PT642831E - Dispositivo e processo para a realizacao de ciclos de temperatura - Google Patents
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Description
1
G
Descrição “Dispositivo e processo para a realização de ciclos de temperatura” A invenção refere-se a um dispositivo para a realização automática de reacções em cadeia de polimerases, numa pluralidade de recipientes de reacção, sendo cada um dos recipientes de reacção fechado com uma tampa e contendo um volume pré-determinado de uma mistura de reacção líquida, contendo o dispositivo os componentes seguintes: a) um suporte, que tem um dispositivo circular de câmaras para a recepção dos recipientes de reacção, sendo cada uma das câmaras apropriada para receber a parte inferior de um recipiente de reacção, sendo o suporte feito de um material que possui uma condutibilidade térmica elevada e tendo uma superfície superior, uma superfície inferior e uma parede exterior cilíndrica, tendo cada uma das câmaras do suporte uma abertura, situada na superfície superior do suporte, b) recipientes de reacção dispostos nas câmaras do suporte, cada um dos quais é fechado com uma tampa, c) um dispositivo de comando e regulação comandado por computador; e d) meios comandados pelo dispositivo de comando e regulação para a alteração cíclica da temperatura do suporte, sendo os ciclos de temperatura apropriados para a realização de reacções em cadeia de polimerases nos recipientes de reacção. A invenção refere-se, em especial, a um dispositivo deste tipo que é apropriado, de preferência, como parte integrante de um aparelho automático de análise, para a realização das reacções em cadeia, de polimerases (“Polymerase--Chain-Reaction”). A invenção refere-se, além disso, a um processo para a amplificação de ácidos nucleicos.
Descreve-se um dispositivo do tipo atrás referido na patente EP-A-0 488 769 A2.
Descreve-se um dispositivo do tipo atrás referido também na patente EP-A-0 236 069 A2, no qual, além disso, se indica que o meio para a alteração cíclica da temperatura de um suporte do tipo atrás referido pode conter elementos Peltier.
Os dispositivos do tipo mencionado na introdução são designados por “Thermalcycler” Utiliza-se este termo na descrição que vai seguir-se.
Os dispositivos descritos na patente EP-A-0 488 769 A2 e na patente EP-A-0 236 069 A2 têm o inconveniente de, após a realização da reacção em cadeia das polimerases, se pipetar uma quantidade determinada do produto da reacção, por meio de uma pipeta, de cada recipiente da reacção para uma cubeta de medição, própria para as medições electro-ópticas por meio de uma pipeta. Para isso, retira-se previamente a tampa de cada um dos recipientes de reacção, manualmente. Como os produtos da reacção podem ser patogénicos, o pessoal do laboratório fica exposto a um perigo de contaminação. Além disso, no caso de execução manual da pipetagem pode não ficar excluída uma contaminação do produto da reacção pipetado. A presente invenção tem portanto como objectivo proporcionar um dispositivo e um processo do tipo mencionado na introdução, com os quais podem eliminar-se os inconvenientes mencionados. A parte deste problema que se refere ao dispositivo, é resolvida, de acordo com a invenção, com um dispositivo do tipo mencionado na introdução, que é 3 caracterizado por: i) a tampa dos recipientes de reacção poder ser penetrada com a agulha de pipetagem de um dispositivo automático para pipetar, para retirar um volume da mistura da reacção contida no recipiente da reacção; e ii) conter uma tampa que pode fechar-se para reter o recipiente fechado, colocado no suporte, apresentando essa tampa uma abertura por cada câmara, através da qual a tampa do recipiente de reacção contido na câmara pode ser penetrada com a agulha de pipetar de um dispositivo automático de pipetagem. A parte deste problema relativa ao processo é, de acordo com a invenção, resolvida com um processo do tipo mencionado na introdução, caracterizado por: i) se utilizar, para a realização do processo, um dispositivo de acordo com a reivindicação 1, ii) depois do passo de amplificação, se retirar uma porção da mistura dos produtos da reacção do recipiente de reacção, sem abrir o recipiente da reacção, no qual, para a remoção, se faz penetrar no fecho do recipiente de reacção uma agulha de pipetagem e se aspira a referida porção da mistura de reacção para a agulha de pipetagem, e iii) se fornece a porção da mistura de reacção retirada para um recipiente de reacção. O dispositivo de acordo com a invenção ou, respectivamente, o processo de acordo com a invenção tomam possível eliminar o perigo de contaminação do pessoal do laboratório ou, respectivamente, uma contaminação dos produtos da reacção durante a operação de pipetagem mencionada.
