PT501215E - Proteinas de fusao contendo anticorpos monoclonais linker- e beta-glucoronidase para a activacao de pro-medicamentos sua preparacao e utilizacao - Google Patents

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Description

5ο-{. 2\ζ
DESCRIÇÃO "PROTEÍNAS DE FUSÃO CONTENDO ANTICORPOS MONOCLONAIS, LINKER- E BETA-GLUCORONIDASE PARA A ACTIVAÇÃO DE PRÓ-MEDICAMENTOS, SUA PREPARAÇÃO E UTILIZAÇÃO" A invenção refere-se a proteínas de fusão para a activação de pró-medicamentos de fórmula geral huTuMAK-L-p-Gluc, em que hutuMAK significa um anticorpo monoclonal humanizado ou humano, específico de tumor, um seu fragmento ou derivado, L significa um "linker" (ligante) e β-Gluc designa β- glucoronidase humana. Estas proteínas de fusão são preparadas por meio de técnicas genéticas. 0 huTuMAK é responsável pela localização específica de tumores, L liga o huTuMAK com a β-Gluc de um modo tal, que não perturba as propriedades específicas de ambos os parceiros de fusão e a β-Gluc activa uma ligação adequada do pró-medicamento através da cisão do ácido glucorónico, em que através do parceiro de fusão humanizado ou humano, se encontra pronto para utilização em humanos, um sistema praticamente autólogo. A combinação do pró-medicamento e conjugados anticorpo-enzima específicos de tumor, para utilização como meio terapêutico está descrita na literatura da especialidade. Assim, injecta-se um animal, que possui um tecido transplantado, com anticorpos contra um determinado tecido, ao qual está ligada de forma covalente uma enzima que cinde um pró-medicamento, e em seguida administra-se uma composto de pró-medicamento, activável por uma enzima. Sob a acção do conjugado anticorpo-enzima ligado ao tecido, o composto de 1
ttas^y pró-medicamento é transformado num tóxico celular que exerce um efeito citotóxico contra o tecido transplantado. A WO 88/07378 descreve um sistema terapêutico contendo dois componentes, que consiste de um componente anticorpo-enzima. Para a preparação do conjugado anticorpo-enzima está descrita a utilização de enzimas de não mamífero, sendo excluída a utilização de enzimas endógenas, com base na libertação não específica do material activo. Devido ao facto das enzimas exógenas serem reconhecidas pelo organismo como um antigénio estranho, a sua utilização tem o inconveniente de uma resposta imune contra este material ligado, que não é do próprio corpo, em virtude da qual, a enzima imobilizada no anticorpo é desactivada e eventualmente todo o conjugado é eliminado. Além disso, utilizam-se aqui o ácido p-Bis-N-(2-cloroetil)-aminobenzilglutamínico e os seus derivados, como pró-medicamentos, cuja semi-vida química é de apenas 5,3 a 16,5 horas. A instabilidade química de um composto de pró-medicamento é desvantajosa, em virtude dos efeitos secundários previsíveis.
Na EP A2-0 302 473 está igualmente descrito um sistema terapêutico contendo dois componentes, no qual um conjugado anticorpo-enzima localizado num tecido de tumor cinde um composto de pró-medicamento numa material activo citotóxico. A utilização combinada aqui descrita, entre outras, de ectopósido-4'-fosfato e seus derivados como pró-medicamento e fosfatase alcalina imobilizada em anticorpo para a libertação do ectopósido, é uma desvantagem, em virtude da forte presença de fosfatases alcalinas endógenas no soro. Tal como descrito na DE Al-38 26 562, já se utiliza o ectopósido-4 '-fosfato sozinho como meio terapêutico antitumor, em que as fosfatases presentes no soro libertam o ectopósido do pró-medicamento. 2 A presente invenção é descrita pelas reivindicações e melhor explicada em seguida. 0 huTuMAk acoplado à L e β-Gluc e preparado por técnicas genéticas representa praticamente, com especial vantagem, um sistema autólogo. A actividade catalítica da β-gluc na proteína de fusão é significativamente maior a pH 7,4 (ou seja sob condições fisiológicas), do que a da enzima nativa, no caso de a proteína de fusão estar ligada na região-V no antigénio.
Verificou-se que uma modificação química da proteína de fusão, em especial uma oxidação parcial ou total da estrutura do hidrato de carbono, de preferência seguido de uma aminação reductora, conduz a um maior tempo de semi-vida. 0 tratamento enzimático da proteína de fusão de acordo com a invenção com fosfatase alcalina de, por exemplo, intestino de bovino ou de E. coli, não conduz, geralmente, a nenhum prolongamento significativo do tempo de semi-vida. A presente invenção refere-se à proteína de fusão de fórmula huTuMAK-L^-Gluc (I) em que huTuMAK representa um anticorpo monoclonal específico de tumor, humanizado ou humano ou um fragmento seu derivado, de preferência o MAK descrito na EP-A1-0 388 914.
