JPH07179500A - プロドラッグ活性化のための融合タンパク質、その製造および使用 - Google Patents
プロドラッグ活性化のための融合タンパク質、その製造および使用Info
- Publication number
- JPH07179500A JPH07179500A JP4078644A JP7864492A JPH07179500A JP H07179500 A JPH07179500 A JP H07179500A JP 4078644 A JP4078644 A JP 4078644A JP 7864492 A JP7864492 A JP 7864492A JP H07179500 A JPH07179500 A JP H07179500A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- fusion protein
- protein according
- human
- exon
- hutumab
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
- B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
- A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6891—Pre-targeting systems involving an antibody for targeting specific cells
- A61K47/6899—Antibody-Directed Enzyme Prodrug Therapy [ADEPT]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01031—Beta-glucuronidase (3.2.1.31)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Nanotechnology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medical Informatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 プロドラッグ活性化のための融合タンパク質
を提供する。 【構成】 一般式ｈｕＴｕＭＡｂ−Ｌ−β−Ｇｌｕｃ
（式中、ｈｕＴｕＭＡｂは人体に適合させたまたはヒト
腫瘍特異的単クローン性抗体またはそのフラグメントで
あり、Ｌはリンカーであり、β−Ｇｌｕｃはヒトβ−グ
ルクロニダーゼである）のプロドラッグ活性化のための
融合タンパク質。これらの融合タンパク質は、遺伝子操
作によって製造される。ｈｕＴｕＭＡｂによって、腫瘍
の特異的局在化が確実となり、Ｌは２つの融合パートナ
ーの特異的特性が損なわれないようなやり方でｈｕＴｕ
ＭＡｂをβ−Ｇｌｕｃに結合させ、β−Ｇｌｕｃはグル
クロン酸を除去することによって好適なプロドラッグ化
合物を活性化して、ヒトに用いるための実質的に自己由
来の系を人体に適合させたまたはヒトの融合パートナー
によって提供する。
を提供する。 【構成】 一般式ｈｕＴｕＭＡｂ−Ｌ−β−Ｇｌｕｃ
（式中、ｈｕＴｕＭＡｂは人体に適合させたまたはヒト
腫瘍特異的単クローン性抗体またはそのフラグメントで
あり、Ｌはリンカーであり、β−Ｇｌｕｃはヒトβ−グ
ルクロニダーゼである）のプロドラッグ活性化のための
融合タンパク質。これらの融合タンパク質は、遺伝子操
作によって製造される。ｈｕＴｕＭＡｂによって、腫瘍
の特異的局在化が確実となり、Ｌは２つの融合パートナ
ーの特異的特性が損なわれないようなやり方でｈｕＴｕ
ＭＡｂをβ−Ｇｌｕｃに結合させ、β−Ｇｌｕｃはグル
クロン酸を除去することによって好適なプロドラッグ化
合物を活性化して、ヒトに用いるための実質的に自己由
来の系を人体に適合させたまたはヒトの融合パートナー
によって提供する。
Description
【０００１】本発明は、一般式ｈｕＴｕＭＡｂ−Ｌ−β
−Ｇｌｕｃ（式中、ｈｕＴｕＭＡｂは人体に適合させた
またはヒト腫瘍特異的単クローン性抗体、そのフラグメ
ントまたは誘導体であり、Ｌはリンカーであり、β−Ｇ
ｌｕｃはヒトβ−グルクロニダーゼを含む）のプロドラ
ッグ活性化のための融合タンパク質に関する。これらの
融合タンパク質は、遺伝子操作によって製造される。ｈ
ｕＴｕＭＡｂによって、腫瘍の特異的局在化が確実とな
り、Ｌは２つの融合パートナーの特異的特性が損なわれ
ないようなやり方でｈｕＴｕＭＡｂをβ−Ｇｌｕｃに結
合させ、β−Ｇｌｕｃはグルクロン酸を除去することに
よって好適なプロドラッグ化合物を活性化して、ヒトに
用いるための実質的に自己由来の系は人体に適合させた
またはヒトの融合パートナーによって提供される。
−Ｇｌｕｃ（式中、ｈｕＴｕＭＡｂは人体に適合させた
またはヒト腫瘍特異的単クローン性抗体、そのフラグメ
ントまたは誘導体であり、Ｌはリンカーであり、β−Ｇ
ｌｕｃはヒトβ−グルクロニダーゼを含む）のプロドラ
ッグ活性化のための融合タンパク質に関する。これらの
融合タンパク質は、遺伝子操作によって製造される。ｈ
ｕＴｕＭＡｂによって、腫瘍の特異的局在化が確実とな
り、Ｌは２つの融合パートナーの特異的特性が損なわれ
ないようなやり方でｈｕＴｕＭＡｂをβ−Ｇｌｕｃに結
合させ、β−Ｇｌｕｃはグルクロン酸を除去することに
よって好適なプロドラッグ化合物を活性化して、ヒトに
用いるための実質的に自己由来の系は人体に適合させた
またはヒトの融合パートナーによって提供される。
【０００２】治療剤として用いられるプロドラッグ(pro
drug) と腫瘍特異的な抗体−酵素複合体との組み合わせ
は、専門家の文献に記載されている。これは、特定の組
織に向けられており且つプロドラッグ開裂酵素が共有結
合する抗体を、移植組織を有する動物に注射した後、酵
素によって活性化することができるプロドラッグ化合物
を投与する必要があった。組織に固定されている抗体−
酵素複合体の作用によって、プロドラッグ化合物が細胞
毒素に変換され、これが移植組織に細胞毒性作用を及ぼ
すのである。
drug) と腫瘍特異的な抗体−酵素複合体との組み合わせ
は、専門家の文献に記載されている。これは、特定の組
織に向けられており且つプロドラッグ開裂酵素が共有結
合する抗体を、移植組織を有する動物に注射した後、酵
素によって活性化することができるプロドラッグ化合物
を投与する必要があった。組織に固定されている抗体−
酵素複合体の作用によって、プロドラッグ化合物が細胞
毒素に変換され、これが移植組織に細胞毒性作用を及ぼ
すのである。
【０００３】ＷＯ８８／０７３７８号明細書には、２つ
の成分を含み且つ抗体−酵素成分を含んで成る治療系が
記載されている。この抗体−酵素複合体を製造するため
に非哺乳類の酵素を使用することがこの場合に記載され
ており、活性物質を非特異的に放出することにより、内
因性酵素の使用は除外される。外因性酵素は生体によっ
て異種抗原として認識されるので、これらの使用は非内
因性物質に対する免疫応答という不利益を伴い、これに
よって抗体に固定された酵素は不活性化され、全複合体
が除去されることがある。更に、この場合には、ｐ−ビ
ス−Ｎ−（２−クロロエチル）−アミノ−ベンジルグル
タミン酸およびその誘導体がプロドラッグとして用いら
れ、その化学的半減期は５．３〜１６．５時間にすぎな
い。プロドラッグ化合物が化学的に不安定であること
は、副作用が予想されるので不利な点である。
の成分を含み且つ抗体−酵素成分を含んで成る治療系が
記載されている。この抗体−酵素複合体を製造するため
に非哺乳類の酵素を使用することがこの場合に記載され
ており、活性物質を非特異的に放出することにより、内
因性酵素の使用は除外される。外因性酵素は生体によっ
て異種抗原として認識されるので、これらの使用は非内
因性物質に対する免疫応答という不利益を伴い、これに
よって抗体に固定された酵素は不活性化され、全複合体
が除去されることがある。更に、この場合には、ｐ−ビ
ス−Ｎ−（２−クロロエチル）−アミノ−ベンジルグル
タミン酸およびその誘導体がプロドラッグとして用いら
れ、その化学的半減期は５．３〜１６．５時間にすぎな
い。プロドラッグ化合物が化学的に不安定であること
は、副作用が予想されるので不利な点である。
【０００４】ヨーロッパ特許出願公開ＥＰ Ａ２−０
３０２ ４７３号明細書にも同様に、２つの成分を含む
治療系であって、腫瘍組織上に局在化されている抗体−
酵素複合体がプロドラッグ化合物を開裂して細胞毒作用
を有する物質を生成することが記載されている。特に、
この文献に記載されているプロドラッグとしてのエトポ
シド４′−ホスフェートおよびその誘導体と、エトポシ
ドを遊離させる抗体に固定されているアルカリ性ホスフ
ァターゼとを組み合わせて用いることは、血清中に内因
性のアルカリ性ホスファターゼが多量に含まれることに
なるので不利な点である。ＤＥ Ａ１−３８ ２６ ５
６２号明細書には、どのようにしてエトポシド４′−ホ
スファターゼだけが治療用の抗腫瘍剤として血清中に含
まれるホスファターゼと共に用いられて、プロドラッグ
からエトポシドを遊離してきたかが説明されている。
３０２ ４７３号明細書にも同様に、２つの成分を含む
治療系であって、腫瘍組織上に局在化されている抗体−
酵素複合体がプロドラッグ化合物を開裂して細胞毒作用
を有する物質を生成することが記載されている。特に、
この文献に記載されているプロドラッグとしてのエトポ
シド４′−ホスフェートおよびその誘導体と、エトポシ
ドを遊離させる抗体に固定されているアルカリ性ホスフ
ァターゼとを組み合わせて用いることは、血清中に内因
性のアルカリ性ホスファターゼが多量に含まれることに
なるので不利な点である。ＤＥ Ａ１−３８ ２６ ５
６２号明細書には、どのようにしてエトポシド４′−ホ
スファターゼだけが治療用の抗腫瘍剤として血清中に含
まれるホスファターゼと共に用いられて、プロドラッグ
からエトポシドを遊離してきたかが説明されている。
【０００５】Ｌを介してβ−Ｇｌｕｃに結合し遺伝子操
作により製造されるｈｕＴｕＭＡｂは、実質的に自己由
来であるため、特に有利な系であることを見出した。ま
た、ｐＨ７．４（すなわち、生理学的条件）で融合タン
パク質中のβ−Ｇｌｕｃの触媒活性は、融合タンパク質
がＶ領域を介して抗原に結合するときには本来の酵素の
活性よりもかなり高いことも見出した。更に、一つのヒ
ンジ領域のみを有する融合タンパク質（図１３および例
Ｏを参照されたい）は、生成する生成物のほとんどが一
つのバンド（この場合には、分子量１２５，０００を有
するもの）として生じ且つアフィニティクロマトグラフ
ィによって抗−イディオタイプＭＡｂまたは抗−グルク
ロニダーゼＭＡｂと共に容易に精製することができるの
で、遺伝子操作によって高収率で生成させることができ
る。
作により製造されるｈｕＴｕＭＡｂは、実質的に自己由
来であるため、特に有利な系であることを見出した。ま
た、ｐＨ７．４（すなわち、生理学的条件）で融合タン
パク質中のβ−Ｇｌｕｃの触媒活性は、融合タンパク質
がＶ領域を介して抗原に結合するときには本来の酵素の
活性よりもかなり高いことも見出した。更に、一つのヒ
ンジ領域のみを有する融合タンパク質（図１３および例
Ｏを参照されたい）は、生成する生成物のほとんどが一
つのバンド（この場合には、分子量１２５，０００を有
するもの）として生じ且つアフィニティクロマトグラフ
ィによって抗−イディオタイプＭＡｂまたは抗−グルク
ロニダーゼＭＡｂと共に容易に精製することができるの
で、遺伝子操作によって高収率で生成させることができ
る。
【０００６】更に、融合タンパク質の化学修飾、特に炭
水化物構造の部分または完全酸化に好ましくは続いて還
元的アミノ化を行うと、半減期が増加することも見出し
た。本発明による融合タンパク質をたとえばウシ腸また
は大腸菌由来のアルカリ性ホスファターゼでの酵素処理
では、通常は半減期は余り増加しなかった。
水化物構造の部分または完全酸化に好ましくは続いて還
元的アミノ化を行うと、半減期が増加することも見出し
た。本発明による融合タンパク質をたとえばウシ腸また
は大腸菌由来のアルカリ性ホスファターゼでの酵素処理
では、通常は半減期は余り増加しなかった。
【０００７】したがって、本発明は、式 ｈｕＴｕＭＡｂ−Ｌ−β−Ｇｌｕｃ (I) （式中、ｈｕＴｕＭＡｂは、人体に適合させたまたはヒ
ト腫瘍特異的単クローン性抗体またはそのフラグメント
或いはその誘導体であり、好ましくはＥＰ−Ａ１−０
３８８ ９１４号明細書に記載のＭＡｂを含んでいる。
本発明によるこれらの融合タンパク質は、好ましくは人
体に適合させたＭＡｂフラグメントを第３表（表１）に
示されるＶＬおよびＶＨ遺伝子と共に含んでいる。Ｌ
は、リンカーであり、好ましくは、成熟酵素のＮ−末端
にペプチド配列を介して結合している免疫グロブリンの
ヒンジ領域を含んでいる。β−Ｇｌｕｃは、ヒトβ−グ
ルクロニダーゼの完全アミノ酸配列であるか、または関
連の遺伝子構造における完全ｃＤＮＡである（オシマ・
エイ(Oshima A.) ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84,
(1987) 685-689 ）を有する融合タンパク質に関する。
ト腫瘍特異的単クローン性抗体またはそのフラグメント
或いはその誘導体であり、好ましくはＥＰ−Ａ１−０
３８８ ９１４号明細書に記載のＭＡｂを含んでいる。
本発明によるこれらの融合タンパク質は、好ましくは人
体に適合させたＭＡｂフラグメントを第３表（表１）に
示されるＶＬおよびＶＨ遺伝子と共に含んでいる。Ｌ
は、リンカーであり、好ましくは、成熟酵素のＮ−末端
にペプチド配列を介して結合している免疫グロブリンの
ヒンジ領域を含んでいる。β−Ｇｌｕｃは、ヒトβ−グ
ルクロニダーゼの完全アミノ酸配列であるか、または関
連の遺伝子構造における完全ｃＤＮＡである（オシマ・
エイ(Oshima A.) ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84,
(1987) 685-689 ）を有する融合タンパク質に関する。
【０００８】更に、抗体部分にＣＨ１エキソンとヒンジ
エキソンとを有する構造物が好ましく、これらの部分が
