PT842661E

PT842661E - Tratamento da aterosclerose

Info

Publication number: PT842661E
Application number: PT97308862T
Authority: PT
Inventors: Robert Joseph Aiello
Original assignee: Pfizer
Priority date: 1996-11-15
Filing date: 1997-11-05
Publication date: 2001-10-30
Also published as: DK0842661T3; DE69705480D1; US6034102A; EP0842661A2; ATE202702T1; HU223942B1; JPH10147527A; ZA9710292B; JP3287793B2; IL122123A; KR100367793B1; NZ329174A; IL122123A0; AU4523797A; EP0842661A3; MY114586A; EP0842661B1; AU740378B2; CA2221114A1; HUP9702040A1

Description

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DESCRIÇÃO "TRATAMENTO DA ATEROSCLEROSE"

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Esta invenção diz respeito ao tratamento da aterosclerose em mamíferos, incluindo seres humanos, e a utilização de certos agonistas/anta-gonistas de estrogénio para o fabrico de um medicamento para a aterosclerose. O enfarte do miocárdio é a causa principal de morte nos países ocidentais, sendo anualmente responsável por mais de 500.000 mortes somente nos Estados Unidos. A estenose das artérias coronárias e o número de vasos doentes são aceites como indicadores de morbidez e mortalidade cardíacas. A ruptura de placas ateroscleróticas instáveis contribui para quase 75% de todos os enfartes do miocárdio e apoplexias. No entanto, a angiografía não prevê os locais futuros de oclusão e/ou ruptura. Os estudos recentes sugerem que 72% dos acontecimentos coronários não se dão devido a lesões fibróticas, severamente calcificadas, mas antes devido à ruptura de placas ricas em lípidos ligeiramente estenóticas, muitas vezes invisíveis por angiografía (Circulation, 1994; 90:4:2126-21461. Vários estudos recentes têm demonstrado que a infiltração aumentada de macrófagoss se encontra associada à erosão da matriz extracelular de uma lesão aterosclerótica, ao enfraquecimento da cobertura da lesão e a uma vulnerabilidade acrescida quanto à ruptura (Circulation. 1994: 90:1669-16781. Sugeriu-se que a infiltração incontrolada de monócitos conduz à acumulação excessiva de lípidos e ao aumento do enfraquecimento extracelular da cobertura fibrosa da lesão aterosclerótica, despoletando assim a trombose. Também se sugeriu que um inibidor das respostas pro-inflamatórias, irá potenciar a estabilidade das placas ao impedir a infiltração excessiva de monócitos.

Também, Wiseman, et al., Biochem. Pharm. 45, N° 9, 1851 (1993) revelaram o papel da peroxidação de lípidos em danos cardiovasculares e o desenvolvimento de aterosclerose. Adicionalmente, Wiseman at al. Câncer Letters 66, 61 (1992) revelaram que o droloxifene inibe a peroxidação de lípidos. Também, a Patente U.S. N° 5.047.431 revela a utilização de droloxifene para o tratamento de tumores mamários dependentes de hormonas e a Patente U.S. N° 5.254.594 revela a utilização de droloxifene para o alívio de doenças ósseas provocadas pela insuficiência de estrogénio. A Patente U.S. N° 5.426.123 revela os efeitos de droloxifene quanto à diminuição da diminuição de lípidos.

Adicionalmente Grainger, et al., Nature Medicine, Vol. 1, N° 10 (Outubro de 1995) revelaram que o tamoxifene suprime a formação de lesões por lípidos induzidas pela dieta em aortas de ratinhos.

Assim, embora exista uma variedade de terapias anti-ateroscleróti-cas persiste uma necessidade contínua e uma investigação contínua neste campo do conhecimento procurando terapias alternativas para o tratamento da aterosclerose.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Esta invenção diz respeito a um método para o tratamento da aterosclerose, independente da redução da diminuição de lípidos, em mamíferos, incluindo seres humanos, necessitados de tratamento, de preferência pela inibição da progressão de uma lesão arteriogénica ou pela estabilização das placas. Preferencialmente, consegue-se uma tal inibição da progressão de lesões ou a -3-

estabilização das placas inibindo directamente a expressão da quimioquina que conduz ao recrutamento excessivo de células inflamatórias, pela administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto com a Fórmula I. A inibição da progressão de tais lesões ou a estabilização das placas também se consegue inibindo a peroxidação de lípidos.

Embora não pretendendo formular qualquer teoria, crê-se que os efeitos acima descritos (inibição da progressão arteriogénica e estabilização das placas) ocorram de preferência pela inibição do recrutamento de células inflamatórias controlando directamente a expressão de um gene. Este controlo directo sobre a expressão de um gene é distinto da inibição da peroxidação de lípidos (que também ocorre) porque implica o controlo directo de quimioquinas ao nível do ADN em vez de impedir directamente a expressão do gene pelo impedimento da oxidação de lípidos através das propriedades antioxidantes destes compostos. Isto é independente dos efeitos de redução de teor lípidos destes compostos.

Os compostos com a fórmula I têm a fórmula:

Z1-G

em que: A seja seleccionado de entre CH2 e NR; B, D e E sejam seleccionados independentemente de entre CH e N; Y seja (a) fenilo, substituído opcionalmente com 1-3 substituintes seleccionados independentemente de entre R4; (b) naftilo, substituído opcionalmente com 1-3 substituintes seleccionados independentemente de entre R4; (c) cicloalquilo C3-Q, substituído opcionalmente com 1-2 substituintes seleccionados independentemente de entre R4; (d) cicloalcenilo C3-C8, substituído opcionalmente com 1-2 substituintes seleccionados independentemente de entre R4; (e) um heterociclo com cinco membros contendo até dois o heteroátomos seleccionados de entre 0 grupo que consiste em -O-, -NR - e -S(0)n-, substituído opcionalmente com 1-3 substituintes seleccionados independentemente de entre R4; (f) um heterociclo com seis membros contendo até dois λ heteroátomos seleccionados de entre o grupo que consiste em -O-, -NR - e -S(0)n-, substituído opcionalmente com 1-3 substituintes seleccionados independentemente de entre R4; ou (g) um sistema anelar bicíclico consistindo num anel -5-