De preferência, o fragmento de anticorpo huTuMAK contém o fragmento MAK humanizado com os genes de VL e VH de acordo com a tabela 3. 3
Tab. 3 431/26 VR hum 10 30 50 caactgcaggagagcggtccaggtcttgtgagacctagccagaccctgagcctgacctgc GlnLeuGlnGluSerGlyProGlyLeuValArgProSerGlnThrLeuSerLeuThrCys 70 90 110 accgtgtctggcttcaccatcagcagtggttatagctggcãctgggtgagacagccacct ThrValSerGlyPheThrlleSerSerGlyTyrSerTrpHisTrpValArgGlnProPro 130 150 170 ggacgaggtcttgagtggattggatacatacagtacagtggtatcactaactacaacccc GlyArgGlyLeuGluTrpIleGlyTyrlleGlnTyrSerGlylleThrAsnTyrAsnPro 190 210 230 tctctcaaaagtagagtgacaatgctggtagacaccagcaagaaccagttcagcctgaga SerLeuLysSerArgValThrMetLeuValAspThrSerLysAsnGlnPheSerLeuArg 250 270 290 ctcagcagcgtgacagccgccgacaccgcggtctattattgtgcaagagaagactatgat LeuSerSerValThrAlaAlaAspThrAlaValTyrTyrCysAlaArgGluAspTyrAsp 310 330 350 taccactggtacttcgatgtctggggtcaaggcagcctcgtcacagtctcctca TyrHisTrpTyrPheAspValTrpGlyGlnGlySerLeuValThrValSerSer 431/26 VK hum 10 30 50 ggtgtccactccgacatccagatgacccagagcccaagcagcctgagcgccagcgtgggt GlyValHisSerAspIleGlnMetThrGlnSerProSerSerLeuSerAlaSerValGly 70 90 110 gacagagtgaccatcacctgtagtaccagctcgagtgtaagttacatgcactggtaccag AspArgValThrlleThrCysSerThrSerSerSerValSerTyrMetHisTrpTyrGln 130 150 170 cagaagccaggtaaggctccaaagctgctgatctacagcacatccaacctggcttctggt GlnLysProGlyLysAtaProLysLeuLeuIleTyrSerThrSerAsnLeuAlaSerGly 190 210 230 gtgccaagcagattcagcggtagcggtagcggtaccgacttcaccttcaccatcagcagc ValProSerArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspPheThrPheThrlleSerSer 250 270 290 ctccagccagaggacatcgccacctactactgccatcagtggagtagttatcccacgttc LeuGlnProGluAspIleAlaThrTyrTyrCysHisGlnTrpSerSerTyrProThrPhe 310 330 ggccaagggaccaaggtggaaatcaaacgt GlyGlnGlyThrLysValGluIleLysArg 4
L designa um Linker peptídico e contém uma região "Hinge" (dobradiça) de uma imunoglobulina, a qual está ligada por uma sequência peptidica ao terminal-N da enzima madura. β-Gluc designa a sequência de aminoácidos completa da β-glucoronidase humana, ou o ADNc completo da construção genética correspondente (Oshima A. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84, (1987) 685-689). A construção adequada para a expressão da proteína de fusão de acordo com a invenção, apresenta nas regiões que codificam para o fragmento de anticorpo huTuMAK um exão CHi e pelo menos um exão-"hinge"; são especialmente preferidas as construções nas quais esta fracçâo provém de um gene-C de IgG3 humano. Para a expressão da proteína de fusão de acordo com a invenção, são adequadas as construções de acordo, por exemplo, com o exemplo (I), em que a cadeia leve correspondente do TuMAK humanizado é co-expressa e assim uma das propriedades de ligação originárias do TuMAK permite obter porções huTuMAK idênticas. A invenção refere-se exclusivamente a processos para a produção, por meio de técnicas genéticas, das proteínas de fusão referidas, sua purificação, bem como utilização como medicamento. As proteínas de fusão descritas podem ser utilizadas para a activação de pró-medicamentos em doenças de tumor.
Numa outra forma de concretização, as proteínas de fusão de acordo com a invenção são quimicamente modificadas, a fim de se obter um maior tempo de semi-via e assim uma melhor localização nos tumores. De preferência, as proteínas de fusão são tratadas com um meio de oxidação, por exemplo o periodato, que em geral conduz a uma cisão parcial, ou total, do anel de hidrato de carbono e assim a uma modificação da estrutura do - 5 - , I , · * Ί. r , hidrato de carbono. Esta modificação conduz em geral a uma maior semi-vida. Além disso, é vantajoso derivatizar os grupos aldeído existentes num segundo passo reaccional, por exemplo através de aminação reductora. A destruição parcial ou total dos grupos adeído conduz, em geral, a uma menor possibilidade de reacções secundárias com, por exemplo, proteínas do plasma. Assim, é vantajoso, que as proteínas de fusão de acordo com o invento sejam oxidadas, num primeiro passo reaccional, por exemplo com periodato, e que num segundo passo se proceda a uma aminação reductora, por exemplo com etanolamina e cianoborohidreto.
Os exemplos seguintes descrevem a síntese por meio de técnicas genéticas de uma proteína de fusão de acordo com a invenção, especialmente preferida, a sua derivatização, bem como a demonstração da capacidade funcional de ambos os parceiros da fusão.
Exemplo (A): 0 material de partida foi o plasmídeo pGEM4-HUGP13 (Fig. A). 0 pGEM4-HUGP13 contém um inserto de ADNc, que contém a sequência codificante completa da enzima β-glucoronidase humana (Oshima et al. a.a.O.). Todas as técnicas utilizadas foram retiradas de Maniatis et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor USA (1989).
Exemplo (B): 0 plasmídeo pGEM4-HUGPl3 foi cortado com as endonucleases de restrição Pstl e Sall e isolou-se o fragmento Pstl/Sall de 342 pb de comprimento, o qual transporta o local de restrição - 6 -
de NotI. 0 fragmento Pstl/Sall foi clonado no vector pTZ cortado com Pstl/Sall (Fig. B.l) e isolou-se o clone pTZpGlc350 (Fig. B.2. )
Exemplo (C): O clone de plasmideo pTZpGlc350 foi cortado com Pstl e o fragmento de ADN de cadeia dupla PGlc linker, que corresponde aos oligonucleótidos PGlc linker 1 e PGlc linker 2 (Tab.l) e possui extremidades Pstl coesivas, foi ligado no local de corte de Pstl, aberto.
Tab. 1 PGlc linker 1: 5' 3'
GCG GCG GCG GCG GTG CA pGlc linker 2: 5' 3’
CCG CCG CCG CCG CTG CA
Isolou-se o clone pTZPGlc370, no qual o fragmento de p-Glucoronidase é prolongado na sua extremidade 5' com o fragmento de ADN do PGlc linker e que perdeu o local de corte de Pstl anteriormente existente, obtendo assim na sua extremidade 5' um novo local de corte de Pstl. 7
Exemplo (D) 0 clone de plasmídeo pTZpGlc370 é cortado com Pst I e ligado com o fragmento Hinge-Linker correspondente aos oligonucleótidos-hinge 1 e 2b (Tab. 2), que possui duas extremidades Pst I coesivas. Assim, o local de corte de Pst I da extremidade 5' do fragmento PGlc370 é destruído. Isola-se o clone de plasmídeo pTZPGlc420, no qual o inserto PGlc é aumentado na extremidade 5' com o fragmento Hinge-Linker H (Fig. D)
Tab. 2
Hinge 1 oligo
5'GAG CCC AAA TCT TGT GAC ACA CCT CCC CCG TGC CCA 3' CGG TGC CCA GTT GCA Hinge 2b oligo 5'
ACT GGG CAC CGT GGG CAC GGG GGA GGT GTG TCA CAA 3' GAT TTG GGC TCT GCA Exemplo (E) 0 plasmídeo pTZPGlc420 é cortado com Pstl e Sall e isola-se o inserto de 420 pb. O plasmídeo IgG3c F(ab')2 2H (EP-A2-0 352 761, Fig. 3, ibidem) , que contém o exão CHi e dois exões Hinge de um gene-C de IgG3 humana, é cortado totalmente com 8
Sall e parcialmente com Pstl. O inserto de 420 pb isolado é ligado com este plasmideo cortado com Sall/Pstl (pare.) e isola-se o clone de plasmideo, que contém o exão CHi, um exão "Hinge" e o fragmento PGlc420, que transporta também entre o exão CHi e a β-Glucoronidase, a informação genética para dois exões "Hinge" (pCJC CHi + H + PGcl420) (Fig. E).
