KR100261823B1 - TGF-β군의 신규한 생장/분화 인자 - Google Patents

Abstract

본 발명은 TGF - β 군의 단백질, 이를 암호화하는 DNA 및 상기 단백질을 함유하는 제약학적 조성물에 관한다.

Description

TGF-β군의 신규한 생장/분화 인자

본 발명은 TGF-β 군의 생장/분화 인자 및 이의 DNA 서열 암호화에 관한다.

BMP -, TGF - 및 인히빈 -관련 단백질 (Roberts and Sporn, Handbook of Experimental Pharmacology 95(1990), 419 - 472)을 포함하는 생장 인자중 TGF-β 군은 특히 광범위한 의학적 치료 방법 및 응용물에 적당하다. 이들 인자는 상처 치료 및 조직 재생에 관한 방법에 적당하다. 더우기 TGF-β 군의 몇몇 구성원은 조직 생장, 특히 뼈의 생장을 촉진시키므로 뼈 및 연골의 발달을 촉진시키는 중요한 역할을 한다.

Wozney(Progress in Growth Factor Research 1 (1989), 267 - 280) 및 Vale 등 (Handbook of Experimental Pharmacology 95 (1990), 211 - 248)은 BMP 그룹 (bone morphogenetic proteins : 뼈 형태 형성 단백질) 및 인히빈 그룹에 관련된 인자들과 같은 여러가지 생장 인자들에 대하여 기술하고 있다. 이들 그룹의 구성원들은 중요한 구조적인 유사점들을 보인다. 단백질의 전구체는, 전구체로 부터 분열되어 성숙 단백질을 구성하는 약 110 개의 아미노산의 프로펩티드 및 카복시 -종결 서열, 아미노 - 종결 시그널 서열로 이루어진다. 또 이들의 구성원들은 아미노산 서열 상동관계에 의하여 정해진다. 성숙 단백질은 가장 상보적인 서열, 특히 군 구성원들 사이에 보존되는 7 개의 시스테인 잔기들을 함유한다. TGF-β 와 같은 단백질은 다관능, 호르몬적으로 활성인 생장 인자이다. 이들은 또한 세포의 화학주성 유인, 세포 분화의 촉진 및 연골 - 유도 및 뼈 - 유도 능력과 같은 조직 - 유도 능력과 같은 관련 생물학적인 활성들을 가진다. 미합중국 특허 제 5,013,649 호는 BMP - 2로 표시된 뼈 - 유도성 단백질을 암호화하는 DNA 서열에 대하여 기술하고 있으며 미합중국 특허 시리즈 제 179 101 호 - 제 170 197 호는 BMP 단백질 (BMP - 1 및 BMP 3)에 대하여 기술하고 있다. 또 많은 형태의 세포들은 TGF-β와 같은 단백질을 합성할 수 있고 실제로 모든 세포는 TGF-β 수용체를 가진다.

대체로 이들 단백질은 이들의 정확한 생물학적 기능에 중요한 변화를 일으키는 구조적인 상이점들을 보여준다. 또 이들은 광범위하게 상이한 형태의 조직내에서 다양한 발달 단계로 발견된다. 결과적으로 이들은 이들의 정확한 기능 예를 들어 요구되는 세포 생리적인 환경, 수명, 표적 위치, 보조 인자에 대한 필요조건 및 생분해에 대한 안정성에 관하여 상이점들을 보일 수 있다. 따라서 조직 - 유도성 및 특히 뼈 - 유도성 가능성을 보이는 다수의 단백질이 기술되어 왔으나 유기체내에서의 이들의 자연적인 기능 및 - 더 중요하게는 - 이들의 의학적인 적절성은 여전히 상세하게 연구되어져야 한다. 뼈형성 또는 기타 형태의 조직의 분화/유도에 중요하면서 여전히 공지되지 않은 TGF-β 군의 구성원들이 존재할 가능성이 높다고 사료되어 진다. 그러나 이들 신규한 TGF-β 류 단백질 분리의 주요한 문제점은 이들의 기능을 아직 충분히 정확하게 기술할 수 없어 식별력 있는 생물학적 검정법을 개발시킬 수 없다는 것이다. 한편 상기 군의 기타 구성원들에 대하여 예상되는 누클레오티드 서열 상동성 정도가 너무 적어 고전적인 핵산 잡종형성 기술에 의하여 스크리닝시킬 수 없다. 그럼에도 불구하고 모든 원하는 의학적인 요구조건들을 충족시키는 유도 및 분화 - 촉진 단백질을 제공하기 위하여 신규한 TGF-β 류 단백질의 분리 및 특성 묘사가 시급히 요구된다. 이들 인자들은 뼈 및/또는 신장 또는 간장과 같은 기타 형태 조직의 퇴행성 질환의 치료 및 외상의 치료에 의학적으로 사용될 수 있을 것이다.

TGF-β 단백질 MP - 52 에 대한 누클레오티드 및 아미노산 서열은 성숙 펩티드에 해당하는 서열 및 MP - 52의 프로 펩티드에 해당하는 서열의 주요 부분이 나타나 있는 특허 출원 제 PCT/EP93/00350 에 언급되어 있다. 프로펩티드 MP - 52의 완전한 서열은 기술되어 있지 않다.

본 발명의 목적은 유사분열 및/또는 분화 - 유도 (예를들어 뼈 - 유도) 가능성을 갖는 TGF-β 단백질군의 신규한 구성원들을 암호화하는 DNA 서열을 제공하는 것이다. 따라서 본 발명의 목적은 특히 TGF 단백질 MP - 52의 아미노산 서열 및 완전한 DNA 서열을 제공하는 것이었다.

이러한 목적은

(a) 완성된 단백질을 암호화하는 부분 및 바란다면 서열 제 1 번에 나타낸 누클레오티드 서열의 관능 부분

(b) 유전 암호의 동의성의 범위내에서 (a)로부터의 서열에 대응하는 누클레오티드 서열

(c) (a) 및 (b)로부터의 서열 중 하나에 대응되는 누클레오티드 서열의 대립 유전자 유도체

(d) (a), (b) 또는 (c)로부터의 서열 중 하나로 잡종형성시킨 서열로 구성되고, TGF-β 군의 단백질을 암호화화는 DNA 분자에 의하여 성취된다.

본 발명의 구체예는 특허청구의 범위 제2항 내지 제10항의 내용에 관한다. 본 발명의 기타 양상 및 이점은 바람직한 구체예 및 도면에 대한 기술로부터 추론될 수 있다. 이제 서열 프로토콜 및 도면을 간단히 기술하기로 하겠다.

서열 제1번은 TGF-β 단백질 MP - 52를 암호화하는 DNA의 완전한 누클레오티드 서열을 보여준다. ATG 출발코돈은 누클레오티드 640으로 출발된다. 성숙단백질의 출발은 누클레오티드 1782 후에 시작된다.

서열 제2번은 서열 제1번에 나타낸 누클레오티드 서열로부터 유도되었던 TGF-β 단백질 MP - 52의 완전한 아미노산 서열을 보여준다.

제1도는 7개의 보존 시스테인 잔기들 중 첫번째로 출발되는 BMP 단백질 군의 몇몇 구성원들 및 MP - 52의 아미노산 서열 비교를 보여준다. *는 비교되는 모든 단백질에서 아미노산이 동일함을 나타내고 ; +는 아미노산이 MP - 52와 비교되는 하나이상의 단백질에 대응됨을 나타낸다.

제2도는 본 발명에 사용된 올리고누클레오티드 프라이머의 누클레오티드 서열 및 TGF-β 군의 공지된 구성원들과 상기 서열의 비교를 보여준다. M은 A 또는 C를, S는 C 또는 G를, R는 A 또는 G를 나타내고 K는 G 또는 T를 나타낸다. 제2a도는 프라이머 OD의 서열을 보여주고 제2b도는 프라이머 OID의 서열을 보여준다.

본 발명은 최소한 성숙단백질을 암호화하는 부분 및 바란다면 서열 제1번에 나타낸 누클레오티드 서열 및 유전 암호의 동의성 범위내에서 상기 서열에 대응되는 서열 및 이러한 서열들의 대립형질 유도체의 관능 부분을 추가로 포함한다. 또 본 발명은 DNA 분자가 TGF-β 군의 성숙단백질을 암호화하는 최소한의 부분을 완전히 함유할 것을 조건으로 상기 서열들로 잡종형성시킨 서열을 또한 포함한다.