heterocíclico com cinco ou seis membros fundido com um anel de fenilo, contendo o referido anel heterocíclico até dois heteroátomos seleccionados de entre o grupo que consiste em -0-, -NR2- e -S(0)n-, substituído opcionalmente com 1-3 substituintes seleccionados independentemente de entre R4; Z1 seja (a) -(CH2)pW(CH2)q-; 0>) -0(CH2)pCR5R6-; (c) "(CH2)pW(CH2)q-; (d) -OCHR2CHR3-; ou (e) -SCHR2CHR3-; G seja (a) -NR7R8; —V (b) X(CH2)n—/ em que n seja 0, 1, ou 2; m seja 1, 2 ou 3; Z2 seja -NH-, -O-, -S-, ou -CH2-; fundido opcionalmente em átomos de carbono adjacentes com um ou dois anéis de fenilo e, substituído independentemente opcionalmente sobre carbono com um a três substituintes e, opcionalmente, independentemente sobre azoto com um substituinte quimicamente adequado seleccionado de entre R4; ou -6- c (c) uma amina bicíclica contendo cinco a doze átomos de carbono, quer em ponte ou fundidos e substituída opcionalmente com 1-3 substituintes seleccionados independentemente de entre R4; ou R2 /

/—N -OCH2—( fon Z e G em combinação poderão ser W seja (a) -CHr; (b) -CH=CH-; (c) -0-; (d) -NR2-; (e) -S(0)n-;

O (f) — è—; (g) -CR2(OH)-; (h) -CONR2-; (i) -NR2CO-; -7- (j) “(D- ; ou

(k) -OC-; R seja hidrogénio ou alquilo C]-C6; R2 e R3 sejam independentemente (a) hidrogénio; ou (b) alquilo Ci-C4; R4 seja (a) hidrogénio; (b) halogéneo; (c) alquilo Ci-C6; (d) alcoxilo Ci-C4; (e) aciloxilo CrC4; (f) alquiltio Ci-C4; (g) alquilsulfmilo CrC4; -8- ÍÇa. (h) alquilsulfonilo CrC4; (i) hidroxi(Ci-C4)alquilo; (j) aril(Ci-C4)alquilo; (k) -C02H; (l) -CN; (m) -CONHOR; (n) -S02NHR; (o) -NH2; (p) -alquilamino CrC4; (q) dialquilamino CrC4; (r) -NHS02R; (s) -N02; (t) -arilo; ou (u) -OH; -9-

R5 e R6 sejam independentemente alquilo Ci-C8 ou formem em conjunto um anel carbocíclico C3-C10; 7 o R e R sejam independentemente (a) fenilo; (b) um anel carbocíòlico C3-C10, saturado ou insaturado; (c) um anel heterocíclico C3-C10 contendo até dois heteroátomos, seleccionados de entre -O-, -N- e -S-; (d) H; (e) alquilo Cj-Có; ou (f) formem um anel contendo azoto com 3 a 8 membros com R5 e R6; R7 e R8 quer sob forma linear ou anelar poderão ser substituídos opcinalmente com até três substituintes seleccionados independentemente de entre alquilo CrC6, halogéneo, alcoxilo, hidroxilo e carboxilo; um anel formado por R e R poderá ser fundido opcionalmente a um anel de fenilo; e seja 0,1 ou 2; m seja 1,2 ou 3; \ ®*·Λ - 10- η seja 0, 1 ou 2; ρ seja 0,1,2 ou 3; qsejaO, 1,2 ou 3; e seus isómeros ópticos e geométricos; e seus sais de adição de ácido não tóxicos farmacologicamente aceitáveis, N-óxidos, ésteres e sais de amónio quaternários.

Os compostos preferidos da invenção para os métodos acima têm a fórmula:

em que G seja -o· /

e B e E sejam seleccionados R4 seja H, OH, F, ou Cl; independentemente de entre CH e N.

Uma dosagem para os métodos acima é de cerca de 0,0001 a 200 mg/kg/dia, de preferência de 0,001 a 10 mg/kg/dia. ”ι -11 - ”ι -11 -

\

Os compostos especialmente preferidos da invenção para os métodos acima são:

Cis-6-(4-fluoro-fenil)-5-[4-(2-piperidin-l-il-etoxi)-fenil]-5,6,7,8- tetrahidro-naftalen-2-ol; (-)-Cis-6-fenil-5-[4-(2-pirrolidm-l-il-etoxi)-fenil]-5,6,7,8-tetrahidro-naftalen-2-ol;

Cis-6-fenil-5-[4-(2-pirrolidin-l-il-etoxi)-fenil]-5,6,7,8-tetrahidro- naftalen-2-ol;

Cis-1 - [6'-pirrolodinoetoxi-3'-piridil3-2-fenil-6-hidroxi-1,2,3,4-tetrahidronaftalina; 1 -(4'-Pirrolidinoetoxifenil)-2-(4"-fluorofenil)-6-hidroxi-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina;

Cis-6-(4-hidroxifenil)-5-[4-(2-piperidin-l-il-etoxi)-fenil]-5,6,7,8-tetrahidro-naftalen-2-ol; e 1 -(4-Pirrolidinoetoxifenil)-2-fenil-6-hidroxi-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina.

Por progressão da lesão entende-se recrutamento acrescido de monócitos, crescimento com a proliferação de células de músculos lisos, migração, e síntese da matriz, e degeneração com acumulação de lípidos celulares e extra celulares. - 12- Π ί

Por estabilização das placas entende-se a inibição da passagem de placas por uma fase em que o núcleo lipídico cresceu e a cobertura fibrosa é muito fina e vulnerável à ruptura devido a um aumento da densidade dos macrófagos.

Por quimioquinas entende-se citoquinas específicamente quimio-atractivas para monócitos que pertençam à sub-família C-C (β) de quimioquinas incluindo ΜΙΡ-Ια, MIP-Ιβ, RANTES, MCP-1, MCP-2 e MCP-3 que são produzidas por células endoteliais, células dos músculos lisos e macrófagos encontrados na parede dos vasos.

Por inibição directa da expressão das quimioquinas entende-se a inibição da expressão de genes por interacção com um elemento ou factor transcricional que se liga directamente ao ADN, impedindo assim a expressão desse gene. O controlo da transcrição leva-se a cabo ao nível da iniciação da síntese de mARN.

