PT743853E

PT743853E - Compostos activos num novo local em canis de calcio activados por um receptor uteis para o tratamento de perturbacoes e doencas neurologicas

Info

Publication number: PT743853E
Application number: PT94932057T
Authority: PT
Inventors: Manuel F Balandrin; Eric G Delmar; Scott T Moe; Alan L Mueller; Linda D Artman; Robert M Barmore; Bradford C Van Wagenen
Original assignee: Nps Pharma Inc
Priority date: 1994-02-08
Filing date: 1994-10-26
Publication date: 2001-10-31
Also published as: GR3036215T3; WO1995021612A2; EP0743853A1; JP2007314556A; EP1123922B1; DE69434889D1; ATE200862T1; DE69427168D1; DK0743853T3; EP1749522A3; EP1123922A3; RU2201224C2; CA2182680A1; EP1123922A2; ATE346595T1; US6306912B1; JP2009143927A; AU8092394A; JPH09509484A; AU710575B2

Description

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DESCRIÇÃO “COMPOSTOS ACTIVOS NUM NOVO LOCAL, EM CANAIS DE CÁLCIO ACTIVADOS POR UM RECEPTOR, ÚTEIS PARA O TRATAMENTO DE PERTURBAÇÕES E DOENÇAS NEUROLÓGICAS”

Campo da invenção A presente invenção diz respeito a compostos úteis como neuro-protectores, anticonvulsivos, ansiolíticos, analgésicos, relaxantes musculares ou co-adjuvantes dos anestésicos genéricos. A presente invenção também diz respeito à utilização de tais compostos para a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento de perturbações e doenças neurológicas, incluindo, mas sem que isso constitua qualquer limitação, a apoplexia isquémica e hemorrágica global e focal, o traumatismo cerebral, a lesão da medula espinal, as lesões das células nervosas induzidas por hipoxia, a epilepsia, a ansiedade e ainda as doenças neurodegenerativas, tais como a doença de Alzheimer, a doença de Huntington e a doença de Parkinson.

Antecedentes da invenção

Seguidamente descrever-se-á a técnica relevante.

0 glutamato é o principal neurotransmissor excitador no cérebro dos mamíferos. 0 glutamato liga-se a um ou mais receptores de glutamato, ou interage com eles, os quais se podem diferenciar em vários subtipos farmacológicos. No sistema nervoso central (SNC) dos mamíferos há três subtipos principais de receptores de glutamato ionotrópicos, definidos farmacologicamente pelos agonistas selectivos N-metil-D-aspartato (NMDA), cainato (KA) e ácido a-amino-3-hidroxi-5--metil-isoxazol-4-propiónico (AMPA). 0 receptor NMDA está implicado em diversas patologias neurológicas, incluindo a apoplexia, o traumatismo cerebral, as lesões na espinal medula, a epilepsia, a ansiedade e as doenças neurodegenerativas, tais como a doença de Alzheimer (Watkins e Collingridge, “The NMDA receptor”, Oxford: IRL 1 * > Γ

Press, 1989). Também foi já postulada uma função dos receptores NMDA na sensibilidade à dor e na dor (Dickenson, “A cure for wind-up: NMDA receptor antagonists as potential analgésicos”, Trends Phamacol. Sei. 11, 307, 1990) . Mais recentemente os receptores AMPA foram amplamente estudados relativamente às suas possíveis contribuições para tais patologias neurológicas (Fisher e Bogousslavsky, “Evolving toward effective therapy for acute ischemic stroke”, J. Amer. Med. Assoe. 270, 360, 1993; Yamaguchi et al., “Anticonvulsant activity of AMPA/kainate antagonists: comparison of GYKI 52466 e NBQX in maximal electroshock and chemoconvulsant seizure models”, Epilepsy Res. 15, 179, 1993).

Quando é activado pelo glutamato (o neurotransmissor endógeno), o receptor NMDA faz com que seja possível o influxo do cálcio extracelular (Ca2+) e do sódio (Na+) através de um canal de iões associado. O receptor NMDA possibilita um influxo consideravelmente maior do Ca2+ do que os receptores de cainato ou AMPA (veja-se, não obstante, o que se diz adiante) e constitui um exemplo de um canal de Ca2+ activado por meio de um receptor. Normalmente o canal abre-se apenas durante um breve período, possibilitando um aumento localizado e passageiro da concentração do Ca2+ intracelular ([Ca2+]i) que por sua vez altera a actividade funcional da célula. No entanto, os aumentos prolongados de [Ca2+]i, resultantes da estimulação crónica do receptor NMDA, são tóxicos para a célula e conduzem à morte celular. Admite-se que o aumento crónico de [Ca2+]i, resultante da estimulação dos receptores NMDA, constitui uma das causas principais da degeneração neuronal que se segue a uma apoplexia (Choi, “Glutamate neurotoxicity and diseases of the nervous System”, Neuron 1, 623, 1988). Também se admite que a estimulação excessiva dos receptores NMDA está implicada na patogénese de algumas formas de epilepsia (Dinggledine et al., “Excitatory amino acids receptors in epilepsy”, Trends Pharmacol. Sei. 11, 334, 1990), de ansiedade (Wiley e Balster, “Preclinical evaluation of N-methyl-D-aspartate antagonists for 2

antianxiety effects: A review” em “Multiple Sigma and PCP Receptor Ligands: Mechanisms for Neuromodulation and Neuroprotection?”, NPP Books, Ann. Arbor, Michigan, págs. 801-15, 1992), doenças neurodege-nerativas (Meldrum e Garthwaite, “Excitatory amino acid neurotoxicity and neurodegenerative disease”, Trends Pharmacol. Sei 11, 379, 1990) e estados hiperalgésicos (Dickenson, “A cure for wind-up: NMDA receptor antagonists as potencial analgesics”, Trends Pharmacol. Sei 11, 307, 1990). A actividade do complexo receptor NMDA-ionóforo é regulada por diversos locais moduladores que podem ser alcançados como alvo por antagonistas selectivos. Os antagonistas competitivos, tais como o fosfonato AP5, actuam no local de ligação do glutamato, ao mesmo tempo que antagonistas não competitivos, tais como a fenciclidina (PCP), MK-801 ou o magnésio (Mg2+), actuam dentro do canal de iões associado (ionóforo). Há também um local de ligação da glicina que pode ser bloqueado selectivamente com compostos tais como o ácido 7-cloro-quinurénico. Há provas que sugerem que a glicina actuam como co-agonista, de tal modo que ambos, o glutamato e a glicina, são necessários para provocar de modo completo respostas mediadas pelo receptor NMDA. Há outros locais potenciais para a modulação da função do receptor NMDA, incluindo um local de ligação do zinco (Zn2+) e um local de ligação do ligando sigma. Além disso, admite-se que as poliaminas endógenas, tais como a espermina, se ligam a um local especifico e potenciam assim a função do receptor NMDA (Ransom e Stec, “Cooperative modulation on [3H]MK-801 binding to the NMDA receptor-ion channel complex by glutamate, glycine and polyamines”, J. Neurochem. 51, 830, 1988) . 0 efeito potenciador das poliaminas sobre a função do receptor NMDA pode ser mediado através de um local do receptor especifico para as poliaminas; foram já descritos poliaminas que exibem actividade agonista, antagonista e agonista inversa (Reynolds, “Arcaine is a competitive antagonisst of the polyamine site on the NMDA receptor”, Europ. J. Pharmacol. 177, 215, 1990; Williams et al., “Characterization of polyamines having 3 agonist, antagonist and inverse agonist effects átomo the polyamine recognition site of the NMDA receptor”, Neuron 5, 199, 1990) . Os estudos de fixação de um radioligando demonstraram ainda que as elevadas concentrações de poliaminas inibem a função do receptor NMDA (Reynolds e Miller, “Ifenprodil is a novel type of NMDA receptor antagonist: Interaction with polyamines”, Moléculas. Pharmacol. 36, 758, 1989; Williams et al., “Effects of polyamines on the binding of [3H]MK-801 to the NMDA receptor: Pharmacological evidence for the existence of a polyamine recognition site”, Molec. Pharmacol. 36, 575, 1989; Scaan e Johnson, “Characterization of the stimulatory and inhibitory effects of polyamines on [3H]TCP binding to the NMDA receptor-ionophore complex”, Molec. Pharmacol. 37, 572, 1990). Este efeito inibidor das poliaminas sobre os receptores NMDA é provavelmente um efeito não especifico (isto é, não é mediado através do receptor de poliamina), visto que os estudos electrofisiológicos com sujeição por partes demonstraram que esta inibição é produzida por compostos que já anteriormente se admitia que actuavam sobre o receptor de poliamina, quer como agonistas ou como antagonistas (Donevan et al., “Arcaine Blocks N-Methyl-D-Aspartate Receptor Responses by an Open Channel Mechanism: Whole-Cell and Single-Channel Recording Studies in Cultured Hipocampal Neurons”, Molec. Pharmacol. 41, 727, 1992; Rock e Macdonald, “Spermine and Related Polyamines Produce a Voltage-Dependent Reduction of NMDA Receptor Single-Channel Conductance”, Molec. Pharmacol. 42, 157, 1992).

Estudos recentes demonstraram que a diversidade molecular dos receptores de glutamato (revista por Nakanishi, “Molecular Diversity of Glutamate Receptors and Implications for Brain Function”, Science 258, 597, 1992) . Até ao momento presente, foram identificadas no mínimo 5 unidades distintas de receptores NMDA (NMDARl e NMDAR2A a NMDAR2D), cada uma delas codificada por um gene distinto. De igual modo, no NMDARl, o corte e o acoplamento alternativos dão lugar a pelos menos mais seis isoformas. Foi já visto que o NMDARl é uma 4

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subunidade necessária e que a combinação de NMDAR1 com diferentes membros dos NMDAR2 dá origem ao complexo plenamente funcional receptor NMDA-ionóforo. Sendo assim, o complexo receptor NMDA-ionóforo pode ser definido como uma estrutura hetero-oligomérica constituída pelo menos pelas subunidades NMDAR1 e NMDAR2; com esta definição não se exclui a existência de outras subunidades ainda não descobertas. Demonstrou-se que o NMDAR1 possui locais de ligação para o glutamato, para a glicina e para Mg2+, MK-801 e Zn2+. Os locais de ligação para os ligandos sigma e para as poliaminas ainda não foram localizados nas subunidades do receptor NMDA, embora tenha sido descoberto recentemente que o ifenprodil é mais potente na subunidade NMDAR2B do que na subunidade NMDAR2A (Williams, “Ifenprodil discriminates subtypes of the N-methyl-D-aspartate receptor: selectivity and mechanisms at recombinant heteromeric receptors”, Mol. Pharmacol. 44, 851, 1993).

Também já foram clonados diversos subtipos diferentes de receptores AMPA e de cainato (revisão de Nakanishi, “Molecular diversity of glutamate receptors and implications for brain function”, Science 258, 597, 1992). São particularmente relevantes os receptores AMPA designados por GluRl, GluR2, GluR3 e GluR4 (também designados GluRA a GluRD), cada um dos quais existe sob uma ou duas formas, chamadas flip e flop, que resultam do corte e do acoplamento alternativo de ARN. Os receptores GluRl, GluR3 e GluR4, quando expressos como receptores homoméricos ou heteroméricos, são permeáveis ao Ca2+, constituindo deste modo exemplos de canais de Ca2+ activados por um receptor. A expressão de GluR2 por si só ou em combinação com as outras subunidades proporciona um receptor que é muito impermeável ao Ca2+. Visto que a maior parte dos receptores AMPA originais, estudados in situ, não são permeáveis ao Ca2+ (descrito supra), admite-se que tais receptores in situ possuem pelo menos uma subunidade GluR2. Além disso, coloca-se a hipótese de a subunidade GluR2 ser funcionalmente distinta devido ao facto de conter um resíduo arginina dentro da região transmembranar II, supostamente formadora de poros; todos os receptores GluRl, GluR3 e 5 )

GluR4 contêm um resíduo glutamina nesta região crítica (denominada local Q/R, em que Q e R são as abreviaturas de uma só letra respectivamente para a glutamina e para a arginina) . A actividade do receptor AMPA é regulada por vários locais moduladores que podem ser alcançados como alvo por antagonistas selectivos (Honore et al., “Quinoxaline-diones: potent competitive non-NMDA glutamate receptor antagonists”, Science 241, 701, 1988; Donevan e Rogawski, “GYKI 52466, a 2,3-benzodiazepine, is a highlt selective, noncompetitive antagonist of AMPA/kainate receptor responses”, Neuron 10, 51, 1993). Os antagonistas competitivos, tais como o NBQX, actuam no local de ligação do glutamato, ao passo que os compostos, tais como o GYKI 52466, actuam de forma não competitiva no local alostérico associado.

Verificou-se que os compostos que actuam como antagonistas competitivos ou não competitivos no receptor NMDA são eficazes para evitar a morte das células neuronais em diversos ensaios de neurotoxicidade in vitro (Meldrum e Garthwaite, “Excitatory amino acid neurotoxicity and neurodegenerative disease”, Trends Pharmacol. Sei. 11, 379, 1990) e em modelos de apoplexia in vivo (Scatton, “Therapeutic potencial of NMDA receptor antagonists in ischemic cerebrovascular disease” em “Drug Strategies in the Prevention and Treatment of Stroke”, IBC Technical Services Ltd., 1990). Tais compostos também são eficazes como agentes anticonvulsivos (Meldrum, “Excitatory amino acid neurotransmission in epilepsy and anti-convulsant therapy” em “Excitatory Amino Acids”, Meldrum, Moroni, Simon e Woods (Compils.), Nova Iorque, Raven Press, pág. 655, 1991), ansiolíticos (Wiley e Balster, “Preclinical evaluation of N-methyl-D-aspartate antagonists for anti-anxiety effects: A review” em “Multiple Sigma and PCP Receptor Ligands: Mechanism for Neuro-modulation and Neuroprotection?”, NPP Books, Ann. Arbor, Michigan, págs. 801-15, 1992) e analgésicos (Dickenson, “A cure for wind-up: NMDA receptor antagonists as potencial analgesics”, Trends Pharmacol. 6

Sei. 11, 307, 1990) e determinados antagonistas do receptor NMDA podem reduzir a demência associada à doença de Alzheimer (Hughes, “Merz’ novel approach to the treatment of dementia”, Certificado n° 1666, 24, 1991).

De um modo idêntico, os antagonistas do receptor NMDA foram submetidos a um escrutínio intenso como agentes terapêuticos potenciais para o tratamento de tais perturbações e doenças neurológicas. Foi demonstrado que os antagonistas do receptor NMDA possuem actividade neuroprotectora (Fisher e Bogousslavsky, “Evolving toward effective therapy for acute ischemic stroke”, J. Amer. Med. Assoe. 270, 360, 1993) e anticonvulsiva (Yamaguchi et al., “Anticonvulsant activity of AMPA/kainate antagonists: comparison of GYKI 52466 e NBQX in maximal electroshock and chemoconvulsant seizure models”, Epilepsy Res. 15, 179, 1993), respectivamente em modelos de apoplexia isquémica e epilepsia com animais. 0 receptor colinérgico nicotínico presente no sistema nervoso central dos mamíferos constitui outro exemplo de um canal de Caz+ activado por meio de um receptor (Deneris et al., “Pharmacological and functional diversity of neuronal nicotinic acetylcholine receptors”, Trends Pharmacol. Sei. 12, 34, 1991), Foram já clonadas diversas subunidades distintas do receptor, podendo estas subunidades ser expressas, por exemplo, em oócitos de Xenopus, para formar receptores funcionais com os seus canais de catiões associados. Colocou-se a hipótese de que tais complexos receptor-ionóforo fossem estruturas hetero-pentaméricas. O papel possivelmente desempenhado pelos canais de Ca2+, activados por meio de um receptor nicotínico, sobre a patologia das perturbações e das doenças neurológicas, tais como a apoplexia isquémica, a epilepsia e as doenças neurodege-nerativas, foi ainda muito pouco explorado.