ヒトＩｇＧ３ Ｃ遺伝子に由来するものが特に好ましい
構造である。最も好ましいものは、例(I) に記載されて
いる構造であって、人体に適合させたＴｕＭＡｂの対応
する軽鎖を共発現させて、この方法で、結合特性が元の
ＴｕＭＡｂにできる限り類似しているｈｕＴｕＭＡｂ部
分を得るものである。最後に、本発明は、前記の融合タ
ンパク質の遺伝子操作による製造法、その精製およびそ
の医薬としての使用に関する。記載される融合タンパク
質は、腫瘍症におけるプロドラッグの活性化に用いるこ
とができる。
エキソンとを有する構造物が好ましく、これらの部分が
ヒトＩｇＧ３ Ｃ遺伝子に由来するものが特に好ましい
構造である。最も好ましいものは、例(I) に記載されて
いる構造であって、人体に適合させたＴｕＭＡｂの対応
する軽鎖を共発現させて、この方法で、結合特性が元の
ＴｕＭＡｂにできる限り類似しているｈｕＴｕＭＡｂ部
分を得るものである。最後に、本発明は、前記の融合タ
ンパク質の遺伝子操作による製造法、その精製およびそ
の医薬としての使用に関する。記載される融合タンパク
質は、腫瘍症におけるプロドラッグの活性化に用いるこ
とができる。
【０００９】もう一つの態様では、本発明による融合タ
ンパク質を化学的に修飾して、半減期を増加させ、これ
により腫瘍の局在化を向上させる。融合タンパク質は、
好ましくは酸化剤、例えば過ヨウ素酸塩のように通常は
炭水化物環を部分的または完全に開裂して炭水化物の構
造を変化させるもので処理する。この変化によって、一
般的には半減期が増加する。これは、第二の反応段階
で、存在するアルデヒド基を例えば還元的アミノ化によ
って誘導体形成させる上で有利である。アルデヒド基を
部分的または完全に破壊すると、一般的には還元におい
て例えば血漿タンパク質との可能な副反応を生じる。し
たがって、本発明による融合タンパク質は、第一の反応
段階において例えば過ヨウ素酸塩で酸化し、第二の反応
段階において例えばエタノールアミンおよびシアノボロ
ハイドライドで還元的にアミノ化するのが有利である。
ンパク質を化学的に修飾して、半減期を増加させ、これ
により腫瘍の局在化を向上させる。融合タンパク質は、
好ましくは酸化剤、例えば過ヨウ素酸塩のように通常は
炭水化物環を部分的または完全に開裂して炭水化物の構
造を変化させるもので処理する。この変化によって、一
般的には半減期が増加する。これは、第二の反応段階
で、存在するアルデヒド基を例えば還元的アミノ化によ
って誘導体形成させる上で有利である。アルデヒド基を
部分的または完全に破壊すると、一般的には還元におい
て例えば血漿タンパク質との可能な副反応を生じる。し
たがって、本発明による融合タンパク質は、第一の反応
段階において例えば過ヨウ素酸塩で酸化し、第二の反応
段階において例えばエタノールアミンおよびシアノボロ
ハイドライドで還元的にアミノ化するのが有利である。
【００１０】下記の例により、本発明による特に好まし
い融合タンパク質の遺伝子操作による合成、その誘導体
形成および２つの融合パートナーの機能する能力の例示
を記載する。
い融合タンパク質の遺伝子操作による合成、その誘導体
形成および２つの融合パートナーの機能する能力の例示
を記載する。
【００１１】
例（Ａ） 出発物質は、プラスミドｐＧＥＭ４−ＨＵＧＰ１３（図
１）であった。ｐＧＥＭ４−ＨＵＧＰ１３は、ヒトβ−
グルクロニダーゼ酵素のための完全なコード配列を含む
ｃＤＮＡ挿入物を有している（オシマ(Oshima)ら、上記
引用）。用いた総ての手法は、マニアティス(Maniatis)
ら、分子クローニング：実験室マニュアル(Molecular C
loning: A Laboratory Manual)、第２版、コールド・ス
プリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス(Cold Spri
ng Harbor LaboratoryPress) 、コールド・スプリング
・ハーバー、アメリカ合衆国（１９８９年）から引用し
た。
１）であった。ｐＧＥＭ４−ＨＵＧＰ１３は、ヒトβ−
グルクロニダーゼ酵素のための完全なコード配列を含む
ｃＤＮＡ挿入物を有している（オシマ(Oshima)ら、上記
引用）。用いた総ての手法は、マニアティス(Maniatis)
ら、分子クローニング：実験室マニュアル(Molecular C
loning: A Laboratory Manual)、第２版、コールド・ス
プリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス(Cold Spri
ng Harbor LaboratoryPress) 、コールド・スプリング
・ハーバー、アメリカ合衆国（１９８９年）から引用し
た。
【００１２】例（Ｂ） プラスミドｐＧＥＭ４−ＨＵＧＰ１３を制限エンドヌク
レアーゼＰｓｔＩ及びＳａｌＩで切断し、ＮｏｔＩ制限
開裂部位を有する３４２ｂｐの長さのＰｓｔＩ／Ｓａｌ
Ｉフラグメントを単離した。ＰｓｔＩ／ＳａｌＩフラグ
メントを、ＰｓｔＩ／ＳａｌＩで開裂したベクターｐＴ
Ｚ（図２）にクローニングして、クローンｐＴＺβＧｌ
ｃ３５０を単離した（図３）。
レアーゼＰｓｔＩ及びＳａｌＩで切断し、ＮｏｔＩ制限
開裂部位を有する３４２ｂｐの長さのＰｓｔＩ／Ｓａｌ
Ｉフラグメントを単離した。ＰｓｔＩ／ＳａｌＩフラグ
メントを、ＰｓｔＩ／ＳａｌＩで開裂したベクターｐＴ
Ｚ（図２）にクローニングして、クローンｐＴＺβＧｌ
ｃ３５０を単離した（図３）。
【００１３】例（Ｃ） プラスミドクローンｐＴＺβＧｌｃ３５０をＰｓｔＩで
開裂して、オリゴヌクレオチドβＧｌｃリンカー１とβ
Ｇｌｃリンカー２（第１表）から成り且つ粘着ＰｓｔＩ
末端を有する二本鎖ＤＮＡフラグメントβＧｌｃリンカ
ーを開環したＰｓｔＩ開裂部位に連結した。 第１表βＧｌｃリンカー１： ５′ ＧＣＧ ＧＣＧ ＧＣＧ ＧＣＧ ＧＴＧ ＣＡ３′ βＧｌｃリンカー２： ５′ ＣＣＧ ＣＣＧ ＣＣＧ ＣＣＧ ＣＴＧ ＣＡ３′ β−グルクロニダーゼフラグメントがオリゴヌクレオチ
ドＩによって５′末端に伸びており、以前は存在したＰ
ｓｔＩ開裂部位を喪失し、代わりに５′末端に新たなＰ
ｓｔＩ開裂部位を得たクローンｐＴＺβＧｌｃ３７０を
単離した（図４）。
開裂して、オリゴヌクレオチドβＧｌｃリンカー１とβ
Ｇｌｃリンカー２（第１表）から成り且つ粘着ＰｓｔＩ
末端を有する二本鎖ＤＮＡフラグメントβＧｌｃリンカ
ーを開環したＰｓｔＩ開裂部位に連結した。 第１表βＧｌｃリンカー１： ５′ ＧＣＧ ＧＣＧ ＧＣＧ ＧＣＧ ＧＴＧ ＣＡ３′ βＧｌｃリンカー２： ５′ ＣＣＧ ＣＣＧ ＣＣＧ ＣＣＧ ＣＴＧ ＣＡ３′ β−グルクロニダーゼフラグメントがオリゴヌクレオチ
ドＩによって５′末端に伸びており、以前は存在したＰ
ｓｔＩ開裂部位を喪失し、代わりに５′末端に新たなＰ
ｓｔＩ開裂部位を得たクローンｐＴＺβＧｌｃ３７０を
単離した（図４）。
【００１４】例（Ｄ） プラスミドクローンｐＴＺβＧｌｃ３７０をＰｓｔＩで
開裂し、ヒンジオリゴヌクレオチド１および２ｂから成
り且つ２つの粘着ＰｓｔＩ末端を有するヒンジ−リンカ
ーフラグメントに連結した（第２表）。これにより、破
壊されたβＧｌｃ３７０の５′末端にＰｓｔＩ開裂部位
を得た。βＧｌｃ挿入物がヒンジリンカーＨによって
５′末端に伸びているプラスミドクローンｐＴＺβＧｌ
ｃ４２０を単離した（図５）。 第２表ヒンジ１オリゴ： ５′ ＧＡＧ ＣＣＣ ＡＡＡ ＴＣＴ ＴＧＴ ＧＡＣ ＡＣＡ ＣＣＴ ＣＣＣ ＣＣＧ ＴＧＣ ＣＣＡ ＣＧＧ ＴＧＣ ＣＣＡ ＧＴＴ ＧＣＡ３′ ヒンジ２ｂオリゴ： ５′ ＡＣＴ ＧＧＧ ＣＡＣ ＣＧＴ ＧＧＧ ＣＡＣ ＧＧＧ ＧＧＡ ＧＧＴ ＧＴＧ ＴＣＡ ＣＡＡ ＧＡＴ ＴＴＧ ＧＧＣ ＴＣＴ ＧＣＡ３′
開裂し、ヒンジオリゴヌクレオチド１および２ｂから成
り且つ２つの粘着ＰｓｔＩ末端を有するヒンジ−リンカ
ーフラグメントに連結した（第２表）。これにより、破
壊されたβＧｌｃ３７０の５′末端にＰｓｔＩ開裂部位
を得た。βＧｌｃ挿入物がヒンジリンカーＨによって
５′末端に伸びているプラスミドクローンｐＴＺβＧｌ
ｃ４２０を単離した（図５）。 第２表ヒンジ１オリゴ： ５′ ＧＡＧ ＣＣＣ ＡＡＡ ＴＣＴ ＴＧＴ ＧＡＣ ＡＣＡ ＣＣＴ ＣＣＣ ＣＣＧ ＴＧＣ ＣＣＡ ＣＧＧ ＴＧＣ ＣＣＡ ＧＴＴ ＧＣＡ３′ ヒンジ２ｂオリゴ： ５′ ＡＣＴ ＧＧＧ ＣＡＣ ＣＧＴ ＧＧＧ ＣＡＣ ＧＧＧ ＧＧＡ ＧＧＴ ＧＴＧ ＴＣＡ ＣＡＡ ＧＡＴ ＴＴＧ ＧＧＣ ＴＣＴ ＧＣＡ３′
【００１５】例（Ｅ） プラスミドｐＴＺβＧｌｃ４２０をＰｓｔＩ及びＳａｌ
Ｉで開裂して、４２０ｂｐの挿入物を単離した。ヒトＩ
ｇＧ３ Ｃ遺伝子のＣＨ１エキソン及び２つのヒンジエ
キソンを含むプラスミドＩｇＧ３ｃ Ｆ（ａｂ′）２２
Ｈ（ＥＰ−Ａ２−０ ３５２ ７６１、図３、同上）を
ＳａｌＩで完全に開裂し、ＰｓｔＩで部分開裂した。単
離した４２０ｂｐの挿入物をこのＳａｌＩ／ＰｓｔＩで
（部分）開裂したプラスミドに連結し、ＣＨ１エキソ
ン、ヒンジエキソンおよびβＧｌｃ４２０フラグメント
を含む、すなわちＣＨ１エキソンとβ−グルクロニダー
ゼとの間に２つのヒンジエキソンの遺伝子情報を有する
プラスミドクローンを単離した（ｐＵＣ ＣＨ１＋Ｈ＋
βＧｌｃ４２０）（図６）。
Ｉで開裂して、４２０ｂｐの挿入物を単離した。ヒトＩ
ｇＧ３ Ｃ遺伝子のＣＨ１エキソン及び２つのヒンジエ
キソンを含むプラスミドＩｇＧ３ｃ Ｆ（ａｂ′）２２
Ｈ（ＥＰ−Ａ２−０ ３５２ ７６１、図３、同上）を
ＳａｌＩで完全に開裂し、ＰｓｔＩで部分開裂した。単
離した４２０ｂｐの挿入物をこのＳａｌＩ／ＰｓｔＩで
（部分）開裂したプラスミドに連結し、ＣＨ１エキソ
ン、ヒンジエキソンおよびβＧｌｃ４２０フラグメント
を含む、すなわちＣＨ１エキソンとβ−グルクロニダー
ゼとの間に２つのヒンジエキソンの遺伝子情報を有する
プラスミドクローンを単離した（ｐＵＣ ＣＨ１＋Ｈ＋
βＧｌｃ４２０）（図６）。
【００１６】例（Ｆ） プラスミドｐＧＥＭ４−ＨＵＧＰ１３βＧｌｃをＳａｌ
Ｉで開裂し、β−グルクロニダーゼからの１７５０ｂｐ
のＳａｌＩフラグメントを単離した。単離した１７５０
ｂｐのＳａｌＩフラグメントを、ＳａｌＩで開裂したプ
ラスミドｐＵＣＣＨ１＋Ｈ＋βＧｌｃ４２０に連結し
た。ヒンジエキソンとヒトβ−グルクロニダーゼｃＤＮ
Ａとの間にＣＨ１エキソン、ヒンジエキソン及び融合エ
キソンから成る融合遺伝子を含むプラスミドクローンｐ
ＵＣ ＣＨ１＋Ｈ＋ｈｕβＧｌｃを単離した（図７）。
Ｉで開裂し、β−グルクロニダーゼからの１７５０ｂｐ
のＳａｌＩフラグメントを単離した。単離した１７５０
ｂｐのＳａｌＩフラグメントを、ＳａｌＩで開裂したプ
ラスミドｐＵＣＣＨ１＋Ｈ＋βＧｌｃ４２０に連結し
た。ヒンジエキソンとヒトβ−グルクロニダーゼｃＤＮ
Ａとの間にＣＨ１エキソン、ヒンジエキソン及び融合エ
キソンから成る融合遺伝子を含むプラスミドクローンｐ
ＵＣ ＣＨ１＋Ｈ＋ｈｕβＧｌｃを単離した（図７）。
【００１７】例（Ｇ） 発現ベクターｐＡＢｓｔｏｐ（図１０）を、ＨｉｎｄＩ
ＩＩおよびＳａｌＩで開裂した。プラスミドｐＵＣ Ｃ
Ｈ１＋Ｈ＋ｈｕβＧｌｃをＨｉｎｄＩＩＩで完全に開裂
し、ＳａｌＩで部分開裂し、ＣＨ１＋Ｈ＋ｈｕβＧｌｃ
挿入物を単離した。ＣＨ１＋Ｈ＋ｈｕβＧｌｃ挿入物
を、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｌＩで開裂したｐＡＢｓｔｏ
ｐに連結し、クローンｐＡＢｓｔｏｐＣＨ１＋Ｈ＋ｈｕ
βＧｌｃを単離した（図８）。
ＩＩおよびＳａｌＩで開裂した。プラスミドｐＵＣ Ｃ
Ｈ１＋Ｈ＋ｈｕβＧｌｃをＨｉｎｄＩＩＩで完全に開裂
し、ＳａｌＩで部分開裂し、ＣＨ１＋Ｈ＋ｈｕβＧｌｃ
挿入物を単離した。ＣＨ１＋Ｈ＋ｈｕβＧｌｃ挿入物
を、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｌＩで開裂したｐＡＢｓｔｏ
ｐに連結し、クローンｐＡＢｓｔｏｐＣＨ１＋Ｈ＋ｈｕ
βＧｌｃを単離した（図８）。
【００１８】例（Ｈ） 抗−ＣＥＡ ＭＡｂ ＢＷ ４３１／２６のＶＨ遺伝子
の人体に適合させたものを含むｐＡＢｓｔｏｐベクター
ｐＡＢｓｔｏｐ ＢＷ ４３１／２６ ｈｕｍＶＨ（ボ
スレット・ケイ(Bosslet K.)ら、Eur. J. Nucl. Med. 1
4, (1988) 523-528 ）（人体に適合させたＶＨ及びＶＫ
遺伝子の配列に就いては第３表（表１）を参照された
い）をＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩで開裂し、シグナル
エキソン及びＶＨエキソンを含む挿入物を単離した。プ
ラスミドクローンｐＡＢＳｔｏｐＣＨ１＋Ｈ＋ｈｕβＧ
ｌｃをＨｉｎｄＩＩＩで開裂し、ＨｉｎｄＩＩＩ／Ｂａ
ｍＨＩ ４３１／２６ ｈｕｍ ＶＨフラグメントに連
結させた。室温で２時間連結させた後、７０℃で１０分
間インキュベーションすることによって連結を停止し、
遊離のままの末端をクレノウポリメラーゼ及びｄＮＴＰ
で充填した。次いで、連結を更に一晩行った。形質転換
の後、免疫グロブリンＦ（ａｂ′）２遺伝子を、ヒトβ
−グルクロニダーゼのコード領域に融合しているヒンジ
エキソンと共に含むクローンｐＡＢＳｔｏｐ ４３１／
２６ ｈｕｍ ＶＨ ｈｕβＧｌｃ１Ｈを制限マッピン
グ及び核酸配列分析の助けによって単離した（図９）。
の人体に適合させたものを含むｐＡＢｓｔｏｐベクター
ｐＡＢｓｔｏｐ ＢＷ ４３１／２６ ｈｕｍＶＨ（ボ
スレット・ケイ(Bosslet K.)ら、Eur. J. Nucl. Med. 1
4, (1988) 523-528 ）（人体に適合させたＶＨ及びＶＫ
遺伝子の配列に就いては第３表（表１）を参照された
い）をＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩで開裂し、シグナル
エキソン及びＶＨエキソンを含む挿入物を単離した。プ
ラスミドクローンｐＡＢＳｔｏｐＣＨ１＋Ｈ＋ｈｕβＧ
ｌｃをＨｉｎｄＩＩＩで開裂し、ＨｉｎｄＩＩＩ／Ｂａ
ｍＨＩ ４３１／２６ ｈｕｍ ＶＨフラグメントに連
結させた。室温で２時間連結させた後、７０℃で１０分
間インキュベーションすることによって連結を停止し、
遊離のままの末端をクレノウポリメラーゼ及びｄＮＴＰ