Exemplo (F) : O plasmideo pGEM-HUGP13pGlc é cortado com Sall e isola-se o fragmento Sall de 1750 pb do ADNc de β-glucoronidase. O fragmento Sall de 1750 pb isolado é ligado com o plasmideo pUC CHi + H + pGlc420 cortado com Sall. Isola-se o clone de plasmideo pUC CHi/pGluc o qual contém um gene de fusão de um exão CHi, um exão "Hinge" e um exão de fusão entre um exão Hinge e o ADNc da β-glucoronidase humana (Fig. F).
Exemplo (G): O vector de expressão pABstop (Fig. 1.1) é cortado com HindIII e Sall. O plasmideo pUC CHi + H + HuPGlc é cortado totalmente com HindIII e parcialmente com Sall e isola-se o inserto CHi + H + huPGlc. 0 inserto CHi· + H + huPGlc é ligado com o pABstop cortado com HindIII/Sall e isola-se o clone pBAstop CHi + H + huPglc (Fig. G).
Exemplo (H): O vector pBAstop, pBAstop BW 431/26 hum VH, que contém a versão humanizada do gene de VH do anti CEA MAK BW 431/26 (Bosslet K. et ai., Eur. J. Nucl. Med. 14, (1988) 523-528) 9 (sequência do gene VH e VK humanizado, veja-se Tab. 3) é cortado com HindIII e BamHI e isola-se o inserto, que contém o exão sinal e o exão VH. 0 clone de plasmideo pABstop.CHi + H + hupGlc é cortado com HindIII e ligado com o fragmento HindIII/BamHI 431/26 VH hum. Após 2h de ligação à temperatura ambiente, a ligação é interrompida por incubação durante 10' a 70°C, as extremidades ainda livres são preenchidas com polimerase Klenow e dNTPs. Em seguida, faz-se nova ligação durante a noite. Após transformação, isola-se, com o auxilio de mapas de restrição e análise da sequência de ácidos nucleicos, o clone PABstop 431/26 VH hum huPGlclH, que contém um gene de imunoglobulina F(ab')2 com um exão-"hinge", que está fundido com a fracção codificante da β-Glucoronidase humana (Fig. H) .
Exemplo (I): O clone pABstop 431/26 hum VH huPGlclH é transfectado em células BHK, juntamente com um clone plasmideo, que transporta a cadeia leve do BW 431/26 humanizado (Fig. I), e dois plasmideos, que transportam um gene de resistência à neomicina (Fig. K) , ou ao metotrexato (Fig. L) . É expressa uma proteina de fusão que possui tanto as propriedades de ligação ao antigénio de MAK BW 431/26 hum, como também a actividade enzimática da β-Glucoronidase humana.
Exemplo J:
Demonstração das propriedades de ligação ao antigénio e da actividade enzimática da proteina de fusão 431/26 hum VH huPglc A capacidade da proteína de fusão 431/25 hum VH hupGlc 1H se ligar de forma específica ao epítopo definido por 431/26 de CEA ("carcinoembryonic antigen") e simultaneamente exercer a actividade enzimática da β-Glucoronidase humana, é determinada por meio de um teste da especificidade-actividade enzimática. Este teste é realizado como a seguir descrito: - Incubam-se placas de microtítulo de poliestirol (96 poços) (forma -U, tipo B, Fa. Nunc, No Ref. 4-60445) com CEA purificado (1-5 μρ CEA/ml, e destes 75 μΐ/poço) ou com GIT-mucino (a mesma quantidade que para CEA), durante a noite, à temperatura ambiente. - O antigénio não adsorvido é aspirado e lavado 3x com tampão Tris-citrato 0,05 M, pH 7,4. - As placas de microtítulo são deixadas em repouso durante a noite à temperatura ambiente, com a abertura voltada para baixo sobre celulose. - As placas de microtítulo são incubadas durante 30 minutos a 20°C com 250 μΐ de solução de caseína a 1% em PBS, pH 7,2/poço (solução bloqueadora).
Durante o bloqueamento, adiciona-se o substrato. A quantidade de substrato é baseada no número de sobrenadantes a ser testados. O substrato é utilizado de fresco para cada teste.
Substrato: 4-metilumbeliferil β-D-glucorónido (No de Ref: M-9130 da Fa. Sigma), 2,5 mM em tampão acetato de sódio 200 m, pH 5,0 com BSA 0,01% 11 - A solução bloqueadora é aspirada e adiciona-se cada 50 μΐ de sobrenadante celular de BHK, que contém a proteína de fusão, à placa de microtítulo revestida com CEA- ou GIT-mucino (o volume de amostra necessário é no mínimo 120 μΐ)
Em seguida incuba-se à temperatura ambiente durante 30 minutos.
As placas são lavadas 3x com tampão de lavagem ELISA (Behring, OSEW 96). - O substrato é adicionado (50 μΐ/poço) e incubado durante 2 horas a 37°C. Para evitar uma possível diluição, as placas são cobertas. - Após 2 horas, pipetam-se 150 μΐ de solução stop/poço (solução stop = glicina 0,2 M + SDS a 0,2%, pH 11,7) . - A medição apenas pode ser realizada sob uma lâmpada CJV (energia de excitação 380 nm) ou num aparelho de medição de fluorescência (Fluoroscan II, ICN-Biomedicals, No Cat: 78-611- 00) .
