CZ289810B6

CZ289810B6 - Vakcínová kompozice obsahující alespoň jeden antigen a způsob její přípravy

Info

Publication number: CZ289810B6
Application number: CZ19973597A
Authority: CZ
Inventors: Francois Arminjon; Jean René Cartier
Original assignee: Pasteur Merieux Serums Et Vaccins S. A.
Priority date: 1995-05-24
Filing date: 1996-05-24
Publication date: 2002-04-17
Also published as: FR2734484A1; MX9709011A; HU223941B1; EA199700419A1; DE122011100030I1; TR199701424T1; FR2734484B1; ES2162067T3; HK1017251A1; US6333036B1; HUP9901432A3; HUP9901432A2; EA000411B1; NO2011019I1; DE69620271T2; NO2011019I2; ATE207365T1; CA2218764C; AU708777B2; EP0828511A1

Abstract

e en m je vakc nov kompozice obsahuj c alespo jeden antigen vytvo°en² kapsul rn m polysacharidem ch°ipky Haemophilus typu b nebo polyribosylribitolfosf tem o vysok molekulov hmotnosti kondenzovan²m k anatoxinu tetanu a adjuvans na b zi hlin ku, ve kter adjuvans na b zi hlin ku m bod nulov ho n boje men ne 7,2. e en m tak je zp sob p° pravy takov vakc nov kompozice, kter² spo v v tom, e se nejprve sn bod nulov ho n boje adjuvans na b zi hlin ku na m n ne 7,2 a pot se k v²choz kompozici vakc ny p°id antigen vytvo°en² kapsul rn m polysacharidem ch°ipky Haemophilus typu b.\

Description

Oblast techniky

Tento vynález se týká oblasti vakcínových kompozic a zejména se týká vakcínových kompozic, které obsahují alespoň jeden antigen vytvořený kapsulámím polysacharidem chřipky Haemophilus typu b nebo polyribosylribitolfosfátem o vysoké molekulové hmotnosti kondenzovaným na anatoxin tetanu.

Dosavadní stav techniky

Antigen, který se může použít pro účely vakcinace u člověka, a jehož účelem je ochrana člověka před infekcemi způsobenými chřipkou Haemophilus typu b, je znám podle dosavadního stavu znalostí a zejména z článku „Quantitative and Qualitative Analyses of Sérum Antibodies Elicited in Adults by Haemophilus influenzae Type b and Pneumococcus Type 6A Capsular Polysaccharide Tetanus Toxoid Conjugates“, Ráchel Schneerson a kol., Infect. Immun. (květen 1986). Tento antigen je vytvořen kapsulámím polysacharidem baktérie, polyribosylribitolfosfátem (PRP), který je T-dependentní následkem kondenzace na nosičový protein, anatoxin tetanu. Zkoušky prováděné na rheus dětem ukazují, jak tento článek uvádí, že imunitní odezva je v jednom a témže čase větší a časnější, pokud antigen je doprovázen hydroxidem hlinitým. Avšak jak ukazuje jiný článek o názvu „Clinical and Immunologic Responses to the Capsular Polysaccharide of Haemophilus Influenzae Type b Alone or Conjugated to Tetanus Toxoid in 18-23 Month-old Children“, Bo A. Claesson a kol., The Joumal of Pediatrics (květen 1988), upozorňuje se, že tento antigen, adsorbovaný na hydroxidu hlinitém, je méně imunogenní po skladování než antigen udržovaný ve fyziologickém roztoku, co může být důsledkem degradace polysacharidu.

Aby se vyřešil problém stability PRP-T, podle dosavadního stavu techniky bylo navrženo provést jeho lyofilizaci. Toto řešení rovněž projevuje určité nevýhody, zejména však při výrobní úrovni, i když dovoluje antigenu zachovat jeho imunogenní charakter v průběhu času. Lyofilizace a zvláštní operace kondicionování, která se požaduje, komplikují výrobní proces, což zvyšuje náklady. Kromě toho v době podání je nezbytné znovu absorbovat lyofilizát, což znamená, že je nutné mít kromě lyofilizátu i kapalinu pro absorbování tohoto lyofilizátu. Tato operace představuje doplňkové omezení pro praktického pracovníka a představuje riziko, podobně jako jakákoli manipulace, že bude provedena špatně.