Foi já anteriormente demonstrado (para revisão veja-se: Jackson e Usherwood, “Spider toxins as tools for dissecting elements of excitatory amino acid transmission”, Trends. Neurosci. 11, 278, 1988; Jackson e Parks, “Spider Toxins: Recent Applications in Neurobiology”, 7

Annu, Rev. Neurosci. 12, 405, 1989; Saccomano et al., “Polyamine spider toxins: Unique pharmacological tools”, Annu. Representa. Med. Chem. 24, 287, 1989; Usherwood e Blagbrough, “Spider Toxins Affecting Glutamate Receptors: Polyamines in Therapeutic Neurochemistry”, Pharmacol. Therap. 52, 245, 1991; Kawai, “Neuroactive Toxins of Spider Venoms”, J. Toxicol. Toxin Rev. 10, 131, 1991) que determinados venenos de aranha e vespa contêm toxinas de aril--alquilamina (também chamadas toxinas de poliamina, toxinas de arilamina, toxinas de acil-poliamina ou toxinas de poliaminamida) que possuem actividade face aos receptores de glutamato no sistema nervoso central dos mamíferos. Foi inicialmente descrito que as toxinas de aril-alquilamina eram antagonistas selectivos dos subtipos AMPA/cainato de receptores de glutamato no sistema nervoso central dos mamíferos (Kawai et al., “Effect of a spider toxin on glutaminergic synapses in the mammalian brain”, Biomed. Res. 3, 353, 1982; Saito et al., “Spider toxin (JSTX) blocks glutamate synapse in hippocampal CAI neurons in vitro”, Brain Res. 481, 16, 1989; Akaike et al., “Spider toxin blocks excitatory amino acid responses in isolated hippocampal pyramidal neurons”, Neurosci. Lett. 79, 326, 1987; Ashe et al., “Argiotoxin-636 blocks excitatory synaptic transmission in rat hippocampal CAI pyramidal neurons”, Brain Res. 480, 234, 1989; Jones et al., “Philanthotoxin blocks quisqualate-induced, AMPA-induced and kainate-induced, but not NMDA-induced excitation of rat brainstem neurones in vivo”, Br. J. Pharmacol. 101, 968, 1990). Estudos posteriores demonstraram que embora haja determinadas toxinas de aril-alquilaminas que são simultaneamente não potentes e não selectivas em vários receptores de glutamato, há outras aril-alquilaminas que são simultaneamente muito potentes e selectivas ao antagonizar respostas medidas pela activação do receptor NMDA no sistema nervoso central de mamíferos (Mueller et al., “Effects of polyamine spider toxins on NMDA receptor-mediated transmission in rat hippocampus in vitro”, Soc. 8 t Γ

Neurosci. Anst. 15, 945, 1989; Mueller et al., “Arylamine spider toxins antagonize receptor-mediated synaptic transmission in rat hippocamal slices”, Synapse 9, 244, 1991; Parks et al., “Polyamine spider toxins block NMDA receptor-mediated increases in cytosolic calcium in cerebellar granule neurons”, Soc. Neurosci. Abst. 15, 1169, 1989; Parks et al., “Arylamine toxins from funnel-web spider (Agelenopsis aperta) venom antagonize N-methyl-D-aspartate receptor function in mammalian brain”, J. Biol. Chem. 266, 21523, 1991; Priestley et al., “Antagonism of responses to excitatory amino acids on rat cortical neurones by the spider toxin, argiotoxin-636”, Br. J. Pharmacol. 97, 1315, 1989; Draghun et al., “Argiotoxin-636 inhibits NMDA-activates ion channels expressed in Xenopus oocytes”, Neurosci. Lett. 132, 187, 1991; Kiskin et al., “A highly potent and selective N-methyl-D-aspartate receptor antagonist from the venom of the Agelenopsis aperta spider”, Neuroscience 51, 11, 1992; Brackley et al., “Selective antagonism of native and cloned kainate and NMDA receptors by polyamine-containing toxins”, J. Pharmacol. Exp. Therap. 266, 1573, 1993; Williams, “Effects of Agelenopsis aperta toxins on the N-methyl-D-aspartate receptor: Polyamine-like and high-affinity antagonist actions”, J. Pharmacol. Exp. Therap. 266, 231, 1993). Também se verificou que a filantoxina, que é uma toxina de aril-alquilamina, inibe os receptores colinérgicos nicotinicos (Rozental et al., “Allosteric inhibition of nicotinic acetylcholine receptors of vertebrates and insects by philanthotoxin”, J. Pharmacol. Exp. Therap. 249, 123, 1989).

Parks et al. (“Arylamine toxins from funnel-web spider (Agelenopsis aperta) venom antagonize N-methyl-D-aspartate receptor function in mammalian brain”, J. Biol. Chem. 266, 21523, 1991) descrevem toxinas de aril-alquilamina de aranha (α-agatoxinas) que antagonizam a função do receptor NMDA no cérebro de mamíferos. Os autores discutem o mecanismo de acção das toxinas de aril-alquilamina 9

e afirmam que um canal de iões activado por meio de um receptor NMDA é o local provável de acção das α-agatoxinas, havendo uma probabilidade máxima de também o ser para outras aril-alquilaminas do veneno de aranha. Os autores afirmam: “a descoberta de que as poliaminas endógenas do cérebro de vertebrados modulam a função dos receptores NMDA sugere que as toxinas de arilamina podem produzir o seu antagonismo através de um local de ligação da poliamina sobre os receptores do glutamato. Brackley et al. estudaram os efeitos da espermina e da filantotoxina 433 sobre as respostas provocadas por aplicação de aminoácidos excitadores a oócitos de Xenopus injectados com ARNm de cérebro de ratos ou galinha. Estes autores demonstraram que, para concentrações inferiores às que antagonizm a função do receptor de glutamato, ambos os compostos, a espermina e a filantotoxina, potenciam os efeitos dos aminoácidos excitadores e de alguns outros neurotransmissores. Com base nestes e noutros dados, Brackley et al. concluíram que as toxinas de arilamina, mediante fixação de modo não especifico às membranas de células excitáveis, podem reduzir a fluidez das membranas e alterar a função do receptor. A validez desta ideia curiosa acerca da função do receptor NMDA não está bem amparada por dois estudos recentes de fixação. Reynolds demonstrou que a argiotoxina-636 inibe a ligação de [JH]MK-801 às membranas do cérebro de ratos, de uma forma que é insensível ao glutamato, à glicina ou à espermina. Este autor concluiu que a argiotoxina-636 exerce um novo efeito inibidor sobre o complexo de receptor NMDA, mediante a fixação a um dos locais do Mg2+ situados dentro do canal de iões franqueado por NMDA. Os dados de fixação a indicados por Williams et al. também defendem a conclusão de que a argiotoxina-636 não actua primariamente no local modulador da poliamina sobre o receptor NMDA, mas que actua muito mais directamente para produzir um bloqueio, dependente da actividade, do canal de iões. É já conhecido que os compostos, tais como a fenciclidina e a 10 quetamina, podem bloquear os canais de iões associados aos receptores de glutamato dos músculos de artrópodes e aos receptores NMDA dos mamíferos. Sendo assim, parece possível que os receptores de glutamato dos vertebrados e dos invertebrados partilhem locais de ligação adicionais para os moduladores alostéricos da função do receptor, quiçá relacionados com os locais de ligação de catiões divalentes. Como é evidente, será necessário um trabalho adicional considerável para determinar se as arilaminas definem um novo local regulador desta classe.”

Usherwood e Blabrough (“Spider Toxins Affecting Glutamate Receptors: Polyamines in Therapeutic Neurochemistry”, Pharmacol. Therap. 52, 245, 1991) descrevem iam local de ligação intracelular proposto para as toxinas de aril-alquilamina (toxinas de poliaminamida) localizado dentro do campo de potencial da membrana, designado por filtro de selectividade do canal QUIS-R. Os autores postulam que o local de ligação para as toxinas de poliaminamida pode estar próximo da entrada interna do canal, franqueada pelo QUIS-R de músculo de lagosta. Os autores também assinalam que uma toxina desta classe, a argiotoxina-636, antagoniza selectivamente o receptor NMDA em culturas de neurónios corticais de ratos.

Gullak et al. (“CNS binding sites of the novel NMDA antagonist Arg-636”, Soc. Neurosci. Abst. 15, 1168, 1989) descrevem a argiotoxina--636 (Arg-636) como uma toxina de poliamina (aril-alquilamina) componente de um veneno de aranha. Admite-se que esta toxina bloqueia o aumento de GMPc induzido por NMDA de uma forma não competitiva. Os autores afirmam que: “Teve lugar a ligação de [125I]Arg-636 às membranas do prosencéfalo de ratos com valores Kd e Bmax de 11,25 e 28,95 pmol/mg de proteína (especificidade de 80%). A capacidade que outras poliaminas conhecidas e que as poliaminas de Agelenopsis aperta descobertas recentemente têm para inibir a ligação era comparável à neuroactividade como antagonistas funcionais de NMDA. Nenhum 11

outro dos compostos testados foi capaz de bloquear a ligação especifica”.

Os autores demonstraram que as poliaminas (aril-alquilaminas) podem antagonizar as respostas ao NMDA por interacção com os canais de iões da membrana.

Seymor e Mena (“In vivo NMDA antagonist activity of the polyamine spider venom component, argiotoxin-636”, Soc. Neurosci. Abst. 15, 1168, 1989) descrevem estudos que, segundo indicam, demonstram que a argiotoxina-636 não afecta significativamente a actividade loco-motora, em doses que são eficazes face aos ataques audiogénicos em ratos da estirpe DBA/2, e que antagoniza significativamente os ataques induzidos por NMDA, com uma dose mínima eficaz de 32 mg/kg administrada por via subcutânea (s.c.).

Herold e Yaksh (“Anhestesia and muscle relaxation with intratecal injections of AR636 and AG489, two acylpolyamine spider toxins, in rats”, Anesthesiology 77, 507, 1992) descrevem estudos os quais, segundo indicam, demonstram que a aril-alquilamina argiotoxina-636 (AR636) produz relaxamento muscular e anestesia após a sua administração por via intratecal em ratos, mas o mesmo não se passa com a agatoxina-489.

Williams (“Effects of Agelenopsis aperta toxins on the N--methyl-D-aspartate receptor: Polyamine-like and high-affinity antagonist actions”, J. Pharmacol. Exp. Therap. 266, 231, 1993) divulga que as α-agatoxinas (aril-alquilaminas) Agel-489 e Agel-505 melhoram a ligação de [3H]MK-801 aos receptores NMDA sobre membranas preparadas a partir de cérebro de ratos, mediante uma acção no receptor de poliamina estimulador; os agonistas do receptor de poliamina obstruíam os efeitos estimuladores de Agel-489 e de Agel-505 e os antagonistas do receptor de poliamina inibiam o efeito estimulador de Agel-505. As concentrações mais elevadas de Agel-489 e de Agel-505, e bem assim todas as concentrações testadas a argiotoxina-636, tinham efeitos inibidores sobre a fixação do [3H]MK-801. Em oócitos de Xenopus submetidos por voltagem a -70 mV, a Agel-505 inibia as respostas ao NMDA com um valor CI5o de 13 nM; este efeito de Agel-505 era produzido em concentrações aproximadamente 10000 vezes inferiores às que afectam a fixação do (^HjMK-eoi. As respostas ao cainato foram 12 Γ u ^—t inibidas apenas em 11% pela Agel-505 a 30 nM. O antagonismo das correntes induzidas por NMDA, revelado pela Agel-505, dependia bastante da voltagem, facto este que é coerente com um efeito bloqueador do canal aberto por parte da toxina. Williams afirma: “Embora as α-agatoxinas possam interagir no local alostérico de poliamina positivo sobre o receptor NMDA, os efeitos estimuladores produzidos por esta interacção podem estar mascarados nos ensaios funcionais devido a uma acção independente das toxinas como antagonistas, não competitivos e de elevada afinidade, do receptor”.

Brackley et al. (“Selective antagonism of native and cloned kainate and NMDA receptors by polyamine-containing toxins”, J. Pharmacol. Exp. Therap. 266, 1573, 1993) afirmam que as toxinas filantotoxina-343 (phTX-343) e argiotoxina-636 (Arg-636), que contêm poliamina (aril-alquilamina), produzem um antagonismo reversível, não competitivo e parcialmente dependente da voltagem, das correntes induzidas por cainato e por NMDA em oócitos de Xenopus injectados com ARN de cérebro de ratos. Demonstrou-se que a Arg-636 era selectiva para as respostas induzidas por NMDA (CI50 = 0,04 μΜ) em comparação com as respostas induzidas por cainato (CI50 = 0,07 μΜ), ao passo que a PhTX-343 foi selectiva para as respostas induzidas por cainato (CI50 = 0,12 μΜ) em comparação com as respostas induzidas por NMDA (CI50 = 2,5 μΜ) . A Arg-636 antagonizou as respostas ao NMDA em oócitos de Xenopus que exprimem subunidades clonadas de NMDA-R1 (CI50 = 0, 09 μΜ) de forma mais poderosa do que as respostas ao cainato em oócitos que exprimem subunidades clonadas de GluRl (CI50 = 3,4 μΜ) ou de GluRl+GluR2 (CI50 = 300 μΜ) . No entanto, a PhTX-343 foi igualmente potente ao antagonizar o NMDAR1 (CI5o = 2,19 μΜ) e o GluRl (CI50 = 2,8 μΜ), mas foi muito menos potente face a subunidades GluRl+GluR2 (CI50 = 270 μΜ) .

Raditsch et al. (“Subunit-specific block of cloned NMDA receptors by argiotoxin-636”, FEBS Lett., 324, 63, 1993) referem 13 rf"' que a Arg-363 antagoniza de forma mais potente as respostas em oócitos de Xenopus que expressam subunidades NMDAR1+NMDAR2A (CI50 = 9 nM) ou subunidades NMDAR1+NMDAR2B (CI50 = 2,5 nM) do que as subunidades NMDAR1+NMDAR2C (CI50 = 460 nM), embora todas as subunidades de receptor contenham um resíduo de asparagina na região trans-membranar II, supostamente formadora de potos (o local Q/R referido anteriormente). Os autores afirma que a grande diferença em sensibilidade à Arg-363 entre os canais NMDAR1+NMDAR2A e NMDAR1 + NMDAR2C “deve ser conferida por outras determinantes estruturais”.

Herlitz et al. (“Argiotoxin detects molecular differences in AMAP receptor channels”, Neuron 10, 1131, 1993) afirmam que a Arg-363 antagoniza os subtipos de receptores AMPA de uma forma dependente da voltagem e da utilização, coerente com o bloqueio do canal aberto. A Arg-363 antagoniza de um modo potente os receptoers AMPA permeáveis a Ca2+ que compreendem subunidades GluRAi (Ki = 0,35 μΜ) ou GluRDi (Ki = 0,43 μΜ), ao passo que é praticamente ineficaz face às subunidades GluRBi impermeáveis a Ca2+, para concentrações na ordem de 10 μΜ. Outros dados revelados por estes investigadores sugerem fortemente que o local Q/R na região transmembranar II, supostamente formadora de poros, tem uma importância fundamental na determinação do poder da Arg-363 e da permeabilidade de Ca2+.

Blaschke et al. (“A single amino acid determines the subunit--specific spider toxín block of a-amino-3-hydroxy-5-methylisoxazole--4-propionate/kainate receptor channels”, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90, 6528, 1993) referem que a aril-alquilamina JSTX-3 antagoniza de forma potente as respostas ao cainato em oócitos de Xenopus que exprimem subunidades GluRl (CI50 = 0, 04 μΜ) ou GluR3 (CI50 = 0,03 μΜ), mas os receptores exprimidos, nos quais está presente uma subunidade GluR2, não são praticamente afectados pela toxina. Os estudos de mutagénese dirigida ao local implicam fortemente o local Q/R enquanto local fundamental que influi sobre o poder da toxina.