で充填した。次いで、連結を更に一晩行った。形質転換
の後、免疫グロブリンＦ（ａｂ′）２遺伝子を、ヒトβ
−グルクロニダーゼのコード領域に融合しているヒンジ
エキソンと共に含むクローンｐＡＢＳｔｏｐ ４３１／
２６ ｈｕｍ ＶＨ ｈｕβＧｌｃ１Ｈを制限マッピン
グ及び核酸配列分析の助けによって単離した（図９）。
【表１】
【００１９】例（Ｉ） クローンｐＡＢＳｔｏｐ ４３１／２６ｈｕｍ ＶＨ
ｈｕβＧｌｃ１Ｈを、人体に適合させたＢＨ ４３１／
２６（図１０）の軽鎖を有するプラスミドクローンとネ
オマイシン耐性遺伝子（図１１）およびメトトレキセー
ト耐性遺伝子（図１２）を有する２つのプラスミドと共
にＢＨＫ細胞中にトランスフェクションした。ＭＡｂ
ＢＷ ４３１／２６ｈｕｍの抗原結合特性およびヒトβ
−グルクロニダーゼの酵素活性を両方とも有する融合タ
ンパク質を発現させた。
ｈｕβＧｌｃ１Ｈを、人体に適合させたＢＨ ４３１／
２６（図１０）の軽鎖を有するプラスミドクローンとネ
オマイシン耐性遺伝子（図１１）およびメトトレキセー
ト耐性遺伝子（図１２）を有する２つのプラスミドと共
にＢＨＫ細胞中にトランスフェクションした。ＭＡｂ
ＢＷ ４３１／２６ｈｕｍの抗原結合特性およびヒトβ
−グルクロニダーゼの酵素活性を両方とも有する融合タ
ンパク質を発現させた。
【００２０】例（Ｊ） 抗原結合特性および４３１／２６ｈｕｍ ＶＨｈｕβＧ
ｌｃ １Ｈ融合タンパク質の酵素活性の説明 ４３１／２６ｈｕｍ ＶＨｈｕβＧｌｃ １Ｈ融合タン
パク質のＣＥＡ（癌胎児性抗原）上で４３１／２６によ
って画定されたエピトープに特異的に結合し、同時にヒ
トβ−グルクロニダーゼの酵素活性を発揮する能力を、
特異性／酵素活性分析法で測定した。この分析法は、下
記のようにして行う。ポリスチレン（９６−ウェル）マ
イクロタイタープレート（Ｕ型、タイプＢ、ヌンク(Nun
c)製、整理番号４−６０４４５）を、精製したＣＥＡ
（ＣＥＡ１〜５μｇ／ｍｌ、ウェル当たりこれを７５μ
ｌ）と共に、またはＧＩＴムチン（ＣＥＡと同量）と共
に、室温で一晩インキュベーションする。非吸着抗原を
吸引によって取り除き、３×０．０５Ｍトリス／クエン
酸緩衝液、ｐＨ７．４で洗浄する。マイクロタイタープ
レートを開口部をセルロース上で下に向けて室温で一晩
放置する。マイクロタイタープレートを、ＰＢＳ中１％
強度のカゼイン溶液、ｐＨ７．２をウェル当たり２５０
μｌ（ブロッキング溶液）で、２０℃で３０分間インキ
ュベーションする。ブロッキングの際に、基質を作成す
る。基質の量は、分析を行う上澄液の数によって変わ
る。基質はそれぞれの分析ごとに新たに作成する。 基質： ４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−グルクロ
ニド（整理番号：シグマ(Sigma) 社製Ｍ−９１３０）、
０．０１％ＢＳＡを有する２００ｍＭ酢酸ナトリウム緩
衝液、ｐＨ５．０中２．５ｍＭ。 ブロッキング溶液を吸引によって除き、それぞれの場合
に融合タンパク質を含むＢＨＫ細胞上澄液５０μｌをＣ
ＥＡまたはＧＩＴムチンをコーティングしたマイクロタ
イター上に載せる（すなわち、必要とする試料容量は少
なくとも１２０μｌである）。次に、室温でインキュベ
ーションを３０分間行う。プレートをＥＬＩＳＡ洗浄用
緩衝液（ベーリング(Behring) 、ＯＳＥＷ ９６）で３
回洗浄する。基質を（５０μｌ／ウェル）で載せ、３７
℃で２時間インキュベーションする。蒸発の可能性があ
るので、プレートをカバーする。２時間後に、停止溶液
１５０μｌをそれぞれのウェルにピペットで加える（停
止溶液＝０．２Ｍグリシン＋０．２％ＳＤＳ、ｐＨ１
１．７）。ＵＶランプ（励起エネルギー３８０ｎｍ）下
または螢光測定機器（フルオロスキャン(Fluoroscan)Ｉ
Ｉ、アイシーエヌ・バイオメディカルス(ICN Biomedica
ls) 、製品番号：７８−６１１−００）で、評価を行う
ことができる。
ｌｃ １Ｈ融合タンパク質の酵素活性の説明 ４３１／２６ｈｕｍ ＶＨｈｕβＧｌｃ １Ｈ融合タン
パク質のＣＥＡ（癌胎児性抗原）上で４３１／２６によ
って画定されたエピトープに特異的に結合し、同時にヒ
トβ−グルクロニダーゼの酵素活性を発揮する能力を、
特異性／酵素活性分析法で測定した。この分析法は、下
記のようにして行う。ポリスチレン（９６−ウェル）マ
イクロタイタープレート（Ｕ型、タイプＢ、ヌンク(Nun
c)製、整理番号４−６０４４５）を、精製したＣＥＡ
（ＣＥＡ１〜５μｇ／ｍｌ、ウェル当たりこれを７５μ
ｌ）と共に、またはＧＩＴムチン（ＣＥＡと同量）と共
に、室温で一晩インキュベーションする。非吸着抗原を
吸引によって取り除き、３×０．０５Ｍトリス／クエン
酸緩衝液、ｐＨ７．４で洗浄する。マイクロタイタープ
レートを開口部をセルロース上で下に向けて室温で一晩
放置する。マイクロタイタープレートを、ＰＢＳ中１％
強度のカゼイン溶液、ｐＨ７．２をウェル当たり２５０
μｌ（ブロッキング溶液）で、２０℃で３０分間インキ
ュベーションする。ブロッキングの際に、基質を作成す
る。基質の量は、分析を行う上澄液の数によって変わ
る。基質はそれぞれの分析ごとに新たに作成する。 基質： ４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−グルクロ
ニド（整理番号：シグマ(Sigma) 社製Ｍ−９１３０）、
０．０１％ＢＳＡを有する２００ｍＭ酢酸ナトリウム緩
衝液、ｐＨ５．０中２．５ｍＭ。 ブロッキング溶液を吸引によって除き、それぞれの場合
に融合タンパク質を含むＢＨＫ細胞上澄液５０μｌをＣ
ＥＡまたはＧＩＴムチンをコーティングしたマイクロタ
イター上に載せる（すなわち、必要とする試料容量は少
なくとも１２０μｌである）。次に、室温でインキュベ
ーションを３０分間行う。プレートをＥＬＩＳＡ洗浄用
緩衝液（ベーリング(Behring) 、ＯＳＥＷ ９６）で３
回洗浄する。基質を（５０μｌ／ウェル）で載せ、３７
℃で２時間インキュベーションする。蒸発の可能性があ
るので、プレートをカバーする。２時間後に、停止溶液
１５０μｌをそれぞれのウェルにピペットで加える（停
止溶液＝０．２Ｍグリシン＋０．２％ＳＤＳ、ｐＨ１
１．７）。ＵＶランプ（励起エネルギー３８０ｎｍ）下
または螢光測定機器（フルオロスキャン(Fluoroscan)Ｉ
Ｉ、アイシーエヌ・バイオメディカルス(ICN Biomedica
ls) 、製品番号：７８−６１１−００）で、評価を行う
ことができる。
【００２１】酵素活性をｐＨ５、触媒的最適条件で測定
したときには、螢光性の４−メチルウンベリフェロール
をＣＥＡをコーティングしたウェルで検出可能であるこ
とをこの特異性／酵素活性分析法を用いて示すことが可
能であった（第４表）。第４表 ＣＥＡおよびＧＩＴムチン上での融合タンパク質細胞培養上澄液（Ｂ７３／２ ）からの希釈 各種の溶液中の基質 希釈段階 0.2 M 酢酸ナトリウム PBS 、pH 7.2、 PBS 、pH 7.2、 緩衝液＋0.01% BSA 、 CEA 上 GIT ムチン上 pH 5、CEA 上 濃厚 9118 2725 115.7 1:2 7678 2141 93.37 1:4 4662 1195 73.39 1:8 2927 618.5 60.68 1:16 1657 332.1 53.69 1:32 853 168.2 40.44 1:64 425 99.26 48.21 1:128 192.5 57.89 47.48
したときには、螢光性の４−メチルウンベリフェロール
をＣＥＡをコーティングしたウェルで検出可能であるこ
とをこの特異性／酵素活性分析法を用いて示すことが可
能であった（第４表）。第４表 ＣＥＡおよびＧＩＴムチン上での融合タンパク質細胞培養上澄液（Ｂ７３／２ ）からの希釈 各種の溶液中の基質 希釈段階 0.2 M 酢酸ナトリウム PBS 、pH 7.2、 PBS 、pH 7.2、 緩衝液＋0.01% BSA 、 CEA 上 GIT ムチン上 pH 5、CEA 上 濃厚 9118 2725 115.7 1:2 7678 2141 93.37 1:4 4662 1195 73.39 1:8 2927 618.5 60.68 1:16 1657 332.1 53.69 1:32 853 168.2 40.44 1:64 425 99.26 48.21 1:128 192.5 57.89 47.48
【００２２】ｐＨ７．２における転換率の測定では、こ
の生理的ｐＨでは、融合タンパク質の転換率はｐＨ５の
転換率の約２５％のままであることを示していた。ＧＩ
Ｔムチンをコーティングし、ｐＨ５で測定した陰性コン
トロールプレートでは、何んら有意なメチルウンベリフ
ェロールの遊離は測定されなかった。この知見は、４３
１／２６ｈｕｍ ＶＨｈｕβＧｌｃ １Ｈ融合タンパク
質の人体に適合させたＶ領域は、そのエピトープ特異性
を保持しており、この融合タンパク質のβ−グルクロニ
ダーゼ部分は、元のヒト酵素と同様に、４−メチルウン
ベリフェロールのβ−グルクロニドを開裂することがで
きることを示している。
の生理的ｐＨでは、融合タンパク質の転換率はｐＨ５の
転換率の約２５％のままであることを示していた。ＧＩ
Ｔムチンをコーティングし、ｐＨ５で測定した陰性コン
トロールプレートでは、何んら有意なメチルウンベリフ
ェロールの遊離は測定されなかった。この知見は、４３
１／２６ｈｕｍ ＶＨｈｕβＧｌｃ １Ｈ融合タンパク
質の人体に適合させたＶ領域は、そのエピトープ特異性
を保持しており、この融合タンパク質のβ−グルクロニ
ダーゼ部分は、元のヒト酵素と同様に、４−メチルウン
ベリフェロールのβ−グルクロニドを開裂することがで
きることを示している。
【００２３】例（Ｋ） ４３１／２６ｈｕｍ ＶＨｈｕβＧｌｃ １Ｈ融合タン
パク質のＶ領域と人体に適合させたＭＡｂ ＢＷ ４３
１／２６のＶ領域およびマウスＭＡｂ ＢＷ ４３１／
２６のＶ領域との機能上の同一性の説明 ４３１／２６ｈｕｍ ＶＨｈｕβＧｌｃ １Ｈ融合タン
パク質は、ある種のＣＥＡ−結合ポテンシャルおよびβ
−グルクロニダーゼ活性を有することが、例（Ｊ）に示
された。以下に記載する抗原特異的な競合分析法では、
競合する分子によって認識されるＣＥＡエピトープの同
一性およびエピトープ／融合タンパク質およびエピトー
プ／抗体相互作用の強さについての情報を提供する。こ
の分析法は下記のようにして行う。ポリスチレン製９６
−ウェルのマイクロタイタープレート（Ｕ型、タイプ
Ｂ、ヌンク(Nunc)製、整理番号４−６０４４５）を、精
製したＣＥＡ（ＣＥＡ１〜５μｇ／ｍｌ、ウェル当たり
これを７５μｌ）と共に、ＧＩＴムチン（ＣＥＡと同
量）と共に、室温で一晩インキュベーションする。非吸
着抗原を吸引によって取り除き、３×０．０５Ｍトリス
／クエン酸緩衝液、ｐＨ７．４で洗浄する。マイクロタ
イタープレートを開口部をセルロース上で下に向けて室
温で一晩放置する。マイクロタイタープレートを、ＰＢ
Ｓ中１％強度のカゼイン溶液、ｐＨ７．２をウェル当た
り２５０μｌ（ブロッキング溶液）で、室温で３０分間
インキュベーションする。５ｎｇ／ｍｌの濃度のＭＡｂ
ＢＷ ４３１／２６ ５０μｌを、人体に適合させた
ＭＡｂ ＢＷ ４３１／２６または融合タンパク質の１
０倍に濃縮した上澄液５０μｌ並びに連続した２つの希
釈物と混合する。これらの混合物の５０μｌ量を、ＣＥ
ＡまたはＧＩＴムチンをコーティングしたマイクロタイ
タープレートのウェルに秤量する。マイクロタイタープ
レートを、室温で３０分間インキュベーションする。次
に、プレートをＥＬＩＳＡ洗浄用緩衝液（ベーリングヴ
ェルケ・アーゲー製(Behringwerke AG) 、整理番号：Ｏ
ＳＥＷ ９６）で３回洗浄する。次に、アルカリ性ホス
ファターゼ（サウザン・バイオテクノロジー・アソシエ
ーツ(Southern Biotechnology Associates) 、整理番
号：１０１０−０４）に結合した１：２５０に希釈した
ヤギ抗−マウスＩｇ抗体５０μｌを加える。室温で３０
分間インキュベーションし、３回洗浄した後、基質反応
を次のようにして行う。ウェル当り０．１ｍＭ ＮＡＤ
Ｐ（７．６５ｍｇを２０ｍＭトリス１００ｍｌ、０．１
ｍＭ ＭｇＳＯ４、ｐＨ９．５に溶解する）３０μｌを
加える。溶液は、−２０℃で数か月間保存することがで
きる。室温で３０分間インキュベーションする。インキ
ュベーション中にＮＡＤＰでエンハンサー系を作成す
る：（プレート当たり５ｍｌ）。 ＩＮＴ（超音波槽で３０％強度のエタノール中に２．５
ｍｇ／ｍｌを溶解；常に新たに作成する）２部 ＋ＰＢＳ、ｐＨ７．２ １部 ＋ジアフォラーゼ（１ｍｇ／ｍｌＰＢＳ、ｐＨ７．２）
１部 ＋ＡＤＨ（０．５ｍｇ／ｍｌＰＢＳ、ｐＨ７．２）１
部。 エンハンサー系５０μｌを加える。反応の程度が所要の
程度になったならば、０．１Ｎ Ｈ２ＳＯ４をウェル当
たり１００μｌで反応を停止する。タイターテック(TIT
ERTEK)Ｒマルチスキャン(MULTISCAN) で、４９２ｎｍで
測定する（ブランク＝ＮＡＤＰ５０μｌ＋エンハンサー
溶液５０μｌ＋０．１ＮＨ２ＳＯ４１００μｌ）。 ＮＡＤＰ： シグマ(Sigma) 製、整理番号Ｎ−０
５０５ ＩＮＴ： シグマ(Sigma) 製、整理番号Ｉ−８
３７７ ＡＤＨ： シグマ(Sigma) 製、整理番号Ａ−３
２６３ ディアフォラーゼ：シグマ(Sigma) 製、整理番号Ｄ−２
３８１
パク質のＶ領域と人体に適合させたＭＡｂ ＢＷ ４３
１／２６のＶ領域およびマウスＭＡｂ ＢＷ ４３１／
２６のＶ領域との機能上の同一性の説明 ４３１／２６ｈｕｍ ＶＨｈｕβＧｌｃ １Ｈ融合タン
パク質は、ある種のＣＥＡ−結合ポテンシャルおよびβ
−グルクロニダーゼ活性を有することが、例（Ｊ）に示
された。以下に記載する抗原特異的な競合分析法では、
競合する分子によって認識されるＣＥＡエピトープの同
一性およびエピトープ／融合タンパク質およびエピトー
プ／抗体相互作用の強さについての情報を提供する。こ
の分析法は下記のようにして行う。ポリスチレン製９６
−ウェルのマイクロタイタープレート（Ｕ型、タイプ
Ｂ、ヌンク(Nunc)製、整理番号４−６０４４５）を、精
製したＣＥＡ（ＣＥＡ１〜５μｇ／ｍｌ、ウェル当たり
これを７５μｌ）と共に、ＧＩＴムチン（ＣＥＡと同
量）と共に、室温で一晩インキュベーションする。非吸
着抗原を吸引によって取り除き、３×０．０５Ｍトリス