Uma outra vantagem do dispositivo e do processo de acordo com a invenção consiste em eliminar os inconvenientes dos dispositivos e processos deste tipo conhecidos, da maneira mais simples e com custos reduzidos.
Descrição de um exemplo de realização
Descreve-se a seguir um exemplo de realização da invenção, com referência aos desenhos anexos, cujas figuras representam: A fig. 1, um “Thermalcycler”-Parte 2, retirado de um aparelho de análise, do “Thermalcycler” (18) e (19) de acordo com a invenção, estando o “Thermalcycler” (18) aberto e estando representado um anel de tubos de ensaio (23), retirado; A fig. 2, um corte feito pela linha (ΙΙ-Π) da fig. 1, estando o “Thermalcycler” (18) fechado; A fig. 3, uma representação esquemática de um dispositivo de comando “Master-Slave” para regulação e vigilância dos parâmetros de serviço de um “Thermalcycler” de acordo com a invenção; A fig. 4, um diagrama de Temperatura-Tempo do andamento da temperatura registado num processador principal (“master”) ou, respectivamente, das temperaturas do termobloco dela resultante e da amostra; e A fig. 5, uma representação geral, em perspectiva, de um aparelho de análises, que contém como parte componente um “Thermalcycler”-Parte 2 de acordo com a invenção. “Thermalcycler”
Na descrição seguinte designa-se por “Thermalcycler” um dispositivo que serve para a realização automática de ciclos de temperatura, em pelo menos um tubo de ensaio (21), fechado com uma tampa, que contém um volume pré-determinado de uma mistura de reacção líquida. 5 />
Descreve-se a seguir um “Thermalcycler” que é de preferência próprio como componente de um aparelho automático para análises, para a execução da reacção em cadeia de polimerases. O aparelho para análises é, por exemplo, concebido para a realização de análises imunológícas.
Na fig. 1, está representado um “Thermalcycler”- Parte 2 constituído por um aparelho para análises (1), de acordo com a fig. 5. Este “Thermalcycler”-Parte 2 contém, por exemplo, dois “thermalcycler” (18, 19) e uma “Stand-by Position” (22). A descrição que se segue do “Thermalcycler” (18) serve também para o “Thermalcycler” (19). O “Thermalcycler” (18) contém os seguintes componentes. a) um termobloco (33), que serve de suporte dos tubos de ensaio e que tem uma disposição em forma de anel de cavidades (27), servindo cada uma das cavidades como câmara para a recepção da parte inferior de um tubo de ensaio (21), b) um dispositivo de comando e regulação, controlado por computador, representado na fig. 6, e c) elementos de aquecimento ou, respectivamente, arrefecimento, comandados por este dispositivo de comando e regulação, como meios para a alteração cíclica da temperatura do termobloco (33). O termobloco (33) é feito de um material com uma elevada condutibilidade térmica. O termobloco (33) é, de preferência, um corpo de alumínio ou prata. O termobloco (33) tem uma superfície superior, uma superfície inferior e uma parede exterior cilíndrica, tendo cada uma das cavidades (27) do termobloco uma abertura, que se situa na superfície superior do suporte.
Como se representa na fig. 1, agrupam-se doze tubos de ensaio (21) num anel (23) de tubos de ensaio. Os tubos de ensaio (21) são cónicos na zona inferior, formados cilíndricos na zona superior e fechados hermeticamente por uma tampa (87). Como pode ver-se bem nas fig. 1 e 3, um anel (23) para os tubos de ensaio deste género pode ser usado em cavidades correspondentes (27) do termobloco (33) do “thermalcycler” (18).
Acesso ao conteúdo de um tubo de ensaio O “thermalcycler” (18) tem uma tampa (28), que pode fechar-se por articulação, que apresenta, por cada cavidade (27) do termobloco (33), uma abertura (29), que toma possível uma penetração do fecho (87) do tubo de ensaio (21) introduzido na cavidade. Como pode ver-se a partir da fig. 2, na posição de fecho da tampa articulada (28), cada uma das aberturas (29) está alinhada com o eixo longitudinal (31) do tubo de ensaio (21) correspondente.
