CN1129013A - 转化生长因子-β家族中新的生长/分化因子 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及TGF-β家族中的一种蛋白、编码它的DNA以及包含这种蛋白的药物组合物。

Description

转化生长因子—β家族中 新的生长/分化因子
本发明涉及TGF—β家族中一种新的生长/分化因子及编码它的DNA序列。
包括BMP—，TGF—，和抑制素相关蛋白在内的TGF—β家族中的生长因子(Roberts and Sporn，Handbook of Experimental Pharmacolo-gy 95(1990)，419—472)对医学治疗方法和应用方面，在很广的范围内是特别相关的。这些因子在涉及创伤治疗和组织再生治疗方法中很适宜。而且TGF—β家族中有几个生长因子能诱导组织生长，特别是骨的生长，因而在诱导软骨和骨的发育中起重要作用。
Wozney(Progress in Growth Factor Research，(1989)，267—280)和Wale等(Handbook of Experimental Pharmacology 95(1990)，211～248)都介绍过与BMP(骨形态发育蛋白)群和抑制素群相关的那些生长因子，这几群中的生长因子结构上有一定的相似性。其前体蛋白由一个氨基末端信号序列、前肽及大约由110个氨基酸组成的羧基末端序列构成。这110个氨基酸从前体蛋白中切割下来，构成成熟蛋白。此外，通过氨基酸序列同源性也可确定这些生长因子。成熟蛋白含有最保守的序列，特别是在这一家族成员中都保留的7个半胱氨酸残基。TGF—β样蛋白都是多功能的、有激素活性的生长因子，它们还有象细胞趋化吸引、细胞分化的促进以及诸如软骨诱导和骨的诱导等组织诱导能力有关的生物学活性。美国专利NO.5,013,649揭示了编码称为BMP—2的骨诱导蛋白的DNA序列，美国专利申请NO.179 101和170 197中揭示了BMP蛋白BMP—1和BMP2。而且还有许多类型细胞能合成TGF—β样蛋白，实际上，几乎所有细胞都有TGF—β受体。
基于这些蛋白结构上显示的不同，导致它所发挥的精确生物学作用有一定的变化。此外，在相当广泛的不同类型组织中和在不同发育阶段发现它们。因此，它们发挥的功能可能表现得有所不同，如需要的细胞生理环境、它们的寿命、它们的靶位点、它们所需要的辅助因子和抗退化的稳定性等。虽然有人已介绍过许多蛋白表现出一种组织诱导、特别是骨诱导功能，但它们在机体中的自然功能，更有意义的在医疗相关方面的功能仍需详细加以研究。相信很可能存在未知的TGF—β家族中的成员对骨形成发生或对其他组织的分化/诱导是很重要的。然而分离这些新的TGF—β样蛋白一个主要困难是它们的功能目前还不能精确的描述使之足以建立高分辨能力的生物学检测方法。另一方面，推测的与这个家族其他成员核苷酸序列的同源性太低，不足以能用经典的核酸杂交技术来筛选。不过，对新的TGF—β样蛋白急需作进一步分离和鉴定，以便提供进一步诱导和促进分化的蛋白，这些蛋白可满足所有想要的医学上的需要。在治疗损伤和骨组织及/或其他类型组织如肾脏或肝脏的退化性疾病中可以使用这些因子。
在专利申请PCT/EP93/00350中讲述了TGF—β蛋白MP—52的核苷酸和氨基酸序列，其中给出了相应成熟肽的序列和MP—52前肽相应的大部分序列，其全部序列没有显示出来。
本发明的基本目的在于提供一种编码具有促有丝分裂和/或分化诱导(如骨形成诱导)能力的TGF—β蛋白家族新成员的DNA序列。本发明的目的特别是要提供TGF蛋白MP—52的完整DNA序列和氨基酸序列。
这个目的通过一个编码TGF—β家族的一种蛋白的DNA分子达到，这种DNA分子包括：(a)SEQ ID NO.1所示核苷酸序列中编码成熟蛋白的部分和必要时的其他功能部分，(b)在遗传密码简并范围内与(a)序列相应的核苷酸序列，(c)和(a)和(b)之一序列相应的核苷酸序列的等位基因衍生序列，或(d)能与(a)(b)或(c)之一序列杂交的序列，条件是根据(d)的DNA分子至少含有编码TGF—β家族中一种成熟蛋白的序列部分。
本发明进一步的实施方案涉及权利要求书中2到10项的内容。本发明其他特征和优点可从优选实施方案和附图的描述中演化出来。对序列表和附图示简单介绍如下：
SEQ ID NO.1显示编码TGF—β蛋白MP—52的全部DNA核苷酸序列。ATG起始密码子从640位核苷酸开始。从1782位核苷酸之后才起始成熟蛋白。
SEQ ID NO.2显示由SEQ ID NO.1显示的核苷酸序列而推演出来的TGF—β蛋白MP—52的全部氨基酸序列。
图1表示MP—52氨基酸序列同BMP蛋白家族中其他几个成员的比较，都是从7个保守的半胱氨酸中的第一个开始的。星号“*”表示在比较的所有蛋白中该氨基酸都相同；加号“＋”表示BMP家族中比较的蛋白至少有一种与MP—52相应氨基酸是相同的。
图2表示本发明中所用的寡核苷酸引物的核苷酸序列。并与TGF—β家族中已知成员作比较。M表示A或C，S表示C或G，R表示A或G，K表示G或T。2a显示引物OD的序列，2b显示引物OID的序列。
本发明至少包括SEQ ID NO.1所示核苷酸序列中编码成熟蛋白的部分和必要的其他功能部分，以及在遗传密码简并范围内同这一序列相应的序列和这些序列的等位基因衍生序列。此外，本发明还包括能与这种序列杂交的序列，只要这种DNA分子至少完全含有编码TGF—β家族成熟蛋白的部分。
本发明中用“功能部分”一词表示一种蛋白部分，它能起诸如象信号肽、前肽作用或成熟蛋白部分的作用，即它能执行MP—52天然蛋白部分的至少一种生物学功能。
编码这种成熟蛋白的序列是SEQ ID NO.1中所示序列的1783位核苷酸到2142位核苷酸。必要的话，这种DNA分子还可以包括SEQ ID NO.1中所示序列的其他功能部分，即编码信号肽或/和前肽部分的核苷酸序列。特别优选的是DNA分子含有编码信号肽、前肽部分和成熟蛋白部分的序列，即SEQ ID NO.1中所示序列的640—2142核苷酸。另一方面，这种DNA分子还可包括除编码成熟蛋白外其他蛋白的功能性信号肽或/和前肽序列，特别是TGF—β家族其他蛋白，如上述提及的BMP蛋白。各自的核苷酸序列在上述的文献中给出，这里参考其公开内容。
再者，本发明还包括含有一个非编码性内含子序列的如上面限定的一种DNA分子，所述内含子位于SEQ ID NO.1所示序列的1270和1271核苷酸之间。这个内含子序列在质粒SKL52(H3)MP12中含有，该质粒保藏在DSM，并有MP—52基因组核酸序列。