／クエン酸緩衝液、ｐＨ７．４で洗浄する。マイクロタ
イタープレートを開口部をセルロース上で下に向けて室
温で一晩放置する。マイクロタイタープレートを、ＰＢ
Ｓ中１％強度のカゼイン溶液、ｐＨ７．２をウェル当た
り２５０μｌ（ブロッキング溶液）で、室温で３０分間
インキュベーションする。５ｎｇ／ｍｌの濃度のＭＡｂ
ＢＷ ４３１／２６ ５０μｌを、人体に適合させた
ＭＡｂ ＢＷ ４３１／２６または融合タンパク質の１
０倍に濃縮した上澄液５０μｌ並びに連続した２つの希
釈物と混合する。これらの混合物の５０μｌ量を、ＣＥ
ＡまたはＧＩＴムチンをコーティングしたマイクロタイ
タープレートのウェルに秤量する。マイクロタイタープ
レートを、室温で３０分間インキュベーションする。次
に、プレートをＥＬＩＳＡ洗浄用緩衝液（ベーリングヴ
ェルケ・アーゲー製(Behringwerke AG) 、整理番号：Ｏ
ＳＥＷ ９６）で３回洗浄する。次に、アルカリ性ホス
ファターゼ（サウザン・バイオテクノロジー・アソシエ
ーツ(Southern Biotechnology Associates) 、整理番
号：１０１０−０４）に結合した１：２５０に希釈した
ヤギ抗−マウスＩｇ抗体５０μｌを加える。室温で３０
分間インキュベーションし、３回洗浄した後、基質反応
を次のようにして行う。ウェル当り０．１ｍＭ ＮＡＤ
Ｐ（７．６５ｍｇを２０ｍＭトリス１００ｍｌ、０．１
ｍＭ ＭｇＳＯ４、ｐＨ９．５に溶解する）３０μｌを
加える。溶液は、−２０℃で数か月間保存することがで
きる。室温で３０分間インキュベーションする。インキ
ュベーション中にＮＡＤＰでエンハンサー系を作成す
る：（プレート当たり５ｍｌ）。 ＩＮＴ（超音波槽で３０％強度のエタノール中に２．５
ｍｇ／ｍｌを溶解；常に新たに作成する）２部 ＋ＰＢＳ、ｐＨ７．２ １部 ＋ジアフォラーゼ（１ｍｇ／ｍｌＰＢＳ、ｐＨ７．２）
１部 ＋ＡＤＨ（０．５ｍｇ／ｍｌＰＢＳ、ｐＨ７．２）１
部。 エンハンサー系５０μｌを加える。反応の程度が所要の
程度になったならば、０．１Ｎ Ｈ２ＳＯ４をウェル当
たり１００μｌで反応を停止する。タイターテック(TIT
ERTEK)Ｒマルチスキャン(MULTISCAN) で、４９２ｎｍで
測定する（ブランク＝ＮＡＤＰ５０μｌ＋エンハンサー
溶液５０μｌ＋０．１ＮＨ２ＳＯ４１００μｌ）。 ＮＡＤＰ： シグマ(Sigma) 製、整理番号Ｎ−０
５０５ ＩＮＴ： シグマ(Sigma) 製、整理番号Ｉ−８
３７７ ＡＤＨ： シグマ(Sigma) 製、整理番号Ａ−３
２６３ ディアフォラーゼ：シグマ(Sigma) 製、整理番号Ｄ−２
３８１
【００２４】この抗原特異的な競合分析法における吸光
度の減少は、同一であるかまたは空間的に極めて近接し
ているエピトープについて互いに競合する分子の間に競
合があることを意味している。
度の減少は、同一であるかまたは空間的に極めて近接し
ているエピトープについて互いに競合する分子の間に競
合があることを意味している。
【００２５】得られる阻害データーは、融合タンパク質
４３１／２６ｈｕｍ ＶＨｈｕβ−Ｇｌｃ １Ｈと人体
に適合させたＭＡｂ ４３１／２６とがいずれも、マウ
スＭＡｂ ＢＷ ４３１／２６のそのＣＥＡエピトープ
への結合をブロックすることを示している。５０％阻害
は、関連する競合相手２０モル過剰量で達成される。こ
れから、ＣＥＡエピトープに対する融合タンパク質の結
合活性は、人体に適合させたＭＡｂ ４３１／２６の結
合活性に匹敵すると結論される。更に、融合タンパク質
と人体に適合させたＭＡｂは、同じエピトープまたはＣ
ＥＡ上のマウスＭＡｂ ＢＷ ４３１／２６によって画
定されるものの空間的に極めて近接しているエピトープ
に結合する。
４３１／２６ｈｕｍ ＶＨｈｕβ−Ｇｌｃ １Ｈと人体
に適合させたＭＡｂ ４３１／２６とがいずれも、マウ
スＭＡｂ ＢＷ ４３１／２６のそのＣＥＡエピトープ
への結合をブロックすることを示している。５０％阻害
は、関連する競合相手２０モル過剰量で達成される。こ
れから、ＣＥＡエピトープに対する融合タンパク質の結
合活性は、人体に適合させたＭＡｂ ４３１／２６の結
合活性に匹敵すると結論される。更に、融合タンパク質
と人体に適合させたＭＡｂは、同じエピトープまたはＣ
ＥＡ上のマウスＭＡｂ ＢＷ ４３１／２６によって画
定されるものの空間的に極めて近接しているエピトープ
に結合する。
【００２６】例（Ｌ） ４３１／２６ｈｕｍ ＶＨｈｕβＧｌｃ １Ｈ融合タン
パク質の組織特異性の説明 例（Ｋ）は、融合タンパク質のＶ領域が同一または極め
て近接したエピトープについてマウスＢＷ４３１／２６
のＶ領域と競合することができることを示した。β−グ
ルクロニダーゼに特異的で、以下に記載される間接的免
疫組織化学分析法を用いて、凍結保存した組織で融合タ
ンパク質のミクロスペシフィシティ(micro- specificit
y)を測定することができる。この分析法は、下記のよう
に記載される。６μｍの厚みの凍結切片をスライド上に
置き、少なくとも３０分間風乾する。このスライドを、
次にアセトン中で−２０℃で１０秒間固定する。スライ
ドを０．１％ＢＳＡを含むトリス／ＮａＣｌ洗浄用緩衝
液、ｐＨ７．４中で５分間洗浄する。融合タンパク質を
含有するＢＨＫ細胞上澄液（濃縮またはトリス／ＢＳ
Ａ、ｐＨ７．４で希釈）２０〜１００μｌをそれぞれの
切片に適用して、湿度室(humidity chamber)で室温で３
０分間インキュベーションする。スライドを０．１％Ｂ
ＳＡを含むトリス／ＮａＣｌ洗浄用緩衝液、ｐＨ７．４
中で５分間洗浄する。マウス抗−β−グルクロニダーゼ
ＭＡｂ ＢＷ ２１１８／１５７のハイブリドーマ上澄
液５０μｌをそれぞれの切片に加え、スライドを湿度室
で室温で３０分間インキュベーションする。次に、スラ
イドを０．１％ＢＳＡを含むトリス／ＮａＣｌ洗浄用緩
衝液、ｐＨ７．４中で５分間洗浄する。ブリッジＡｂ
（ヒト血清、ｐＨ７．４で１：１００に希釈したウサギ
−抗マウスＩｇＧ）２０〜１００μｌをそれぞれの切片
に適用して、湿度室で室温で３０分間インキュベーショ
ンする。次いで、スライドを０．１％ＢＳＡを含むトリ
ス／ＮａＣｌ洗浄用緩衝液、ｐＨ７．４中で５分間洗浄
する。次に、ＡＰＡＡＰ錯体（トリス／ＢＳＡ、ｐＨ
７．４で１：１００に希釈したマウス抗−ＡＰ）２０〜
１００μｌをそれぞれの切片に適用して、湿度室で室温
で３０分間インキュベーションする。次に、スライドを
０．１％ＢＳＡを含むトリス／ＮａＣｌ洗浄用緩衝液、
ｐＨ７．４中で５分間洗浄する。アルカリ性ホスファタ
ーゼ用の基質は次のようにして作成する（１つのガラス
キュベットに十分な基質溶液１００ｍｌ）： 溶液１： ＮａＣｌ ３．７ｇ トリス塩基２．７ｇ（蒸溜水７５ｍｌに溶解） ＋プロパンジオール緩衝液、ＨＣｌでｐＨ９．７５に調
整したもの２６．８ｍｌ ＋レバミゾール４２．９ｍｇを、透明で無色な溶液にし
たもの。 溶液２： 蒸溜水５３５μｌに亜硝酸ナトリウム２１．
４ｍｇを溶解して、透明で無色な溶液にしたもの。 溶液３： ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）６４２μｌ
にナフトールＡＳ ＢＩホスフェート５３．５ｍｇを透
明な黄色溶液にしたもの。 ５％強度の新たなフクシン溶液３６８μｌを溶液２（亜
硝酸ナトリウム）に加え、１分間反応させ（タイマ
ー）、透明な褐色溶液を得る。溶液（新たなフクシンを
有する亜硝酸ナトリウム）と溶液３（ナフトールＡＳＢ
Ｉホスフェート）を溶液１（トリス／ＮａＣｌ／プロパ
ンジオール緩衝液）に加えて、透明な黄色溶液を得る。
ＨＣｌでｐＨ８．８に調整して、濁った黄色溶液を得
る。溶液を濾過し、スライド上に置き、振盪装置上で１
５分間反応させて、溶液を不透明にする。スライドをト
リス／ＮａＣｌ緩衝液、ｐＨ７．４で１０分間洗浄す
る。スライドを蒸溜水で１０分間洗浄する。２時間風乾
した後、スライドをカイザーグリセロール(Kaiser's gl
ycerol) ／ゼラチンに５６℃で封入する。
パク質の組織特異性の説明 例（Ｋ）は、融合タンパク質のＶ領域が同一または極め
て近接したエピトープについてマウスＢＷ４３１／２６
のＶ領域と競合することができることを示した。β−グ
ルクロニダーゼに特異的で、以下に記載される間接的免
疫組織化学分析法を用いて、凍結保存した組織で融合タ
ンパク質のミクロスペシフィシティ(micro- specificit
y)を測定することができる。この分析法は、下記のよう
に記載される。６μｍの厚みの凍結切片をスライド上に
置き、少なくとも３０分間風乾する。このスライドを、
次にアセトン中で−２０℃で１０秒間固定する。スライ
ドを０．１％ＢＳＡを含むトリス／ＮａＣｌ洗浄用緩衝
液、ｐＨ７．４中で５分間洗浄する。融合タンパク質を
含有するＢＨＫ細胞上澄液（濃縮またはトリス／ＢＳ
Ａ、ｐＨ７．４で希釈）２０〜１００μｌをそれぞれの
切片に適用して、湿度室(humidity chamber)で室温で３
０分間インキュベーションする。スライドを０．１％Ｂ
ＳＡを含むトリス／ＮａＣｌ洗浄用緩衝液、ｐＨ７．４
中で５分間洗浄する。マウス抗−β−グルクロニダーゼ
ＭＡｂ ＢＷ ２１１８／１５７のハイブリドーマ上澄
液５０μｌをそれぞれの切片に加え、スライドを湿度室
で室温で３０分間インキュベーションする。次に、スラ
イドを０．１％ＢＳＡを含むトリス／ＮａＣｌ洗浄用緩
衝液、ｐＨ７．４中で５分間洗浄する。ブリッジＡｂ
（ヒト血清、ｐＨ７．４で１：１００に希釈したウサギ
−抗マウスＩｇＧ）２０〜１００μｌをそれぞれの切片
に適用して、湿度室で室温で３０分間インキュベーショ
ンする。次いで、スライドを０．１％ＢＳＡを含むトリ
ス／ＮａＣｌ洗浄用緩衝液、ｐＨ７．４中で５分間洗浄
する。次に、ＡＰＡＡＰ錯体（トリス／ＢＳＡ、ｐＨ
７．４で１：１００に希釈したマウス抗−ＡＰ）２０〜
１００μｌをそれぞれの切片に適用して、湿度室で室温
で３０分間インキュベーションする。次に、スライドを
０．１％ＢＳＡを含むトリス／ＮａＣｌ洗浄用緩衝液、
ｐＨ７．４中で５分間洗浄する。アルカリ性ホスファタ
ーゼ用の基質は次のようにして作成する（１つのガラス
キュベットに十分な基質溶液１００ｍｌ）： 溶液１： ＮａＣｌ ３．７ｇ トリス塩基２．７ｇ（蒸溜水７５ｍｌに溶解） ＋プロパンジオール緩衝液、ＨＣｌでｐＨ９．７５に調
整したもの２６．８ｍｌ ＋レバミゾール４２．９ｍｇを、透明で無色な溶液にし
たもの。 溶液２： 蒸溜水５３５μｌに亜硝酸ナトリウム２１．
４ｍｇを溶解して、透明で無色な溶液にしたもの。 溶液３： ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）６４２μｌ
にナフトールＡＳ ＢＩホスフェート５３．５ｍｇを透
明な黄色溶液にしたもの。 ５％強度の新たなフクシン溶液３６８μｌを溶液２（亜
硝酸ナトリウム）に加え、１分間反応させ（タイマ
ー）、透明な褐色溶液を得る。溶液（新たなフクシンを
有する亜硝酸ナトリウム）と溶液３（ナフトールＡＳＢ
Ｉホスフェート）を溶液１（トリス／ＮａＣｌ／プロパ
ンジオール緩衝液）に加えて、透明な黄色溶液を得る。
ＨＣｌでｐＨ８．８に調整して、濁った黄色溶液を得
る。溶液を濾過し、スライド上に置き、振盪装置上で１
５分間反応させて、溶液を不透明にする。スライドをト
リス／ＮａＣｌ緩衝液、ｐＨ７．４で１０分間洗浄す
る。スライドを蒸溜水で１０分間洗浄する。２時間風乾
した後、スライドをカイザーグリセロール(Kaiser's gl
ycerol) ／ゼラチンに５６℃で封入する。
【００２７】融合タンパク質の特異的結合を、エピトー
プ−陽性の組織切片を赤色に着色することによって、光
学顕微鏡で例示した。間接ＡＰＡＡＰ法（コルデル(Cor
dell) ら、J. Histochem. Cytochem., 32, 219, 1984）
によって検出されたマウスＭＡｂ ＢＷ ４３１／２６
との比較研究により、融合タンパク質の組織特異性はマ
ウスＭＡｂ ＢＷ ４３１／２６の組織特異性と精確に
一致し、すなわち、個々の標本における反応型および様
々な癌の大多数と正常の組織から得られる正および負の
知見の数とのいずれもが一致することが明らかになっ
た。
プ−陽性の組織切片を赤色に着色することによって、光
学顕微鏡で例示した。間接ＡＰＡＡＰ法（コルデル(Cor
dell) ら、J. Histochem. Cytochem., 32, 219, 1984）
によって検出されたマウスＭＡｂ ＢＷ ４３１／２６
との比較研究により、融合タンパク質の組織特異性はマ
ウスＭＡｂ ＢＷ ４３１／２６の組織特異性と精確に
一致し、すなわち、個々の標本における反応型および様
々な癌の大多数と正常の組織から得られる正および負の
知見の数とのいずれもが一致することが明らかになっ
た。
【００２８】例（Ｍ） ４３１／２６ｈｕｍ ＶＨｈｕβＧｌｃ １Ｈ融合タン
パク質の精製 マウスおよび人体に適合させたＭＡｂは、これらの分子
のＦｃ部分について選択的なイムノアフィニティクロマ
トグラフィ法によって精製することができる。４３１／
２６ｈｕｍ ＶＨｈｕβＧｌｃ １Ｈ融合タンパク質に
はＦｃ部分がないので、別の高度に選択的なイムノアフ
ィニティクロマトグラフィ法を開発する必要があった。
開発すべきこの方法の選択性の外に、単離条件を極めて
温和にして、酸性およびアルカリ性の範囲では極めて不
安定なβ−グルクロニダーゼを痛めないようにする必要
がある。この方法の原理は、人体に適合させたＶ部に向
けられた抗−イディオタイプＭＡｂを用いて、トランス
フェクションしたＢＨＫ細胞からの上澄液からの融合タ
ンパク質の精製から成っている。この様なＭＡｂの製造
は、文献により知られている（ウォルター(Walter)ら、
Behring Inst. Mitt., 82, 182-192, 1988）。この抗Ｍ
Ａｂは、固相に固定して、そのＶ部が損なわれないよう
にするのが好ましい。この例は文献既知である（フレミ
ンガー(Fleminger) ら、Applied Biochem.Biotechnol.,
23, 123-137, 1990 ；ホルスファール(Horsfall)ら、J
IM 104,43-49, 1987 ） 既知の方法によって固相に固定された抗−イディオタイ
プＭＡｂは、トランスフェクションしたＢＨＫ細胞から
精製される融合タンパク質を例えばｐＨ７で極めて効率