Nakanishi et al. (“Bioorganic studies of trnasmitter receptors with philanthotoxin analogs”, Pure Apll. Chem., no prelo) sintetizaram diversos análogos da filantotoxina (PhTX) marcados com uma 14

L· grande fotoafinidade. Tais análogos foram estudados sobre receptores colinérgicos nicotínicos expressos como um sistema modelo para os receptores dos canais de cálcio activados por meio de um receptor. Estes investigadores sugerem que os referidos análogos de PhTX bloqueiam o canal de iões, ao ligar-se a parte dianteira hidrófoba da toxina a um local próximo da superfície citoplásmica, ao passo que a cauda de poliamina se prolonga no canal de iões a partir do citoplasma.

No documento DD-A-0 033 285 está descrito um procedimento para a preparação de difenil-alquilaminas, o qual compreende o passo que consiste em submeter um radical atilo a uma alquilação de Friedel-Crafts, utilizando uma monofenil-alquilamina halogenada. 0 documento NL-A-0 300 541 diz respeito à preparação de difenil-alquilaminas específicas e de composições farmacêuticas que incorporem estes compostos para o tratamento de doenças cardiovasculares. Gisvold et al. (em “British Journal of Anaesthesia 57, 96-109, 1985) discutem os efeitos fisiológicos de diversos compostos, incluindo a terodilina (N-terc-butil-l-metil-3,3-difenil-propilamina), que são eficazes como bloqueadores da entrada do cálcio e descrevem também a sua utilização potencial para o tratamento da isquémia cerebral. Reynolds em “Martindale, The Extra Pharmacopoeia” (The Pharmaceutical Perss, Londres, 543-44, 1989) descreveu a utilização de preparações de terodilina para o tratamento da bexiga neurogénica. Leszkovsky et al. (“ACta Physiologica Academiae Scientiarum Hungaricae”, Tomo 29, 283-98, 1966) discorrem sobre estudos referentes à actividade farmacológica de derivados difenil-alquílicos específicos, incluindo os seus efeitos sobre o sistema nervoso central. Assim, o documento WO 93/04373 descreve aminas específicas que são activas em um ou vários receptores do Ca2+.

Descrição abreviada da invenção A requerente determinou (ver o Exemplo 23 adiante apresentado) que as aril-alquilaminas simplificadas (veja-se infra) são antagonistas poderosos e não competitivos do complexo receptor NMDA-ionóforo. 15 r— L·, —V*

\! T

Tais compostos ligam-se ao local marcado por [3H]MK-801 em concentrações aproximadamente 1 a 50 vezes superiores às que antagonizam a função mediada pelo receptor NMDA. Tais aril-alquil-aminas simplificadas possuem ainda uma ou várias das seguintes propriedades biológicas: actividade neuroprotectora significativa, actividade anticonvulsiva significativa, actividade analgésica significativa, ausência do comportamento estereotipado semelhante ao da PCP em roedores (hiperexcitabilidade e movimento oscilante da cabeça) para doses eficazes de agente neuroprotector, anticonvulsivo e analgésico, ausência de generalização para PCP num ensaio de discriminação de PCP com doses eficazes de agente neuroprotector, anticonvulsivo e analgésico, ausência de vacuolização neuronal para doses eficazes de agente neuroprotector, anticonvulsivo e analgésico, actividade significativamente menos potente face ais canais de cálcio sensíveis à voltagem e actividade hipotensiva mínima para doses eficazes de agente neuroprotector, anticonvulsivo e analgésico. Tais compostos podem, sem dificuldade, inibir a indução da PLP em secções laminares cortadas do hipocampo de ratos e podem produzir uma deterioração motora para doses eficazes de agente neuroprotector, anticonvulsivo e analgésico. A invenção também diz respeito a composições farmacêuticas que incorporam um composto de acordo com a invenção, ou um dos seus sais farmaceuticamente aceitáveis, facultativamente em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável.

De acordo com outro dos seus aspectos, a invenção proporciona a utilização de tais aril-alquilaminas para a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento de um paciente que padeça de uma doença ou perturbação neurológica. A composição farmacêutica incorpora compostos que satisfazem à fórmula estrutural seguinte:

16

em que cada X pode representar independentemente um ou vários H, Br, Cl, F, alquilo inferior e/ou OCH3, cada R1 pode representar independentemente H, alquilo inferior, OH, O-alquilo ou O-acilo e cada R2 pode representar independentemente H ou alquilo inferior; ou então R1

em que cada X pode representar independentemente um ou vários H, Br, Cl, F, alquilo inferior e/ou OCH3, cada R1 pode representar independentemente H, alquilo inferior, OH, O-alquilo ou O-acilo e cada R2 pode representar independentemente H ou alquilo inferior; ou então

em que η = 1 a 6, cada X pode representar independentemente um ou vários H, Br, Cl, F, alquilo inferior e/ou OCH3, cada R1 pode representar independentemente H, alquilo inferior, OH, O-alquilo ou O-acilo e cada R2 pode representar independentemente H ou alquilo inferior; ou então

17 em que η = 1 a 6, cada X pode representar independentemente um ou vários H, Br, Cl, F, alquilo inferior e/ou OCH3, cada R1 pode representar independentemente H, alquilo inferior, OH, O-alquilo ou O-acilo e cada R2 pode representar independentemente H ou alquilo inferior.

Estão excluídos da presente invenção os compostos: 3,3-di-fenil-propilamina, 3- (3-metil-fenil)-3-fenil-propilamina, N-terc--butil-l-metil-3,3-difenil-propilamina, N-metil-3,3-difenil-propilamina, N-isopropil-3,3-difenil-propilamina, N-(3-metil-2-butil)-3,3-difenil--propilamina e os seus sais farmaceuticamente aceitáveis e ainda 3,3-bis(3-fluorofenil)-propilamina.

As variantes preferenciais da presente invenção compreendem os Compostos 21 a 53 ou os sais farmaceuticamente aceitáveis dos Compostos 20 a 53.

F

NH2 F Composto 20

F

F Composto 21 18 Γ

F

19 Γ u

nh3ci

Composto 27

nh3ci 20 L·, 'P*—^

nh3ci

Composto 33

22 - U κ

23

L-L

Composto 45

24 Γ Í—Cj t

Η,

NH.

Cl

25

A expressão “perturbação ou doença neurológica” designa uma perturbação ou uma doença do sistema nervoso, incluindo, mas sem que isso constitua qualquer limitação, a apoplexia isquémica e hemorrágica global e focal, o traumatismo cerebral, a lesão da medula espinal, a lesão das células nervosas induzida por hipoxia, a epilepsia, a ansiedade e as doenças neurodegenerativas. A expressão “perturbação ou doença neurológica” também designa os estados patológicos e afecções para os quais pode estar indicado, ser útil, 26

U recomendar-se ou prescrever-se um agente neuroprotector, um anti-convulsivo, um ansiolítico, um analgésico, um relaxante muscular e/ou um co-adjuvante da anestesia geral. A expressão “doença neurodegenerativa” designa as doenças que compreendem, mas sem que isso constitua qualquer limitação, a doença de Alzheimer, a doença de Huntington e doença de Parkinson. 0 termo “neuroprotector” designa um composto capaz de evitar a morte dos neurónios associada a uma perturbação ou a uma doença neurológica. 0 termo “anticonvulsivo” designa um composto capaz de reduzir as convulsões produzidas por afecções, tais como os ataques parciais simples, os ataques parciais complexos, o estado epiléptico e os ataques induzidos por traumatismos, tais como os que ocorrem após uma lesão ou um dano cerebral, incluindo a cirurgia cerebral. 0 termo “ansiolítico” designa um composto capaz de mitigar a dor por alteração da percepção dos estímulos dolorosos, sem provocar anestesia ou perda de conhecimento. A expressão “relaxante muscular” designa um composto que reduz a tensão muscular. A expressão “co-adjuvante da anestesia geral” designa um composto útil para produzir, em combinação com agentes anestésicos, a perda de capacidade de percepção da dor associada à perda de conhecimento. 0 termo “potente” designa um composto que tem um valor CI5o inferior a 10 μΜ, de preferência inferior a 100 nM e mais preferencialmente inferior a 1 nM nos receptores NMDA. 0 termo “selectivo” significa que o composto é potente nos receptores NMDA, mas é menos potente, em proporções superiores a 10 vezes, de preferência superiores a 50 vezes e mais preferencialmente superiores a 100 vezes, noutros receptores neurotransmissores, canais de iões activados por meio de um receptor neurotransmissor ou canais de iões dependentes da voltagem. A expressão “ensaios bioquímicos e electrofisiológicos da função de um canal de cálcio activado por meio de um receptor” designa os 27

I

ensaios concebidos para detectar por meios bioquímicos ou electrofisiológicos a actividade funcional dos canais de cálcio activados por meio de um receptor. Como exemplos de tais ensaios refere-se, mas sem que isso constitua qualquer limitação, o ensaio fluorimétrico com fura-2 para determinar o cálcio citosólico em culturas de células de grânulos de cerebelo de ratos (ver o Exemplo 1 e o Exemplo 2), ensaios electrofisiológicos com sujeição por partes (ver o Exemplo 3 e o Exemplo 27), ensaios de transmissão sináptica em secções laminares cortadas de hipocampo de ratos (ver o Exemplo 5), ensaios de fixação de radioligandos (ver o Exemplo 4, o Exemplo 24, o Exemplo 25 e o Exemplo 26) e os ensaios de neuro-protecção in vitro (ver o Exemplo 6). 0 termo “eficácia” significa que um nível estatisticamente significativo da actividade desejada é detectável com um composto elegido; o termo “significativo” designa uma significância estatística ao nível p < 0,5. A expressão “actividade neuroprotectora” designa a eficácia no tratamento de perturbações ou doenças neurológicas, incluindo, mas sem que isso constitua qualquer limitação, a apoplexia isquémica e hemorrágica global e focal, o traumatismo cerebral, a lesão da medula espinal, a lesão das células nervosas induzida por hipoxia e as doenças neurodegenerativas, tais como a doença de Alzheimer, a doença de Huntington e doença de Parkinson (ver os Exemplos 7 e 8, adiante). A expressão “actividade anticonvulsiva” designa a eficácia para reduzir as convulsões provocadas por doenças, tais como os ataques parciais simples, os ataques parciais complexos, o estado epiléptico e os ataques induzidos por traumatismos, tais como os que ocorrem após uma lesão ou um dano cerebral, incluindo a cirurgia cerebral (ver os exemplos 9 e 10, mais adiante). A expressão “actividade ansiolítica” significa que um composto reduz os sentimentos de receio, insegurança e medo que são característicos da ansiedade. 28 j-' U κ A expressão “actividade analgésica” significa que um composto produz ausência de dor em resposta a um estimulo que normalmente seria doloroso. Tal actividade é útil em afecções clinicas de dores agudas ou crónicas, incluindo, mas sem que isso constitua qualquer limitação, as seguintes: analgesia pré-operatória preventiva; neuropatias periféricas, tais como as que ocorrem na diabetes mellitus e na esclerose múltipla; dor nervosa num membro; causalgia; neuralgias, tais como as que ocorrem no herpes zoster; dor central, tal como a que se sente em lesões da medula espinal; hiperalgesia e alodinia. 0 temo “causalgia” designa uma estado doloroso associado a uma lesão dos nervos periféricos. 0 temo “neuralgia” designa a dor na distribuição de um ou vários nervos. A expressão “dor central” designa a dor associada a uma lesão do sistema nervoso central. O temo “hiperalgesia” designa uma resposta aumentada a um estimulo que normalmente é doloroso. 0 termo “alodinia” designa a dor que se deve um estimulo que normalmente não provoca dor (ver os exemplos 11 a 14, mais adiante). A expressão “indução da potenciação a longo prazo (PLP, em inglês LTP) em secções laminares cortadas de hipocampo de ratos” designa a capacidade de estimulação tetânica eléctrica das fibras colaterais aferentes de Schaffer para provocar aumentos a longo prazo na intensidade da transmissão sináptica na via das células piramidais CAI colaterais de Schaffer, em secções laminares de cortadas de hipocampo de ratos mantidas in vítro (ver o Exemplo 19). A expressão “dose terapêutica” designa uma quantidade de um composto que mitiga, num determinado grau, um ou mais sintomas de uma doença ou afecção do paciente. Além disso, a expressão “dose terapêutica” também designa uma quantidade que devolve aos seus níveis normais, quer de um modo parcial quer completo, os parâmetros fisiológicos ou bioquímicos associados à doença ou afecção ou que a provocam. De um modo geral, tal quantidade estará compreendida entre cerca de 1 nmol e 1 μιηοΐ do composto, dependendo 29

isso do seu valor DE50 (CI50 no caso de um antagonista) e da idade, tamanho e doença do paciente. A expressão “deterioração da cognição” designa a capacidade para deteriorar a aquisição de memória ou a execução de tarefa aprendida (ver o Exemplo 20) . A expressão “deterioração da cognição” também designa a capacidade para interferir nos processos e no raciocínio do pensamento racional normal. A expressão “interrupção da função motora” designa a capacidade para alterar significativamente a actividade locomotora (ver o Exemplo 15) ou para provocar uma ataxia significativa, a perda do reflexo para se endireitar, a sedação ou o relaxamento muscular (ver o Exemplo 16) . A expressão “actividade locomotora” designa a capacidade para realizar movimentos ambulatórios normais. A expressão “perda do reflexo para se endireitar” designa a capacidade de um animal, tipicamente um roedor, para se por direito por si só depois de ter sido colocado numa posição supina. A expressão “vacuolização neuronal” designa a produção de vacúolos em neurónios do córtex cingulado o do córtex retroesplénico (ver o exemplo 18). A expressão “actividade cardiovascular” designa a capacidade para provocar alterações significativas em parâmetros, tais como, mas sem que isso constitua qualquer limitação, a pressão sanguínea arterial média e o ritmo cardíaco (ver os Exemplos 21 e 22). 0 termo “hiperexcitabilidade” designa uma susceptibilidade aumentada face a um estímulo excitador. A hiperexcitabilidade manifesta-se amiúde sob a forma de um aumento significativo da actividade locomotora em roedores aos quais se administrou um fármaco (ver o Exemplo 15). 0 termo “sedação” designa um efeito calmante ou o alívio de uma actividade e da excitação. A sedação manifesta-se amiúde por uma diminuição significativa da actividade locomotora em roedores aos quais se administrou um fármaco (ver o Exemplo 15). 30 A expressão “potencial de abuso semelhante ao da PCP” designa o potencial de um fármaco para ser utilizado de forma errónea, tal como acontece com a utilização recreativa da PCP (isto é, o “pó de anjo”) por parte dos seres humanos. Admite-se que o potencial de abuso semelhante ao da PCP pode ser prognosticado pela capacidade de um fármaco para a generalização em PCP em roedores treinados para distinguir a PCP do soluto salino (ver o Exemplo 17). A expressão “actividade psicotomimética como a da PCP” designa a capacidade de um fármaco para provocar nos seres humanos uma síndroma de comportamento que se assemelha à da psicose aguda, incluindo alucinações visuais, paranoia, agitação e confusão. Crê-se que a actividade psicotomimética como a da PCP pode prever-se em roedores através da capacidade um fármaco para produzir comportamentos estereotipados como sendo resultantes da PCP, incluindo a ataxia, o movimento oscilante da cabeça, a hiperexcitabilidade e a generalização em PCP em roedores treinados para distinguir a PCP do soluto salino (ver o Exemplo 15, o Exemplo 16 e o Exemplo 17). 0 termo “ataxia” designa um défice na coordenação muscular. A expressão “movimento oscilante da cabeça” designa o comportamento estereotipado provocado em roedores pela PCP, em que a cabeça se move de modo repetitivo, lento e intenso, de iam lado para o outro. A expressão “composição farmacêutica” designa uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto da presente invenção num veículo farmaceuticamente aceitável, isto é, uma formulação à qual se pode adicionar o composto para o dissolver ou para facilitar de qualquer outro modo a administração do composto. Como exemplos de veículos farmaceuticamente aceitáveis refere-se a água, o soluto salino e o soluto salino fisiológico tamponado. Uma composição farmacêutica desta classe é administrada numa dose adequada. Tais composições são tais que de um modo geral são aprovadas pela FDA, ou organizações equivalentes noutros países que não os Estados Unidos da América do Norte, para a sua utilização no tratamento de uma determinada perturbação. 31

Outras caracteristicas e vantagens da invenção tornar-se-ão evidentes na descrição subsequente das suas variantes preferidas e nas reivindicações.