本发明还包括由噬菌体λ15.1编码的MP—52蛋白互补DNA序列，这一序列起始于SEQ ID NO.1中的321核苷酸位点。
尽管本发明包括的等位基因、简并和杂交序列由于它们的核苷酸或/和氨基酸序列微小改变而导致结构上不同，但由这些序列编码的蛋白基本上还都有相同的有用特性，使它们能在相同的医学领域里应用。
本发明使用的“杂交”一词，意指用通常的杂交条件，优选条件为在62到66C、盐浓度6×SSC，然后用0.6×SSC、0.1％SDS在62到66℃下洗一小时。特别优选的是“杂交”一词表示用严格杂交条件：盐浓度为4×SSC、在62到66℃，然后用0.1×SSC、0.1％SDS在62到66℃洗一小时。
本发明优选的实施方案是如上述定义的DNA序列，它们可从脊椎动物，特别是哺乳动物如猪、牛和啮齿动物如大鼠或小鼠，特别是从灵长类如人中得到。
本发明特别优选的实施方案是SEQ ID NO.1中显示的代表MP—52的序列。MP—52的转录物是从胚胎组织中获得的，编码一种同BMP一样蛋白成熟部分有相当氨基酸同源性的蛋白(见图1)。Wozney等介绍了BMP2(＝BMP2A)和BMP4(＝BMP2B)的蛋白序列(Science 242(1988)，1528—1534)。Celeste等介绍了BMP5、BMP6和BMP7的相应序列(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87(1990)，9843—9847)。在MP—52的前肽部分中还发现了对已知的BMP序列是特异的几个典型的序列同源性，而MP—52前体部分的其他一些部分与BMP前体有相当的差别。
此外，本发明还涉及一种载体，它至少含有一个拷贝的本发明的DNA分子。优选把本发明的DNA序列有效地连接到这种载体的表达调控序列上，这样的载体适宜在稳定或临时性转化细胞中产生TGF—β样蛋白。可以用作转化和随后培养的细胞有各种动物、植物、真菌及细菌系统。本发明的载体优选含有在宿主细胞里复制所必需的序列并且能自主复制。而且优选使用的载体要含有可选择的标记基因，可用这种标记基因在宿主细胞中检测转化子。
此外，本发明涉及一种用本发明的DNA或载体转化的宿主细胞。适宜的宿主细胞举例包括各种真核和原核细胞如大肠杆菌，昆虫细胞、植物细胞、哺乳动物细胞以及真菌，象酵母菌等。
此外，本发明涉及一种TGF—β家族蛋白，它是由权利和要求1中的DNA序列编码的。本发明的蛋白优选具有在SEQ ID NO.2中显示的氨基酸序列或必要时它的功能性部分，并表现如组织诱导(特别是骨形成诱导)或/和或促有丝分裂能力的生物学特性，这些特性可能对治疗应用有关。上述这些蛋白特性会根据形成的同源二聚体或异源二聚体而变。这种结构也可能证明是适合于临床应用的。
本发明蛋白的这些生物学特性，特别是促有丝分裂和骨形成诱导能力可以用象Seyedin等人(PNAS 82(1985)，2267—2271)或Sam-path及Reddi(PNAS 78(1981)，7599—7603)提到的方法检测。
而且，本发明涉及产生TGF—β家族蛋白的方法，其特征是宿主细胞用本发明的DNA或载体转化并培养，从细胞或/和培养上清液中分离TGF—β蛋白。这一方法包括在适宜的培养基里培养转化的宿主细胞并纯化产生的TGF—β样蛋白。以这种方式，这一方法能产生相当量的理想蛋白用于临床治疗或在需要生长因子的细胞培养技术中应用。宿主细胞可以是一种细菌如芽胞杆菌或大肠杆菌、一种真菌如酵母菌、一种植物细胞如烟草、马铃薯或拟南芥属细胞或一种动物细胞，特别是脊椎动物细胞系如MoCOS，或CHO细胞系或一种昆虫细胞系。
本发明另一个目的是提供药物组合物，这些组合物含有药物活性量的本发明的TGF—β样蛋白作为有活性物质。必要时，这种组合物含有药物可接受的载体物质、辅组剂、稀释剂或填料。在创伤愈合、组织再生以及在治疗骨、软骨、结缔组织、皮肤、粘膜、表皮或牙齿的损伤以及在牙齿的移植中可以使用这种药物组合物，其单独应用或与其他活性物质如TGF—β家族其他蛋白或生长因子如EGF(表皮生长因子)或PDGF(血小板衍生的生长因子)等合用。而且在预防诸如骨质疏松和关节病中也可使用这种药物组合物。
本发明的TGF—β蛋白另一个可能的临床应用是用它作为一种免疫反应的抑制剂，防止器官移植排斥反应或与血管生成有关的应用。在预防医学整容外科手术中也可使用本发明的这种药物组合物。此外，这种药物服用不限于人，而且还包括动物，特别是宠物。
最后，本发明还涉及一种能与本发明的蛋白特异性结合的抗体或抗体片段(如Fab或Fab’)。产生这种抗体或抗体片段的方法是本领域里普通技术人员所掌握的一般技术知识。这种抗体优选是单克隆抗体、这种抗体或抗体片段可能也适用于诊断方法中。
下面的举例是用来进一步解释本发明的：实施例1：
MP—52的分离：1.1，根据Chirgwin等介绍的方法(Biochemistry 18(1979)5294～5299)，从8到9周龄的人胚胎组织中分离总RNA，再从厂家推荐方法用poly(A)快速分离柱(Stratagenc)、通过Oligo(dT)层析把poly(A+)RNA从总RNA中分离出来。1.2，为进行逆转录反应，把1到2.5μg poly(A+)RNA加热到65℃5分钟，然后快速在冰上冷却。反应混合物含有2.7U RNA—Guard(pharmacia)、2.5μg Oligo(dT)12—18(pharcmacia)，5X缓冲液(250mmol/l Tris/HCl，pH8.5，50mmol/l mgCl2，50mmol/l DTT，5mmol/l每种dNTP，600mmol/l KCl)和每μg poly(A+)RNA加有20UAMV逆转录酶(Bochringer Mannheim)。反应混合物在42℃保温2小时。1.3，在DNA自动合成仪(Biosearch)上制备图2中显示的脱氧核苷酸引物OD和OID。通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯化，用等速电泳把主要带从凝胶中分离出来。通过比较TGF—β家族中已知成员的核酸序列和选择高度保守的区域来设计寡核苷酸。这种区域的比较显示在图2中，为了便于克隆，两个引物都含有EcoR1限制性内切酶位点，OD在它的5’末端还含有一个NcoI内切酶位点。1.4，在PCR反应中，使用与20ng poly(A+)RNA相应的cDNA作为起始物。