を増加させた。ＱＡ−１７およびＱＡ−１７とＱＡ−１８の混合物は最も高 い応答を誘発し、サポニンアジュバント不存在下の免疫化よりも大きい、はぼ２ ケタオーダーの終点力価を誘発し１こ。二メ一ろの実験結果を第１１図にまとめ ｆ二。 以上本発明の詳細な説明してきにが、以下に記載の本発明の範囲および精神を逸 脱することなく多くの変形例や改良例をなすことは当業者には明らかである。 国際出願 微生物 本明細書の７頁１４行に言及しｆ二微生物に関する任意の書面Ａ、寄託の証明 寄託施設の名称 アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション寄託施設の住所 米国、メリーランド州２０８５２、ロックビル、パークラウン、ドライブ、１２ ３０１番 寄託臼　寄託番号 １９８６年５月２９日　ＣＲＬ　９１１６Ｂ、付加的な表示 セルライン、ＦｅＬＶ−３２８１ 国際出願 微生物 本明細書の１６頁３２行に言及しに微生物に関する任意の書面Ａ、寄託の証明 寄託施設の名称 アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション寄託施設の住所 米国、メリーランド州２０８５２、ロックビル、パークラウン、ドライブ、１２ ３０１番 寄託臼　寄託番号 １９８７年５月２２日　６７４１１ Ｂ、付加的な表示 エシェリキア・コリ、Ｒ１６−３８（プラスミド・ｐＪＬＢＯＴ）国際出願 微生物 本明細書の１８頁１８行に言及し乙微生物に関する任意の書面Ａ、寄託の証明 寄託施設の名称 アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション寄託施設の住所 米国、メリーランド州２０８５２、ロックビル、パークラウン、ドライブ、１２ ３０１番 寄託臼　寄託番号 １９８６年５月２２日　６７１１９ Ｂ、付加的な表示 エシェリキア・コリ、Ｒ１６−１２ 国際出願 微生物 本明細書の１９頁３２行に言及した微生物に関する任意の書面Ａ、寄託の証明 寄託施設の名称 アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション寄託施設の住所 米国、メリーランド州２０８５２、ロックビル、パークラウン、ドライブ、１２ ３０１番 寄託臼　寄託番号 １９８７年５月２８日　６７４］２ Ｂ、付加的な表示 工’／ｘリキア・コリ、Ｒ１６−１２（プラスミド、ｐＬｃＢＯｏ）第１図 外来性ＦｅＬＶプローブ 第２図 側面に位置する 細胞性Ｄ　Ｎ　Ａ配列 ＦｅＬＶ　：　８．８ｋｂ　ＦｅＬＶ　ＤＮＡ配列 Ｆｉｇｕｒｅ３ ．０　−　１）　；　石　； −−１″Ｕ　円　− Ｌｊ　（ｊ−Ｉｄ二　■し　ζコ　←コζ　←−く−　−二　Ｉ−ｏ、ＩＬ：１ μζ　ＬＯ）　（ｊＬ）　ζ→　■−−く−ζコ　ＬｊＩ／Ｉ　■−■Ｑ　ζ１ ←　Ｉ−■　ζ−Ｌｊ−（１：　ｕｎ　Ｌ）−＜ζ　←−Ｃｊ：！：　Ｃ−り（ １：　Ｌ）ζ　ＯζＬｊＬｊ　二　く　ロ　←　口　←−ＬＪ’Ｉ　ＣＬ：３　 ：８−一　ζい　Ｌ−）μ　ζい　Ｌ）＞　（ｊ−トー　ζ　（ＣＬＪＣＬ　ζ 　く：　←−Ｌｊ　ＣＤ　Ｌ）ロフ　←　−−Ｌｊ＋−ｏ　ＬＪＣト吻　ｔロ　 ←−Ｃ：ζ　Ｌ）＋ｃ　ｕ−ζ　い　Ｃ１−ζ　いＵ（ｌ：Ｉ−＋Ｏｃｒ、ζく 　ｕ工　ζくＵ　■い　こ−　←−くコ　―− 一　ζ　＼　←　ＱＪ　Ｌｊｊ　←　ＣＬＩＣＪニー　ζ−く＝　ζ−−一　ζ ←− 一　←　Ｕロ　ζｃｕ　Ｃｒｗ　Ｃ４ｔｖ　Ｌｊ　−ＣＪＬｊ＋−１−、−ｍ　 ＬＪｊ　ＬＪ、−１−ｆｆｉの　Ｌ）　−良　ζ−ζ←　０ζ　０〉−ζ口　０ ＞　ζ−（Ｃ：、ＬＪμ ζ　Ｌｊ−０−←−■−一　−よ： ζ　−ＣＬ　■０　０〉　０■　ζ←−−＋−―　■−→口　ζコ　０ロ ｃＪＬ）Ｑ、Ｉ＋−−ζ　Ｌｎ　ｌ−■　ζＩｎζ　この　０〉　ζζ　→−Ｃ ζ ０　ζコ　０フ　←し　ＬＤ−ζ；Ｎ Ｏζ−←　■　ζ　ンＮ　←　印　〇−（ＣＬ）Ｌ）　Ｃ＃−←→ｅ：ｃｘ＝　 ｃｗｒｗｏ　■−Ｓ−■　ζＱｌ　＋−ｙ−Ｌ）　−〇　→ＣＬＪト：　←−− Ｃυ　←− →　ζ＝１−＋ユ　ζ−→ＣＪｉ　Ｌ）：：ＴｈＣｕ　Ｏ）　：ｌ；”　Ｅ　４ フ　ｎｐζ　ζ　１つ　一つ　一つ　さ ロコ　−　ζ　〉−ζ　〉Ｎ　）−−ζ　〉Ｎ　Ｉ−−ζ−と−　Ｌ）　−Ｌ） ■　じ−　ζさＣ＋）　ヒフ　ＣＤ　ＣＤ　ＣＤ　ＣＤ　ζ　Ｃ＋１″）　口コ 　ヒフ　トー　トーζ　Ｌｎ　ζ　ｃｓＣ）ｗ　こウ　〉Ｎ　ＣＤ　ｅ：　（Ｘ 　ｗ−ζメ　−Ｉ−一：０−　ζ−Ｕ二 ζ−−工　ζト　００−こ　ζＨ− →ユ　０コ　→−ζＩ＋ｌ＋１　じ■　−μζＬｎ　→Ｉ：ＬＩＯメ　ζ洲　→ 二　ζ；−０ζ　−Ｊ　＋−−一　ζ−←ユ　←−ζ１−Ｌ）％−ζメ　ζ−〇 二　ζコ ■ｊ　ＬＪＱＪ　ロー　←−ζ−←■ ζ→　←ＣＪ”）　■０　じン　−０−−ｉ口　≦＝　＝；　ｆ窩　冒ｇ　冒呂 ヒｊ　ロー　ヒ」　二フ　ヒフ　〉　ヒフ　〉　ヒｊ　−く口　ζ