Kromě toho určitý počet kapalných vakcínových kombinací má antigeny adsorbované na adjuvand na bázi hliníku a je výhodné, že jsou schopny bez ztráty imunogenity, umožnit přidání antigenu vytvořeného PRP-T k této substanci. Ve skutečnosti řešení navržené podle dosavadního stavu techniky a spočívající ve zvláštní injekční stříkačce se dvěma odděleními (první oddělení obsahuj PRP-T v lyofilizované formě a druhé oddělení obsahuje jiné antigeny ve vodné suspenzi), jejichž obsahy se smíchají pro použití pouze v době podání, není uspokojivé buď z důvodu hladiny nákladů na produkci nebo úrovně operací, které musí být prováděny praktickým pracovníkem.

Je žádoucí být schopen mít kapalnou vakcínovou kompozici sestávající z antigenu vytvořeného PRP-T projevujícího velmi dobrý imunogenní charakter zachovávaný v průběhu času a jehož podmínky přípravy dovolují produkci při nejnižších nákladech.

Podstata vynálezu

Předmětem tohoto vynálezu je vakcínová kompozice obsahující alespoň jeden antigen vytvořený kapsulámím polysacharidem chřipky Haemophilus typu b nebo polyribosylribitolfosfátem o vysoké molekulové hmotnosti kondenzovaným k anatoxinu tetanu a adjuvans na bázi hliníku, ve které adjuvands na bázi hliníku má bod nulového náboje menší než 7,2.

Předmětem tohoto vynálezu také je způsob přípravy výše uvedené vakcínové kompozice, který spočívá v to, že se nejprve sníží bod nulového náboje adjuvans na bázi hliníku na méně než 7,2 a poté se k němu přidá alespoň jeden antigen vytvořený kapsulámím polysacharidem chřipky Haemophilus typu b nebo polyribosylribitolfosfátem kondenzovaným k anatoxinu tetanu.

Některé jiné znaky tohoto vynálezu jsou uvedeny dále.

Je třeba poznamenat, že překvapivě za těchto podmínek si PRP-T uchovává v průběhu času v kapalném prostředí svůj velmi dobrý imunogenní charakter.

Podle zvláštní charakteristiky vynálezu adjuvans na bázi hliníku zahrnuje hydroxidy hlinité, ke kterým jsou přidány aniony.

Tak je možné použít adjuvans přesně kvalifikované pro použití vakcíny, i když si PRP-T uchovává v kapalném prostředí velmi dobrou imunogenitu.

Podle jiné charakteristiky vynálezu se aniony volí z fosfátů a citrátů.

Tak získané kompozice mají vždy záruku míry bezpečnosti, která je nutné pro podávání vakcíny.

Podle zvláštního způsobu provedení vynálezu vakcínová kompozice kromě toho zahrnuje jednu nebo větší počet vakcínových valencí zvolených ze záškrtu, tetanu, černého kašle, hepatitidy B a poliomyelitidy.

Tak je možné dostat kapalnou stabilní vakcínovou kompozici, ve které každý antigen uchovává svou imunogenitu, co dovoluje praktickému pracovníkovi bez dodatečné manipulace zjeho strany vakcinovat současně proti několika chorobám. To umožňuje snížit náklady na jeden produkt i pokud se tak současně týká dalších produktů, stejně jako pokud jde o počet návštěv.

Tento vynález se obdobně týká způsobu přípravy vakcínové kompozice obsahující alespoň jeden antigen vytvořený kapsulámím polysacharidem chřipky Haemophilus typu b nebo polyribosylribitolfosfátem o vysoké molekulové hmotnosti kondenzovaným k anatoxinu tetanu, který spočívá v tom, že se přidá adjuvans k vakcínové kompozici pomocí suspenze komplexů hliníku, které mají bod nulového náboje menší než přibližně 7,2.

Tomuto vynálezu se lépe porozumí přečtením podrobného popisu, který s uvádí dále.

Antigen vytvořený kapsulámím polysacharidem chřipky Haemophilus typu b je přímý polymer sestávající z ibózy, ribitolu a kyseliny fosforečné, který má monomemí strukturu vyjádřenou vzorcem

OH _o_ OCHjCHCHCHCHjOPOr

HO i oj ||

M OH OH

...........O OH

-2CZ 289810 B6

Počet monomerů tohoto typu je vysoký (vyšší než 100), co vede k polysacharidu, jehož molekulová hmotnost je řádově 500 000 a 1 000 000.