反应在50μl体积中进行，含有1×PCR缓冲液(16.6mmol/l(NH4)2SO4，67mmol/l Tris/HCl pH8.8，2mmol/l MgCl2，6.7μmol/l EDTA，10mmol/l β—巯基乙醇，170μg/ml牛血清白蛋白(Gibco)，200μmol/l每种dNTP(pharmacia)，两种引物(OD和OID)各30pmol，1.5U Taq聚合酶(AmpliTag，Perkin Eliner Cetus)。反应混合物上面盖有石醋油，进行40个循环。PCR反应产物用酚/氯仿提取，用酒精沉淀来浓缩。1.5，PCR反应产物用限制性内切酶SphI(pharmacia)和AlwNI(Biolabs)，按厂家说明进行酶切。1.6，用琼脂糖凝胶电泳来分离酶切产物，溴化乙锭染色后，未酶切的扩增产物从胶中切出，并用酚提取分离出来。得到的DNA再用酚/氯仿提取纯化二次。1.7，酒精沉淀后，取1/4或1/5分离到的DNA再作扩增，条件除循环周期减为13圈外其余同第一次扩增的条件相同。纯化再次扩增的产物，用同上的内切酶酶切，未酶切的产物按上述扩增产物一样从琼脂糖凝胶中分离出来。再次扩增的步骤重复二次。1.8，从凝胶最后分离出来的扩增产物，按厂家推荐的条件用4单位EcoR1酶(pharmacia)进行酶切，把1/4酶切混合物连接到用EcoR1酶切的载体pBLuescriptII SK+(Stratagene)上。连接之后，通过测序进一步分析24个克隆。用AlwNI和SphI酶切的样品产生一个新的序列，即代号MP—52的序列。其他克隆主要含有BMP6序列，有一个克隆含有BMP7序列。
根据Frohmann详细介绍的方法(Amplifications，由Perkin—Elmer Corp.出版，Issue 5(1990)，pp11—15)完成克隆到cDNA的3’端。把被用以分离MP—52第一个片段的相同胚胎mRNA，按上述方法进行反转录。用接头引物(AGAATTCGCATGC-CATGGTCGACG)和MP—52序列的内引物(CTTGAGTACGAG-GCTTTCCACTG)进行扩增，扩增的产物用重叠的接头引物(ATTCG-CATGCCATGGTCGACGAAG)和MP—52序列的重叠内引物(GGAGCCCACGAATCATGCAGTCA)进行再扩增。用NcoI酶切后，再扩增产物克隆到以同样方式酶切的载体上(pUC19(pharmacia No，27—4951—01)，它含有一个修饰过的多克隆位点，其中包括单一NcoI酶切位点)并测序。通过它们的序列与已知的MP—52 3’端序列有重叠来鉴定这些克隆。其中一个克隆被用作根据Ausubel等详细介绍的方法(Current protocols in Molecular Biology，由Greene Pub-lishing Associates and Wiley—Intersciencl出版(1989))来筛选人类基因组基因文库的探针(Stratagene NO，946203)。从8×105噬菌体λ中分离到一个噬菌体(λ2.7.4)，它含有大约20kb的插入片段，并以保藏号7387保藏在DSM中。这个克隆还含有除象扩增方法中介绍的从mRNA中分离的序列作的其他序列信息。
为了作序列分析，把大约7.5kb的HindIII片段亚克隆到按同样方法酶切的载体中(Bluescript SK，Stratagene No.212206)。这个取名为SKL52(H3)MP12的质粒也保藏在DSM，保藏号为7353。SEQID NO.1中显示的序列信息就是从噬菌体λ2.7.4中推衍出来的。640位的ATG是在这个读框内的第一个ATG(终止密码子出现在403位上)。根据这些序列资料，可以假设它是翻译的起始密码子。
这一基因组DNA在SEQ ID NO.1中第1270和1271之间含有一个大约2kb的内含子，内含子的序列尚不清楚。通过对一个扩增产物的序列分析，证实了这个剪接位点的正确性，该扩增产物是从含有这一序列的cDNA中衍化出来的。这些序列资料是用一种略有改进的方法得到的。此法Frohmann详细介绍过(Amphifications，perkin—Elmer Corporation出版，Issue 5(1990).pp11—153。也用于分离MP—52 3’端的相同胚胎RNA，通过使用MP—52序列5’端方向的内引物(ACAGCAGGTGGGTGGTGTGGACT)进行反转录。用末端转移酶将PolyA尾巴连到第一条cDNA链的5’末端上。进行两步法扩增。第一步使用一个由oligo(dT)和一接头序列(AGAATTCG-CATGCCATGGTCGACGAAGC(T16))组成的引物，第二步使用一个接头引物(AGAATTCGCATGCCATGGTCGACG)和一个来自MP—52序列的内引物(CCAGCAGCCCATCCTTCTCC)。用相同的接头引物及重叠的来自MP52序列的内引物对扩增产物再行扩增。随后用重叠的接头引物(ATTCGCATGCCATGGTCGACGAAG)及重叠的来自MP—52序列的内引物对再扩增产物再次扩增。把最后扩增产物平端克隆到用EcoRV酶切的载体上(BLuesctipt SK，Stratagene No.212206)。用它们与λ2.7.4 DNA重叠的序列进行这些克隆体的鉴定。
此外，还筛选了由人成纤维细胞RNA产生的并克隆到λgt10中的cDNA文库。以这种方法，用大约1kb的MP—52基因组DNA片段(到3’非翻译区里HindIII位点的第二个外显子)作放射性探针检测了2×106噬菌体。挑出了17个混合噬菌斑，并用MP—52序列的5’和3’端引物，通过PCR反应来检查。随后选出8个噬菌斑并作了分离。用EcoR1作部分酶切，从噬菌体中分离出cDNA，并克隆到也用EcoR1酶切的Bluescript载体中。
对得到的一个质粒SK52L15.1 MP25进行测序表明，最大的噬菌体(15.1)从SEQ ID NO.1中第321位核苷酸开始。此外，剪接位点(1270位核苷酸)也被测序所证实。
质粒SKL 52(H3)MP12于1982年12月10日保存于DSM中(“Deutsche Sammlung Von Mikroorganismen and Zellkulturen，Mascheroder Weg 16，38124 Braunschweig)、保藏号为7353。
噬菌体λ2.7.4于1993年1月13日保存在DSM中，保藏号为7387。
质粒SK52 L15.1MP25于1993年7月16日保存于DSM中、保藏号为8421。
实施例2：
MP52的表达：
