PT828511E

PT828511E - Composicao vacinal anti-haemophillus influenzae de tipo b compreendendo fosfato de polirribosilribitol e seu processo de preparacao

Info

Publication number: PT828511E
Application number: PT96917554T
Authority: PT
Inventors: Francois Arminjon; Jean-Rene Cartier
Original assignee: Aventis Pasteur
Priority date: 1995-05-24
Filing date: 1996-05-24
Publication date: 2002-02-28
Also published as: PL323457A1; TR199701424T1; CZ289810B6; NO975366D0; BR9608810C8; US6333036B1; FR2734484B1; DE69620271D1; CZ359797A3; PL185846B1; NO319579B1; CA2218764C; AU6008696A; LU91924I2; DK0828511T3; GR3037011T3; NL300231I1; EP0828511A1; JPH11505824A; CN1190898A

Description

DESCRIÇÃO "COMPOSIÇÃO VACINAL ΑΝΤΙ-HÃEMOPHILLUS INFLUENZAE DE TIPO B COMPREENDENDO FOSFATO DE POLIRRIBOSILRIBITOL E SEU PROCESSO DE PREPARAÇÃO" A invenção insere-se no domínio das composições vacinais e mais particularmente das composições vacinais que compreendem pelo menos um antigénio constituído pelo polissacárido capsular de Haemophilus Influenzae de tipo b ou fosfato de polirribosilribitol com elevado peso molecular acoplado à anatoxina tetânica. É conhecido na técnica anterior, e nomeadamente pelo artigo "Quantitative and Qualitative Analyses of Serum Antibodies Elicited in Adults by Haemophilus influenzae Type b and Pneumococcus Type 6A Capsular Polysaccharide Tetanus Toxoid Conjugates" de Rachel Schneerson e col., Infect. Immun., Maio de 1986, Volume 52, págs. 519-520, um antigénio que se pode utilizar para fins vacinais no homem a fim de o proteger de infecções provocadas pelo Haemophilus influenzae do tipo b. Este antigénio é constituído por um polissacárido capsular da bactéria, o fosfato de polirribosillribitol (ou PRP) que se torna T-dependente graças a um acoplamento a uma proteína portadora, a anatoxina tetânica. Ensaios realizados em crianças rhesus demonstraram, assim o relata este artigo, que a resposta imunitária era ao mesmo tempo muito importante e muito precoce, se o antigénio estivesse associado a hidróxido de alumínio. Todavia, assim o menciona um outro artigo intitulado "Clinicai and Immunologic responses to the capsular polysaccharide of Haemophilus influenzae tipo b alone or conjugated to tetanus toxoid in 18-23 month-old children", de Bo A Claesson e col., The Journal of Pediatrics, Maio de 1988, Volume 112, Número 5, págs. 695 -702, foi possível notar que este antigénio, absorvido em hidróxido de alumínio era, após armazenamento, menos imunogénico que o antigénio mantido em solução salina, o que pode ser devido a uma degradação do polissacárido. A fim de resolver este problema de estabilidade dos PRP-T, foi proposto na técnica anterior a sua liofilização. Esta solução, embora permitindo ao antigénio conservar o seu carácter imunogénio no decurso do tempo, apresenta contudo inconvenientes, nomeadamente ao nível do fabrico; a liofilização e as operações particulares de condicionamento que ela requer complicam o processo de fabrico, o que aumenta o custo. Além disso, no momento de administração, é necessário efectuar uma retoma do liofilizado, o que significa que é necessário dispor além do liofilizado um líquido de retoma deste liofilizado; esta operação representa um constrangimento suplementar para o profissional de medicina e comporta, como qualquer manipulação, o risco de ser mal efeçtuada.

Além disso, algumas combinações vacinais líquidas possuem antigénios absorvidos sobre um adjuvante à base de alumínio e seria vantajoso poder, sem perda de imunogenicidade, adicionar-lhe o antigénio constituído pelo PRP-T. Com efeito, a solução proposta pela técnica anterior e consistindo numa seringa particular com 2 compartimentos (um primeiro compartimento contendo o PRP-T sob a forma liofilizada e um segundo compartimento contendo os outros antigénios em suspensão aquosa), cujo conteúdo é misturado extemporaneamente no momento da administração, não é scsLisfatória quer ao nível dos custos de fabrico quer ao nível das operações a efectuar pelo profissional de medicina. É portanto desejável poder dispor de composição vacinai líquida compreendendo o antigénio constituído pelo PRP-T tendo um muito bom carácter imunológico conservado no decurso do tempo, e cujas condições de fabrico permitam a produção com custo mínimo.

