PT713529E - Factor de crescimento/diferenciacao da familia tgf-beta - Google Patents

Description

"Factor de crescimento/diferenciação da família TGF-β" O presente invento refere-se a um novo factor de crescimento/ diferenciação da família TGF-β e a sequências de ADN que o codificam. A família TGF-β de factores de crescimento, à qual pertencem proteínas aparentadas com BMP, TGF e inibina (Roberts e Sporn, Handbook of Experimental Pharmacology 95 (1990), 419-472) é particularmente relevante para uma vasta área de métodos de tratamento e aplicações médicas. Estes factores são apropriados em processos que se referem à cicatrização e reconstituição de tecidos. Além disso, vários membros da família TGF-β induzem o crescimento de tecidos, especialmente o crescimento dos ossos e desempenham, por isso, um papel central na indução do desenvolvimento de cartilagens e ossos.

Wozney (Progress in Groth Factor Research 1 (1989), 267-280), e Vale et a/. (Handbook of Experimental Pharmacology 95 (1990), 211-248) descrevem factores de crescimento diferentes como, por exemplo, os que são aparentados com o grupo BMP (proteínas osteomorfogenéticas) e com o da inibina. Os membros destes grupos apresentam semelhanças estruturais significativas. O precursor da proteína consiste numa sequência de sinal aminoterminal, numa sequência propeptídica e numa sequência carboxiterminal de cerca de 110 aminoácidos, que é separada do precursor e representa a proteína madura. Além disso, os seus membros estão definidos por uma homologia de sequências de aminoácidos. A proteína madura contém as sequências mais bem conservadas, especialmente sete resíduos de cisteína, que são conservados entre os membros da família. As proteínas do tipo TGF-β são factores de crescimento multifuncionais e hormonalmente activas. Apresentam também actividades biológicas afins como, por exemplo, atracção quimiotrópica de células, estimulação da diferenciação das células e capacidade de indução de tecidos como, por exemplo, capacidade de indução de cartilagens e ossos. A patente número US 5,013,649 revela sequências de ADN que codificam proteínas osteoindutoras, designadas por BMP-2, e os pedidos de patente norte-americanos com os números de série de 179 101 e 170 197 revelam as 83 816 ΕΡ Ο 713 529/ΡΤ 2

proteínas ΒΜΡ-1 e ΒΜΡ-3. Em W090/11366 descrevem-se as proteínas osteoindutoras BMP-5, BMP-6 e BMP-7. Estas proteínas podem ser utilizadas não apenas para o tratamento de defeitos dos ossos e das cartilagens como também para o tratamento vulnerário. Além disso, muitos tipos de células são capazes de sintetizar proteínas do tipo TGF-β, e praticamente todas as células possuem receptores de TGF-β.

Resumidamente, estas proteínas apresentam diferenças na sua estrutura, o que resulta em variações consideráveis na sua função biológica específica. Além disso, são encontradas num vasto domínio de diferentes tipos de tecido e fases de desenvolvimento. Em consequência disso, podem apresentar diferenças no que se refere à sua função específica, p. ex. ao ambiente fisiológico celular necessário, à sua duração de vida, aos locais a que se destinam, aos seus requisitos em relação a factores auxiliares e à sua resistência à degradação. Portanto, embora sejam descritas numerosas proteínas que apresentam um potencial indutor de tecidos, especialmente osteoindutor, falta ainda pesquisar pormenorizadamente as suas funções naturais no organismo e - o que é ainda mais importante - a sua relevância para a medicina. Pensa-se ser muito provável existirem membros ainda desconhecidos da família TGF-β importantes para a osteogénese ou a diferenciação/ indução de outros tipos de tecidos. Uma grande dificuldade no isolamento destas novas proteínas do tipo TGF-β, no entanto, consiste no facto das suas funções ainda não poderem ser descritas com a precisão necessária para a concepção de um bioensaio (bioassay) com boa capacidade distintiva. Por outro lado, a homologia presumível das sequências nucleotídicas em relação a membros da família que já se conhecem é demasiado pequena para possibilitar um screening (uma pesquisa) através de técnicas clássicas de hibridação de ácidos nucleicos. Apesar disso, urge continuar com o isolamento e caracterização de novas proteínas do tipo TGF-β, para proporcionar outras proteínas de indução e diferenciação que cumpram todos os requisitos médicos desejados. Estes factores poderiam encontrar uma aplicação médica na cura de lesões e no tratamento de doenças degenerativas dos ossos e/ou de outros tipos de tecido como, p. ex., do rim ou do fígado.

No pedido de patente W093/16099 está indicada uma sequência nucleotídica e de aminoácidos para a proteína de TGF-β MP-52, estando

83 816 ΕΡ Ο 713 529/ΡΤ 3 indicada a sequência que corresponde ao péptido maduro e uma grande parte da sequência que corresponde ao propéptido de MP-52. A sequência completa do propéptido de MP-52 não é revelada. 0 problema em que o presente invento assenta consiste em proporcionar sequências de ADN que codificam novos membros da família TGF-β com potencial mitogénico e/ou indutor de diferenciação, p. ex. osteoindutor. 0 problema a resolver pelo presente invento consiste, especialmente, em proporcionar a sequência completa de ADN e de aminoácidos da proteína de TGF-β MP-52.

Este problema é resolvido através de uma molécula de ADN que codifica uma proteína da família TGF-β e que consiste numa das sequências de ADN seguintes: a) nucleótidos 1783 - 2142 ou 640 a 2142 de SEQ ID NO. 1, b) uma sequência nucleotídica que corresponde à sequência de a), nos limites da degeneração do código genético, c) uma sequência nucleotídica que corresponde a um derivado alélico de uma das sequências de a) e b), ou d) uma sequência nucleotídica que hibrida, sob condições de hibridação rigorosas, com uma das sequências de a), b) ou c), com a condição de uma molécula de ADN de acordo com d) conter, pelo menos, a parte que codifica uma proteína madura da família TGF-β por completo, e de a sequência nucleotídica não ser totalmente complementar a SEQ ID NO. 1.

Outras concretizações do presente invento referem-se ao objecto das reivindicações 2 a 12. Outras características e vantagens do invento constam da descrição das concretizações preferidas e também dos desenho. Iremos descrever, a seguir, sucintamente os protocolos de sequências e desenhos. SEQ ID NO. 1 mostra a sequência nucleotídica completa do ADN codificador da proteína de TGF-β MP-52. O codão de iniciação ATG começa no nucleótido 640. O início da proteína madura começa a seguir ao nucleótido 1782. SEQ ID NO. 2 mostra a sequência completa de aminoácidos da proteína

83 816 ΕΡ Ο 713 529/ΡΤ 4 de TGF-β ΜΡ-52, sequência essa derivada da sequência nucleotídica mostrada em SEQ ID NO. 1. A figura 1 mostra uma comparação da sequência de aminoácidos de MP-52 com a de alguns membros da família de proteínas BMP, começando no primeiro dos sete resíduos de cisteína conservados. * significa que o aminoácido é igual em todas as proteínas comparadas; + significa que o aminoácido é igual a MP-52, pelo menos, numa das proteínas em comparação. A figura 2 mostra as sequências nucleotídicas dos iniciadores oligonucleotídicos que se utilizaram no presente invento, e uma comparação destas sequências com membros da família TGF-β que se conhecem. M significa A ou C, S significa C ou G, R significa A ou G e K significa G ou T. 2a mostra a sequência do iniciador OD, 2b mostra a sequência do iniciador OID. O presente invento compreende, pelo menos, a parte que codifica a proteína madura e, eventualmente, outras partes funcionais da sequência nucleotídica mostrada em SEQ ID NO. 1, assim como sequências que correspondem a esta sequência nos limites da degeneração do código genético, e derivados alélicos de sequências deste género. Além disso, o presente invento compreende também sequências que hibridam com sequências deste género, sob a condição de que, pelo menos, uma molécula de ADN deste género compreenda na totalidade a parte que codifica uma proteína madura da família TGF-β. O termo "parte funcional", no sentido do presente invento, significa uma parte proteica capaz de actuar, p. ex., como péptido de sinal, propéptido ou parte proteica madura, isto é, de cumprir, pelo menos, uma das funções biológicas das partes proteicas nativas de MP-52. O domínio codificador da parte madura da proteína estende-se dos nucleótidos 1783 a 2142 da sequência mostrada em SEQ ID NO. 1. Eventualmente, a molécula de ADN pode compreender ainda outras partes funcionais da sequência mostrada em SEQ ID NO. 1, a saber as sequências nucleotídicas codificadoras da parte do péptido de sinal e/ou propeptídica. Prefere-se particularmente que a molécula de ADN compreenda a sequência

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para a parte de péptido de sinal e propeptídica e a parte da proteína madura, isto é, os nucleótidos 640-2142 da sequência mostrada em SEQ ID NO. 1. Por outro lado é também possível que a molécula de ADN compreenda, além da parte codificadora da proteína madura, ainda partes funcionais de sinalização e/ou propeptídicas de outras proteínas, especialmente de outras proteínas da família TGF-β, p. ex. das proteínas BMP mencionadas anteriormente. As respectivas sequências nucleotídicas constam das referências mencionadas anteriormente, à revelação das quais nos referimos aqui.

Além disso o presente invento compreende também uma molécula de ADN como a que foi definida anteriormente, que contém adicionalmente, entre os nucleótidos 1270 e 1271 da sequência mostrada em SEQ ID NO. 1, uma sequência de intrão não codificadora. Esta sequência de intrão está contida no plasmídeo SKL 52(H3)MP12, depositado na DSM, o qual apresenta a sequência genómica de ácido nucleico de MP-52. O invento compreende também a sequência de ADNc codificada pelo fago λ 15.1, da proteína MP-52. Esta sequência começa com o nucleótido 321 de SEQ ID NO. 1.

Apesar das sequências alélicas, degeneradas e hibridadas que o presente invento compreende apresentarem diferenças estruturais, devido a pequenas alterações na sequência nucleotídica e/ou de aminoácidos, as proteínas codificadas por sequências deste género continuam, essencialmente, a possuir as mesmas características úteis que tornam possível a sua utilização nas, em princípio iguais, aplicações médicas.

De acordo com o presente invento, a designação "hibridação" significa condições de hibridação usuais, de preferência condições com uma concentração salina de 6 x SSC de 62 a 66°C, seguida por uma lavagem de uma hora com 0,6 x SSC, SDS a 0,1% de 62 a 66°C, preferindo-se particularmente que a designação "hibridação" se refira a condições de hibridação rigorosas com uma concentração salina de 4 x SSC de 62 a 66°C, seguida por uma lavagem de uma hora com 0,1 x SSC, SDS a 0,1% de 62 a 66°C.

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As concretizações preferidas do presente invento são sequências de ADN, como as definidas anteriormente, que podem ser obtidas de vertebrados, de preferência de mamíferos, como por exemplo, porcos, vacas e roedores como, por exemplo, ratos ou ratinhos, e, especialmente de primatas como por exemplo, de humanos.