的に結合するが、ｐＨが１．５だけ低下してｐＨ５．５
となると、最早融合タンパク質を結合しないという予想
外の特性を有する。この温和なｐＨ溶出法は、融合タン
パク質に、ＣＥＡに結合するその能力またはその酵素活
性（方法については、例Ｊを参照されたい）のいずれに
おいても悪影響を与えない。第５表に、固相に固定した
抗−イディオタイプＭＡｂ ＢＷ ２０６４／３４を用
いる精製からの個々の画分のＯＤ値および蛍光単位（Ｆ
Ｕ）を示す。第５表： 抗−イディオタイプアフィニティクロマトグラフィ画分 ＯＤ(%) ＦＵ(%) ｐＨ クロマトグラフィ処理法 1-5 1 0 7.2 PBS, pH 7.2 によるカラムの予備洗浄 6-142 20 0 7.2 試料充填 143-162 1 0 7.2 PBS, pH 7.2 によるカラムの洗浄 163 1 0 7.2 164 1 0 7.2 165 1 0 7.2 166 1 0 6.8 167 2 10 6.1 168 5 20 5.7 169 16 40 5.6 170 23 80 5.5 171 26 100 5.4 PBS で溶出 172 24 80 5.3 pH 4.2 173 19 60 5.2 174 14 40 5.2 175 10 30 5.1 176 8 25 5.1 177 6 20 5.1 178 3 10 5.0 179 2 5 5.0 180 1 0 5.0 1 画分＝6.6 分間収集（送液速度：18 ml/時）＝2 ml。 ＦＵ値は、最高値（画分171 ）の％として表わされる。
パク質の精製 マウスおよび人体に適合させたＭＡｂは、これらの分子
のＦｃ部分について選択的なイムノアフィニティクロマ
トグラフィ法によって精製することができる。４３１／
２６ｈｕｍ ＶＨｈｕβＧｌｃ １Ｈ融合タンパク質に
はＦｃ部分がないので、別の高度に選択的なイムノアフ
ィニティクロマトグラフィ法を開発する必要があった。
開発すべきこの方法の選択性の外に、単離条件を極めて
温和にして、酸性およびアルカリ性の範囲では極めて不
安定なβ−グルクロニダーゼを痛めないようにする必要
がある。この方法の原理は、人体に適合させたＶ部に向
けられた抗−イディオタイプＭＡｂを用いて、トランス
フェクションしたＢＨＫ細胞からの上澄液からの融合タ
ンパク質の精製から成っている。この様なＭＡｂの製造
は、文献により知られている（ウォルター(Walter)ら、
Behring Inst. Mitt., 82, 182-192, 1988）。この抗Ｍ
Ａｂは、固相に固定して、そのＶ部が損なわれないよう
にするのが好ましい。この例は文献既知である（フレミ
ンガー(Fleminger) ら、Applied Biochem.Biotechnol.,
23, 123-137, 1990 ；ホルスファール(Horsfall)ら、J
IM 104,43-49, 1987 ） 既知の方法によって固相に固定された抗−イディオタイ
プＭＡｂは、トランスフェクションしたＢＨＫ細胞から
精製される融合タンパク質を例えばｐＨ７で極めて効率
的に結合するが、ｐＨが１．５だけ低下してｐＨ５．５
となると、最早融合タンパク質を結合しないという予想
外の特性を有する。この温和なｐＨ溶出法は、融合タン
パク質に、ＣＥＡに結合するその能力またはその酵素活
性（方法については、例Ｊを参照されたい）のいずれに
おいても悪影響を与えない。第５表に、固相に固定した
抗−イディオタイプＭＡｂ ＢＷ ２０６４／３４を用
いる精製からの個々の画分のＯＤ値および蛍光単位（Ｆ
Ｕ）を示す。第５表： 抗−イディオタイプアフィニティクロマトグラフィ画分 ＯＤ(%) ＦＵ(%) ｐＨ クロマトグラフィ処理法 1-5 1 0 7.2 PBS, pH 7.2 によるカラムの予備洗浄 6-142 20 0 7.2 試料充填 143-162 1 0 7.2 PBS, pH 7.2 によるカラムの洗浄 163 1 0 7.2 164 1 0 7.2 165 1 0 7.2 166 1 0 6.8 167 2 10 6.1 168 5 20 5.7 169 16 40 5.6 170 23 80 5.5 171 26 100 5.4 PBS で溶出 172 24 80 5.3 pH 4.2 173 19 60 5.2 174 14 40 5.2 175 10 30 5.1 176 8 25 5.1 177 6 20 5.1 178 3 10 5.0 179 2 5 5.0 180 1 0 5.0 1 画分＝6.6 分間収集（送液速度：18 ml/時）＝2 ml。 ＦＵ値は、最高値（画分171 ）の％として表わされる。
【００２９】融合タンパク質の溶出は、２８０ｎｍにお
いてＯＤを測定することによってタンパク質として測定
した。更に、単離した画分を、特異性／酵素活性分析法
（例Ｊ）でＣＥＡに対する特異的結合および同時の酵素
活性について検討を行った。これらの値は、総ての特異
的結合および酵素活性は一つのピーク（約ｐＨ５．０〜
ｐＨ５．６で溶出するピーク）に集中したことを示して
いる。これにより、前記の抗−イディオタイプアフィニ
ティクロマトグラフィの方法は、４３１／２６ｈｕｍ
ＶＨｈｕβＧｌｃ １Ｈ融合タンパク質については極め
て効率的且つ選択的な精製法であることが結論される。
いてＯＤを測定することによってタンパク質として測定
した。更に、単離した画分を、特異性／酵素活性分析法
（例Ｊ）でＣＥＡに対する特異的結合および同時の酵素
活性について検討を行った。これらの値は、総ての特異
的結合および酵素活性は一つのピーク（約ｐＨ５．０〜
ｐＨ５．６で溶出するピーク）に集中したことを示して
いる。これにより、前記の抗−イディオタイプアフィニ
ティクロマトグラフィの方法は、４３１／２６ｈｕｍ
ＶＨｈｕβＧｌｃ １Ｈ融合タンパク質については極め
て効率的且つ選択的な精製法であることが結論される。
【００３０】例（Ｎ） 融合タンパク質のゲルクロマトグラフィ ４３１／２６ｈｕｍ ＶＨｈｕβＧｌｃ １Ｈ融合タン
パク質分泌ＢＨＫ細胞からの上澄液（Ｂ ７０／６，Ｂ
７４／２， Ｂ ７２／７２， Ｂ ７３／２）を取
り出し、濾過によって滅菌し、ゲル濾過による分析を行
った。このために、ＴＳＫ Ｇ３０００ ＳＷ−ＸＬカ
ラム（７．８×３００ｍｍ）を０．１Ｍリン酸ナトリウ
ム緩衝液、ｐＨ６．７と０．０２％ＮａＮ３で平衡にし
て、上澄液２０μｌを充填し、０．６ｍｌ／分の流速で
溶出を行った。９分の溶出時間（排除容積９．５分）の
溶出時間から始め、画分（それぞれ０．３分）を集め、
β−グルクロニダーゼ活性を分析した。このために、特
定の画分２５μｌを基質溶液（２００ｍＭ酢酸ナトリウ
ム緩衝液、ｐＨ５中２．５ｍＭ４−メチルウンベリフェ
リルβ−グルクロニドに０．１ｍｇ／ｍｌＢＳＡを加え
たもの）７５μｌと混合し、３７℃で２時間インキュベ
ーションした。次に、反応を０．２Ｍグリシン／０．２
％ＳＤＳ溶液１．５ｍｌを用いて停止し、グルクロニダ
ーゼによって遊離した蛍光標識をヒタチ(Hitachi) 蛍光
計（励起波長３６０ｎｍおよび発光波長４５０ｎｍ）で
定量した。
パク質分泌ＢＨＫ細胞からの上澄液（Ｂ ７０／６，Ｂ
７４／２， Ｂ ７２／７２， Ｂ ７３／２）を取
り出し、濾過によって滅菌し、ゲル濾過による分析を行
った。このために、ＴＳＫ Ｇ３０００ ＳＷ−ＸＬカ
ラム（７．８×３００ｍｍ）を０．１Ｍリン酸ナトリウ
ム緩衝液、ｐＨ６．７と０．０２％ＮａＮ３で平衡にし
て、上澄液２０μｌを充填し、０．６ｍｌ／分の流速で
溶出を行った。９分の溶出時間（排除容積９．５分）の
溶出時間から始め、画分（それぞれ０．３分）を集め、
β−グルクロニダーゼ活性を分析した。このために、特
定の画分２５μｌを基質溶液（２００ｍＭ酢酸ナトリウ
ム緩衝液、ｐＨ５中２．５ｍＭ４−メチルウンベリフェ
リルβ−グルクロニドに０．１ｍｇ／ｍｌＢＳＡを加え
たもの）７５μｌと混合し、３７℃で２時間インキュベ
ーションした。次に、反応を０．２Ｍグリシン／０．２
％ＳＤＳ溶液１．５ｍｌを用いて停止し、グルクロニダ
ーゼによって遊離した蛍光標識をヒタチ(Hitachi) 蛍光
計（励起波長３６０ｎｍおよび発光波長４５０ｎｍ）で
定量した。
【００３１】結果 総ての４つの構造は、画分４および６（第６表）の間に
単一の主要な活性ピークを示す。このピークは、約１
０．２〜１０．８分の保持時間に相当する。上澄液にグ
ルクロニダーゼ活性を有する融合タンパク質は、化学的
に調整した抗体−β−グルクロニダーゼ構造と同じ大き
さの次数の保持時間を有する（１０．４分）。遊離の酵
素に対する保持時間は１１．９分であり、遊離の抗体に
対する保持時間は１２．３分である。第６表 各種の融合タンパク質のゲル濾過 インキュベーション：２５μｌ、３７℃、１２０分 物質濃度：１．８７５ｍＭ；０．１ｍｇ／ｍｌＢＳＡ それぞれの画分０．３分；９分から開始。
単一の主要な活性ピークを示す。このピークは、約１
０．２〜１０．８分の保持時間に相当する。上澄液にグ
ルクロニダーゼ活性を有する融合タンパク質は、化学的
に調整した抗体−β−グルクロニダーゼ構造と同じ大き
さの次数の保持時間を有する（１０．４分）。遊離の酵
素に対する保持時間は１１．９分であり、遊離の抗体に
対する保持時間は１２．３分である。第６表 各種の融合タンパク質のゲル濾過 インキュベーション：２５μｌ、３７℃、１２０分 物質濃度：１．８７５ｍＭ；０．１ｍｇ／ｍｌＢＳＡ それぞれの画分０．３分；９分から開始。
【００３２】例（Ｏ） ４３１／２６ｈｕｍ ＶＨｈｕβＧｌｃ １Ｈ融合タン
パク質の分子特性決定融合タンパク質を、例（Ｍ）の抗
−イディオタイプアフィニティクロマトグラフィによっ
て精製した。ｐＨ５．５で溶出したピークの一部を、非
還元性および還元性条件下で１０％ ＳＤＳ ＰＡＧＥ
電気泳動を行い、抗−イディオタイプＭＡｂを用いてま
たは抗−β−グルクロニダーゼＭＡｂを用いて、ウェス
タンブロットで免疫染色した（トウビン(Towbin)とゴー
ドン(Gordon)、Proc. Natl.Acad. Sci. USA, 76, 4350-
4354, 1979 ）。４３１／２６ｈｕｍ ＶＨｈｕβＧｌ
ｃ １Ｈ融合タンパク質を用いた非還元性条件下で
は、、約１２５ｋＤａの主バンドおよび２５０ｋＤａの
バンドが検出され、抗−イディオタイプＭＡｂによって
も、ウェスタンブロットでの抗−β−グルクロニダーゼ
ＭＡｂによっても検出可能であった。還元条件下では、
抗−イディオタイプＭＡｂによっても、ウェスタンブロ
ットでの抗−β−グルクロニダーゼＭＡｂによっても免
疫染色は検出されなかった。１００ｋＤａと２５ｋＤａ
のバンドは、還元性ＳＤＳ ＰＡＧＥで検出された。し
かしながら、変性条件下で分析されるこれらの分子は、
ＴＳＫ Ｇ ３０００ ＳＷ−ＸＬ−ゲル濾過によれ
ば、元の条件下では分子量が約２５０ｋＤａの高分子量
生成物の形態をしている（例Ｎ）。４３１／２６ｈｕｍ
ＶＨｈｕβＧｌｃ １Ｈ融合タンパク質の模式的表現
を、図１３に示す。図１３ｂは、約２５ｋＤａの軽鎖と
約１００ｋＤａの重鎖を有するモノマーを示している。
このモノマーと重鎖間ジスルフィドブリッジによって結
合されたダイマーは、変性条件下で検出することができ
る（図１３ａ）。変性条件下では、融合タンパク質は約
２５０ｋＤａのダイマーの形態をしており、重鎖間ジス
ルフィドブリッジがある場合もまたはない場合もある
（図１３ｃ）。
パク質の分子特性決定融合タンパク質を、例（Ｍ）の抗
−イディオタイプアフィニティクロマトグラフィによっ
て精製した。ｐＨ５．５で溶出したピークの一部を、非
還元性および還元性条件下で１０％ ＳＤＳ ＰＡＧＥ
電気泳動を行い、抗−イディオタイプＭＡｂを用いてま
たは抗−β−グルクロニダーゼＭＡｂを用いて、ウェス
タンブロットで免疫染色した（トウビン(Towbin)とゴー
ドン(Gordon)、Proc. Natl.Acad. Sci. USA, 76, 4350-
4354, 1979 ）。４３１／２６ｈｕｍ ＶＨｈｕβＧｌ
ｃ １Ｈ融合タンパク質を用いた非還元性条件下で
は、、約１２５ｋＤａの主バンドおよび２５０ｋＤａの
バンドが検出され、抗−イディオタイプＭＡｂによって
も、ウェスタンブロットでの抗−β−グルクロニダーゼ
ＭＡｂによっても検出可能であった。還元条件下では、
抗−イディオタイプＭＡｂによっても、ウェスタンブロ
ットでの抗−β−グルクロニダーゼＭＡｂによっても免
疫染色は検出されなかった。１００ｋＤａと２５ｋＤａ
のバンドは、還元性ＳＤＳ ＰＡＧＥで検出された。し
かしながら、変性条件下で分析されるこれらの分子は、
ＴＳＫ Ｇ ３０００ ＳＷ−ＸＬ−ゲル濾過によれ
ば、元の条件下では分子量が約２５０ｋＤａの高分子量
生成物の形態をしている（例Ｎ）。４３１／２６ｈｕｍ
ＶＨｈｕβＧｌｃ １Ｈ融合タンパク質の模式的表現
を、図１３に示す。図１３ｂは、約２５ｋＤａの軽鎖と
約１００ｋＤａの重鎖を有するモノマーを示している。
このモノマーと重鎖間ジスルフィドブリッジによって結
合されたダイマーは、変性条件下で検出することができ
る（図１３ａ）。変性条件下では、融合タンパク質は約
２５０ｋＤａのダイマーの形態をしており、重鎖間ジス
ルフィドブリッジがある場合もまたはない場合もある
（図１３ｃ）。
【００３３】例（Ｐ） 融合タンパク質の化学修飾 例（Ｎ）におけるのと同様にして精製した融合タンパク
質（１１０μｇ／ｍｌ）をｐＨ４．５に調整し、過ヨウ
素酸ナトリウム（最終濃度１ｍＭ）と混合した。室温、
暗所で１時間インキュベーションした後、過ヨウ素酸ナ
トリウムをゲルクロマトグラフィによって除いた後、融
合タンパク質を再度ｐＨ８に調整した。エタノールアミ
ンを最終濃度０．１Ｍまで添加した後、４℃で更に３時
間インキュベーションし、次いで、ナトリウムシアノボ
ロハイドライド（最終濃度５ｍＭ）を加え、３０分間イ
ンキュベーションした（還元）。この後に、更にゲル濾
過を行って桿現在を除去し、融合タンパク質の緩衝剤を
変化させた。化学修飾では、融合タンパク質の機能的活
性に何んらの影響がなかった。第７表に、ヌードマウス
の修飾していないおよび修飾した融合タンパク質の血漿
濃度における変化を示す。血漿からの融合タンパク質の
除去は、修飾によって著しく遅くなる。第７表 ヌードマウスにおけるβ−グルクロニダーゼ活性の血漿中の水準 β−グルクロニダーゼ融合タンパク質 ｔ（分） 処理済みの％活性 未処理の％活性 0 100 100 10 54 30 76 60 22 240 40 4 480 1 1380 19 1440 1 5880 3