对MP52的表达，检查了各种系统。用痘苗病毒作为表达系统在现代分子生物学方法(以下简写为CP)一书中详细介绍过(见16章15～18节)(Ausubel等，Greene Publishing，Associates and Wiley—InterScience，Wiley和Sons)，并能被本领域技术人员所重复。这一表达系统是基于外源DNA能通过某些载体同源重组整合到痘苗病毒基因组里去。出于这一目的，所用载体含有来自痘菌病毒基因组里的TK(胸苷激酶)基因。此外，为了能筛选重组病毒，载体还含有黄嘌呤、鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(gpt)基因(Falkner等，J.virol，62(1988)，1849—1854)。把带有MP52完整编码序列的cDNA克隆到这种载体中。cDNA来自质粒SK52L15、1MP25(DSM，保藏号8421)，然而，它是先缺失再亚克隆的，以便去掉大部分5’端非翻译区。为此，用SalI将SK52L15.1MP25质粒酶切成线性并用ExoIII/mang bean药盒根据厂家说明一步步将5’端缺失(Stratasenl #2003330)。用BamHI酶切后，从残留载体中把已有不同长度缺失的MP52 cDNA分离出来，并用琼脂糖凝胶电泳分离，再根据标准方法(Sambrook等，Molecular Cloning，second edition，Cold Spring Harbor cab-oratary press(1989))把它(pSK52s)亚克隆到用EcoRV和BamHI酶切的载体pBluescriptII SK中(Stratagene #212206)。所有的酶切反应均按厂家说明进行。用测序酶测序(USB/Amersham #70770)产生一个特别的克隆，它起始于SEQ ID NO.1第576位核苷酸(距起始密码子64个碱基对)。用SalI和SacI双酶切把插入的cDNA从中分离出来并克隆到同样酶切的载体上以在痘苗病毒系统中重组。得到的质粒pBP1MP52s)于1994年5月24日保存在DSM中(保藏号为9217)，并被用于产生重组痘苗病毒。为此，用2ml PBS中的野生型痘苗病毒感染35mm培养皿中高达80％的汇合的143B细胞(HuTK，ATCC CRL 8303)，室温下放置30分钟，不定时振动(每10个细胞1个病毒)。吸去上清液后加入2ml培养液(MEM、Gibco BRL #041—01095)，37℃保温2小时。随后去掉培养液，用100ng质粒pBPIMP52s DNA、2μg载体DNA(小牛胸腺DNA，Boehringer Mannheim#104175)和10μl Lipofectin(脂质转染试剂)(Gibco BRL # 18292—011)在1ml MEM中、于37℃保温15小时来完成这些细胞的转化。加入1ml含有20％FCS(Gibco BRL # 011～06290)的MEM后，这些细胞在37℃再保温24小时，然后冰冻裂解这些细胞。
有关黄嘌泠—鸟嘌呤磷酸核糖转移酶gpt的选择及单个重组病毒的分离及扩增，基本上按CP一书中第16章17节所述方法进行，只是使用的是RK 13细胞(ATCC CCL37)。
通过斑点印迹和Southern印迹杂交分析(CP 16.18单元)证实了MP52 cDNA整合到了病毒基因组中。用重组病毒来分析在143B细胞系(HuTK，ATCC CRL 8303，人)中的表达。汇合细胞用与细胞数相应的病毒在37℃感染45分钟，然后加入各自的培养液(MEM、Gibco BRI # 041—01095)，含有10％的FCS和青霉素/链霉素(1∶500，Gibco RRL # 043—05140H)。37℃6个小时后，去掉培养液，用HBSS(Gibco BRL # 042—04180M)洗细胞2次，加入不含FCS的生产培养液(如MEM)。生产表达20到22小时后，收集细胞上清液。用标准的Western印迹方法(CP，10.8单元)分析表达产物。为此，通过加入等体积的丙酮并在冰浴中至少放置1小时，然后离心。来沉淀100到500μl细胞培养上清液中的蛋白。沉淀重新悬浮在应用缓冲液(7M尿素，10％SDS，7mM磷酸二氢钠，0.01％溴酚兰和需要时的10％β—二巯基乙醇)中，用15％聚丙烯酰胺凝胶电泳来进行分离。用带色的蛋白分子量标准品(Gibco BRL# 26041—020)作标志蛋白。用标准方法进行转膜(PVDF、Immobilon# IPVH00010)和封闭膜。
为了在膜上检测MP52蛋白，在小鸡和兔子中制备抗MP52的多克隆抗体。为此，在大肠杆菌中表达N末端带有6个组氨酸的MP52成熟部分，再按Hochuli等人介绍的方法纯化(BIO/Technolo-gy，Vol，6，1321—1325(1988))。两种抗体能特异性检测MP52的表达，其中双体MP52识别能力不如单体MP52。图3中显示的West-ern印迹结果用的是鸡抗体，它是通过PEG沉淀(Thalley等BIO/Technology Vol.8 934—938(1990))和膜结合抗原(含有6个组氨酸的成熟MP52)特异性纯化出来的(Sambrook等，Molecular Cloning一书的18、17，Second edition，cold Spring Harbor Laboratoy Press1989)。用碱性磷酸酶标记的抗鸡IgG(Sigma A9171)作为第二抗体。用Tropix Western—Light蛋白检测药盒(Serva # WL10RC)根据厂家说明进行检测。
图3中Western印迹结果表明：只在重组病毒出现MP52特异性带，而野生型病毒没有(无整合的外源DNA)。MP52表达在非还原条件下电泳胶中生产一种表观分子量为约25kDa的分泌蛋白。而在还原条件下，蛋白在胶中迁移到14到15KDa处。这些结果表明：MP52是以双体成熟蛋白表达的。在Western印迹结果中于60KDa附近出现的弱带可能是未酶解的前体蛋白残留物。这一迁移特点也证实了可由SEQ ID NO.2推断的分子量，据此，成熟的单体MP52分子量为13.6kDa。
已证明可在多种细胞系里表达MP52并由前体蛋白酶分解成熟MP52。已试验过C127(ATCC CRL 1616，小鼠)，BHK21(ATCCCCL 10，地鼠)，MRC—5(ATCC CCL 171，人类)和ST6—Swiss albino(ATCC CCL96，小鼠)细胞。