As aberturas (29) da tampa articulada (28) possibilitam o acesso ao conteúdo de cada tubo de ensaio, com a tampa articulada (28) fechada. Para isso, introduz-se a agulha de pipetar (32) de um dispositivo de pipetar através das aberturas (29), faz-se penetrar a agulha de pipetar (32) através da tampa (87) do tubo de ensaio (21) e, em seguida, aspira-se um volume determinado do líquido contido no tubo de ensaio.
Transmissão do calor entre o termobloco e os tubos de ensaio
Pode ver-se a partir da fig. 2 que as cavidades (27) no termobloco (33) estão adaptadas à zona cónica dos tubos de ensaio (21), de modo que a parede periférica do tubo de ensaio (21) pode encostar-se de maneira fiável à parede interior da cavidade (27), a fim de se obter uma melhor transmissão do calor. A fim de aumentar a velocidade térmica da reacção, a precisão e a homogeneidade, o termobloco (33) é o mais possível isolado termicamente, está contido numa caixa 7 y *? y / s (34) e apresenta uma massa reduzida, com boa condutibilidade térmica.
Elemento calefactor na tampa articulada do “thermalcvcler” A tampa (28) contém de preferência um elemento calefactor, por exemplo um aquecedor eléctrico de resistência (52), que serve para o aquecimento dos tubos de ensaio colocados fechados no termobloco (33).
Numa primeira forma de realização do “thermalcycler”, utiliza-se o aquecedor eléctrico de resistência (52) em combinação com um elemento de Peltier (36), descrito a seguir, a fim de se obter um perfil de temperaturas desejado (curva da temperatura num determinado intervalo de tempo) no termobloco (33). Nesta forma de realização, o elemento de Peltier é utilizado de acordo com a temperatura a atingir, dentro de um perfil de temperaturas, como elemento de arrefecimento ou como elemento de aquecimento. A colaboração do aquecedor eléctrico de resistência (52) com o elemento de Peltier (36) toma possível aumentar a velocidade da alteração de temperatura necessária do termobloco (33) e a precisão necessária e a homogeneidade da distribuição de temperatura. Pela actuação do aquecedor de resistência (52) evita-se além disso uma eventual condensação na zona superior do tubo de ensaio (21). Dispositivo de fecho e pressão da tampa articulada do “thermalcvcler” A tampa articulada (28) contém de preferência um dispositivo de fecho e pressão, para fixar os tubos de ensaio (21) colocados no termobloco (33). Para isso, a tampa articulada (28) apresenta uma placa de pressão, retida por uma mola (46), que empurra cada um dos tubos de ensaio (21) com uma certa força para dentro da camada (27) do termobloco (33). As cavidades (47) para a recepção da tampa (87) em forma de calote dos tubos de ensaio (21), bem como as aberturas de penetração 8
(48) para a agulha de pipetar (32), são previstas coaxiais com os tubos de ensaio (21), na placa de pressão (46). Como mola pode prever-se um disco ondulado (49). Por meio de um anel de segurança (51) protege-se a placa de pressão (46) contra a queda, quando a tampa articulada (28) estiver aberta. O aquecedor de resistência (52) atrás referido está contido, de preferência na placa de pressão (46) com mola.
Elemento de Peltier como elemento de arrefecimento ou aquecimento
Como se representa na fig. 2, o “thermalcycler” de acordo com a invenção (18) contém, de preferência, pelo menos um elemento de Peltier (36) fazendo parte dos meios previstos no “thermalcycler” (18) para a alteração cíclica da temperatura do termobloco (33). O elemento de Peltier (36) é colocado, com uma das suas superfície de transmissão do calor (37) em contacto, a toda a superfície, com a superfície inferior do termobloco (33) e, com a sua outra superfície de transmissão do calor (38), a toda a superfície, em contacto com um corpo de refrigeração (39) para a dissipação do calor. O corpo de refrigeração (39) é de preferência de alumínio ou de cobre. Previu-se um ventilador (45), que pode ser ligado para a dissipação do calor. O elemento de Peltier (36) representado na fig. 2, esquematicamente, é de preferência um dispositivo com tais elementos.