Para atingir estes fins, a invenção tem por objectivo uma composição vacinai compreendendo pelo menos um antigénio que é o fosfato de polirribosilribitol com elevado peso molecular constitutivo do polissacárido capsular de Haemophilus influenzae do tipo b acoplado à anatoxina tetânica, assim como um adjuvante à base de alumínio, caracterizada por o adjuvante à base de alumínio apresentar um ponto de carga zero inferior a 7,2.

Notou-se assim que, de forma surpreendente, nestas condições, o PRP-T conservava no decurso do tempo em meio líquido, o seu muito bom carácter imunogénico.

De acordo com uma característica particular da invenção o adjuvante à base de alumínio compreende hidróxidos de alumínio aos quais se adicionaram aniões.

; % L ^ Π

A

Assim, é possível utilizar um adjuvante perfeitamente qualificado para uma utilização vacinai conservando contudo o PRP-T em meio líquido uma muito boa imunogenicidade.

De acordo com uma outra característica da invenção, os aniões são e3colhido3 de entre os fosfatoo ou oc citratos.

Assim, a composição obtida apresenta todas as garantias de segurança necessárias para uma administração vacinai.

De acordo com um modo de realização particular da invenção, a composição vacinai compreende também uma ou várias valências vacinais escolhidas de entre: a difteria, o tétano, a tosse convulsa, a hepatite B, a poliomielite.

Pode assim dispor-se de combinações vacinais liquidas, estáveis, nas quais cada antigénio conserva a sua imunogenicidade, o que permite ao profissional de medicina, sem manipulação suplementar da sua parte, vacinar simultaneamente contra várias doenças; isto permite simultaneamente reduzir os custos no que respeita aos produtos e no que respeita ao número de visitas a efectuar. A invenção tem igualmente por objecto um processo de preparação de uma composição vacinai compreendendo pelo menos um antigénio constituído pelo fosfato de polirribosilribitol com elevado peso molecular constitutivo do polissacárido capsular de Haemophilus influenzae do tipo b acoplado à anatoxina tetânica, caracterizado por consistir em adicionar à composição vacinai, por meio de uma suspensão, complexos de alumínio possuindo um ponto de carga zero inferior a 7,2. 4 ί

A presente invenção será melhor compreendida pela leitura da descrição pormenorizada que se segue. 0 antigénio constituído pelo polissacárido capsular de Haemophilus influenzae do tipo b é um polímero linear consistindo em ribose, ribitol e ácido fosfórico cuja estrutura de monómero é a seguinte:

OH

HO OCH2CHCHCHCH2OP02

OH OH

----------O OH 0 número de monómeros deste tipo é elevado (superior a 100), o que conduz a um polissacárido cujo peso molecular é da ordem de 500 000 a 1 000 000. A fim de induzir uma resposta imunitária das células T nos jovens, este antigénio é conjugado com uma proteína portadora constituída pela anatoxina tetânica.

Um tal antigénio pode por exemplo ser obtido de acordo com o método descrito em "Quantitative and Qualitative analysis of serum antibodies elicited in adults by Haemophilus influenzae type b and Pneumococcus type 6A capsular polysaccharide-tetanus toxoid conjugates" de Schneerson e col., Infect.Immun. 52-519 (1986).

As características próprias a este antigénio são: número elevado de monómeros do polissacárido, natureza da proteína portadora, natureza da ligação entre o polissacárido e a 5 - u proteína portadora, conferindo-lhe qualidades particulares e nomeadamente uma muito boa imunogenicidade. A fim de conservar estas qualidades em meio líquido com o decorrer do tempo, verificou-se agora que se podiam utilizar complexos de alumínio cujo puaLo de carga zero era inferior a 7,2. Com efeito, verificou-se que, de forma surpreendente, quando o PRP-T está associado a tais complexos de alumínio, o seu muito bom carácter imunogénico é conservado no decurso do tempo em meio liquido e isto, seja qual for o seu grau de fixação aos complexos de alumínio. 0 ponto de carga zero dos complexos de alumínio é o equivalente do ponto isoeléctrico das proteínas: é o pH ao qual a carga em superfície dos complexos de alumínio é nula. De facto, este ponto de carga zero é avaliado por medidas de potencial zeta que podem ser realizadas de acordo com diferentes técnicas, sendo o método de base a electroforese. É possível efectuar as medidas por meio de um aparelho como por exemplo o DELSA 440 de Coulters Electronics, Hialeah, Fl, EUA.