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Claims (59)

【特許請求の範囲】
1. （１）ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）のｇｐ７０−含有蛋白質のアミノ酸配列 を含む組換え体ポリペプチド。
2. （２）実質的に天然グリコシル化を含まないネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）の ｇｐ７０−含有蛋白質のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
3. （３）実質的に純粋形である請求項２記載のポリペプチド。
4. （４）約４５キロダルトンの分子量を有する請求項１、２または３記載のポリペ プチド。
5. （５）約５５キロダルトンの分子量を有する請求項１、２または３記載のポリペ プチド。
6. （６）約６５−７０キロダルトンの分子量を有する請求項１、２または３のいず れか１項記載のポリペプチド。
7. （７）上記ｇｐ７０−含有蛋白質がＦｅＬＶサブグループＡのものである、請求 項１または２記載のポリペプチド。
8. （８）上記ＦｅＬＶサブグループＡがセルライン３２８１から分離された遺伝子 によりコードされるものである、請求項７記載のポリペプチド。
9. （９）アミノ酸配列が第７図に示された核酸配列７７６−２００４によりコード されたものである、請求項２記載のポリペプチド。
10. （１０）アミノ酸配列が第７図に示された核酸配列によりコードされたものであ る、請求項２記載のポリペプチド。
11. （１１）アミノ酸配列が第６図に示された核酸配列７７６−２０４６によりコー ドされたものである、請求項２記載のポリペプチド。
12. （１２）アミノ酸配列が第６図に示された核酸配列によりコードされたものであ る、請求項２記載のポリペプチド。
13. （１３）アミノ酸配列が第８図に示された核酸配列によりコードされたものであ る、請求項２記載のポリペプチド。
14. （１４）アミノ酸配列が第８図に示された核酸配列７７６−２６０１によりコー ドされたものである、請求項２記載のポリペプチド。
15. （１５）ＦｅＬＶのｇｐ７０−含有蛋白質をコードするＤＮＡ配列を含む発現ビ ークル。
16. （１６）発現ビークルが、 ａ）複製開始点、 ｂ）プロモーター、および ｃ）ネコ白血病ウイルスのｇｐ７０−含有蛋白質をコードするＤＮＡ配列 を操作可能な連鎖状態で含む、宿主において複製可能なプラスミドである、請求 項１５記載の発現ビークル。
17. （１７）発現ビークルが、 ａ）原核生物複製開始点、 ｂ）原核生物プロモーター、および ｃ）ネコ白血病ウイルスのｇｐ７０−含有蛋白質をコードするＤＮＡ配列 を操作可能な連鎖状態で含む、原核生物宿主において複製可能なプラスミドであ る、請求項１６記載の発現ビークル。
18. （１８）ＤＮＡ配列がネコ白血病ウイルスのｇ９７０Ｒ−デルタをコードする、 請求項１７記載の発現ビークル。
19. （１９）ＤＮＡ配列がネコ白血病ウイルスのｇｐ７０Ｒをコードする、請求項１ ７記載の発現ビークル。
20. （２０）ＤＮＡ配列がネコ白血病ウイルスのｇｐ９０Ｒをコードする、請求項１ ７記載の発現ビークル。
21. （２１）ＦｅＬＶサブグループＡのＤＮＡ配列によりコードされた請求項２記載 のｇｐ７０−含有蛋白質。
22. （２２）ＦｅＬＶサブグループＡのＤＮＡ配列がセルライン３２８１から分離さ れたものである、請求項２１記載のｇｐ７０−含有蛋白質。