Na primeira forma de realização, atrás mencionada, do “thermalcycler”, o elemento de Peltier (36) é utilizado como elemento de arrefecimento ou como elemento de aquecimento. Este modo de serviço do elemento de Peltier (36) e a sua colaboração com o aquecedor eléctrico de resistência (52) possibilita atingir um perfil de temperaturas necessário.
Para o aumento da duração do elemento de Peltier (36), este é protegido, contra picos de tensão mecânica, com base termodinâmica, mantendo-se o elemento de Peltier (36), por meio de uma fixação central, com uma tensão elástica prévia, apertado contra o termobloco (33). Para isso, fixa-se o elemento de Peltier, elasticamente, entre as superfícies de transmissão do calor do termobloco (33) e o corpo de refrigeração (39). Para isso, o corpo de arrefecimento (39) é apertado, por exemplo por meio de uma mola de compressão (41), com a sua superfície de contacto, contra o elemento de Peltier (36). A tensão elástica pode ser ajustada através de um parafuso de ajustamento (42), do prato elástico (43) e uma articulação esférica (44), que aumenta ainda mais os graus de liberdade do corpo de arrefecimento (39).
Elemento de Peltier adicional em tomo do termobloco Numa segunda forma de realização do “thermalcycler” este contém, de preferência, adicionalmente, um aquecedor eléctrico de resistência (35), colocado em tomo do termobloco (33) e ao longo da periferia da sua parede cilíndrica exterior. No caso da utilização deste elemento aquecedor adicional no “thermalcycler”, o elemento de Peltier (36) é utilizado apenas para o arrefecimento. Isso tem a vantagem de uma redução da carga do elemento de Peltier devida a tensões mecânicas de origem térmica e contribui desse modo para prolongar a vida do elemento de Peltier no “thermalcycler”.
Meios para a deteccão de uma marcação no anel de tubos de ensaio O “thermalcycler” (18) contém, além disso, de preferência, meios para a detecção de uma armação do dispositivo (23) de tubos de ensaio, por exemplo uma marcação na forma de talão (25), dirigido verticalmente. O talão (25) colabora com um dispositivo de detecção (26) no interior do “thermalcycler” (18) para possibilitar uma detecção da presença do anel de tubos de ensaio (23) no “thermalcycler” (18). O dispositivo de detecção (26) é por exemplo um limitador óptico. O talão (25) permite, além disso, um posicionamento único do dispositivo de tubos de ensaio (23) no termobloco (33). Uma combinação deste posicionamento único com uma numeração das tampas dos tubos de ensaio possibilita, além disso, uma correspondência inequívoca entre amostra e paciente. O dispositivo (23) de tubos de ensaio tem além disso uma placa (24), que serve, por exemplo, de superfície de suporte para os dados sobre os conteúdos das amostras do dispositivo (23), existindo esses dados, por exemplo, na forma de um código de barras.
Comando e regulação do “thermalcycler”
Na fig. 3 está representado esquematicamente um dispositivo de comando e regulação de um “thermalcycler” (18), por meio de processadores Principal--Secundário (72, 73).
As temperaturas da placa de pressão (46) da tampa articulada (28), do termobloco (33) e do ambiente são detectadas por meio de detectores de temperatura (65, 66, 67) e conduzidas ao processador secundário (73), através de uma interface de temperatura (68). No processador principal (72) (interface para o utilizador) são introduzidos, entre outros, o valor nominal da temperatura, o valor nominal do tempo, o número de ciclos de temperatura e a velocidade das operações de aquecimento e arrefecimento.
Podem escolher-se perfis de temperatura/tempo já pré-determinados memorizados, e utilizar os mesmos. A introdução faz-se através do teclado (16) ou de uma outra interface. Estes dados são conduzidos ao processador secundário (73), que comanda, através do regulador (69), um ajustador da potência (71) o qual, por sua vez, regula a alimentação de energia do elemento aquecedor (35, 52) e do elemento de Peltier (36). Os valores de retomo (valores efectivos) são conduzidos, através do processador secundário (73), ao processador principal (72) e aí processados ou, respectivamente, indicados ao utilizador. Deste modo, o utilizador é informado, através da temperatura instantânea das amostras de ensaio, das temperaturas já atingidas, indicações dos tempos e das temperaturas a atingir com indicação dos tempos. O estado de funcionamento do sistema é controlado permanentemente e registado em protocolos. Os erros ou avarias que não podem ser eliminados pelo próprio aparelho provocam uma desligação automática, ou uma indicação de erro. A temperatura das amostras é calculada a partir da temperatura do termobloco (33). Para isso determina-se a função de transferência do espaço das amostras para as amostras nos tubos de ensaio (21). Esta função é essencialmente um filtro passa-baixo com tempo morto.