Uma concretização particularmente preferida do presente invento é a sequência mostrada em SEQ ID NO. 1 e designada por MP-52. Os transcritos de MP-52 foram obtidos de tecido embrionário e codificam uma proteína que apresenta uma homologia considerável de aminoácidos em relação à parte madura das proteínas do tipo BMP (veja-se a figura 1). As sequências proteicas de BMP2 (= BMP2A) e BMP4 (= BMP2B) estão descritas em Wozney et a!., Science 242 (1988), 1528-1534. As sequências correspondentes de BMP5, BMP6 e BMP7 estão descritas em Celeste et a!., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87 (1990), 9843-9847. Foram também encontradas algumas homologias de sequências típicas, específicas de sequências de BMP conhecidas, na parte propeptídica de MP-52, enquanto que outras partes da parte do precursor de MP-52 apresentam diferenças consideráveis em relação aos precursores de BMP.

Um outro objecto do presente invento é um vector contendo, pelo menos, uma cópia de uma molécula de ADN de acordo com o invento. Num vector deste género, a sequência de ADN de acordo com o invento está ligada, de preferência operativamente ligada, a uma sequência de controlo da expressão. Vectores deste género são apropriados para a produção de proteínas do tipo TGF-β em células transformadas de forma estável ou transiente. Podem utilizar-se diferentes sistemas animais, vegetais, de fungos ou bacterianos para a transformação e o cultivo subsequente. De preferência, os vectores de acordo com o invento contêm sequências necessárias para a replicação na célula hospedeira e são replicáveis de forma autónoma. Além disso prefere-se a utilização de vectores contendo genes marcadores seleccionáveis, pelo que a transformação de uma célula hospedeira possa ser comprovada.

Um outro objecto do invento é uma célula hospedeira transformada com um ADN de acordo com o invento ou com um vector de acordo com o invento. Exemplos de células hospedeiras apropriadas compreendem células eucarióticas

83 816 ΕΡ Ο 713 529/ΡΤ 7 e procarióticas diferentes como, p. ex., E.coli, células de insectos, células vegetais, células de mamíferos e fungos como, por exemplo, levedura.

Um outro objecto do invento é uma proteína da família TGF-β codificada por uma sequência de ADN de acordo com a reivindicação 1. De preferência, a proteína de acordo com o invento apresenta a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO. 2 ou, eventualmente, partes funcionais da mesma, e apresenta características biológicas como, por exemplo, capacidades indutoras de tecidos, especialmente osteoindutoras e/ou mitogénicas, possivelmente relevantes para uma utilização terapêutica. As características da proteína mencionadas anteriormente podem variar em função da formação de homodímeros e heterodímeros. Estruturas deste género podem revelar-se também como sendo apropriadas para aplicações clínicas.

As características biológicas das proteínas de acordo com o invento, especialmente o potencial mitogénico e osteoindutor, podem ser determinadas, p. ex., em ensaios de acordo com Seyedin et a/., PNAS 82 (1985), 2267-2271 ou Sampath e Reddi, PNAS 78 (1981), 7599-7603.

Um outro objecto do presente invento é um processo para a fabricação de uma proteína da família TGF-β, caracterizado por se cultivar uma célula hospedeira transformada com um ADN de acordo com o invento ou um vector de acordo com o invento, e por se obter a proteína de TGF-β a partir de células e/ou do sobrenadante de culturas. Um processo deste género compreende a cultura da célula hospedeira transformada num meio de cultura apropriado e a purificação da proteína do tipo TGF-β produzida. Desta maneira, o processo torna possível produzir uma quantidade suficiente da proteína procurada, para utilização num tratamento médico ou em aplicações com utilização de técnicas de cultura celular em que se precisam de factores de crescimento. A célula hospedeira pode ser uma bactéria como, por exemplo, BaciUus ou E.coli, um fungo como, por exemplo, levedura, uma célula vegetal como, por exemplo, tabaco, batata ou Arabidopsis, ou uma célula animal, especialmente uma linha celular de um vertebrado como, por exemplo, linhas celulares Mo, COS ou CHO, ou uma linha celular de insecto.

Um objecto adicional do presente invento consiste em proporcionar 8 83 816 ΕΡ Ο 713 529/ΡΤ preparações farmacêuticas contendo uma quantidade farmaceuticamente eficaz de uma proteína do tipo TGF-β de acordo com o invento, como substância activa. Se for necessário, uma preparação deste género compreende uma substância transportadora, adjuvante, de diluição ou de enchimento, farmaceuticamente aceitável. Uma preparação farmacêutica deste género pode ser utilizada como medicamento vulnerário e para a reconstituição de tecidos, assim como na cura de lesões dos ossos, de cartilagens, do tecido conjuntivo, da pele, das mucosas, do epitélio ou dos dentes, e em caso de implantes dentários, sozinho ou em combinação com outras substâncias activas, p. ex. com outras proteínas da família TGF-β ou factores de crescimento como, por exemplo, EGF (epidermal growth factor), ou PDGF {plate/et derived growth factor). Além disso é possível utilizar uma preparação farmacêutica deste género na prevenção de doenças como, p. ex., para a prevenção de osteoporose e artrose.

Uma outra aplicação clínica possível da proteína do tipo TGF-β de acordo com o invento, consiste na sua utilização como supressor da reacção imunitária para evitar a rejeição de órgãos implantados, ou uma utilização relacionada com a angiogénese. A preparação farmacêutica de acordo com o invento pode também ser utilizada para profilaxia ou na cirurgia cosmética. Além disso, a utilização da preparação não fica limitada aos humanos, mas pode estender-se também a animais, especialmente animais domésticos.

Um outro objecto do presente invento é, finalmente, um anticorpo capaz de se ligar de modo específico às proteínas de acordo com o invento, ou um fragmento de anticorpo deste género (p. ex. Fab ou Fab'). Processos para a fabricação de um anticorpo ou fragmento de anticorpo específicos deste género fazem parte dos conhecimentos profissionais gerais de um perito médio. Um anticorpo deste género é, de preferência, um anticorpo monoclonal. Os anticorpos ou fragmentos de anticorpos deste género podem também ser apropriados para métodos diagnósticos. O invento pormenorizar-se-á ainda mais através do exemplo seguinte.

83 816 ΕΡ Ο 713 529/ΡΤ Exemplo 1

Isolamento de ΜΡ-52 1.1

Isolou-se ARN completo de tecido embrionário humano (com 8 a 9 semanas) de acordo com o método de Chirgwin et ai, Biochemistry 18 (1979), 5294-5299. Do ARN completo foi separado poli(A + )-ARN através de cromatografia com Oligo-(dT), de acordo com as instruções do fabricante (colunas Stratagene Poly(A) Quick). 1.2

Para a reacção de transcrição inversa foram aquecidos 1 a 2,5 pg de poli(A + )-ARN durante 5 minutos a 65°C e arrefecidos rapidamente sobre gelo. A mistura reaccional continha 27 U de RNA-Guard (Pharmacia), 2,5 pg de Oligo-(dT) 12-18 (Pharmacia), 5 x tampão (Tris/HCI 250 mmol/l, pH 8,5, MgCh 50 mmol/l, DTT 50 mmol/l, 5 mmol/l de cada dNTP, KCI 600 mmol/l) e 20 U de Transcriptase Inversa AMV (Boehringer Mannheim) por pg de poli(A+ )-ARN. A mistura reaccional (25 μ!) foi incubada durante 2 horas a 42°C. 1.3

Os iniciadores desoxinucleotídicos OD e OID mostrados na figura 2 foram produzidos num sintetizador de ADN automático (Biosearch). A purificação foi realizada através de electroforese desnaturante sobre gel de poliacrilamida e isolamento da banda principal a partir do gel através de isotacoforese. Os oligonucleótidos foram concebidos através da comparação das sequências de ácidos nucleicos de membros da família TGF-β que se conhecem e selecção de regiões com a melhor conservação. A figura 2 mostra uma comparação desta região. Para tornar a clonagem mais fácil, ambos os nucleótidos continham locais de restrição EcoRI e OD continha, além disso, um local de restrição Ncol no seu terminal 5'. 1.4

Na reacção PCR utilizou-se ADNc como material de partida correspondente a 20 ng de poli(A + )-ARN. A reacção foi realizada num volume de 50 pl e continha 1 x tampão de PCR ((NH4>2S04 16,6 mmol/l, Tris/HCI 83 816 ΕΡ Ο 713 529/ΡΤ 10

67 mmol/l, ρΗ 8,8, MgCL· 2 mmol/l, EDTA 6,7 μιτιοΙ/Ι, β-mercaptoetanol 10 mmol/l, albumina de soro de bovino (Gibco) 170 pg/ml, 200 pmol/l de cada dNTP (Pharmacia), 30 pmol de cada oligonucleótido (OD e OID) e 1,5 U de Taq-polimerase (AmpliTaq, Perkin Elmer Cetus). A mistura reaccional foi coberta com uma camada de parafina e foram realizados 40 ciclos de PCR. Os produtos da reacção PCR foram purificados através de extracção com fenol/ clorofórmio e concentrados por precipitação com etanol. 1.5 O produto da reacção PCR foi cortado com as enzimas de restrição Sphl (Pharmacia) e AlwNI (Biolabs) de acordo com as instruções do fabricante. 1.6

Os produtos da digestão de restrição foram fraccionados através de electroforese em gel de agarose. Após a coloração com brometo de etídio, os produtos de amplificação não cortados foram separados do gel e isolados através de extracção com fenol. O ADN obtido foi purificado a seguir duas vezes através de extracção com fenol/ clorofórmio. 1.7

Após uma precipitação com etanol foi de novo amplificado um quarto ou um quinto do ADN isolado, utilizando as mesmas condições que na primeira amplificação, com excepção de que se reduziu o número de ciclos para 13. Os produtos de desta nova amplificação foram purificados, cortados com as mesmas enzimas que anteriormente, e os produtos não cortados foram isolados a partir de geles de agarose, como se explicou anteriormente no que se refere aos produtos de amplificação. A etapa de nova amplificação repetiu-se duas vezes. 1.8

Após o último isolamento a partir do gel, os produtos de amplificação foram cortados com de 4 U de EcoRI (Pharmacia) sob as condições recomendadas pelo fabricante. Uma quarta parte da mistura de restrição foi ligada ao vector pBluescriptll SK+ (Stratagene) cortado com EcoRI. Após a ligação, continuou-se a analisando 24 clones através de sequenciação. A amostra cortada com AlwNI e Sphl originou uma nova sequência que foi 11 83 816

EPO 713 529/PT designada por MP-52. Os outros clones continham na sua maioria sequências de BMP6 e um continha uma sequência de BMP7. O clone foi completado, no terminal 3' do ADNc, de acordo com o método descrito pormenorizadamente por Frohmann (Amplifications, publicado por Perkin-Elmer Corp., Issue 5 (1990), pp. 11-15). 0 mesmo ARNm embrionário que tinha sido utilizado para o isolamento do primeiro fragmento de MP-52, foi transcrito por transcrição inversa da forma descrita anteriormente. A amplificação foi realizada utilizando o iniciador adaptador (AGAATTCGCATGCCATGGTCGACG) e um iniciador interno (CTTGAGTACGAGGCTTTCCACTG) da sequência de MP-52. Os produtos de amplificação foram novamente amplificados utilizando um iniciador adaptador apresentando sobreposição (ATTCGCATGCCATGGTCGACGAAG) e um iniciador interno apresentando sobreposição (GGAGCCCACGAATCATGCAGTCA) da sequência de MP-52. Após digestão de restrição com Ncol, os produtos da nova amplificação foram clonados num vector cortado da mesma maneira (pUC 19 (Pharmacia N° 27-4951--01) com um local de clonagem múltiplo alterado contendo um único local de restrição de Ncol, e foram sequenciados. Os clones foram caracterizados através da sua sobreposição de sequências no terminal 3' com a sequência de MP-52 já conhecida. Um deles foi utilizado como sonda para o screening de um banco de genómico humano (Stratagene N° 946203) de acordo com um método descrito pormenorizadamente em Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, publicado por Greene Publishing Associates e Wiley-lnterscience (1989)). De 8 x 105 fagos λ isolou-se um fago (λ 2.7.4) que continha uma inserção de cerca de 20 kb e que foi depositado na DSM com o número de depósito 7387. Este clone contém, além da sequência isolada de ARNm através dos métodos de amplificação descritos, ainda outras informações sobre a sequência no terminal 5'.

Para a análise da sequência foi sub-clonado um fragmento Hindlll, de cerca de 7,5 kb, num vector (Bluescript SK, Stratagene N° 212206) cortado da mesma maneira. Este plasmídeo designado por SKL 52 (H3) MP12 foi também depositado na DSM com o número de depósito 7353. A informação sobre a sequência apresentada em SEQ ID NO.1 é proveniente do fago λ 2.7.4. O ATG na posição 640 é o primeiro ATG dentro da estrutura de leitura (na posição 403

83 816 ΕΡ Ο 713 529/ΡΤ 12 aparece um códão de terminação). Os dados sobre a sequência levam à suposição de se tratar neste caso do códão de iniciação para a tradução. 0 ADN genómico contém um intrão de cerca de 2 kb entre os pares de bases 1270 e 1271 de SEQ ID NO. 1. A sequência do intrão não é visualizada. Através de sequenciação de um produto de amplificação proveniente de um ADNc que contém esta região, foi confirmado que o local de ligação estava correcto. Estas informações sobre as sequências foram obtidas por meio de um método, ligeiramente modificado, descrito pormenorizadamente em Frohmann (Amplifications, publicado por Perkin-Elmer Corporation, Issue 5 (1990), pp. 11-15). Foi transcrito por transcrição inversa o mesmo ARN embrionário que foi também utilizado para o isolamento do terminal 3' de MP-52, utilizando um iniciador interno de MP-52, de sequência (ACAGCAGGTGGGTGGTGTGGACT), orientado no sentido do terminal 5'. Utilizando transferase terminal juntou-se uma cauda de poli-A ao terminal 5' do primeiro troço de ADNc. Realizou-se uma amplificação em duas fases, utilizando primeiro um iniciador que consistia num Oligo-dT e numa sequência adaptadora (AGAATTCGCATGCCATGGTCGACGAAGC (TI 6)) e depois um segundo iniciador adaptador (AGAATTCGCATGCCATGGTCGACG) e um iniciador interno (CCAGCAGCCCATCCTTCTCC) da sequência de MP-52. Os produtos de amplificação foram novamente amplificados utilizando o mesmo iniciador adaptador e um iniciador interno apresentando sobreposição (TCCAGGGCACTAATGTCAAACACG) da sequência de MP-52. A seguir, os produtos da nova amplificação foram de novo amplificados utilizando um iniciador adaptador apresentando sobreposição (ATTCGCATGCCATGGTCGACGAAG) e um iniciador interno apresentando sobreposição (ACTAATGTCAAACACGTACCTCTG) da sequência de MP-52. Os produtos finais da nova amplificação foram clonados com extremidades lisas num vector (Bluescript SK, Stratagene N° 212206) que tinha sido cortado com EcoRV. Os clones foram caracterizados pela sua sobreposição de sequências com o ADN de λ 2.7.4.

Além disso fez-se um screening de um banco de ADNc produzido a partir de ARN de fibroblastos humanos e clonado em λ gt10. Foram ensaiados, neste caso, 2 x 106 fagos, utilizando um fragmento de cerca de 1 kb do ADN genómico de MP-52 (do 2o exão até ao local de restrição Hindlll no domínio 3' 83 816 ΕΡ Ο 713 529/ΡΤ não traduzido) como sonda radioactiva. Foram recolhidas 17 placas fágicas mistas que foram testadas por PCR utilizando iniciadores dos domínios 5' e 3' da sequência de MP-52. A seguir foram seleccionadas e separadas 8 placas fágicas. O ADNc foi isolado do fago através de uma digestão parcial com EcoRI e clonado no vector Bluescript igualmente cortado com EcoRI.

Uma sequenciação de um dos plasmídeos resultantes, SK52L15.1 MP25, revelou que o fago mais longo (15.1) começa no nucleótido N° 321 de SEQIDNO. 1. Além disso, a sequenciação confirmou o local de ligação (nucleótido 1270). O plasmídeo SKL 52 (H3) MP12 foi depositado com o número de depósito 7353, na DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig), a 10 de Dezembro de 1992. O fago λ 2.7.4 foi depositado na DSM a 13 de Janeiro de 1993 com o número de depósito 7387. O plasmídeo SK52L1 5.1 MP25 foi depositado na DSM a 16 de Julho de 1993 com o número de depósito 8421.

Exemplo 2 Expressão de MP52

Para a expressão de MP52 foram testados sistemas diferentes. A utilização de vírus Vaccinia como sistema de expressão está descrita de forma pormenorizada e reprodutível pelo perito em Current Protoco/s in Molecular Biology (Ausubel et al., Greene Publishing Associates and Wiley-lnterscience, Wiley & Sons), no texto seguinte abreviados por CP, no Chapter 16 Unit 16.15-16.18. O sistema assenta na possibilidade de se integrar ADN estranho no genoma dos vírus Vaccinia utilizando determinados vectores, através de recombinação homóloga. Para este efeito o vector utilizado contém o gene dê TK (timidina-quinase) do genoma de Vaccinia. Para possibilitar a selecção de vírus recombinantes, o vector contém além disso o gene de xantina-guanina-fosforribosil-transferase de E.coli (gpt) (Falkner et a!., J. Virol. 62 (1988), 1849- 14 83 816 ΕΡ Ο 713 529/ΡΤ 1854). Neste vector foi clonado o ADNc com todo o domínio codificador de MP52. O ADNc é proveniente do plasmídeo SK52L1 5.1 MP25 (DSM, número de depósito 8421), ADNc esse, no entanto, em que foi primeiro removida uma grande parte do domínio 5' não traduzido e que foi clonado temporariamente. Para este efeito, o plasmídeo SK52L15.1 MP25 foi linearizado com Sall e o terminal 5' suprimido progressivamente com o Exolll/Mung Bear) Kit (Stratagene #200330) de acordo com as indicações do fabricante. Após a restrição com BamHI, os ADNc de MP52 com um grau de remoção diferente do domínio terminal foram separados do vector restante através de um gel de agarose, isolados e clonados temporariamente de acordo com métodos Standard (Sambrook et ai, Molecular Cloning, segunda edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989) (pSK52s) num vector pBluescriptll SK (Stratagene #212206) cortado com EcoRV e BamHI. Todas as restrições foram feitas de acordo com as indicações do fabricante. A sequenciação incompleta com Sequenase (USB/ Amersham #70770) deu como resultado, entre outros, um clone que começa no nucleótido 576 de SEQ ID NO. 1 (a uma distância de 64 pares de bases do códão de iniciação). Através de restrição com Sall e Saci isolou-se deste a inserção de ADNc que foi clonada no vector para a recombinação em Vaccínia cortado da mesma maneira. O plasmídeo resultante (pBP1MP52s) foi depositado na DSM (número de depósito 9217) a 24 de Maio de 1 994 e utilizado para a produção de vírus Vaccinia recombinantes. Para este efeito foram infectadas células 143B, 80% confluentes, (HuTk-, ATCC CRL 8303) (1 vírus por cada 10 células) em placas de cultura de 35 mm, com vírus Vaccinia do tipo selvagem em 2 ml de PBS, durante 30 minutos à temperatura ambiente, agitando de vez em quando. Após a remoção do sobrenadante por sucção e adição de 2 ml de meio de cultura (MEM, Gibco BRL #041-01095), foi feita uma incubação de 2 horas a 37°C. A seguir, o meio foi removido e conseguiu-se a transformação destas células com 100 ng de pBP1MP52s, 2 pg de ADN transportador (timo de vitela, Boehringer Mannheim #104175) e 10 μΙ de Lipofectina (Gibco BRL #18292-011) em 1 ml de MEM durante 15 h a 37°C. Após a adição de 1 ml de MEM com FCS a 20% (Gibco BRL #011-06290) incubou-se durante mais 24 horas a 37°C e as células lisadas foram a seguir congeladas. A selecção de gpt quanto à xantina-guanina-fosforribosil-transferase e o isolamento e amplificação de vírus recombinantes individuais foram realizados 83 816 ΕΡ Ο 713 529/ΡΤ 15

essencialmente como descrito na Unit 16.17 dos CP, com a diferença de que se utilizaram células de RK13 (ATCC CCL 37). A integração do ADNc de MP52 no genoma do vírus foi confirmada por análises Dot blot e Southern b/ot (CP Unit 16.18). Foi utilizado um vírus recombinante para análises de expressão na linha celular 143B (HuTk-, ATCC CRL 8303, de humanos). As células confluentes foram infectadas com o número de vírus correspondente ao número de células, durante 45 minutos a 37°C, e a seguir adicionou-se o meio de cultura adequado (MEM, Gibco BRL #041-01095) com FCS a 10% e penicilina/ estreptomicina (1:500, Gibco BRL #043-05140H). Após 6 horas a 37°C removeu-se o meio, as células foram lavadas duas vezes, p. ex. com HBSS (Gibco BRL #042-04180M) e adicionou-se o meio de produção (p. ex. MEM) sem FCS. Após uma produção de 20 a 22 horas, o sobrenadante das células foi reunido. A análise da expressão foi realizada através de Western blot de acordo com métodos Standard (CP Unit 10.8). Para este efeito foram precipitadas as proteínas de 100 a 500 μΙ de sobrenadante da cultura celular através de adição do volume equivalente de acetona e incubação, pelo menos, durante uma hora sobre gelo e separadas por centrifugação. Após a ressuspensão da pelete num tampão de aplicação (ureia 7 M, SDS a 1%, di-hidrogenofosfato de sódio 7mM, azul de bromofenol a 0,01 % e, eventualmente, β-mercaptoetanol a 1 %) foi feita a separação em geles de poliacrilamida a 15%. Como proteínas de marcação utilizou-se uma proteína de peso molecular padrão pré-corada (Gibco BRL #26041-020). A transferência para uma membrana de PVDF (Immobilon #IPVH00010) e o bloqueio da membrana foram realizados de acordo com métodos Standard.

Para detecção de MP52 na membrana tinham sido produzidos anticorpos policlonais contra MP52 não apenas em galinhas como também em coelhos. Para este efeito foi expressa a parte madura de MP52 com 6 histidinas no terminal N, em E.coli e a seguir foi purificada, como descrito, p. ex. em Hochuli et ai (BIO/Technology, vol. 6, 1321-1325 (1988)). Com ambos os anticorpos é possível detectar especificamente expressão de MP52, sendo detectada MP52 dimérica com menos eficácia do que a monomérica. Para o Western blot na figura 3 utilizaram-se anticorpos de galinha que tinham sido purificados especificamente através de precipitação PEG (Thalley et a!., BIO/Technology, 83 816 ΕΡ Ο 713 529/ΡΤ 16

νοΙ. 8, 934-938 (1990)) e através de antigénío ligado à membrana (MP52 madura com 6 histidinas) (18.17 em Sambrook et ai, Molecular Cloning, segunda edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989). Como segundo anticorpo utilizou-se IgG anti-chicken com fosfatase alcalina acoplada (Sigma A9171). A detecção foi realizada com o Tropix Western-Light Protein Detection Kit (Serva #WL10RC) de acordo com as indicações do fabricante. O Western blot na figura 3 mostra que bandas específicas de MP52 aparecem apenas nos vírus recombinantes, mas não nos vírus do tipo selvagem (sem ADN estranho integrado). A expressão de MP52 resulta numa proteína segregada com um peso molecular que aparece no gel em condições não redutoras, de cerca de 25 kDa. Sob condições redutoras, a proteína corre no gel com 14 ou 15 kDa. Estes resultados mostram que a MP52 é expressa como proteína madura dimérica. Nas bandas fracas que aparecem no Western blot, no domínio acima de 60 kDa, trata-se provavelmente de restos de proteínas precursoras não cortadas. O seu comportamento no gel confirma, além disso, os pesos moleculares teóricos que se pode estimar a partir de SEQ ID NO. 2, segundo os quais uma MP52 madura monomérica possui um tamanho de 13,6 kDa.

Foi provado que a expressão de MP52 e a cisão da proteína precursora que resulta na MP52 madura são possíveis em linhas celulares diferentes. Foram testadas células C127 (ATCC CRL 1616, ratinho), BHK21 (ATCC CCL 10, hamster), MRC-5 (ATCC CCL 171, humano) e 3T6-Swiss albino (ATCC CCL 96, ratinho). A expressão e a cisão na MP52 madura foram também demonstradas num outro sistema de expressão eucariótico. Para este efeito clonou-se o ADNc de MP52 (começando no nucleótido 576) no plasmídeo de expressão pSG5 (Stratagene #216201). O plasmídeo pSK52s foi submetido a restrição com Clal e Xbal e as extremidades coesivas do fragmento de MP52 foram tornadas lisas através de tratamento com polimerase de T4. A clonagem no vector pSG5 submetido a restrição com EcoRI e possuindo igualmente extremidades lisas através de tratamento com polimerase de T4, foi realizada de acordo com métodos Standard. Todas as reacções enzimáticas se realizaram de acordo com as indicações do fabricante. A orientação correcta do fragmento de MP52 foi

83 816 ΕΡ Ο 713 529/ΡΤ 17 assegurada através de análise de restrição e sequenciação incompleta com o iniciador de T7 (Stratagene #300302). O plasmídeo pSG52s resultante (depositado a 17/05/94 na DSM com o número de depósito DSM 9204) pode ser co-transformado com um vector que codifica um marcador seleccionável como, p. ex., o gene para a resistência a G418, para se obter linhas celulares estáveis. Para este efeito co-transformou-se pSG52s com o plasmídeo p3616 (depositado a 17/05/94 na DSM com o número de depósito DSM 9203) em células L929 (ATCC CCL1, ratinho) com Lipofectina (Gibco BRL #18292-011) de acordo com as indicações do fabricante. A selecção com G418 foi feita de acordo com métodos conhecidos dos peritos (CP, unit 9.5) e resultou numa linha celular que produz MP52 madura como se pode comprovar no Western blot.

Um outro vector de expressão de MP52 foi produzido utilizando o plasmídeo pABWN (Niwa et a/., Gene 108 (1991), 193-200 e figura 4), que foi disponibilizado pelo Sr. Dr. Miyazaki.

Para este efeito isolou-se o fragmento de Hindlll do plasmídeo pSK52s que começa no nucleótido 576 de SEQ ID NO. 1, e as extremidades coesivas foram tornadas lisas através de tratamento com fragmento de Klenow. Através de ligação do adaptador introduziu-se em ambas as extremidades do fragmento um local de restrição Not I.

Adaptador: AGCGGCCGCT TCGCCGGCGA O vector pABWN foi submetido a restrição com Xho I, tratado também com o fragmento de Klenow e desfosforilado com a Fosfatase Alcalina Intestinal de Vitela (Boehringer Mannheim). O mesmo adaptador fosforilado foi ligado, tornando-se desta maneira possível uma inserção do fragmento de MP52, após a restrição com Not I, no local de restrição de Not I criado no vector. O vector de expressão resultante é designado a seguir por Hindl!l-MP52/pABWN. Todas as reacções realizadas para a clonagem foram realizadas de acordo com métodos Standard (p. ex. CP unit 3.16). A estrutura do vector de expressão Hindlll-MP52/pABWN foi confirmada por sequenciação e mapeamento de restrição. O Hindlll-MP52/pABWN contém a sequência de

83 816 ΕΡ Ο 713 529/ΡΤ ΜΡ52 começando no nucleótido 576 e acabando no nucleótido 2278 de SEQ ID NO. 1. O Hindlll-MP52/pABWN foi transfectado para células L (fibroblastos de ratinho) e foram estabelecidos a partir daí transformantes estáveis. Para este efeito foram transfectados, em cada caso, 4 pg dos plasmídeos (Hindlll-MP52/pABWN ou pABWN) em 5 x 105 células L numa placa de cultura de 6 cm utilizando 20 μΙ de reagente LipofectAMINE (Gibco BRL#18324-012). Para este efeito a solução A (4pg do respectivo ADN de plasmídeo em 200 μΙ de OPTI-MEM I (Gibco BRL # 31985)) foi misturada cuidadosamente com a solução B (20 μΙ de reagente LipofectAMINE em 200 μΙ de OPTI-MEM I) e incubada à temperatura ambiente durante 45 minutos, para criação do complexo de lipossomas de ADN. Entretanto, as células foram lavadas uma vez com 2 ml de OPTI-MEM I. Para cada transfecção adicionaram-se 1,6 ml de OPTI-MEM I ao recipiente contendo o complexo de lipossomas de ADN. A solução foi misturada cuidadosamente e utilizada para revestir as células lavadas. As células foram incubadas com o complexo diluído durante 5 horas a 37°C no incubador de CO2. Após a incubação foram adicionados 2 ml de DMEM (Gibco BRL, Meio de Eagle modificado por Dulbecco/FCS a 20%. Vinte e quatro horas após a transfecção, o meio foi substituído por DMEM/FCS a 10%, fresco. Quarenta e oito horas após o início da transfecção, as células foram transferidas para uma placa de cultura de 10 cm. Setenta e duas horas após o início da transfecção, iniciou-se a selecção com G418 numa concentração de 800 pg/pl. Os clones estáveis apareceram após 1 a 2 semanas.

Obtiveram-se 5 ml de DMEM condicionado, com ou sem FCS, de transformantes confluentes que tinham crescido durante 3 dias numa placa de cultura de 10 cm. Os dois sobrenadantes diferentes das culturas celulares (Hindlll-MP52/ pABWN e pABWN) de células transfectadas, assim como lisados celulares foram analisados por Western blot. Foi encontrada, neste caso, MP52 madura no meio condicionado assim como em lisados celulares de células transfectadas com Hindlll-MP52/ pABWN. Os clones foram novamente clonados e seleccionaram-se, em cada caso, as células produtoras de MP52 após uma análise Western blot. Estimativas feitas com base nas análises Western blot deram como resultado uma produção de MP52 até 1 mg/l.

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Exemolo 3

Actividade biológica de MP52

Para provar a actividade biológica de MP52 e demonstrar a utilidade deste invento em aplicações médicas, para prevenção e/ou tratamento de doenças dos ossos, foram realizadas várias experiências in vitro e in vivo. 1. Ensaios in vitro 1.1

Dado que existe uma descrição de um aumento da síntese de glicosaminoglicanos (GAG) em condrócitos após estimulação com TGF-β (Hiraki et aL, Biochimica et Biophysica Acta 969 (1988), 91-99), foi examinado se a MP52 também exerce esta influência. Utilizando os sobrenadantes de culturas celulares (DMEM com FCS a 10%) de transformantes de células L produtores de MP52 (transfectados com Hindlll-MP52/pABWN), ensaiou-se a actividade condrogénica de MP52 em culturas primárias provenientes de extremidades de ratos fetais.

Para este efeito foram utilizadas as quatro extremidades de fetos de ratos de 16 dias de idade. Após um tratamento com tripsina, as células obtidas foram espalhadas no meio F-12 (Nutrient Mixture HanVs F-12, Gibco BRL #21700) com FCS a 10% em placas 24 poços revestidas com colagénio tipo I, com 3x105 células e foram cultivadas durante cerca de 2 dias até à confluência. A 500 μΙ de meio de cultura (meio F-12 com FCS a 10%) adicionaram-se, em cada caso, 56 μΙ de meio condicionado (KM) de células L transfectadas com Hindlll-MP52/ pABWN, de células L transfectadas com pABWN ou apenas de meio (DMEM com FCS a 10%). Ao longo de um período de 0, 3, 6 e 9 dias utilizou-se o meio F-12 com FCS a 10% assim como com os respectivos aditivos. De três em três dias substituiu-se o meio com os respectivos aditivos. Depois disso, a cultura foi cultivada durante mais 2 dias no meio F-12 sem FCS, na presença dos respectivos aditivos (meios condicionados ou meio de controlo) adicionando-se a seguir, durante 6 horas, sulfato de 35S. O 35S incorporado em polissacáridos foi medido, após digestão com pronase E, e precipitação, de acordo com a descrição em Hiraki et al. (Biochimica et Biophysica Acta 969 (1988), 91-99). 20 83 816 ΕΡ Ο 713 529/ΡΤ

Tabela 1:

Radioactividade (cpm/poço) Número de dias DMEM (FCS a KM de células L KM de células L de incubação 10%) de células transfectadas transfectadas com L de controlo com pABWN Hindlll-MP52/ pABWN 2 3720±114 38651120 48791422 5 4188±135 4154129 82231275* 8 3546+160 33101115 989011260* 11 36791218 36331167 75201160*

Os valores referem-se a ± S.E.M.para 3 ou 4 preparações de cultura. *: p<0,01 vs DMEM e KM de células L transfectadas com pABWN (Scheffe's multiple t-test)

Como se mostra na tabela 1, os sobrenadantes das culturas celulares dos transfectantes produtores de MP52 estimulam significativamente a síntese de GAG, em comparação com o meio de cultura puro (DMEM com FCS a 10%) ou com o sobrenadante das culturas celulares de células L transfectadas com pABWN. Isto mostra que a MP52 é capaz de estimular a diferenciação de condrócitos. 1.2

Um efeito descrito em relação a alguns membros da família BMP é o aumento da actividade da fosfatase alcalina (ALP) em osteoblastos. A linha celular clonal de ratos (ROB-C26 (C-26) faz parte dos osteoblastos com um estado de maturidade relativamente precoce (Yamaguchi et ai, Calcif. Tissue Int. 49 (1991), 221-225). Para proteínas osteoindutoras como, p. ex.( a BMP-2, a aptidão para o aumento da actividade de ALP está descrita em Yamaguchi et ai (J. Cell Biol. 113 (1991), 681-687). A influência de MP52 em células C26 foi examinada de forma seguinte: As células C26 foram disseminadas ,com 3 x 104 células por poço numa placa de 24 poços e cultivadas em a-MEM (Gibco BRL)/FCS a 10% até à confluência.

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Por poço, adicionaram-se 56 μΙ do sobrenadante de cultura de células L transfectadas (Hindlll-MP52/ pABWN) produtoras de MP52 ou de sobrenadante de cultura de células L transfectadas com pABWN ou simplesmente de sobrenadante de cultura (DMEM com FCS a 10%) de células L, respectivamente, a 500 μΙ do meio de cultura de células C26. De três em três dias substituiu-se o meio com os respectivos aditivos. A actividade de ALP nos extractos celulares foi determinada após 0, 3, 6, 9 e 12 dias por meio de técnicas Standard com base em fosfato de p-nitrofenilo como substrato, como se descreve, p. ex., em Takuwa et al. (Am. J. Physiol. 257 (1989), E797-E803).

Tabela 2:

Actividade da ALP (nmol/ min) por poço KM de células L transfectadas com Hindlll-MP52/pABWN 41,8±2,8 1 81,3±14,2* 258,0±8,3* 258,4±10,6* 237,8±11,0* Número de dias de incubação 0 3 6 9 12 DMEM (FCS a 10%) de células L de controlo 41,8±2,8 136,3±3,7 1 29,0±7,8 118,4±3,7 121,2±3,2 KM de células L transfectadas com pABWN 41,8±2,8 I 25,8±2,3 II 9,3±6,4 110,1±2,8 1 25,3±6,0

Os valores referem-se a ± S.D.para 4 preparações de cultura. *: p<0,01 vs DMEM e KM de células L transfectadas com pABWN (Scheffe's multiple t-test)

Como se mostra na tabela 2, a actividade de ALP aumenta significativamente através da adição de MP52, em comparação com o meio DMEM/FCS a 10% e o meio de células L infectadas com pABWN. Este resultado mostra que a MP52 pode provocar não apenas a diferenciação dos condrócitos como também a diferenciação e amadurecimento de osteoblastos. Uma outra linha celular de osteoblastos (MC3T3-E1, ratinho) que mostra, como descrito em Takuwa et al. (Biochem. Biophys. Res. Com. 174 (1991), 96-101), através de tratamento com BMP-2, um aumento da actividade de ALP, não origina, após incubação com meio condicionado de células L transfectadas

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(Hindlll-MP52/pABWN) produtoras de MP52, ou com o meio depois da produção de MP52 através de infecção com vírus Vaccinia recombinantes, nenhuma alteração da actividade de ALP. Isto é um indício de que a MP52 possui uma especificidade celular que difere da de BMP-2. Funções diferentes provocadas por locais de destino diferentes para os membros individuais da família TGF-β podem ser de grande relevância médica. 2. Ensaios in vivo 2.1 A possibilidade mais concludente de examinar o desenvolvimento ósseo, baseia-se no desenvolvimento ectópico dos ossos in vivo. Este pode ser induzido, p. ex., através de implantação de matriz óssea desmineralizada (Urist, Science 150 (1965), 893-899). Através da combinação de matriz inactiva com proteínas indutoras de osso pode ser induzido o mesmo processo, como está descrito, p. ex., em Sampath et ai. (PNAS *78 (1981), 7599-7603). Este processo de formação de ossos é semelhante ao da formação óssea encondral embrionária e da cicatrização óssea no adulto. Assim, este método oferece a possibilidade de examinar proteínas com vista na sua aptidão para a indução óssea in vivo.

* Proc. Natl. Acad. Sei. USA

Para uma experiência deste género, proteína MP52 obtida através de expressão no sistema Vaccinia (veja-se exemplo 2) foi parcialmente purificado e implantado. Para este efeito foram cultivadas células 143B (HuTk-, ATCC CRL 8303) em placas de cultura e frascos de agitação, até à confluência e, como descrito no exemplo 2 em relação às análises de expressão, foram infectadas com vírus recombinantes, lavadas, e deixou-se a acumular a MP52 durante cerca de 20 horas em MEM (Gibco BRL, cerca de 1 ml por 106 células). Como controlo foi feita a mesma preparação através de infecção com vírus do tipo selvagem. O sobrenadante da cultura celular (meio condicionado) de cada preparação foi recolhido e centrifugado (40000 x g durante 30 minutos a 4°C). Para a remoção dos vírus, os sobrenadantes foram filtrados através de filtros inorgânicos (tamanho de poros de 0,1 μιτι, Whatman, Anotop 25). No decorrer da caracterização de MP52 pôde ser demonstrado que esta proteína se liga à Sepharose de heparina. Este comportamento foi aproveitado para uma 23 83 816 EPO 713 529/PT purificação parcial. Para este efeito, o meio condicionado filtrado e centrifugado foi ajustado a uma concentração final de Tris 50 mM, pH 7,0, NaCI 100 mM e ureia 6 M, e carregado numa coluna de heparina (HiTrap™, Pharmacia #17-0407-01) equilibrada em tampão A (Tris 50 mM, pH 7,0, NaCI 100 mM e ureia 6 Μ). A coluna carregada foi lavada com tampão A e eluída com um gradiente linear para até 100% de tampão B (Tris 50 mM, pH 7,0, NaCI 600 mM e ureia 6 M), com um caudal de 0,5 ml/min ao longo de 50min (2,5 ml por fracção). A utilização de ureia não é obrigatória. Através de uma análise Western blot (veja-se Exemplo 2) foi possível verificar que a MP52 é eluída, de forma reprodutível, principalmente em 2 fracções, a cerca de 250 a 400 mM de NaCI. Partes alíquotas destas fracções foram também examinadas em geles de poliacrilamida a 15% corados com prata de acordo com as indicações do fabricante (Silver Stain-ll, Daiichi #SE140000) e as fracções foram reunidas. As fracções comparáveis foram também reunidas a seguir à purificação do meio condicionado após infecção com vírus do tipo selvagem, depois de análise em geles coloridos com prata. De outras investigações relativas à MP52 resultou que a MP52 se liga também à hidroxiapatite. Por isso é possível, em princípio, conseguir uma purificação adicional através de uma coluna de hidroxiapatite, ou então substituir uma coluna de heparina por uma coluna de hidroxiapatite (p. ex.: BIO-RAD, Econo-pac HTP). Para outras purificações adicionais pode pensar-se também em outros métodos conhecidos dos peritos, p. ex., colunas de filtração em gel, colunas de permuta iónica, colunas de afinidade, colunas de quelantes de metais ou colunas à base de interacções hidrófobas. A proteína MP52 pré-purificada através de cromatografia em Sepharose-heparina ou as respectivas proteínas ainda contaminantes que se encontram também nos sobrenadantes das culturas celulares infectadas com o tipo selvagem, foram purificadas ainda mais por meio de uma Reversed Phase HPLC. Para este efeito, equilibrou-se uma coluna C8 (Aquapore RP300, Applied Biosystems, tamanho de partículas: 7 pm, tamanho de poros: 300 Á) com tampão B a 10% (tampão A: ácido trifluoroacético a 0,1%; tampão B: acetonitrilo a 90%, ácido trifluoroacético a 0,1%). Após o carregamento da coluna com as fracções reunidas da coluna de heparina e contendo MP52, lavou-se abundantemente com tampão B a 10%. A proteína ligada foi eluída com o gradiente seguinte: tampão B de 10 a 50% durante 20 minutos e tampão B de 50 a 100% durante 50 minutos. Foram recolhidas fracções de 500 μΙ e analisadas não apenas por Western blot como também em geles coloridos com prata. A proteína MP52 83 816 ΕΡ Ο 713 529/ΡΤ 24

elui, sob as condições escolhidas, aproximadamente no intervalo de 55 a 65% de acetonitrilo. As fracções com MP52 foram reunidas. O mesmo foi feito com as fracções correspondentes da purificação de controlo de sobrenadante de culturas celulares das células infectadas com vírus do tipo selvagem. A proteína MP52 parcialmente purificada também apresentava, numa concentração estimada, após uma análise Western blot, em 50 ng/ml, um nítido aumento da actividade de ALP sobre células ROB-C26 depois de uma incubação de três dias. A proteína MP52 parcialmente purificada ou proteína de controlo dos sobrenadantes parcialmente purificados de modo análogo das culturas celulares a seguir a uma infecção com vírus do tipo selvagem, foram reconstituídas com uma matriz e implantadas em ratos, para comprovar a sua capacidade de formação de cartilagens e ossos.

Em princípio deveriam ser utilizáveis materiais de matriz diferentes conhecidas dos peritos, isto é, matrizes nativas (também modificadas) e de fabrico sintético, mas preferem-se materiais porosos biocompatíveis, biologicamente degradáveis in vivo. Nestas experiências foi utilizada matriz óssea de ratos que foi preparada, essencialmente, de maneira semelhante à descrita em Sampath et ai. (PNAS 80 (1983), 6591-6595). Os ossos de ratos (fémur e tíbia) foram desmineralizados durante 24 horas em HCI 0,6 M, e a seguir foi removida a medula óssea ainda existente. Após uma lavagem com água e desengorduramento durante três horas numa mistura de clorofórmio/ metanol (1/1), os ossos foram secos ao ar, moídos sob a forma congelada num moinho, e separaram-se por peneiração as partículas com um tamanho entre os 400 e 1000 pm. A seguir, a matriz foi extraída durante 7 dias à temperatura ambiente em guanidina-HCI 4 M, na presença de inibidores de protease. Após uma lavagem cuidadosa com água, a matriz foi liofilizada e guardada a 4°C. As matrizes tratadas desta maneira já não apresentam, por si só, nenhuma actividade de indução de ossos. A proteína pode ser combinada com a matriz óssea extraída através de métodos diferentes conhecidos dos peritos. A proteína MP52 parcialmente purificada, ou proteína de controlo, que tinha sido purificada não apenas através de Sepharose de heparina como também através de Reversed Phase HPLC, foi reunida, na solução de acetonitrilo/ácido 83 816 ΕΡ Ο 713 529/ΡΤ 25

trifluoroacético, após eluição, em cada caso, com 25 mg de matriz por implante, bem misturada, congelada e liofilizada. Para a implantação de MP52 ligada à matriz utilizaram-se duas ratos (Whistar) de cerca de três meses de idade que tinham sido narcotizadas através de injecção intramuscular de um narcótico (0,2 ml de Rompun (Bayer) misturado com 0,5 ml de Ketanest 50 (Parke Davis), com 0,14 ml por 100 g de peso corporal. Para os implantes foram preparadas, de forma bilateral, bolsas nos músculos abdominais (abaixo do tórax, começando a cerca de 0,5 cm abaixo da curvatura inferior das costelas). A MP52 ligada à matriz (cerca de 2 a 4 pg segundo uma estimativa em Western blot), assim como as proteínas de controlo ligadas à matriz de modo análogo, foram humidificadas com solução de sal de cozinha a 0,9% (Delta Pharma) e transferidas nas bolsas musculares. A seguir, as bolsas musculares assim como os cortes na pele necessários foram cosidos. Para imunossupressão, foi administrada aos ratos Ciclosporina A (Sandimmun).

Após 18 ou 26 dias, respectivamente, os implantes foram retirados dos ratos e fixados para as análises histológicas. Dado que o implante com MP52, já depois de 26 dias, fez supor macroscopicamente a formação de ossos, o mesmo foi incorporado em metacrilato de metilo para a preparação de cortes finos, e os outros implantes foram incorporados em parafina. Os tecidos de cartilagens e ossos mineralizados são realçados a preto através da técnica de coloração de von Kossa (Romeis, B.;Mikroskopische Technik, ed. Bõck, P.; Urban und Schwarzenberg; Miinchen, Baltimore, Wien (1989)). Na coloração tricromática de acordo com Masson-Goldner (Romeis, B.;Mikroskopische Technik, ed. Bõck, P.; Urban und Schwarzenberg; Múnchen, Baltimore, Wien (1989)), o tecido ósseo mineralizado e colagénio são corados de verde brilhante, osteóides são vermelhos e o citoplasma castanho avermelhado. Ambas as técnicas de coloração foram aplicadas aos implantes de dois ratos. Com ambas as técnicas de coloração foi possível comprovar em ambas as cobaias uma nítida formação de cartilagens e ossos nos implantes contendo MP52. Os implantes correspondentes contendo proteína de controlo não apresentaram nenhuma formação de cartilagens ou ossos. A percentagem de estádios precoces de cartilagem, com condrócitos e áreas de cartilagem com formação inicial da matriz extracelular e a sua mineralização em círculos concêntricos é mais elevada no implante de 18 dias do que no de 26 dias. Mas também no implante de 18 dias já é detectável tecido ósseo maduro com 83 816 ΕΡ Ο 713 529/ΡΤ 26

formação vectorial de osteóides, assim como osteócitos individuais no osso. Além disso são visíveis Ossikel fechados com formação de medula óssea no estado inicial. No implante de 26 dias são detectáveis, além disso, áreas de cartilagens com formação de matriz e calcificação no estádio precoce, a percentagem do tecido ósseo mineralizado de coloração verde com osteócitos e margens de osteóides, no entanto, aumentou nitidamente. Também neste implante é detectável a formação de medula óssea com existência de células de gordura isoladas. Para a exemplificação, a figura 5 mostra a prova de coloração (von Kossa) do material ósseo de todo o implante após 26 dias. Na figura 6 mostra-se um pequeno pormenor do mesmo implante após uma coloração segundo Masson-Goldner. Mostra material ósseo activo com uma margem que consiste em osteoblastos cuboidais e oesteóides, em que são visíveis osteoblastos isolados incorporados. Além disso são visíveis osteócitos isolados no tecido ósseo mineralizado (na preparação original, coloridos em verde). A formação de medula óssea é igualmente detectável. O ensaio mostra que a MP52 proveniente de fabrico recombinante está apta a induzir por si só, em combinação com uma matriz, uma formação encondral de ossos. 2.2

Para confirmar os resultados, realizou-se um outro teste de formação óssea ectópico, utilizando os transformantes de células L de MP52. Células L (1 x 106 células) produtoras (transfectadas com Hindlll-MP52/ pABWN) e não produtoras (transfectadas com pABWN), respectivamente, foram injectadas no músculo das coxas, dos dois lados, de três ratinhos nus machos. Após três semanas, todos os animais foram mortos, os músculos das coxas foram separados e analisados não apenas com raios X de baixa energia como também histopatologicamente.

Como está listado na tabela 3, a análise de raios X mostra material denso nos locais de injecção no tecido muscular de todas as células L produtoras de MP52. Com análises histológicas foi possível detectar uma formação de cartilagens simples e formação de cartilagens calcificadas nos músculos. Também estes resultados confirmam que a MP52 é capaz de induzir uma formação óssea encondral.

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Tabela 3: Células produtoras deMP52 Células de controlo (Hindi ll-MP52/pABWN) (pABWN) Material denso na análise 3/3 0/3 de raios X Condrócitos na histologia 3/3 0/3 Formação de cartilagens calcificante na histologia 3/3 0/3

As experiências realizadas confirmam que a proteína MP52 estimula a formação de cartilagem a partir de células de tecido conjuntivo embrionário, assim como a diferenciação e amadurecimento de osteoblastos. Isto conduz a uma formação óssea encondral que se assemelha à cascata indutora na formação óssea embrionária e à cura dos ossos em caso de fracturas.

As condições indicadas nos ensaios devem ser consideradas como ilustração da actividade de MP52 e não como limitação. O invento pode ser examinado e caracterizado também de outra forma.

Para as linhas celulares e plasmídeos indicados neste fascículo juntaram-se como anexo os certificados de depósito, dos quais constam os dados de depósito.

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UDAP2ST TREATY ΟΝ THE INTERNATIONAL RECOGNITION OF THE DEPOSIT OF MICROORCANSWS FOR THE PURPOSES OF PATENT PR0CE3URE

INTERNATIONAL FORM

Biophara GmbH PosTÍach 101425 6900 Keideiberg RECEIPT IN THE CA£E OF AN ORIGINAL DEPOSIT iaauad punuaat te Rui· 7.1 by th« INTERNATIONAL DEPOSITAKT ΑΟΤΗΟΕΓΓΥ irUntrlWi mt th· bottom of thi· p»c< I. IDENTiriCATION OF THE MICROORCANISM 1 Identification raíerenc* fiy*a by th* DEPOSITQR Aecciaioa nurabor girea by th· SKL £2 (K2) KP12 INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY: DSM 7253 Π. SCIENTIFIC DESCIUPTION AND/OR TXXONOMIC DE3IGNATION The microercaniata identiíied under L. ibeve wu ictompasitd by: ( X ] a tacntific d<*ciiption ( ) a propoacd taxononuc duigaacion _ (Meríc wieh i erei* *h«r* appheahJ») i

m. RECEIPT AND ACCEPTANCE

Thi* Intwnaxionai Dtpeticuy Authority acscpu thi* mieroorsaniim identiílac under L abovt, whieh vu rccaived by it on 1992-12-10 (Dau of otipul depoâit)1

IY. RECEIPT OF RE0UE3T FOR CONVERSION

Tb· sdcrooryuuam idcetificd under I abor« wu receired by thi* Inttrnalionoi Depoeituy Authority un (d»t« of originei depoíit) uid i r«quc*t to eanvcrt tb« oripnoi dtpo«it to a dtpotic under th* Budaput Trtaty wu :*cuv«d by it on (date of recaipt af r»qu«t tor tooveraion).

Y. INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY

Nune: DSM-DEUTSCHE SAMMLUNG VON Sifnarurr(t) of per*oo(·} havin* the povar MIKROORCANISMEN UND 2ELLXULTUREN GmbH t: rtprejent the Internacional Deporitiry Authority or of authohtcd oí5cial(»): Adrtet: Muútnxjtr Wtf 1 B CJ , (C<J ^ D *3300 Braunmhwtif Dat.: 1992-12-15 — 1 Whert Rult 6.4(d) »ppu««, *uei) date u th« date on wnieh lhe itacu» of mcemetioajJ dapoaitary authority wu aequired. Γ—BSM-BP/4 (-^^705068 S2 29 83 816 ΕΡ Ο 713 529/ΡΤ

BUDAPEST TREATY ΟΝ ΤλΕ INTERNATIONAL RZCOGNTTION ΟΓ THE DEPOSIT OF MICROCR.GAN1SMS γολ τηε purnosks ο»· ρλτεντ ρκ,ύύ£Ι>ϋϊί£ INTERNATIONAL r ORhí

3iopham GabH PosTfacn 10 14 25 6900 Heideiberç R£CE3>T IN THE CASE ΟΓ AN ORIGINAL DEPOSIT itavad puauiat to Ruía 7.1 by th1 INTERNATIONAL DEPOSITaRY AUT2CRTTY idcatiSad it th1 boctom of thim pifa t. IDENTIFICATION 0Γ THE MICROORCANISNf Idantificatioa rcfcreaet rivaa by th· DEPOSITOR Aeoaaaioa sumbar fivaa by tha INTERNATIONAL DEPOSITARY aUTHORITY: Lambda 2.7.4 DSM 7387 II. SCIENTITIC DESCKFTION AND/OR TAXONOMIC DESIGNATION

Th* ctcroorgmma idanthlae una ar L i»ov« «u aeeompaniad by. ( X ) »1<i1atifie daacripcioa ( X ) i propoaed lazonomic dajifnalion (Mark vila i eroaa vhipi ippUcabi1) ui. recei?τ and acceptancs

Thii Inuraatioaii Dtpoaitiry Authariry aesopti Chi· sucroerfinins idtnci£«d undar L »bov», vhich wu recoivad by it | on 1593“ 01 — 13 (Dit1 of oncinii dapoait)^ j

IV. RECE1PT OF REQUEST FOR CONVERSION

The ínieroercsniíta idaotifiad undar I abor· vu received by thi1 Internacional Dapoaitnry Authorily ea (dai1 of onjinai depoait) and » raquaat to esovart tbc on finil dapoait to a depoait undar th1 Budspatt Treaty via raeaivad by it on (dat1 of racaipt a( raqueac for aoavenion).

V. INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHOPJTY

Ne.ua: DSM-DEUTSCHE SAMMLUNC V0N Sign1tur1(i) of panon(a) havir.f tha povar MIKROORGaNISMEN UND ZELLXULTCREN GmbH to rapraaanc thc lacarsitiocii Depoaitary Authority or of auehorúod o£ficiai(>): Adreu: Much«rtxi«r W«f X B t; CJ^-Co 0-::00 Braunachvcif Oau: 1993-01-15 1

Wnttt Rui1 6.4(d) appli2, íucb dita ia th1 data on wnich thc atatua of iotarnitionil depoaitiry authortty »u icquired. 2

Tona DSM-BP/4 Joatoptçt) <rçp4Q506S $4

83 816

EPO 713 529/PT 30

BKJaPEST TREATY ΟΝ TSE INTERNATIONAL recognition or tse deposit or MicaooRCANisMs FOR TíE RUIUOSE3 ΟΓ FATENT ritutasuuki

International roRM 3io?hara GnbH csemyring 22 D-69115 Heidelberg

RECEIFT IN TSE CASE O? AN ORIGINAL DEPOSIT ieeued punuul te Rulc T,1 by tba INTERNATIONAL DEPOSITART ACTBORITY identifwrl at tb· bottom oí ihi· pt(t

r. 19 ENTIPICATI ON or THE MICROORGANISM

Idenlificatioa níarrncc pvtn by lhe DEPOSITOU.

Aceueico nureber grren by th· INTERNATIONAL DEPOSITART AUTHORITT: SK52L15. 1HP25 DSM 8421

II. SCIENTIF1C DESCRIPTICN aND/OR. TAXONOMIC DE3IGNATION

The iRiervorfamtm identified under 1. above vai occompaniad by: ( X ) » íeienciíU deeenption ( ) » propoeed lajcoaomic deeignatioa IMtfk with v eroea »hirt appiieable)

III. SECEIPT ANE ACCEPTANCS

Tbú International Depoeitary Aurhority Kupci thti aúcroorpaaian identified under I. abp*e, which vu rcceived by it on 1992—07-26 (Date oí origina) depoeií}^

IV. RECEIPT OF REQUEST FOR CONVER3ION

The microorgoniim identified under l abov· received by thii Interaaiieoal Qepaeitary Authority en (date oí original depooit) and a requeoc to eonvert th· original dcpotit to a depoeit under th* Budapeeí Treaty vai neeived by it on (dat· oí receipt oí requett íor eonvenion).

V. INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY

Nana: DSM-DEUTSCHE SaMMLUNC VONMIXROOR.GANISMEN UNO ZELLXULTUREX CmbK Adrex: Ma»eheroder W<c 1 3 0-38124 Brbunichveig

Sifnature(í) ofpenon(a) hiving tb« pover to rtpnMnt the International Depoaitary Authority or oí authorieed oíTicial(·}:

Date: 1993-07-21 * Wher· Rui· fl.-i(d) applici, iucà aat* 'u th* eac« on vbicji th* jcatua oí intcm&tional depoíitary *uthority vaj *cquirtd. r or» DSM-BP/e 0 5O 6 $ .S b

83 816 EPO 713 529/PT 31

BUDAPEST TR2ATY ON THE INTERNATIONAL RECOC.\TTION ΟΓ THE DEPOSIT ΟΓ MICROORCANJSMS ΓΟΡ. THE PUPJPOSES ΟΓ ΡΛΤΕΝΤ PROCEDURE

INTERNACIONAL FORM

Biopharm GmbH Postfach 10 14 15 69004 Heidelberg RSCEIPT IN THE CASE OΓ AN ORIGINAI DEPOSIT iitued pumiont ta Rule 7.1 by th· INTERNATIONAL DEPOSTTARY AUTHORITY idtatiCad it th· bottom oí thii pir

I. IDENTIFICATION OF THE MICROORCANISM

Identification reíerenet ρν«η 'οχ th· DEPOS1TOP.:p3 616

Aceeeeion numbcr pm bjr th· INTERNATIONAL DEPOSTTARY AUTHORITY:DSM 9203

Q- SCIENTIFIC DESCRIPT20N AND/OR 7R0P0SED TAXONOMIC DESIGNATION

Tht micrsertaniim id*ntifi<d under I. abere wu tesosspknicd by: (X ) * fcitntlSe d«*cnpcon ( } x propoud tixooocuc deiiptation (híarlc vith » exoer vhcrt applieable).

ΠΙ. RECE3»T AND ACCEPTANCE

Thii lnttmationtl Depoiitary Authoriry icttpti th· miereorranittn idcatificd under L above, vhich vu rtceived by it od 1994-05-17 (Date oí the oripnal depoiit)^.

IV. RECEIPT OF REQUEST FOR CONVERSION

Th« isicroorf aailir. identlQtd under I ahe»i nt r«ctiv*d by thij Internacional Depoettary Authohty on (d xtt oí orifir.ii dtpoiit) and i rtquut to eonrerT th· orifinal depoeit to s depoiil ca d cr thc Budapeet Trtaty «VI recrived by It «r. (d·:· oí rtceipt oí nqueet for eonvenion).

V. INTERNATIONAL DEPOSIT AR Y AUTHORITY N«K dsm-deutsche sammlung von MTKP.OORGANISMEN UND ZELLKoLTUREN CmbK Addreet: Maeeheroder W«y lbD-2Si:< Brvun)ch*«íf

Sicsaeure(a) oí persosft) har-nf the power to nprMcat th· lnt«rnationoi Depoiitary AUChority o; oí authorired eíRáU(t):ÍS. C>SJ2<~Dau: 1994-05-19 1 Whci Rul« %.< (d) »ppli«t. tuch ait« li th« d*:t on whieh ch· ttatui oí internacional depoiitary authoncy wxi aequind. Fenn DSM-BP/< (sole ?ec«) 17/93 83 816ΕΡ Ο 713 529/ΡΤ 32

BVDAPES7 ΤΡ-ΕαΓΥ ΟΝ 7Η2 INTERNATIONAL

rscocntticn cr the csposrr or micro organisms roa THE PURPCSES ΟΓ PATENT PROCE3CRE

INTSRN ATI CN AL P0R.M

Biopiiem GrbK

Posníach 10 14 25 69004 Heidaiberg

L IDENTITICATION ΟΓ THE MICROORC ANISM IdmtiLcorion roíerenee jivan by th* DEPOSITOR: Acctuion aurabor (ivea by tbe INTERNACIONAL DEPOSITARY aUTSCRTTY: p3?lM?52S DSM 9217 Π. SCIEXTCTC BESC3UPT30N AND/OR PR0PQSE3 TAXONOMIC DESICNATION

The nueroorpanum id«nti£id txadvf I· abov· Vti aeeosipa&Í«d by: HSCEa»T IN THE CASE ΟΓ AN ORIGINAL 3SP0SIT iaouod ponuxat to Rulc 7*1 by lh« INTERNATIONAL DEPCSITARY AV7SCK7Y idcatiLcd ti th· bonota oi :ha pan (X ) i jcitatiiií deienpeien ( ) x propo»«d tojconomie d«*icr.at:oa (Moíit «ita a cran wnirt appiieabU). itl rscspt and acceptance

ThU !nt«raatioaai Dcpoaitsry Authonty aeccpu the ccieroorrinura idontiíjcd uod«r I. abovt, whieá «u rcccivad by it ao 1994—05—24 (Dat· of th« onçinaj depasit}1. IV. RECSIPT ΟΓ RSQUEST FOR CONVER3JCN 7b« siicroarranius idintiCad undtr I «bovt »u netivtd by tbi< Intersotional Dcpoiitary Authonty on (dat* c' oripnai dtpoitt) and a rtpuut to eonvart the onimaJ dcpoii: te a depont undtr the Budtptic Treacy »u ίΗΐτ'Μ by it os (datt o{ reeaipt o( requir: (or eonvonien).

V. INTERNATIONAL DEPCSITAP.Y ACTEOPJTY

Natna: DSM-DE'JTSCHE SAMMLUNC VON SijTiamrt(i) oí ptnon(i) hannj the powcr MIKROORCaXISMEN UND ZELLKVLTUREN GmbH to rrpriitn: th· Intvaatioaal Dcpoiitary Authority or ef authonted oCieial(>): Addma: Majebiroder TVec 2b D-3S124 Brsoiuchw«i( Dato: 1994-05-25 1 Whtrt Rui* 6.4 (d) ippliti, iuch date i« chi dai» or. «hich ch< ttacuj oí Inccrsiticnal depotitary authority vs» aequired.

Ferre OSM-SP/4 (joli psf») 11/9! 33 83 816 ΕΡ Ο 713 529/ΡΤ

BUDAPEST TRRATY ΟΝ THE INTERNATIONAL RECOCNITION ΟΓ THE DEPOSIT OF MICROORGaNISMS ΓΟΡ. THE PVRP03E5 ΟΓ PATENT PROCEDURE

INTERNATIONAL FORM

Biopharm GmbH

Posmíach 10 14 15 69004 Heidelberg RECEIPT IN THE CASE ΟΓ AN ORIGINAL DEPOSIT iaauad punuant te Rule T.I by the INTERNATIONAL DEPOSITAR.Y AUTHORITY idcntificd et th* botcom oí thu pt|e

I.IDENTIFICATION 0Γ THE MICROCRGANISM IdeotUleation raíerine* fivan by th· DEPOSITOR: pSG52s Aecuaion numbar fivan by tha INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY: DSM 9204 IL SC1ENTITIC DESCRIPT10N AND/OR PROPOSED TAXONOMIC DESIGNaTION Th· cieroorranism identiliad under I. abovr wu accsspanicd by: (X ) * íeienciíie dcicription ( ) a propoacd taxonomic dtiifnation (Marlt vith a croai «hera applicablc). P-ECEIPT AND ACCEPTANCE

Thil IntaraationaJ Dcpoaitary Authority acetpta th· cicroorgaaiim idantiíiad under I. abovo, which wu raccivad by it oa 1994-05-17 (Da:« oí lho orifinal depoiit)1.

IV. RECEIPT ΟΓ REQUEST POR CONVERSION

Th· microorfaniam idanti&ad und«r I »bovt wjj reeeivtd by chia Internacional Depoeitary Authority on (data oí o ri final dtpoait) and - rcqueat lo «onvcrt thc orifir.ai depoail to a depoait uncer the Budapeat Treaty vaa racaivad by St on (data oí rcecipt oí requcat for convcnioa).

V. INTERNATIONAL DEPOSIT ARY AUTHORITY

Naeit:

Adarart: DSM-DEUTSCHE SAMMLUNG VON MKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH Maichcrodcr W«f lb D-381SÍ Braunaenwcif

Sifnatura(a) oí panon(a) httvtitf tht pover to repreee» thc Internationa] Dapoaltary Authority ar oí authoriacd oflicial(t):Dtte: 1994-05-19 1 r»·. bi.i. c i f j> 83 816 ΕΡ Ο 713 529/ΡΤ 34

SEQ ID ΝΟ. 1 TIPO DE SEQUÊNCIA: Sequência de ácido nucleico DESIGNAÇÃO E ORIGEM: ADN de MP-52 COMPRIMENTO: 2703 nucleótidos

GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGAAGTATTTTCACTGGAAAGGATTCAAAACTA

GGGGGAAAAAAAAACTGGAGCACACAGGCAGCATTACG C CATT CTT C CTT CTTGGAAAAA

TCCCTCAGCCTTATACAAGCCTCCTTCAAGCCCTCAGTCAGTTGTGCAGGAGAAAGGGGG

CGGTTGGCTTTCTCCTTTCAAGAACGAGTTATTTTCAGCTGCTGACTGGAGACGGTGCAC gtctggatacgagagcatttccactatgggactggatacaaacacacacccggcagactt

CAAGAGTCTCAGACTGAGGAGAAAGCCTTTCCTTCTGCTGCTACTGCTGCTGCCGCTGCT TTTGAAAGTCCACTCCTTTCATGGTTTTTCCTGCCAAACCAGAGGCACCTTTGCTGCTGC CGCTGTTCTCTTTGGTGTCATTCAGCGGCTGGCCAGAGGATGAGACTCCCCAAACTCCTC ACTTTCTTGCTTTGGTACCTGGCTTGGCTGGACCTGGAATTCATCTGCACTGTGTTGGGT GCCCCTGACTTGGGCCAGAC-ACCCCAGGGGACCAGGCCAGGATTGGCCAAAGCAGAGGCC AAGGAGAGGCCCCCCCTGGCCCGGAACGTCTTGAGGCCAGGGGGTCACAGCTATGGTGGG GGGGCCACCAATGCCAATGCCAGGGCAAAGGGAGGCACCGGGCAGACAGGAGGCCTGACA CAGCCCAAGAAGGATGAACCCAAAAAGCTGCCCCCCAGACCGGGCGGCCCTGAACCCAAG C CAGGACAC C CT CC C CAAACAAGGCAGG CTACAGCC CGGACTGTGAC C C CAAAAGGACAG CTTCCCGGAGGCAAGGCACCCCCAAAAGCAGGATCTGTCCCCAGCTCCTTCCTGCTGAAG AAGGCCAGGGAGCCCGGGCCCCGACGAGAGCCCAAGGAGCCGTTTCGCCCACCCCCCATC ACACCCCACGAGTACATGCTCTCGCTGTACAGGACGCTGTCCGATGCTGACAGAAAGGGA GGCAACAGCAGCGTGAAGTTGGAGGCTGGCCTGGCCAACACCATCACCAGCTTTATTGAC AAAGGGCAAGATGACCGAGGTCCCGTGGTCAGGAAGCAGAGGTACGTGTTTGACATTAGT GCCCTGGAGAAGGATGGGCTGCTGGGGGCCGAGCTGCGGATCTTGCGGAAGAAGCCCTCG GACACGGCCAAGCCAGCGGCCCCCGGAGGCGGGCGGGCTGCCCAGCTGAAGCTGTCCAGC TGCCCCAGCGGCCGGCAGCCGGCCTCCTTGCTGGATGTGCGCTCCGTGCCAGGCCTGGAC GGATCTGGCTGGGAGGTGTTCGACATCTGGAAGCTCTTCCGAAACTTTAAGAACTCGGCC CAGCTGTGCCTGGAGCTGGAGGCCTGGGAACGGGGCAGGGCCGTGGACCTCCGTGGCCTG GGCTTCGACCGCGCCGCCCGGCAGGTCCACGAGAAGGCCCTGTTCCTGGTGTTTGGCCGC AC CAAGAAACGGGACCTGTTCTTTAATG AGATT AAGG CCCGCTCTGGC CAGGACGATAAG 35 83 816 ΕΡ Ο 713 529/ΡΤ

ACCGTGTATGAGTACCTGTTCAGCCAGCGGCGAAAACGGCGGGCCCCACTGGCCACTCGC

CAGGGCAAGCGACCCAGCAAGAACCTTAAGGCTCGCTGCAGTCGGAAGGCACTGCATGTC

AACTTCAAGGACATGGGCTGGGACGACTGGATCATCGCACCCCTTGAGTACGAGGCTTTC

CACTGCGAGGGGCTG7GCGAGTTCCCATTGCGCTCCCACCTGGAGCCCACGAATCATGCA GTCATCCAGACCCTGATGAACTCCATGGACCCCGAGTCCACACCACCCACCTGCTGTGTC-

CCCACGCGGCTGAGTCCCATCAGCATCCTCTTCATTGACTCTGCCAACAACGTGGTGTAT

AAGCAGTATGAGGACATGGTCGTGGAGTCGTGTGGCTGCAGGTAGCAGCACTGGCCCTCT

GTCTTCCTGGGTGGCACATCCCAAGAGCCCCTTCCTGCACTCCTGGAATCACAGAGGGGT

CAGGAAGCTGTGGCAGGAGCATCTACACAGCTTGGGTGAAAGGGGATTCCAATAAGCTTG

CTCGCTCTCTGAGTGTGACTTGGGCTAAAGGCCCCCTTTTATCCACAAGTTCCCCTGGCT

GAGGATTGCTGCCCGTCTGCTGATGTGACCAGTGGCAGGCACAGGTCCAGGGAGACAGAC

TCTGAATGGGACTGAGTCCCAGGAAACAGTGCTTTCCGATGAGACTCAGCCCACCATTTC

TCCTCACCTGGGCCTTCTCAGCCTCTGGACTCTCCTAAGCACCTCTCAGGAGAGCCACAG

GTGCCACTGCCTCCTCAAATCACATTTGTGCCTGGTGACTTCCTGTCCCTGGGACAGTTG

AGAAGCTGACTGGGCAAGAGTGGGAGAGAAGAGGAGAGGGCT7GGATAGAGTTGAGGAGT

GTGAGGCTGTTAGACTGTTAGATTTAAATGTATATTGATGAGATAAAAAGCAAAACTGTG

CCT

SEQ ID NO. 2 TIPO DE SEQUÊNCIA: Sequência de aminoácidos DESIGNAÇÃO E ORIGEM: Proteína de MP-52 COMPRIMENTO: 501 aminoácidos MRLPXLLTFL LWYLAWLDLE FICTVLGAPD

PPLARNVPR? PGGPEPKPGH EPGPPREPXE TITSFIDKGQ XPAAPGGGRA RNFXNSAQLC RDLFFNEIXA SRXALEVNFX TLMNSMDPES

Lisboa, 29

GGHSYGGGAT

PPQTRQATAR

PFRPPPITPE

DDRGPWRKQ

AQLXLSSCPS

LELEAWERGR

RSGQDDKTVY

DMGWDDWIIA

TPPTCCVPTR MAR. 2000

NANARAXGGT

TVTPKGQLPG

EYKLSLYRTL

RYVFDISALE

GRQPASLLDV

AVDLRGLGFD

EYLFSQRRXR

PLEYEAFECE

LSPISILFID

LGQRPQGTR? GQTGGLTQPK GKAPPKAGSV SDADRXGGNS K DGLLGAExiR RSVPGLDGSG RAARQVEEKA RAPLATRQGK GLCEFPLRSH SANNWYKQY

GZiAXAEAXER KDEPXXLPPR ? S SFLLKKAR SVKLEAGLAN ILRKKPSDTA WEVFDIWKLF LFLVFGRTXX RPSKNLKARC LEPTNEAVIQ EDMWESCGC

R

Por BIOPHARM GESELLSCHAFT ZUR BIOTECHNOLOGISCHEN ENTWICKLUNG VON PHARMAKA mbH - O AGENTE OFICIAL -

Claims (12)

1. 83 816 ΕΡ Ο 713 529/ΡΤ 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Molécula de ADN que codifica uma proteína da família TGF-β e que consiste numa das sequências de ADN seguintes: a) Os nucleótidos 1783 - 2142 ou 640 a 2142 de SEQ ID NO. 1, b) Uma sequência nucleotídica que corresponde às sequências de a) nos limites da degeneração do código genético, c) Um derivado alélico de uma sequência nucleotídica que corresponde a uma das sequências de a) e b), ou d) Uma sequência nucleotídica que hibrida com uma das sequências de a), b) ou c) em condições de hibridação rigorosas, com a condição de que uma molécula de ADN de acordo com d) contenha, pelo menos, a poção completa que codifica uma proteína madura da família TGF-β e que a sequência nucleotídica não seja totalmente complementar de SEQ ID NO. 1.
2. 2. Vector, caracterizado por conter, pelo menos, uma cópia de uma molécula de ADN de acordo com a reivindicação 1.
3. 3. Célula hospedeira, caracterizada por ter sido transformada com um ADN de acordo com a reivindicação 1 ou com um vector de acordo com a reivindicação 2.
4. 4. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 3, caracterizada por ser uma bactéria, um fungo ou uma célula vegetal ou animal.
5. 5. Proteína da família TGF-β que é codificada por uma sequência de ADN de acordo com a reivindicação 1.
6. 6. Proteína de acordo com a reivindicação 5, caracterizada por apresentar a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO. 2 ou, eventualmente, partes funcionais da mesma.
7. 7. Processo para a fabricação de uma proteína da família TGF-β, caracterizado por se cultivar uma célula hospedeira de acordo com a reivindicação 3 ou 4 e se obter a proteína de TGF-β a partir da célula e/ou do sobrenadante da cultura. 83 816 EPO 713 529/PT 2/2
8. 8. Preparação farmacêutica caracterizada por conter, pelo menos, uma proteína de acordo com a reivindicação 5 ou 6 como substância activa, se for necessário juntamente com substâncias transportadoras, adjuvantes, diluentes ou de enchimento farmaceuticamente usuais.
9. 9. Preparação farmacêutica de acordo com a reivindicação 8, caracterizada por a substância activa ter sido aplicada num material de matriz nativo ou sintético e/ou estar integrada no mesmo.
10. 10. Preparação farmacêutica de acordo com a reivindicação 9, caracterizada por o material de matriz ser um material poroso biocompatível e biologicamente degradável in vivo.
11. 11. Preparação farmacêutica de acordo com uma das reivindicações 8 a 10 para o tratamento ou prevenção de lesões dos ossos, da cartilagem, da pele, das mucosas, do epitélio ou dos dentes, para aplicação em implantes dentários e para aplicação em processos vulnerários e de reconstituição de tecidos.
12. 12. Anticorpos ou fragmentos de anticorpos, caracterizados por se ligarem a uma proteína de acordo com a reivindicação 5 ou 6. Lisboa, 29 ΜΛίϊ. 2000 Por BIOPHARM GESELLSCHAFT ZUR BIOTECHNOLOGISCHEN ENTWICKLUNG VON PHARMAKA mbH - O AGENTE OFICIAL -

    ENG.e ANTÓNIO JO© DA CUNHA FERREIRâ! Ag. Of. Pr. Ind. Rmq das Flores, 74 - 4.° 1EQO LISBOA o ADJUNTO