23. （２３）ＤＮＡ配列が第７図に示された配列７７６−２００４を含む、請求項２ ２記載のｇｐ７０−含有蛋白質。
24. （２４）ＤＮＡ配列が第６図に示された配列７７６−２１３４を含む、請求項２ ２記載のｇｐ７０−含有蛋白質。
25. （２５）ＤＮＡ配列が第８図に示された配列７７６−２６０１を含む、請求項２ ２記載のｇｐ７０−含有蛋白質。
26. （２６）ｇｐ７０−含有蛋白質をコードするＤＮＡ配列を有するプラスミド。
27. （２７）ＤＮＡ配列が第７図に示された核酸配列を含む、請求項２６記載のプラ スミド。
28. （２８）ＤＮＡ配列が第６図に示された核酸配列を含む、請求項２６記載のプラ スミド。
29. （２９）ＤＮＡ配列が第８図に示された核酸配列を含む、請求項２６記載のプラ スミド。
30. （３０）プラスミドが受託番号ＡＴＣＣ６７４１１を有するプラスミドＲ１６− ３８である、請求項２６記載のプラスミド。
31. （３１）プラスミドが受託番号ＡＴＣＣ６７１１９を有するプラスミドＲ１６− １２である、請求項２６記載のプラスミド。
32. （３２）プラスミドが受託番号ＡＴＣＣ６７４１２を有するプラスミドｐＲｇｐ ９０である、請求項２６記載のプラスミド。
33. （３３）ＦｅＬＶ由来のｇｐ７０−含有蛋白質をコードするＤＮＡ配列を含む組 換え体ＤＮＡ分子により形質転換された宿主。
34. （３４）原核生物である請求項３３記載の宿主。
35. （３５）ＤＮＡ配列がＦｅＬＶサブグループＡに由来するものである、請求項３ ３記載の宿主。
36. （３６）ＤＮＡ配列がセルライン３２８１に由来するものである、請求項３４記 載の宿主。
37. （３７）遺伝子配列が第７図に示された核酸配列を含む、請求項３３記載の宿主 。
38. （３８）ｇｐ７０−含有蛋白質が第７図に示された核酸配列７７６−２００４に よりコードされたものである、請求項３３記載の原核生物。
39. （３９）遺伝子配列が第６図に示された核酸配列を含む、請求項３３記載の宿主 。
40. （４０）遺伝子配列が第８図に示された核酸配列を含む、請求項３３記載の宿主 。
41. （４１）組換え体ＤＮＡ分子がプラスミドである、請求項３３−４０のいずれか １項記載の宿主。
42. （４２）エシェリヒア・コリである、請求項３３記載の宿主。
43. （４３）ｇｐ７０−含有蛋白質の製造方法であって、ａ）ＦｅＬＶ由来のｇｐ７ ０−含有蛋白質をコードするＤＮＡ配列により宿主を形質転換し、 ｂ）遺伝子を発現させ、 ｃ）ｇｐ７０−含有蛋白質を回収する ことを含む方法。
44. （４４）宿主が原核生物である、請求項４３記載の方法。
45. （４５）ＤＮＡ配列がＦｅＬＶサブグループＡに由来するものである、請求項４ ３記載の方法。
46. （４６）ＤＮＡ配列がセルライン３２８１に由来するものである、請求項４５記 載の方法。
47. （４７）請求項２記載のポリペプチドの免疫原有効量を薬理学的に許容し得る担 体と共に含む、ＦｅＬＶに対する抗体のネコにおける生産の誘発に有用な医薬組 成物。
48. （４８）ポリペプチドがアグリゲートしている、請求項４７記載の医薬組成物。
49. （４９）薬理学的担体がアジュバントを含む、請求項４７または４８のいずれか １項記載の医薬組成物。
50. （５０）アジュバントがサポニンである請求項４９記載の医薬組成物。
51. （５１）サポニンがＱｕｉｌ−Ａから誘導されたものである、請求項５０記載の 医薬組成物。
52. （５２）サポニンが実質的に純粋形を呈している、請求項５０記載の医薬組成物 。
53. （５３）サポニンがＱＡ−７である、請求項５２記載の医薬組成物。
54. （５４）サポニンがＱＡ−１７である、請求項５２記載の医薬組成物。
55. （５５）サポニンがＱＡ−１８である、請求項５２記載の医薬組成物。
56. （５６）アジュバントが無機塩である、請求項４９記載の医薬組成物。
57. （５７）無機塩がＡｌ（ＯＨ）３である、請求項５６記載の医薬組成物。
58. （５８）アジュバントが無機塩およびサポニンを含む、請求項４９記載の医薬組 成物。
59. （５９）請求項４７、４８または４９のいずれか１項記載の医薬組成物を用いた ネコの免疫化を含む、ＦｅＬＶに対するネコにおける抗体生産の誘導方法。