Podendo os métodos e aparelhos de medida ser diferentes, os resultados obtidos podem igualmente variar. Os complexos de alumínio convenientes para os fins da invenção são aqueles para os quais este ponto de carga zero é inferior a 7,2, sendo este valor de 7,2 apenas aproximado.

Os complexos de alumínio convenientes para os fins da invenção são aqueles que, por natureza, têm um ponto de carga zero inferior a 7,2 ou os que podem ser modificados a fim de baixar o seu ponto de carga zero. 6

De entre os complexos de alumínio possuindo por natureza um ponto de carga zero interior a 7,2, podem citar-se os que são vulgarmente chamados fosfatos de alumínio no domínio dos adjuvantes vacinais, ainda que do ponto de vista químico, eles possuam outros sais além dos fosfatos de alumínio. Trata-se pox exemplo do fosfato de alumínio ADJUFOS® fornecido pela sociedade SUPERFOS BIOSECTOR a/s.

Podem tratar-se igualmente de complexos de alumínio obtidos pela reacção de carbonato de sódio em tampão PBS com sulfatos de potássio e de alumínio.

Com tais complexos, ainda que o PRP-T esteja completamente ou parcialmente ligado aos complexos de alumínio, a sua imunogenicidade é conservada no decurso do tempo.

Alternativamente, é possível de acordo com a invenção utilizar-se complexos de alumínio que, por natureza, tenham um ponto de carga zero superior a 7,2 e que são modificados para baixar este ponto de carga.

Trata-se nomeadamente de complexos de alumínio conhecidos no domínio dos adjuvantes vacinais como sendo hidróxidos de alumínio, ainda que do ponto de vista químico, eles não sejam constituídos exclusivamente por hidróxido de alumínio. Pode nomeadamente tratar-se do hidróxido de alumínio ALHYDROGEL® fornecido pela sociedade SUPERFOS BIOSECTOR a/s, do produto utilizado como adjuvante em D.T.Coq™ comercializado pela Sociedade PASTEUR MERIEUX S&V ou ainda do produto utilizado como adjuvante no Recombivax® comercializado pela Sociedade MERCK. ι - .4" t:

De acordo com a invenção, a modificação destes complexos de alumínio consiste na adição de anioes. Os anioes adicionados podem ser de diferentes naturezas, com a condição de apresentarem todas as garantias de segurança necessárias para uma utilização para fins vacinais. Verificou-se que a adlçâO de iões ci Lícitos ou de iões fosfatos convinha muito particularmente bem para os fins da invenção. Os iões fosfatos podem nomeadamente ser incorporados por meio de uma solução contendo fosfato monopotássico, fosfato dissódico e cloreto de sódio. É possível igualmente utilizar uma combinação de diferentes aniões, por exemplo uma combinação de iões fosfatos e de iões carbonatos. É possível que os aniões sejam adicionados à suspensão de complexos de alumínio antes da adição do PRP-T, ou que os aniões sejam adicionados ao PRP-T antes da colocação em contacto com os complexos de alumínio. Por comodidade, prefere-se utilizar o PRP-T em suspensão numa solução contendo os aniões escolhidos antes de o colocar em contacto com o adjuvante. A quantidade de aniões adicionados é calculada para baixar o ponto de carga zero dos complexos de alumínio utilizados a um valor inferior a 7,2. Esta quantidade varia portanto em função da natureza dos complexos de alumínio utilizados assim como da quantidade de aniões eventualmente conferida pelas substâncias tampão utilizadas. A sua determinação pode ser feita pelo especialista na matéria. 8 i i

JSs. \

Assim, obtém-se uma composição vacinai estável no estado liquido, quer · dizer em que o PRP-T conserva o seu bom carácter imunogénico.

Notou-se além disso que, graças à adição de aniões, a fixação do PRP-T aos complexos de alumínio cra reduzida, o que deve contribuir para a manutenção da sua integridade e portanto da sua imunogenicidade.

