CZ288795B6

CZ288795B6 - Molekula DNA, vektor, buňka, protein, způsob jeho výroby, farmaceutický prostředek s jeho obsahem a protilátky

Info

Publication number: CZ288795B6
Application number: CZ1996357A
Authority: CZ
Inventors: Gertrud HÖTTEN; Helge Neidhardt; Michael Paulista
Original assignee: Biopharm Gesellschaft Zur Biotechnologischen Entwi
Priority date: 1993-08-10
Filing date: 1994-08-09
Publication date: 2001-09-12
Also published as: ATE189475T1; NZ271376A; CN1129013A; US5994094A; ES2142953T3; JP3795068B2; CA2169171A1; HU219504B; EP0713529B1; TW448183B; AU7498694A; CA2169171C; AU688362B2; WO1995004819A1; HUT74271A; JP2006083178A; PT713529E; MX9406061A; EP0713529A1; CZ35796A3

Abstract

eÜen se t²k nov ho r stov -diferencia n ho proteinu skupiny TGF-.beta., postupu v²roby DNA, kter ho k duje, vektoru a produk n bu ky, farmaceutick ho prost°edku s obsahem tohoto proteinu a protil tky.\

Description

Řešení se týká nového růstově-diferenciačního proteinu skupiny TGF-β, postupu výroby DNA, která ho kóduje, vektoru a produkční buňky, farmaceutického prostředku s obsahem tohoto proteinu a protilátky.

Molekula DNA, vektor, buňka, protein, způsob jeho výroby, farmaceutický prostředek s jeho obsahem a protilátka

Oblast techniky

Vynález se týká nově růstově - diferenciačního faktoru skupiny TGF-β a sekvencí DNA, které ho kódují.

Dosavadní stav techniky

Skupina růstových faktorů TGF-β, ke kterým patří proteiny, příbuzné BMP, TGF a inhibinu (Roberts a Spom, Handbook of Experimental Pharmacology 95 (1990), 419 - 472), je významná zvláště pro široký okruh lékařských léčebných metod a použití. Tyto faktory jsou užitečné u postupů, které se týkají hojení ran a obnovy tkání. Větší počet členů skupiny TGF-β dále indukuje růst tkání, zvláště růst kostí, a hraje proto klíčovou úlohu při indukci vývoje chrupavek a kostí.

Wozney (Progress in Growth Factor Research 1 (1989), 267 - 280) a Vale a další (Handbook of Experimental Pharmacology 95 (1990), 211-248) popisují různé růstové faktory, jako ty, které jsou příbuzné s BMP (proteiny morfogeneze kostí) a se skupinou inhibinu. Členy těchto skupin vykazují významnou strukturální podobnost. Prekurzor proteinů se skládá ze signální sekvence na aminovém konci, propeptidu a sekvence přibližně 110 aminokyselin na karboxylovém konci, která po odštěpení zprekurzoru představuje zralý protein. Jejich členy jsou dále definovány homologií sekvence aminokyselin. Zralý protein obsahuje nejvíce zachované sekvence, zvláště sedm cysteinových zbytků, které jsou zachovány u členů skupin. Proteiny typu TGF-β jsou vícefunkční, hormonálně aktivní růstové faktory. Mají také podobné biologické účinky, jako chemotaktické přitahování buněk, podpora diferenciace buněk a schopnosti indukovat tkáň, jako chrupavky a kosti. US patentový spis č. 5 013 649 popisuje sekvence DNA, které kódují osteoinduktivní proteiny, označované jako BMP-2, a US patentové přihlášky sériových čísel 179 101 a 170 197 popisují proteiny typu BMP BMP-1 a BMP-3. Syntetizovat proteiny typu TGF-β je schopno mnoho typů buněk a receptory pro TGF-β mají prakticky všechny buňky.

Vesměs mají tyto proteiny rozdíly ve struktuře, což vede ke značné variabilitě jejich přesné funkce. Dají se nalézt v širokém okruhu tkání rozdílných druhů a vývojových stupňů. Mohou se tudíž lišit co se týče jejich přesné funkce, např. fyziologického prostředí buňky, které vyžadují, doby života, cílového místa, potřebu pomocných faktorů a jejich odolností proti odbourávání. I když je popsáno mnoho proteinů, které jsou schopny indukce tkáně, zvláště indukce kostí, je ještě nutno podrobně prozkoumat jejich přirozené úlohy v organismu a - což je ještě důležitější jejich lékařský význam. Předpokládá se, že se u vysokých pravděpodobností vyskytují dosud neznámé látky ze skupiny TGF-β, které mají význam pro osteogenezi nebo diferenciaci/indukci jiných druhů tkání. Velká obtížnost izolace těchto nových proteinů ze skupiny TGF-β je v tom, že jejich funkce nelze dostatečně přesně popsat na to, aby se dal vyvinout biologický test, schopný dostatečného rozlišení. Na druhé straně je očekávaná homologie nukleotidové sekvence příliš nízká na to, aby umožňovala screening klasickými hybridizačními technikami nukleových kyselin. Proto je naléhavě žádána další izolace a charakterizace nových proteinů typu TGF-β, aby bylo možno připravit další indukční a diferenciační proteiny, které splňují požadavky medicíny. Tyto faktory by mohly najít lékařské použití při léčbě úrazů a degenerativních onemocnění kostí a jiných tkání, jako např. ledvin nebo jater.

V patentové přihlášce PCT/EP 93/00350 zveřejněné jako EP-A-0625989 je udána sekvence nukleotidů a aminokyselin pro protein TGF-β MP-52, a to sekvence, odpovídající zralému peptidu a větší části propeptidu MP-52. Úplná sekvence propeptidu MP-52 zveřejněna není.

-1 CZ 288795 B6

Podstata vynálezu

Podstatu předkládaného vynálezu tvoří příprava sekvencí DNA, které kódují nové členy skupiny TGF-β proteinů s mitogenní a/nebo diferenciačně-induktivními, např. osteoinduktivní schopností. Úkolem předkládaného vynálezu je zvláště připravit úplnou sekvenci DNA a aminokyselin TGF-proteinu MP-52.

Tato úloha je řešena molekulou DNA, která kóduje protein ze skupiny TGF-β a která zahrnuje

a) část kódující zralý protein, a v případě potřeby navíc signální a/nebo propeptidovou část nukleotidové sekvence označené jako SEKVENCE 1,

b) nukleotidovou sekvenci, odpovídající sekvenci podle a) v rámci degenerace genetického kódu,

c) nukleotidovou sekvenci, odpovídající alelickému derivátu jedné ze sekvencí podle a) a b), nebo

d) sekvenci, hybridizující za stringentních podmínek s jednou ze sekvencí podle a), b) nebo c) za předpokladu, že molekula DNA podle d) obsahuje alespoň tu část sekvence kódující protein, který je schopen vykonávat biologickou funkci zralého proteinu skupiny TGF-β.

Další provedení předkládaného vynálezu se týkají předmětu nároků 2 až 10. Další znaky a přednosti vyplývají z popisu výhodných provedení a z výkresů.

Předkládaný vynález zahrnuje alespoň tu část sekvence nukleotidů, ukázanou v protokolu SEKVENCE 1, která kóduje úplný protein a popř. další funkční část této nukleotidové sekvence, které této sekvenci odpovídají v rámci degenerace genetického kódu, a alelické deriváty takových sekvencí. Dále zahrnuje předkládaný vynález také sekvence, hybridizující s těmito sekvencemi, za předpokladu, že taková molekula DNA úplně obsahuje alespoň tu část, která kóduje úplný protein skupiny TGF-β.

Pojem „funkční část“ ve smyslu předkládaného vynálezu znamená část proteinu, která je schopna působit jako např. signálový peptid, propeptid nebo zralý protein, to znamená plnit alespoň jednu z biologických funkcí přirozené části proteinu MP-52.

Oblast protokolu SEKVENCE 1, ve které je kódována úplná část proteinu, je v rozmezí nukleotidů 1783 - 2142. Molekula DNA může popř. zahrnovat ještě další funkční část sekvence, popsané protokolem SEKVENCE 1, totiž sekvence nukleotidů, kódující signálovou nebo/a propeptidovou část. Zvláště výhodně zahrnuje molekula DNA sekvenci pro signálovou nebo propeptidovou část a část zralého proteinu, to znamená nukleotidy 640 - 2142 v protokolu SEKVENCE 1. Na druhé straně může molekula DNA vedle části, kódující zralý protein, obsahovat také ještě funkční části signálových nebo/a propeptidových částí jiných proteinů, zvláště jiných proteinů ze skupiny TGF-β, např. výše uvedené BMP-proteiny. Odpovídající nukleotidové sekvence je třeba vybírat z výše uvedených referencí, na jejichž znění se tímto odvolává.

Dále zahrnuje předkládaný vynález také molekulu DNA, jak je definována výše, která obsahuje navíc mezi nukleotidy 1270 a 1271 protokolu SEKVENCE 1 nekódující introvenovou sekvenci. Tato intronová sekvence je obsažena vplazmidu SKL 52 (H3) MP12, uložené vDSM, jehož genom má nukleotidovou sekvenci proteinu MP-52.

-2CZ 288795 B6

Vynález také zahrnuje cDNA sekvenci proteinu MP-52, kódovanou fágem λ 15.1. Tato sekvence začíná nukleotidem 321 podle protokolu SEKVENCE 1.

Ačkoliv vykazují alelické, degenerované a hybridizovatelné sekvence, které vynález zahrnuje, strukturní rozdíly na základně nepatrných změn v nukleotidové nebo/a aminokyselinové sekvenci, mají proteiny, kódované takovými sekvencemi, v podstatě stejné užitné vlastnosti, které umožňují jejich použití ve v zásadě stejných lékařských aplikacích.

Podle předkládaného vynálezu znamená termín „hybridizace“ obvyklé podmínky hybridizace, s výhodou podmínky s koncentrací soli 6 x SSC při 62 až 66 °C, následované jednohodinovým praním s 0,6 x SSC, 0,1 % SDS při 62 až 66 °C. Zvláště výhodně se týká termín „hybridizace“ těsných (stringent) podmínek hybridizace s koncentrací soli 4 x SSC při 62 až 66 °C, následované jednohodinovým praním s 0,1 x SSC, 0,1 % SDS při 62 až 66 °C.

Výhodné formy provedení předkládaného vynálezu jsou sekvence DNA, jak je definováno výše, které se dají získat z obratlovců, s výhodou savců, jako prasat, krav a hlodavců, jako krys nebo myší, a zejména z primátů, jako lidí.

Zvláště výhodným provedením vynálezu je sekvence, uvedená v protokolu SEKVENCE 1 a označená jako MP-52. Transkripty MP-52 byly získány z embryonální tkáně a kódují protein, který vykazuje značnou homologii aminokyselin k zralé části proteinů typu BMP (viz obr. 1). Sekvence proteinů BMP2 (=BMP2A) a (BMP4) (=BMP2B) jsou popsány ve: Wozney a další, Science 242 (1988), 1528 - 1534. Odpovídající sekvence BMP5, BMP6 a BMP7 jsou popsány u: Celeste a další, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87 (1990), 9843 - 9847. Několik typických homologii sekvencí, specifických pro známé sekvence BMP, bylo nalezeno také v propeptidové části MP52, zatímco jiné části prekurzorového dílu MP-52 se podstatně od prekurzorů BMP liší.

Dalším předmětem předkládaného vynálezu je vektor, který obsahuje alespoň jednu kopii molekul DNA podle vynálezu. V takovém vektoru je sekvence DNA podle vynálezu s výhodou operativně spojena se sekvencí, která řídí expresi. Takové vektory se hodí pro výrobu proteinů typu TGF-β ve stabilně nebo přechodně transformovaných buňkách. Pro transformaci a následnou kultivaci je možno použít různých systémů, jako zvířecích, rostlinných, houbových a bakteriálních. S výhodou obsahují vektory podle vynálezu sekvence, nutné pro replikaci v hostitelských buňkách a jsou autonomně replikovatelné. Dále je výhodné použití vektorů, které obsahují markerové geny, podléhající sekvenci, čímž je možno prokázat transformaci hostitelské buňky.

Dalším předmětem vynálezu je hostitelská buňka, která je transformována DNA podle vynálezu nebo vektorem podle vynálezu. Příklady vhodných hostitelských buněk zahrnují různé eukaryotické a prokaryotické buňky, jako E. coli, hmyzí buňky, rostlinné buňky, savčí buňky a houby, jako jsou kvasinky.

Dalším předmětem vynálezu je protein skupiny TGF-β, kódovaný sekvencí DNA podle nároku 1. S výhodou má protein podle vynálezu sekvenci aminokyselin, popsanou v protokolu SEKVENCE 2, nebo popř. její funkční částí, a má biologické vlastnosti, jako schopnost indukce tkání, zvláště osteoindukční nebo/a mitogenní schopnost, které mají možné terapeutické možnosti. Výše uvedené znaky proteinů mohou kolísat v závislosti na tvorbě homodimerů nebo heterodimerů. Takové struktury mohou být rovněž vhodné pro klinické účely.

Biologické vlastnosti proteinů podle vynálezu, zejména mitogenní a osteoinduktivní schopnosti, mohou být např. určovány testy podle: Seyedin a další. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 82 (1984), 2267 - 2271 nebo Sampath a Reddi, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 78 (1981), 7599-7503.

Dalším předmětem předkládaného vynálezu je způsob výroby proteinu skupiny TGT-β, vyznačující se tím, že se kultivují hostitelské buňky, transformované DNA podle vynálezu nebo

-3CZ 288795 B6 vektorem podle vynálezu a TGF-β protein se získá z buňky nebo/a supematantu z kultury. Takový způsob zahrnuje kultivaci transformovaných hostitelských buněk ve vhodném kultivačním médiu a čištění vyprodukovaných proteinů skupiny TGF-β. Touto cestou umožňuje způsob podle vynálezu výrobu dostatečného množství žádaného proteinu pro použití při léčení nebo pro použití v technikách buněčných kultur, při kterých jsou nutné růstové faktory. Hostitelskou buňkou může být bakterie, jako Bacillus nebo E. coli, houba, jako např. kvasinka, rostlinná buňka, jako např. tabák, brambor nebo Arobidopsis nebo zvířecí buňka, zvláště savčí buněčná linie, jako např. buněčné linie Mo, COS nebo CHO nebo hmyzí buněčná linie.

Dalším předmětem předkládaného vynálezu je příprava prostředků, které obsahují jako účinnou složku farmaceuticky účinné množství proteinů skupiny TGF-β podle vynálezu. Takový prostředek popřípadě obsahuje ještě z farmaceutického hlediska přijatelnou nosnou, pomocnou zřeďovací nebo plnicí látku. Takový farmaceutický prostředek se může použít při hojení ran nebo obnově tkání, jakož i při léčení poškození kostí, chrupavek, vazivové tkáně, kůže, sliznice, epitelií nebo zubů a při zubních implantátech, buď samostatně nebo v kombinaci s jinými účinnými látkami, např. jinými proteiny ze skupiny TGF-β nebo růstovými faktory, jako EGF (epidermální růstový faktor) nebo PDGF (růstový faktor, odvozený z destiček). Dále může být použit takový farmaceutický prostředek při prevenci onemocnění, jako např. k prevenci osteoporózy a artrózy.

Dalším možným klinickým použitím TGF-β proteinů podle vynálezu je použití jako supresor imunitní reakce ke snížení odhojování tranplantátů orgánů nebo v souvislosti s angiogenezí. Farmaceutický prostředek podle vynálezu může být také použit profylakticky nebo v kosmetické chirurgii. Dále není použití přípravku omezeno na člověka, ale může zahrnovat i zvířata, zvláště domácí.

Konečně je dalším předmětem vynálezu protilátka, která se může specificky vázat na proteiny podle vynálezu, nebo fragment takové protilátky (např. Fab nebo Fab'). Způsob výroby takové specifické protilátky nebo fragmentu protilátky je průměrnému odborníku v oboru všeobecně znám. S výhodou je takovou látkou monoklonální protilátka. Takové protilátky nebo fragment protilátky je možno použít také pro diagnostické metody.

Přehled obrázků na výkresech

Nyní následuje krátký popis protokolů sekvencí a obrázků.

SEKVENCE 1 ukazuje úplnou sekvenci nukleotidů DNA, kódující TGF-β protein MP-52. Startovací kodon ATG začíná nukleotidem 640. Start úplného proteinu začíná za nukleotidem 1782.

SEKVENCE 2 ukazuje úplnou sekvenci aminokyselin TGF-β proteinu MP-52, odvozenou ze sekvence nukleotidů SEKVENCE 1.

Obr. 1 ukazuje porovnání sekvence aminokyselin MP-52 s některými členy skupiny BMPproteinů se začátkem na prvním z konzervovaných zbytků cysteinu.

* znamená, že je aminokyselina ve všech porovnávaných proteinech stejná, + znamená, že je aminokyselina stejná alespoň v jednom proteinu ve srovnání s MP-52.

Obr. 2 ukazuje sekvenci nukleotidů oligonukleotidových primerů, které byly používány v předkládaném vynálezu, a porovnání těchto sekvencí se známými členy skupiny TGF-β.

M znamená A nebo C,

S znamená C nebo G,

-4CZ 288795 B6

R znamená A nebo G a

K znamená G nebo T.

Obr. 2a ukazuje sekvenci primeru OD.

Obr. 2b ukazuje sekvenci primeru OID.

Vynález bude dále znázorněn následujícími příklady.

Příklad provedení vynálezu

Příklad 1

Izolace MP-52

1.1 Celková RNA byla izolována z lidské embryonální tkáně (8-9 týdnů staré) metodou podle: Chirgwin a další, Biochemistry 18 (1979), 5294 - 5299. Z celkové RNA byla oddělena póly (A+) RNA oligo (dT) chromatografií podle předpisů výrobce (kolony Strategene Póly (A) Quick).

1.2 Pro provedení reverzní transkripce bylo zahříváno 1 až 2,5 pg póly (A+)RNA 5 minut při 65 °C a rychle ochlazeno v ledu. Reakční směs obsahuje 27 U RNA-Guard (Pharmacia), 2,5 pg Oligo (dT) 12-18 (Pharmacia), 5x pufr (250 mmol/1 Tris/HCll pH 8,5, 50 mmol/1 mgCl₂, 50 mmol/1 DTT, 5 mmol/1 od každého dNTP, 600 mmol/1 K.C1) a 20 U reverzní transkriptázy (AMW Boehringer Mannheim) na pg póly (A+) RNA. Reakční směs (25 pl) byla inkubována 2 hodiny při teplotě 42 °C.

1.3 Na automatickém syntetizátoru DNA (Biosearch) byly připraveny deoxynukleotidové primery OD a OID, zobrazené na obr. 2. Následovalo čištění denaturační polyakrylamidovou elektroforézou a izolace hlavního pruhu z gelu izotachoforézou. Oligonukleotidy byly navrženy srovnáním sekvencí nukleových kyselin známých členů skupiny TGF-β a výtěrem nejkonzervovanějších oblastí. Porovnání této oblasti je ukázáno na obr. 2. Pro usnadnění obsahovaly oba nukleotidy restrikční místa EcoRI a OD navíc obsahovat na 5'-koncÍ jedno restrikční místo Ncol.

1.4 Pro PCR reakci bylo použito 20 ng cDNA, odpovídající poly(A+) RNA z výchozího materiálu. Reakce byla provedena v objemu 50 pl a obsahovala 1 x pufr PCR (16,6 mmol/ (NH4/SO4, 67 mmol/1 Tris/HCl pH 8,8, 2 mmol/1 mgCl₂, 6,7 pmol/1 EDTA, 10 mmol/1 βmerkaptoethanolu, 170 pg/1 bovinního sérového albuminu (Gibco), 200 pmol/1 od každého dNTP (Pharmacia), 30 pmol každého oligonukleotidu (OD a OID) a 1,5 U Taq polymerázy (AmpliTaq, Perkin Elmer Cetus). Reakční směs byla převrstvena parafínem a bylo provedeno 40 cyklů PCR. Produkty PCR reakce byly vyčištěny fenol/chloroformovou extrakcí a zakoncentrovány srážením ethanolem.

1.5 Reakční produkt PCR byl štěpen restrikčními enzymy Sphl (Pharmacia) a AlwNI (Bilabs) podle předpisů výrobce.

1.6 Produkty restrikčního štěpení byly děleny elektroforézou na agarosovém gelu. Po obarvení ethidiumbromidem byly nerozštěpené produkty amplifikace vyříznuty z gelu a izolovány extrakcí fenolem. Získaná DNA byla poté dvakrát přečištěna fenol/chloroformovou extrakcí.

-5CZ 288795 B6

1.7 Po srážení ethanolem byla čtvrtina nebo pětina izolované DNA opakovaně amplifikována za stejných podmínek jako při první amplifikaci, ale počet cyklů byl snížen na 13. Produkty amplifikace byly vyčištěny, štěpeny stejnými enzymy jako je uvedeno výše, obarveny a izolovány z agarosového gelu. Opakovaná amplifikace byla opakována dvakrát.

1.8 Po poslední izolaci z gelu byly produkty amplifikace štěpeny 4U EcoRI (Pharmacia) za podmínek, doporučených výrobcem. Čtvrtina restrikční směsi byla igována do vektoru pBluescriptlI SK + (Strategene), který byl rozštěpen EcoRI. Po ligaci bylo 24 klonů dále analyzováno sekvenací. Vzorek, štěpený AlwNI a Sphl, poskytl novou sekvenci, která byla označena jako MP-52. Další klony obsahovaly převážně sekvence BMP-6 a jeden obsahoval sekvenci BMP-7.

Klon byl doplněn ke 3'-konci cDNA metodou, důkladně popsanou Frohmannem (Amplifications, uveřejněno společností Perkin Elmer Corp., 5. vydání (1990), str. 11 - 15). Stejná embryonální mRNA, která byla použita pro izolaci prvního fragmentu MP-52, byla podrobena reverzní transkripci, jak bylo popsáno výše. Amplifikace následovala při použití adaptérového primeru (AGAATTCGCATGCCATGGTCGACG) a vnitřního primeru (CTTGAGTACGAGGCTTTCCACTG) v sekvenci MP-52. Produkty amplifikace byly znovu amplifikovány za pomoci překrývajícího se adaptérového primeru (attcgcatgccatggtcgacgaag) a překrývajícího se vnitřního primeru (GGAGCCCACGAATCATGCAGTCA) sekvence MP-52. Produkty této amplifikace byly klonovány a sekvenovány po restrikčním štěpení Ncol ve stejným způsobem rozštěpeném vektoru (pUC19, (Pharmacia Nr. 27—4951—01) se změněným vícenásobným klonovacím místem, které obsahuje jediné restrikční místo Ncol). Klony byly charakterizovány překrytím jejich sekvence na 3'-konci známé sekvence MP-52. Jeden z nich byl použit jako sonda pro screening lidské genomické banky (Strategene Nr. 946203) podle metody, podrobně popsané u: Ausubel a další (Current Protocols in Molecular Biology, uveřejněno Greene Publishing Associates a Wiley-interscience (1989)). Z 8 x 10⁵ fágů λ byl izolován fág (λ 2.7.4), který obsahoval inzert o velikosti 20 kb, a byl uložen vDSM pod depozitním číslem 7387. Tento klon obsahoval na 5'-konci kromě sekvence, izolované z mRNA popsanými amplifíkačními metodami, další informace o sekvenci. Pro analýzu sekvence byl subklonován fragment Hind III o velikosti přibližně 7,5 kb do stejným způsobem rozštěpeného vektoru (Bluescipt SK, Stratagene Nr. 212206). Tento plazmid, označený SKL 52 (H3) MP 12 byl rovněž uložen vDSM pod depozitním číslem 7353. Informace o sekvenci, ukázaná v protokolu SEKVENCE 1 pochází z fágu λ 2.7.4. Triplet ATG na pozici 640 je první ATG uvnitř čtecího rámce (u pozice 403 se vyskytuje zakončovací kodon). Na základě sekvenčních dat je možno se domnívat, že se zde jedná o startovací kodon pro translaci.

Genomická DNA obsahuje mezi páry bází 1270 a 1271 SEKVENCE 1 intron o velikosti přibližně 2 kb. Sekvence intronu není ukázána. Správnost místa spojení byla potvrzena sekvenováním amplifikačního produktu, pocházejícího z cDNA, která obsahovala jednu z těchto oblastí. Tato informace o sekvenci byla získána pomocí poněkud modifikované metody, která je podrobně popsána u: Frohmann (Amplifications, uveřejněno společností Perkin Elmer Corp., 5. vydání (1990), str. 11-15). Byla reverzně transkribována stejná embryonální RNA, která byla také použita k izolaci 3'-konce MP-52, za použití vnitřního primeru sekvence MP-52 (ACAGCAGGTGGGTGGTGTGGACT), orientovaného ve směru 5'. PolyA - zakončení bylo na 5'-konec prvního řetězce cDNA připojeno terminální transferázou. Byla provedena amplifikace ve dvou krocích, nejprve použitím primeru, sestávajícího zoligo dT a adaptérové sekvence (AGAATTCGCATGCCATGGTCGACGAAGC(T16)) a potom adaptérového primeru (AGAATTCGCATGCCATGGTCGACG) a vnitřního primeru (CCAGCAGCCCATCCTTCTCC) sekvence MP-52. Amplifikační produkty byly znovu amplifikovány za použití stejného adaptérového primeru a překrývajícího se vnitřního primeru (ACCAGGGCACTAATGTCAAACACG) sekvence MP-52. Produkty nové amplifikace byly potom dále amplifikovány za použití překrývajícího se adaptérového primeru (ATTCGCATGCCATGGTCGACGAAG) a překrývajícího se vnitřního primeru (ACTTATGTCAAACACGTACCTCTG) sekvence MP-52.

-6CZ 288795 B6

Konečné produkty amplifíkace byly klonovány hladkými konci do vektoru (Bluescript SK, Stratagene Nr. 212206), štěpeného EcoRV. Klony byly charakterizovány překrýváním jejich sekvence s DNA λ 2.7.4.

Dále byla podrobena screeningu banka cDNA, vytvořená z lidských fibroblastů a klonovaná do λ gtlO. Přitom bylo testováno 2 x 106 fágů, přičemž jako radioaktivní sonda sloužil přibližně 1 kb velký fragment genomické MP-52 DNA (2. exon až k restrikčnímu místu HindlII v 3'nepřekládané oblasti). Bylo odpíchnuto 17 směsných plaků, které byly testovány PCR za použití primerů z 5'-oblasti a 3'-oblasti sekvence MP-52. Bylo vybráno a odděleno 8 plaků. cDNA byla z fágů izolována částečným štěpením EcoRI a klonována do stejným způsobem štěpeného vektoru Bluescript.

Sekvenování jednoho ze získaných plazmidů SK52L15.1MP52 ukázalo, že nejdelší fág (15.1) začíná u nukleotidu 321 podle SEKVENCE 1. Dále bylo sekvenováním potvrzeno spojovací místo (nukleotid 1270).

Plazmid SKL 52 (H3) MP12 byl pod depozitním číslem 7353 uložen vDSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Mascheroder Weg lb, 38124 Braunschweig) 10. prosince 1992.

Fág λ 2.7.4. byl pod depozitním číslem 7387 uložen v DSM 13. ledna 1993.

Plazmid SK52L15.1MP52 byl pod depozitním číslem 8421 uložen v DSM 16. července 1993.

Příklad 2

Exprese MP-52

Pro expresi MP-52 byly testovány různé systémy. Použití virů vakcinie jako expresního systému je popsáno podrobně a pro odborníka reprodukovatelně v: Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel a další, Greene Publishing Associates a Wiley-Interscience, Wiley & Sons), v následujícím textu zkráceno CP, v kapitole 15 odstavci 16.15 - 16.18. Systém spočívá vtom, že je možno integrovat do viru vakcinie cizí DNA homologní rekombinací. Za tím účelem obsahuje použitý vektor gen pro thymidinkinázu (TK) z genomu vakcinie. Aby byla umožněna selekce rekombinantních virů, obsahuje dále vektor gen E. coli pro xanthin-ganthin-guaninfisforibosyltransferázu (gpt) (Falkner a další, J. Virol. 62 (1988), 1849 - 1854). Do tohoto vektoru byla klonována cDNA s celou kódující oblastí MP-52. cDNA pochází z plazmidů SK52L15.1MP52, (DSM, depozitní číslo 8421), která ale byla nejprve předběžně klonována pro odstranění velké části nepřekládané 5'-oblasti. Ktomu byl plazmid SK52L15.1MP52 linealizován enzymem Sáli a 5'-konec byl postupně deletován podle doporučení výrobce soupravou ExoIII/Mung Beat Kit (Stratagene #200330). Po restrikci BamHI byly molekuly cDNA MP-52, deletované do různé vzdálenosti, odděleny od zbytkového vektoru na agarosovém gelu standardní metodou (Sambrook a další, Molecular Cloning, druhé vydání, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989), klonovány do vektoru pBluescriptlI SK (Stratagene # 212206), restringovaného EcoRV a BamHI (pSK52s). Restrikce byly vesměs prováděny podle údajů výrobce. Sekvenování sekvenázou (USB/Amersham #70770) poskytlo mezi jinými klon, kteiý začíná nukleotidem 576 v SEKVENCI 1 (vzdálený 64 párů bází od startovacího kodonu). Z toho byl restrikčním štěpením Sáli a Sací izolován inzert cDNA a klonován do stejným způsobem štěpeného vektoru pro rekombinací do vakcinie. Výsledný plazmid (pBPlMP52s) byl uložen 24. května 1994 v DSM (pod depozitním číslem 9217) a použit pro produkci rekombinantních virů vakcinie. Ktomu byly z 80% konfluentní buňky 143B (HuTk-ATCC CRL 8303) infikovány v 35 mm kultivačních miskách standardním typem viru vakcinie ve 2 ml PBS za vhodného třepání po dobu 30 minut při pokojové teplotě (1 virus na 10 buněk). Po odsátí

-7CZ 288795 B6 supematantu v přídavku 2 ml kultivačního média (MEM, Gibco BRL #041-01095) probíhala inkubace 2 hodiny při 37 °C. Médium bylo poté odstraněno a buňky transformovány 100 ng pBPlMP52s, 2 pg nosné DNA (telecí thymus, Boehringer Mannheim #104175) a 10 μΐ Lipofektinu (Gibco BRL #18292-011) a l ml MEM 15 hodin při 37 °C. Po přídavku 1 ml MEM s 20% FCS (Gibco BRL #011-06290) byla kultura inkubována dalších 24 hodin při 37 °C a lyžované buňky poté zamraženy.

Selekce gpt na xanthin-guanin-fosforibosyltransferázu a izolace a amplifikace jednotlivých rekombinantních virů probíhala v podstatě jak je popsáno v odstavci 16.17 CP, s tím rozdílem, že byly použity buňky RK-13 (ATCC CCL 37).

Integrace cDNA MP-52 do virového genomu byla potvrzena analýzou metodou dot blotu a Southemova blotu (CP odstavce 16.18). Rekombinantní virus byl použit pro analýzy exprese v buněčné linii 143 B (HuTk-, ATCC CRL 8303, lidská). Konfluentní buňky byly 45 minut při 37 °C infikovány stejným počtem virů a poté bylo přidáno odpovídající kultivační médium (MEM, Gibco BRL #041-01095) s 10% FCS a penicilin/streptomycin (1 :500, Gibco BRL #043-05140H). Po 6 hodinách při 37 °C bylo médium odstraněno, buňky dvakrát promyty např. HBSS (Gibco BRL #042-04180M) a přidáno produkční médium (např. MEM) bez FCS). Po 20 až 22 hodinách produkce byl supematant oddělen. Následovaly analýzy exprese metodou westernového blotu podle standardní metody (CP odstavec 10.8). Za tím účelem byly proteiny z 100 - 500 μί buněčného supematantu vysráženy přidáním ekvivalentního objemu acetonu a inkubací alespoň 1 hodinu v ledu a odcentrifugovány. Po resuspendování tuhé usazeniny vnanášecím pufru (7 M močovina, 1% SDS, 7 mm dihydrogenfosforečnan sodný, 0,01 % bromfenolová modř a popř. 1 % β-merkaptoethanolu) následovalo dělení na 15 % polyakrylamidovém gelu. Jako směs značkovacích proteinů byl použit předem obarvený standard molekulových hmotností proteinů (Gibco BRL #26041-020). Přenos na PVDF membránu a odblokování membrány probíhaly podle standardních metod.

Pro detekci MP-52 na membráně byly vyrobeny polyklonální protilátky proti MP-52 na kuřatech a králících. K tomu byla úplná část MP-52 s 6 histidiny na N konci exprimována v E. coli a vyčištěna, jak je např. popsáno u: Hochuli a další, (BIO/Technology, díl 6, 1321-1325 (1988). S oběma druhy protilátek je možno prokázat specifickou expresi MP-52, přičemž dimery MP-52 jsou rozpoznány s menší účinností než monomery. Pro westernový blot na obr. 3 byly použity kuřecí protilátky, které byly specificky čištěny srážením PEG (Thalley a další, BIO/Technology, díl 8, 934 - 938 (1990)) a přes antigen, navázaný na membránu (úplný MP-52 se 6 histidiny) (18.17 v Sambrook a další, Molecular Cloning, druhé vydání, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989). Jako druhá protilátka byl použit antikuřecí IgG s navázanou alkalickou fosfatázou (Sigma A9171). Detekce byla provedena podle nároku výrobce soupravou Tropix Westem-Light Protein Detection Kit (Serva #WL10RC).

Westernový blot na obr. 3 ukazuje, že pro MP-52 specifické pruhy se objevují jen u rekombinantních virů, ale ne u virů standardního typu (bez integrované cizí DNA). Exprese MP-52 vede k vylučovanému proteinu s molekulovou hmotností na gelu za neredukujících podmínek přibližně 25 kDA. Za redukujících podmínek odpovídá pohyb proteinu na gelu 14 15 kDa. Tyto výsledky ukazují, že je MP-52 exprimován jako dimer úplného proteinu. U slabých pásů na westernovém blotu, které se objevují nad 60 kDa, se pravděpodobně jedná o zbytky nerozštěpeného prekurzorového proteinu. Pohyblivost na gelu potvrzuje navíc molekulové hmotnosti, které je možno odvodit z protokolu SEKVENCE 2, přičemž úplný monomemí protein MP-52 má molekulovou hmotnost 13,6 kDa.

Exprese MP-52 a štěpení prekurzorového proteinu je prokazatelně možné v různých buněčných liniích. Byly testovány buňky Cl27 (ATCC CRL 1616, myš), BHK21 (ATCC CCL 10, křeček), MRC-5 (ATCC CC1 171, člověk) a 3T6-Seiss albino (ATCC CCL 96, myš).

-8CZ 288795 B6

Exprese a štěpení na úplný MP-52 byla ukázána také na dalším eukaryotickém expresním systému. K tomu účelu byla cDNA MP-52 počínaje nukleotidem 576) klonována do expresního plazmidu pSG5 (Stratagene #216201). Plazmid pSK52s byl restrikčně štěpen Clal a Xba I a štěpením přesahujících řetězců inzertu MP-52 T4 polymerázou byly získány tupé konce. Klonování do vektoru pSG5, který byl štěpen EcoRI a tupé konce T4-polymerázou byly vytvořeny podle standardních metod. Všechny enzymatické reakce probíhaly podle údajů výrobce. Správa orientace inzertu MP-52 byla zajištěna restrikční analýzou a sekvenací T7primerem (Startagene #300302). Výsledný plazmid pSG52s (uložen vDSM pod depozitním číslem DSM 9204 dne 17. 5. 1994) může být kotransformován s vektorem, který kóduje selektovatelný markér, jako např. s genem pro rezistenci G418, a získat stabilní buněčné linie. Pro tento účel byl kotransformován podle údajů výrobce pSG52s s plazmidem p3616 (uložen v DSM pod depozitním číslem DSM 9203 17.5. 1994) do buněk L929 (ATCC CCL1, myš) s Lipofektinem (Gibco BRL #18292-011). Následovala sekvence s G418 podle v oboru známých metod (CP, odstavec 9.5 a vedla k buněčné linii, která podle westernového blotu prokazatelně produkuje úplný MP-52.

Další expresní vektor pro MP-52 byl připraven použitím plazmidu pABWN (Niwa a další, Gene 108 (1991), 193-200), který poskytl Dr. Miyazaki.

Ktomu byl izolován z plazmidu pSK52s fragment HindlII, začínají nukleotidem 576 podle SEKVENCE 1 a jeho přesahující konce změněny na tupé konce Klenowovým fragmentem. Ligací adaptérové oblasti byla na oba konce zavedena restrikční místa Notl.

Adaptérová oblast: AGCGGCCGCT

TCGCCGGCGA.

Vektor pABWN byl restrikčně štěpen Xhol, stejným způsobem opracován Klenowovým fragmentem a defosforylován telecí intestinální alkalickou fosfatázou (Boehringer Mannheim). Byl naligován stejný fosforylovaný adaptér, takže bylo možno vložení fragmentu MP-52 po restrikci Notl do vytvořeného Notl místa vektoru. Výsledný expresní vektor byl označen jako HindIII-MP-52/pABWN. Všechny prováděné klonovací reakce byly prováděny podle standardních metod (např. CP odst. 3.16). Struktura expresního vektoru HindIII-MP-52/pABWN byla potvrzena sekvenováním a restrikčním mapováním. HindIII-MP-52/pABWN obsahuje sekvenci MP-52 počínaje nukleotidem 576 a konče nukleotidem 2278 podle SEKVENCE 1.

HindIII-MP-52/ABWN byl transfekován do L-buněk (myší fibroblasty) a byly získány stabilní transformanty. Bylo přidáno vždy 4 pg plazmidu (HindIII-MP-52/pABWN nebo pABWN) do 5 x 10⁵ buněk na 6 cm kultivační misce a s použitím 20 μΐ LipofectAMINE (Gibco BRL #18324— 012) transfekováno. Ktomu byl opatrně smíchán roztok A (4 pg plazmidové DNA ve 200 pl OPTI-MEM I (Gibco BRL #31985) s roztokem B (20 pl LipofectAMINE ve 200 pl a inkubován 45 minut při pokojové teplotě pro vytvoření komplexu DNA-lipošomy. Během toho byly buňky jednou promyje 2 ml OPTI-MEM I. Pro každou transfekci bylo do nádoby s DNA-liposomovým komolexem přidáno 1,6 ml OPTIMEM I. Roztok byl opatrně promíchán a promyté buňky jím byly převrstveny. Buňky byly se zředěným komplexem inkubovány 5 hodin při 37 °C v CO₂inkubátoru. Po inkubaci bylo přidáno 2 ml DMEM (Gibco BRL, Dulbesso's Modifíed Eagle Medium) /20% FCS. 24 hodin po tranfekci bylo médium nahrazeno čerstvým DMEM/10% FCS. 48 hodin po začátku transfekce byly buňky převedeny do 10 cm kultivační misky. 72 hodin po začátku transfekce započala selekce G418 koncentrací 800 pg/ml. Stabilní klony se objevily po 1 až 2 týdnech.

Z konfluentních transformantů, které rostly 3 dny v 10 cm kultivační misce, bylo získáno 5 ml kondicionovaného DMEM s nebo bez FCS. Tyto dva různé supematanty z transfekovaných buněk (Hind III-MP-52/pABWN nebo pABWN) a buněčné lyzáty byly testovány westernovými bloty. Úplný MP-52 byl přitom nalezen v kondicionovaném médiu i v buněčných lyzátech,

-9CZ 288795 B6 transfekovaných buněk HindIII-MP-52/pABWN a pABWN. Klony byly dále klonovány a analýzou westernovými bloty byl vždy vybrány buňky, produkující MP-52. Podle odhadů z westernových blotů produkce MP-52 dosahovala až 1 mg/1.

Příklad 3

Biologická aktivita MP-52

Aby byla dokázána biologická aktivita MP-52 a byla doložena užitečnost tohoto vynálezu pro lékařské aplikace k prevenci a/nebo léčení onemocnění kostí, bylo provedeno větší množství experimentů in vitro a in vivo.

1. Testy in vitro

1.1

Protože je popsáno zvýšení syntézy glykosaminoglykanu (GAG) v chondrocytech po stimulaci TGF-β (Hiraki a další, Biochimica et Biophysica Acta 969 (1988), 91 - 99), bylo testováni, jestli MP-52 má také tento účinek. Za použití buněčných supematantů (DMEM s 10% FCS) transformantů L-buněk, produkujících MP-52 (transfekovány HindIII-MP-52/pABWN), byla testována chondrogenní aktivita MP-52 v primární kultuře fetálních krysích končetin.

Byly použity čtyři končetiny 16 dní starého kiysího plodu. Po trypsinaci byly buňky v médiu F—12 (Nutrient Mixture Ham's F-12, Gibco BRL #21700) s 10% FCS vysety na potahované 24-jamkové destičky Kokagen Typ I s 3 x 10⁵ buňkami a přibližně 2 dny kultivovány až do dosažení souvislé vrstvy. Na 500 μΐ kultivačního média (médium F-12 s 10 % FCS) bylo vždy přidáváno 56 μΙ kondicionovaného média (KM) z L-buněk, transfekovaných Hind III-MP52/pABWN, nebo samotného média (médium DMEM s 10 % FCS). Po uplynutí 0, 3, 6 a 9 dnů bylo použito médium F-12 s 10 % FCS a s odpovídajícími přísadami. Médium s odpovídajícími přísadami bylo vyměňováno každé 3 dny. Potom byla kultura další dva dny kultivována v médiu F-12 s odpovídajícími přísadami (kondicionované, resp. kontrolní médium) bez FCS a na dalších 6 hodin přidán ³³S-síran. ³⁵S, inkorporovaná do polysacharidů, byla po trávení Pronasou E a srážení měřena podle metody: Hiraki a další, Biochimica et Biophysica Aera 969 (1988), 91-99.

Tabulka 1

	Radioaktivita (cpm/jamku)
Dny inkubace	DMEM+10% FCS z kontrolních L-buněk	KM z pAWBN transfektantů L-buněk	KM z Hind III-MP52/pABWN transfektantů L-buněk
2	3720+114	3865+120	4879+422
5	4188+135	4154+29	8223+275*
8	3546+160	3310+115	9890+1260*
11	3679+218	3633+167	7520+160*

Hodnoty se vztahují na +S.E.M. pro 3 nebo 4 nasazení kultury, *: p<0,01 vs DMEM a KP pABWN transfektantů L-buněk (Scheffe's multiple t-test).

Jak ukazuje tabulka 1, stimulují supematanty transfektantů, které produkují MP-52, průkazně syntézu GAG ve srovnání s čistým kultivačním médiem (DMEM s 10% FCS) nebo s kultivačním médiem pAWBN transfektantů L-buněk. To ukazuje, že MP-52 může stimulovat diferenciaci chondrocytů.

Pro několik členů skupiny BMP je popsán efekt vzrůstu aktivity alkalické fosfatázy (ALP) v osteoblastech. Klonální krysí buněčná linie ROB-C26 (C26) se řadí k osteoblastům s relativně

-10CZ 288795 B6 častým stadiem dospívání (Yamaguchi a další, Calcif. Tissue Int. 49 (1991), 221-225). Schopnost oeteoinduktivních proteinů, jako např. BMP-2, zvyšovat aktivitu ALP je popsána u: Yamaguchi a další (J. Cell. Biol. 113(1991), 681-687).

Vliv MP-52 na buňky C-26 byl zjišťován následovně: Buňky C-26 byly po 3 x 10⁴ buněk vysety na 24-jamkovou destičku a kultivovány v α-MEM (Gibco BRL) / 10 % FCS až do souvislého nárůstu. Na každou jamku bylo přidáno k 500 μΐ média s buněčnou kulturou C-26 56 μΐ buněčného supematantu z HindIII-MP-52/pABWN transfektantů L-buněk, které produkují MP52, popř. supematantu z pABWN transfektantů L-buněk, nebo jen supematantu (DMEM s 10 % FCS) z L-buněk. Médium s odpovídajícími přísadami bylo vyměňováno každé 3 dny. Aktivita ALP v buněčných extraktech byla určována standardními technikami, používajícími jako substrát p-nitrofenylfosfát, popsanými např. u: Takuwa a další, Am. J. Physiol. 257 (1989), E797 E803), po 0, 3, 6, 9 a 12 dnech.

Tabulka 2

	Aktivita ALP (nmol/min) na jamku
Dny inkubace	DMEM+10% FCS z kontrolních L-buněk	KM z pAWBN transfektantů L-buněk	KM z Hind III-MP52/pABWN transfektantů L-buněk
0	41,8±2,8	41,8±2,8	41,8±2,8
3	136,3±3,7	125,8±2,3	181,3±14,2*
6	129,0±7,8	119,3±6,4	258,0+8,3*
9	118,4±3,7	110,1 ±2,8	258,4±10,6*
12	121,2±3,2	125,3±6,0	237,8±ll,0*

Hodnoty se vztahují na ± S.d. pro 4 nasazení kultury, *: p<0,01 vs DMEM a KM pABWN transfektantů L-buněk (Scheffe's multiple t-test).

Jak je ukázáno v tabulce 2, přídavkem MP-52 významně stoupá aktivita ALP ve srovnání s čistým kultivačním médiem (DMEM s 10% FCS) nebo s kultivačním médiem pAWBN transfektantů L-buněk. Tento výsledek ukazuje, že MP-52 může ovlivňovat nejen diferenciaci chondrocytů, ale i diferenciaci a zrání osteoblastů.

Další linie osteoblastů (MC3T3-E1, myš), která, jak popisuje Takuwa a další (Biochem. Biophys. Res. Com. 174 (1991), 96 - 101, vykazuje pod vlivem BMP-2 vzestup aktivity ALP, nemá po inkubaci s kondiciovaným médiem z pAWBN transfektantů L-buněk, produkujících MP-52 (HindIII-MP-52/pABWN), nebo médiem po produkci MP-52 infekcí rekombinovaným virem vakcinie, žádný vliv na změny aktivity ALP. To poukazuje na to, že MP-52 má specifitu, kterou lze odvodit od BMP-2. Rozdílné funkce jednotlivých členů skupiny TGF-β, podmíněné různými cílovými místy, mohou mít pro medicínu velký význam.

2. Test in vivo

2.1

Možnost výzkumu vývoje kostí s největší vypovídací hodnotou se zakládá na ektopické tvorbě kostí in vivo. Tu lze např. indukovat implantací demineralizované kostní matrix (Urist, Science 150 (1965), 893 - 899). Kombinací inaktivní matrix s proteiny, které indukují tvorbu kostí, lze celý proces indukovat, jak popisuje např. Sampath a další (Proč. Nati. Acad. Sci. USA 78 (1981), 7599-7603). Tento proces tvorby kostí je srovnatelný s embryonální echondrální tvorbou kostí a hojením kostí u dospělých. Tato metoda nabízí možnost testovat proteiny na jejich schopnost indukovat kosti in vivo.

Pro takový experiment byl částečně vyčištěn a implantován protein MP-52, získaný expresí v systému vakcinie (viz příklad 2).

-11CZ 288795 B6

Ktomu účelu byly pěstovány buňky 143B (HuTk- ATCC CRL 8303) v kultivačních miskách a otáčivých láhvích až do konfluence, jak bylo popsáno v příkladu 2 pro analýzy exprese, infikovány rekombinantním virem, promyty a přibližně dalších 20 hodin ponechány v médiu MEM (Gibco BRL, cca 1 ml na 10⁶ buněk) akumulovat MP-52. Jako kontrola byl proveden stejný postup s infekcí standardním virem, byl sebrán supematant (kondicionované médium) z každého pokusu a centrifúgován (40000 xg, 30 min, při 4 °C). Pro odstranění virů byly supematanty filtrovány přes anorganický filtr (velikost pórů 0,1 pm, Whatman Anotop 25).

V průběhu charakterizace MP-52 se ukázalo, že se tento protein váže na heparin Sepharosu. Této vlastnosti bylo využito pro částečné čistění. Zfiltrované a zcentrifugované kondicionované médium bylo převedeno do pufru na konečnou koncentraci 50 mm Tris pH 7,0, 100 mm NaCl a 6M močoviny a naneseno na heparinovou kolonu (HiTrap^(tm), Pharmacia #17-0407-01), která byla ekvilibrována v pufru A (50 mm Tris pH 7,0, 100 mm NaCl a 6 M močoviny). Nanesená kolona byla promyta pufrem A a eluována lineárním gradientem do 100% pufru B (50 mm Tris pH 7,0, 600 mm NaCl a 6 M močoviny) při průtoku 0,5 ml/min během 50 minut (2,5 ml/frakci). Použití močoviny není nutné. Pomocí analýzy na westernovém blotu (viz příklad 2) mohlo být zjištěno, že se MP-52 eluuje reprodukovatelně hlavně ve dvou frakcích při přibližně 250 400 mm NaCl. Alikvoty těchto frakcí byly rovněž analyzovány na 15% polyakrylamidových gelech, barvených stříbrem podle údajů výrobce (Silver Stain-II, Daiichi #SE 140000) a frakce byly spojeny. Srovnatelné frakce po čištění kondicionovaného média po infekci standardním typem viru byly po analýze na stříbrem barveném gelu rovněž spojeny.

Z dalších pokusů týkajících se MP-52 vyplynulo, že se MP-52 váže také na hydroxyapatit. Proto je v principu možné dosáhnout dalšího čištění na hydroxyapatitové koloně, popř. nahradit heparinovou kolonu kolonou hydroxyapatitovou (např. Bio-Rad, Econo-pac HTP). Pro další způsoby čištění jsou možné také jiné v oboru známo metody, jako např. gelové kolony, iontoměničové kolony, afinitní kolony, kolony na principu tvorby chelátů kovů nebo kolony, založené na hydrofobních interakcích.

Protein MP-52, předčištěný na heparin Sepharose, popř. ještě spolu s odpovídajícími kontaminujícími proteiny, které se vyskytují i v supematantech buněk, infikovaných standardním typem viru, byly dále čištěny HPLC na reverzní fázi. K tomu byla kolona C-8 (Aquapore RP-300, Applied Biosystems, velikost částic 7 pm, velikost pórů 30 nm) ekvilibrována s 10% pufrem B (pufrem A: 0,1% kyselina trichloroctová; pufr B: 90% acetonitril, 0,1% kyselina trichloroctová). Po nanesení sloučených frakcí zheparinové kolony, obsahující frakce MP-52, byla kolona důkladně promyta 10% pufrem B. Navázaný protein byl eluován následujícími gradienty: během 20 minut 10 až 50% pufr B a během 50 minut 50-100% pufr B. Frakce byly sbírány po 500 μΐ a analyzovány jak western bloty, tak i stříbrem barvenými gely. Protein MP-52 se eluoval za daných podmínek přibližně v rozmezí koncentrací acetonitrilu 55 až 65 %. Frakce s obsahem MP-52 byly spojeny. Totéž bylo provedeno s odpovídajícími frakcemi kontrolního čištění supematantu z buněk, infikovaných standardním typem viru.

Také částečně vyčištěný protein MP-52 vykazoval v koncentraci 50 ng/ml, určené odhadem z analýzy na westernovém blotu, u buněk ROB-C26 po třech dnech inkubace výrazný vzestup aktivity ALP.

Částečně vyčištěný protein MP-52, popř. kontrolní protein z odpovídajících částečně vyčištěných supematantů z buněk, infikovaných standardním typem viru, byly rekonstituovány s matrix a implantovány krysám aby byla dokázána schopnost tvorby kostí a chrupavek.

V principu by bylo možno jako matrix použít různé v oboru známé materiály, to znamená přírodní (i modifikované) a synteticky vyrobené materiály matrix, s výhodou se však používají biokompatibilní, in vivo odbouratelné porézní materiály. V těchto experimentech byla použita kostní matrix krys, která byla přiopravena v podstatě stejným způsobem, jak popisuje Sampath a další (Proč. Nati. Acad. Sci. USA 80 (1983), 6591-6595). Kosti krys (stehenní a holenní) byly

-12CZ 288795 B6 demineralizovány 24 hodin v 0,6 M HC1 a následně ještě byla odstraněna přítomná kostní dřeň. Po vyprání ve vodě a tříhodinovém odmašťování ve směsi chloroformu/methanolu (1/1) byly kosti usušeny na vzduchu, ve hlubokozmrazeném stavu rozemlety na prášek a prosáta frakce s velikostí částic 400 až 1000 pm. Poté byla matrix extrahována 7 dní při pokojové teplotě ve 4 M guanidinium - HC1 v přítomnosti inhibitorů proteáz. Po důkladném vyprání ve vodě byla matrix lyofilizována a uchovávána při 4 °C. Takovým způsobem připravené matrix už samy o sobě nevykazují žádnou aktivitu, indukující růst kostí.

Protein je možno kombinovat s extrahovanou matrix různými v oboru známými postupy. Protein MP-52, popř. kontrolní protein, přečištěný jak na heparin Sepharose, tak i HPLC na reverzní fázi, byl v roztoku acetonitrilu/kyseliny trichloroctové po eluci spojen vždy s 25 mg matrix na jeden implantát, dobře promísen, hluboko zmrazen a lyofilizován.

Pro implantaci MP-52, navázaného na protein, byly použity cca 3 měsíce staré krysy (Whistar), které byly narkotizovány intramuskulámí injekcí narkotika (0,2 ml Rompun (Bayer) ve směsi s 0,5 ml Ketanest 50 (Parke Davis)) 0,14 ml na 100 g tělesné hmotnosti. Pro implantáty byly vytvořeny oboustranné kapsy v břišní svalovině (pod hrudním košem, začínající cca 0,5 cm, pod nejspodnějším žebemím obloukem). MP-52, navázaný na matrix (podle odhadu z westernových blotů přibližně 2 až 4 pg), jakož i odpovídající proteiny kontroly, navázané na matrix, byly navlhčeny 0,9% roztokem kuchyňské soli (Delta Pharma) a převedeny do svalových kapes. Svalové kapsy i nutné kožní řezy byly poté zašity. Imunosuprese krys byla prováděna cyklosporinem A (Sandimmun).

Po 18, popř. po 26 dnech byly z krys implantáty vyjmuty a fixovány pro histologická vyšetření. Protože se zdálo, že implantát s MP-52 již po 26 dnech jeví mikroskopickou tvorbu kostí, byl zalit pro zhotovení tenkých řezů do polymethylmethakrylátu, ostatní implantáty byly zality do parafínu. Mineralizované tkáně kostí a chrupavek byly černě zvýrazněny barvicí technikou Kossa (Romeis, B.; Mikroskopische Technik, ed. Bock, P.; Urban a Schwarzenberg; Můnchen, Baltimore, Wien (1989)). U tříbarevného barvení podle Masson-Goldner (Romeis, B.; Mikroskopische technik, ed. Bock, P.; Urgan a Schwarzenberg; Miinchen, Baltimore, Wien (1989)) se mineralizovaná kostní tkáň a kolagen obarví svítivě zeleně, osteoid je červený a cytoplazma červenohnědá. Obě techniky byly použity pro implantáty zobou krys. Oběma barvicími technikami byla tvorba chrupavek a kostí prokázána u obou zvířat, která nesla implantáty s obsahem MP-52. Odpovídající implantáty s kontrolním proteinem nevykazovaly ani nejmenší tvorbu chrupavek a kostí. Podíl předstupňů chrupavek s chondrocyty a chrupavčitými oblastmi se začínající tvorbou extracelulámí matrix a její mineralizace v soustředných kruzích je v implantátu MP-52 po 18 dnech vyšší než po 26 dnech. Ale také v implantátu po 18 dnech je již prokazatelná zralá kostní tkáň s vektorovou tvorbou osteoidu i jednotlivé osteocyty v kostech. Dále jsou rozpoznatelné uzavřené kůstky s počínající tvorbou kostních znaků. U implantátu po 26 dnech jsou také ještě prokazatelné chrupavčité oblasti se začínající tvorbou matrix a kalcifikací, zřetelně však vzrůstá podíl zeleně zbarvené mineralizované kostní tkáně s osteocyty a osteoidními lemy. Také v tomto implantátu je prokazatelná tvorba kostních znaků s výskytem jednotlivých tukových buněk. Pro osvětlení je na obr. 5 ukázán barevný důkaz (podle Kossa) kostního materiálu celkového implantátu po 26 dnech. Obr. 6 ukazuje malý výřez téhož implantátu po barvení dle Masson-Goldner. Ukazuje aktivní kosti s lemem kuboidálních osteoblastů a osteid, ve kterém jsou rozpoznatelné vestavěné osteoblasty. Dále jsou zřetelné jednotlivé osteocyty v mineralizované kostní tkáni (v originálním preparátu zbarveny zeleně). Rovněž je prokazatelná tvorba kostních znaků.

Pokus ukazuje, že samotný rekombinantně vyrobený MP-52 je schopen v kombinaci s matrix indukovat echondrální tvorbu kostí.

-13CZ 288795 B6

2.2

Pro potvrzení výsledků byl proveden další ektopický test tvorby kostí za použití MP-52 transformantů L-buněk. pAWBN L-buňky, produkující MP-52 (transfektanty HindIII-MP52/pABWN), a neprodukující MP-52 (transfektanty pAWBN) v počtu 1 x 10⁶ buněk byly oboustranně vstříknuty do stehenní svaloviny třech samců nahých myší. Po třech týdnech byla všechna zvířata usmrcena, stehenní svalovina odstraněna a vyšetřována jak nízkoenergetickým rentgenovým zářením, tak i histopatologicky. Jak je uvedeno v tabulce 3, ukazuje rentgenová analýza materiál větší hustoty na místech vstřiku ve svalové tkáni všech L-buněk, produkujících MP-52. Histologickým vyšetřením mohly být zjištěny ve svalech tvorba jednoduchý chrupavek a tvorba kalcifíkovaných chrupavek. Také tyto výsledky potvrzují, že MP-52 je schopen indukovat echondrální tvorbu kostí.

Tabulka 3

	buňky produkující MP-51 (HindIII-MP-52/pABWN)	kontrolní buňky pAWBN
hustý materiál při rentgenové analýze	3/3	0/3
chondrocyty histologicky	3/3	0,/3
tvorba kalcifíkovaných chrupavek	3/3	0/3

Provedené experimenty potvrzují, že protein MP-52 stimuluje tvorbu chrupavek znediferenciovaných mesenchymových buněk, stejně jako diferenciaci a zrání osteoblastů. To vede k echondrální tvorbě kostí, srovnatelné s indukční kaskádou při embryonální tvorbě kostí a hojení kostí u fraktur.

Podmínky, uvedené pro pokusy, je nutno pokládat pouze za ilustraci aktivity MP-52 a nikoliv jako omezující. Vynález může být zkoumán a charakterizován také jinými způsoby.

Pro buněčné linie a plazmidy jsou přiloženy protokoly o uložení, ze kterých jsou zřejmé údaje o uložení.

-14CZ 288795 B6

SEKVENCE 1

Druh sekvence: Sekvence nukleové kyseliny Jméno a původ: MP-52 DNA

Délka: 2703 nukleotidů

GATTT-TTTQACAGAAATATATCGGACTTAAATGAG

TTrAGAQAGQATGAQATOGAGAGTAATTAAATTGGTTTGGGGTGGAAT-CCGTTTCCAA TTCCTGAGTTCAGGTTTGTAAAAGATTTTTCGGAGCkCCTGCkGGCCTGTGAGTGTGTGT GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGiGAAGTAiTTTCACTGGAAAGGATTCAAAACTA GGGGGAAAAAAAAACTGGAGCACACAGGCAGCATTACGCCATTCTTCCTTCITGGAAAAA

TCGCTQAGCCTTATACAAGCCTCCTTCAAGCCCTCAGTCAGTGGTGCAGGAGAAAGGGGG

CGGTTGGCTGTCTCCTTTCAAGAACGAGTTATTTTCAGCTGCTGACTGGAGACGGTGCAC GTCTGGATACGAGAGCATTTCCACTATGGGACTGGATACAAACACACACCCGGCAGACTT GAAGAGTCTCAGACTGAGGAGAAAGCCTTTCGTiCTGCTGCTACTGCTGCTGCCGCTGCG TTTGAAAGTCGACTCCTTTQATGGTTTTTCCTGCGAAACGAG-.GGCACCTTTGCTGCTGC CGCTGTrCTCTiTGGTGTQATTCAGCGGCZGGCGAGAGGATGAGACTCCCGAAACTCCTC

GGGGCCACCAATGCCAATGCCAGGGCAAAGGGAGGCACCGGGCAGACAGGAGGCCTGACA CAGCCCAAGAAGGA7GAACCCAAAAAGCTGCCCCCCAGACCGGGCGGCCCTGAACGCAAG CGAGGAQACCCTCCCQAAACAAGGCAGGCTACAGCCCGGACTGTGACCCCAAAAGGACAG CTTCCCGGAGGCAAGGCACCCCCAAAAGCAGGATCTGTCCCCAGCTCCTTCCTGCTGAAG AAGGCCAGGGAGCCCGGGCCCCCACGAGAGCCCAAGGAGCCGTTTCGCCCACCGCCCATC ACACCCCACGAGTACATGCTCTCGCTGTACAGGACGCTGTCCGATGCTGAQAGAAAGGGA GGCAACAGCAGCGTGAAGTTGGAGGCTGGCCTGGCCAACACCATCACCAGCTTTATTGAC AAAGGGCAAGATGACGGAGGTCCCGTGGTCAGGAAGaAGAGGTACGGGTTTGAQATTAGG GCCCTGGAGAAGGAGGGGCrGCTGGGGGCCGAGCrGCGGATCTiGCGGAAGAAGCCCTCG GACACGGCGAAGCGÁGCGGCCCCCGGAGGCGGGCGGGCTGCCCAGCTGAAGCTGTCGAGC TGCCCCAGCGGCCGGQAGCCGGCCrCCTTGCTGGATGTGCGCTCCGTGCCAGGCCTGGAC GGATCTGGCTGGGAGGTGTTCGAGATCTGGAAGCTCTTCCGAAACTTTAAGAACTCGGCC QAGCTGíGCCTGGAGCTGGAGGCCTGGGAACGGGGCAGGGCCGTGGACCTCCGTGGCCTG GGCTTCGACCGCGCCGCCCGGCAGGTCCACGAGAAGGCCCTGTTCCTGGTGTZTGGCCGC accaagaaacgggacctgttctttaatgagattaaggcccgctctggcgaggacgataag

-15CZ 288795 B6

ACCGTGTATGAGTACCTGTTCAGCCAGCGGCGAAAACGGCGGGCCCCACTGGCCACTCGC CAGGGCAAGCGACCCAGCAAGAACCTTAAGGCTCGCTGCAGTCGGAAGGCACTGCATGTC AACTTCAAGGACATGGGCTGGGACGACTGGATCATCGCACCCCTTGAGTACGAGGCTTTC CACTGCGAGGGGCTGTGCGAGTTCCCATTGCGCTCCCACCTGGAGCCCACGAATCATGCA GTCATCCAGACCCTGATGAACTCCATGGACCCCGAGTCCACACCACCCACCTGCTGTGTG CCCACGCGGCTGAGTCCCATCAGCATCCTCTTCATTGACTCTGCCAAQAACGTGGTGTAT AAGCAGTATGAGGACATGGTCGTGGAGTCGTGTGGCTGCASGTAfiCAGCACTGGCCCTCT GTCTTCCTGGGTGGCACATCCCAAGAGCCCCTTCCTGCACTCCTGGAATCACAGAGGGGT CAGGAAGCTGTGGCAGGAGCATCTACACAGCTTGGGTGAAAGGGGATTCCAATAAGCTTG CTCGCTCTCTGAGTGTGACTTGGGCTAAAGGCCCCCTTTTATCCACAAGTTCCCCTGGCT GAGGATTGCTGCCCGTCTGCTGATGTGACCAGTGGCAGGCACAGGTCCAGGGAGACAGAC TCTGAATGGGACTGAGTCCCAGGAAACAGTGCTTTCCGATGAGACTCAGCCCACCATTTC TCCTCACCTGGGCCTTCTCAGCCTCTGGACTCTCCTAAGCACCTCTCAGGAGAGCCACAG GTGCCACTGCCTCCTCAAATCACATTTGTGCCTGGTGACTTCCTGTCCCTGGGACAGTTG AGAAGCTGACTGGGCAAGAGTGGGAGAGAAGAGGAGAGGGCTTGGATAGAGTTGAGGAGT GTGAGGCTGTTAGACTGTTAGATTTAAATGTATATTGATGAGATAAAAAGCAAAACTGTG CCT

SEKVENCE 2

Druh sekvence: Aminokyselinová sekvence Jméno a původ: MP-52 protein Délka: 501 aminokyselin

HRXPRLLTFL LWYLAWLDL2 FZCTVLGAPD LGQRPQGTRP GLAKAEAJCER PPLARNVFR? GG2SYGGGAT NA2ÍARAKGGT GQTGGLTQPX KDEPKaLPPR PGGPZPKPGa PPQTRQATAR TVTPKGQLPG GKAPPKAGSV PSSFIXKKAR' EPGPPREPKE PFRPPPZTPZ EYHTSX.YKTL SDADRKGGNS SVKLEAGLAN TZTSFIDKGQ DDRGPWRKQ RYVFDISALZ KDGLLGAELR XLRKXPSDTA KPAAPGGGRA AQLKLSSCPS GRQPASLLDV RSVPGLDG3G WEVFDXwKLF RNFRNSAQLC LZLEAWERGR AVDLRGLGFD RAARQVEEKA LFZ.VFGRTKK RDLFFHEXKA RSGQDDKTVY EYLFSQRRKR RAPLATRQGK RPSKNLKARC SRKALHVNFX DMGWDDWZZA ?LETEAE3CE GLCEFPLRSE IZPTNEAVZQ TLMNSMDPES TPPTCCVPTR LSPZSZLFZD SANNVVYaQY EDKVvíSCGC R

Claims

1. Molekula DNA kódující protein ze skupiny TGF-β, která zahrnuje

d) sekvenci, hybridizující za strigentních podmínek s jednou ze sekvencí podle a), b) nebo c) za předpokladu, že molekula DNA podle d) obsahuje alespoň tu část sekvence kódující protein, který je schopen vykonávat biologickou funkci zralého proteinu skupiny TGF-β.

2. Vektor, který obsahuje alespoň jednu kopii molekuly DNA podle nároku 1.

3. Hostitelská buňka, která je transformovaná DNA podle nároku 1 nebo vektorem podle nároku 2.

4. Hostitelská buňka podle nároku 3, která je bakterií, houbou, rostlinnou buňkou nebo živočišnou buňkou.

5. Protein skupiny TGF-β, kódovaný sekvencí DNA podle nároku 1.

6. Protein podle nároku 5, který má sekvenci aminokyselin, označenou jako SEKVENCE 2, nebo část proteinu schopná fungovat jako signální peptid, propeptid nebo část zralého proteinu splňující alespoň jednu z biologických funkcí přirozených proteinových částí MP52.

7. Způsob výroby proteinu skupiny TGF-β, vyznačující se tím, že se kultivuje hostitelská buňka podle nároku 3 nebo 4 a protein skupiny TGF-β se získá z buňky nebo supematantu kultury.

8. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje jako účinnou látku alespoň jeden protein podle nároku 5 nebo 6 popřípadě s farmaceuticky obvyklými nosnými, pomocnými, zřeďovacími nebo plnicími látkami.

9. Farmaceutický prostředek podle nároku 8, vyznačující se tím, že účinná látka je nanesena na a/nebo integrována do přírodní nebo syntetické matrix.

10. Farmaceutický prostředek podle nároku 9, vyznačující se tím, že matrix je biokompatibilní, in vivo biologicky odbouratelný porézní materiál.

11. Farmaceutický prostředek podle některého z nároků 8 až 10 pro použití při léčení nebo prevenci poškození kostí, chrupavek, vazivové tkáně, kůže, sliznice, epitelií nebo zubů, k použití u zubních implantátů a k použití při procesech léčení poranění a obnovy tkání.

12. Farmaceutický prostředek podle některého z nároků 8 až 10 pro použití v souvislosti s angiogenezí.

13. Protilátky nebo části protilátek, které se vážou na protein podle nároku 5 nebo 6.