質（１１０μｇ／ｍｌ）をｐＨ４．５に調整し、過ヨウ
素酸ナトリウム（最終濃度１ｍＭ）と混合した。室温、
暗所で１時間インキュベーションした後、過ヨウ素酸ナ
トリウムをゲルクロマトグラフィによって除いた後、融
合タンパク質を再度ｐＨ８に調整した。エタノールアミ
ンを最終濃度０．１Ｍまで添加した後、４℃で更に３時
間インキュベーションし、次いで、ナトリウムシアノボ
ロハイドライド（最終濃度５ｍＭ）を加え、３０分間イ
ンキュベーションした（還元）。この後に、更にゲル濾
過を行って桿現在を除去し、融合タンパク質の緩衝剤を
変化させた。化学修飾では、融合タンパク質の機能的活
性に何んらの影響がなかった。第７表に、ヌードマウス
の修飾していないおよび修飾した融合タンパク質の血漿
濃度における変化を示す。血漿からの融合タンパク質の
除去は、修飾によって著しく遅くなる。第７表 ヌードマウスにおけるβ−グルクロニダーゼ活性の血漿中の水準 β−グルクロニダーゼ融合タンパク質 ｔ（分） 処理済みの％活性 未処理の％活性 0 100 100 10 54 30 76 60 22 240 40 4 480 1 1380 19 1440 1 5880 3
【００３４】例（Ｑ） 融合タンパク質の酵素処理 ０．０１Ｍトリス／ＨＣｌ中の融合タンパク質（例Ｎ）
５３μｇと０．１５ＭＮａＣｌを、可溶性のアルカリ性
ホスファターゼ（大腸菌）または固定したアルカリ性ホ
スファターゼ（ウシ腸）１単位と共に室温で２０時間イ
ンキュベーションした。表８に、ヌードマウスの未処理
または処理済み融合タンパク質の血漿中濃度の変化を示
す。除去は、酵素処理によっては余り変化しない。第８表 ヌードマウスにおけるβ−グルクロニダーゼ活性の血漿中水準 β−グルクロニダーゼ融合タンパク質 ＡＰ（ウシ腸、固定） ＡＰ（大腸菌） ｔ（分） 未処理（％） 処理（％） 処理（％） 0 100 100 100 10 78 76 65 30 44 57 53 60 35 36 35 240 22 27 22 1440 4 5 5 ＡＰ＝アルカリ性ホスファターゼ
５３μｇと０．１５ＭＮａＣｌを、可溶性のアルカリ性
ホスファターゼ（大腸菌）または固定したアルカリ性ホ
スファターゼ（ウシ腸）１単位と共に室温で２０時間イ
ンキュベーションした。表８に、ヌードマウスの未処理
または処理済み融合タンパク質の血漿中濃度の変化を示
す。除去は、酵素処理によっては余り変化しない。第８表 ヌードマウスにおけるβ−グルクロニダーゼ活性の血漿中水準 β−グルクロニダーゼ融合タンパク質 ＡＰ（ウシ腸、固定） ＡＰ（大腸菌） ｔ（分） 未処理（％） 処理（％） 処理（％） 0 100 100 100 10 78 76 65 30 44 57 53 60 35 36 35 240 22 27 22 1440 4 5 5 ＡＰ＝アルカリ性ホスファターゼ
【００３５】例（Ｒ） ４３１／２６ ｈｕｍ ＶＨｈｕβＧｌｃ １Ｈ融合タ
ンパク質の薬理学的速度論および腫瘍保持 例えば、精製した融合タンパク質であって、ＨＳＡ１０
０μｇ／ｍｌと混合したもの５×４μｇを未修飾の形態
（例Ｎ）および化学修飾した形態（例Ｐ）で、ヒト腫瘍
を有するＣＥＡ−発現ヌードマウスに静脈内に２４時間
の間隔を置いて注射した。所定の時間の後、それぞれの
場合に３匹の動物を頸部脱臼により屠殺した。臓器を取
り出して、秤量し、ＰＢＳ中１％強度のＢＳＡ、ｐＨ
７．２ ２ｍｌと混合した。次に、これらの臓器からの
組織と細胞を、ポッター(Potter)（１０ストローク）中
で破壊し、特異性／酵素活性分析法（例Ｊを参照された
い）で、懸濁液を３０００ｒｐｍおよび室温で１０分間
遠心分離した後（ヘレウス・ラボフュージ(Heraeus Lab
ofuge)ＧＬ、２２０２型）、機能的に活性な融合タンパ
ク質の量を上澄液中で測定した。代表的な実験からのデ
ーターを、第９表に示す。ｔ１／２βが約４時間である
化学的に修飾された融合タンパク質は、反復注射相が完
了した後３日後から腫瘍中に特異的に蓄積することは、
明らかである。ｔ１／２βが約２０分間の未修飾の融合
タンパク質は、同じ実験条件下では、腫瘍中に余り蓄積
しなかった。これらのデーターから、ｈｕ４３１β−Ｇ
ｌｕｃ融合タンパク質は、生体内でＣＥＡ−陽性の腫瘍
に結合し、長期間（＞９日）に亙って酵素活性分子とし
てそこに止どまることができると結論することができ
る。この系にプロドラッグを投与する時間は、融合タン
パク質の注射が完了した後、３〜９日とすべきである。第９表 ＣＥＡ−陽性のヒト胃癌異種移植片（ＭｚＳｔｏ１）による腫瘍保持実験 ２４時間の間隔でマウス当たり融合タンパク質５×４μｇを静脈内注射 最後に静 脈内注射 した後の 腫瘍または臓器ｇ当たりの活性（％）時間（時） 腫瘍 肝臓 肺臓 脾臓 腎臓 腸 血漿 3 100 100 100 100 100 100 100 24 86.7 49.3 26.3 - 64 123 44.4 72 26.4 11 4.4 - 8.1 19 6.5 216 24.4 1.5 0.13 1.2 0.4 0.5 0.015
ンパク質の薬理学的速度論および腫瘍保持 例えば、精製した融合タンパク質であって、ＨＳＡ１０
０μｇ／ｍｌと混合したもの５×４μｇを未修飾の形態
（例Ｎ）および化学修飾した形態（例Ｐ）で、ヒト腫瘍
を有するＣＥＡ−発現ヌードマウスに静脈内に２４時間
の間隔を置いて注射した。所定の時間の後、それぞれの
場合に３匹の動物を頸部脱臼により屠殺した。臓器を取
り出して、秤量し、ＰＢＳ中１％強度のＢＳＡ、ｐＨ
７．２ ２ｍｌと混合した。次に、これらの臓器からの
組織と細胞を、ポッター(Potter)（１０ストローク）中
で破壊し、特異性／酵素活性分析法（例Ｊを参照された
い）で、懸濁液を３０００ｒｐｍおよび室温で１０分間
遠心分離した後（ヘレウス・ラボフュージ(Heraeus Lab
ofuge)ＧＬ、２２０２型）、機能的に活性な融合タンパ
ク質の量を上澄液中で測定した。代表的な実験からのデ
ーターを、第９表に示す。ｔ１／２βが約４時間である
化学的に修飾された融合タンパク質は、反復注射相が完
了した後３日後から腫瘍中に特異的に蓄積することは、
明らかである。ｔ１／２βが約２０分間の未修飾の融合
タンパク質は、同じ実験条件下では、腫瘍中に余り蓄積
しなかった。これらのデーターから、ｈｕ４３１β−Ｇ
ｌｕｃ融合タンパク質は、生体内でＣＥＡ−陽性の腫瘍
に結合し、長期間（＞９日）に亙って酵素活性分子とし
てそこに止どまることができると結論することができ
る。この系にプロドラッグを投与する時間は、融合タン
パク質の注射が完了した後、３〜９日とすべきである。第９表 ＣＥＡ−陽性のヒト胃癌異種移植片（ＭｚＳｔｏ１）による腫瘍保持実験 ２４時間の間隔でマウス当たり融合タンパク質５×４μｇを静脈内注射 最後に静 脈内注射 した後の 腫瘍または臓器ｇ当たりの活性（％）時間（時） 腫瘍 肝臓 肺臓 脾臓 腎臓 腸 血漿 3 100 100 100 100 100 100 100 24 86.7 49.3 26.3 - 64 123 44.4 72 26.4 11 4.4 - 8.1 19 6.5 216 24.4 1.5 0.13 1.2 0.4 0.5 0.015
【００３６】例（Ｓ） ４３１／２６ ｈｕｍ ＶＨｈｕβＧｌｃ １Ｈ融合タ
ンパク質の等電点電気泳動 抗−イディオタイプアフィニティクロマトグラフィ（例
Ｎ）によって精製した融合タンパク質を、リゲッティ(R
ighetti)ら（１９７９年）の方法によってファルマシア
・ファースト・システム(Pharmacia Fast System) で等
電点電気泳動に付した。これにより、分子の等電点は
７．３５〜８．１５のｐＨ範囲にあることが明らかにな
った。
ンパク質の等電点電気泳動 抗−イディオタイプアフィニティクロマトグラフィ（例
Ｎ）によって精製した融合タンパク質を、リゲッティ(R
ighetti)ら（１９７９年）の方法によってファルマシア
・ファースト・システム(Pharmacia Fast System) で等
電点電気泳動に付した。これにより、分子の等電点は
７．３５〜８．１５のｐＨ範囲にあることが明らかにな
った。
【００３７】例（Ｔ） 細胞増殖抑制性のプロドラッグを、４３１／２６ ｈｕ
ｍ ＶＨｈｕβＧｌｃ１Ｈ融合タンパク質により開裂す
ることができることの説明 例（Ｊ）には、融合タンパク質のβ−グルクロニダーゼ
部分は、元のヒト酵素と同様に、４−メチルウンベリフ
ェロールのβ−グルクロニドを開裂させることができる
ことを示した。下記の研究では、酵素開裂に用いられる
基質は、細胞増殖抑制性のダウノマイシンのスペーサー
基によって連結されたβ−グルクロニドであった。これ
らの研究に特異的な方法は、下記のような方法であっ
た。フランス国特許出願明細書（国家登録番号：９１０
５３２６）に記載の化合物であるＮ−（４−ヒドロキシ
−３−ニトロベンジルオキシカルボニル）ダウノルビシ
ンβ−Ｄ−グルクロニド（プロドラッグ）４ｍｇを、２
０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．２ １ｍｌに溶解した。
融合タンパク質（例Ｎ）またはヒトβ−グルクロニダー
ゼ（それぞれの場合の総濃度６．５Ｕ／ｍｌ；１Ｕ＝３
７℃で毎分４−メチルウンベリフェロール１マイクロモ
ルを開裂）３５μｌを、この基質溶液５μｌ量に加え、
暗所で３７℃でインキュベーションした。インキュベー
ション混合物の試料（５μｌ）を様々な時間の後に取り
出して、下記の条件下で高圧液体クロマトグラフィによ
り直ちに分析した。 カラム：ヌクレオシル１００ ＲＰ １８、粒径５μ
ｍ、１２５×４．６ｍｍ。 移動相：溶液Ａ（１００％アセトニトリル）と溶液Ｂ
（２０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ３．０）とのグラディエ
ント。 ０分：３０％溶液Ａ １５分：７０％溶液Ａ ２０分：７０％溶液Ａ 流速：１ｍｌ／分。 検出：蛍光、励起波長４９５ｎｍ、発光波長５６０ｎ
ｍ。 データー分析：ベックマン・システム・ゴールド・ソフ
トウェア(BeckmanSystem Gold Software)。 これらのクロマトグラフィ条件下における出発化合物
（プロドラッグ）の保持時間は１１分であった。インキ
ュベーション中に生成した化合物（ドラッグ）の保持時
間は８．９分であり、ダウノマイシン（ＤＮＭ、同じ条
件下でスタンダードの分析）と同一であった。融合タン
パク質およびヒトβ−グルクロニダーゼによる出発化合
物の開裂の速度論を、それぞれ第１１表および第１０表
に示す。融合タンパク質によるプロドラッグの開裂の半
減期は２．３時間であった。ヒトβ−グルクロニダーゼ
による開裂では、半減期が０．８時間であった。例
（Ｊ）において既に説明したように、この研究の結果
は、融合タンパク質のβ−グルクロニダーゼ部分は機能
的に活性であり、β−グルクロニダーゼを開裂すること
ができることを示している。グルクロニド部分の除去お
よび用いたプロドラッグからのドラッグ（ダウロマイシ
ン）の遊離の速度論では、ヒトβ−グルクロニダーゼに
大きさが匹敵する速度を示すので、融合タンパク質の基
質特異性は本質的にヒトβ−グルクロニダーゼの基質と
杭性と一致する。第１０表： β−グルクロニダーゼ（ヒト、組換え体）によるプロドラッグ開裂の速度論 ｔ（分） プロドラッグ面積（％） ＤＮＭ面積（％） 0 99.2 0.8 57 36.0 64.0 130 10.3 89.7 227 9.3 90.7 第１１表： β−グルクロニダーゼ（融合タンパク質）によるプロドラッグ開裂の速度論 ｔ（分） プロドラッグ面積（％） ＤＮＭ面積（％） 0 98.9 1.1 50 81.1 18.9 135 51.7 48.3 190 33.0 67.0 247 22.0 78.0 317 12.4 87.6
ｍ ＶＨｈｕβＧｌｃ１Ｈ融合タンパク質により開裂す
ることができることの説明 例（Ｊ）には、融合タンパク質のβ−グルクロニダーゼ
部分は、元のヒト酵素と同様に、４−メチルウンベリフ
ェロールのβ−グルクロニドを開裂させることができる
ことを示した。下記の研究では、酵素開裂に用いられる
基質は、細胞増殖抑制性のダウノマイシンのスペーサー
基によって連結されたβ−グルクロニドであった。これ
らの研究に特異的な方法は、下記のような方法であっ
た。フランス国特許出願明細書（国家登録番号：９１０
５３２６）に記載の化合物であるＮ−（４−ヒドロキシ
−３−ニトロベンジルオキシカルボニル）ダウノルビシ
ンβ−Ｄ−グルクロニド（プロドラッグ）４ｍｇを、２
０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．２ １ｍｌに溶解した。
融合タンパク質（例Ｎ）またはヒトβ−グルクロニダー
ゼ（それぞれの場合の総濃度６．５Ｕ／ｍｌ；１Ｕ＝３
７℃で毎分４−メチルウンベリフェロール１マイクロモ
ルを開裂）３５μｌを、この基質溶液５μｌ量に加え、
暗所で３７℃でインキュベーションした。インキュベー
ション混合物の試料（５μｌ）を様々な時間の後に取り
出して、下記の条件下で高圧液体クロマトグラフィによ
り直ちに分析した。 カラム：ヌクレオシル１００ ＲＰ １８、粒径５μ
ｍ、１２５×４．６ｍｍ。 移動相：溶液Ａ（１００％アセトニトリル）と溶液Ｂ
（２０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ３．０）とのグラディエ
ント。 ０分：３０％溶液Ａ １５分：７０％溶液Ａ ２０分：７０％溶液Ａ 流速：１ｍｌ／分。 検出：蛍光、励起波長４９５ｎｍ、発光波長５６０ｎ
ｍ。 データー分析：ベックマン・システム・ゴールド・ソフ
トウェア(BeckmanSystem Gold Software)。 これらのクロマトグラフィ条件下における出発化合物
（プロドラッグ）の保持時間は１１分であった。インキ
ュベーション中に生成した化合物（ドラッグ）の保持時
間は８．９分であり、ダウノマイシン（ＤＮＭ、同じ条
件下でスタンダードの分析）と同一であった。融合タン
パク質およびヒトβ−グルクロニダーゼによる出発化合
物の開裂の速度論を、それぞれ第１１表および第１０表
に示す。融合タンパク質によるプロドラッグの開裂の半