Por meio deste teste de especificidade-actividade enzimática foi possível demonstrar que nos poços ("wells") cobertas com CEA existia 4-metil-umbeliferol fluorescente, quando a determinação da actividade enzimática era feita a pH 5, o pH catalítico óptimo (tab. 4). 12
Tabela 4:
Diluição do sobrenadante da cultura celular da proteína de fusão (B73/2) em CEA e GIT Mucina
Substrato em diferentes soluções
Meio de tampão acetato de Na diluição 0,2M + BSA a 0,01%, pH 5, em CEA
PBS, pH 7,2 em CEA PBS, pH 7,2 em GIT mucina
Concentrado 9118 2725 115,7 1:2 7678 2141 93,37 1: 4 4662 1195 73, 39 1:8 2927 618,5 60, 68 1:16 1657 332,1 53, 69 1:32 853 168,2 40, 44 1:64 425 99,26 48,21 1:128 192,5 57,89 47,48
Por determinação da taxa de conversão a pH 7,2 verificou-se que a proteína de fusão a este pH fisiológico ainda apresenta « 25% da taxa de conversão a pH 5. Nas placas de controlo negativo revestidas com GIT-Mucino e medidas a pH 5, não foi possível determinar nenhuma libertação significativa de metilumbeliferol. »
Esta constatação mostra que a região V humanizada da proteína de fusão 431/26 hum VHhuPGlc 1H manteve a sua especificidade para o epítopo e que a fracção de β-glucoronidase da proteína de fusão é capaz, de modo semelhante à enzima nativa humana, de cindir o β-glucorónido do 4-metilumbeliferol.
Exemplo K:
Demonstração da identidade funcional da região-V da proteína de fusão 431/26 hum νΗ1πιβΘ1σ 1H com a de MAK BW 431/26 humanizado e a de ΜΆΚ BW 431/26 de murídeo.
No exemplo J demonstrou-se que a proteína de fusão 431/26 hum VH ϊΐϋβΰΐο 1H possui um certo potencial de ligação ao CEA, bem como actividade de β-glucoronidase. 0 teste de competição específico de antigénios a seguir descrito, dá uma noção da identidade do epítopo-CEA, que é reconhecido pelas moléculas competidoras, quer através da força de interacção entre o epítopo-proteína de fusão, quer pela reacção epítopo- anticorpo.
Este teste é realizado do modo a seguir descrito: - Incubam-se placas de mícrotítulo de 96 poços, de poliestirol
(forma-U, Tipo B, Fa. Nunc, No. Ref: 4-60445) com CEA purificado (1-5 μq CEA/ml, e deste 75 μΐ/poço) , ou com GIT- mucino (a mesma quantidade que para CEA), durante a noite à temperatura ambiente. - O antigénio não adsorvido é aspirado e lavado 3x com tampão Tris-citrato 0,05 M, pH 7,4. 14
- As placas de microtitulo são deixadas em repouso durante a noite à temperatura ambiente, com a abertura voltada para baixo sobre celulose. - As placas de microtitulo são incubadas durante 30 minutos à temperatura ambiente com 250 μΐ de solução de caseína a 1% em PBS, pH 7,2/poço (solução bloqueadora). - Misturam-se 50 μΐ de MAK BW 431/26 numa concentração de 5 ng/ml com 50 μΐ de sobrenadante 10 vezes concentrado de MAk BW 431/26 humanizado ou da proteína de fusão, bem como 2x diluições em série. - Destas misturas, pipetam-se alíquotas de 50 μΐ nos poços de placas de microtitulo revestidos com CEA ou GIT-mucino. - As placas de microtitulo são incubadas durante 30 minutos à temperatura ambiente. - Em seguida, as placas são lavadas 3x com tampão de lavagem ELISA (Fa. Behringwerke AG, No Ref OSEW 96, 250 μΐ). - Em seguida, adicionam-se 50 μΐ de um anticorpo Ig de cabra anti-rato diluído 1:250, o qual está acoplado a fosfatase alcalina (Southern Biotechnology Associates, No. Ref: 1010- 04) .
Após 30 minutos de incubação à temperatura ambiente e lavagem 3 vezes, a reacção do substrato é realizada como se segue: 15 * ϊ ‘ι - adicionar 30 μΐ por poço de NADP 0,1 M (7,65 mg dissolvidos em 100 ml de Tris 20 mM; MgSO^ 0,1 mM, pH 9,5); a solução pode ser armazenada a -20 °C durante alguns meses. - incubar 30 minutos à temperatura ambiente. durante a incubação com NADP adicionar o sistema de amplificação: (5 ml por placa) 2 vezes INT (dissolver 2,5 mg/ml com etanol a 30% em banho de ultra-sons; adicionar sempre de fresco) + 1 vez PBS, pH 7,2 + 1 vez Diaforase (1 mg/ml PBS, pH 7,2) + 1 vez ADH (0,5 mg/ml PBS, pH 7,2) - adicionar 50 μΐ do sistema de amplificação - ao atingir a intensidade de reacção pretendida, parar a reacção com H2S04 0,1 N , 100 μΐ por poço - medir a 4 92 nm num TITERTEK® MULTISCAN (branco = 50 μΐ NADP + 50 μΐ de solução de amplificação + 100 μΐ H2SC>4 0,1) NADP - Sigma, No. Ref N-0505 INT - Sigma, No. Ref. 1-8377 ADH - Sigma, No. Ref. A-3263 Diaforase - Sigma, No. Ref. D-3281
Neste teste de competição especifico de antigénio, a redução da extinção significa uma competição das moléculas que competem umas com as outras para o mesmo epítopo, ou para epitopos que estejam localizados muito próximos, espacialmente. 16
Os dados de inibição obtidos mostram que tanto a proteína de fusão 431/26hum VHhuPGluc 1H como também o MAK 431/26 humanizado bloqueiam a ligação do MAK BW 431/26 de murídeo ao seu epítopo de CEA. Consegue-se uma inibição de 50% com um excesso de 200 molar dos respectivos competidores. Daqui resulta que a avidez das proteínas de fusão para o epítopo-CEA é comparável à do MAK 431/26 humanizado. Além disso, a proteína de fusão e o MAK humanizado ligam-se ao mesmo epítopo ou a um epítopo que fica muito próximo, espacialmente, do epítopo definido em CEA pelo MAK BW 431/26 de murídeo.