Za účelem vyvolání imunitní odezvy T buněk malých dětí se tento antigen kondenzuje k nosičovému proteinu vytvořenému anatoxinem proteinu.

Takový antigen se může například dostat způsobem, který je popsán v „Quantitative and Qualitative Analysis of Sérum Antibodies Elicited in Adults by Heamophilus Influenzae Type b and Pneumococcus Type 6A Capsular Polysaccharide-tetanus Toxoid Conjugates“, Schneerson a kol., Infect. Immun., 52, 519 (1986).

Charakteristické vlastnosti příslušné tomuto antigenů a to vysoký počet monomerů polysacharidu, povahu nosičového proteinu a povaha vazby mezi polysacharidu, povaha nosičového proteinu a povaha vazby mezi polysacharidem a nosičovým proteinem, udělují zvláštní jakost tomuto antigenů a zejména jeho velmi dobrou imunogenitu.

K dosažení této jakosti v kapalném prostředí v průběhu času bylo nyní nalezeno, že je možné používat komplexy hliníku, jejichž bod nulového náboje je menší než přibližně 7,2. Ve skutečnosti bylo s překvapením nalezeno, že pokud PRP-T je doprovázen takovými komplexy hliníku, jeho velmi dobrý charakter imunogenity se udržuje v průběhu doby v kapalném prostředí a to nastává ve všech jeho stupních imobilizace na komplexy hliníku.

Bod nulového náboje komplexů hliníku je ekvivalentní isoelektrickému bodu proteinů, to je hodnotě pH, při které náboj na povrchu komplexů hliníku je nulový. Ve skutečnosti se tomuto bodu nulového náboje přiblíží změřením zeta potenciálu, přičemž měření se může provádět rozdílnými technickými postupy, avšak základní metodou je elektroforéza. Je možné provádět měření pomocí přístroje, jako je DELSA 440 firmy Coulter Elektronics, Hialeah, Fl, USA.

Měřicí metody a přístroj mohou být rozdílné a získané výsledky se mohou pravděpodobně lišit. Mezi komplexy hliníku vhodné pro účely tohoto vynálezu patří komplexy, pro které tento bod nulového náboje je menší než přibližně 7,2, přičemž hodnota 7,2 je pouze hodnota přibližná.

Komplexy hliníku vhodné pro účely tohoto vynálezu jsou komplexy, které podle povahy mají bod nulového náboje menší než 7,2 nebo komplexy, které mohou být modifikovány za účelem snížení svého bodu nulového náboje.

Mezi komplexy hliníku, které mají povahu bodu nulového náboje menší než 7,2, je možné jmenovat takové komplexy, které jsou obecně označovány jako fosfáty hliníku v oblasti vakcínových adjuvans, a rovněž jestliže, z hlediska chemického, mají soli odlišné od fosfátu hliníku. Těmi je například ADJUFOS^(R) fosfát hlinitý, který dodává firma SUPERFOS BIOSECTOR a/s.

Takovými komplexy mohou být pravděpodobně komplexy hliníku, které byly získány reakcí uhličitanu sodného se síranem draselným nebo hlinitým v PBS pufru.

S takovými komplexy, kde PRP-RT je buď úplně nebo částečně vázán ke komplexům hliníku, se imunogenita může udržet v průběhu času.

Alternativně je možné podle tohoto vynálezu použít komplexů hliníku, které podle své povahy mají bod nulového náboje větší než 7,2 a které jsou modifikovány ke snížení tohoto bodu náboje.

Existují zvláštní komplexy hliníku známé v oblasti vakcínových adjuvans, jako hydroxidy hlinité, třebaže z chemického hlediska nejsou tvořeny výlučně z hydroxidu hlinitého. Zejména může jít o ALHYDROGEL^(R), hydroxid hlinitý dodávaný firmou SUPERFOS BIOSECTOR a/s, produkt

-3 CZ 289810 B6 používaný jako adjuvans v D. T. Coq™, který dodává na trh firmy PASTEUR MERIEUX Sérum et Vaccins nebo rovněž o produkt používaný jako adjuvans s Recombivax^, který je podáván na trhu firmou MERCK.