Por recrutamento excessivo de monócitos entende-se uma resposta inflamatória conduzindo à acumulação de macrófagos na parede arterial devido à migração transendotelial de monócitos para o espaço intimai.

As expressões "tratando", "tratar" ou "tratamento" aqui utilizadas incluem tratamento preventivo (por exemplo, profilático) e paliativo.

Por halo entende-se cloro, bromo, iodo, ou fluoro.

Por alquilo entende-se hidrocarboneto saturado de cadeia linear ou ramificado. Exemplificativos de tais grupos alquilo (assumindo que o compri- -13 - -13 - atfaaaw^.-

J*®®' mento designado engloba o exemplo específico) são metilo, etilo, propilo, isopro-pilo, butilo, sec-butilo, butilo terciário, pentilo, isopentilo, hexilo e isohexilo.

Por alcoxilo entende-se alquilo saturado de cadeia linear ou ramificado ligado por um grupo oxilo. Exemplificativos de tais grupos alcoxilo (assumindo que o comprimento designado engloba o exemplo específico) são metoxilo, etoxilo, propoxilo, isopropoxilo, butoxilo, isobutoxilo, butoxilo terciário, pentoxilo, isopentoxilo, hexoxilo e isohexoxilo. A expressão "sal de adição de ácido farmaceuticamente aceitável" diz respeito a sais aniónicos não tóxicos contendo aniões tais como (mas não de limitam a) cloreto, brometo, iodeto, sulfato, bissulfato, fosfato, acetato, maleato, fumarato, oxalato, lactato, tartarato, citrato, gluconato, metano-sulfonato e 4-tolueno-sulfonato. O sinal parentético negativo ou positivo aqui utilizado na nomenclatura assinala a alteração direccional que o plano de polarização da luz polarizada sofre por interacção com o estereoisómero específico.

Tal como aqui se utilizam, as expressões "solvente inerte à reacção" e "solvente inerte" referem-se a um solvente que não interactua com matérias parimas, reagentes, intermediários ou produtos de um modo que afecte adversamente o rendimento no produto desejado. O químico entendido na matéria reconhecerá que certos compostos desta invenção conterão um ou mais átomos que poderão encontrar-se numa configuração estereoquímica ou geométrica específica, daí surgindo estereo-isómeros e isómeros de configuração. Todos tais isómeros e suas misturas incluem-se nesta invenção. Os hidratos dos compostos desta invenção também estão incluídos. - 14- Μ Ο químico entendido na matéria reconhecerá que certas combinações de substituintes contendo heteroátomos listados nesta invenção definem compostos que serão menos estáveis sob condições fisiológicas (por exemplo, ligações acetal ou aminal). Em conformidade, tais compostos são menos preferidos.

Outras características e vantagens tomar-se-ão aparentes a partir da especificação e das reivindicações que descrevem a invenção.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Os compostos desta invenção inibem a formação (por exemplo, progressão) de placas ateroscleróticas e também ajudam à estabilização das placas. Em geral, crê-se que vários alvos moleculares potenciais possam mediar este efeito incluindo quimioquinas pro-inflamatórias (por exemplo, MCP-1). O MCP-1 é um factor quimioatractor potente para monócitos e macrófagos. Produz-se e segrega-se por células endoteliais, células de músculos lisos vasculares e macrófagos como resposta a mediadores inflamatórios tais como IL-1 e a lípidos oxidados.

Mais particularmente, crê-se que a modificação da lipoproteina de baixa densidade (LDL) por expécies reactivas de oxigénio, para LDL modificada oxidativamente (Οχ-LDL), seja imprescindível à iniciação da aterosclerose. As áreas dos vasos propensas à formação de placas acumulam LDL Endotelial, as células de músculos lisos e/ou inflamatórias circulantes então convertem o LDL em Οχ-LDL. Consequentemente, os monócitos tomam-se extremamente ricos em Οχ-LDL formando células de espuma de macrófagos. As Οχ-LDL e outros factores de risco activam genes dentro dos macrófagos e outras células - 15- inflamatórias para promoverem recrutamento adicional de células inflamatórias para a parede da artéria ou veia. Os compostos desta invenção são tidos como limitantes do recrutamento de células inflamatórias para a parede dos vasos que conduz à progressão das placas ateroscleróticas, controlando a transcrição de genes, tais como o da Proteína Quimioatractora de Monócitos-I (MCP-1=, envolvidos com a quimiotaxia de monócitos ao nível da síntese de mARN. Por exemplo, como resultado da nossa análise do ratinho ApoE KO alimentado com lípidos crê-se que os compostos desta invenção reduzem os níveis elevados de mARN de MCP-1 verificados nas lesões ateroscleróticas. Os níveis reduzidos de mARN de MCP-1 resultam em alterações significativas na migração de monócitos, resultando na inibição da progressão de lesões arteriogénicas.

Os compostos desta invenção também ajudam à estabilização das placas. Crê-se que no princípio do desenvolvimento das placas ateroscleróticas, todas as placas passam por uma fase em que o núcleo lipídico tenha crescido e a cobertura fibrosa seja muito fina e vulnerável à ruptura. Existe uma grande quantidade de provas que implicam macrófagos (que segregam proteases e lipases) na degradação da cobertura fibrosa. Davis et al. (Br. Heart J. 1985; 53:363-373) têm descrito densidades aumentadas de macrófagos em placas rompidas em comparação com placas estáveis. Além disso o local contíguo à ruptura ou erosão das placas fica sempre marcado por um processo inflamatório. Os compostos desta invenção também estabilizam as placas pela inibição de recrutamento (por exemplo, infiltração de monócitos) de monócitos (por exemplo, células inflamatórias) para a parede arterial conduzindo ao enfraquecimento da cobertura fibrosa da lesão aterosclerótica. Esta inibição do recrutamento de monócitos tem lugar inibindo directamente a expressão de quimioquinas tais como MCP-1 que resulta em infiltração excessiva de monócitos e na formação de células de espuma na parede arterial. - 16- γο C~— ι

Os efeitos acima descritos (1. inibição da progressão arteriogénica e 2. estabilização das placas) dão-se através da inibição do recrutamento de células inflamatórias controlando directamentea expressão de um gene. Este controlo directo da expressão de um gene é distinto da inibição da peroxidação de lípidos porque envolve o controlo directo de quimioquinas ao nível do ADN em vez de impedir indirectamente a expressão do gene impedindo a oxidação de lípidos pelas propriedades anti-oxidantes destes compostos.