Exemplo L:
Demonstração da especificidade tecidular da proteína de fusão 431/26hum VHhuPGlc 2H
No exemplo J, demonstrou-se, entre outras coisas, que a proteína de fusão 431/26hum VHhuPGlc 1H se pode ligar a um CEA purificado.
No exemplo K demonstrou-se que a regiâo-V da proteína de fusão é capaz de competir com o BW 431/26 de murídeo pelo mesmo epítopo, ou por um epítopo localizado muito próximo. Com o auxílio de testes imunohistoquímicos específicos, indirectos, para a β-Glucoronidase, a seguir descritos, pode-se averiguar a especificidade fina para tecidos criopreservados. 0 teste é descrito a seguir: - Penduram-se cortes congelados de 6 μπι de espessura no suporte de objectos e secam-se ao ar durante pelo menos 30 minutos. 17 - Em seguida, os suportes de objectos são fixados em acetona fria a -20°C durante 10 seg. - Os suportes de objectos são lavados durante 5 minutos com tampão de lavagem Tris/NaCl, pH 7,4 com BSA 0,1%.
Adicionam-se 20-100 μΐ de sobrenadante celular de BHK (concentrado ou diluído em Tris/BSA, pH 7,4) contendo proteína de fusão, por corte e incuba-se numa câmara húmida durante 30 minutos. - Os suportes de objectos são lavados durante 5 minutos em tampão de lavagem Tris-/NaCl, pH 7,4 com BSA a 0,1%. - Adicionam-se, por corte, 50 μΐ de sobrenadante de hibridoma de MAK BW 2118/157 anti-p-Glucoronidase de murídeo e incuba-se o suporte de objectos durante 30 minutos numa câmara húmida, à temperatura ambiente. - Em seguida, os suportes de objectos são lavado durante 5 minutos em tampão de lavagem Tris/NaCl, pH 7,4 com BSA a 0,1%. - Adicionam-se 20-100 μΐ de Brucken-AK (IgG de cão anti-ratinho diluído 1:100 em soro humano, pH 7,4), por corte, e incuba-se durante 30 minutos numa câmara húmida à temperatura ambiente. - Em seguida, os suportes de objectos são lavados durante 5 minutos em tampão de lavagem Tris/NaCl, pH 7,4 com BSA a 0,1% - Em seguida, adicionam-se 20-100 μΐ de complexo-APAAP (anti AP de ratinho diluído 1:100 em Tris/BSA, pH 7,4), por corte, e 18
incuba-se durante 30 minutos numa câmara húmida, à temperatura ambiente. - Em seguida os suportes de objectos são lavados durante 5 minutos em tampão de lavagem Tris/NaCl, pH 7,4 com BSA a 0,1%. - O substrato da fosfatase alcalina é adicionado como se segue (100 ml de solução de substrato, suficiente para uma cuvete de vidro):
Solução 1: 3,7 g NaCl 2,7 g Tris/Base dissolver em 75 ml de água dest. +26,8 ml de tampão propanodiol, pH 9,75, acertar com HC1 +42,9 mg Levamisol => solução clara, sem cor
Solução 2: 21,4 mg nitrito de sódio dissolver em 535 μΐ de água dest => solução clara, sem cor
Solução 3: 53,5 mg naftol-AS-bifosfasto, dissolver em 642 μΐ de dimetilformamida (DMF) => solução clara, amarelada - Adicionar 368 μΐ de solução de neofucsnia a 5% à solução 2 (nitrito de sódio) e deixar reagir durante 1 minuto (cronómetro), de modo a resultar uma solução clara, castanha. - Adicionar a solução 2 (nitrito de sódio com neofucsina) e a solução 3 (naftol-AS-bifosfato) à solução 1 (tampão Tris/NaCl/Propanodiol) => solução clara, amarelada. 19 - acertar para pH 8,8 com HCl => solução turva, amarelada - Filtrar a solução e adicionar aos suportes de objectos e deixar reagir durante 15 minutos num agitador => a solução fica turva. - Lavar os suportes de objectos em tampão Tris/NaCl, pH 7,4 - Lavar os suportes de objectos durante 10 minutos em água dest. - Após 2 horas de secagem ao ar, os suportes de objectiva são cobertos com glicerina-gelatina de Kaiser a 56 °C. A ligação especifica da proteína de fusão foi demonstrada por microscopia óptica através da coloração vermelha dos cortes de tecido positivos para o epítopo. Uma pesquisa semelhante com o MAK BW 431/26 de murideo, que foi demonstrado por meio da técnica-APAAP indirecta (Cordell et al., J. Histochem. Cytochem., 32, 219, 1984), teve como resultado que a especificidade da proteína de fusão para o tecido é perfeitamente concordante com a do MAK BW 431/26 de murideo, isto é, que tanto o tipo de reacção em preparados individuais, como a quantidade de resultados positivos e negativos é idêntica numa grande variedade de carcinomas e tecidos normais.
Exemplo M:
Purificação da proteína de fusão 431/26hum VjjhuPGlc
Pode-se purificar o MAK de murideo ou humanizado por meio de processos cromatográficos de imunoafinidade, que são 20
selectivos para a fracção Fc desta molécula. No caso de não existir nenhuma fracção Fc na proteína de fusão 431/26hum VfthuP
Glc, dever-se-á desenvolver um método cromatográfico por imunoafinidade alternativo, de especificidade elevada. Além da selectividade deste método a desenvolver, as condições de isolamento deverão ser bastante suaves, de modo a não danificar a β-Glucoronidase, extremamente lábil, com condições ácidas, bem como alcalinas. O princípio do método consiste em purificar a proteína de fusão a partir de sobrenadantes de células BHK transfectadas, por meio de um MAK anti-idiotipo contra a região-V humanizada. A produção deste MAK está descrita na literatura (Walter et al., Behring Inst. Mitt., 82, 182-192, 1988). Este MAK anti-idiotipo pode não só ser de murídeo, como também humanizado. 0 MAK está de preferência imobilizado numa fase sólida, de um modo que não danifique a sua região-V. Exemplos deste são conhecidos na literatura (Fleminger et al., Applied Biochem. Biotechnol., 23, 123-137, 1990; Horsfall et al., JIM 104, 43-49, 1987).