Podle tohoto vynálezu modifikace komplexů hliníku spočívá v přídavku anionů. Přidávané aniony mohou být rozdílné povahy za podmínky, že vždy je zaručena bezpečnost nutná pro použití k účelům vakcíny. Bylo pozorováno, že přídavek citrátových ionů nebo fosfátových ionů by zejména byl vhodný pro účely vynálezu. Fosfátové iony mohou obzvláště být dodávány roztokem, který obsahuje dihydrogenfosfát draselný, monohydrogenfosfát sodný a chlorid sodný.

Je pravděpodobně možné používat kombinaci rozdílných ionů, například kombinaci fosfátových ionů a uhličitanových ionů.

Je možné, aby aniony byly přidávány k suspenzi komplexů hliníku před přidáním PRP-T, nebo 15 aby aniony byly přidány k PRP-T před jeho uvedením do styku s komplexy hliníku. Podle potřeby je výhodné suspendovat PRP-T v roztoku, kteiý obsahuje zvolené aniony před jeho stykem s adjuvans.

Vypočítá se množství přidaného anionu ke snížení bodu nulového náboje použitých komplexů 20 hliníku na hodnotu menší než přibližně 7,2. Toto množství se mění jako funkce povahy použitých komplexů hliníku, stejně jako množství anionů, kterými případně přispívají použité pufrovací substance. Stanovení tohoto množství je v rozsahu znalostí odborníka v oboru.

Stabilní vakcínová kompozice v kapalném stavu se dostane, pokud si PRP-T uchová své dobré 25 imunogenní vlastnosti.

Dodatkově bylo pozorováno, že díky přidání anionů, imobilizace PRP-T na komplexech hliníku se sníží, co může přispět k zachování integrity a tak imunogenity.

Třebaže to není výhodné ve smyslu tohoto vynálezu, je pravděpodobně možné přidávat aniony ke komplexům hliníku, které podle povahy mají bod nulového náboje již menší než přibližně 7,2. V tomto případě se pozorovalo, že bod nulového náboje se může snížit a že imobilizace PRPT na komplexech hliníku se pravděpodobně omezí.

Výrazu imobilizace se má rozumět, že znamená jakoukoliv formu vazby způsobující, že PRP-T je nepřístupný pro dávku, pokud po odstředění se zachytí supematant.

Vakcínová kompozice podle tohoto vynálezu obsahuje antigen vakcíny vytvořený PRP-T, ale může pravděpodobně zahrnovat jiné antigeny vakcíny a zejména ty, které jsou zamýšleny pro 40 ochranu proti záškrtu, tetanu, černému kašli (buněčnému nebo nebuněčnému), poliomyelitidě, hepatitidě A, hepatitidě B a podobně. Ve skutečnosti libovolný antigen vakcíny kompatibilní s PRP-T a komplexy hliníku jsou schopny vstupovat do vakcínové kompozice podle tohoto vynálezu. Tak je možné mít kapalné vakcínové kompozice, které při jednoduchém podání dovolují vakcinaci proti vážným chorobám. Vakcínové kompozice podle tohoto vynálezu je 45 zvláště uzpůsobeny pro podávání malým dětem.

Kromě toho bylo pozorováno, že použití takové kapalné vakcínové kompozice během vakcinace posilovači dávkou, prováděné na dětech starých 12 měsíců, které dostaly injekce ve 2, 4 a 6 měsících dovoluje, aby produkce anti-PRP-T protilátek se zvýšila a zejména se zvýšila 50 s ohledem na posilovači dávku vedenou za stejných podmínek svakcínou TETRAct-HIB™, prodávanou firmou PASTEUR MERIEUX Sérum et Vaccins.

-4CZ 289810 B6

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Připraví se vakcínová kompozice a přitom se vychází z těchto složek:

Čištěný anatoxin tetanu (PTA)

Čištěný anatoxin záškrtu (PDA)

Směs buněk černého kašle

PRP-T (vyjádřeno jako hmotnost polyribosylribitolfosfátu)

Merthiolát

Hydroxid hlinitý (vyjádřeno jako hliník), jak je přítomen v D. T. Coq™ Fosfáty

10-mmolámí Tris-pufr obsahující 8,5 % (hmotn./obj.) sacharózy Voda pro injekce, qsp vakcinační jednotka vakcinační jednotka opacimetrických jednotek (OU) pg

43,75 pg

0,3 mg pmol

0,125 ml

0,5 ml

Fosfátové iony se přidají k výchozímu roztoku obsahujícímu dihydrogenfosfát draselný, monohydrogenfosfát sodný a chlorid sodný.