还在真核表达系统中证实了MP52表达和酶解成成熟的MP52。为此，把MP52的cDNA(从576位核苷酸开始)克隆到表达质粒pSG5(Stratagene # 216201)中，用ClaI和XbaI酶切质粒pSK52s，并用T4聚合酶处理使MP52插入的突出末端为平末端。按标准方法把它克隆到用EcoRI酶切并同样用T4聚合酶处理成平末端的载体pSG5中。所有酶解反应均按厂家说明进行。MP52正确插入方向由内切酶分析和T7引物(Stratagene # 300302)的测序分析得以保证。得到的质粒pSG52s(于1994年5月17日保藏在DSM中，保藏号为DSM9204)可与一种载体共转化，此载体编码一种可选择标记，如G418抗性基因等，以便得到稳定细胞系。为达到这一目的，根据厂家说明使用Lipofectin(Gibco BRL #1 8292—011)，将pSG52s与质粒p3616(1994年5月17日保藏在DSM中，保藏号为DSM 9203)共转化到L929细胞(ATCC CCL1，小鼠)中。用本领域里技术人员熟悉的方法进行G418筛选(CP.9.5单元)，得到了一个能产生在Western印迹中可测到的成熟MP52的细胞系。
用pABWN质粒(Niwa等，Gene 108(1991)，193—200及图4)又得到一个表达MP52的载体，pABWN是由Dr.Miyazaki提供的。
为此，对质粒pSK52s的HindIII的片段(起始于SEQ ID NO.1中576位核苷酸)分离出来，并用Klenow片段处理其突出末端使成平末端。通过对其两个末端连接适宜的接头：AGCGGCCGCT
                                  TCGCCGGCGA引进NotI限制性内切酶位点。载体pABWN用XhoI处理，再用Klenow片段处理，并用牛肠碱性磷酸酶脱磷酰化(BoehringerMannhein)。与同样脱磷酰化的接头连接起来，这样被NotI酶切的MP52片段插入到已产生了NotI酶切位点的载体上成为可能了。产生的表达载体以后就用HindIII—MP52/pABWN表示。进行克隆的所有反应都是根据标准方法(如CP 3.16单元)进行的。
用测序和内切酶图谱证实了表达载体HindIII—MP52/pABWN的结构，它含有在SEQ ID NO.1中从576位核苷酸起始到2278位核苷酸终止的MP52序列。
HindIII—MP52/pABWN在L细胞里(小鼠成纤维细胞)转染，从而建立了稳定的转化子。
对每次转染，取4μg HindIII—MP52/pABWN或pABWN质粒，用20μg lipofectAMINE试剂(Gibco BRL # 18324—012)转染6cm培养皿中的5×105L细胞。为此，把溶液A(200μl OPTI—MEMI(GibcoBRL # 31985)中含有各自4μg DNA)与溶液B(200μl OPTI—MEMI中含有20ml lipofect AMINE)小心混合，室温下孵育45分钟，使形成DNA脂质体复合体。在这一过程中，用2ml OPTI—MEM I洗涤细胞一次。对每次转染，把1.6ml OPTI—MEM I加到含有DNA脂质体复合物的试管里。溶液小心混合，并把洗涤过的细胞盖于其上。细胞和稀释复合物在37℃ CO2孵箱中孵育5小时，孵育后加入2mlDMEM(Gibco BRL，Dulbecco′s modified eagle mediam)/20％FCS。转染24小时后，用新鲜的DMEM/10％FCS更换一次培养液。48小时后，把细胞转移到一个10cm的培养皿中。72小时后，以800μg/ml浓度的G418进行筛选。1～2周后，可出现稳定的克隆。
从汇合的转化子中得到5ml带有或不带有FCS的条件培养基DMEM，这些汇合的转化子在10cm培养皿中生长了3天，用Western印迹方法检查转染细胞的两种不同细胞培养上清液(HindIII—MP52/pABWN和pABWN以及细胞裂解液。用这种方法，在HindIII—MP52/pABWN转染的条件培养液和细胞裂解液中发现了成熟的MP52。这些克隆又被进一步克隆，并在每次Western印迹分析后又筛选出产生MP52的细胞。从Western印迹分析估计，MP52产率可高达1mg/L。
实施例3：
MP52的生物学活性；
为了测定MP52的生物学活性，在体内外作了几种试验，以证明本发明在预防和/或治疗骨疾病等医学领域中的用途。
1，体外试验
1.1，因为有人介绍，用TGF—β刺激后软骨细胞中糖胺聚糖(GAG)合成有增加(Hiraki等，Biochimica et Biophgsica Acta 969(1988)，91—99)，所以我们要检查MP52是否也有这种作用。用能产生MP52的L细胞转化子(以HindIII MP52/pABWN转染的)的细胞培养上清液(含10％FCS的DMEM)，在大鼠胎儿四肢的初级培养物中试验了MP52的软骨生成活性。
为此，使用16日龄的胎鼠四肢。胰蛋白酶消化后，在含有10％FCS的F—12培养基(Nutrient mixture Ham′s F—12，Gibco BRL#21700)中得到的细胞按3×105细胞数铺到用I型胶原包被的24孔平板上，并培养大约2天直到细胞汇合为止。把56μHindIII—MP52/pABWN—L细胞转化子条件培养液(CM)或pABWN—L细胞转化子条件培养液或仅培养液(DMEM—含10％FGS)加到500ml每个试验的培养液中(含有10％FCS的F—12培养液)。使用含有10％FCS和各自添加物的F—12培养液培养0、3、6和9天。含有各自添加物的培养液每3天换一次。此后在不含有FCS、有各自添加物存在的F—12培养液中(条件培养基或对照培养基)再培养2天，然后加入35S硫酸盐6个小时。链霉蛋白酶E消化并按Hikaki等人介绍的方法沉淀(Biochimica et Biophysica Acta 969(1985)，91—99)，后测定35S掺入多糖的量。
表1：
               放射活性(cpm/孔)孵育天数    含10％FCS      pABWN—        HindIII—Mp52/
      的对照L细胞的    L细胞转化子    pABWN—L细胞转
          DMEM         的CM           化子的CM2        3720±114        3865±120      4879±4225     4188±135    4154±29     8223±275*8     3546±160    3310±115    9890±1260*11    3679±218    3633±167    7520±160*
这些值是3或4种培养混合物的±S.E.M.