減期は２．３時間であった。ヒトβ−グルクロニダーゼ
による開裂では、半減期が０．８時間であった。例
（Ｊ）において既に説明したように、この研究の結果
は、融合タンパク質のβ−グルクロニダーゼ部分は機能
的に活性であり、β−グルクロニダーゼを開裂すること
ができることを示している。グルクロニド部分の除去お
よび用いたプロドラッグからのドラッグ（ダウロマイシ
ン）の遊離の速度論では、ヒトβ−グルクロニダーゼに
大きさが匹敵する速度を示すので、融合タンパク質の基
質特異性は本質的にヒトβ−グルクロニダーゼの基質と
杭性と一致する。第１０表： β−グルクロニダーゼ（ヒト、組換え体）によるプロドラッグ開裂の速度論 ｔ（分） プロドラッグ面積（％） ＤＮＭ面積（％） 0 99.2 0.8 57 36.0 64.0 130 10.3 89.7 227 9.3 90.7 第１１表： β−グルクロニダーゼ（融合タンパク質）によるプロドラッグ開裂の速度論 ｔ（分） プロドラッグ面積（％） ＤＮＭ面積（％） 0 98.9 1.1 50 81.1 18.9 135 51.7 48.3 190 33.0 67.0 247 22.0 78.0 317 12.4 87.6
【図１】プラスミドｐＧＥＭ４−ＨＵＧＰ１３を示す説
明図。
明図。
【図２】ベクターｐＴＺを示す説明図。
【図３】クローンｐＴＺβＧｌｃ３５０を示す説明図。
【図４】クローンｐＴＺβＧｌｃ３７０を示す説明図
【図５】プラスミドクローンｐＴＺβＧｌｃ４２０を示
す説明図。
す説明図。
【図６】プラスミドクローン（ｐＵＣ ＣＨ１＋Ｈ＋β
Ｇｌｃ４２０）を示す説明図。
Ｇｌｃ４２０）を示す説明図。
【図７】プラスミドクローン（ｐＵＣ ＣＨ１＋Ｈ＋ｈ
ｕβＧｌｃ）を示す説明図。
ｕβＧｌｃ）を示す説明図。
【図８】クローンｐＡＢｓｔｏｐＣＨ１＋Ｈ＋ｈｕβＧ
ｌｃを示す説明図。
ｌｃを示す説明図。
【図９】クローンｐＡＢＳｔｏｐ ４３１／２６ ｈｕ
ｍ ＶＨ ｈｕβＧｌｃ１Ｈを示す説明図。
ｍ ＶＨ ｈｕβＧｌｃ１Ｈを示す説明図。
【図１０】クローンｐＡＢｓｔｏｐ４３１／２６ｖｋを
示す説明図。
示す説明図。
【図１１】ネオマイシン耐性遺伝子を有するプラスミド
を示す説明図。
を示す説明図。
【図１２】メトトレキセート耐性遺伝子を有するプラス
ミドｐＳＶ２を示す説明図。
ミドｐＳＶ２を示す説明図。
【図１３】４３１／２６ｈｕｍ ＶＨｈｕβＧｌｃ １
Ｈ融合タンパク質の模式的説明図。
Ｈ融合タンパク質の模式的説明図。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成４年５月２１日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１８】例（Ｈ） 抗−ＣＥＡ ＭＡｂ ＢＷ ４３１／２６のＶＨ遺伝子
の人体に適合させたものを含むｐＡＢｓｔｏｐベクター
ｐＡＢｓｔｏｐ ＢＷ ４３１／２６ ｈｕｍＶＨ（ボ
スレット・ケイ（Ｂｏｓｓｌｅｔ Ｋ．）ら、Ｅｕｒ．
Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．１４，（１９８８）５２３−５
２８）（人体に適合させたＶＨ及びＶＫ遺伝子の配列に
就いては第３表（表１）を参照されたい）をＨｉｎｄＩ
ＩＩとＢａｍＨＩで開裂し、シグナルエキソン及びＶＨ
エキソンを含む挿入物を単離した。プラスミドクローン
ｐＡＢＳｔｏｐ ＣＨ１＋Ｈ＋ｈｕβＧｌｃをＨｉｎｄ
ＩＩＩで開裂し、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ ４３１
／２６ ｈｕｍ ＶＨフラグメントに連結させた。室温
で２時間連結させた後、７０℃で１０分間インキュベー
ションすることによって連結を停止し、遊離のままの末
端をクレノウポリメラーゼ及びｄＮＴＰで充填した。次
いで、連結を更に一晩行った。形質転換の後、免疫グロ
ブリンＦ（ａｂ′）２遺伝子を、ヒトβ−グルクロニダ
ーゼのコード領域に融合しているヒンジエキソンと共に
含むクローンｐＡＢＳｔｏｐ ４３１／２６ ｈｕｍ
ＶＨ ｈｕβＧｌｃ１Ｈを制限マッピング及び核酸配列
分析の助けによって単離した（図９）。
の人体に適合させたものを含むｐＡＢｓｔｏｐベクター
ｐＡＢｓｔｏｐ ＢＷ ４３１／２６ ｈｕｍＶＨ（ボ
スレット・ケイ（Ｂｏｓｓｌｅｔ Ｋ．）ら、Ｅｕｒ．
Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．１４，（１９８８）５２３−５
２８）（人体に適合させたＶＨ及びＶＫ遺伝子の配列に
就いては第３表（表１）を参照されたい）をＨｉｎｄＩ
ＩＩとＢａｍＨＩで開裂し、シグナルエキソン及びＶＨ
エキソンを含む挿入物を単離した。プラスミドクローン
ｐＡＢＳｔｏｐ ＣＨ１＋Ｈ＋ｈｕβＧｌｃをＨｉｎｄ
ＩＩＩで開裂し、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ ４３１
／２６ ｈｕｍ ＶＨフラグメントに連結させた。室温
で２時間連結させた後、７０℃で１０分間インキュベー
ションすることによって連結を停止し、遊離のままの末
端をクレノウポリメラーゼ及びｄＮＴＰで充填した。次
いで、連結を更に一晩行った。形質転換の後、免疫グロ
ブリンＦ（ａｂ′）２遺伝子を、ヒトβ−グルクロニダ
ーゼのコード領域に融合しているヒンジエキソンと共に
含むクローンｐＡＢＳｔｏｐ ４３１／２６ ｈｕｍ
ＶＨ ｈｕβＧｌｃ１Ｈを制限マッピング及び核酸配列
分析の助けによって単離した（図９）。
【表１】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 16/30 8318−4Ｈ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ 21/08 9161−4Ｂ // Ｃ１２Ｎ 15/09 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 イエルク、チェック ドイツ連邦共和国マールブルク、ヘーエン ウェーク、３ (72)発明者 ツェネク、コラール ドイツ連邦共和国マールブルク、ドイチュ ハウスシュトラーセ、20 (72)発明者 ディーター、ホフマン ドイツ連邦共和国マールブルク、フォイエ ルドルンウェーク、12 (72)発明者 ハンス‐ハラルト、ゼドラツェク ドイツ連邦共和国マールブルク、ゾネンハ ング、３
Claims (18)
- 【請求項１】式ｈｕＴｕＭＡｂ−Ｌ−β−Ｇｌｕｃ（式
中、ｈｕＴｕＭＡｂは人体に適応させた腫瘍特異的単ク
ローン性抗体またはその腫瘍結合性フラグメントであ
り、Ｌはリンカーであり、β−Ｇｌｕｃはヒトβ−グル
クロニダーゼである）を有するプロドラッグ活性化のた
めの融合タンパク質。 - 【請求項２】抗体フラグメントがＶＨエキソン、ＣＨ１
エキソンおよびヒンジエキソンとから成り、ジスルフィ
ドブリッジによって互いに連結されていない融合タンパ
ク質の発現に導く、請求項１に記載の融合タンパク質。 - 【請求項３】抗体フラグメントがＶＨエキソン、ＣＨ１
エキソンおよび２個のヒンジエキソンとから成り、重鎖
フラグメントがジスルフィドブリッジによって互いに連
結されている融合タンパク質の発現に導く、請求項１に
記載の融合タンパク質。 - 【請求項４】抗体フラグメントがＶＨエキソン、ＣＨ１
エキソンおよび３個のヒンジエキソンとから成り、ジス
ルフィドブリッジによって互いに連結されている融合タ
ンパク質の発現に導く、請求項１に記載の融合タンパク
質。 - 【請求項５】抗体フラグメントがＶＨエキソンとＣＨ３
エキソンンとから成り、発現の際にＶＬおよびＣＨ３ド
メインから成る修飾された軽鎖と結合することができ
る、請求項１に記載の融合タンパク質。 - 【請求項６】ｈｕＴｕＭＡｂ部分がＭＡｂ ＢＷ４３１
／３６に由来する、請求項１〜５のいずれか１項に記載
の融合タンパク質。 - 【請求項７】ｈｕＴｕＭＡｂ部分がＥＰ−Ａ１−０ ３
８８ ９１４に記載のＭＡｂの一つから形成される、請
求項１〜５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。 - 【請求項８】Ｌが、表１および／または２に示されるポ
リペプチドスペーサーを含む、請求項１〜７のいずれか
１項に記載の融合タンパク質。 - 【請求項９】Ｌが、ヒトＩｇＧ３ Ｃ遺伝子の１、２ま
たは３ヒンジ領域を含む、請求項１〜８のいずれか１項
に記載の融合タンパク質。 - 【請求項１０】請求項１〜９のいずれか１項に記載のペ
プチドのｃＤＮＡを含むプラスミド。 - 【請求項１１】請求項１０に記載のプラスミドで形質転
換された、形質転換真核細胞。 - 【請求項１２】請求項１〜９のいずれか１項に記載のタ
ンパク質の製造法であって、これらの融合タンパク質を
形質転換細胞中でプラスミドによって発現させ、該融合
タンパク質を抗−イディオタイプＭＡｂを介して単離す
ることを特徴とする方法。 - 【請求項１３】融合タンパク質が酸化剤で処理される、
請求項１〜９のいずれか１項に記載の融合タンパク質。 - 【請求項１４】融合タンパク質が第二の反応段階で還元
的にアミノ化される、請求項１３に記載の融合タンパク
質。 - 【請求項１５】請求項１３に記載の融合タンパク質の製
造法であって、請求項１〜９のいずれか１項に記載の融
合タンパク質を酸化剤で処理することを特徴とする方
法。 - 【請求項１６】請求項１４に記載の融合タンパク質の製
造法であって、請求項１〜９のいずれか１項に記載の融
合タンパク質を第一の反応段階で酸化し、第二の反応段
階で還元的にアミノ化することを特徴とする方法。 - 【請求項１７】医薬としての、請求項１〜９および請求
項１３および１４のいずれか１項に記載の融合タンパク
質。 - 【請求項１８】診断助剤としての、請求項１〜９および
請求項１３および１４のいずれか１項に記載の融合タン
パク質。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4106389A DE4106389A1 (de) | 1991-02-28 | 1991-02-28 | Fusionsproteine zur prodrug-aktivierung, ihre herstellung und verwendung |
| DE4106389.9 | 1991-02-28 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07179500A true JPH07179500A (ja) | 1995-07-18 |
| JP3524933B2 JP3524933B2 (ja) | 2004-05-10 |
Family
ID=6426148
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP07864492A Expired - Lifetime JP3524933B2 (ja) | 1991-02-28 | 1992-02-28 | プロドラッグ活性化のための融合タンパク質、その製造および使用 |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0501215B1 (ja) |
| JP (1) | JP3524933B2 (ja) |
| KR (1) | KR100249576B1 (ja) |
| AT (1) | ATE193326T1 (ja) |
| AU (1) | AU660445B2 (ja) |
| CA (1) | CA2062047C (ja) |
| DE (2) | DE4106389A1 (ja) |
| DK (1) | DK0501215T3 (ja) |
| ES (1) | ES2149159T3 (ja) |
| GR (1) | GR3033708T3 (ja) |
| IE (1) | IE920630A1 (ja) |
| PT (1) | PT501215E (ja) |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4225853A1 (de) * | 1992-08-05 | 1994-02-10 | Behringwerke Ag | Granulozytenbindende Antikörperfragmente, ihre Herstellung und Verwendung |
| DE4233152A1 (de) * | 1992-10-02 | 1994-04-07 | Behringwerke Ag | Antikörper-Enzym-Konjugate zur Prodrug-Aktivierung |
| DE4314556A1 (de) | 1993-05-04 | 1994-11-10 | Behringwerke Ag | Modifizierte Antikörperenzymkonjugate und Fusionsproteine sowie ihre Anwendung zur tumorselektiven Therapie |
| EP0647450A1 (en) * | 1993-09-09 | 1995-04-12 | BEHRINGWERKE Aktiengesellschaft | Improved prodrugs for enzyme mediated activation |
| GB9324807D0 (en) * | 1993-12-03 | 1994-01-19 | Cancer Res Campaign Tech | Tumour antibody |
| DE19513676A1 (de) | 1995-04-11 | 1996-10-17 | Behringwerke Ag | Cytoplasmatische Expression von Antikörpern, Antikörperfragmenten und Antikörperfragmentfusionsmolekülen in E.coli |
| ATE316799T1 (de) * | 1996-03-12 | 2006-02-15 | Sanofi Aventis Deutschland | Neuartige prodrugs für die therapie von tumoren und entzündlichen erkrankungen |