Os agonistas/antagonistas de estrogénio desta invenção são compostos tal como se descrevem na Patente denominada U.S. N° 5.552.412 cujas revelações se incorporam neste documento, por referência. A preparação de tais compostos também se descreve na Patente U.S. N° 5.552.412. Os compostos especialmente preferidos definidos nesse documento e úteis para esta invenção são:

Cis-6-(4-fluoro-fenil)-5-[4-(2-piperidin-l-il-etoxi)-fenil]-5,6,7,8-tetrahidro-naftalen-2-ol; (-)-Cis-6"fenil-5-[4-(2-pirrolidin-l-il-etoxi)-fenil]-5,6,7,8-tetrahidro-naftalen-2-ol;

Cis-6-fenil-5-[4-(2-pirrolidin-l-il-etoxi)-fenil]-5,6,7,8-tetrahidro- nafitalen-2-ol;

Cis-1 -[6'-pirrolodinoetoxi-3'-piridil]-2-fenil-6-hidroxi-1,2,3,4-tetrahidronaftalina;

^X -17- 1 -(4'-Pirrolidinoetoxifenil)-2-(4"-fluorofenil)-6-hidroxi-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina;

Cis-6-(4-hidroxifenil)-5-[4-(2-piperidin-l-il-etoxi)-fenil]-5,6,7,8-tetrahidro-naftalen-2-ol; e 1 -(4'-Pirrolidinoetoxifenil)-2-fenil-6-hidroxi-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina.

Alguns dos métodos de preparação úteis para a produção dos compostos desta invenção poderão necessitar de protecção da funcionalidade remota (i.e., amina primária, amina secundária, carboxilo). A necessidade de uma tal protecção irá variar consoante a natureza da funcionalidade remota e as condições dos métodos de preparação. A necessidade de uma tal protecção pode ser determinada prontamente por um entendido na matéria. A utilização de tais métodos de protecção/desprotecção também se encontra ao alcance de um entendido na matéria. Para uma descrição geral dos grupos protectores e da sua utilização, consultar T.W.Greene, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, Nova Iorque, 1991. As matérias primas e os reagentes para os compostos desta invenção também se encontram prontamente disponíveis ou poderão ser facilmente sintetizados pelos entendidos na matéria utilizando métodos convencionais de síntese orgânica.

Alguns dos compostos desta invenção têm átomos de carbono assimétricos e são portanto enantiómeros ou diaestereómeros. As misturas diaestereoméricas poderão separar-se nos seus diaestereómeros individuais baseadas nas suas físico-químicas segundo métodos conhecidos per se, por exemplo, por cromatografia e/ou cristalização fraccionada. Os enantiómeros

poderão separar-se pela conversão da mistura enantiomérica numa mistura diaestereomérica por reacção com um composto activo opticamente apropriado (por exemplo, um álcool), separando os diaestereómeros e convertendo (por exemplo, hidrolizando) os diaestereómeros individuais nos enantiómeros puros correspondentes. Consideram-se todos tais isómeros, incluindo diaestereómeros, enantiómeros e suas misturas, como parte desta invenção.

Adicionalmente, alguns dos compostos desta invenção são básicos, e formam um sal com um anião farmaceuticamente aceitável. Todos tais sais encontram-se no alcance desta invenção e podem preparar-se segundo métodos convencionais. Por exemplo, podem preparar-se simplesmente contactando as entidades ácidas e básicas, normalmente num rácio estequiométrico, quer num meio aquoso, quer não aquoso, ou parcialmente aquoso, tal como seja apropriado. Recuperam-se os sais quer por filtração, por precipitação com um não solvente seguido por filtração, por evaporação do solvente, ou, no caso de soluções aquosas, por liofilização, tal como seja apropriado.

Adicionalmente, quando os compostos desta invenção formarem hidratos ou solvatos também estes se encontram no alcance da invenção.

Os métodos desta invenção adaptam-se todos a utilização terapêutica quer pela inibição do recrutamento de células inflamatórias controlando a expressão dos genes ou establizando as placas em mamíferos, particularmente seres humanos. Visto que estas funções se encontram estreitamente relacionadas com o desenvolvimento da aterosclerose e de disfunções relacionadas com doenças coronárias do coração, estes métodos impedem, param, regridem ou invertem a aterosclerose. -19- A utilidade dos compostos da invenção presente como agentes medicinais no tratamento da aterosclerose em mamíferos (por exemplo, seres humanos, particularemente no génreo femenino) demonstra-se pela actividade dos compostos desta invenção em ensaios convencionais e nos ensaios in vivo abaixo descritos. Tais ensaios também proporcionam um meio pelo qual as actividades dos compostos desta invenção podem ser comparados entre eles e com as actividades de outros compostos conhecidos. Os resultados destas comparações são úteis para a determinção dos níveis de dosagem em mamíferos, incluindo seres humanos, para o tratamento de tais doenças. A actividade anti-aterosclerótica destes compostos pode demonstrar-se avaliando o efeito destes compostos, comparados com um controlo de placebo, (administrados subcutaneamente, ratinhos fêmea ovariectomizadas deficientes em Apo E alimentadas com uma dieta de teor elevado em gordura), pela percentagem de superfície aórtíca coberta por lesões ateroscleróticas.

PROTOCOLO

Preparação dos Animais: Alimentam-se ratinhos fêmea ovariectomizadas deficientes em Apo E com uma dieta elevada em gordura. Dividem-se os animais em grupos de controlo e grupos de compostos em teste. O composto a ser testado ou um placebo (contidos em peletes sub-dérmicas, de libertação a 60 dias) inserem-se por baixo da pele na parte detrás do pescoço do animal com um trocarte. Voltam-se a dosear os animais aproximadamente 55 dias após a dosagem inicial por forma a conseguir-se um período de dosagem total aos ratinhos de aproximadamente 90 dias.