*：P＜0.01 VS pABWN—L细胞转化子的DMEM和CM(Scheffe′s多重t—检验)
正如表1中所显示的那样，产生MP52的转化子细胞培养上清液与纯培养液(含10％FCS的DMEM)或用pABWN转染的L细胞培养上清液相比有明显的刺激GAG合成作用。这表明MP52能刺激软骨细胞分化。
1.2已介绍过的BMP家族中某些成员的一种作用就是在成骨细胞中刺激碱性磷酸酶(ALP)活性的作用。克隆的大鼠细胞系ROB—C26(C—26)是相对成熟早期阶段的成骨细胞(Yamaguchi等，Calcif.Tissue Int.49(1991)，221—225)。对骨诱导性蛋白如BMP—2刺激ALP活性的能力，Yamaguchi等人已作过介绍(J.ced Biol，113(1991)681～687)。
按下述方法检查MP52对C—26细胞的作用：把C26细胞按每孔3×104铺到24孔平板里并在α—MEM培养液(Gibco BRL)/10％FCS中培养直至汇合为止。取56μl产生MP52的L细胞转化子(HindIII—MP52/pABWN)转染的L细胞培养上清液或pABWN—L细胞转化子转染的细胞培养上清液或仅L细胞培养上清液(含10％FCS的DMEM)，加到500μl C—26细胞培养基中。带有各自添加物的培养基每3天换一次。在0、3、6、9和12天后，按如Takuwa等人介绍的以磷酸对硝基苯酯作为底物的标准技术，检测细胞提取物中的ALP活性(Am.J.physiol，257(1989)、E 797—E803)。
表2：
             每孔的ALP活性(nmol/min)孵育天数    含10％FCS          培养pABWN—     培养HindIII—
        培养对照L′细      L细胞转化子的   MP52/pABWN
        胞的DMEM           CM培养液        —L细胞转化
                                          子的CM培养液
0       41.8±2.8         41.8±2.8       41.8±2.8
3       136.3±3.7        125.8±2.3      181.3±14.2*
6       129.0±7.8        119.3±6.4      258.0±8.3*
9       118.4±3.7        110.1±2.8      258.4±10.6*12       121.2±3.2        125.3±6.0      237.8±11.0*
其中数值为4种培养混合物的±S.D.。
*P＜0.01vs培养pABWN—L细胞转化子的DMEM和CM(Scheffe′s多重t—检验)
正如表2中所显示的那样，加入MP52导致ALP活性与纯DMEM/10％FCS培养液及pABWN感染的L细胞培养液相比有明显的增加。这一结果表明，MP52可能不仅仅会引起软骨细胞分化，而且还能导致成骨细胞分化和成熟。
以Takuwa等人介绍的方法(Biochem，Biophys，Res.Com.174(1991)、96—101)，用BMP—2处理使ALP活性有所增加的另外一个成骨细胞细胞系(MC3T3—E1、小鼠)，与产生MP52的L细胞转化子的条件培养液(HindIII—MP52/pABWN)或与用重组痘苗病毒感染MP52产生后的培养液孵育后，ALP活性没有任何改变。这表明MP52有细胞特异性，这部分区别于BMP—2。由于TGF—β家族各个成员有不同的靶位点而导致的不同功能可能有很大的医学作用。2.体内试验：2.1.检查骨发育最确定的可能性是基于体内异位骨形成。例如这可能是由脱矿质化骨基质植入引起的(Urist，Science 150(1965)、893—899)。同样的过程可能由象Sampath等人所介绍的(PNAS*Proc.Natl.Acad.Soi.USA 78(1981)，7599—7603)非活性基质和骨诱导蛋白结合引起。骨形成的这一过程类似于胚胎软骨内的骨形成及成人骨的愈合。因此这种方法可在体内检查蛋白的骨诱导能力。
把在痘苗系统中表达(见实例2)而得到的MP52蛋白部分纯化并植入以便进行这种检查试验。
为此，在培养皿和转瓶中培养143B细胞(HaTK，ATcc CRL，8303)直至汇合，按实施例2中所述方法用重组病毒感染，以便进行表达分析。洗涤这些细胞并在MEM(Gibco BRL，大约每ml有106细胞)中培养约20个小时以便积累MP52蛋白。同样的制备物用野生型病毒感染作为对照。收集每批试验的细胞培养上清液(条件培养基)并离心(4℃40000xg，30分钟)。为了去掉病毒，使上清液过一个无机滤膜过滤(孔径0.1μM，Whatman，Anotop 25)。在鉴定MP52过程中，已表明这种蛋白会与肝素化琼脂糖凝胶结合。利用这种特性进行部分纯化。为此，把滤过的离心后条件培养液调整到终浓度为50mM TrisPH 7.0，100mM NaCl和6M尿素的缓冲液里，上样到已用缓冲液A(50mM Tris pH7.0，100mM NaCl和6M尿素)平衡过的肝素化柱上(HiTrapTM，pharmacia # 17—0407—01)。上样后的柱子用缓冲液A洗涤，并用线性梯度到100％的缓冲液B(50mMTris pH7.0，600mM NaCl和6M尿素)以每分钟0.5ml/m流速洗脱50分钟(每2.5ml收集一管)。尿素并不是绝对需要的。MP52洗脱物主要是在大约250到400mM NaCl浓度下的2个流份中可重复地出现，这可用Western印迹分析检查出来(见实施例2)。这些流份的样品还用15％聚丙烯酰胺凝胶电泳胺厂家说明银染色进行了检查，(Silver Stain—II Daiichi #SE140000)，并把两个流份合并。由野生型病毒感染后，以条件培养基培养，其上清液纯化后在银染凝胶中分析，相应部分也合并。
进一步检查MP52，表明MP52也能和羟基磷灰不结合。因此原则上，通过羟基磷灰石柱或用羟基磷灰石柱代替肝素化柱也可能达到进一步纯化目的(如BIO—RAD，Econo—pas HTP)。对本领域内技术人员还可想出进一步纯化的其他方法，如用凝胶过筛柱，离子交换柱，亲和层析柱，金属嵌合柱或基于疏水性作用的柱。
用肝素化琼脂糖凝色谱法纯化的MP52蛋白或在野生型病毒感染的细胞培养上清液中也存在的仍污染的相应蛋白，用反相HPLC方法进一步纯化。为此，用10％缓冲液B(缓冲液A：0.1％三氟乙酸；缓冲液B：90％乙腈、0.1％三氟乙酸)平衡C8柱(AquapazeRP300，Applied Biocsy，粒径：7μM：孔径：300A)，把肝素柱上洗脱下来含有MP52的部分合并上到C8柱上后、用10％缓冲液B彻底洗涤。再用下列梯度液洗脱结合蛋白：10到50％缓冲液B先洗20分钟，再用50到100％缓冲液B洗脱50分钟。每500μl收集一份并用Western印迹及银染凝胶电泳法分析。在选定条件下，MP52大约在55到65％乙腈的范围内被洗脱下来。合并含有MP52的流份。由野生型病毒感染的细胞培养上清液经对照纯化后，相应流份进行同样处理。
根据Western印迹分析法估测浓缩为50ng/ml的部分纯化的MP52蛋白，在ROB—C26细胞中孵育3天后，也明显增加ALP活性。
部分纯化的MP52蛋白和用野生型病毒感染后从细胞培养上清液相应部分纯化的对照蛋白与基质重构并植入到大鼠中，以证明它们的软骨和骨形成能力。
原则上，对本领域内技术人员熟知的各种基质材料都是可用的，即天然的(也包括修饰过的)和合成制备的基质，然而优选的是那些能生物降解的具有生物相容性的多孔材料。在这些试验中，使用的是大鼠骨基质，按基本类似于Sampath等人介绍的方法制备(PNAS 80(1993)、6591—6595)。大鼠骨骼(股骨和胫骨)在0.6MHCl中脱矿物质24小时，随后去掉仍存在的骨髓。用水洗涤并在氯仿/甲醇(1∶1)混合液中脱脂3小时后，将这些骨空气干燥，并在深冻状态用小磨研成粉状，筛出400到1000μM大小的颗粒。然后在有蛋白酶抑制剂存在的情况下于4M盐酸胍中室温下放置7天来提取基质。用水彻底洗涤后，将基质冷冻干燥并在4C保存。以这种方法处理的基质。自身不显示骨诱导活性。
蛋白可以和本领域内技术人员所知的各种方法提取的骨基质结合。
对每次试验和每个植入物，把经肝素—琼脂糖和反相HPLC纯化并在乙腈/三氟乙酸溶液洗脱后的MP52蛋白或对照蛋白与25mg基质结合，充分混合、深冻并冷冻干燥。
对基质结合的MP52蛋白的植入，使用2只大约3月龄的大鼠(Whistar)，鼠是经过肌内注射麻醉剂(0.2ml Rompun(Bayer)混合0.5ml Ketanest 50(Parke Davis))麻醉的，每100g体重注射0.14ml剂量。为了植入，在腹肌制备双侧袋(胸廓下，从最低肋弓下大约0.5cm处开始)。把基质结合的MP52蛋白(由Westera印迹方法估计的大约2到4μg量)以及相应的基质结合的对照蛋白用0.9％盐溶液润湿(Delta Plarma)，再引入肌袋中。随后把肌袋和必须的皮肤切口缝合。大鼠用环孢菌素A(Sandimman)作免疫抑制处理。
18天或26天后，从大鼠中取出植入物，并固定以便作组织学检查。因为可假定26天后带有MP52的植入物已经发生了肉眼可见的骨形成，这一植入物包埋在甲基丙烯酸甲酯中以便制备薄切片，其他植入物包埋在石醋中。用Von Kossa染色技术(Romeis，B.，″Mikroskopis che Technik″，Ed：Bck，P.，Urban and Schwarzenberg；Mu-nich，Baltimore，Vienna(1989))，矿质化的软骨和骨骼组织强染成黑色。以Masson—Goldner等介绍的三色染色技术(Romeis，B.，″Mikroskopische Technik“，Ed：Boch，P.；Urban and Schwarzenberg；Mu-nich，Baltimore，Vienna(1989))、矿质化的骨组织和胶原被染成亮绿色、软骨被染成红色、胞浆被染成棕红色。对两只大鼠的植入物都使用两种染色技术。在两个试验动物中，用两种染色技术，在含有MP52的植入物中都检测到了明显的软骨及骨形成。而在含有对照蛋白的相应植入物中没有显示出有软骨或骨的形成。带有软骨细胞的软骨前体和细胞外基质开始形成的软骨区的数目及其在同心环处的矿质化，18天后的MP52植入物比26天后的多。然而，在18天后的植入物中，还能检测到带有媒体骨样的成熟骨组织以及骨中的单个骨细胞。此外，随着骨髓的形成能观察到致密的小骨。在26天后的植入物中。开始基质形成的软骨区和钙化作用也检测到了，然而，染成绿色并有骨细胞及骨样边缘的矿质化骨组织部分明显增加。在这样的植入物中，骨髓形成以及分离的脂肪细胞一块也都能检出。为了说明这一点，图5显示26天后整个植入物骨材料的染色检测结果(根据Von Kossa染色技术)。相同植入物的小切片，用Masson—Goldner介绍的方法染色结果表示在图6中。它显示带有立方形成骨细胞的活性骨和类骨样的活性骨，其中也能识别出单个包埋的成骨细胞。而且在矿质化的骨组织中也能看到单个骨细胞(在原始的制片中染成绿色)。也能检测到骨髓的形成。
实验表明：重组产生的MP52单独与一种基质结合能诱导软骨内骨形成。2.2，为了证明这一结果，用MP52感染的L细胞转化子进行了骨形成的异位试验。对每次试验，把产生MP52的L细胞(用HindIII—MP52/pABWN转染的)和不产生MP52的L细胞(pABWN转染的)以1×106细胞数接种到3只雄性裸鼠的两侧股骨肌肉中。3周后，杀死所有的小鼠，切除股骨肌肉。并用低能量X—射线检测仪及组织病理学方法检查它们。
用X—射线检测表明：在所有产生MP52的L细胞的肌肉组织接种部位都有致密物质，正如表3中所列出的那样。用组织学检查在这些肌肉组织中能够测出简单软骨形成和钙化软骨形成。这些结果也证实了MP52能诱导软骨内的骨形成。
表3：
                   产生MP52的L细胞   对照细胞
                   (用HindIII—MP52/ (用pABWN转
                   pABWN转染的)      染的)用X—射线检查到致密物  3/3                 0/3用组织学方法检查到软骨 3/3                 0/3细胞用组织学方法检查到钙   3/3                 0/3化软骨形成
试验证实MP52蛋白刺激未分化间叶细胞形成软骨以及成骨细胞的分化和成熟。这导致软骨内的骨形成，类似于在胚胎骨形成和骨折的骨愈合过程中诱导的串联反应。
试验中讲到的条件应看作是对MP52活性的说明而不是限制，本发明也用其他形式(条件)作过检查和鉴定。
对本申请中涉及到的细胞系和质粒都附有保藏证明，其中收集了保藏的详情。SEQ ID NO.1序列类型：核酸序列名称和来源：MP—52 DNA长度：2703个核苷酸CCATGGCCTCGAAAGGGCAGCGGTGATTTTTTTCACATAAATATATCGCACTTAAATGAGTTTAGACAGCATGACATCAGAGAGTAATTAAATTGGTTTGGGTTGGAATTCCGTTTCCAATTCCTGAGTTCAGGTTTGTAAAAGATTTTTCTGAGCACCTGCAGGCCTGTGAGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGAAGTATTTTCACTGGAAAGGATTCAAAACTAGGGGGAAAAAAAAACTGGAGCACACAGGCAGCATTACGCCATTCTTCCTTCTTGGAAAAATCCCTCAGCCTTATACAAGCCTCCTTCAAGCCCTCAGTCAGTTGTGCAGGAGAAAGGGGGCGGTTGGCTTTCTCCTTTCAAGAACGAGTTATTTTCAGCTGCTGACTGGAGACGGTGCACGTCTGGATACGAGAGCATTTCCACTATGGGACTGGATACAAACACACACCCGGCAGACTTCAAGAGTCTCAGACTGAGGAGAAAGCCTTTCCTTCTGCTGCTACTGCTGCTGCCGCTGCTTTTGAAAGTCCACTCCTTTCATGGTTTTTCCTGCCAAACCAGAGGCACCTTTGCTGCTGCCGCTGTTCTCTTTGGTGTCATTCAGCGGCTGGCCAGAGGATGAGACTCCCCAAACTCCTCACTTTCTTGCTTTGGTACCTGGCTTGGCTGGACCTGGAATTCATCTGCACTGTGTTGGGTGCCCCTGACTTGGGCCAGAGACCCCAGGGGACCAGGCCAGGATTGGCCAAAGCAGAGGCCAAGGAGAGGCCCCCCCTGGCCCGGAACGTCTTCAGGCCAGGGGGTCACAGCTATGGTGGGGGGGCCACCAATGCCAATGCCAGGGCAAAGGGAGGCACCGGGCAGACAGGAGGCCTGACACAGCCCAAGAAGGATGAACCCAAAAAGCTGCCCCCCAGACCGGGCGGCCCTGAACCCAAGCCAGGACACCCTCCCCAAACAAGGCAGGCTACAGCCCGGACTGTGACCCCAAAAGGACAGCTTCCCGGAGGCAAGGCACCCCCAAAAGCAGGATCTGTCCCCAGCTCCTTCCTGCTGAAGAAGGCCAGGGAGCCCGGGCCCCCACGAGAGCCCAAGGAGCCGTTTCGCCCACCCCCCATCACACCCCACGAGTACATGCTCTCGCTGTACAGGACGCTGTCCGATGCTGACAGAAAGGGAGGCAACAGCAGCGTGAAGTTGGAGGCTGGCCTGGCCAACACCATCACCAGCTTTATTGACAAAGGGCAAGATGACCGAGGTCCCGTGGTCAGGAAGCAGAGGTACGTGTTTGACATTAGTGCCCTGGAGAAGGATGGGCTGCTGGGGGCCGAGCTGCGGATCTTGCGGAAGAAGCCCTCGGACACGGCCAAGCCAGCGGCCCCCGGAGGCGGGCGGGCTGCCCAGCTGAAGCTGTCCAGCTGCCCCAGCGGCCGGCAGCCGGCCTCCTTGCTGGATGTGCGCTCCGTGCCAGGCCTGGACGGATCTGGCTGGGAGGTGTTCGACATCTGGAAGCTCTTCCGAAACTTTAAGAACTCGGCCCAGCTGTGCCTGGAGCTGGAGGCCTGGGAACGGGGCAGGGCCGTGGACCTCCGTGGCCTGGGCTTCGACCGCGCCGCCCGGCAGGTCCACGAGAAGGCCCTGTTCCTGGTGTTTGGCCGCACCAAGAAACGGGACCTGTTCTTTAATGAGATTAAGGCCCGCTCTGGCCAGGACGATAAGACCGTGTATGAGTACCTGTTCAGCCAGCGGCGAAAACGGCGGGCCCCACTGGCCACTCGCCAGGGCAAGCGACCCAGCAAGAACCTTAAGGCTCGCTGCAGTCGGAAGGCACTGCATGTCAACTTCAAGGACATGGGCTGGGACGACTGGATCATCGCACCCCTTGAGTACGAGGCTTTCCACTGCGAGGGGCTGTGCGAGTTCCCATTGCGCTCCCACCTGGAGCCCACGAATCATGCAGTCATCCAGACCCTGATGAACTCCATGGACCCCGAGTCCACACCACCCACCTGCTGTGTGCCCACGCGGCTGAGTCCCATCAGCATCCTCTTCATTGACTCTGCCAACAACGTGGTGTATAAGCAGTATGAGGACATGGTCGTGGAGTCGTGTGGCTGCAGGTAGCAGCACTGGCCCTCTGTCTTCCTGGGTGGCACATCCCAAGAGCCCCTTCCTGCACTCCTGGAATCACAGAGGGGTCAGGAAGCTGTGGCAGGAGCATCTACACAGCTTGGGTGAAAGGGGATTCCAATAAGCTTGCTCGCTCTCTGAGTGTGACTTGGGCTAAAGGCCCCCTTTTATCCACAAGTTCCCCTGGCTGAGGATTGCTGCCCGTCTGCTGATGTGACCAGTGGCAGGCACAGGTCCAGGGAGACAGACTCTGAATGGGACTGAGTCCCAGGAAACAGTGCTTTCCGATGAGACTCAGCCCACCATTTCTCCTCACCTGGGCCTTCTCAGCCTCTGGACTCTCCTAAGCACCTCTCAGGAGAGCCACAGGTGCCACTGCCTCCTCAAATCACATTTGTGCCTGGTGACTTCCTGTCCCTGGGACAGTTGAGAAGCTGACTGGGCAAGAGTGGGAGAGAAGAGGAGAGGGCTTGGATAGAGTTGAGGAGTGTGAGGCTGTTAGACTGTTAGATTTAAATGTATATTGATGAGATAAAAAGCAAAACTGTGCCTSEQ ID NO：2序列类型：氨基酸序列名称和来源：MP—52蛋白长度：501个氨基酸MRLPKLLTFL   LWYLAWLDLE   FICTVLGAPD   LGQRPQGTRP   GLAKAEAKERPPLARNVFRP   GGHSYGGGAT   NANARAKGGT   GQTGGLTQPK   KDEPKKLPPRPGGPEPKPGH   PPQTRQATAR   TVTPKGQLPG   GKAPPKAGSV   PSSFLLKKAREPGPPREPKE   PFRPPPITPH   EYMLSLYRTL   SDADRKGGNS   SVKLEAGLANTITSFIDKGQ   DDRGPVVRKQ   RYVFDISALE   KDGLLGAELR   ILRKKPSDTAKPAAPGGGRA   AQLKLSSCPS   GRQPASLLDV   RSVPGLDGSG   WEVFDIWKLFRNFKNSAQLC   LELEAWERGR   AVDLRGLGFD   RAARQVHEKA   LFLVFGRTKKRDLFFNEIKA   RSGQDDKTVY   EYLFSQRRKR   RAPLATRQGK   RPSKNLKARCSRKALHVNFK   DMGWDDWIIA   PLEYEAFHCE   GLCEFPLRSH   LEPTNHAVIQTLMNSMDPES   TPPTCCVPTR   LSPISILFID   SANNVVYKQY   EDMVVESCGC R

Claims (10)

1.编码TGF—β家族中一种蛋白的DNA分子，它包括
(a)SEQ ID NO.1中所示核苷酸序列的编码成熟蛋白的部分和需要的话，其他功能部分，
(b)在遗传密码子简并范围内与(a)相应的核苷酸序列，
(c)与(a)和(b)之一序列的等位基因衍生物相应的核苷酸序列，或
(d)与(a)、(b)或(c)之一序列杂交的核苷酸序列，条件是
根据(d)的DNA分子至少完全含有编码TGF—β家族中一种成熟蛋白的部分序列。
2.一种载体，其中至少含有一个拷贝的权利要求1的DNA分子。
3.一种宿主细胞，其中它被权利要求1的DNA或权利要求2的载体所转化。
4.权利要求3的宿主细胞，其中它是细菌、真菌、植物或动物细胞。
5.一种TGF—β家族中的蛋白质，它由权利要求1的DNA序列所编码。
6.权利要求5的蛋白质，其中它具有SEQ ID NO.2中显示的氨基酸序列，或必要时，其功能部分。
7.生产TGF—β家族一种蛋白的方法，其中培养权利要求3或4的宿主细胞，并从细胞或/和培养上清液中分离这种TGF—β蛋白。
8.一种药物组合物，其中含有至少一种权利要求5或6的蛋白作为活性物质，需要时与常用的药物载体物质，辅助物质、稀释剂或填料一起。
9.权利要求8的药物组合物，其适于治疗或预防骨、软骨、结缔组织、皮肤、粘膜、表皮或牙齿的损伤，用于牙齿植入、创伤治疗和组织再生方法中。
10.抗体或抗体片段，其中它们能与权利要求5或6的蛋白质结合。
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