본 발명의 의미에서 "관능 부분"은 예를들어 시그널 펩티드, 프로펩티드 또는 성숙단백질 부분으로서 작용할 수 있는, 즉 MP -52의 천연 단백질의 하나이상의 생물학적인 관능을 충족시키는 단백질 부분을 나타낸다.

단백질의 성숙 부분을 암호화하는 부위는 서열 제1번에 나타낸 서열의 누클레오티드 1783 - 2142이다. 바란다면 DNA 분자는 또한 추가로 서열 제1번에 나타낸 서열의 관능적인 부분 즉 시그널 또는/및 프로펩티드 부분을 암호화하는 누클레오티드 서열로 구성될 수 있다. DNA 분자가 시그널 및 프로펩티드 부분 및 성숙단백질의 부분에 대한 서열 즉 서열 제1번에 나타낸 서열의 누클레오티드 640 - 2142로 구성되는 것이 특히 바람직하다. 한편 DNA 분자는 또한 성숙단백질을 암호화하는 부분외에 다른 단백질, 특히 예를들어 상기 언급한 BMP 단백질과 같은 TGF-β 군의 다른 단백질로부터의 관능적인 시그널 또는/및 프로펩티드 부분으로 구성될 수 있다. 개별적인 누클레오티드 서열은 그 공개내용을 본원이 참고로하고 있는 상기 언급한 문헌들에 나타나있다.

본 발명은 또한 서열 제1번에 나타낸 서열의 누클레오티드 1270 및 1271 사이의 비암호화 인트론을 함유하는 상기 규정한 DNA 분자를 포함한다. 이 인트론 서열은 DSM에 기탁되어 있고 MP - 52의 게놈핵산을 갖는 플라스미드 SKL 52 (H3)에 함유되어 있다.

본 발명은 또한 파아지 λ 15.1 에 의하여 암호화된 MP - 52 단백질의 cDNA 서열을 포함한다. 이 서열은 서열 제1번의 누클레오티드 321로 출발된다.

본 발명에 포함되는 대립형질, 동의성 및 잡종형성 서열이 이들의 누클레오티드 또는/및 아미노산 서열내 작은 변화롤 인하여 구조적인 차이점들을 가질지라도 이러한 서열로 암호화된 단백질은 여전히 기본적으로 동일한 의학적 응용물에 이들을 사용가능하게 하는 동일한 유용한 특성들을 본질적으로 가진다.

본 발명에서 "잡종형성" 이란 통상의 잡종형성 조건, 바람직하게는 62 - 66℃에서 6 x SSC의 염농도를 가지고 이어 62 - 66℃에서 0.1% SDS, 0.6 x SSC로 1시간 세척시키는 조건을 의미한다. "잡종형성" 이 62 -66℃에서 4 x SSC의 염농도를 가지고 이어 62 - 66℃에서 0.1 x SSC, 0.1% SDS로 1 시간 세척시키는 잡종형성 조건을 나타내는 것이 바람직하다.

본 발명의 바람직한 구체예는 척추동물, 바람직하게는 돼지 (pig), 소 (cow) 및 랫 (rat) 또는 마우스 (mouse)와 같은 설치류와 같은 포유동물, 특히 인간과 같은 영장류로부터 얻을 수 있는 상기 규정된 바와같은 DNA 서열이다.

본 발명의 특히 바람직한 구체예는 SEQ ID NO. 1에 나타낸 MP - 52로 표시된 서열이다. MP - 52의 전사물(transcript)은 태아 조직으로부터 얻어지며 BMP - 류 단백질 (제1도를 참고하시오)의 성숙부분에 대하여 상당한 아미노산 상동관계를 갖는 단백질을 암호화한다. BMP2 ( = BMP2A) 및 BMP4 ( = BMP2B)의 단백질 서열은 Wozney 등의 Science 242 (1988), 1528 - 1534 에 기술되어 있다. BMP5, BMP6 및 BMP7의 대응되는 서열은 Celeste 등의 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87(1990), 9843 - 9847에 기술되어 있다. 공지된 BMP 서열에 특정한 몇가지 일반적인 서열 상동관계가 MP - 52의 프로펩티드 부분에서 발견된 반면 MP -52의 전구체 부분의 다른 부분은 BMP 전구체와 상당한 차이점을 보인다.

또 본 발명은 본 발명 DNA 분자의 하나 이상의 복제물을 함유하는 벡터에 관한다. 본 발명 DNA 서열은 바람직하게는 발현 조절 서열과 상기 벡터로 효과적으로 결합되어 있다. 이러한 벡터는 안정적으로 또는 일시적으로 형질 전환된 세포내에서 TGF-β - 류 단백질을 제조시키는데 적당하다. 형질전환 및 차후의 배양을 위하여 여러가지 동물, 식물, 균류 및 박테리아 시스템을 사용할 수 있다. 본 발명의 벡터는 바람직하게는 숙주 세포내 복제에 필요한 서열을 함유하며 자율적으로 복제가능하다. 또 숙주 세포의 형질전환을 검출하기 위하여 사용할 수 있는 선택가능한 표지 유전자를 함유하는 벡터를 사용하는 것이 바람직하다.

또 본 발명은 본 발명 DNA 또는 본 발명 벡터로 형질전환된 숙주 세포에 관한다. 적당한 숙주 세포의 예에는 이. 콜리와 같은 원핵 및 진핵 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 포유동물 세포 및 이스트와 같은 균류가 포함된다.

또 본 발명은 특허청구범위 제1항의 DNA 서열에 의하여 암호화된 TGF-β 군의 단백질에 관한다. 본 발명의 단백질은 바람직하게는 SEQ ID NO. 2에 나타낸 아미노산 서열 또는 바란다면 이의 관능 부분을 가지며 조직 - 유도성 특히 뼈 - 유도성 또는/및 치료 용도에 적절할 수 있는 유사분열 능력과 같은 생물학적인 특성을 보인다. 상기 언급한 단백질의 특성들은 호모이위체 또는 헤테로이위체의 형성에 따라 변할 수 있다. 이러한 구조는 또한 임상응용물에 적당할 수 있을 것이다.

본 발명 단백질의 생물학적인 특성, 특히 유사분열 및 뼈 - 유도 가능성은 예를들어 Seyedin 등의 PNAS 82 (1985), 2267 - 2271 또는 Sampath 및 Reddi 의 PNAS 78 (1981), 7599 - 7603 에 따른 분석법으로 측정할 수 있다.

또 본 발명은 본 발명의 DNA 또는 본 발명의 벡터로 숙주 세포를 형질전환 시키고 상기 세포 또는/및 배양 상청액으로부터 TGF-β 단백질을 분리시키는 것을 특징으로하는 TGF-β 군 단백질의 제조방법에 관한다. 상기 방법은 형질전환된 숙주 세포를 적당한 배양 매질내에서 배양시키는 단계 및 생성된 TGF-β 류 단백질을 정제시키는 단계로 구성된다. 이러한 방식으로 본 방법은 생장 인자를 요하는 세포 배양 기술을 사용하는 응용물 또는 의학적인 치료용의 적절한 양의 의도하는 단백질의 제조를 가능하게 한다. 숙주 세포는 바실러스(Bacillus) 또는 이. 콜리와 같은 박테리아, 이스트와 같은 균류, 담배, 감자 또는 애러비돕시스(arabidopsis)와 같은 식물 세포 또는 동물 세포 특히 Mo, Cos 또는 CHO 세포 계통과 같은 척추동물 세포 계통 또는 곤충 세포 계통일 수 있다.

본 발명의 제2의 주제는 활성물질로서 제약학적으로 활성인 양의 본 발명 TGF-β 류 단백질을 함유하는 제약학적 조성물의 제공이다. 바란다면 이러한 조성물은 제약학적으로 허용가능한 담체물질, 보조물질, 희석제 또는 충전제로 구성된다. 상기 제약학적 조성물은 단독으로 또는 기타의 활성 물질 예를들어 TGF-β 군의 다른 단백질 또는 EGF (epidermal growth factor : 표피 생장 인자) 또는 PDGF (platelet derived growth factor : 혈소판 유도된 생장 인자)와 같은 생장 인자와 조합시켜 치아의 이식 및 뼈, 연골, 연결 조직, 피부, 점액성막, 상피 세포 또는 치아 손상의 치료뿐만 아니라 상처 - 치료 및 조직 재생성에 사용할 수 있다. 또 상기 제약학적 조성물은 골다공증 및 관절증의 예방과 같은 질병 예방에 사용할 수 있다.

본 발명의 TGF-β 단백질의 또다른 가능한 임상 용도는 이것을 면역반응의 억제인자로 사용하여 기관 이식조직 또는 맥관형성과 관련된 이의 응용물에 대한 거부 반응을 막아주는 것이다. 본 발명의 제약학적 조성물은 또한 질병 예방적으로 또는 성형ㅇ 수술에 사용할 수 있다. 또 본 조성물의 투여는 인간에 한정되지 않고 동물 특히 애완동물을 또한 포함할 수 있다.

최종적으로 본 발명은 또한 구체적으로 본 발명 단백질과 결합하는 항체 또는 이러한 항체 단편 (예를들어 Fab 또는 Fab')에 관한다. 상기 특정 항체 또는 항체 단편의 제조 방법은 당업자의 일반적인 기술적 지식의 부분이다. 이러한 항체는 바람직하게는 단클론성 항체이다. 이러한 항체 또는 항체 단면은 또한 진단상의 방법들에 적당할 수 있을 것이다.

다음 실시예는 본 발명을 더 상세히 설명하고자 함이다.

MP - 52의 분리

1.1 Chirgwin 등의 Biochemistry 18 (1979), 5294 - 5299의 방법에 따라 인간 태아 조직 (8 - 9 주) 으로 부터 전체의 RNA를 분리시켰다. 제조자의 지시(Stratagene Poly (A) Quick columns)에 따라 올리고(dT) 크로마토그래피에 의하여 전체 RNA 로부터 폴리 (A+) RNA를 분리시켰다.

1.2 역전사반응을 위하여 1 - 2.5 ㎍의 폴리 (A+) RNA를 5 분동안 65℃로 가열시키고 얼음 위에서 재빨리 냉각시켰다. 이 반응 혼합물은 폴리 (A+) RNA 1 ㎍ 당 27 U RNA - Guard (Pharmacia 사 제품), 2.5 ㎍ 의 올리고 (dT) 12 - 18 (Pharmacia 사 제품), 5 x 완충제 (250 mmol/ℓ의 Tris/HCl, pH 8.5, 50 mmol/ℓ의 MgCl₂, 50 mmol/ℓ의 DTT, 5 mmol/ℓ의 각 dNTP, 600 mmol/ℓ의 KCl) 및 20 U AMV 역전사효소(Boehringer Mannheim 사 제품)를 함유하였다. 이 반응 혼합물(25㎕)을 42℃에서 2 시간동안 인큐베이팅시켰다.

1.3 제2도에 나타낸 데옥시누클레오티드 프라이머 OD 및 OID를 자동 DNA 합성기(Biosearch 사 제품) 상에서 제조하였다. 폴리아크릴아미드겔을 변성시키고 동속전기이동에 의하여 상기 겔로부터 주요 밴드를 분리시켜 정제시켰다. TGF - β 군의 공지된 구성원들의 핵산 서열을 비교하여 가장 보존력 있는 영역을 선택하여 올리고누클레오티드를 설계하였다. 이 영역의 비교를 제2도에 나타내었다. 클로닝을 용이하게 하기 위하여 두 누클레오티드는 EcoRI 제한 부위를 함유하였고 임의로 OD는 5' 말단에 NcoI 제한부위를 함유하였다.

1.4 20ng의 폴리 (A+) RNA에 대응되는 cDNA를 PCR 반응의 출발물질로 사용하였다. 상기 반응은 50 ㎕ 의 부피로 수행되었으며 1 x PCR 완충제(16.6 mmol/ℓ (NH₄)₂SO₄, 67 mmol/ℓ Tris/HCl pH 8.8, 2 mmol/ℓ MgCl₂, 6.7 μmol/ℓ EDTA, 10 mmol/ℓ β - 머캅토 - 에탄올, 170 ㎍/㎖ 소혈청 알부민 (Gibco 사 제품), 200 μmol/ℓ의 각 dNTP (Pharmacia 사 제품), 30 pmol 의 각 올리고누클레오티드 (OD 및 OID) 및 1.5 V Taq 중합효소 (AmpliTaq, Perkin Elmer Cetus 사 제품)을 함유하였다. 이 반응 혼합물에 파라핀을 입히고 PCR 싸이클을 40 회 수행하였다. PCR 반응의 생성물을 페놀/클로로포름 추출법으로 정제시키고 에탄올 침전법으로 농축시켰다.

1.5 제조자의 지시에 따라 제한 효소 SphI (Pharmacia 사 제품) 및 AIWNI(Biolabs 사 제품)으로 PCR 반응 생성물을 분열시켰다.

1.6 제한 난할의 생성물을 아가로스 겔 전기이동에 의하여 분별시켰다. 에티듐 브로마이드로 스테이닝시킨 후 분열시키지 않은 증폭 생성물을 겔에서 잘라내어 페놀 추출법으로 분리시켰다. 이렇게 얻은 DNA를 이후 페놀/클로로포름 추출법으로 두번 정제시켰다.

1.7 에탄올 침전후, 싸이클의 횟수를 13으로 감소시키는 것을 제외하고 첫번째 증폭과 동일한 조건을 사용하여 분리된 DNA의 4 분의 1 또는 5 분의 1을 재증폭시켰다. 재증폭 생성물을 정제시키고 상기와 동일한 효소로 분열시키고, 분열되지 않은 생성물을 증폭 생성물에 관하여 상기 설명한 바와같은 아가로스 겔로부터 분리 시켰다. 재증폭 단계를 2회 반복하였다.

1.8 겔로부터의 최후의 분리후, 제조자가 추천한 조건하에 4 단위 EcoRI (Pharmacia 사 제품)에 의하여 증폭 생성물을 분열시켰다. 제한 생성물의 4 분의 1을 EcoRI로 분열된 벡터 pBluescriptII SK+ (Stratagene 사 제품) 내로 라이게이팅(ligating) 시켰다. 라이게이팅시킨 후 시퀀싱 (sequencing) 시켜 24 개의 클론을 추가로 분석하였다. AlwNI 및 SphI로 분열시킨 샘플은 MP - 52로 표시된 새로운 서열을 나타내었다. 다른 클론들은 주로 BMP6 서열을 함유하였고 하나는 BMP7 서열을 함유하였다.

Frohmann (Amplifications, Perkin - Elmer Corp. 사 출판, 5판 (1990), 페이지 11 - 15)에 의하여 상세히 기술된 방법에 따라 cDNA의 3' 말단까지 클론을 완성시켰다. MP - 52의 제1단편을 분리시키기 위하여 사용된 동일한 태아 mRNA를 상기 기술한 바와같이 역전사시켰다. MP - 52 서열의 내부 프라이머 (CTTGAGTACGAGGCTTTCCACTG) 및 어댑터 프라이머 (AGAATTCGCATGCCATGGTCGACG)를 사용하여 증폭시켰다. 이 증폭 생성물을 MP - 52 서열의 오버랩핑 내부 프라이머 (GGAGCCCACGAATCATGCAGTCA) 및 오버랩핑 어댑터 프라이머 (ATTCGCATGCCATGGTCGACGAAG) 를 사용하여 재증폭시켰다. NcoI 로 제한 분열시킨 후 재증폭 생성물을, 같은 방법으로 분열시키고 시퀀싱시킨 벡터 (단일 NcoI 제한 부위를 함유하는 개질된 다중 클로닝 부위를 갖는 pUC 19 (Pharmacia No. 27 - 4951 - 01)) 내로 클로닝 및 시퀀싱시켰다. 상기 클론들은 공지된 MP - 52 TJDUFDML 3' 말단에서 오버랩된 서열을 특징으로하였다. 이들 중 하나는 Ausubel 등 (Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley - Interscience 사 출판 (1989))에 의하여 상세히 기술된 방법에 따라 인간의 게놈 유전자은행 (Stratagene No. 946203)을 스크링시키기 위한 탐침으로 사용하였다. 약 20 kb의 삽입변이를 함유하고 기탁번호 7387로 DSM에 기탁된 8 x 10⁵λ 파아지로부터 하나의 파아지 (λ 2. 7. 4.)를 분리시켰다. 이 클론은 기술된 증폭 방법에 의하여 mRNA로부터 분리시킨 서열외에 5' 말단에서 추가의 서열 정보를 함유하였다.

서열 분석을 위하여 약 7.5 kb의 HindIII를 동일한 방식으로 분열시킨 벡터 (Blusescript SK, Stratagene No. 212206) 내로 서브클로닝시켰다. SKL 52 (H3) MP12로 표시된 이 플라스미드를 또한 기탁번호 7353으로 DSM에 기탁하였다. 서열 제1번에 나타낸 서열 정보를 파아지 λ 2. 7. 4. 로부터 유도하였다. 위치 640의 ATG는 판독구조내에서 최초의 ATG이다 (정지코돈은 위치 403에서 일어남.). 서열 정보를 근거로하여 이것이 번역을 위한 출발코돈임을 추측할 수 있을 것이다.

게놈 DNA는 서열 제1번의 염기쌍 1270 및 1271 사이에 약 2kb의 인트론을 함유한다. 상기 인트론의 서열은 도시하지 않았다. 이 영역을 함유하는 cDNA에서 유도된 증폭 생성물을 시퀀싱시켜 접합부위를 정확하게 확인하였다. 이러한 서열 정보는 Frohmann (Amplifications, Perkin - Elmer Corporation 사 출판, 5 판 (1990), 페이지 11 - 15)에 의하여 상세히 기술된 약간 개질된 방법을 사용하여 얻었다. 또한 MP - 52의 3' 말단을 분리시키기 위하여 사용된 것과 동일한 태아 RNA를 MP - 52 서열 (ACAGCAGGTGGGTGGTGTGGACT)의 5' 방향으로 배향시킨 내부 프라이머를 사용하여 역전사시켰다. 말단 전달효소를 사용하여 최초의 cDNA 사슬의 5' 말단에 폴리 A 미부를 부착시켰다. 첫번째로 올리고 dT 및 어댑터 서열 (AGAATTCGCATGCCATGGTCGACGAAGC(T16) 로 구성된 프라이머를 사용하고 두번째로 MP - 52 서열로부터의 내부 프라이머 (CCAGCAGCCCATCCTTCTCC) 및 어댑터 프라이머 (AGAATTCGCATGCCATGGTCGACG)를 사용하여 2단계 증폭시켰다. MP - 52 서열로부터의 오버랩핑 내부 프라이머 (TCCAGGGCACTAATGTCAAACACG) 및 동일한 어댑터 프라이머를 사용하여 상기 증폭 생성물을 재증폭시켰다. 이후 MP - 52 서열로부터의 오버랩핑 내부 프라이머 (ACTAATGTCAAACACGTACCTCTG) 및 오버랩핑 프라이머 (ATTCGCATGCCATGGTCGACGAAG)를 사용하여 상기 재증폭 생성물을 재증폭시켰다. EcoRV 로 분열시킨 벡터 (Bluescript SK, Stratagene No. 212206) 내로 최종 증폭 생성물을 무딘 말단으로 클로닝시켰다. 상기 클론은 λ 2. 7. 4. 의 DNA로 오버랩된 서열을 특징으로하였다.

또 cDNA 은행 - 인간의 섬유 아세포의 RNA 로부터 생성되어 λgt 10 내로 클로닝된 - 을 스크리닝시켰다. 본 방법에서는 방사성 탐침으로서 약 1 kb의 게놈 MP - 52 DNA 단편 (3'의 미번역 영역내 HindIII 제한부위에 이르는 제2엑손)을 사용하여 2 x 10⁶파아지를 테스트하였다. 17 개의 혼합된 플라크를 가려내어 MP - 52 서열의 5' 및 3' 영역으로부터의 프라이머를 사용하는 PCR에 의하여 체킹하였다. 이 후 8개의 파아지 플라크를 선택하여 분리시켰다. EcoRI 부분 분열에 의하여 상기 파아지로부터 cDNA 를 분리시키고, 또한 EcoRI로 분열시킨 Bluescript 벡터내로 클로닝시켰다.

이렇게 얻은 플라스미드 SK52L15. 1MP25 중 하나를 시퀀싱한 것은 가장 긴 파아지 (15.1)가 서열 제1번의 누클레오티드 번호 321에서 출발되었음을 보여주었다. 또 상기 시퀀싱에 의하여 접합위치 (누클레오티드 1270) 를 확인하였다.

플라스미드 SKL 52 (H3) MP12를 1992 년 12 월 10 일에 기탁번호 7353으로 DSM ("Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig)에 기탁하였다.

파아지 λ 2. 7. 4. 는 1993 년 1 월 13일에 기탁번호 7387로 DSM에 기탁하였다.

플라스미드 SK52L15. 1MP25는 1993 년 7 월 16 일에 기탁번호 8421로 DSM에 기탁하였다.

[실시예 2]

MP52의 발현

MP52의 발현을 위하여 여러가지 시스템을 검토하였다. 이후로 CP로 약해지는 Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel 등, Greene Publishing Associates and Wiley - Interscienece, Wiley ＆ Sons) 16장 16.15 - 16.18 절에는 발현 시스템으로 사용되는 Vaccinia 바이러스의 용도가 상세히 기술되어 있고 당업자는 재생산할 수 있다. 상기 시스템은 혹종의 벡터를 사용하는 Vaccinia 바이러스의 게놈내로의 상동 재조합에 의하여 이질 DNA 를 삽입시킬 수 있다는 사실에 근거를 두고 있다. 이러한 목적으로 사용되는 벡터는 Vaccinia 게놈으로부터의 TK(thymidine kinase : 티미딘키나아제) 유전자를 함유한다. 재조합 바이러스에 대한 선택을 가능하게 하기 위하여 상기 벡터는 또한 이. 콜리 크산틴 - 구아닌 포스포리보실 전달효소 유전자 (gpt) (Falkner 등, J. Virol. 62 (1988), 1849 - 1854)를 함유한다. MP52를 암호화한 전체 영역을 갖는 cDNA를 상기 벡터내로 클로닝시켰다. 그러나 상기 cDNA는 미번역 영역의 대부분을 제거하기 위하여 먼저 삭제 및 서브클로닝된 플라스미드 SK52L15. 1MP25 (DSM, 기탁번호 8421)에서 유래된다. 이를 위하여 플라스미드 SK52L15. 1MP25를 Sall로 선형화시키고 5' 말단을 제조자의 지시에 따라 ExoIII/mung bean kit (Stratagene # 200330)로 단계적으로 삭제시켰다. BamHI로 제한시킨 후, 상이한 정도로 삭제된 MP52 cDNA 들을 잔류하는 벡터로부터 분리시키고, 아가로스 겔에 의하여 분리시키고, EcoRV 및 BamHI 로 제한된 pBluescriptII SK 벡터 (Stratagene # 212206) 내에 표준 방법 (Sambroock 등, Molecular Cloning, 2판, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989)에 따라 서브클로닝 (pSK52S) 시켰다. 모든 제한은 제조자의 지시에 따라 수행하였다. 시쿼나아제(USB/Amersham # 70770)로 시퀀싱하여 특히 SEQ ID NO. 1의 누클레오티드 576 (출발 코돈으로부터 떨어져 있는 64 개의 염기쌍)으로 출발되는 클론을 얻었다. SalI 및 SacI로 제한시켜 상기로부터 cDNA 삽입물을 분리시키고 Vaccinia 바이러스 시스템내 재조합을 위하여 마찬가지로 분열시킨 벡터내로 클로닝시켰다. 이렇게 얻은 플라스미드(pBP1MP52S)를 1994 년 5 월 24 일에 DSM에 기탁시키고 (기탁번호 9217) 재조합 Vaccinia 바이러스의 제조에 사용하였다. 이를 위하여 35 mm 들이 배양액 접시내의 80% 이하의 유착성 143B 세포들 (HuTK, ATCC CRL 8303)을 때때로 흔들어주면서 실온에서 30 분동안 2 ㎖의 PBS 내 Vaccinia 야생형 바이러스로 감염시켰다 (세포 10 개당 바이러스 1개). 상청액을 아스피레이팅시키고 2 ㎖의 배양 매질 (MEM, Gibco BRL # 041 - 01095)을 가한 후 37℃에서 2 시간동안 인큐베이팅시켰다. 이 후 매질을 제거시키고 37℃에서 15 시간동안 1 ㎖ MEM 내 10 μl의 Lipofectin (Gibco BRL # 18292 - 011), 2 ㎍의 벡터 DNA (calf thymus, Boehringer Mannheim # 104175) 및 100 ng의 pBP1MP52s로 상기 세포들을 형질전환시켰다. 20%의 FCS(Gibco BRL # 011 - 06290)를 함유하는 1 ㎖의 MEM을 가한후 이들을 37℃에서 추가로 24 시간동안 인큐베이팅시킨 후 용균된 세포들을 동결시켰다.

크산틴 - 구아닌 포스포리보실 전달효소에 대한 gpt 선택 및 개별적인 재조합 바이러스의 분리 및 증폭은 RK13 세포 (ATCC CCL 37)를 사용한 것을 제외하고 CP의 16.17 절에 기술된 바와같이 수행시켰다.

MP52 cDNA 가 바이러스 게놈으로 삽입된것을 도트 블로트 (dot blot) 및 Southern 블로트 분석 (CP 16.18 절)으로 확인하였다. 세포 계통 143B (HuTk -, ATCC CRL 8303, human) 내 발현 분석을 위하여 재조합 바이러스를 사용하였다. 유착성 세포들을 세포수에 대응하는 수의 바이러스들로 37℃에서 45분동안 감염시킨 후 10%의 FCS의 페니실린/스트렙토마이신 (1 : 500, Gibco BRL # 043 - 05140H)을 함유하는 각각의 배양 매질 (MEM, Gibco BRL # 041 - 01095) 에 가하였다. 37℃에서 6 시간 후 상기 매질을 제거시키고 세포들을 예를들어 HBSS (Gibco BRL # 042 - 04180M)로 두번 세척하고 FCS가 없는 생성 매질 (예를 들어 MEM)을 가하였다. 20 - 22 시간의 생성후 세포 상청액을 수거하였다. 표준 방법 (CP 10.8 절)에 따른 Western 블로트를 이용하여 발현을 분석하였다. 이를 위하여 100 - 500 ㎕의 세포 배양 상청액으로부터 단백질을 동일한 부피의 아세톤을 가하여 침전시키고 1 시간 이상 얼음 위에서 인큐베이팅시키고 원심분리하였다. 상기 펠릿을 도포 완충제 (7 M의 유레아, 1%의 SDS, 7 mM의 소듐 디하이드로젠 포스페이트, 0.01%의 브로모페닐 블루 및 바란다면 1%의 β - 머캅토에탄올) 내에 재현탁시킨 후 15%의 폴리아크릴아미드 겔내에서 분리시켰다. 표준 분자량의 미리 스테이닝시킨 단백질 (Gibco BRL # 26041 - 020)을 표지 단백질로 사용하였다. 표준 방법에 따라 PVDF 막 (Immobilon # IPVH00010) 상에 전달시키고 막을 블로킹시켰다.

막상에 MP52를 검출시키기 위하여 닭 및 래빗내에서 MP52에 대한 다클론성 항체를 제조하였다. 이를 위하여 N - 말단에 6 개의 히스티딘을 갖는 MP52의 성숙부분을 이.콜리내에 발현시키고 예를들어 Hochuli 등 (BIO/Technology, 6 권, 1321 - 1325 (1988)) 이 기술한 바와 같이 정제시켰다. 두 항체 모두 MP52 발현의 특정한 검출을 가능하게 하며 단량체 MP52가 이량체 MP52보다 더 효과적으로 인지된다. PEG 침전법 (Thalley 등, BIO/Technology 제8권 934 - 938 (1990)) 및 막으로 둘러싸인 항원 (6 개의 히스티딘을 함유하는 성숙한 MP52) (Sambrook 등, Molecular cloning 18.17, 2 판, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989)을 이용하여 특별히 정제된 닭의 항체는 제3도의 Western 블로트를 위하여 사용되었다. 쌍을 이룬 알카리성 포스파타아제 (Sigma A9171)를 갖는 항 - 치킨 IgG를 제2항체로 사용하였다. 제조자의 지시에 따라 Tropix Western - Light 단백질 검출 키드 (Serva # WL10RC)를 사용하여 검출하였다.

제3도의 Western 블로트는 MP52 - 특정밴드가 야생형 바이러스 (삽입된 이질 DNA가 없는)가 아니라 재조합 바이러스로 생긴 다른 것을 보여준다. MP52는 발현되어 비환원 조건하 겔내에서 약 25 kDa의 명백한 분자량을 갖는 은닉된 단백질이 된다. 상기 단백질은 환원 조건하에 14 - 15 kDa의 겔내에서 이동된다. 이 결과는 MP52가 이량체 성숙단백질로 발현됨을 보여준다. Western 블로트에서 발생되며 60 kDa 이상의 영역에서 나타나는 약한 밴드는 아마도 분열되지 않은 전구 단백질의 잔기일 것이다. 또한 이동 특성은 SEQ ID NO. 2 (이에 따라 성숙된 단량체 MP52의 크기는 13.6 kDa 임)로 부터 도출할 수 있는 이론적인 분자량을 확인시켜 준다.

MP52를 발현시켜 전구 단백질을 다양한 세포 계통의 성숙 MP52로 분열시키는 것이 가능함이 입증되었다. C127 (ATCC CRL 1616, 마우스), BHK21 (ATCC CCL 10, 햄스터), MRC - 5 (ATCC CCL 171, 인간) ALC 3T6 - 스위스 알비노 (ATCC CLL 96, 마우스) 세포들을 테스트 하였다.

성숙 MP52를 제조하기 위한 발현 및 분열 또한 추가의 진핵 발현 시스템에서 증명되었다. 이를 위하여 MP52 로부터의 cDNA (누클레오티드 576으로 출발됨)를 발현 플라스미드 pSG5 (Stratagene # 216201) 내로 클로닝시켰다. 이 플라스미드 pSK52s를 ClaI 및 XbaI로 제한시키고 MP52 삽입물의 비어져 나온 말단을 T4 중합효소 처리로 무디게 하였다. EcoRI 로 제한시키고 T4 중합효소 처리로 마찬가지로 무디게 말단처리한 벡터 pSG5 내로 표준 방법에 따라 클로닝시켰다. 모든 효소 반응은 제조자의 지시에 따라 수행시켰다. 제한 분석에 의하여 및 T7 프라이머 (Stratagene # 300302)로 시퀀싱시켜 MP52를 확실히 올바르게 배향시켰다. 안정한 세포계통을 얻기 위하여 이렇게 얻은 플라스미드 pSG52s (기탁번호 DSM 9204 로 94년 5월 17일 DSM에 기탁됨)를 예를들어 G418 저항성 유전자와 같이 선택가능한 표지를 암호화하는 벡터로 동시 형질전환 시킬 수 있다. 이러한 목적을 위하여 pSG52s는 제조자의 지시에 따라 Lipofectin (Gibco BRL # 18292 - 011)을 사용하여 L929 세포 (ATCC CCL1, 마우스) 내 플라스미드 p3616 (기탁번호 DSM 9203 으로 94년 5월 17일 DSM에 기탁됨)로 동시형질전환시켰다. 당업자에 널리 공지된 방법 (CP. 9.5 절)에 따라 G418로 선택시킨 결과 Western 블로트내에 검출가능한 성숙 MP52를 생성시키는 세포계통이 얻어졌다.

Dr. Miyazaki에 의한 플라스미드 pABWN (Niwa 등, Gene 108 (1991), 193 - 200 및 제4도)를 사용하여 MP52의 추가의 발현 벡터를 제조하였다.

이를 위하여 SEQ ID NO. 1의 누클레오티드 576으로 출발되는 플라스미드 pSK52s 로부터의 HindIII 단편을 분리시키고 클레노우 단편으로 처리시켜 비어져 나온 말단을 무디게 하였다. 어댑터의 배위자 결합에 의하여 단편의 양말단에 NotI 제한 분열 부위를 도입시켰다.

어댑터 : AGCGGCCGCT

TCGCCGGCGA

벡터 pABWN을 XhoI로 제한시키고, 또한 Klenow 단편으로 처리시키고 송아지로부터의 장내 알카리성 포스파타아제 (Boehringer Mannheim 사 제품)으로 탈인산화시켰다. Not I로 제한시킨 후 생성된 벡터의 Not I 분열 부위내로 MP52 단편을 삽입시킬 수 있도록 동일한 인산화된 어댑터를 배위 결합시켰다. 이후 얻어지는 발현 벡터를 HindIII - MP52/pABWN으로 표시하였다. 클로닝을 위하여 수행되는 모든 반응은 표준방법 (에를들어 CP 3.16 절)에 따라 수행시켰다.

HindIII - MP52/pABWN 발현 벡터의 구조를 시퀀싱 및 제한 지도작성에 의하여 확인하였다. HindIII - MP52/pABWN은 SEQ ID NO. 1의 누클레오티드 576으로 출발되고 누클레오티드 2278로 종결되는 MP52를 함유한다.

L 세포^*(마우스 섬유 아세포) 내에서 HindIII - MP52/pABWN을 형질전환시켜 이로부터 안정한 형질변환체를 확립시켰다.

이를 위하여 20 ㎕의 lipofectAMINE 시약 (Gibco BRL # 18324 - 012)을 사용하여 6 cm의 배양 접시내 5 x 10⁵L의 세포 내에 각 경우 4 ㎍의 플라스미드(HindIII - MP52/pABWN 또는 pABWN)를 형질전환시켰다. 이를 위하여 용액 A (200 μl의 OPTI - MEM (Gibco BRL # 31985) 내 각 DNA 4 ㎍)를 용액 B (200 μl의 OPTI - MEM I 내 20 ㎕의 lipofectAMINE 시약)와 조심스럽게 혼합시키고 실온에서 45 분동안 인큐베이팅시켜 DNA 리포솜 착체를 제조하였다. 이러한 과정에서 2 ㎖의 OPTI - MEM I로 한번 세포들을 세척시켰다. 각각의 형질전환에 대하여 DNA 리포솜 착체와 함께 1.6 ㎖의 OPTI - MEM I을 용기에 가하였다. 상기 용액을 조심스럽게 혼합시키고 세척된 세포들을 상기 용액으로 덮어 씌웠다. CO₂인큐베이터내 37℃ 에서 5 시간동안 희석 착체로 상기 세포들을 인큐베이팅시켰다. 인큐베이팅시킨 후 2 ㎖의 DMEM (Gibco BRL 사 제품, Dulbecco의 개질된 이글 (eagle) 매질)/20%의 FCS를 가하였다. 형질전환 24 시간 후, 매질을 새로운 DMEM/10%의 FCS로 대체하였다. 형질전환의 개시 48 시간 후, 세포들을 10 cm의 배양 접시로 옮겼다. 형질전환의 개시 72 시간후, 800 ㎍/㎖의 농도에서 G418 선택을 개시하였다. 1 - 2 주후 안정한 클론들이 나타났다.

10 cm의 배양접시에서 3 일동안 생장시킨 유착성 형질전환체들로부터 FCS 가 없는 또는 FCS를 함유하는 5 ㎖의 상태조절된 DMEM을 얻었다. 형질전환시킨 세포 및 세포 용균액의 두가지 상이한 세포 배양 상청액(HindIII - MP52/pABWN 및 pABWN)을 Western 블로트로 검사하였다. 이 과정에서 HindIII - MP52/pABWN 으로 형질전환된 세포들의 세포 용균액 및 상태조절된 매질내에서 성숙 MP52가 발견되었다. 상기 클론들을 더욱 클로닝시키고 Western blot 후 MP52를 생성시키는 세포들을 각각 선택하였다. Western 블로트 분석으로부터 평가 했더니 MP52 생성물의 수율은 1 ㎎/ℓ에 달했다.

[실시예 3]

MP52의 생물학적 활성

MP52의 생물학적 활성을 검출하고 뼈 질환의 치료 및/또는 예방 의학적 응용물에 대한 본 발명의 유용성을 증명하기 위하여 시험관 및 생체내에서 몇가지 실험을 하였다.

1. 시험관 분석

1.1

TGF - β로 자극시킨 후 연골세포내 글리코스아미노글리칸 (GAG) 합성이 증가됨이 기술되어 있으므로 (Hiraki 등, Biochimica et Biophysica Acta 969 (1988), 91 - 99) MP52 또한 이러한 영향력을 갖는지 조사하였다. MP52를 생성시키는 L 세포 형질전환체 (HindIII MP52/pABWN으로 형질전환됨)의 세포 배양 상청액 (10%의 FCS를 함유하는 DMEM)을 사용하여 태아 상태의 랫 수족으로부터의 1차 배양액내에서 MP52의 연골원 활성을 테스트하였다.

이를 위하여 16일짜리랫 태아의 사지를 사용하였다. 트립신화시킨 후, 10%의 FCS를 함유하는 F - 12 매질 (Nutrient mixture Ham's F - 12, Gibco BRL # 21700) 내 얻어진 세포를 콜라겐 형태 I로 피복된 24 - 웰 플레이트상에 3 x 10⁵의 세포로 배양시키고 약 2 일 동안 컨플루언스 (confluence) 상태가 될때까지 배양시켰다. 각 경우 (10%의 FCS를 함유하는 F - 12 매질)에 HindIII - MP52/pABWN -L 세포 형질전환체, pABWN - L 세포 형질전환체의 56 ㎕의 상태조절된 매질(CM)을 500 ㎕의 배양매질에 가하였다. 10 %의 FCS를 함유하는 F - 12 매질 및 각각의 첨가제를 0, 3, 6 및 9 일에 걸쳐 사용하였다. 각각의 첨가제를 함유하는 매질을 3 일마다 교환하였다. 각각의 첨가제 존재하에 FCS 가 없는 F - 12 매질 (상태 조절시킨 매질 또는 대조구 매질) 내에서 추가로 2 일동안 배양물을 배양시킨 다음³⁵S 설페이트를 6 시간동안 가하였다. Hiraki 등 (Biochimica et Biophysica Acta 969 (1988), 91 - 99)이 기술한 바와같은 프로나아제 E 분해 및 침전후, 다당류에 합체된³⁵S를 측정하였다.

[표 1]

상기 값들은 3 또는 4 개의 배양 혼합물에 대한 ± S.E.M과 관계가 있다.

* : pABWN - L 세포 형질전환체로부터의 CM 및 DMEM 대 P＜0.01

(Scheffe 의 다중 t - 테스트)

표 1에서 알 수 있는 바와 같이, MP52를 생성시키는 형질전환체의 세포 배양 상청액은 pABWN으로 형질전환시킨 L 세포로부터의 세포 배양 상청액 또는 순수한 배양 매질 (10%의 FCS를 함유하는 DMEM)과 비교할때 GAG 합성을 현저하게 자극 시킨다. 이것은 MP52가 연골세포의 분화를 자극시킬 수 있음을 보여준다.

1.2

BMP 군의 몇몇 구성원에 대하여 기술되어온 효과는 골아세포내 알카리성 포스파타아제(ALP) 활성을 자극시키는 것이다. 클러널랫 세포 계통 ROB - C26 (C-26)는 성숙의 비교적 초기 단계에 있는 골아세포들 사이에 있다 (Yamaguchi 등, Calcif. Tissue Int. 49(1991), 221-225). ALP 활성을 자극시키는 능력은 예를들어 Yamaguchi 등(J. Cell Biol.113 (1991), 681 - 687)에 의하여 BMP - 2와 같은 뼈유도 단백질에 대하여 기술되어 있다.

C26 상에서의 MP52의 영향을 다음과 같이 조사하였다 : 24 - 웰 플레이트의 웰당 3 x 10⁴개의 세포로 C26 세포를 평판 배양시키고 α -MEM (Gibro BRL)/10%의 FCS 내에서 배양시켰다. 500 ㎕의 C - 26 세포 배양 매질에 MP52 (HindIII - MP52/pABWN)를 생성시키는 L 세포 형질전환체로부터의 세포 배양 상청액 56 ㎕ 또는 pABWN - L 세포 형질전환체로부터의 세포 배양 상청액 56 ㎕ 또는 단순히 L 세포로부터의 세포 배양 상청액 (10%의 FCS를 함유하는 DMEM) 56 ㎕를 가하였다. 각각의 첨가제로 매질을 3 일마다 변화시켰다. 기판으로서 Takuwa 등 (Am. J. Physiol. 257 (1989), E797 - E803)이 기술한 바와같은 P - 니트로페닐 포스페이트를 기본으로 하는 표준 기술의 도움으로 0, 3, 6, 9 및 12 일 후 세포 추출물내 ALP 활성을 측정하였다.

[표 2]

상기 값들은 4 개의 배양 혼합물에 대하여 ±S.D와 관계가 있다.

* : pABWN - L 세포 형질전환체로부터의 CM 및 DMEM 대 P ＜ 0.01

(Scheffe의 다중 t - 테스트)

표 2에서 알 수 있는 바와 같이 pABWN -감염된 L 세포로부터의 매질 및 순수한 DMEM/10 %의 FCS 매질과 비교할때 ALP 활성을 현저히 증가시킨다. 이러한 결과는 MP52가 분화되어 연골세포를 생성시킬수는 없으나 골아세포들을 분화 및 성숙시킬 수 있다는 것을 보여준다.

Takuwa 등 (Biochem. Biophys. Res. Com. 174 (1991), 96 - 101)에 의하여 기술된 바와같은 BMP - 2로 처리되어 ALP 활성 증가를 보이는 추가의 골아 세포 계통 (MC3T3 - E1, 마우스)은 재조합 Vaccinia 바이러스로 감염시켜 MP52를 생성시킨 후의 매질 또는 MP52 (HindIII - MP52/pABWN)를 생성시키는 L 세포 형질전환체로부터의 매질로 인큐베이팅시킨 후에는 ALP 활성에 어떤 변화로 보이지 않는다. 이것은 MP52 가 BMP -2 의 세포 특이성에서 부분적으로 벗어난 세포 특이성을 가짐을 암시한다. 개별적인 TGF - β 군의 구성원들에 대한 상이한 표적 부위로 인한 상이한 관능들이 의학적으로 대단히 적절할 수 있을 것이다.

2. 생체내 실험

2.1

골격 발달을 조사하는 가장 명확한 가능성은 생체내 변위 골격 형성을 기본으로 한다. 이것은 예를들어 탈염 뼈 매트릭스 (Urist, Science 150 (1965), 893 - 899)의 이식으로 유도될 수 있다. 예를들어 Sampath 등 (PNAS^*Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981), 7599 - 7603)에 의하여 기술된 바와같은 골격 - 유도 단백질과 불활성 매트릭스를 조합시켜 동일한 방법을 유도할 수 있다. 이러한 뼈 형성의 방법은 태아의 엔콘드랄 (enchondral) 골격 형성 및 성인 골격 치료법과 유사하다. 따라서 이 방법으로 생체내 뼈 - 유도 능력에 대하여 단백질을 조사할 수 있다.

Vaccinia 시스템 (실시예 2를 참조하시오) 내 발현으로 얻은 MP52 단백질을 정제시켜 상기 실험과 같이 이식시켰다.

이를 위하여 143B 세포 (HuTK, ATCC CRL 8303)가 컨플루언스될때까지 배양 접시 및 롤러 플라스크에서 배양시키고 발현 분석을 위하여 실시예 2에 기술한 바와같이 재조합 바이러스로 감염시키고 세척하였으며 MP52를 20 시간동안 MEM (Gibco BRL, 10⁶개의 세포당 약 1 ㎖)에 축적시켰다. 대조구로서 동일한 제조물을 야생형 바이러스로 감염시켰다. 각각의 제조물로부터의 세포 배양 상청액 (상태조절된 매질)을 수거하여 원심분리 (4℃에서 30 분동안 40000 x g) 시켰다. 바이러스를 제거하기 위하여 무기 필터 (공극 크기 0.1 ㎛, Whatman, Anotop 25)로 상청액을 여과시켰다. MP52의 특화중에, 이 단백질이 헤파린 - 세파로오제와 결합한다는 것을 알았다. 이 특성을 부분적인 정제에 이용하였다. 이를 위하여 50 mM의 트리스 pH 7.0, 100 mM의 NaCl 및 6M의 우레아 농축물에 여과 및 원심분리되고 상태조절된 매질을 가하고 완충제 A (50 mM의 Tris pH 7.0, 100 mM의 NaCl 및 6 M의 우레아) 내에서 평형시킨 헤파린 칼럼 (HiTrap^TM, Pharmacia # 17 - 0407 - 01) 상에 로딩시켰다. 로딩시킨 칼럼을 완충제 A로 세척하고 0.5 ㎖/min의 유속으로 50 분 (단편당 2.5 ㎖) 내에 100 %의 완충제 B (50 mM의 트리스 pH 7.0, 600 mM의 NaCl 및 6 M의 우레아)로 선형 기울기 용리시켰다. 우레아의 사용은 절대적으로 필요한 것은 아니다. MP52는 Western 블로트 분석 (실시예 2를 참조하시오) 으로 시험할 수 있도록 약 250 - 400 mM의 NaCl로 주로 2 개의 단편으로 재생 가능하도록 용리된다. 제조자의 지시에 따라 은으로 스테이닝시킨 15 %의 폴리아크릴아미드겔 (Silver Stain - II, Daiichi # SE140000) 내에서 상기 단편들의 분취물을 또한 조사하고 단편들을 풀 (pool) 링시켰다. 야생형 바이러스로 감염시키고 상태조절시킨 매질로부터 정제시킨 후 은으로 스테이닝시킨 겔내에서 분석시키고 비교가능한 단편들을 또한 풀링시켰다. MP52 상에서의 추가의 검사는 MP52가 또한 하이드록시아파티트와 결합하고 있음을 보여주었다. 따라서 원칙적으로 하이드록시아파티트로 추가로 정제시키고 헤파린 칼럼을 하이드록시아파티트 칼럼 (에를들어 BIO - RAD, Econo - pac HTP)으로 대체시키는 것이 가능하다. 예를들어 겔 시브 칼럼, 이온 교환 칼럼, 친화력 칼럼, 금속 킬레이트 칼럼 또는 소수성 상호작용을 기본으로 하는 칼럼과 같은 당업자에 공지된 기타의 방법 또한 추가의 정제를 위하여 생각할 수 있다.

헤파린 - 세파로오제 크로마토그래피에 의하여 미리 정제시킨 MP52 단백질 또는 야생형으로 감염된 세포 배양 상청액에 존재하는 여전히 오염된 대응 단백질을 역상 HPLC를 이용하여 더 정제시켰다. 이를 위하여 10 %의 완충제 B (완충제 A : 0.1 %의 트리플루오로아세트산 ; 완충제 B : 90 %의 아세토니트릴, 0.1%의 트리플루오로아세트산)로 C8 칼럼 (Aquapore RP 300, Applied Biosystems 사 제조, 입도 : 7 ㎛, 공극 크기 : 300 Å)을 평형상태가 되게 하였다. 헤파린칼럼으로부터의 MP52를 함유하는 풀링시킨 단편으로 칼럼을 로딩시킨 후 10 %의 완충제 B로 광범위하게 세척하였다. 결합형 단백질을 다음 그래디언트 즉 20 분 동안 10 - 50 %의 완충제 B 및 50 분동안 50 - 100%의 완충제 B로 용리시켰다. 500 ㎕의 단편들을 수거하여 Western 블로트 및 은으로 스테이닝시킨 겔로 분석하였다. 약 55 - 65 %의 아세토니트릴의 선택된 조건하에 MP52 단백질을 용리시켰다. MP52를 함유하는 단편들을 풀링시켰다. 야생형 바이러스로 감염시킨 세포로부터의 세포 배양 상청액을 조절 정제시켜 얻은 대응 단편들을 가지고 동일한 절차를 수행하였다.

Western 블로트 분석에 따라 농도가 50 ng/㎖로 추정되는 부분적으로 정제된 MP52 단백질은 3 일동안의 인큐베이팅 후 ALP 활성의 현저한 증가를 또한 보여주었다.

연골 및 뼈 형성 능력을 제공하기 위하여 부분적으로 정제시킨 MP52 단백질 또는 야생형 바이러스로 감염시킨 후 대응되는 부분적으로 정제시킨 세포 배양 상청액으로부터 얻은 대조구 단백질을 매트릭스로 재구성시켜 랫내 이식시켰다.

일반적으로 당업자에 공지된 여러가지 매트릭스 물질은 사용가능한 즉 천연 (또는 개질된) 및 합성 제조된 매트릭스일 것이나 생분해될 수 있는 생체에 유리한 다공성 물질이 바람직하다. 이들 실험에서는 본질적으로 Sampath 등 (PNAS 80 (1983), 6591 - 6596)이 기술한 바와같은 방법으로 제조된 랫으로부터의 경골 매트릭스를 사용하였다. 0.6 M의 HCl 내에서 24 시간동안 랫 뼈 (대퇴골 및 경골)를 탈염시킨 후 여전히 존재하는 골수를 제거시켰다. 물론 세척하고 3 시간동안 클로로포름/메탄올 (1/1) 혼합물내에서 탈지시킨 후 뼈들을 공기 건조시키고 급속 냉동 상태에서 밀내에서 분쇄시키고 입도가 400 - 1000 ㎛인 입자들을 체로 걸러 내었다. 이 후 프로테아제 저해제의 존재하에 7 일동안 실온에서 상기 매트릭스를 4 M의 구아니듐 HCl로 추출시켰다. 물로 광범위하게 세척시킨 후, 상기 매트릭스를 냉동 건조시켜 4℃에서 저장하였다. 이런식으로 처리된 매트릭스는 독력으로 뼈 - 유도 활성을 보이지 않는다.

당업자에 공지된 여러가지 방법으로 추출된 뼈 매트릭스와 단백질을 조합시킬 수 있다. 헤파린 - 세파로제 및 역상 HPLC로 정제시킨 대조구 단백질 또는 MP52 단백질을 아세토니트릴/트리플루오로 - 아세트산 용액내에 용리시킨 후, 각 경우 잘 혼합된 급속 냉동되고 냉동 건조된 이식조직당 25 mg의 매트릭스와 조합시켰다.

매트릭스 - 결합형 MP52의 이식을 위하여 체중 100 g 당 0.14 ㎖를 사용하는 마취제 (0.5 ㎖의 Ketanest 50 (Parke Davis 사 제품)와 혼합시킨 0.2 ㎖의 Rompun (Bayer 사 제품))를 근내 주사하여 마취시킨 약 3 개월된 두 마리의 랫 (Whistar)을 사용하였다. 이식 조직 (흉강아래, 가장 낮은 늑골궁아래 약 0.5 cm)을 위하여 복부 근육에 좌우 상칭의 포켓을 만들었다. 매트릭스 - 결합형 MP52 (Western 블로트로 추정할때 약 2 - 4 ㎍ 임) 및 대응되는 매트릭스 - 결합형 대조구 단백질을 0.9 %의 염용액 (Delta Pharma 사 제품)을 사용하여 적시고 근육포켓에 도입시켰다. 이후 근육 포켓 및 필요한 피부 절개부를 봉합시켰다. Cyclosporin A (Sandimmun 사 제품)로 랫을 면역억제시켰다.

18 또는 26 일 후 랫으로부터 이식조직을 제거시켜 조직 검사를 위하여 고정시켰다. 26 일 후 MP52를 함유하는 이식조직을 통하여 거시적으로 뼈 형성이 이미 이루어졌다고 사료되어졌으므로 박편을 제조하기 위하여 이것을 메틸메타크릴레이트에 임베팅(embedding) 시키고 다른 이식 조직을 파라핀에 임베딩시켰다. Von Kossa 스테이닝 기술 (Romeis, B ; "Mikroskopische Technik", Ed : Bck, p. ; Urban and Schwarzenberg ; Munich, Baltimore, Vienna (1989))로 연골 및 뼈 조직을 흑색으로 강조시켰다. Masson - Goldner (Romeis, B. ; "Mikroskopische Technik", Ed : Bck, p. ; Urban and Schwarzenberg ; Munich, Baltimore, Vienna (1989))에 따라 스테이닝시키는 삼색형에서 광물화시킨 뼈 조직 및 콜라겐은 밝은 녹색으로, 오스테오이드는 적색으로, 세포질은 적갈색으로 스테이닝 시킨다. 두마리 랫으로부터 얻은 이식조직에 두 스테이닝 기술을 사용하였다. 두 실험 동물의 MP52를 함유하는 이식조직에서 스테이닝 기술을 사용하여 연골 및 뼈의 상당한 형성을 관찰하였다. 대조구 단백질을 함유하는 대응 이식조직은 연골 또는 뼈의 형성을 보이지 않는다. 연골세포를 갖는 연골 전구체 및 세포질 밖의 매트릭스가 초기 형성되고 동심원에서 광물화된 연골부의 수는 26 일 후의 MP52 이식조직 보다 18 일 후의 MP52 이식조직에서 더 높다. 그러나 뼈내 개개의 골수세포 및 병인균전파성의 유골 형성을 갖는 성숙 뼈조직은 또한 18 일 후에 이식조직에서 검출가능하다. 또 폐쇄된 소골은 골수 형성 초기에 관찰할 수 있다. 26 일 후에는 초기 매트릭스 형성 및 석회화를 갖는 연골부 또한 검출가능하고 골세포 및 유골 에지 (edge)를 갖고 녹색으로 스테이닝된 광물화된 뼈조직의 부분은 현저하게 증가된다. 이 이식조직에서 지방 세포의 분리와 골수형성을 또한 검출할 수 있다. 제5도에서는 26 일 후 전체 이식조직으로부터의 뼈물질 (von kossa stain에 따름)의 스테이닝 테스트를 보여준다. 제6도에 나타낸 동일한 이식 조직의 작은 조각은 개별적인 임베딩된 조골세포를 인지할 수 있는 입방형 조골세포 및 유골을 에징시킨 활성뼈를 보여준다. 또 개별적인 골세포들은 광물화된 뼈조직 (원 제조시 녹색으로 스테이닝된)에서 볼 수 있다. 골수형성 또한 관찰가능하다.

상기 실험은 매트릭스와 조합된 재조합 생성된 MP52 자체가 뼈형성을 유도할 수 있음을 보여준다.

2.2

상기 결과를 확인하기 위하여 MP52 L 세포 형질전환체를 사용하여 뼈형성에 대한 변위 테스트를 하였다. MP52 (HindIII - MP52/pABWN으로 형질전환된)를 생성시키는 L 세포 (1 x 10⁶세포) 및 비생성 (pABWN - 형질전환된) L 세포를 각 경우 세마리의 수컷 마우스의 양 대퇴 근육에 주사하였다. 3 주후 모든 동물들이 죽었고 대퇴 근육을 절제하여 저에너지 X - 레이 방사선으로 및 히스토파토로직하게 검사하였다.

X - 레이 방사선에 의한 분석은 표 3에 나열한 바와같이 MP52를 생성시키는 모든 L 세포의 근육 조직의 주사 부위의 높은 밀도의 물질을 보여준다. 조직학적 검사로 근육내에서 간단한 연골 형성 및 석회화된 연골 형성을 측정할 수 있다. 이들 결과는 또한 MP52가 뼈형성을 유도할 수 있음을 확인해 준다.

[표 3]

수행된 실험은 MP52 단백질의 분화되지 않은 감엽 세포로부터의 연골 형성 및 조골세포의 분화 및 성숙을 자극함을 확인해준다. 이것은 태아의 뼈형성 유도 케스케이드 및 뼈 골절 치료와 같은 뼈형성을 이끈다.

실험에 언급된 조건을 MP52 활성의 예시로서 간주하여야 하며 제한은 아니다. 본 발명은 또한 또다른 형태로 검사되고 특징지어질 수 있다.

본 발명 응용물에 언급된 플라스미드 및 세포 계통의 기탁증을 부착하였으며 이 기탁증으로부터 기탁의 세부사항을 모을 수 있다.

(페이지 31~36 누락)

서열 제1번

서열의 형태 : 핵산 서열

명칭 및 기원 : MP - 52 DNA

길이 : 2703 개의 누클레오티드

서열 제2번

서열의 형태 : 아미노산 서열

명칭 및 기원 : MP -52 단백질

길이 : 501 개의 아미노산

Claims (13)

1. (a) 서열 제1번의 누클레오티드 640-2142, 또는 1783-2142 또는 1837-2142 또는 640-1782, (b) 서열 제2번의 아미노산 1-501 또는 382-501 또는 400-501 또는 1- 381을 암호화하는 누클레오티드 서열 및 (c) 긴축 조건(stringent condition) 하에서 (a) 및 (b) 로부터의 서열 중 하나와 잡종형성하는 누클레오티드 서열 중의 하나를 포함하는, TFG - β 군의 단백질을 암호화하는 DNA 분자.
2. 제1항의 DNA 분자 복제물을 하나이상 함유하는 벡터.
3. 제1항의 DNA 또는 제2항의 벡터에 의하여 형질전환된 숙주 세포.
4. 제3항에 있어서, 박테리아, 균류, 식물 또는 동물 세포인 숙주 세포.
5. 제1항의 DNA 서열에 의하여 암호화된 TGF - β 군의 단백질.
6. 제5항에 있어서, 서열 제2번에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 단백질.
7. 제3항 또는 제4항의 숙주 세포를 배양시키고, 상기 세포 또는/및 배양 상청액으로부터 TGF - β 단백질을 분리시키는 TGF - β 군의 단백질 제조 방법.
8. 활성물질로서 제5항 또는 제6항의 단백질을 하나이상 함유하는 제약학적 조성물.
9. 제8항에 있어서, 뼈, 연골, 결합 조직, 피부, 점막, 상피 또는 치아 손상의 예방 또는 치료용, 치아 이식용 및 상처 치료 및 조직 재생 공정용의 제약학적 조성물.
10. 제5항 또는 제6항의 단백질과 결합한 항체 또는 항체 단편들.
11. 제8항에 있어서, 단백질이 천연 또는 합성 매트릭스 물질 내에 또는 상에 함유되어 있는 제약학적 조성물.
12. 제11항에 있어서, 상기 매트릭스 물질이 생분해될 수 있는 생물학적으로 허용가능한 다공성 물질인 제약학적 조성물.
13. 제8항에 있어서, 통상의 제약학적 담체물질, 보조 물질, 희석제 또는 충전재를 추가적으로 함유하는 제약학적 조성물.