ANIMAIS Fêmeas, ratinhos deficientes m Apo E transgénicos pesos médios de 20 a 30 gramas OVX aos 25 dias de idade

Colocadas em gaiolas de isolamento individuais no inicio do estudo Doseados aos 70 dias de idade durante 90 dias

Alimentados com uma dieta de tipo Western contendo 21% de gordura e 0,15% de colesterol (% em peso) (Harlan Teklad, Madison, Wisconsin, Cat.# TD 88137 TEKLAD) durante 3 meses antes do sacrifício.

Sacrificados aos 155 dias de idade

PELETES DE LIBERTAÇÃO PROLONGADA

Obtiveram-se peletes de libertação prolongada (60 dias, 30 mm) da Innovative Research of America (1-800-421-8171) como se segue:

Placebo: pelete de 5 mg (83pg/dia) CAT #SC-111 obtida da Innovative Research of America (1-800-421-8171)

Composto em Teste: peletes CAT # de encomenda especial obtidas da Innovative Research of America (1-800-421-8171)

Recolha de Tecidos: No final do período de 90 dias de dosagem, os animais são jejados de um dia para o outro antes de serem sacrificados. Anestesiam-se os animais e retira-se uma amostra de sangue inteiro de cada animal para análise do colesterol e dos triglicéridos no plasma. Os ratinhos são sujeitos a uma perfusão in situ com PBS (através da punção do coração no ventrículo esquerdo) durante um período curto ou até que os tecidos estejam i -21 -

livres de sangue (o perfusado seja transparente). Passa-se o perfusado para paraformaldeído tamponizado com cacodilato a 4% e o animal permanece fixado por perfusão in situ durante um período curto. Retira-se o útero e pesa-se. Retiram-se o coração e a aorta (do arco no coração mesmo abaixo da ramificação renal) e transferem-se para frascos separados contendo paraformaldeído tamponizado com cacodilato a 4%. Os tecidos são fixados post-perfusão durante algumas horas. Os tecidos transferem-se para goma de sacacrose a 30% e deixa-se infiltrar a sacacrose nos tecidos durante pelo menos um dia antes da sua secção.

Aorta: Retira-se a adventícia exterior da aorta e corta-se o vaso abrindo-o fazendo um corte longitudinal ao longo do lado da aorta começando no arco e indo até à ramificação femural. Faz-se um segundo corte longitudinal no outro lado do arco da aorta para dividir o vaso a meio neste local. Quantifica-se a extensão da lesão no vaso aórtico utilizando por exemplo, um programa OPTIMAS de análise de imagem (software 'ÓPTIMAS 4.1 (Image Processing Solutions, Wobum, MA)). Armazenam-se as aortas em formalina tamponizada a 10%.

Coração: Os corações são embebidos em OCT e fazem-se secções criostáticas do sinus aórtico e da válvula aórtica do coração. Retiram-se seccções de lOpm e guarda-se uma em cada duas secções em diapositivos revestidos com Vectabond. Cada região da aorta deve preencher aproximadamente 3-4 diapositivos com 4 secções por diapositivo. Tingem-se as secções de coração para lípidos com Oil Red O e quantifica-se a extensão da lesão nas zonas da cavidade aórtica e/ou da válvula aórtica utilizando o programa OPTIMAS de análise de imagem. A administração dos compostos desta invenção pode levar-se a -22-

cabo por qualquer método que ministre sistematicamente um composto desta invenção. Estes métodos incluem vias orais, parentéricas, vias intraduodenais, etc.. Geralmente, os compostos desta invenção são administrados oralmente, mas pode-se utilizar a administração parentérica (por exemplo, intravenosa, intramuscular, subcutânea ou intramedularmente), por exemplo, quando a administração oral seja inapropriada para o alvo em questão ou quando o paciente seja incapaz de ingerir o medicamento. Os composto desta invenção podem ser administrados individualmente ou co-administrados simultaneamente ou sequencialmente em qualquer ordem.

De qualquer forma a quantidade e a cadência do(s) composto(s) administrado(s) irá, está claro, estar dependente do sujeito a ser tratado, da severidade da doença, do modo de administração e do critério do médico prescritor. Assim, devido à variabilidade de paciente para paciente, as dosagens abaixo indicadas são indicativas e o médico poderá titular doses do medicamento para conseguir a actividade (i.e., efeito anti-aterosclerótico) que o médico considere apropriada para o paciente específico. Ao considerar o grau de actividade desejado, o médico tem que equilibrar uma variedade de factores tais como o nível de aterosclerose inicial, a idade do paciente, bem como a existência de outras doenças (por exemplo, osteoporose). Por exemplo, a administração de um agonista/antagonista de estrogénio pode proporcionar benefícios para a osteoporose, particularemente para mulheres na pós-menopausa. Os exemplos seguintes oferecem gamas de dosagem preferidas para os vários compostos desta invenção. A quantidade do composto desta invenção a ser utilizada determina-se pela sua actividade como agente anti-aterosclerótico. Esta actividade determina-se recorrendo às farmacocinéticas de um composto específico e à sua dose mínima de eficácia máxima na inibição da formação e/ou estabilização de placas utilizando um protocolo tal como acima se descreve. -23-

Geralmente uma dosagem eficaz para as actividades anti-ateroscleróticas desta invenção, para os compostos desta invenção, encontra-se na gama de 0,0001 a 200 mg/kg/dia, de preferência de 0,001 a 10 mg/kg/dia.

Os compostos da invenção presente são geralmente administrados sob a forma de uma composição farmacêutica incluindo pelo menos um dos compostos desta invenção em conjunto com um veículo ou diluente farmacêuticamente aceitável. Assim, os compostos desta invenção podem ser administrados individualmente ou em conjunto sob qualquer forma de dosagem oral, parentética ou transdérmica convencional.