Apesar de o MAK anti-idiotipo imobilizado na fase sólida, por métodos conhecidos, se ligar à proteína de fusão purificada a partir de células BHK transfectadas de forma muito eficaz, por exemplo a pH 7, tem no entanto a propriedade surpreendente de não se ligar mais à proteína de fusão mesmo com um decréscimo do valor de pH de 2,5, para pH 5,5. A proteína de fusão é ainda capaz, por meio desta técnica suave de eluição pelo pH, de se ligar ao CEA, mesmo que esteja afectada na sua actividade enzimática (Métodos, veja-se exemplo J). 21
os valores de DO e unidades .isoladas após purificação, anti-idiotipo, imobilizados
Na Tabela 5. são apresentados de fluorogéneo (FU) das fracções com o auxíliio dos MAK BW 2064/34 em fase sólida.
Tabela 5
Cromatografia de afinidade anti-idiotipo
Fracções DO em % FU em % Valor de pH Evolução da cromatografia 1-5 1 0 7,2 pré-lavagem da coluna com PBS, pH 7,2 6-142 20 0 7,2 Recolha de amostras 143-162 1 0 7,2 Lavagem da coluna com PBS, pH 7,2 163 1 0 7,2 164 1 0 7,2 165 1 0 7,2 166 1 0 6, 8 167 2 10 6,1 168 5 20 5,7 169 16 40 5,6 170 23 80 5,5 171 26 100 5,4 Eluição com PBS, 172 24 80 5, 3 pH 4,2 173 19 60 5,2 174 14 40 5,2 175 10 30 5,1 176 8 25 5,1 177 6 20 5,1 178 3 10 5,0 179 2 5 5, 0 180 1 0 5,0 22
Fracção 1 = recolher a 6,6 min (a uma velocidade de bombagem de 18 ml/h) = 2ml
Os valores FU são dados como % dos valores mais elevados (fracção 171)
Através da medição de DO a 280 nm, mediu-se a eluição das proteínas de fusão como proteínas. Adicionalmente, avaliaram-se as fracções isoladas quanto à ligação específica em CEA e igualmente a actividade enzimática, num teste da especificidade da actividade enzimática (Exemplo J) . Os valores mostram que a ligação específica total e actividade enzimática estavam concentradas num pico (pico de eluição entre pH 5,0 e pH 5,6). Daqui resulta que o método descrito de cromatografia de afinidade anti-idiotipo representa uma técnica de purificação muito eficaz e selectiva para a proteína de fusão 431/26hum VHhuPGlc 1H.
Exemplo N:
Cromatografia gel da proteina de fusão O sobrenadante das células BHK que segregam a proteína de fusão 431/26hum VHhuPGlc 1H (B 70/6, B 74/2, B 72/72, B 73/2) foi recolhido, filtrado em condições estéreis e analisado por filtração gel analítica. Para isso, utilizou-se uma coluna TSK G3000 SW-XL (7,8 x 300 nm) equilibrada com tampão fosfato de sódio 0,1M, pH 6,7 + NaN3 0, 02%, recolheram-se 20 μΐ do sobrenadante e eluiu-se com um caudal de 0,6 ml/min. Iniciando com um tempo de eluição de 9 min (volume excluído 9,5 min), recolheram-se fracções (a cada 0,3 min) e testaram-se quanto à actividade de β-glucoronidase. 23
Assim, misturaram-se 25 μΐ de cada fracção com 75 μΐ de solução de substrato (4-metilumbeliferil-p-glucorónido 2,5 mM em 200 mM de tampão acetato de Na, pH 5, +0,1 mg/ml de BSA) e incubou-se a 37 °C durante 2 horas. Em seguida, bloqueou-se com 1,5 ml de Glicina 0,2M/solução de SDS a 0,2%, pH 11,7 e quantificou-se o marcador fluorescente libertado pela glucoronidase num fluorómetro Hitachi (a um comprimento de onda de excitação de 360 nm e a um comprimento de onda de emissão de 450 nm).
Resultado:
Todos as 4 construções apresentam um pico de actividade máxima único entre a fracção 4 e 6 (Tabela 6). 0 tempo de retenção correspondente é de 10,2 - 10,8 min. As proteínas de fusão activas como glucoronidase, existentes nos sobrenadantes, têm tempos de retenção que seguem a mesma ordem que os das construções anticorpo-p-glucoronidase preparados quimicamente (10,4 min). 0 tempo de retenção para a enzima livre é de 11,9, para o anticorpo livre, de 12,3 min. 24
Tabela β:
Filtração em gel de diferentes proteínas de fusão Incubação : 25 μΐ , 37 °C, 120 min Concentração da substância: 1, 875 mM; 0,1 mg/ml de BSA Fracçâo a cada 0 ,3 min; inicio a 9 min marcador libertado/ensaio (FU) Fracções B70/6 B74/2 B72/72 B73/2 1 11 17 15 15 2 22 35 44 38 3 125 97 873 1014 4 1072 196 2959 3994 5 1588 165 2206 3141 6 1532 120 1133 1760 7 941 103 581 926 8 710 69 376 723 9 500 108 302 626 10 371 123 316 613 11 320 107 263 472 12 254 91 210 456 13 224 57 146 357 14 190 65 134 332 15 171 52 83 294 16 167 44 99 243 17 100 38 73 217 18 129 34 55 179 19 75 45 48 155 20 66 41 36 129 21 118 22 93 23 78 24 61 25 24 26 51 25
Exemplo Ο:
Caracterização molecular da proteína de fusão 431/26 hum VHhupGlc 1H
No exemplo M as proteínas de fusão são purificadas por meio de cromatografia de afinidade anti-idiotipo. Faz-se a electroforese em SDS-PAGE a 10% sob condições não redutoras ou redutoras de alíquotas do pico de eluição a pH 5,5 e faz-se uma coloração imune "Westernblot", com o auxílio de MAK anti-idiotipo ou com MAK anti-p-glucoronidase (Towbin e Gordon (1979), Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76: 4350-4354).