Com base em algoritmos de regulação (sistemas explorados) calcula-se a respectiva grandeza de ajustamento, que é necessária para reconduzir a temperatura das amostras ao valor nominal pré-determinado da temperatura. A grandeza de regulação calculada é levada, na forma de duração de um impulso, ao ajustador da potência (71). O ajustador da potência (71) é, por exemplo um transístor FET de potência, com um circuito de protecção e eliminação de interferências. O comando e regulação atrás descritos possibilitam a utilização do “thermalcycler” para aquecer e arrefecer as amostras de anel de tubos de ensaio usado no “thermalcycler”, de acordo com detenninados perfis de temperatura. Os perfis de temperatura são definidos por patamares de temperatura com durações definidas e o gradiente, que define o tempo, ao fim do qual tem de ser atingido um patamar de temperatura. A condição é que todas as amostras tenham, no “thermalcycler”, a mesma temperatura nos mesmos tempos.
Na fíg. 4 estão indicados exemplos de curvas da temperatura num processo cíclico. A curva (A) mostra o andamento da temperatura no termobloco (33), a curva (B) mostra o andamento da temperatura do líquido no recipiente de recepção (21). Com o “thermalcycler” podem ajustar-se temperaturas entre 40°C e 98°C. Tipicamente, as temperaturas inferiores situam-se entre 50°C e 60°C e as temperaturas superiores entre 90°C e 96°C. Quando se usar a temperatura média ela situa-se à roda dos 72°C. A velocidade de aquecimento/arrefecimento obtida com o “thermalcycler” é de 1°C por segundo. Um ciclo típico tem uma duração de 120 segundos. Se tiver de se manter as temperaturas correspondentes mais de 10 segundos, prolonga-se a duração do ciclo.
Aparelho para análises com “thermalcycler”
Na fig. 5 está representado um aparelho para análises (1), concebido para a realização de, por exemplo, análises imunológicas. A fim de elevar, em volume, as substâncias a analisar contidas nas amostras, além dos limites de indicação, para o processo de análise seguinte, previu-se no aparelho para análises, como sua parte integrante, um “thermalcycler”-parte 2 que, de acordo com a invenção, contém o “thermalcycler” (18, 19) atrás descrito, com o qual, por utilização da reacção em cadeia de polimerases, pode realizar-se um processo de amplificação DNS.
Para aumentar a capacidade do aparelho para análises, isto é, para tratar o maior número possível de amostras por unidade de tempo, o número de amostras preparadas é ajustado aos tempos de processamento seguintes, de modo tal que não haja quaisquer tempos mortos. Por exemplo, isso é realizado pelos dois “thermalcycler” (18, 19), cada um dos quais pode receber doze tubos de ensaio (21), e por duas estações de reserva em prontidão (22), que podem igualmente receber doze tubos de ensaio, que podem ser recebidos por um dos “thermalcycler” (18, 19) no fim do processo nele em curso.
Além disso, o aparelho de análises (1) contém todos os outros dispositivos para a realização das análises imunológicas atrás referidas, por exemplo duas prateleiras (3, 4) com reagentes, numa mesa vibratória (5), uma prateleira (6) com outros reagentes, três prateleiras com recipientes de reacção (8) não reutilizáveis, um incubador temperável (9), no qual podem introduzir-se os recipientes de reacção (8), um dispositivo de lavagem (11) e um dispositivo fotométrico (12) para a determinação do resultado do ensaio.
Cabeça de transferência do aparelho para análises A transferência das amostras e dos reagentes, bem como a transferência dos recipientes de reacção é possibilitada por uma cabeça de transferência (13) móvel segundo um sistema de coordenadas X-Y, que apresenta um dispositivo de pipetar (14) e um órgão de preensão (15) dos recipientes de reacção, ambos susceptíveis de se mover na direcção Z.