| GB9709421D0 (en) * | 1997-05-10 | 1997-07-02 | Zeneca Ltd | Chemical compounds |
| CA2344440A1 (en) * | 1998-09-18 | 2000-03-30 | Immunomedics, Inc. | Antibody directed enzyme prodrug therapy (edept) with glucoronidase |
| US6361774B1 (en) | 1999-09-17 | 2002-03-26 | Immunomedics, Inc. | Methods and compositions for increasing the target-specific toxicity of a chemotherapy drug |
| US7232888B2 (en) | 2002-07-01 | 2007-06-19 | Massachusetts Institute Of Technology | Antibodies against tumor surface antigens |
| US7834258B2 (en) * | 2003-06-30 | 2010-11-16 | Mu-Hyeon Choe | Dimer of chimeric recombinant binding domain-functional group fusion formed via disulfide-bond-bridge and the processes for producing the same |
| MX2019007795A (es) | 2017-01-03 | 2019-08-16 | Hoffmann La Roche | Moleculas de union a antigeno biespecificas que comprenden el clon 20h4.9 anti-4-1bb. |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| PT80662B (en) * | 1984-06-20 | 1986-12-09 | Sanofi Sa | Process to obtain anti-tumoral glycoprotein modified on its glycidic portions |
| FR2591895B1 (fr) * | 1985-12-20 | 1988-08-26 | Sanofi Sa | Immunotoxines a longue duree d'action in vivo comportant la chaine a de ricine modifiee sur ses motifs polysaccharidiques |
| GB8705477D0 (en) * | 1987-03-09 | 1987-04-15 | Carlton Med Prod | Drug delivery systems |
| NZ225599A (en) * | 1987-08-04 | 1991-09-25 | Bristol Myers Co | Antibody-enzyme conjugates and combinations with prodrugs for the treatment of tumour cells |
| DE3825615A1 (de) * | 1988-07-28 | 1990-02-01 | Behringwerke Ag | Antigenkonstrukte von "major histocompatibility complex" klasse i antigenen mit spezifischen traegermolekuelen, ihre herstellung und verwendung |
| ATE123414T1 (de) * | 1989-01-23 | 1995-06-15 | Akzo Nobel Nv | Ortspezifische in-vivo-aktivierung von therapeutischen arzneimitteln. |
| DE3909799A1 (de) * | 1989-03-24 | 1990-09-27 | Behringwerke Ag | Monoklonale antikoerper (mak) gegen tumorassoziierte antigene, ihre herstellung und verwendung |
| DE68928946T2 (de) * | 1989-12-11 | 1999-10-21 | Immunomedics, Inc. | Verfahren zum aufspüren von diagnostischen oder therapeutischen mitteln durch antikörper |
| DE4002888A1 (de) * | 1990-02-01 | 1991-08-08 | Behringwerke Ag | Anthracyclin-glycosyl-prodrugs, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung in kombination mit funktionalisierten tumorspezifischen enzymkonjugaten |
-
1991
- 1991-02-28 DE DE4106389A patent/DE4106389A1/de not_active Withdrawn
-
1992
- 1992-02-10 PT PT92102197T patent/PT501215E/pt unknown
- 1992-02-10 DK DK92102197T patent/DK0501215T3/da active
- 1992-02-10 ES ES92102197T patent/ES2149159T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-02-10 AT AT92102197T patent/ATE193326T1/de active
- 1992-02-10 EP EP92102197A patent/EP0501215B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1992-02-10 DE DE59209839T patent/DE59209839D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1992-02-26 KR KR1019920002961A patent/KR100249576B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1992-02-27 IE IE063092A patent/IE920630A1/en not_active IP Right Cessation
- 1992-02-27 AU AU11251/92A patent/AU660445B2/en not_active Expired
- 1992-02-28 CA CA002062047A patent/CA2062047C/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-02-28 JP JP07864492A patent/JP3524933B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2000
- 2000-06-16 GR GR20000401398T patent/GR3033708T3/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU1125192A (en) | 1993-01-28 |
| EP0501215B1 (de) | 2000-05-24 |
| CA2062047A1 (en) | 1992-08-29 |
| AU660445B2 (en) | 1995-06-29 |
| PT501215E (pt) | 2000-10-31 |
| EP0501215A3 (en) | 1993-08-11 |
| EP0501215A2 (de) | 1992-09-02 |
| GR3033708T3 (en) | 2000-10-31 |
| CA2062047C (en) | 2007-12-18 |
| JP3524933B2 (ja) | 2004-05-10 |
| DE59209839D1 (de) | 2000-06-29 |
| DE4106389A1 (de) | 1992-09-03 |
| ES2149159T3 (es) | 2000-11-01 |
| DK0501215T3 (da) | 2000-09-18 |
| KR100249576B1 (ko) | 2000-03-15 |
| IE920630A1 (en) | 1992-09-09 |
| ATE193326T1 (de) | 2000-06-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3171268B2 (ja) | 治療抗体基融合タンパク質 | |
| JP2978210B2 (ja) | 二特異性およびオリゴ特異性の一価およびオリゴ価リセプター、それらの調整および使用 | |
| CA2095836C (en) | Cytokine immunoconjugates | |
| US20030139575A1 (en) | Cytokine immunoconjugates | |
| JP3524933B2 (ja) | プロドラッグ活性化のための融合タンパク質、その製造および使用 | |
| JPH1070991A (ja) | 腫瘍関連抗原のためのキメラ免疫グロブリン遺伝子 | |
| JP3776137B2 (ja) | プロドラッグ活性化のための融合タンパク質 | |
| IE83238B1 (en) | Fusion proteins with monoclonal antibody, linker and beta glucuronidase for prodrug activation; preparation and use thereof | |
| US6475486B1 (en) | Glycosyl-etoposide prodrugs, a process for preparation thereof and the use thereof in combination with functionalized tumor-specific enzyme conjugates | |
| KR100387452B1 (ko) | 변형된탄수화물보체를갖는이작용성당단백질및이를포함하는약제학적제제 | |
| JP2000504218A (ja) | リガンド指令酵素プロドラッグ療法 | |
| US6610299B1 (en) | Glycosyl-etoposide prodrugs, a process for preparation thereof and the use thereof in combination with functionalized tumor-specific enzyme conjugates | |
| US7241595B2 (en) | Glycosyl-etoposide prodrugs, a process for preparation thereof and the use thereof in combination with functionalized tumor-specific enzyme conjugates | |
| JP2004507205A (ja) | Ｃａ１９−９抗原陽性細胞の検出および除去のためのポリペプチド | |
| HRP20010149A2 (en) | High-affinity antibodies | |
| JPS63112995A (ja) | 腫瘍関連抗原に特異的なキメラ齧歯類／ヒト免疫グロブリン |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20031209 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20040116 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20040216 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080220 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090220 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100220 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100220 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110220 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120220 Year of fee payment: 8 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120220 Year of fee payment: 8 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130220 Year of fee payment: 9 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term | ||
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130220 Year of fee payment: 9 |