Sob condições não redutoras foi possível identificar para a proteína de fusão 431/26hum VHhuPGlc 1H uma banda principal de « 125 kDa e uma banda de 250 kDa, que foram identificadas por "Westernblot" tanto de MAK anti-idiotipo como de MAK anti-β-glucoronidase. Sob condições redutoras foi possível distinguir uma coloração imune, quer através de MAK anti-idiotipo, quer através de MAK anti-p-glucoronidase. Na SDS-PAGE redutora foi possível identificar uma banda de 100 kDa e uma de 25 kDa. Estas moléculas analisadas sob condições desnaturantes existem, no entanto, sob condições nativas em filtração gel TSK G 3000 SW-XL como um produto molecular maior, que possui um peso molecular de « 250 kDa (Exemplo N) . Na Fig. M, apresentam-se representações esquemáticas da proteína de fusão 431/26h um VHhuPGlc 1H. A figura Mb mostra o monómero, o qual possui uma cadeia leve de ® 25 kDa e uma cadeia pesada de « 100 kDa. Sob condições desnaturantes, pode-se identificar este monómero e um dímero ligado por meio de pontes disulfuretos "inter heavy chain" (fig. Ma). Sob condições nativas, a proteína de fusão existe como um dímero 26
de « 250 kDa, com ou sem pontes disulfureto "inter heavy Chain" (Fig. Mc).
Exemplo P:
Modificação quimica da proteina de fusão A proteína de fusão purificada de acordo com o exemplo N (110 μg/ml) é ajustada para pH 4,5 e adiciona-se periodato de sódio (concentração final lmM). Após uma incubação de 1 hora à temperatura ambiente no escuro, o periodato de sódio é removido por meio de cromatograf ia em gel e a proteína de fusão é reajustada para pH 8. Após adição de etanolamina até uma concentração final de 0,1M incuba-se por mais 3 horas a pH 4°G e adiciona-se cianoborohidreto de sódio (concentração final de 5 mM) e incuba-se durante 30 minutos (redução) . Logo a seguir faz-se nova filtração em gel para a remoção dos meios redutores e para re-tamponar a proteína de fusão. A modificação química não teve qualquer efeito na actividade funcional da proteína de fusão. A tabela 7 mostra a evolução da concentração plasmática de proteína de fusão não modificada e modificada no ratinho "nú". A eliminação da proteína de fusão pelo plasma é bastante retardada pela modificação. 27
Tabela 7
Nivel plasmático de actividade de β-glucoronidase no ratinho "nú" t [min] β-glucoronidase-proteína de fusão tratada não tratada % de actividade % de actividade 0 100 100 10 54 30 76 60 22 240 40 4 480 1 1380 19 1440 1 5880 3
Exemplo Q
Tratamento enzimático da proteína de fusão
Incubam-se 53 μς de proteína de fusão (exemplo N) em Tris/HCl 0,01M, NaCl 0,15 M com uma unidade de fosfatase alcalina solúvel (E. coli), ou fosfatase alcalina imobilizada (intestino de bovino) 20 h à temperatura ambiente. A tabela 8 mostra a evolução da concentração plasmática de proteína de fusão tratada e não tratada no ratinho "nú". A eliminação não é afectada de forma significativa pelo tratamento da enzima. 28
Tabela 8 Nível plasmátíco da actividade de β-glucoronidase no ratinho "nú" proteína de fusão de β-glucoronidase
tratada com FA tratada com FA (intestino de (E. coli) t [min] não tratada [%] bovino, imobil.) [%] [%] 0 100 100 100 10 78 76 65 30 44 57 53 60 35 36 35 240 22 27 22 1440 4 5 5 FA = fosfatase alcalina Exemplo R:
Farmacocinética e retenção no tumor da proteína de fusão
431/26 hum VHh^Glc 1H A título de exemplo, injectaram-se i.v. 5x 4 μς de proteína de fusão purificada e misturada com 100 μg de HSA/ml na forma não modificada (Exemplo N) ou modificada quimicamente (Exemplo P) , a intervalos de 24 horas em ratinhos "nús" com tumor humano que expressa CEA. Após intervalos de tempo definidos, cada 3 animais são mortos por deslocamento 29 cervical. Removem-se os orgãos, pesam-se e adicionam-se 2 ml de BSA a 1% em PBS, pH 7,2. Em seguida, os tecidos e células destes orgãos são destruídos num Potter (10 voltas) e determina-se a quantidade de proteína de fusão activa no sobrenadante, após centrifugação da suspensão a 3000 rpm, à temperatura ambiente durante 10' (Labofuge GL, Tipo 2202 da Heraeus), num teste de especificidade de actividade enzimática (veja-se exemplo J) . Os dados de uma experiência representativa são apresentados na tabela 9. Pode-se reconhecer claramente que a proteína de fusão modificada quimicamente, que tem um tl/2p de * 4h, especificamente a partir de > 3 dias no final da fase de injecção repetitiva, concentra-se no tumor. A proteína de fusão não modificada, que possui um ί1/2β de « 20 min, não apresenta, nas mesmas condições experimentais, nenhuma concentração significativa no tumor. A partir destes dados, é de concluir que a proteína de fusão hu 431 β-gluc é capaz de se ligar a tumores positivos para CEA in vivo e aí permanecer, como molécula enzimaticamente activa durante intervalos de tempo longos (> 9 dias) . O ponto de tempo para a aplicação do pró-medicamento deverá ser, neste sistema, entre o dia 3 e 9 após a finalização da injecção de proteína de fusão 30 Λ
Tabela 9:
Experiências de retenção no tumor com enxertos de carcinoma do estômago humano positivo para CEA (Mz Sto 1)
Injecção i.v. de 5 x 4 μς de proteína de fusão por ratinho, em intervalos de 24 horas
Tempo (std.) desde a última % Actividade/g de tumor ou orgão icção i.v. Tumor Fígado Pulmão Baço Rim Intestino Plasma 3 100 100 100 100 100 100 100 24 86,7 49,3 26, 3 - 64 123 44,4 72 26,4 11 4,4 - 8,1 19 6,5 216 24,4 1,5 0,13 1,2 0,4 0,5 0,015
Exemplo S:
Focagem isoeléctrica da proteína de fusão 431/26hum VH hu PGlc 1H
Fez-se a focagem isoeléctrica da proteína de fusão purificada por meio de cromatografia de afinidade anti-idiotipo (Exemplo N) , num "Pharmacia Fast System", de acordo com o método de Righetti et al. (1979). Verificou-se que o ponto isoeléctrico da molécula está num intervalo de pH de 7,35 a 8,15. 31
Exemplo T:
Verificação da cindibilidade de um pró-medicamento citoestático através da proteína de fusão 431/26hum VH hu pGlc 1H
No exemplo J, mostrou-se que a fracção β-glucoronidase da proteína de fusão, de modo semelhante à enzima nativa humana, é capaz de separar o β-glucorónido do 4-metilumbeliferol. Nas experiências realizadas, a seguir descritas, utilizou-se como substracto para a cisão enzimática, um β-glucorónido ligado a um grupo espaçador do citoestático daunomicina. Em pormenor, estas experiências foram realizadas como se segue:
Dissolveram-se 4 mg do composto N-(4-hidroxi-3-nitro-benziloxicarbonil)-daunorubicina^-D-glucorónido (pró- medicamento) descrito no pedido de patente francês (No. d'Enregistrement National: 9105326), em 1 ml de tampão fosfato 20 mM, pH 7,2. Em cada 5 μΐ desta solução de substrato, pipetaram-se 35 μΐ de proteína de fusão (exemplo N) ou de β-glucoronidase humana (concentração total cada 6,5 U/ml; 1 U = cisão de 1 μΜοΙ de 4-metilumbeliferol/min a 37°C) e incubou-se a 37°C, no escuro. Após diferentes tempos, recolheram-se amostras (5 μΐ) do meio de incubação e estas foram analisadas directamente por meio de cromatografia líquida de alta pressão, nas seguintes condições: coluna:
Nucleosil 100 RP 18, diâmetro de partícula de 5 ura, 125 x 4,6 mm 32
Fase móvel:
Gradiente da solução A (100% deacetonitri.lo) e solução B (Tampão fosfato 20 mM pH 3,0) 0 min: Solução A a 30% 15 min: solução A a 70% 20 min: solução A a 70%
Caudal: lml/min
Detecção: Fluorescência, Excitação a 495 nm, emissão a 560 nm Análise de dados: Beckman System Gold Software 0 tempo de retenção do composto de partida (pró-medicamento) , nestas condições cromatográficas é de 11 min. O composto resultantes da incubação (medicamento) apresenta um tempo de retenção de 8,9 min, idêntico ao da daunomicina (DNM, Análise de um padrão em condições idênticas). As cinéticas da cisão do composto de partida através da proteína de fusão ou de β-glucoronidase humana são apresentadas na tabela 10. 0 tempo de semi-vida da cisão do pró-medicamento por meio da proteína de fusão é de 2,3 h. A cisão por meio da β-glucoronidase humana tem um tempo de semi-vida de 0,8 h. Tal como apresentado no exemplo J, os resultados das experiências mostram que a fracção de β-glucoronidase da proteína de fusão está funcionalmente activa e é capaz de cindir o β-glucorónido. A cinética da cisão da fracção de glucorónido ou a libertação do medicamento (daunomicina) do pró-medicamento utilizado é realizada com uma velocidade de ordem de grandeza comparável à da β-glucoronidase humana, de modo que a especificidade da proteína de fusão para o substrato é essencialmente 33 concordante com a da β-glucoronidase humana. Tabela 10: da β
Cinética da cisão do pró-medicamento por meio glucoronidase t pró-medicamento DNM min área % área 0. Ό 0 99,2 0,8 57 36, 0 64,0 130 10,3 89,7 227 9,3 90,7 Tabela 11: Cinética da cisão do pró-medicamento por glucoronidase (proteína de fusão) t pró-medicamento DNM min área % área o, o 0 98,9 1,1 50 81,1 18,9 135 51,7 48,3 190 33,0 67,0 247 22,0 78,0 317 12,4 87, 6 Lisboa, 26 de Julho de 2000 ÍAGEN lf^FICIAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL, L. da β 34

Claims (14)

  1. REIVINDICAÇÕES 1. Proteína de fusão para a activação de um pró-medicamento de fórmula huTuMAK-L-p-Gluc, em que o HuTuMAK significa num anticorpo monoclonal específico de tumor, humanizado, ou um fragmento seu derivado ligado ao tumor o qual consiste de porções das cadeias pesada, que estão associadas com as cadeias leves dos anticorpos, L é um péptido-"linker" e β-Gluc é a β-glucoronidase humana.
  2. 2. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 1, em que o fragmento de anticorpo huTuMAK se compõe de regiões que são codificadas por um exão VH, bem como por um Exão CHi e o péptido -"linker" L contém uma região que é codificada por um Exão-"hinge".
  3. 3. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o fragmento de anticorpo huTuMAK se compõe de regiões que são codificadas por um exão VH, um exão CHi e um exão-"hinge".
  4. 4. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o fragmento de anticorpo se compõe de regiões de huTuMAK, que são codificadas por um exão VH, um exão CHx e dois exões-"hinge".
  5. 5. Proteína de fusão de acordo com uma das reivindicações 1 a 4 em que o fragmento de anticorpo huTuMAK se compõe de sequências de aminoácidos de acordo com a tabela 3. 1
  6. 6. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 1 a 5, em que L significa um péptido-"linker", que é codificado por um ADN de acordo com a Tab 1 e/ou Tab. 2.
  7. 7. Proteína de fusão de acordo com uma das reivindicações 1 a 6, que contém 1, 2 ou 3 regiões-"hinge" de um gene C de IgG3 humana.
  8. 8. Plasmídeo que contém um ADNc que codifica para uma proteína de fusão de acordo com uma das reivindicações 1 a 7.
  9. 9. Célula eucariótica transformada, que é transformada com um plasmídeo de acordo com a reivindicação 8.
  10. 10. Processo para a preparação de uma proteína de fusão de acordo com uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado por a proteína de fusão ser expressa numa célula transformada por meio de um plasmídeo e por o isolamento desta proteína de fusão ser realizado com anticorpos monoclonais antiidiotipo.
  11. 11. Proteína de fusão obtida por expressão de uma proteína de fusão de acordo com uma das reivindicações 1 a 7 numa célula eucariótica transformada de acordo com a reivindicação 9 e, em seguida, por tratamento da proteína de fusão com um meio oxidativo.
  12. 12. Proteína de fusão, obtida por aminação redutora de uma proteína de fusão de acordo com a reivindicação 11.
  13. 13. Proteína de fusão de acordo com uma das reivindicações 1 a 7, e 11 a 12, para utilização como medicamento. 2
  14. 14. Utilização de uma proteína de fusão de acordo com a reivindicação 1 a 7 e 11 a 12, para a preparação de um medicamento, que é adequado para a activação de pró-medicamentos, em doenças tumorais. Lisboa, 26 de Julho de 2000 Ψ AGENTE OFICIAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL
    3
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