Para administração oral uma composição farmacêutica pode assumir a forma de soluções, suspensões, comprimidos, pílulas, cápsulas, pós, e suas semelhantes. Os comprimidos contendo vários excipientes tais como citrato de sódio, carbonato de cálcio e fosfato de cálcio são utilizados em conjunto com vários desintegrantes tais como amido e de preferência amido de batata ou de mandioca e certos silicatos complexos, em conjunto com agentes de ligação tais como polivinilpirrolidona, sacarose, gelatina e goma arábica. Adicionalmente, os agentes lubrificantes tais como estearato de magnésio, laurilsulfate de sódio e talco são muitas vezes úteis para fins de fabrico de comprimidos. As composições sólidas de um tipo semelhante são também utilizadas como cargas em cápsulas de gelatina mole e dura com enchimento; os materiais preferidos nestas aplicações também incluem lactose ou açúcar de leite bem como polietilenoglicóis de elevado peso molecular. Quando se desejam suspensões aquosas e/ou elixires para administração oral, os compostos desta invenção podem combinar-se com vários agentes adoçantes, agentes aromatizantes, agentes corantes, agentes emulsificantes e/ou agentes de suspensão, bem como com diluentes tais como água, etanol, propilenoglicol, glicerina e várias suas combinações semelhantes. -24-

Para propósitos de administração parentérica, podem utilizar-se soluções em óleo de gergelim ou de amendoim ou em propilenoglicol aquoso, bem como soluções aquosas estéreis dos sais solúveis em água correspondentes. Tais soluções aquosas podem ser tamponizadas adequadamente, se necessário for, e o diluente líquido ser em primeiro lugar tomado isotónico com solução salina ou glucose suficiente. Estas soluções aquosas são especialmente adequadas para propósitos de injecção endovenosa, intramuscular, subcutânea e intraperitoneal. Nesta área, os meios aquosos utilizados obtêm-se prontamente segundo técnicas convencionais bem conhecidas pelos entendidos na matéria.

Para propósitos de administração trandérmica (por exemplo, tópica), preparam-se soluções, estéreis diluídas, aquosas ou parcialmente aquosas (normalmente com uma concentração de cerca de 0,1% a 5%), de outra forma semelhantes às soluções parentéricas acima.

Os métodos para a preparação de várias composições farmacêuticas com uma certa quantidade de ingrediente activo são conhecidos, ou tomar-se-ão aparentes à luz destas revelações, pelos entendidos na matéria. Para se obterem exemplos de métodos para a preparação de composições farmacêuticas, consultar Remington’s Pharmaceutical Sciences. MackPublishing Company, Easter, Pa., 15th Edition (1995).

As composições farmacêuticas de acordo com a invenção podem conter 0,l%-95% do(s) composto(s) desta invenção, l%-70% de preferência. De qualquer modo, a composição ou formulação a ser administrada irá conter um teor de um(ns) composto(s) de acordo com a invenção, numa quantidade eficaz para tratar a doença/estado do sujeito sob tratamento. -25- EXEMPLO 1

Este EXEMPLO compara a extensão de lesão aterosclerótica encontrada em ratinhos fêmea ovariectomizados deficientes em Apo E alimentados com uma dieta elevada em gordura e doseados subcutaneamente com placebo, 17-beta-estradiol, ou {4-[2-(2-aza-biciclo[2.2.1]hept-2-il)-etoxi]-fenil}-[6-hidroxi-2-(4-hidroxi-fenil)-benzo[b]tiofen-3-il]-metanona, durante 90 dias.

Animais

Procriaram-se no laboratório ratinhos deficientes em apolipo-proteína (apo)E homozigóticos. Os ratinhos tinham uma herança genética mista (129ola x C57B/6). Mantiveram-se trinta e seis ratinhos num numa câmara com um ciclo de dia/noite de 12 horas e com acesso não restrito a alimento e água. Alimentaram-se os ratinhos com uma dieta de "tipo Western" (Harlan Teklad, Madison, Wisconsin, Cat.# TD 88137, contendo 21% de gordura e 0,15% de colesterol em peso). No desmame (idade de 28 dias), os ratinhos fêmea foram ovariectomizados (OVX) bilateralmente ou sujeitos a uma operação simulada através de uma incisão dorsal de um centímetro. Aos 45 dias de idade, os ratinhos foram alocados aleatoriamente a um dos três grupos de tratamento e inseriram-se interscapularmente, sob anestesia, peletes de libertação lenta a 60 dias (Innovative Research of America, Toledo, Ohio): 0,5 mg de placebo, 6 pg por dia de 17-beta-estradiol, ou 50 pg por dia de {4-[2-(2-aza-biciclo[2.2.1]hept-2-il)-etoxi]-fenil}-[6-hidroxi-2-(4-hidroxi-fenil)-benzo[b]tiofen-3-il]-metanona. Após 55 dias voltaram-se a dosear os ratinhos para permitir um período de dosagem total de 90 dias. -26-

Preparacão dos Tecidos

Após um jejum de um dia para o outro, anestesiaram-se os ratinhos com Cetamina/Xilazina/PLBS 1:1:2 (Miles Inc.)· Retiraram-se então o sangue e os úteros por perfusão in situ (80 mm hg) com solução salina tamponizada com fosfato (PBS) com um valor de pH de 7,4.

Prepararam-se secções para contraste para lípidos e análise morfométrica tal como se segue. Os corações foram fixados por perfusão in situ com paraformaldeído tamponizado com cacodilato a 4%. Retiraram-se e fixaram-se o coração e a aorta durante 2 a 3 horas adicionais em paraformaldeído tamponizado com cacodilato a 4% seguido por infiltração com goma de sacarose a 30% (1% de goma arábica + 30% de sacarose em PBS) durante 24 horas, 4°C. Para se determinar a área de lesão numa secção perpendicular, embeberam-se corações em meio circundante OCT (Optimal Cryostat Temperature Inc.) e seccionaram-se no criostato a 10μ, -18°C. Uma em cada duas secções colocaram-se em diapositivos revestidos Vectabond (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA). A área do coração a ser seccionada dividiu-se em duas regiões separadas habitualmente utilizadas para se quantificar o grau de lesões ateroscleróticas em ratinhos, no sinus aórtico e na válvula aórtica. Quando em deslocação para cima a partir da base do coração, o sinus começou ao primeiro aparecimento dos limites das válvulas que dividem o lúmen em três regiões distintas. Nesta região, a parede aórtica encontra-se saliente e irregular. A região do sinus termina e inicia-se a região da válvula começa quando os limites das válvulas já não dividem o lúmen e a parede parece mais arredondada e distinta. A válvula começava no final do sinus e continuava até já não se verem os limites das válvulas e a parede era bem arredondada (aproximadamente 280 μτη). Tingiram-se as secções para lípidos com Oil red O (0,5% em propilenoglicol, Polyscientific, BayShore, NY) e contra-tingiram-se com Gill's III Hematoxylin (Sigma). -27-