Depois da realização da amplificação DNS nos tubos de ensaio (21) contidos nos “thermalcyclers” (18,19) retiram-se, com o dispositivo de pipetar (14), volumes 14 de amostras dos tubos de ensaio (21) e fomecem-se ao recipiente de reacção (8) colocados nas prateleiras (7). No caso das análises imunológicas efectuadas no aparelho para análises examinam-se os volumes das amostras fornecidos aos recipientes de reacção (8).
Unidade de comando do aparelho para análises
Todas as operações a efectuar são comandadas por uma unidade de comando central (não representada) do aparelho para análises e pelas mesmas coordenadas. Uma superfície superior de operação, ou teclado (16) para a introdução dos parâmetros do processo, bem como um mostrador para apresentar os estados do processo, estão também representados esquematicamente. Os dados das amostras, que podem ser colocados, na forma de códigos de barras, nos tubos de ensaio, podem ser lidos por um lápis de leitura ou por um leitor de exploração por varrimento (17), para uma memória. Preferiram-se interfaces para uma impressora etc. (não representadas).
Lisboa, 4 de Maio de 2001
JOSÉ DE SAMPAIO '·
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Claims (3)
1 Reivindicações 1. Dispositivo para a realização automática de reacções em cadeia de polimerases, numa pluralidade de recipientes da reacção, no qual cada um dos recipientes de reacção é fechado com uma tampa e contém um volume, determinado previamente, de uma mistura de produtos de reacção líquidos, contendo o referido dispositivo os componentes seguintes: a) um suporte (33), que possui uma disposição anular de câmaras (27) para a recepção dos recipientes de reacção, estando cada uma das câmaras adaptada para receber a parte inferior de um recipiente de reacção (21), e sendo o suporte (33) feito de um material com uma condutibilidade térmica elevada e que tem uma superfície superior, uma superfície inferior e uma parede exterior cilíndrica, tendo cada uma das câmaras (27) do suporte (33) uma abertura, situada na superfície superior do suporte, b) recipientes de reacção (21) dispostos nas câmaras (27) do suporte (33), os quais são fechados com uma tampa (87), c) um dispositivo de comando e regulação comandado por computador; e d) meios comandados pelo dispositivo de comando e regulação, para a variação cíclica da temperatura do suporte, sendo os ciclos de temperatura apropriados para a realização de reacções em cadeia de polimerases, nos recipientes de reacção, sendo o dispositivo caracterizado por. i) a tampa (87) dos recipientes de reacção (21) ser susceptível de ser penetrada com a agulha de pipetar (32) de um dispositivo automático para pipetar (14), para a retirada de um volume da mistura de produtos da reacção contida no 2
recipiente da reacção; e ii) conter uma tampa articulada (28), para a fixação dos recipientes de reacção (21) colocados, fechados, no suporte (33), apresentando a tampa (28), por cada câmara (27), uma abertura (29), através da qual a tampa (87) do recipiente de reacção (21) que contém as câmaras (27) pode ser penetrada com a agulha de pipetar (32) de um dispositivo automático de pipetar (14).
2. Processo para a amplificação de ácidos nucleicos, no qual: (a) se introduz, num recipiente de reacção, uma amostra que se supõe conter uma sequência de ácidos nucleicos a detectar, e reagentes apropriados para a amplificação de uma tal sequência de ácidos nucleicos, a fim de formar uma mistura de reacção, (b) se fecha hermeticamente a mistura de reacção no recipiente de reacção, sendo este último fechado com um fecho de vedação hermética, (c) se amplifica a sequência de ácidos nucleicos a detectar, no recipiente de reacção, por um processo que compreende a realização de ciclos de temperatura da mistura de reacção contida no recipiente de reacção, caracterizado por: (i) para a realização do processo se utilizar um dispositivo de acordo com a reivindicação 1, (ii) se retirar, depois do passo de amplificação, uma porção da mistura de reacção do recipiente de reacção, sem abrir o recipiente da reacção (21), sendo, para a retirada, o fecho (87) do recipiente de reacção (21) penetrado por uma agulha de pipetar e absorvida a porção desejada de mistura da reacção na agulha de pipetar, e (iii) se introduzir a porção retirada de mistura de reacção, num recipiente de 3 reacção.
3. Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o recipiente de reacção (21) ser colocado num aparelho automático que contém um dispositivo automático de pipetar para a realização da retirada e fornecimento da porção da mistura de reacção. Lisboa, 4 de Maio de 2001
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