Ainda que isso não seja preferencial para o objectivo da invenção, é possível igualmente adicionar aniões aos complexos de alumínio tendo por natureza um ponto de carga zero já inferior a 7,2. Neste caso, verificou-se que o ponto de carga zero pode ser baixado, e que a fixação do PRP-T aos complexos de alumínio é igualmente reduzida.

Por fixação, entende-se qualquer forma de ligação que torne o PRP-T inacessível à dosagem quando, após centrifugação, se recolhe o sobrenadante.

As composições vacinais de acordo com a invenção compreendem o antigénio vacinai constituído pelo PRP-T mas podem compreender igualmente outros antigénios vacinais e nomeadamente os destinados à protecção contra a difteria, o tétano, a tosse convulsa (celular ou acelular), a poliomielite, a hepatite A, a hepatite B ... etc. Enfim, qualquer antigénio vacinai compatível com o PRP-T e os complexos de alumínio é susceptível de entrar na composição vacinai de acordo com a invenção. Pode assim dispor-se de combinações vacinais líquidas permitindo, numa só administração, vacinar contra várias doenças. As composições vacinais de acordo com a invenção são particularmente 9 f ' I--^^Sa. !] adaptadas para a administração a crianças.

Além disso, verificou-se que a utilização de tal composição vacinai liquida permitia durante a vacinação de nova dose efectuada nos lactentes de 12 meses que tinham recePido injecções com 2, 4 e 6 meses, aumentar a produção do anticorpos anti-PRP-T de forma particularmente acrescida em relação a uma nova dose nas mesmas condições com a vacina TETRAct-HlB™ comercializada pela Sociedade PASTEUR MERIEUX Sérums et Vaccins.

Exemplo 1

Prepara-se uma composição a partir dos elementos seguintes: 1 unidade vacinante 1 unidade vacinante 15 OU (unidades 12 yg 43,75 yg 0,3 mg 30 ymoles 0,125 ml 0,5 ml • anatoxina tetânica purificada (ATP) • anatoxina diftérica purificada (ADP) • mistura celular Pertussis opacimétricas) • PRP-T (expresso em peso de PRP) • mertiolato • hidróxido de alumínio (expresso em AI tal como o presente no D.T. Coq™ • fosfatos • tampão tris 10 molar compreendendo sacarose a 8,5% • água p.p.i. qbp

Os iões fosfatos são incorporados a partir de uma solução contendo fosfato monopotássico, fosfato dissódico e cloreto de sódio. 10

Exemplo 2

Determinou-se em crianças a imunogenicidade da composição vacinai obtida de acordo com o exemplo 1, comparativamente com a imunogenicidade de uma vacina da técnica anterior, constituída pela vacina comercializada sob a marca TETRAct-HIB™ e que possui as mesmas valências vacinais mas em que a valência PRP-T conservada liofilizada é reconstituída imediatamente antes da injecção pela composição vacinai contendo as anatoxinas diftéricas, tetânicas assim como a mistura celular Pertussis.

Este teste foi realizado num grupo de 262 lactentes, dos quais 130 receberam a formulação de acordo com o exemplo 1 e 132 receberam a vacina comercial TETRAct-HIB™. A administração de vacinas foi efectuada aos 2, 6 e 12 meses por via intra-muscular.

Antes da imunização, o título GMT em anticorpos anti-PRP era de 0,2 pg/ml nos dois grupos; era de 1,9 e 1,4 pg após a segunda injecção e de 5,9 e 5,8 após a terceira injecção respectivamente para a vacina de acordo com a invenção e a vacina da técnica anterior.

Após a segunda injecção, 98% (com a vacina de acordo com a invenção) e 93% (com a vacina de acordo com a técnica anterior) dos lactentes tinham uma taxa de anticorpos anti-PRP superior a 0,15 pg/ml; esta taxa era atingida após a 3a injecção em 100% dos lactentes que haviam recebido a vacina de acordo com a invenção e em 99% dos lactentes que haviam recebido a vacina de acordo com a técnica anterior.

Após a terceira injecção, as quantidades de anticorpos dirigidos contra cada uma das valências vacinais eram em média as seguintes:

Vacina da técnica anterior Vacina da invenção Difteria UI/ml 1,35 1,56 Tétano UI /ml 5,1 4,9 Titulo Agglutin.Pertussis GMT 597 601 PRP μg/ml 5, 8 5,9

Após a injecção de nova dose efectuada aos 12 meses, as quantidades de anticorpos eram desta vez:

Vacina da técnica anterior Vacina da invenção Difteria UI/ml 3,2 4,5 Tétano UI/ml 12, 0 11,5 Titulo Agglutin. Pertussis GMT 2447 2560 PRP μς/ml 19, 4 32, 6

Estes resultados mostram que a combinação vacinai obtida de acordo com a invenção é estável; com efeito a injecção de nova dose efectuada em crianças de 12 meses, foi realizada com uma vacina que tinha sido preparada 18 meses antes: ora i

os resultados mostram que a imunogenicidade de cada um dos antigénios da combinação é conservada. Além disso, obtém-se, de forma surpreendente, um efeito de nova dose claramente superior com a composição vacinai de acordo com a invenção, em relação ao efeito de nova dose obtido com uma vacina da Lécniud anterior possuindo as mesmas valências vacinais.

Exemplo 3 São mantidas doses de composição vacinai tal como descrita no exemplo 1 a +4°C durante 18 a 24 meses e em seguida são utilizadas num ensaio que inclui 104 crianças.

Os títulos obtidos para cada uma das valências vacinais são recapitulados no quadro seguinte.

Antes da vacinação Depois da vacinação Difteria G.M.T. 0, 013 0, 736 Tétano G.M.T. 0,181 3, 831 PRP G:M.T. pg/ml 0,22 6,40

Pode assim verificar-se que, mesmo após um armazenamento de longa duração a +4°C, a composição vacinai de acordo com a invenção conserva o seu carácter imunogénico, quer em relação ao PRP-T quer quanto a outros antigénios vacinais.

Exemplo 4

Preparam-se composições vacinais compreendendo cada uma PRP-T numa concentração de 20 pg de PRP/ml, na presença de 13

complexos de alumínio de diferentes naturezas, e de diferentes pontos de carga zero (PCZ) . A quantidade de complexos de alumínio é tal que a concentração em alumínio nas composições é de 0,6 g/1.

Composição 1: Complexo de alumínio constituído por hidróxido de alumínio tal como o utilizado na vacina D.T.Coq™ comercializado pela PMsv. PCZ=11,3

Composição 2: Complexo de alumínio constituído por hidróxido de alumínio tal como o utilizado na vacina Recombivax® comercializada pela Merck. PCZ=7,4

Composição 3: Complexo de alumínio constituído por fosfato de alumínio obtido pela mistura de cloreto de sódio e de fosfato trissódico. PCZ=6,2

Composição 4: Complexo de alumínio constituído pelo produto chamado Alum e obtido pela reacção de carbonato de sódio em tampão PBS com sulfatos de potássio e de alumínio. PCZ=5,4

As composições vacinais são obtidas por simples mistura das suspensões contendo os complexos de alumínio e PRP-T.

Exemplo 5

Determina-se a imunogenicidade em ratos das diferentes composições obtidas. A fim de verificar a estabilidade imunogénica, submetem-se as composições a condições de envelhecimento acelerado, 14

I

V por exemplo conservando-as durante 2 semanas a 37°C. 0 teste de imunogenicidade é efectuado em ratos de 22-24 g aos quais se administram doses sub-cutâneas de 0,5 ml contendo cada uma 2,5 pg de PRP. As administrações são efectuadas no DO e no D14. ReLira-se o sangue do3 ratos no D14 e no D21 e determina-se a taxa de anticorpos por dosagem radio- imunológica. O número de ratos inoculados para cada composição vacinai é de 8. O resultado é considerado satisfatório se: • houver pelo menos 75% de ratos que tenham um titulo ^ 0,5, • houver uma diferença significativa entre os resultados obtidos no D14 e os obtidos no D21.

Considera-se que a composição vacinai obtida é estável se os resultados obtidos após envelhecimento acelerado forem satisfatórios.

Os resultados obtidos para as composições testadas são resumidos no quadro a seguir apresentado: PCZ Teste imuno. Cl 11, 3 Não satisfatório C2 7,4 Não satisfatório C3 6,2 Satisfatório C4 5,4 Satisfatório 15

de carga zero dos composição vacinai

Verifica-se assim que quando o ponto complexos de aluminio é um pH ácido, a obtida é estável.

Exemplo 6

Verifica-se para cada uma das composições do exemplo 4, a percentagem de PRP-T fixado aos complexos de aluminio.

Para isso, centrifuga-se cada uma das composições; recolhe-se o sobrenadante no qual se determina por ELISA ou por RIA a quantidade de PRP-T não fixado. A diferença entre a concentração de PRP-T na composição de partida e a quantidade doseada no sobrenadante permite determinar a percentagem de PRP-T fixado.

Os resultados obtidos são a seguir descritos:

Cl : 100% C2 : 100% C3 : 100% C4 : 70%

Exemplo 7

Modifica-se a composição 1 adicionando-lhe iões fosfatos a fim de se obter uma concentração de 50 mMole/1. O teste de imunogenicidade realizado em ratos após envelhecimento acelerado da solução conduz então a um resultado satisfatório. 16

I

A determinação da percentagem de fixação do PRP-T aos cuiuplexos de alumínio mostra que, nestas condições, só 20% do PRP-T é fixado.

Exemplo 8

Modifica-se a composição 1 adicionando-lhe desta vez iões citratos a fim de se obter uma concentração de 200 mMole/1. 0 teste de imunogenicidade realizado em ratos após envelhecimento acelerado da solução conduz então a um resultado satisfatório. A determinação da percentagem de fixação do PRP-T aos complexos de alumínio mostra que, nestas condições, o PRP-T não é fixado.

Exemplo 9

Modifica-se a composição 2 adicionando-lhe iões fosfatos a fim de se obter uma concentração de 20 mMole/1. 0 teste de imunogenicidade realizado em ratos após envelhecimento acelerado da solução conduz então a um resultado satisfatório. A determinação da percentagem de fixação do PRP-T aos complexos de alumínio mostra que, nestas condições, o PRP-T já não é fixado.

Exemplo 10

Modifica-se a composição 3 adicionando-lhe iões fosfatos em diferentes quantidades e determina-se a percentagem de fixação do PRP-T aos complexos de alumínio. 17 I ' 1 η-

Se a quantidade de iões fosfatos adicionada for tal que a concentração em fosfatos na composição é de 2 mMole/1/ a percentagem de PRP-T fixada é reduzida a 10%.

Se a quantidade de iões fosfatos adicionada for tal que a concentração em fosfatos na composição é de 4 mMole/1, o PRP-T já não é fixado.

Os testes de imunogenicidade realizados em ratos após envelhecimento acelerado da solução são satisfatórios.

Exemplo 11

Modifica-se a composição 4 adicionando-lhe iões fosfatos para atingir uma concentração de 60 mMole/1. A determinação da percentagem de PRP-T fixado aos complexos de alumínio mostra que, nestas condições, só 30% do PRP-T é fixado. 0 teste de imunogenicidade realizado em ratos após envelhecimento acelerado da solução conduz a um resultado satisfatório.

Exemplo 12

Prepara-se uma composição vacinai a partir dos elementos seguintes: • Hidróxido de Alumínio (expresso em Al) 0,25 mg • PRP-T (expresso em peso de PRP) 10 pg • ADP 1 dose vacinante • ATP 1 dose vacinante 18

f • Fosfatos 15 μΜοΙθΞ • Antigénes Polio tipo I 40 U tipo II 8 U tipo III 32 U • Anatoxina Pertussis 25 μg • F-HA Pertussis 25 μg • Tampão tris 50 mmolar compreendendo 0,125 ml sacarose a 42,5% • Água p.p.i. qbp 0, 5 ml

Os testes de imunogenicidade relativos ao PRP-T realizados em ratos com uma solução assim preparada, assim como com uma solução armazenada 1 mês a 37°C, uma solução armazenada 2 meses a 25°C, e uma solução armazenada 6 meses a 4°C, conduziram todos a resultados satisfatórios, o que mostra a estabilidade do PRP-T num tal ambiente.

Exemplo 13

Prepara-se uma composição vacinai a partir dos elementos seguintes: • Hidróxido de Alumínio (expresso em Al) • PRP-T (expresso em peso de PRP) • ADP • ATP • Anatoxina Pertussis • F-HA • Proteína Hbs (tal como presente na vacina GenHevac B PASTEUR®) 0,3 mg 10 μg 1 dose vacinante 1 dose vacinante 25 μg 25 μg 20 μg 19

• Antigénes Polio tipo I 40 U tipo II 8 U tipo III 32 U • Fosfatos 20 pMoles • Carbonatos 5 pMoles • Tampão tris 50 mMolar 0,125 ml compreendendo sacarose a 42,5% • Água p.p.i. qbp 0, 5 ml

Verifica-se a estabilidade da solução assim preparada submetendo-a durante 2 semanas a 37°C e efectuando em seguida um teste de imunogenicidade do PRP-T em ratos como foi descrito no exemplo 5.

Os resultados obtidos são satisfatórios.

Realiza-se um teste de imunogenicidade da proteína Hbs; este teste foi realizado em ratos e consiste em dosear os anticorpos anti-Hbs por ELISA, em seguida determina-se a Dose Eficaz de 50% que deve, para que o teste seja considerado satisfatório, ser inferior a 0,970 pg de proteína Hbs.

Os resultados obtidos com a solução preparada como acima indicado e mantida durante 2 semanas a 37 °C antes de ser testada, foram satisfatórios.

Exemplo 14

Prepara-se uma composição vacinai a partir dos elementos seguintes: 20 • Hidróxido de Alumínio (expresso em Al) 0,3 mg • PRP-T (expresso em peso de PRP) 10 μς • ADP 1 dose vacinante • ATP 1 dose vacinante • Anatoxina Pertussis 10 μς • F-HA 5 μg • Fimbriae 5 μς • Pertactina 3 μς • Proteína Hbs (tal como presente na vacina GenHevac B PASTEUR®) 20 μg • Antigénes Polio tipo I 40 ϋ tipo II 8 ϋ tipo III 32 U • Fosfatos 20 μΜοΙββ • Carbonatos 10 μΜοΙθβ • MgCl2 5 μΜοΙβε • Tampão tris 50 mMolar compreendendo sacarose a 42,5% 0,125 ml • Água p.p.i. qbp 0,5 ml

Os testes de imunogenicidade relativos ao PRP-T realizados como foi descrito no exemplo 5, e os relativos à proteína Hbs realizados assim como foi descrito no exemplo 13, conduziram todos a resultados satisfatórios, demostrando a estabilidade da composição vacinai de acordo com a invenção.

Lisboa, 31 de Outubro de 2001

O AGENTE OFICIAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL

Claims

ί

REIVINDICAÇÕES 1. Composição vacinai que compreende pelo menos um antigénio que é o fosfato de polirribosilribitol com elevado peso molecular constitutivo do polissacárido capsular de Haemophilus influenzae do tipo b acoplado à anatoxina tetânica assim como um adjuvante à base de alumínio, caracterizada por o adjuvante à base de alumínio apresentar um ponto de carga zero inferior a 7,2.
2. Composição vacinai de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o adjuvante à base de alumínio compreender hidróxidos de alumínio aos quais foram adicionados aniões.
3. Composição vacinai de acordo com a reivindicação 2, caracterizada por os aniões serem escolhidos de entre fosfatos e citratos.
4. Composição vacinai de acordo com uma das reivindicações anteriores, caracterizada por o adjuvante à base de alumínio compreender fosfatos de alumínio.
5. Composição vacinai de acordo com uma das reivindicações anteriores, caracterizada por o adjuvante à base de aluminio compreender sulfatos de potássio e alumínio.
6. Composição vacinai de acordo com uma das reivindicações 1 anteriores, caracterizada por compreender também uma ou várias valências vacinais escolhidas de entre: a difteria, o tétano, a tosse convulsa, a hepatite B, a poliomielite.
7. Processo de preparação de uma composição vacinai compreendendo pelo menos um antigénio constituído pelo fosfato de polirribosilribitol com elevado peso molecular constitutivo do polissacárido capsular de Haemophilus influenzae do tipo b acoplado à anatoxina tetânica, caracterizado por consistir em adicionar a composição vacinai por meio de uma suspensão complexos de alumínio que tenham um ponto de carga zero inferior a 7,2.
8. Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por a suspensão de complexos de alumínio compreender aniões escolhidos de entre fosfatos e citratos. Lisboa, 31 de Outubro de 2001 O AGENTE OFICIAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL

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