Análise das Lesões

Avaliou-se cada secção do sinus aórtíco e da válvula aórtica quanto à área contrastada por Oil red O captando imagens directamente a partir de uma câmara ligada a um microscópio de luz Leitz Laborlux S (Leica) e apresentando-as num monitor Trinitron RGB. Determinou-se a análise de imagem utilizando software 'ÓPTIMAS 4.1 (Image Processing Solutions, Wobum, MA). Delinearam-se os perímetros exterior e interior da parede aórtica em secções perpendiculares e definiram-se limiares para se distinguir entre tecido normal (tingido com hematoxilina) e doente (tingido com Oil red O). Expressaram-se os resultados como a dimensão média de lesão por secção ou como a percentagem de área da secção perpendicular da parede do vaso (área/secção normal + doente, excluindo o lúmen) tingida com Oil red O. Para cada animal, determinou-se a média das 12 a 16 secções e expressaram-se os dados sob a forma de dimensão da lesão ou percentagem média de área da lesão.

Determinou-se a percentagem de superfície aórtica coberta por lesões utilizando uma preparação enface. Limparam-se as aortas infiltradas com goma de sacarose, tal como se descreveu acima, retirando-se as adventícias e fez-se um corte longitudinal do arco para baixo em direcção à ramificação femural. Fez-se um segundo corte longitudinal entre as artérias coronárias e carótidas no arco aórtico e colocou-se a aorta aberta sobre um peça em poliestireno. Avaliou-se cada aorta quanto à área de lesão captando imagens directamente a partir de uma câmara CCD ligada a um dispositivo de cópia e apresentadas num monitor Trinitron. Determinou-se a área de lesão em tecido não tingido utilizando análise de imagem 'ÓPTIMAS 4.1. As áreas de placas ateroscleróticas em aortas limpas de adventícias surgem sob a forma de áreas brancas amareladas. Quantificou-se -28-

esta área estabelecendo manualmente limiares para tons de preto (fundo), cinzento (tecido normal) e branco (área de lesão). Lípidos do Plasma O colesterol e os triglicéridos totais do plasma mediram-se utilizando métodos colorimétricos com estjos ("kits") comercialmente disponíveis (Wako ADN Boehrringer-Mannheim).

Análise Estatística

Utilizou-se a análise da variância (ANOVA) para se testarem as diferenças estatisticamente significativas entre os grupos no que diz respeito a tratamento, lípidos no soro e dimensão da lesão. Utilizou-se o teste F de Fisher para se determinarem as diferenças significativas nas médias.

Resultados

Os resultados do Exemplo encontram-se descritos em detalhe na Tabela seguinte. O Exemplo demonstra a validade do protocolo evidenciando a redução em termos da dimensão da lesão aterosclerótica para o agonista de estrogénio {4-[2-(2-aza-biciclo[2.2.1]hept-2-il)-etoxi]-fenil}-[6-hidroxi-2-(4-hidroxi-fenil)-benzo[b]tiofen-3-il]-metanona. E importante notar que isto sucedeu sem uma redução de colesterol já que não se observou a actividade de redução do colesterol do agonista de estrogénio nesta experiência, quer porque o composto foi administrado subcutaneamente em vez de oralmente ou porque os ratinhos são não reactivos a compostos semelhantes ao estrogénio no que diz respeito a efeitos sobre lípidos. -29-

TABELA í4-r2-(2-aza-biciclor2.2.11hept-2-ils)-etoxi]-feniB-[6-hidroxi-2-('4-hidroxi-fenilV benzorbltiofen-3-ill-metanona Reduz a Dimensão da Lesão em Ratinhos OVX Deficientes em ApoE Sem Afectar os Lípidos no Plasma ou o Peso Uterino

Grupo N Colesterol Total (mg/dl) Triglicéridos (mg/dl) Peso Uterino (gm) r Area de Lesão na Válvula Aortica (%) Placebo 15 929±315 96±24 37±39 33,4±11,2 17-beta-estradiol 8 641±172* 53±24* 165±105* 18,9±6,2* (6 μg/d) X (50 pg/d) 10 820±134 91±55 35±15 21,1±6* * Diferença significativa em relação ao placebo (P é menos do que 0,05) X é {4-[2-(2-aza-biciclo[2.2.1]hept-2-il)-etoxi]-fenil}-[6-hidroxi-2-(4-hidroxi-fenil)-benzo[b]tiofen-3-il]-metanona

Deve entender-se que a invenção não se limita às concretizações aqui descritas, mas que se poderão fazer várias alterações e modificações sem sair fora do espírito e do alcance deste conceito inovador tal como se define nas reivindicações seguintes.

Lisboa, 6 de Julho de 2001

^-1

ALBERTO CANELAS Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA

Claims

- 1 -

t-i REIVINDICAÇÕES 1. A utilização de um composto com a fórmula (I), ou de um seu isómero óptico ou geométrico; ou de um seu sal de adição de ácido não tóxico farmaceuticamente aceitável, para o fabrico de um medicamento para o tratamento da aterosclerose, independente da diminuição de lípidos:-