Ensaios para antagonistas potentes e selectivos dos canais de cálcio activados por meio de um receptor no sistema nervoso central dos mamíferos

As propriedades desejadas de um fármaco compreendem: elevada afinidade e selectividade para os canais de Ca2+ activados por meio de um receptor, tais como os que se encontram presentes nos complexos NMDA-, AMPA- e receptor colinérgico nicotínico-ionóforo (comparados com as respostas mediadas por outros receptores neurotransmissores, por canais de iões activados por meio de um receptor neurotransmissor ou por canais de iões dependentes da voltagem), e um antagonismo não competitivo dos referidos canais de Ca2+ activados por meio de um receptor. 0 complexo receptor NMDA-ionóforo é utilizado como exemplo de um canal de Ca2+ activado por meio de um receptor. A activação do receptor NMDA abre um canal selectivo de catiões que permite o influxo de Ca2+ extracelular e Na+, dando origem a aumentos de [Ca2+]i e à despolarização da membrana celular. As medições de [Ca2+]i irão ser utilizadas como ensaios primários para detectar a actividade dos compostos de aril-alquilaminas sobre os receptores NMDA. As aril-alquilaminas purificadas, as aril-alquilaminas sintéticas e os análogos sintéticos de aril-alquilaminas foram examinadas quanto á sua actividade em ensaios in vitro com capacidade para medir a actividade do receptor de glutamato. Foram seleccionadas para um estudo pormenorizado as aril-alquilaminas presentes no veneno de diversas espécies de aranhas. Outros análogos sintéticos mais simplificados são constituídos geralmente por grupos cromóforos aromáticos adequadamente substituídos, ligados a um resíduo de alquil-(poli)-amina (ver os Compostos 19 a 53 mais adiante).

Efectuou-se um ensaio primário que proporciona um índice funcional da actividade do receptor de glutamato e permite um 32

escrutínio de elevado rendimento total. Foram preparadas culturas primárias de células de grânulos de cerebelo de ratos marcadas com o indicador fluorimétrico fura-2 e utilizaram-se para medir as alterações em [Ca2+]i provocadas pelo NMDA e pelo seu co-agonista, a glicina. Este ensaio proporciona um índice extremamente sensível e exacto da actividade do receptor NMDA. Os aumentos de [Ca2+]i provocados por NMDA dependem da presença de glicina e são bloqueados pelo Mg2+ extracelular ou pelos antagonistas que actuam nos locais de ligação do glutamato, da glicina ou de MK-801. Os aumentos de [Ca2+]i provocados por NMDA/glicina distinguem-se facilmente dos que resultam da despolarização, pela sua oposição a inibição por parte de bloqueadores de canais de Ca2+ sensíveis à voltagem. A fidelidade com que estas medições de [Ca2+]i corroboram os resultados obtidos pelos estudos electrofisiológicos e de ligação ao ligando, sugere que tais medições reflectem fielmente a activação do complexo receptor NMDA-ionóforo.

Exemplo 1. Inibição potente e não competitiva da função do receptor

NMDA

Mediu-se os efeitos inibidores preferenciais das aril-alquilaminas sobre os aumentos de [Ca2+]i mediados pelo receptor NMDA em culturas de células de grânulos de cerebelo de ratos. Os aumentos e [Ca2+]i foram provocados pela adição de NMDA/glicina (50 μΜ/1μΜ) na presença ou na ausência de diferentes concentrações de cada composto de ensaio. Os valores CI5o foram obtidos para cada composto de ensaio efectuando 2 a 8 experiências individuais por cada composto de ensaio, tendo o nível de erro padrão sido inferior a 10% do valor médio para cada composto.

Todas as aril-alquilaminas testadas bloquearam os aumentos de [Ca2+]i em células de grânulos de cerebelo provocados por NMDA/glicina. Muitas das aril-alquilaminas testadas foram mais potentes do que os antagonistas competitivos, tais como ο AP5 (CI5o = 15 μΜ) . Os efeitos inibidores das aril-alquilaminas não foram superados aumentando as 33 Γ concentrações de NMDA ou glicina. Ou seja, não se observou nenhuma variação nos valores CE50 correspondentes ao NMDA ou à glicina. Sendo assim, as aril-alquilaminas são antagonistas não competitivos no complexo receptor NMDA-ionóforo e não actuam nos locais de ligação nem do glutamato nem da glicina.

Exemplo 2. Actividade face à função do receptor de cainato e AMPA

As medições de [Ca2+]i em células de grânulos de cerebelo podem também ser utilizadas para pesquisar a activação dos receptores de cainato ou AMPA originais presentes neste tecido. Embora os aumentos de [Ca2+]x provocados por estes agonistas sejam de uma magnitude inferior à dos provocados por NMDA/glicina, tais respostas são fortes e podem ser utilizadas para avaliar com precisão a especificidade de acção das aril-alquilaminas sobre subtipos de receptores de glutamato definidos farmacologicamente. As medições comparativas de [Ca2+]i revelaram uma distinção nítida das aril-alquilaminas na selectividade do receptor. Algumas delas, tais como a JSTX-3 (toxina “Joro Spider” da aranha Nephila clavata) demonstraram ser antagonistas mais potentes das respostas provocadas pelo cainato (100 μΜ) ou por AMPA (30 μΜ) .

Actividade neuroprotectora

As propriedades desejadas para um fármaco neuroprotector compreendem as seguintes: (1) que o fármaco possa ser administrado por via oral ou injectável (isto é, que o fármaco não se decomponha de forma significativa no estômago, intestino ou sistema vascular e deste modo consiga alcançar os tecidos que se pretendem tratar numa quantidade terapeuticamente eficaz). Tais fármacos são facilmente ensaiáveis em roedores para a determinação da sua biodisponibilidade. (2) Que o fármaco demonstre actividade neuroprotectora (isto é, eficácia) quando administrado a seguir a um ataque isquémico (apoplexia, asfixia) ou a uma lesão traumática (traumatismo cerebral, lesão da medula espinal). (3) Que o fármaco seja desprovido de efeitos 34

secundários ou que estes sejam de mínima importância; referimo-nos a efeitos tais como a deterioração da cognição, a interrupção do comportamento motor, a sedação ou a hiperexcitabilidade, a vacuo-lização neuronal, a actividade cardiovascular, o potencial de abuso semelhante ao da PCP ou a actividade psicotomimética semelhante à da PCP.

Se bem que o glutamato seja o transmissor sináptico fisiológico, a exposição crónica ao glutamato conduz à morte das células neuronais. Grande parte da neurodegeneração provocada pelo glutamato resulta do facto de ser mediada pelos receptores NMDA e de proceder directamente de níveis cronicamente elevados de Ca2+ citosólico. Não há uma base experimental extensa que avalize o ponto de vista que sustenta o facto de os receptores NMDA e AMPA desempenharem um papel principal na mediação da degeneração neuronal que se segue a uma apoplexia e a outros fenómenos isquémicos/hipóxicos (Choi, “Glutamate neurotoxicity and diseases of the nervous system”, Neuron 1, 623, 1988). A maior parte destas evidências baseiam-se na capacidade dos antagonistas competitivos do receptor NMDA ou AMPA para bloquear eficientemente a morte das células neuronais, em modelos de apoplexia tanto in vitro como in vivo.

Actividade anticonvulsiva

As propriedades desejadas para um fármaco anticonvulsivo compreendem: o fármaco poder ser administrado por via oral ou injectável, o fármaco apresentar actividade anticonvulsiva eficaz face a diversos tipos de ataques, incluindo, mas sem que isso constitua qualquer limitação, ataques parciais simples, os ataques parciais complexos, o estado epiléptico e os ataques induzidos por traumatismos, tais como os que ocorrem após uma lesão ou um dano cerebral, incluindo a cirurgia cerebral; e o fármaco ser desprovido de efeitos secundários ou que estes sejam de mínima importância; como exemplos de tais efeitos refere-se a deterioração da cognição, a interrupção do comportamento motor, a sedação ou a hiperexcitabilidade, a vacuolização neuronal, a actividade cardiovascular, 35 Γ u o potencial de abuso semelhante ao da PCP ou a actividade psicoto-mimética semelhante à da PCP. 0 glutamato é o principal transmissor excitador do cérebro, podendo assim desempenhar um papel básico na actividade relativa aos ataques e contribuir para a patogénese da epilepsia. Muitas das evidências a favor de um papel principal dos receptores de glutamato na epilepsia provêm de estudos farmacológicos que demonstram que os agonistas de receptores do glutamato provocam ataques e que os antagonistas dos receptores NMDA e AMPA são anticonvulsivos eficazes quando administrados in vivo. Há inúmeros modelos in vivo que compreendem diferentes classes de ataques e efeitos sobre o comportamento que são relevantes para formas de epilepsia clinicamente distintas. Sendo assim, é prudente ensaiar os efeitos em vários modelos, porque pode haver uma simplificação excessiva da suposição de que o mecanismo subjacente a todas as formas de actividade relativa aos ataques é o mesmo.

Exemplo 3. Actividade de bloqueio dos agentes convulsivos

Em estudos iniciais examinou-se a capacidade das aril--alquilaminas para bloquear os ataques induzidos por cainato, picrotoxina ou bicuculina. Cada um destes agentes convulsivos acua através de um mecanismo diferente e os ataques provocados por cainato são qualitativamente diferentes dos provocados por picrotoxina ou bicuculina. Nestas experiências administrou-se por via intravenosa (i.v.) uma fracção do veneno de Agenelopsis aperta, que contém várias toxinas de aril-alquilamina, decorridos 5 minutos após a administração de picrotoxina ou bicuculina e decorridos 5 minutos após a administração de cainato. As aril-alquilaminas reduziram os ataques induzidos pelos três agentes. Os efeitos da picrotoxina ou da bicuculina foram tão graves que morreram todos os 19 animas de contraprova ao fim de um período de 20 minutos. Pelo contrário, não morreu nenhum dos 19 animais tratados previamente com aril-alquilaminas. Com efeito, apenas cerca de metade dos animais tratados com as aril-alquilaminas apresentou convulsões, tendo os sintomas cessado ao fim de 1 hora. Estes resultados 36

V f demonstram os óbvios efeitos anticonvulsivos das aril-alquilaminas e inspiraram outros estudos utilizando aril-alquilaminas purificadas e seus análogos.

Química e actividade biológica das aril-alquilaminas sintéticas simplificadas

As aril-alquilaminas simplificadas compreendem as seguintes fórmulas estruturais

37

X

X- R

em que η = 1 a 6, cada X pode representar independentemente um ou vários H, Br, Cl, F, alquilo inferior e/ou OCH3, cada R1 pode representar independentemente H, alquilo inferior, OH, O-alquilo ou O-acilo e cada R2 pode representar independentemente H ou alquilo inferior.

Os exemplos de tais aril-alquilaminas simplificadas compreendem, mas sem que isso constitua qualquer limitação, os Compostos 19 a 53, cujas fórmulas estruturais são a seguir apresentadas.

/X

Composto 19 F

NH2 Composto 20 38

F

2 3

39

nh3ci

40

nh3ci

NH3C1

41

42

L~ w ^

43

VI

Composto 41

44

Cl Composto 45

45

46 Γ

Exemplo 4. Actividade biológica do Composto 19 e seus análogos

Os Compostos 19 a 53 revelaram uma grande eficácia face aos aumentos de [Ca2+]i induzidos por NMDA em células de grânulos de cerebelo de ratos criadas em cultura (Quadro 1). 0 efeito inibidor do Composto 19 sobre as respostas a NMDA foi não competitivo. Os Compostos 19 a 37 inibiram a fixação de [3H]MK-801 em membranas preparadas a partir de tecido do hipocampo e do córtex de ratos (Quadro 1). 0 Composto 19 possuía as seguintes actividades biológicas adicionais: actividade anticonvulsiva significativa (p < 0,5 comparativamente com a contraprova) face a ataques importantes induzidos por electrochoque em ratos após a administração i.p. (DE50 = 26,4 mg/kg e DT50 (rotorod) = 43,8 mg/kg); actividade anticonvulsiva significativa (P < 0,5 comparativamente com a contraprova) face a ataques importantes induzidos por electrochoque em ratos após a administração por via oral p.o. (DE50 = 35 mg/kg), mas com deterioração motora para a concentração de 30 mg/kg; actividade analgésica significativa nos ensaios de retorcimento em placa quente e induzido por PBQ na concentração de 16 mg/kg i.p.; sem comportamento estereotipado como PCP (hiperexcitabilidade e movimento oscilante da cabeça) para a concentração de 30 mg/kg i.p. em ratos; sem generalização em PCP no ensaio de discriminação da PCP para doses a partir da dose activa sob o ponto de vista do comportamento da concentração de 30 mg/kg i.p.. 0 composto 19 foi significativamente menos potente para antagonizar os aumentos de [Ca2+]i provocados pelas concentrações de 47

despolarização de KC1 em células de grânulos de cerebelo de ratos (CI5o = 10,2 μΜ) e não teve nenhum efeito sobre a pressão sanguínea quando administrado por via subcutânea em ratos, em doses de cerca de 100 mg/kg. Não obstante, o composto 19 bloqueava a indução da PLP em secções laminares cortadas do hipocampo de ratos, quando se testou na concentração de 100 μΜ. O Composto 20 possuía as seguintes actividades biológicas adicionais: actividade anticonvulsiva significativa face a ataques importantes induzidos por electrochoque em ratos após a administração i.p. (DE50 = 20,1 mg/kg e DT50 (rotorod) = 20,6 mg/kg); sem actividade anticonvulsiva significativa (p < 0,5 comparativamente com a contraprova) face a ataques importantes induzidos por electrochoque em ratos após a administração por via oral p.o. em doses de 30 mg/kg, mas com deterioração motora para a concentração de 30 mg/kg; actividade anticonvulsiva significativa face a ataques induzidos por ruído num modelo de epilepsia reflexa em ratos geneticamente susceptíveis (ratos da estirpe Fring) após a administração i.p. (DE50 = 2,1 mg/kg e DT50 = 19,9 mg/kg) e por via oral (DE50 = 9,7 mg/kg e DT50 = 21,8 mg/kg); actividade neuroprotectora significativa no modelo de isquémia temporal focal em ratos (uma redução de 51% no volume do enfarte após a administração de duas doses de 1 mg/kh i.p., a primeira imediatamente após a oclusão da artéria cerebral central e a segunda administração 6 horas mais tarde; uma redução de 43% do volume do enfarte após a administração de duas doses de 1 mg/kg i.p., a primeira imediatamente após a oclusão da artéria cerebral central [isto é, no momento da reperfusão] e a segunda administração 6 horas mais tarde); sem generalização em PCP no ensaio de discriminação da PCP para doses a partir da dose activa sob o ponto de vista do comportamento da concentração de 10 mg/kg i.p.; sem vacuolização neuronal quando administrado em doses de 10 e 30 mg/kg i.p.; e sem actividade cardiovascular significativa para doses de cerca de 15 μπιοΐ/kg i.v. ou 10 mg/kg i.p.. 0 Composto 21 possuía as seguintes actividades biológicas adicionais: actividade anticonvulsiva significativa face a ataques 48 f

Lz

induzidos por ruído num modelo de epilepsia reflexa em ratos geneticamente susceptíveis (ratos da estirpe Fring) após a administração i.p. (DE50 = 3,41 mg/kg e DT50 (sustos) = 15,3 mg/kg) . 0 Composto 22 possuía as seguintes actividades biológicas adicionais; actividade anticonvulsiva significativa face a ataques induzidos por ruído num modelo de epilepsia reflexa em ratos geneticamente susceptíveis (ratos da estirpe Fring) após a administração i.p. (DE5o = 4,90 mg/kg e DT50 (grelha invertida) 26,8 mg/kg) e por administração oral (DE50 = 5,1 mg/kg e DT50 = 18,3 mg/kg); e sem actividade cardiovascular significativa para doses inferiores a 15 pmol/kg (4,47 mg/kg) i.v..

Considerados em conjunto, os resultados obtidos com estas aril-alquilaminas sintéticas simplificadas sugerem que tais moléculas simplificadas não interagem especificamente com o local de ligação das aril-alquilaminas nos canais de Ca2+ activados por meio de um receptor. De forma específica, os Compostos 19 a 53 ligam-se ao local marcado com [/^HjMK-SOl em concentrações aproximadamente 1 a 50 vezes superiores às que antagonizam a função do complexo receptor NMDA-ionóforo. O facto de os Compostos 19 a 53, em doses terapêuticas, não produzirem um comportamento estereotipado de PCP, não serem substituídos por PCP nos ensaios de discriminação do fármaco ou não provocarem vacuolização neuronal, sugere no entanto que tais compostos podem ser úteis tanto como compostos principais ou então como compostos candidatos a fármacos para perturbações e doenças neurológicas. Foi já descrito que os compostos que se ligam com fraca afinidade (no que diz respeito ao MK-801) ao local marcado com [3H]MK-801 poderiam possuir utilidade terapêutica e um perfil de efeitos secundários mais favorável do que de um agonista de elevada afinidade, tal como o próprio MK-801 (Rogawski, “Therapeutic potential of excitatory amino acid antagonists: channel blockers and 2,3-benzodiazepines”, Trends Pharmacol. Sei. 14, 325, 1993). A fraca afinidade dos Compostos 19 a 53 ((no que diz respeito ao MK-801) 49

j-— I—L para o local marcado com [3H]MK-801 situa os Compostos 19 a 53 nesta classe geral de antagonistas não competitivos de fraca afinidade.

Identificação de um novo local modulador nos canais de cálcio activados por meio de um receptor

Tendo sido identificadas aril-alquilaminas que possuem propriedades terapeuticamente úteis, conforme definidas antes, é possivel agora identificar compostos que actuem no local critico de ligação de aril-alquilaminas nos canais de Ca2+ activados por meio de um receptor, tais como os que se encontram presentes dentro dos complexos NMDA-, AMAP- e receptor colinérgico nicotínico-ionóforo.

Exemplo 5. Fixação de um radioligando no córtex ou no cerebelo de ratos 0 ensaio seguinte pode ser utilizado como ensaio de elevado rendimento total para o escrutínio de colecções de produtos (por exemplo, colecções de produtos naturais e arquivos de compostos nas grandes companhias farmacêuticas) destinado a identificar novas classes de compostos com actividade neste local singular de ligação das aril-alquilaminas. Assim, estas novas classes de compostos são utilizadas como estruturas químicas principais para um programa de pesquisa de fármacos, utilizando como alvo o local de união de aril-alquilaminas nos canais de Ca2+ activados por meio de um receptor. Os compostos identificados por meio deste ensaio proporcionam um novo enfoque terapêutico para o tratamento de perturbações ou doenças neurológicas. Como exemplos de tais compostos refere-se os que satisfazem às fórmulas estruturais genéricas anteriores. Podem realizar-se experiências de rotina para identificar aqueles compostos que possuem as actividades desejadas.

As membranas de cérebro de ratos são preparadas em conformidade com o método de Williams et al. (“Effects of polyamines on the binding of [3HjMK-801 to the NMDA receptor: Pharmacological evidence for the existence of a polyamine recognition site”, Molec. Pharmacol. 36, 575, 1989) com as seguintes modificações. Sacrificou-se por 50 v

L-Cj decapitação ratos (machos) da estirpe Sprague-Dawley (Harlan Laboratories) com 100 a 200 g de peso. Limpou-se e dissecou-se os córtex ou os cerebelos de 20 ratos. Homogeneizou-se o tecido cerebral resultante a 4°C, utilizando um homogeneizador politrónico na sua posição de configuração mais baixa, em 300 mL de sacarose 0,32 M que continha K-EDTA 5 mM (pH 7,0). Centrifugou-se o homogeneizado a 1000 x g durante 10 minutos, removeu-se o sobrenadante e centrifugou-se a 30000 x g durante 30 minutos. Colocou-se o sedimento novamente em suspensão em 300 mL de K-EDTA 5 mM (pH 7,0) e incubou-se a 32°C durante 30 minutos. Em seguida centrifugou-se a suspensão a 100 000 x g durante 30 minutos. Lavou-se as membranas, que foram depois novamente colocadas em suspensão em 500 mL de K-EDTA 5 mM (pH 7,0), incubou-se a 32°C durante 30 minutos e centrifugou-se a 100 000 x g durante 30 minutos. Repetiu-se o procedimento de lavagem, incluindo a incubação durante 30 minutos. Coloca-se o sedimento final novamente em suspensão em 60 mL de K--EDTA 5 mM (pH 7,0) e guarda-se em porções a -80°C. O amplo processo de lavagem utilizado neste ensaio foi concebido num esforço para minimizar as concentrações de glutamato e de glicina (co-agonistas no complexo receptor NMDA-ionóforo) presentes na preparação membranar.

Para realizar um ensaio de fixação com [3H]aril-alquilamina descongelou-se porções de MPS (membranas de plasma sinápticas, em inglês SPM) que foram novamente colocadas em suspensão em 30 mL de EPPS 30 irM/K-EDTA 1 mM, a pH 7, 0, e depois centrifugou-se a 100 000 x g durante 30 minutos. Colocou-se as MPS novamente em suspensão em tampão A (EPPS 30 mM/K-EDTA 1 mM, a pH 7,0). Adicionou-se a esta mistura de reacção a [3H]-aril-alquilamina. Os ensaios de fixação foram realizados em tubos de ensaio de polipropileno. 0 volume final de incubação era de 500 μΕ. Determinou-se a fixação não especifica em presença de aril-alquilamina não radioactiva 100 μΜ. Efectuou-se a incubação de amostras em duplicado a 0°C durante 1 hora. Os ensaios foram interrompidos por adição de 3 mL de tampão A arrefecido com gelo, seguindo-se a filtração através de filtros feitos de fibra de 51

vidro (Schleicher & Schuell, n° 30) que se embeberam previamente em polietileno-imina a 0,33% (PEI). Lavou-se os filtros com 3 x 3 iL de tampão A e determinou-se a radioactividade por contagem de cintilações com uma eficiência de 35%-40% tomando como referência o 3H.

Para se validar o ensaio descrito foram também realizadas as experiências seguintes: (a) determinou-se a quantidade de fixação não especifica da [3H]-aril-alquilamina aos filtros fazendo passar 500 μL de tampão A, contendo diversas concentrações de [3H]-aril-alquilamina, através dos filtros de fibra de vidro previamente embebidos. Lavou-se os filtros com mais 4 x 3 mL de tampão A e determinou-se a radioactividade ligada aos filtros por contagem de cintilação com uma eficiência de 35%-40% tomando como referência o 3H. Nos filtros que não tinham sido tratados previamente com PEI a 0,33% descobriu-se que 87% do ligando 3H estava ligado ao filtro. O embebimento prévio com PEI a 0,33% reduz a fixação não especifica a 0,5%-l,0% do ligando total acrescentado. (b) Construiu-se uma curva de saturação colocando novamente em suspensão as MPS em tampão A. O tampão de ensaio (500 μΕ) continha 60 μg de proteína. Foram utilizadas concentrações de [3H]aril--alquilamina compreendidas no intervalo entre 1,0 nM e 400 μΜ em unidades semilogarítmicas. Construiu-se uma curva de saturação a partir dos dados e determinou-se um valor de 1¾ aparente e um valor de Bmax. por análise de Scatchard (Scatchard, “The atractions of proteins fórmula geral small molecules and ions” Ann. N. Y. Acad. Sei. 51, 660, 1949) . A cooperatividade da fixação da [3H]aril- -alquilamina foi determinada por construção de um diagrama de Hill (Hill, “A new mathematical treatment of changes of ionic concentrations in mucle and nerve under the action of electric currents, with a theory to their mode of excitation”, J. Physiol. 40, 190, 1910).

(c) A dependência entre a fixação e a concentração de proteína (receptor) foi determinada colocando novamente em suspensão as MPS 52 I—^ em tampão A. 0 tampão de ensaio (500 μΐ,) continha uma concentração de [3H]aril-alquilamina igual ao seu valor de Kj e concentrações crescentes de proteína. A fixação específica de [3H]aril-alquilamina deve estar relacionada linearmente com a quantidade de proteína (receptor) presente. (d) Determinou-se o curso temporal da ligação ligando-receptor colocando novamente em suspensão as MPS em tampão A. O tampão de ensaio (500 μΐ,) continha uma concentração de [3H]aril-alquilamina igual ao seu valor de K e 100 μg de proteína. Efectuou-se a incubação de amostras em duplicado a 0°C durante vários intervalos de tempo; determinou-se o momento em que foi alcançado o equilíbrio e utilizou-se este valor temporal de forma rotineira em todos os ensaios subsequentes. (e) A farmacologia do local de ligação pode ser analisada por experiências de competição. Em tais experiências a concentração de pHjaril-alquilamina e a quantidade de proteína mantiveram-se constantes, ao mesmo tempo que se faz variar a concentração do fármaco de ensaio (fármaco competidor). Este ensaio possibilita a determinação de um valor CI50 e de uma K aparente para o fármaco competidor (Cheng e Prusoff, “Relationship between the inhibition constant (Kl) and the concentration of inhibitor which causes 50 percent inhibition (IC50) of an enzymatic reaction”, J. Biochem. Pharmacol. 22, 3099, 1973). A cooperatividade da fixação do fármaco competidor é determinada por análise de um diagrama de Hill. A fixação específica da [^aril-alquilamina representa a fixação a um local novo no canais de Ca2+ activados por meio de um receptor, tais como os que estão presentes dentro dos complexos NMDA-, AMPA-e receptor colinérgico nicotínico-ionóforo. Outras aril-alquilaminas devem competir, como tais, com a fixação de [3H]aril-alquilamina de um modo competitivo, e as suas potências neste ensaio devem estar relacionados com as suas potências inibidoras num ensaio funcional de antagonismo dos canais de Ca2+ activados por meio de um receptor 53

(por exemplo, a inibição dos aumentos de [Ca2+]i induzidos por um receptor NMDA nas culturas de células de grânulos de cerebelo de ratos). Pelo contrário, os compostos que possuem actividade nos outros locais conhecidos dos canais de Ca2+ activados por meio de um receptor (por exemplo, MK-801, Mg2+, poliaminas) não devem deslocar a fixação de [3H]aril-alquilamina de uma forma competitiva. De uma forma ainda melhor, dever-se-ia prever uma modulação alostérica complexa da fixação de [3H]aril-alquilamina, indicadora de interacções não competitivas. Em experiências preliminares o MK-801 não deslocou a fixação de ptflaril-alquilamina para concentrações de cerca de 100 μΜ. (f) Os estudos para determinar a cinética da dissociação foram realizados medindo a fixação de [3H]aril-alquilamina depois de a deixar atingir um equilíbrio (veja-se a alínea (d) anterior) e adicionando à mistura de reacção um grande excesso de fármaco competidor não radioactivo. A fixação da [3H]aril-alquilamina é ensaiada logo para diversos intervalos de tempo. Por meio deste ensaio são determinadas as taxas de associação e dissociação da fixação da [^aril-alquilamina (Triteler, ‘Multiple Dopamine receptors: receptor Binding Studies in Dopamine Pharmacology”, Mareei Dekker, Inc., Nova Iorque, 1983). Outras experiências implicam a variação da temperatura de reacção (desde 0°C até 37°C) com o objectivo de se compreender a dependência deste parâmetro relativamente à temperatura.

Exemplo 6. Fixação de um radioligando em células de grânulos de cerebelo A partir de ratos com 8 dias de idade foram obtidas culturas primárias de neurónios de grânulos de cerebelo, as quais foram dispostas em placas sobre quadrados de plástico Aclar revestidos com poli-L-lisina. Coloca-se os quadrados de plástico em placas de cultura de 24 cavidades e adiciona-se a cada cavidade aproximadamente 7,5 x 105 células de grânulos. Mantém-se as culturas em meio de Eagle (Laboratórios HyClone), que contém KC1 25 mM, soro fetal de vitela a 10% /Laboratórios HyClone), glutamina 2 mM, gentamicina na concentração de 100 μg/mL, 50 U/mL de penicilina e estreptomicina 54

na concentração de 50 μς/πϋΟ a 37°C, em atmosfera humidificada com 5% de C02 no ar, durante 24 horas antes da adição de citosina--arabinósido (10 μΜ, final) . Não se substitui o meio de cultura até as células seres utilizadas para os estudos de ligação ao receptor, decorridos 6 a 8 dias após a disposição em placas.

Para a realização de um ensaio e fixação com [3H]aril--alquilamina, coloca-se uma mistura de reacção constituída por 200 μΐ, de tampão A (K-HEPES 20 mM, K-EDTA 1 mM, a pH 7,0) em cada cavidade da placa de 24 cavidades. Adiciona-se a [3H]aril-alquilamina a esta mistura de reacção. Determina-se a fixação não específica em presença de aril-alquilamina não radioactiva 100 μΜ. Efectua-se a incubação de amostras em triplicado a 0°C durante 1 hora. Os ensaios são interrompidos retirando-se manualmente as células dos quadrados Aclar e colocando-as em tubos de ensaio feitos de polipropileno. Coloca-se as membranas assim preparadas a partir das células intactas em suspensão em 10 mL de tampão A arrefecido com gelo e filtra-se através de filtros de fibra de vidro (Schleicher & Schuell, n° 30) que se embeberam previamente em polietileno-imina a 0,33% (PEI). Lavou-se os filtros com mais 3 x 3 mL de tampão A e determinou-se a radioactividade por contagem de cintilações com uma eficiência de 35%-40% tomando como referência o 3H. 0 ensaio pode ser terminado por centrifugação, em vez de o ser por filtração, com o objectivo de minimizar a fixação não específica.

As experiências específicas para caracterizar e validar o ensaio são realizadas essencialmente conforme descrito antes, com a excepção de se utilizarem células em vez de membranas para a fixação inicial. 0 ensaio de fixação prevê a determinação de um valor CI50 e de uma Kd aparente para o fármaco competitivo, tal como se descreve por análise de Scatchard (Scatchard, “The atractions of proteins fórmula geral small molecules and ions” Ann. N. Y. Acad. Sei. 51, 660, 1949). A cooperatividade da fixação do fármaco competidor é determinada por análise de um diagrama de Hill (Hill, “A new mathematical treatment of changes of ionic concentrations in 55

\| mucle and nerve under the action of electric currents, with a theory to their mode of excitation”, J. Physiol. 40^ 190, 1910) . A fixação específica da [3H]aril-alquilamina representa a ligação a um local novo nos canais de cálcio activados por meio de um receptor.

Exemplo 1. Ensaio de electrofisiologia com sujeição por partes O ensaio seguinte é realizado para compostos seleccionados, identificados nos ensaios de fixação de radioligandos descritos supra, enquanto interactivadores, de um modo muito potente e competitivo, no novo local de ligação da aril-alquilamina nos canais de Ca2+ activados por meio de um receptor, tal como os que estão presentes nos complexos NMDA-, AMPA- ou receptor colinérgico nicotínico-ionóforo. Este ensaio com sujeição por partes proporciona dados adicionais relevantes acerca do local e do mecanismo de acçâo dos referidos compostos previamente seleccionados. De forma específica, são determinadas as seguintes propriedades farmacológicas e fisiológicas dos compostos que interactuam no local de ligação da aril-alquilamina, utilizando o complexo receptor NMDA-ionóforo como exemplo de canais de Ca2+ activados por meio de um receptor: a potência e eficácia para bloquear as correntes iónicas mediadas pelo receptor NMDA, a natureza não competitiva do bloqueio referente ao glutamato e à glicina, a dependência entre a acção e a utilização, a dependência entre a acção e a voltagem, tanto em relação ao início como à inversão do bloqueio, a cinética do bloqueio e desbloqueio (inversão) e o mecanismo do bloqueio em canal aberto. Tais dados confirmam que os compostos que interactuam no local de ligação da aril-alquilamina mantêm o perfil biológico singular das aril-alquilaminas e não têm a sua actividade principal nos locais conhecidos do complexo receptor NMDA-ionóforo (local de ligação o glutamato, local de ligação da glicina, local de ligação do MK-801, local de ligação do Mg2+, local de ligação do Zn2+, local de ligação sigma, local de ligação da poliamina).

Os registos com sujeição por partes dos neurónios de mamíferos (células do hipocampo, cortiçais e de grânulos de cerebelo) são 56 f realizados recorrendo a procedimentos convencionais (Donevan et ai., “Arcaine Blocks N-Methyl-D-Aspartate Receptor Responses by an Open Channel Mechanism: Whole-Cell and Single-Channel Recording Studies in Cultured Hipocampal Neurons”, Molec. Pharmacol. 41, 727, 1992; Rock e Macdonald, “Spermine and Related Polyamines Produce a Voltage-Dependent Reduction o f NMDA Receptor Single-Channel Conductance”, Molec. Pharmacol. 42, 157, 1992).

Em alternativa, é possível realizar experiências com sujeição por partes em oócitos de Xenopus ou numa linhagem celular de mamíferos transfectada de uma forma estável (por exemplo, células HEK 293) que expressam subunidades específicas dos canais de Ca2+ activados por meio de um receptor. Deste modo, é possível determinar, por exemplo, a potência e a eficácia em diversos subtipos de receptores de glutamato (por exemplo, NMDAR1, NMDAR2A a NMDAR2D, GluRl a GluR4). É possível obter-se mais informações sobre o local de acção das aril-alquilaminas em estes subtipos de receptores de glutamato, utilizando a mutagénese dirigida ao local.

Exemplo 8. Síntese de aril-alquilaminas simplificadas A síntese do Composto 20 foi efectuada conforme a seguir se descreve.

Preparou-se uma solução de 1,21 g (50 mmol) de hidreto de sódio em dimetoxietano, tratou-se com 8,86 g (50 mmol) de ciano--metil-fosfonato de dietilo e agitou-se a mistura de reacção durante 4 horas à temperatura ambiente. A esta acrescentou-se 10 g (46 mmol) de 3, 3’-difluorobenzofenona em DME. Agitou-se a mistura de reacção durante 24 horas à temperatura ambiente, extinguiu-se com água e repartiu-se entre éter dietílico e água. Secou-se a fracção etérea sobre sulfato de sódio e concentrou-se. A análise do EM-CG para este material mostrou 90% do produto A e 10% da benzofenona de partida.

Preparou-se uma solução deste material em etanol com uma quantidade catalítica de Pd(0H)2 e hidrogenou-se em atmosfera de hidrogénio a uma pressão de 379 kPa durante 4 horas à temperatura 57

u. ambiente. Filtrou-se a mistura de reacção e lavou-se o catalisador com etanol (3 x). Combinou-se o filtrado e os produtos da lavagem com etanol e concentrou-se. A análise do EM-CG deste material revelou 90% do produto Be 10% da benzofenona de partida.

Preparou-se uma solução deste material em THF, tratou-se com 70 mL de B2H6 1 M (70 mmol) em THF e manteve-se ao refluxo durante 1 hora. Após o arrefecimento, alcalinizou-se a mistura de reacção para pH 14 com NaOH 10 N e equilibrou-se com éter. Removeu-se a camada etérea e lavou-se com HC1 a 10% (3x) . Combinou-se os produtos ácidos da lavagem, alcalinizou-se para pH 14 com NaOH 10 N e extraiu-se com diclorometano (3x). Combinou-se os produtos orgânicos da lavagem, secou-se sobre sulfato de sódio e concentrou-se para se obter um óleo. A análise do EM-CG deste material revelou 100% do Composto 20. Análise do EMIE-CG (Tr = 7,11 min) m/z (intensidade relativa) 247 (M+, 31), 230 (100), 215 (30), 201 (52), 183 (63), 134 (23), 121 (16), 101 (21), 95 (15), 77 (15). Colocou-se este material em éter dietilico, filtrou-se e tratou-se com 35 mL de HC1 1 M em água-etanol para se obter 1,045 g do Composto 20 sob a forma do seu sal cloridrato. ΕΜΝ^Η (CDC13) δ 8,28 (3H, s lr), 7,28-7,17 (2H, m), 7,02-6,86 (6H, m) , 4,11 (1H, t, J = 8 HZ), 2,89 (2H, t lr, J = 8 Hz), 2,48 (2H, t lr, J = 7 Hz); RMN-13C (CDC13) δ 164, 6, 161,3, 144,8, 144,7, 130,4, 130,3, 123,3, 123,2, 114,7, 114,5, 114, 1, 113, 8, 47,4, 38,4, 32,7. 58

11 1) NaH-DME

Pd(0H)2-EtOH H2 379 kPa

A síntese do Composto 23, do Composto 33 e do Composto 34 foi realizada conforme a seguir se descreve.

Num balão de fundo redondo com a capacidade de 100 mL, equipado com um agitador, septos e uma fonte de árgon, carregou-se 2,43 g (10 mmol) do composto 1 em 30 mL de THF. Arrefeceu-se a solução para -78°C e tratou-se gota a gota com 11 mL (11 mmol) de bis--(trimetil-silil)-amida de lítio 1M (THF). Agitou-se a mistura de reacçâo durante 30 minutos a -78°C e tratou-se gota a gota com um excesso de iodometano (50 mmol, 3,1 mL) . Agitou-se a mistura de reacção durante 30 minutos a -58°C. A análise do EM-IE-CG de uma porção da mistura de reacção revelou o consumo do composto nitrilo de partida 1. Extinguiu-se a mistura de reacção com água, diluiu-se com éter dietílico e transferiu-se para um funil de separação. Lavou-se a camada etérea com HC1 a 10% (3x) e com salmoura (lx) , secou-se sobre sulfato de magnésio anidro e concentrou-se para se obter um óleo castanho. Destilou-se este material (tubo com esferas, 100°C) sob pressão reduzida para se obter 1,5 g de um óleo 59 ^

claro. A análise do EM-IE-CG deste material demonstrou que contém o produto 2 desejado. (Tr = 7,35 min) m/z (intensidade relativa) 257 (M+, 3), 203 (100), 183 (59), 170 (5), 133 (4), 109 (3); RMN-aH (CDC13) δ 7,4-6,9 (8H, m) , 4,01 (1H, d, J = 10 Hz), 3,38 (1H, qd, J = 7, 10 Hz), 1,32 (3H, d, J = 7 Hz); RMN-13C (CDC13) δ 19,4, 30,5, 54,2, 114,5, 114, 6, 114,7, 114, 9, 115, 0, 115,3, 123,3, 123,4, 123, 6, 123, 7, 130, 5, 130, 6, 131,7. 0 produto 3 foi sintetizado por redução catalítica do produto 2 utilizando níquel de Raney numa mistura de EtOH e solução aquosa de hidróxido de sódio (2 eq.) a 95:5, em atmosfera de hidrogénio sob uma pressão de 413 kPa. Análise por EM-IE-CG (Tr = 7,25 min) m/z (intensidade relativa) 261 (M+, 20), 244 (35), 229 (16), 215 (17), 201 (80), 183 (100), 133 (42), 115 (27), 109 (47), 95 (20); RMN-1H (CDCI3) δ 7,3-6,8 (8H, m) , 3,62 (1H, d, J = 10 Hz), 2,70 (1H, m) , 2,40 (2H, m), 1,73 (2H, m), 0,91 (3H, d, J = 7 Hz). Note-se que o produto 3 nesta sequência de reacção corresponde ao Composto 21.

Submeteu-se o produto 2, em porções de 500 μΐι, numa mistura de IPA a 10% em hexano (100 mg/mL) a cromatografia através de Célula OD quiral (2,0 x 25 cm), utilizando a mistura de IPA a 10% em hexano à razão de 10 mL/minuto, medindo a densidade óptica a 254 nm. Esta deu os dois enantiómeros opticamente puros 4 e 5 (conforme determinado por CLER analítica quiral; note-se que a atribuição estereoquímica destes dois compostos não tinha ainda sido feita neste momento) . Estes dois compostos revelaram uma análise por EM--IQ-CG e um espectro de EMN^H idênticos ao do produto 2 (dados indicados supra).

Cada um dos enantiómeros 4 e 5 foi reduzido individualmente, utilizando-se para tal um complexo de enxofre de dimetil-borano, tal como a seguir se descreve. Preparou-se uma solução do composto (_4 ou 5) em THF, aqueceu-se ao refluxo, tratou-se com um excesso (2 eq.) do complexo de enxofre de dimetil-borano 1M (em THF) e depois manteve-se a mistura de reacção ao refluxo durante 30 minutos. No final deste intervalo de tempo, arrefeceu-se a mistura de reacção para 0°C e tratou-se com HC1 6N. Manteve-se a mistura de reacção ao refluxo durante 30 minutos. No final deste intervalo de 60

ool M tempo, transferiu-se a mistura de reacção para um funil de separação, alcalinizou-se para pH > 12 com NaOH 10N e extraiu-se o produto (6 ou 7) com éter. Lavou-se a camada etérea com salmoura, secou-se sobre sulfato de magnésio anidro e concentrou-se para se obter um óleo. Purificou-se o produto por CCF preparatória, utilizando uma mistura de metanol a 5% em clorofórmio. Verificou-se que a análise por EM-IQ-CG e o espectro de ΚΜΝ^Η de cada um dos enantiómeros individuais (6 e 7) eram idênticos aos do produto (dados indicados antes). Faz-se observar que os produtos 6 e deste esquema correspondem aos Compostos 33 e 34.

(Composto 21) 2

Cel OD Quiral 10% IPA/Hexano ---——>

1) Me,S - BH, 2) HC1

(Composto 33)

(Composto 34) 61

Γ A síntese do Composto 22 foi efectuada conforme a seguir se descreve. 0 Composto 23 foi sintetizado de um modo idêntico.

Adicionou-se lentamente 17,2 g (76,8 mmol) de fosfono-acetato de trietilo a uma suspensão de 3,07 g (76,8 mmol) de hidreto de sódio em 350 mL de Ν,Ν-dimetilformamida. Decorridos 15 minutos acrescentou-se à solução 15,2 g (69,8 mmol) de 3,3’-difluorobenzo-fenona e agitou-se durante mais 18 horas. Extinguiu-se a mistura de reacçâo com água e repartiu-se entre água e éter. Lavou-se as camadas orgânicas combinadas, utilizando para tal salmoura, e secou-se sobre sulfato de magnésio anidro. Evaporou-se o solvente sob vácuo para se obter 19,7 g de 3,3-bis(3-fluorofenil)-acrilato de etilo com o aspecto de um óleo amarelo. A uma solução de 19,7 g (8,4 mmol) de 3,3-bis(3-fluorofenil)--acrilato de etilo em 200 mL de etanol adicionou-se 3,5 g de hidróxido de paládio sobre carvão. Agitou-se a mistura em atmosfera de hidrogénio à pressão de 413 kPa durante 3 horas, filtrou-se e evaporou-se sob vácuo para se obter 19,5 g do produto A com o aspecto de um óleo incolor.

Hidrolizou-se 19,2 g do éster etílico A por agitação durante 6 dias com 50 mL de hidróxido de sódio 10N. Depois diluiu-se a mistura de reacção com 50 mL de água e acidificou-se para pH 0 com HC1 concentrado. Extraiu-se 3 vezes a mistura aquosa com éter, secou-se os extractos etéreos sobre sulfato de magnésio anidro e evaporou-se para se obter ácido 3,3-bis(3-fluorofenil)-propiónico com o aspecto de um pó branco.

Dissolveu-se 13 g (49,6 mmol) de ácido 3,3-bis (3-fluorofenil)--propiónico em 50 mL (685 mmol) de cloreto de tionilo e agitou-se de um dia para o outro à temperatura ambiente. Removeu-se sob vácuo o excesso de cloreto de tionilo, utilizando para tal um evaporador rotativo, para se obter 13,7 g do produto B com o aspecto de um óleo amarelo. A uma quantidade de 13,7 g (49 mmol) do cloreto de ácido B, dissolvido em 100 mL de THF anidro, adicionou-se 0,52 g (1,47 mmol) de acetil-acetonato de ferro (III). Em seguida, acrescentou-se 62

16,3 mL (49 iranol) de cloreto de metil-magnésio ao longo de 1 hora, utilizando uma bomba com seringa. Agitou-se a mistura de reacçâo durante mais 1 hora e depois extinguiu-se vertendo-a sobre uma mistura de éter e HCl a 5%. Separou-se a camada etérea, lavou-se com HCl a 5% e uma solução saturada de NaCl e secou-se sobre sulfato de sódio. Evaporou-se o solvente sob vácuo para se obter 4,4-bis (3-fluorofenil)-2-butanona com o aspecto de um óleo amarelo. Purificou-se o óleo impuro através de gel de silica, utilizando como eluente uma mistura de heptano e acetato de etilo.

F

COOEt F

A F

Cl B

F

nh2 F Composto 22

1. NaOH/MeOH/HjO 2. SOCl2 1. Fe(Acac)3, MeMgBr 2. H2N-OMe, piridina

3. NaBH4/ZrCl4, THF 63 u A sintese do Composto 24 foi efectuada conforme a seguir se descreve. Os Compostos 25 a 29 foram sintetizados de um modo idêntico.

Preparou-se uma suspensão de 0,95 g (39,2 mmol) de aparas de magnésio em 150 mL de éter dietilico anidro e tratou-se com 6,83 g (39,2 mmol) de l-bromo-3-fluorobenzeno, gota a gota, com o auxílio de uma seringa. Decorridas 1,5 horas transferiu-se a solução, utilizando para tal uma cânula, para um frasco que continha 5,0 g (36,7 mmol) de o-anisaldeído em 100 mL de éter dietilico anidro a 0°C e agitou-se durante 2 horas. Extinguiu-se a mistura de reacção com água e repartiu-se entre água e éter. Lavou-se as camadas orgânicas combinadas, utilizando salmoura para o efeito, e secou-se sobre sulfato de magnésio anidro para se obter 7,90 g (rendimento de 93%) do produto A.

Adicionou-se 16,0 g (42,5 mmol) de dicromato de piridínio a uma solução de 7,90 g (34,0 mmol) do álcool A em 100 mL de diclorometano e agitou-se a mistura de reacção durante 12 horas. Acrescentou-se 300 mL de éter dietilico à mistura de reacção, filtrou-se a solução turva através de uma camada de gel de sílica com 30 cm e lavou-se com mais 500 mL de éter. Após a evaporação do solvente sob vácuo, deixou-se o sólido recristalizar a partir de acetona para se obter 7,45 g (rendimento de 95%) do produto B.

Adicionou-se 7,0 g (39,5 mmol) de ciano-metil-fosfonato de dietilo lentamente a uma suspensão de 1,58 g (39,5 mmol) de hidreto de sódio em 100 mL de Ν,Ν-dimetilformamida. Decorridos 30 minutos acrescentou-se a cetona B à solução e agitou-se durante mais 2 horas. Extinguiu-se a mistura de reacção com água e repartiu-se entre água e éter. Lavou-se com salmoura as camadas orgânicas cominadas e secou-se sobre sulfato de magnésio anidro. Evaporou-se o solvente sob vácuo para se obter um óleo amarelo pálido.

Num balão feito de vidro resistente à pressão dissolveu-se o óleo em 100 mL de etanol e 20 mL de NaOH 10N. Adicionou-se à solução uma quantidade catalítica de níquel de Raney em suspensão em água (aproximadamente 15% em moles) . Agitou-se a mistura de 64

reacção em atmosfera de hidrogénio à pressão de 413 kPa durante 12 horas num dispositivo de hidrogenação de Parr. Depois de se separar por filtração o excesso de níquel de Raney, extraiu-se a solução com clorofórmio. Lavou-se com salmoura as camadas orgânicas combinadas e secou-se sobre sulfato de magnésio anidro. Após a filtração fez-se passar o óleo através de uma coluna de gel de sílica, utilizando para tal clorofórmio e metanol. Evaporou-se o solvente sob vácuo para se obter um óleo amarelo pálido. Análise por EMIQ-CG (Tr = 8,10 min) m/z (intensidade relativa) 259 (100), 242 (44), 213 (48), 183 (42), 136 (50), 109 (94), 91 (60), 77 (25). Acidificou-se o óleo com ácido clorídrico em éter dietílico. A evaporação do éter proporcionou um sólido amarelo pálido, o qual recristalizou a partir de acetonitrilo quente para se obter 3,45 g (rendimento de 42,1%) do Composto 24 com o aspecto de agulhas brancas. 1) Mg, éter

EtO II

F

,CN, NaH-DMF

EtO^ 2) Ni Raney, EtOH, Na OH H2 413 kPa 3) HCl-éter A síntese do Composto 30 foi efectuada conforme a seguir se descreve. 0 Composto 31 foi sintetizado de um modo idêntico.

Preparou-se uma suspensão de 0,95 g (39,1 mmol) de aparas de magnésio em 150 mL de éter dietílico anidro e tratou-se com 6,85 g 65 f~ ^ (39,1 mmol) de l-bromo-3-fluorobenzeno, gota a gota, com o auxilio de uma seringa. Decorridas 1,5 horas transferiu-se a solução, utilizando para tal uma cânula, para um frasco que continha 5,0 g (35,6 mmol) de 3-cloro-benzaldeído em 100 mL de éter dietilico anidro a 0°C e agitou-se durante 2 horas. Extinguiu-se a mistura de reacçâo com água e repartiu-se entre água e éter. Lavou-se as camadas orgânicas combinadas, utilizando salmoura para o efeito, e secou-se sobre sulfato de magnésio anidro para se obter 8,40 g (rendimento > 99%) do produto A.

Adicionou-se 15,0 g (39,8 mmol) de dicromato de piridinio a uma solução de 8,40 g (35,5 mmol) do álcool A em 100 mL de diclorometano e agitou-se a mistura de reacçâo durante 18 horas. Acrescentou-se 300 mL de éter dietilico à mistura de reacçâo, filtrou-se a solução turva através de uma camada de gel de sílica com 30 cm e lavou-se com mais 500 mL de éter. Após a evaporação do solvente sob vácuo, deixou-se o sólido recristalizar a partir de acetona para se obter 6,31 g (rendimento de 76%) do produto B.

Adicionou-se 5,2 g (29,6 mmol) de ciano-metil-fosfonato de dietilo lentamente a uma suspensão de 1,2 g (29,6 mmol) de hidreto de sódio em 100 mL de Ν,Ν-dimetilformamida. Decorridos 30 minutos acrescentou-se a cetona B à solução e agitou-se durante mais 6 horas. Extinguiu-se a mistura de reacçâo com água e repartiu-se entre água e éter. Lavou-se com salmoura as camadas orgânicas cominadas e secou-se sobre sulfato de magnésio anidro. Evaporou-se o solvente sob vácuo para se obter um óleo amarelo.

Num balão feito de vidro resistente à pressão dissolveu-se o óleo em 100 mL de etanol e 20 mL de NaOH 10N. Adicionou-se à solução uma quantidade catalítica de ródio em suspensão em alumina (aproximadamente 35% em moles). Agitou-se a mistura de reacçâo em atmosfera de hidrogénio à pressão de 413 kPa durante 24 horas num dispositivo de hidrogenação de Parr. Depois de se separar por filtração o excesso de ródio, extraiu-se a solução com clorofórmio. Lavou-se com salmoura as camadas orgânicas combinadas e secou-se sobre sulfato de magnésio anidro. Após a filtração e evaporação do 66 solvente sob vácuo, retomou-se o óleo em 100 mL de tetra--hidrofurano. Adicionou-se 23,4 mL de diborano (1,0 M) e manteve-se a solução ao refluxo durante 1,5 horas. Evaporou-se o solvente sob vácuo e acrescentou-se cuidadosamente 50 mL de HC1 6 N. Manteve-se a solução ao refluxo durante 1 hora. Após o seu arrefecimento, alcalinizou-se a mistura para pH 14, utilizando para tal NaOH 10N, e repartiu-se entre diclorometano e água. Secou-se sobre sulfato de magnésio anidro as camadas orgânicas combinadas e filtrou-se. Após a evaporação do solvente, fez-se passar o óleo amarelo através de uma coluna de gel de sílica, utilizando para tal clorofórmio e metanol. Evaporou-se o solvente sob vácuo para se obter um óleo amarelo. Análise por EMIQ-CG (Tr = 8,15 min) m/z (intensidade relativa) 263 (17), 246 (21), 211 (84), 196 (33), 183 (100), 165 (19), 133 (19). Acidificou-se o óleo com ácido clorídrico em éter dietílico. A evaporação do éter proporcionou 0,96 g de um sólido branco, o Composto 30.

D 2) 3) 4) 5)

EtO-t 8 .CN, NaH-DMF EUT \/

NH3C1 Composto 30

Rh/Alumina EfcOH 1¾ 413 kPa BjH^-THF HC1 6 N HCl-éter

A síntese do Composto 35 foi efectuada conforme a seguir se descreve. Os Compostos 36 e 37 foram sintetizados de um modo idêntico.

Preparou-se uma solução de 3,0 g (24,2 mirtol) de 3-flúor--benzaldeído a 0°C em 150 mL de éter dietílico e tratou-se com 12,7 mL (25,4 mmol) de cloreto de etil-magnésio 3,0 M em tetra-hidrofurano, com o auxílio de uma seringa. Decorridas 4 horas extinguiu-se a mistura de reacção com água e repartiu-se entre água e éter. Lavou-se as camadas orgânicas combinadas, utilizando salmoura para o efeito, e secou-se sobre sulfato de magnésio anidro para se obter 4,25 g do produto A.

Adicionou-se 6,53 g (30,3 mmol) de cloro-cromato de piridínio a uma solução de produto A em 100 mL de diclorometano e agitou-se durante 18 horas. Acrescentou-se 300 mL de éter dietílico à mistura de reacção, filtrou-se a solução turva através de uma camada de gel de sílica com 30 cm e lavou-se com mais 500 mL de éter. Após a evaporação do solvente sob vácuo, deixou-se o sólido recristalizar a partir de acetona para se obter 3,05 g do produto B. Evaporou-se o solvente sob vácuo para se obter um óleo amarelo pálido.

Adicionou-se lentamente 4,7 g (26,4 mmol) de ciano-metil--fosfonato de dietilo a uma suspensão de 1,1 g (26,4 mmol) de hidreto de sódio em 100 mL de N, N-dimetilformamida. Decorridos 30 minutos acrescentou-se a cetona B à solução e agitou-se durante mais 6 horas. Extinguiu-se a mistura de reacção com água e repartiu-se entre água e éter. Lavou-se com salmoura as camadas orgânicas cominadas e secou-se sobre sulfato de magnésio anidro. Evaporou-se o solvente sob vácuo para se obter um óleo amarelo pálido.

Num balão feito de vidro resistente à pressão dissolveu-se o óleo em 100 mL de etanol e 20 mL de NaOH 10N. Adicionou-se à solução uma quantidade catalítica de níquel de Raney em suspensão em água (aproximadamente 15% em moles) . Agitou-se a mistura de reacção em atmosfera de hidrogénio à pressão de 413 kPa durante 24 horas num dispositivo de hidrogenação de Parr. Depois de se separar por filtração o excesso de níquel de Raney, extraiu-se a solução 68 p U ^^ com clorofórmio. Lavou-se com salmoura as camadas orgânicas combinadas e secou-se sobre sulfato de magnésio anidro. Após a filtração fez-se passar o óleo através de uma coluna de gel de sílica, utilizando para tal clorofórmio e metanol. Evaporou-se o solvente sob vácuo para se obter um óleo amarelo pálido. Análise por EMIQ-CG (Tr = 3,45 min) m/z (intensidade relativa) 167 (4), 150 (63), 135 (58), 109 (100), 96 (53), 75 (48). Acidificou-se o óleo com ácido clorídrico em éter dietílico. A evaporação do éter proporcionou um sólido amarelo pálido, o qual recristalizou a partir de acetonitrilo quente para se obter 2,2 g do Composto 35.

EtCL H _ >P. CN, NaH-DMF EtO

2) Ni Raney, EtOH, NaOH H2 413 kPa 3) HCl-éter A síntese do Composto 38 foi efectuada conforme a seguir se descreve. A nmg solução de 1,5 g (6,17 mmol) de 3,3-bis(3-fluorofenil)--propionitrilo em 250 mL e THF, à temperatura de -70°C, adicionou-se butil-lítio (4,25 mL em hexano, 6,8 mmol), com o auxílio de uma seringa, ao longo de 5 minutos. Agitou-se a solução durante 5 minutos e em seguida acrescentou-se 1,75 g (12,3 mmol) de iodeto de metilo ao longo de 1 minuto. Depois deixou-se a mistura de reacção aquecer até à temperatura ambiente. Interrompeu-se a reacção por 69

diluição com éter e lavou-se com HC1 a 5% e com água. Secou-se a camada etérea sobre sulfato de sódio e evaporou-se para se obter 1,5 g do nitrilo metilado com o aspecto de um óleo amarelo. A uma quantidade de 1,46 g (5,7 mmol) de 3,3-bis (3-fluoro-fenil)-2-metil-propionitrilo em 50 mL de diclorometano a 0°C adicionou-se 1,02 mL (5,7 mmol) de di-isobutil-alumínio, com o auxílio de uma seringa, ao longo de um período de 10 minutos.

Agitou-se a mistura de reacção durante 30 minutos a 0°C e depois durante mais 2 horas à temperatura ambiente. Interrompeu-se a reacção por adição de 200 mL de HCl a 10% e agitação a 40°C durante 30 minutos, seguindo-se a extracção do produto com diclorometano. Secou-se a camada orgânica sobre sulfato de sódio e evaporou-se para se obter 1,36 g do produto A. A uma solução de 1,36 g (5,23 mmol) do aldeído A em 40 mL de éter a 0°C adicionou-se brometo de metil-magnésio (5,23 mL em éter, 5,23 mmol). Agitou-se a mistura de reacção durante 3 horas à temperatura ambiente e extinguiu-se então com HCl diluído. Separou-se a camada orgânica, secou-se sobre sulfato de sódio e evaporou-se para se obter 1,48 g de 4,4-bis(3-fluorofenil)-3-metil--butano-2-ol. A uma solução de 1,4 g (5,07 mmol) do álcool em 300 mL de diclorometano juntou-se 1,2 g (5,58 mmol) de cloro-cromato de piridínio e agitou-se a mistura de um dia para o outro. Diluiu-se então a mistura de reacção com 100 mL de éter e filtrou-se através de uma camada de sílica. Por evaporação dos solventes obteve-se 1,39 g do produto B.

Adicionou-se 1,3 g (4,9 mmol) da cetona B a uma solução de 0,45 g (5,38 mmol) de cloridrato de metoxil-amina e 0,44 mL (5,38 mmol) de piridina em 30 mL de etanol e agitou-se de um fia para o outro. Em seguida evaporou-se o etanol e retomou-se o resíduo em éter e HCl a 10%. Separou-se a camada etérea, lavou-se uma vez com HCl a 10%, secou-se sobre sulfato de sódio e evaporou-se para se obter 1,4 g da O-metil-oxima. 70

A uma suspensão de 0,87 g (23,1 mmol) de boro-hidreto de sódio em 5 mL de THF adicionou-se 1,35 g (5,8 mmol) de tetracloreto de zircónio e agitou-se a solução durante 15 minutos, seguindo-se a adição de mais 5 mL de THF. Em seguida, juntou-se 1,4 g (4,6 mmol) da O-metil-oxima em 5 mL de THF e agitou-se a mistura de um dia para o outro. Removeu-se o THF por evaporação sob vácuo e tratou-se o resíduo com hidróxido de sódio a 10%. Quando deixou de borbulhar, acrescentou-se éter e as camadas foram separadas. Extraiu-se a camada aquosa 4 vezes com éter e secou-se sobre sulfato de sódio os extractos etéreos combinados. Evaporou-se o éter para se obter 1,25 g do Composto 38.

A 1. MeMgBr

F 1. H2N-Ome, piridina 2. NaBH4/ZrCl4

B F

NH2 Composto 38 71 Ο Composto 32 e os Compostos 39 a 53 foram sintetizados de acordo com procedimentos convencionais, conforme descrito supra.

Exemplo 9. Propriedades biológicas de aril-alquilaminas sintetizadas Os compostos sintetizados tal como descrito no Exemplo 29 foram submetidos a ensaios para pesquisa de diversas propriedades biológicas, as quais estão resumidas nos exemplos. QUADRO 1

Composto CI50 (μΜ) face a NMDAa CI50 (μΜ) face a [3H]MK-801C Composto 19 0,407 (7) 2, 4 83) Composto 20 0, 058 (6) 0, 426 (3) Composto 21 0,029 (2) 0, 602 (1) 0, 038 (5)e 0, 380 (l)e 0,468 (3)e 4,1 (l)e Composto 22 0,136 (4) 1/2 (1) Composto 23 0,267 (3) 5,4 (1) Composto 24 0,190 (1) 0,724 81) Composto 25 0,245 (1) 1,4 81) Composto 26 42 (1) 34 (1) Composto 27 0,071 (1) 0,275 (1) Composto 28 0,380 (1) 2,7 (1) Composto 29 1/9 (2) 6,2 81) Composto 30 0,208 (2) 1,6 81) Composto 31 0,039 (4) 1/7 (1) Composto 32 não testado não testado Composto 33 não testado não testado Composto 34 não testado não testado Composto 35 6,2 (1) 25,1 (1) Composto 36 não testado não testado Composto 37 0,944 (2) 3,8 (1) Composto 38 0,468 (1) 2,8 (1) Composto 39 não testado não testado Composto 40 não testado não testado 72 Γ L-^ ^ QUADRO 1 (cont.)

Composto CI50 (μΜ) face a NMDAa CI50 (μΜ) face a [3H]MK-801C Composto 41 0, 724 (1) 12,6 (1) Composto 42 não testado não testado Composto 43 não testado não testado Composto 44 não testado não testado Composto 45 não testado não testado Composto 46 não testado não testado Composto 47 não testado não testado Composto 48 não testado não testado Composto 49 não testado não testado Composto 50 não testado não testado Composto 51 não testado não testado Composto 52 não testado não testado Composto 53 não testado não testado a Inibição dos aumentos do cálcio intracelular induzidos por

NMDA/glicina em culturas de células de grânulos de cerebelo de ratos (CGCR) (ver o Exemplo 1) . O número que aparece entre parêntesis indica o número de experiências. b Sal de ATF c Inibição da fixação de [3H]MK-801 em preparações de membrana lavada cortical/de hipocampo de ratos (ver o exemplo 4). d Estudo de CI50 incompleto; percentagem (%) de inibição para a concentração indicada e Diastereoisómeros do Composto 21 (Compostos 33 e 34), cuja estereoquímica não foi determinada neste momento.

As aril-alquilaminas simplificadas exemplificadas pelos compostos 19 a 53 ligam-se ao local marcado com [3H]MK-801, em concentrações 1 a 50 vezes mais elevadas do que as antagonizam a função mediada pelo receptor NMDA, no ensaio das células de grânulos de cerebelo de ratos. 73

V

QUADRO 2

Composto Supressão da transmissão sináptica mediada pelo receptor NMDAa Ensaio de PLP° Queda da pressão sanguínea arterial média0 Composto 19 100 - 300 μΜ bloqueio a 100 μΜ não testado Composto 20 30 - 300 μΜ bloqueio a 100 μΜ sem efeito para doses até cerca de 15 μιηοΐ/kg i.v. Composto 22 não testado não testado sem efeito para doses até cerca de 15 μιηοΐ/kg i.v. a Concentração que suprime a transmissão sináptica mediada pelo receptor NMDA (ver o Exemplo 5). b Concentração que não bloqueia a indução da PLP (ver o Exemplo 19). c Queda da pressão sanguínea sistémica produzida pela administração do composto a ratos (ver o Exemplo 22).

As propriedades vantajosas dos compostos aril-alquilamínicos da presente invenção são ilustradas pelo facto de as concentrações que suprimem a transmissão sináptica mediada pelo receptor NMDA fracassarem na inibição da PLP.

Formulação e administração

Conforme evidenciado na presente memória descritiva, os compostos úteis da presente invenção e os seus sais farmaceuticamente aceitáveis podem ser utilizados para o tratamento de perturbações ou doenças farmacológicas. Embora estes compostos seja utilizados tipicamente para o tratamento terapêutico de seres humanos, também podem é possível utilizá-los para tratar doenças semelhantes ou idênticas noutros vertebrados, tais como outros primatas, animais de criação, tais como veados, gado vacum e aves de capoeira, assim como animais para desporto e animais domésticos, tais como cavalos, cães e gatos.

Para aplicações terapêuticas e/ou de diagnóstico, os compostos da invenção podem ser formulados para diversos modos de administração, incluindo a administração sistémica e tópica ou localizada. As técnicas e as formulações genéricas podem encontrar-se na obra “Remoington’s Pharmaceutical Sciences”, Mark Publishing Co., Easton, PA. 74

V

L-Cj A formulação exacta, a via de administração e a dosagem podem ser determinadas por cada médico assistente, em função do estado do paciente (ver, por exemplo, Fingi et al. em “The Pharmacological Basis of Therapeutics”, 1975, Com o aspecto de. 1, pág. 1).

Faz-se observar que o médico assistente do paciente deverá saber como e quando terminar, interromper ou ajustar a administração, devido à toxicidade ou à disfunção de um órgão. Por outro lado, o referido médico também deverá saber como ajustar o tratamento para niveis mais elevados no caso de as respostas clinicas não serem adequadas (excluindo a toxicidade). A quantidade de uma dose administrada para lidar com a doença oncogénica relevante, irá variar em função da gravidade da afecção que se pretende tratar e da via de administração. A gravidade da afecção pode ser avaliada em parte, por exemplo, por métodos convencionais de avaliação do prognóstico. Assim, a dose e eventualmente a frequência da dose irão variar também em função da idade, do peso corporal e da resposta de cada paciente. É possível utilizar um regime idêntico ao descrito supra em medicina veterinária.

Dependendo das afecções específicas que se pretendem tratar, os agentes da invenção podem ser formulados e administrados sistémica ou localmente. As técnicas para a formulação e administração podem ser encontradas em “Remoington’s Pharmaceutical Sciences”, Mark Publishing Co., Easton, PA. As vias adequadas de administração podem compreender as seleccionadas entre oral, rectal, transdérmica, vaginal, através das mucosas ou intestinal; a administração parentérica, incluindo a injecção intramuscular, subcutânea, intramedular e bem assim a injecção intratecal, intraventricular directa, intravenosa, intraperitoneal, intranasal ou intraocular, para referir apenas algumas delas.

Para a injecção os agentes da invenção podem ser formulados em soluções aquosas, de preferência em tampões fisiologicamente compatíveis, tais como a solução de Hank, a solução de Ringer ou o tampão de soluto salino fisiológico. Para a administração através das mucosas, referida antes, são utilizados na formulação agentes “penetradores” adequados à barreira que se pretende atravessar. Tais agentes penetradores são genericamente conhecidos na especialidade. 75

I . I-

ΐ A utilização de veículos farmaceuticamente aceitáveis, para formular os compostos aqui descritos para a prática da invenção, em dosagens adequadas para a administração sistémica, estão abrangidos no âmbito da invenção. Com uma selecção adequada do veículo e uma prática de fabrico adequada, as composições da presente invenção, em particular as que são formuladas como soluções, podem ser administradas por via parentérica, incluindo a injecção intravenosa. Os compostos podem ser facilmente formulados utilizando veículos farmaceuticamente aceitáveis e bem conhecidos na especialidade em dosagens adequadas para administração oral. Tais veículos possibilitam a formulação dos compostos da invenção em comprimidos, pílulas, cápsulas, líquidos, geles, xaropes, loções, suspensões e não só, para ingestão oral por parte de um paciente que se pretenda tratar.

Os agentes concebidos para administração intracelular podem ser administrados recorrendo a procedimentos bem conhecidos pelos especialistas na matéria. Por exemplo, tais agentes podem ser encapsulados em lipossomas e depois administrados conforme descrito antes. Os lipossomas são bicamadas esféricas de lípidos com conteúdos internos aquosos. Todas as moléculas presentes numa solução aquosa no momento da formação do lipossoma são incorporadas no conteúdo interno aquoso. 0 conteúdo dos lipossomas está protegido do “micromeio” externo e por tal motivo, uma vez que os lipossomas se fundem com as membranas das células, efectua-se a administração ao citoplasma celular. Além disso, devido ao seu carácter hidrófobo, as pequenas moléculas orgânicas podem ser administradas intracelularmente de modo directo.

As composições farmacêuticas adequadas para utilização na presente invenção compreendem as composições que incorporem os ingredientes activos numa quantidade eficaz para se atingir o objectivo pretendido. A determinação das quantidades eficazes está perfeitamente ao alcance dos especialistas na matéria, especialmente à luz da descrição minuciosa proporcionada pela presente memória descritiva.

Para além dos ingredientes activos, tais composições farmacêuticas podem conter veículos adequados farmaceuticamente aceitáveis, os quais compreendem excipientes e produtos auxiliares que facilitam o 76

processamento dos compostos activos, por forma a obter-se preparações farmaceuticamente utilizáveis. As preparações formuladas para administração oral podem assumir a forma de comprimidos, drageias, cápsulas ou soluções.

As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser produzidas de uma forma conhecida per si, por exemplo, recorrendo a procedimentos convencionais de mistura, dissolução, granulação, preparação de drageias, lixiviação, emulsificação, encapsulação, captura ou liofilização.

As formulações farmacêuticas para administração parentérica compreendem as soluções aquosas dos compostos activos, numa forma solúvel em água. Além disso, é possível preparar suspensões dos compostos activos, sob a forma de uma suspensão em óleo adequada para injecção. Como solventes ou veículos lipofílicos adequados refere-se os óleos gordos, tais como o óleo de sésamo, ou os ésteres sintéticos de óleos gordos, tais como o oleato de etilo ou os triglicéridos, ou os lipossomas. As suspensões aquosas para injecção podem conter substâncias que aumentam a viscosidade da suspensão, tais como a carboximetil-celulose de sódio, o sorbitol ou o dextrano. Facultativamente, a suspensão também pode conter agentes estabilizadores ou agentes adequados para aumentar a solubilidade dos compostos, possibilitando a preparação de soluções muito concentradas.

As preparações farmacêuticas para utilização oral podem ser obtidas combinando os compostos activos com excipientes sólidos, triturando facultativamente a mistura resultante e processando a mistura de grânulos depois de se adicionar os produtos auxiliares adequados, se desejado, para se obter comprimidos ou núcleos de drageias. Como excipientes particulares adequados refere-se as cargas, tais como açúcares, incluindo os seleccionados entre lactose, sacarose, manitol ou sorbitol; preparações de celulose, por exemplo, amido de milho, amido de trigo, amido de arroz, amido de batata, gelatina, goma de alcatira, metil-celulose, hidroxipropil--metil-celulose, carboximetil-celulose de sódio e/ou poli(vinil--pirrolidona) (PVP). Se desejado, é possível acrescentar agentes desintegradores, tais como a poli(vinil-pirrolidona) reticulada, 77 gelose ou ácido algínico ou um dos seus sais, tal como o alginato de sódio.

Os núcleos de drageias são administrados com revestimentos adequados. Para tal é possível utilizar soluções concentradas de açúcar que podem conter facultativamente goma arábica, talco, poli-(vinil-pirrolidona), gel de carbopol, polietileno-glicol e/ou dióxido de titânio, soluções para lacar e solventes orgânicos adequados ou misturas de solventes. É possível adicionar corantes ou pigmentos aos revestimentos dos comprimidos ou das drageias, para os identificar ou para caracterizar diferentes combinações de doses de compostos activos.

As preparações farmacêuticas utilizáveis por via oral compreendem cápsulas de ajuste rígidas, feitas de gelatina, assim como cápsulas moles, fechadas estanquemente e feitas de gelatina, e um plastificante, tal como o glicerol ou o looseness sorbitol. As cápsulas de ajuste rígidas podem conter os ingredientes activos misturados com uma carga, tal como a lactose, agentes aglomeradores, tais como amidos, e/ou agentes lubrificantes, tais como o talco ou o estearato de magnésio, e facultativamente agentes estabilizadores. Nas cápsulas moles os compostos activos podem estar em solução ou suspensão em líquidos adequados, tais como óleos gordos, parafina líquida ou polietileno-glicóis líquidos. Além disso, é possível acrescentar agentes estabilizadores.

Outras variantes da invenção estão abrangidas pelas reivindicações em anexo.

Lisboa, 26 de Julho de 2001 O AGENTE OFICIAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAI,

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Claims

r

REIVINDICAÇÕES 1. Composto que possui a estrutura seguinte, com excepção dos compostos 3,3-difenil-propilamina, 3-(3-metil-fenil)-3-fenil--propilamina, N-terc-butil-l-metil-3, 3-difenil-propilamina, N--metil-3,3-difenil-propilamina, N-isopropil-3,3-difenil-propilamina, N-(3-metil-2-butil)-3,3-difenil-propilamina,

em que cada X pode representar independentemente um ou vários H, Br, Cl, F, alquilo inferior e/ou OCH3, cada R1 pode representar independentemente H, alquilo inferior, OH, O-alquilo ou O-acilo e cada R2 pode representar independentemente H ou alquilo inferior; ou então X

μ-" R NR^-R2 em que cada X pode representar independentemente um ou vários H, Br, Cl, F, alquilo inferior e/ou OCH3, cada R1 pode representar independentemente H, alquilo inferior, OH, O-alquilo ou O-acilo e cada R2 pode representar independentemente H ou alquilo inferior; ou então

(CH2)n S. / 1 X t r em que η = 1 a 6, cada X pode representar independentemente um ou vários H, Br, Cl, F, alquilo inferior e/ou OCH3, cada R1 pode representar independentemente H, alquilo inferior, OH, O-alquilo ou O-acilo e cada R1 pode representar independentemente H ou alquilo inferior; ou então

em que η = 1 a 6, cada X pode representar independentemente um ou vários H, Br, Cl, F, alquilo inferior e/ou 0CH3, cada R1 pode representar independentemente H, alquilo inferior, OH, 0--alquilo ou O-acilo e cada R1 pode representar independentemente H ou alquilo inferior; ou um dos seus sais farmaceuticamente aceitáveis, com excepção do Composto 20 (3,3-bis(3-fluorofenil)--propilamina).
2 1 Composto de acordo com a reivindicação 1, o qual é: f L-Ci

nh3ci Composto 26
3. Composição farmacêutica que incorpora um composto de acordo com a reivindicação 1 ou 2, ou um dos seus sais farmaceuticamente aceitáveis, facultativamente em combinação com um veiculo farmaceuticamente aceitável.

3 Γ t

NH3C1

NH3CI Composto 36

NH-

NH,

Composto 40

Γ u

Composto 53 ou um dos seus sais farmaceuticamente aceitáveis.
4. Utilização de um composto que satisfaz à fórmula estrutural seguinte:

NHR2 em que cada X pode representar independentemente um ou vários H, Br, Cl, F, alquilo inferior e/ou OCH3, cada R1 pode representar independentemente H, alquilo inferior, OH, O-alquilo ou O-acilo 6

e cada R2 pode representar independentemente H ou alquilo inferior; ou então R1

em que cada X pode representar independentemente um ou vários H, Br, Cl, F, alquilo inferior e/ou OCH3, cada R1 pode representar independentemente H, alquilo inferior, OH, O-alquilo ou O-acilo e cada R2 pode representar independentemente H ou alquilo inferior; ou então

em que η = 1 a 6, cada X pode representar independentemente um ou vários H, Br, Cl, F, alquilo inferior e/ou OCH3, cada R1 pode representar independentemente H, alquilo inferior, OH, O-alquilo ou O-acilo e cada R2 pode representar independentemente H ou alquilo inferior; ou então

em que η = 1 a 6, cada X pode representar independentemente um ou vários H, Br, Cl, F, alquilo inferior e/ou OCH3, cada R1 pode representar independentemente H, alquilo inferior, OH, O-alquilo ou O-acilo e cada R2 pode representar independentemente H ou 7

alquilo inferior, ou um dos seus sais farmaceuticamente aceitáveis, para a preparação de uma composição farmacêutica activa num receptor NMDA, desde que o composto não seja a terodilina (N--terc-butil-l-metil-3,3-difenil-propilamina).
5. Utilização de acordo com a reivindicação 4, em que o composto é:

NH,

NH,

NH, Composto 21

8 F Composto 25 PV Composto 29

NH3C1

Composto 26

NH3CI

9 r : u

NH,

NH-

CH,

NH3C1 Composto 36

NH-

CH„ 10

11 I

ou um dos seus sais farmaceuticamente aceitáveis.
6. Utilização de acordo com a reivindicação 4 ou 5, em que a composição farmacêutica é utilizável para o tratamento de perturbações ou doenças neurológicas.
7. Utilização de acordo com a reivindicação 6, em que a perturbação ou doença neurológica é seleccionada entre a apoplexia isquémica ou hemorrágica, global ou focal, o traumatismo cerebral, a lesão da medula espinal, a lesão das células nervosas induzida por hipoxia, a epilepsia, a ansiedade ou uma doença neurodegenerativa.
8. Utilização de acordo com a reivindicação 7, em que a doença neurodegenerativa é a doença de Alzheimer, a doença de Huntington ou a doença de Parkinson. Lisboa, 26 de Julho de 2001 0 AGENTE OFICIAL Da PROPRIEDADE INDUSTRIAL

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