Příklad 2

Imunogenita vakcínové kompozice získané podle příkladu 1 se testuje na malých dětech při srovnání s imunogenitou vakcíny předchozího typu, kterou tvoří vakcína prodávaná pod názvem TETRAct-HIB™, jež má stejné vakcínové valence, ale kde lyofilizovaně uchovaná PRP-T valence se rekonstituuje právě před injekcí vakcínové kompozice obsahující anatoxiny záškrtu a tetanu, stejně jako buněčnou směs černého kašle.

Tento test se provádí na skupině 262 dětí, z nichž 130 obdrželo přípravek podle příkladu 1 a 132 obdrželo komerčně dostupnou vakcínu TETRAct-HIB™. Podávání vakcíny se provádí ve 2, 6 a 12 měsících intramuskulámě.

Před imunizací GMT titr anti-polyribosylribitolfosfátové protilátky činí 0,2pg/ml v obou skupinách, 1,9 a 1,4 pg/ml po druhé injekci a 5,9 a 5,8 pg/ml po třetí injekci pro vakcínu podle tohoto vynálezu a pro vakcínu podle dosavadního stavu techniky.

Po druhé injekci má 98 % (s vakcínou podle tohoto vynálezu) a 93 % (s vakcínou podle dosavadního stavu techniky) ze všech dětí hladinu anti-polyribosyltribitolfosfátové protilátky větší než 0,15 pg/ml. Tato hladina je dosažena po třetí injekci u 100% ze všech dětí, které obdržely vakcínu podle tohoto vynálezu a u 99 % ze všech dětí, které dostaly vakcínu podle dosavadního stavu techniky.

Po třetí injekci množství protilátek zaměřených proti každé z vakcínových valencí je v průměru toto:

-5CZ 289810 B6

	Vakcína podle dosavadního stavu techniky	Vakcína podle tohoto vynálezu
Záškrt mezinár. jednotek/ml	1,35	1,56
Tetanus mezinár. jednotek/ml	5,1	4,9
Pertussis aglutin. titr	597	601
GMT
PRP pg/ml	5,8	5,9

Po injekci posilovači dávky podané ve 12 měsících je množství protilátek v této době takovéto:

	Vakcína podle dosavadního stavu techniky	Vakcína podle tohoto vynálezu
Záškrt mezinár. jednotek/ml	3,2	4,5
Tetanus mezinár. jednotek/ml	12,0	11,5
Pertussis aglutin. titr	2447	2560
GMT
PRP pg/ml	19,4	32,6

Tyto výsledky ukazují, že vakcínová kombinace získaná podle tohoto vynálezu je stabilní. Ve skutečnosti injekce posilovači dávky podávaná dětem sterým 12 měsíců se provádí svakcínou, která byla připravena před 18 měsíci, avšak výsledky ukazují, že imunogenita každého z antigenů kombinace se zachovala. Kromě toho je překvapující, že se dostane účinek posilovači dávky, 10 který je zřetelně větší s vakcínovou kompozicí podle tohoto vynálezu, ve srovnání s účinkem posilovači dávky dosaženým s vakcínou podle dosavadního stavu techniky, která má stejné vakcínové valence.

Příklad 3

Dávky vakcínové kompozice, jako je popsána v příkladu 1, se udržuje za teploty 4 °C po dobu 18 až 24 měsíců a potom použijí při klinických zkouškách, které zahrnují 104 děti.

Dosažené titry pro každou z vakcínových valencí jsou shrnuty do tabulky zařazené dále.

Před vakcinaci Po vakcinaci

Záškrt	0,013	0,736
GMT
Tetanus GMT	0,181	3,831
PRP GMT gg/ml	0,22	6,40

Tak může být zřejmé, že rovněž po skladování během dlouhého období při teplotě +4 °C si vakcínová kompozice podle tohoto vynálezu uchovává svůj imunogenní charakter, jak pokud jde 25 o PRP-T, tak pokud jde o jiné antigeny obsažené ve vakcíně.

-6CZ 289810 B6

Příklad 4

Vakcínové kompozice obsahující PRP-T při koncentraci 20 pg polyribosylribitolfosfatu na ml se připraví v přítomnosti komplexů hliníku různých typů a při rozdílných bodech nulového náboje (PZC). Množství komplexů hliníku je takové, že koncentrace hliníku v kompozici činí 0,6 g/1.

Kompozice 1: Komplex hliníku vytvořený hydroxidem hlinitým, jako je použit vD. T. Coq™ vakcíně prodávané firmou Pasteur Merieux Sérum et Vaccins. Bod nulového náboje odpovídá 11,3.

Kompozice 2: Komplex hliníku vytvořený hydroxidem hlinitým, jako je použit v Recombivax^(R)vakcíně prodávané firmou Měrek. Bod nulového náboje odpovídá 7,4.

Kompozice 3: Komplex hliníku vytvořený fosfátem hlinitým, který byl získán smícháním chloridu sodného a fosfátu sodného. Bod nulového náboje odpovídá 6,2.

Kompozice 4: Komplex hliníku vytvořený produktem Alum, který byl získán reakcí uhličitanu sodného v PBS pufru na síranu draselném a hlinitém. Bod nulového náboje odpovídá 5,4.

Vakcínové kompozice se dostanou jednoduchým smícháním suspenzí obsahujících komplexy hliníku s PRP-T.

Příklad 5

Imunogenita získaných různých kompozic se testuje na myších.

Za účelem ověření imunogenní stability se získané kompozice podrobí podmínkám urychlujícím stárnutí, to znamená, že se udržují při teplotě 37 °C po dobu 2 týdnů.

Testy stanovení imunogenity se provádějí na myších o hmotnosti 22 až 24 g, kterým se subkutánně podávají dávky 0,5 ml přípravků, z nichž každý obsahuje 2,5 pg polyribosylribitolfosfátu. Podávání se provádí ve dnech 0 a 14. Krev myší se odebere ve dnech 14 a 21 a hladina protilátek se určí radioimunologickým stanovením. Počet naočkovaných myší pro každou vakcínovou kompozici je 8.

Výsledky jsou pokládány za uspokojivé, pokud:

* je alespoň 75 % ze všech myší ve dni 21, které mají titr větší nebo roven 0,5, * je signifikantní rozdíl mezi výsledky dosaženými ve dni 14 a výsledky dosaženými ve dni 21.

Předpokládá se, že získaná vakcínová kompozice je stabilní, pokud výsledky dosažené po urychlení stárnutí jsou uspokojující.

Dosažené výsledky pro testované kompozice jsou shrnuty v dále zařazené tabulce.

	PZC	Imunologický test
Cl	11,3	neuspokojivý
C2	7,4	neuspokojivý
C3	6,2	uspokojivý
C4	5,4	uspokojivý

-7CZ 289810 B6

Zdá se, že pokud bod nulového náboje komplexů hliníku leží v kyselé oblasti pH, získaná vakcínová kompozice je stabilní.

Příklad 6

Procento PRP-T imobilizovaného na komplexech hliníku se ověřuje pro každou kompozici v příkladu 4.

K tomuto účelu se každá z kompozic odstřeďuje, supematant se zachytí a vněm se změří množství neimobilizovaného PRP-T testem ELISA nebo RIA.

Rozdíl mezi koncentrací PRP-T ve výchozí kompozice a množství stanoveným v supematantu dovoluje stanovit procentuální obsah imobilizovaného PRP-T.

Dosažené výsledky uvádějí dále.

Cl: 100%

C2: 100%.

C3: 100%.

C4: 70 %.

Procentuální hodnoty v tomto příkladě jsou ve všech případech vztaženy na množství PRP-T vyjádřené v pg/ml.

Příklad 7

Kompozice se upraví přidáním fosfátových ionů za účelem dosažení jejich koncentrace 50 mmol/1. Test stanovení imunogenity provedený na myších po urychleném stárnutí roztoku potom vede k uspokojivým výsledkům.

Stanovení procenta imunizovaného PRP-T na komplexech hliníku ukazuje, že za těchto podmínek pouze 20% PRP-T je imobilizováno. Procentuální hodnota v tomto případě je vztažena na množství PRP-T vyjádřené v pg/ml.

Příklad 8

Kompozice 1 se upraví v této době přidáním citrátových ionů ktéto kompozici za účelem dosažení jejich koncentrace 200 mmol/1.

Test stanovení imunogenity provedený na myších po urychlení stárnutí roztoku potom vede k uspokojivému výsledku.

Stanovení procenta imobilizace PRP-T na komplexech hliníku ukazuje, že za těchto podmínek PRP-T není dále vůbec imobilizován.

Příklad 9

Kompozice 2 se upraví přidáním fosfátových iontů ktéto kompozici za účelem dosažení koncentrace 20 mmol/1.

-8CZ 289810 B6

Test stanovení imunogenity provedený na myších po urychlení stárnutí roztoku potom vede k uspokojivému výsledku. Stanovení procenta imobilizace PRP-T na komplexech hliníku ukazuje, že za těchto podmínek PRP-T není dále vůbec imobilizován.

Příklad 10

Kompozice 3 se upraví přidáním fosfátových ionů ktéto kompozici v rozdílných množstvích a stanoví se procento imobilizace PRP-T na komplexech hliníku.

Pokud se přidá takové množství fosfátových ionů, že koncentrace fosfátů v kompozici je 2 mmol/1, procentuální obsah imobilizovaného PRP-T se sníží na 10%, kde procentuální hodnota je vztaženo na množství PRP-T vyjádřené v pg/ml.

Pokud se přidá takové množství fosfátových ionů, že koncentrace fosfátů v kompozici je 4 mmol/1, PRP-T není dále vůbec imobilizován.

Testy imunogenity provedené na myších po stárnutí roztoku jsou uspokojující.

Příklad 11

Kompozice 4 se upraví přidání fosfátových ionů ktéto kompozici, pro dosažení koncentrace 60 mmol/1.

Stanovení procenta PRP-T imobilizovaného na komplexech hliníku ukazuje, že za těchto podmínek pouze 30 % PRP-T je imobilizováno, přičemž procentuální hodnota je vztažena na množství PRP-T vyjádřené v pg/ml. Test stanovení imunogenity provedený na myších po urychlení stárnutí roztoku vede k uspokojivým výsledkům.

Příklad 12

Připraví se vakcínová kompozice a přitom se vychází z těchto složek:

Hydroxid hlinitý (vyjádřeno jako hliník)	0,025 mg
PRP-T (vyjádřeno jako hmotnost polyribosylribitolfosfátu)	10 pg
Čištěný anatoxin záškrtu (PDA)	1 vakcinační dávka
Čištěný anatoxin tetanu (PTA)	1 vakcinační dávka
Fosfáty	15 pmol
Antigeny dětské obrny typ I	40jednotek
typH	8jednotek
typ III	32 jednotek
Anatoxin černého kašle	25 pg
Pertussis F-HA	25 pg
50-mmolámí Tris-pufr	0,125 ml
obsahující 42,5 % (hmotn./obj.) sacharózy
Voda pro injekce, qsp	0,5 ml

Test stanovení imunogenity ve vztahu k PRP-T se provádí na myších s roztokem připraveným uvedeným způsobem, stejně jako s roztokem skladovaným za teploty 37 °C po dobu 1 měsíce, roztokem skladovaným za teploty 25 °C po dobu 2 měsíců a s roztokem skladovaným za teploty 4°C po dobu 6 měsíců. Všechny případy vedou k uspokojivým výsledkům, co ukazuje na stabilitu PRP-T v takovém prostředí.

-9CZ 289810 B6

Příklad 13

Připraví se vakcínová kompozice a přitom se vychází z těchto složek:

Hydroxid hlinitý (vyjádřeno jako hliník) 0,3 mg

PRP-T (vyjádřeno jako hmotnost polyribosylribitolfosfátu) 10 pg

Čištěný anatoxin záškrtu (PDA) 1 vakcinační dávka

Čištěný anatoxin tetanu (PTA) 1 vakcinační dávka

Anatoxin černého kašle 25 pg

F-HA 25 pg

Hbs protein (jako je přítomen ve vakcíně GenHevac B PASTEUR^(R)) 20 pg Antigeny dětské obrny typ I typR typ III

40jednotek 8jednotek

32jednotek pmol pmol

0,125 ml

Fosfáty

Uhličitany

50-mmolámí Tris-pufr obsahující 42,5 % (hmotn./obj) sacharózy Voda pro injekce, qsp

0,5 ml

Stabilita roztoku připraveného tímto způsobem se ověří tím, že se roztok vystaví teplotě 37 °C po dobu 2 týdnů a potom se provede test stanovení imunogenity PRP-T na myších, jak je popsáno v příkladu 5.

Dosažené výsledky jsou uspokojivé.

Provede se test imunogenity pro Hbs protein. Tento test se provádí na myších a spočívá ve stanovení anti-HBs protilátky testem Elisa, přičemž potom se určí na těchto myších 50% účinná dávka, která může být menší než 0,970 pg Hbs proteinu, pokud se předpokládá, že test je uspokojivý.

Výsledky dosažené s roztokem připraveným jak je uvedeno výše a udržovaným za teploty 37 °C po dobu 2 týdnů před testováním jsou uspokojivé.

Příklad 14

Připraví se vakcínová kompozice a přitom se vychází z těchto složek:

Hydroxid hlinitý (vyjádřeno jako hliník) 0,3 mg

PRP-T (vyjádřeno jako hmotnost polyribosylribitolfosfátu) 10 pg

Čištěný anatoxin záškrtu (PDA) 1 vakcinační dávka

Čištěný anatoxin tetanu (PTA) 1 vakcinační dávka

Anatoxin černého kašle 10 pg

F-HA 5 pg

Řasy 5 pg

Pertactin 3 pg

HBS protein (jako je přítomen ve vakcíně GenHevac B PASTEUR^(R)) 20 pg Antigeny dětské obrny typl 40 jednotek typ II 8 jednotek typ III 32 jednotek pmol

Fosfáty

-10CZ 289810 B6 i

Uhličitany Chlorid hořečnatý 50-mmolámí Tris-pufr obsahující 42,5 % (hmotn./obj.) sacharózy Voda pro injekce, qsp

10 pmol 5 pmol 0,125 ml 0,5 ml

Testy imunogenity ve vztahu k PRP-T se provádí jak je popsáno v příkladu 5. Test stanovení imunogenity vzhledem k Hbs proteinu se provádějí jak je popsáno v příkladu 13. Všechny tyto testy vedou k uspokojivým výsledkům, co ukazuje na stabilitu vakcínové kompozice podle tohoto vynálezu.

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

1. Vakcínová kompozice obsahující alespoň jeden antigen vytvoření kapsulámím polysacharidem chřipky Haemophilus typu b nebo polyribosylribitolfosfátem o vysoké molekulové hmotnosti kondenzovaným k anatoxinu tetanu a adjuvans na bázi hliníku, vyznačující se tím, že adjuvans na bázi hliníku má bod nulového náboje menší než 7,2.

2. Vakcínová kompozice podle nároku 1, vyznačující se tím, že adjuvans na bázi hliníku obsahuje hydroxidy hlinité chemicky modifikované přidanými aniony.

3. Vakcínová kompozice podle nároku 2, vyznačující se tím, že aniony jsou vybrány z fosfátů a citrátů.

4. Vakcínová kompozice podle některého z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že adjuvand na bázi hliníku obsahuje fosfáty hlinité.

5. Vakcínová kompozice podle některého z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že adjuvans na bázi hliníku obsahuje síran draselný a hlinitý.

6. Vakcínová kompozice podle některého z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že dodatkově obsahuje alespoň jeden z vakcínovaných antigenů zvolených ze záškrtu, tetanu, černého kašle, hepatitidy b a polyomyelitidy.

7. Způsob přípravy vakcínové kompozice podle nároku 1, vy zn a č u j í c í se t í m, že se nejprve sníží bod nulového náboje adjuvans na bázi hliníku na méně než 7,2 a poté se k němu přidá alespoň jeden antigen vytvořený kapsulámím polysacharidem chřipky Haemophilus typu b nebo polyribosylribitolfosfátem kondenzovaný k anatoxinu tetanu.

8. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že se nejprve sníží bod nulového náboje adjuvans na bázi hliníku na méně než 7,2 přidáním anionu vybraného z fosfátu a citrátů.