em que: A seja seleccionado de entre CH2 e NR; B, D e E sejam seleccionados independentemente de entre CH e N; Y seja (a) fenilo, substituído opcionalmente com 1-3 substituintes seleccionados independentemente de entre R4; (b) naftilo, substituído opcionalmente com 1-3 substituintes seleccionados independentemente de entre R4; -2- (c) cicloalquilo C3-C8, substituído opcionalmente com 1-2 substituintes seleccionados independentemente de entre R4; (d) cicloalcenilo C3-C8, substituído opcionalmente com 1-2 substituintes seleccionados independentemente de entre R4; (e) um heterociclo com cinco membros contendo até dois heteroátomos seleccionados de entre 0 grupo que consiste em -O-, -NR2- e -S(0)n-, substituído opcionalmente com 1-3 substituintes seleccionados independentemente de entre R4; (f) um heterociclo com seis membros contendo até dois heteroátomos seleccionados de entre o grupo que consiste em -O-, -NR2- e -S(0)n-, substituído opcionalmente com 1-3 substituintes seleccionados independentemente de entre R4; ou (g) um sistema anelar bicíclico consistindo num anel hetero-cíclico com cinco ou seis membros fundido com um anel de fenilo, contendo o referido anel heterocíclico até dois heteroátomos seleccionados de entre o grupo que consiste em -O-, -NR2- e -S(0)n-, substituído opcionalmente com 1-3 substituintes seleccionados independentemente de entre R4; Z1 seja (a) -(CH2)pW(CH2)q-; (b) -0(CH2)pCRsR6-; (C) -(CH2)pW(CH2)q-; (d) -OCHR2CHR3-; ou (e) -SCHR2CHR3-; G seja (a) -NR7R8; —N (b) \ (CH2), m em que n seja 0, 1, ou 2; m seja 1, 2 ou 3; Z seja -NH-, -O-, -S-, ou -CH2-; fundido opcionalmente em átomos de carbono adjacentes com um ou dois anéis de fenilo e, substituído independentemente opcionalmente sobre carbono com um a três substituintes e, opcionalmente, independentemente sobre azoto com um substituinte quimicamente adequado seleccionado de entre R4; ou (c) uma amina bicíclica contendo cinco a doze átomos de carbono, quer em ponte ou fundidos e substituída opcionalmente com 1-3 substituintes seleccionados independentemente de entre R4; ou

W seja -4-rn

(a) -CH2-; (b) -CH=CH-; (c) -0-; (d) -NR2-; (e) -S(0)n-; II (f) —C—; (g) -CR2(OH)-; (h) -CONR2-; (i) -NR2CO-; S OU ()) (k) -OC-; R seja hidrogénio ou alquilo CrC6; R e R sejam independentemente (a) hidrogénio; ou -5- A fo* r.n (b) alquilo CrC4; R4 seja (a) hidrogénio; (b) halogénio; (c) alquilo Cj-Có; (d) alcoxilo Ci-C4; (e) aciloxilo CrC4; (f) alquiltio Ci-C4; (g) alquilsulfinilo CrC4; (h) alquilsulfonilo CrC4; (i) hidroxi(Ci-C4)alquilo; (j) aril(CrC4)alquilo; (k) -C02H; (l) -CN; (m) -CONHOR; -6-

(n) -S02NHR; (ο) -ΝΗ2; (ρ) -alquilamino CrC4; (q) dialquilamino CrC4; (r) -NHS02R; (s) -N02; (t) -arilo; ou (u) -OH; R5 e R6 sejam independentemente alquilo CpCg ou formem em conjunto um anel carbocíclico C3-C10; 7 R R eR sejam independentemente (a) fenilo; (b) um anel carbocíclico C3-C]o, saturado ou insaturado; (c) um anel heterocíclico C3-C10 contendo até dois heteroátomos, seleccionados de entre -O-, -N- e -S-; -7- (d) Η; (e) alquilo Ci-C6; ou (f) formem um anel contendo azoto com 3 a 8 membros com R1 2 3 e R6; R7 e R8 quer sob forma linear ou anelar poderão ser substituídos opcinalmente com até três substituintes seleccionados independentemente de entre alquilo CrC6, halogénio, alcoxilo, hidroxilo e carboxilo; um anel formado por R e R poderá ser fundido opcionalmente a um anel de fenilo; e seja 0, 1 ou 2; m seja 1,2 ou 3; n seja 0,1 ou 2; p seja 0, 1,2 ou 3; q seja 0, 1, 2 ou 3.
2. A utilização tal como se reivindica na reivindicação 1 que seja para o fabrico de um medicamento para o tratamento da aterosclerose, independentemente da diminuição de lípidos, pela inibição da progessão de uma lesão arteriogénica ou pela estabilização das placas. 1 A utilização tal como se reivindica na reivindicação 1 que 2 seja para o fabrico de um medicamento para o tratamento da aterosclerose, 3 independentemente da diminuição de lípidos, pela inibição directa da expressão -8-

η

de quimioquina conduzindo ao recrutamento excessivo de células inflamatórias, ou pela inibição da peroxidação de lípidos.
4. Uma utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores em que o composto da fórmula (I) tenha a fórmula:- em que G seja

R4

R4 seja H, OH, F, ou Cl; e B e E sejam seleccionados independentemente de entre CH e N.
5. Uma utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que o composto com a fórmula I seja: Cis-6-(4-fluoro-fenil)-5-[4-(2-piperidin-l-il-etoxi)-fenil]-5,6,7,8-tetrahidro-naftalen-2-ol; -9- (-)-Cis-6-fenil-5-[4-(2-pirrolidin-l-il-etoxi)-fenil]-5,6,7,8-tetrahi- dro-nafitalen-2-ol; Cis-6-fenil-5-[4-(2-pirrolidin-l-il-etoxi)-fenil]-5,6,7,8-tetrahidro- naftalen-2-ol; Cis-1 -[6'-pirrolodinoetoxi-3'-piridil]-2-fenil-6-hidroxi-1,2,3,4-tetrahidronaftalina; 1 -(4'-Pirrolidinoetoxifenil)-2-(4"-fluorofenil)-6-hidroxi-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina; Cis-6-(4-hidroxifenil)-5-[4-(2-piperidin-l-il-etoxi)-fenil]-5,6,7,8-tetrahidro-naftalen-2-ol; ou 1 -(4'-Pirrolidinoetoxifenil)-2-fenil-6-hidroxi-1,2,3,4-tetrahidro- isoquinolina.
6. A utilização de um composto com a fórmula (I) tal como se define em qualquer uma das reivindicações 1, 4 e 5, ou um seu isómero óptico ou geométrico, ou um seu sal de adição de ácido não tóxico farmacologicamente aceitável, de um seu N-óxido, éster ou sal de amónio quaternário, para o fabrico de um medicamento para a inibição da progressão da placa aterosclerótica por limitação do recrutamento de células inflamatórias para a parede do vaso. Lisboa, 6 de Julho de 2001

ALBERTO CANELAS Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA