PT2480658T - Método de preparação de vlps derivados de plantas - Google Patents

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Vezina Louis-Philippe
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Paquet Dany
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Description

DESCRIÇÃO
MÉTODO DE PREPARAÇÃO DE VPLS DERIVADOS DE PLANTAS CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a métodos de preparação de partículas semelhantes a vírus derivadas de plantas (VLPs).
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
As atuais estratégias de expressão recombinante em células hospedeiras tais como E. coli, cultura de células de inseto e cultura de células de mamíferos expressam e segregam proteínas a níveis muito elevados nos meios de cultura. Utilizando estes sistemas são alcançados altos níveis de expressão, dobramento de proteínas e modificação pós-tradução das proteínas. Além disso, a purificação da proteína expressa é simplificada, uma vez que as proteínas intracelulares podem ser facilmente segregadas de outros componentes (ADN, vesículas, membranas, pigmentos, etc.) . Para os sistemas de expressão de plantas ou leveduras, a parede celular impede a secreção de proteínas expressas nos meios de cultura.
Um dos principais métodos para combater infeções virais é a vacinação. A produção de vacinas em resposta a um surto ou epidemia, ou para atender às demandas sazonais (por exemplo, a "temporada de gripe" anual que ocorre no outono, ou os recentes surtos de gripe suína observados em todo o mundo) requerem a geração de quantidade suficiente de vacina dado o período de aviso prévio. A produção mundial atual de vacina contra a gripe pode ser insuficiente diante de uma pandemia mundial de gripe. Além disso, as estirpes de gripe dominantes mudam de ano para ano, portanto, fazer reservas em tempos de baixa necessidade no ano não é prático. A produção económica e em grande escala de uma vacina eficaz contra a gripe é de valor significativo.
As partículas semelhantes a vírus (VLPs) podem ser empregues para preparar vacinas contra a gripe. Supraestruturas como VLPs imitam a estrutura da cápside virai, mas carecem de um genoma e, portanto, não podem replicar ou fornecer um meio para uma infeção secundária. As VLPs oferecem uma alternativa melhorada aos antigenos recombinantes isolados (solúveis) para estimular uma forte resposta imune. As VLPs são montadas sobre a expressão de proteínas virais específicas e apresentam uma superfície externa semelhante à do seu vírus cognado, mas, ao contrário da verdadeira partícula virai, não incorporam material genético. A apresentação de antigenos em uma estrutura particulada e multivalente semelhante à do vírus nativo atinge uma estimulação reforçada da resposta imune com componentes equilibrados de humor e celulares. Considera-se que essa melhoria em relação à estimulação por antigénios isolados é particularmente verdadeira para vírus envolvidos à medida que as VLP envolvidas apresentam os antigenos de superfície em seu estado natural ligado à membrana (Grgacic e Anderson, 2006, Methods 40, 60-65). Além disso, as VLPs da gripe, com a organização das nano partículas, mostraram ser melhores candidatos vacinais em comparação com a hemaglutinina recombinante (HA) (ou seja, HA monomérico ou HA organizado em rosetas, montagem de 3-8 trímeros de HA) e são capazes de ativar a resposta imune humoral e celular. (Bright, RA, et. al., 2007, Vaccine 25, 3871-3878). A grande maioria das vacinas contra a gripe atualmente no mercado são compostos de partículas virais ou antigenos de vírus obtidos a partir de viriões cultivados em ovos. A produção de vacinas derivadas de ovos depende da cultura de vírus vivos em ovos de galinha embrionados. As vacinas contra a gripe dividida são obtidas após inativação química e rutura de viriões purificados com detergente. Os antigenos da gripe recombinante são uma alternativa efetiva aos antigenos derivados de virus como produtos de vacina pandémica. Os antígenos recombinantes podem ser produzidos a partir de informações sobre a composição genética de uma nova estirpe uma vez que esta informação está disponível e permite uma rápida iniciação do processo de produção. Contudo, as subunidades de HA recombinante purificadas parecem menos eficazes do que as vacinas de gripe dividida inativada e é necessário um maior teor de antigénio para gerar uma resposta imune potente (Treanor et al., 2007, J. Am. Med. Assoe. 297, 1577-1582) .
As VLP de gripe foram obtidas em células de mamíferos cultivadas a partir da co-expressão de todas as 10 proteínas da gripe (Mena et al., 1996, J. Virol. 70, 5016-5024). Várias proteínas virais são dispensáveis para a produção de VLPs e VLP de gripe em programas de desenvolvimento de vacinas foram produzidas a partir da co-expressão das 2 principais proteínas de envelope antigénico (HA e NA) com Ml ou da co-expressão de HA e Ml só (Kang et al., 2009, Virus Res. 143, 140-146). Chen et al. (2007, J. Virol. 81, 7111-7123) demonstraram que o HA sozinho é capaz de gerar formação de VLP e brotação e a coexpressão Ml pode ser omitida no seu sistema. No entanto, uma vez que o HA foi encontrado para se ligar a glicoproteínas sialiladas na superfície das células de mamífero que produzem as VLPs, uma sialidase virai foi co-expressa para permitir a libertação de VLPs da célula produtora após o broto.
Um sistema de produção de VLP mais simples, por exemplo, que se baseia na expressão de apenas uma ou algumas proteínas virais, sem necessidade de expressão de proteínas virais não estruturais, é desejável para acelerar o desenvolvimento de vacinas. A produção de antígenos virais, incluindo VLPs, em sistemas de plantas proporciona uma vantagem para a produção, na medida em que podem ser cultivadas em estufa ou campo e não requerem métodos de cultura de tecido asséptico e manuseio. A Publicação PCT WO 2006/119516(para Williamson e Rybicki) descreve a expressão de H5 HA otimizado de comprimento total e truncado humano codificado de Influenza A/Vietnam/ 1194/2004 em plantas. A construção truncada não possui o domínio de ancoragem da membrana. A maior acumulação de proteína HA foi obtida com construções que visavam o ER. As construções que não possuíam um domínio de segmentação de membrana não produzam HA detetável. A produção de VLPs não foi relatada. A produção de VLP HA da gripe que compreende um envelope lipídico foi previamente descrita pelos inventores na WO 2009/009876 e WO 2009/076778 (para D'Aoust et al.) e D'Aoust et al. (2008, Plant Biotechnol. J. 6: 930-940). Para vírus envolvidos, pode ser vantajoso que uma camada lipídica ou membrana seja retida pelo vírus. A composição do lípido pode variar com o sistema (por exemplo, um vírus envolvido produzido por planta inclui lipídios vegetais ou fito esteróis no envelope) e pode contribuir para uma resposta imune melhorada. A montagem de VLPs envolvidas em tabaco transgénico que expressa o antígeno de superfície HBV (HBsAg) foi descrita por Mason et al. (1992, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89, 11745-11749) . As VLP de HBV produzidas em planta mostraram induzir potentes respostas imunes de células B e T em ratos quando administradas por via parenteral (Huang et al., 2005, Vaccine 23, 1851-1858), mas a imunização oral através de estudos alimentares induziu apenas uma resposta imune modesta (Smith et al., 2003, Vaccine 21, 4011-4021). Greco (2007, Vaccine 25, 8228-8240) mostraram que os epítopos do vírus da imunodeficiência humana (HIV) em fusão com HBsAg se acumulavam como VLP quando expressos em tabaco transgénico e Arabidopsís, criando uma vacina VLP bivalente. A expressão da proteína da cápside viral (NVCP) em tabaco transgénico e plantas de batata resultou na montagem de VLP não envolvidas (Mason et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93, 5335-5340) . As VLP NVCP foram produzidas em folhas de N. benthamiana (filtro agroinfiltrado)Huang et al. 2009, Biotechnol. Bioeng. 103, 706-714) e a sua imunogenicidade após administração oral demonstrada em ratinhos (Santi et al., 2008, Vaccine 26, 1846-1854). A administração de 2 ou 3 doses de batatas cruas contendo 215-751 pg de NVCP sob a forma de VLPs para voluntários adultos saudáveis resultou no desenvolvimento de uma resposta imune em 95% dos voluntários imunizados (Tacket et al. 2000, J. Infect. Dis. 182, 302-305). As VLP não envolvidas também foram obtidas a partir da expressão do antigeno do núcleo de HBV (HBcAg; Huang et al., 2009, Biotechnol. Bioeng. 103, 706-714), e a proteína Ll principal da proteina da cápside do virus do papilomavírus humano (HPV) (Varsani et al., 2003, Arch. Virol. 148, 1771-1786).
Pode ser desejável separar as VLPs de algumas, ou todas as proteínas, carboidratos, etc. presentes na planta ou na matéria vegetal antes da VLP ser utilizada na formulação da vacina. Um método para extrair proteína do espaço intercelular de plantas, que compreende um processo de vácuo e centrifugação para proporcionar um extrato de fluido intersticial compreendendo a proteína de interesse é descrito na Publicação PCT WO 00/09725 (para Turpen et al.). Esta abordagem é adequada para proteínas pequenas (de 50 kDa ou menores) que passam através de poros sob vácuo e centrifugação, mas não são adequadas para proteínas de superestrutura maiores ou complexos de proteínas tais como uma VLP.
McCormick et al 1999 {Proc Natl Acad Sci USA 96: 703-708) descreve a utilização de um péptido de sinal de amilase de arroz fundido em um epítopo de Fv (scFv) de cadeia simples para direcionar a proteína expressa para o compartimento extracelular, seguido de infiltração de vácuo de folha e tecido de caule para recuperação dos polipéptidos scFv. Moehnke et al., 2008 (Biotechnol Lett 30: 1259-1264) descreve o uso do método de infiltração a vácuo de McCormick para obter um alergénio de planta recombinante de tabaco usando uma extração apoplástica. A Publicação PCT WO 2003/025124 (para Zhang et al) descreve a expressão de imunoglobulinas scFv em plantas, visando o espaço apoplásico usando sequências de sinal murino. Fischer et al. 1999 (J Imm Meth 226: 1-10) descreve a purificação por afinidade de um anticorpo recombinante de tamanho completo a partir de uma cultura em suspensão de tabaco.
Dada a complexidade das VLP e do tecido vegetal em que podem ser produzidas, são desejados os métodos de preparação de VLPs que são substancialmente livres ou facilmente separados das proteínas vegetais, mantendo as características estruturais e imunogénicas do vírus envolvido.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO O âmbito da invenção é determinado pelas reivindicações anexas. A presente invenção refere-se a métodos de preparação de partículas semelhantes a vírus derivadas de plantas (VLPs). Mais especificamente, a presente invenção é dirigida a métodos de preparação de VLPs compreendendo antigénios de gripe. É um objetivo da invenção proporcionar um método melhorado de preparação de partículas semelhantes a vírus derivadas de plantas. A presente invenção proporciona um método (A) de preparação de VLP derivadas de plantas compreendendo a obtenção de uma matéria vegetal ou vegetal compreendendo VLPs derivadas de plantas localizadas dentro do apoplastoo; produzindo uma fração de protoplastos e apoplastoos, a fração apoplastoo compreendendo VLP derivadas de plantas; e recuperando a fração apoplastoo. 0 método pode ainda compreender um passo de purificação das VLP derivadas da planta a partir da fração apoplasto. A VLP derivada de planta pode ser uma VLP derivada de planta quimérica. A VLP derivada da planta pode ser selecionada do grupo de proteínas de envelope virai, proteínas estruturais virais, proteínas de cápside virai e proteínas de revestimento viral. As VLP derivadas da planta podem compreender a hemaglutinina da gripe.
As frações apoplasto e protoplasto podem ser produzidas por tratamento da planta ou matéria vegetal por uma composição enzimática. A composição enzimática compreende uma ou mais de uma celulase, ou uma ou mais de uma pectinase e uma ou mais de uma celulase. Além disso, se desejado, a composição enzimática não inclui uma lipase ou protéase, ou a composição não inclui uma lipase ou protéase adicionada. A planta ou matéria vegetal pode ser obtida por crescimento, colheita ou crescimento e colheita da planta. A matéria da planta pode incluir parte ou a totalidade da planta, uma ou mais de uma folha, caules ou raízes. A presente invenção proporciona um método de preparação de VLP derivadas de plantas como descrito acima (Método A), em que um ácido nucleico que codifica o VLP selecionado do grupo de proteínas de envelope virai, proteínas estruturais virais, proteínas de cápside virai e proteínas de revestimento virai é introduzido em a planta de forma transitória. Em alternativa, o ácido nucleico está integrado de forma estável dentro de um genoma da planta. A presente invenção proporciona um método de preparação de VLP derivadas de plantas como descrito acima (Método A) compreendendo ainda um passo de purificação das VLP derivadas da planta a partir da fração apoplasto. 0 passo de purificação pode compreender filtrar a fração apoplasto utilizando filtração em profundidade para produzir um extrato clarificado, seguido de cromatografia do extrato clarificado utilizando uma resina de permuta catiónica.
Sem pretender ser limitado pela teoria, as proteínas obtidas a partir do apoplasto são mais homogéneas, uma vez que as formas intermediárias de proteínas modificadas pós-tradução ou proteínas que compreendem outros tipos de processamento que ocorrem em vários compartimentos intracelulares não são co-extraídos. Um maior grau de homogeneidade de uma proteína recombinante tipicamente resulta numa qualidade superior de uma preparação que compreende a proteína e pode resultar em um produto com propriedades benéficas incluindo maior potência, meia-vida mais longa ou melhor capacidade imunogénica. Por exemplo, as proteínas do sangue contendo glicosilação com alto teor de manose são eliminadas na circulação sanguínea mais rapidamente do que as proteínas que compreendem glicosilação complexa. Uma proteína glicosilada produzida na fração apoplástica apresenta uma glicosilação de tipo mais complexo. Assim sendo, uma proteína derivada de apoplasto preparada usando os métodos aqui descritos, envolvendo digestão de parede celular, exibem, por exemplo, uma meia vida melhor em circulação. A presente invenção também proporciona um método (B) de preparação de VLP derivadas de plantas compreendendo um envelope lipídico derivado da planta, compreendendo o método, a obtenção de uma planta ou matéria vegetal compreendendo VLP localizadas dentro do apoplasto; tratamento da planta ou matéria vegetal com uma composição enzimática para produzir uma fração de protoplastos e uma ou mais de uma composição proteica apoplásica; separando um ou mais de um complexo de proteína apoplástica da fração de protoplastos, em que o um ou mais de um complexo de proteína apoplásica compreende os VLPs. A composição enzimática compreende uma ou mais de uma celulase, ou uma ou mais de uma pectinase e uma ou mais de uma celulase. Além disso, se desejado, a composição enzimática não inclui uma lipase ou protéase, ou a composição não inclui uma lipase ou protéase adicionada. A VLP derivada de planta pode ser uma VLP derivada de planta quimérica. A VLP derivada da planta pode ser selecionada do grupo de proteínas de envelope virai, proteínas estruturais virais, proteínas de cápside virai e proteínas de revestimento viral. As VLP derivadas da planta podem compreender a hemaglutinina da gripe. A presente invenção proporciona um método de preparação de VLP derivadas de plantas como descrito acima (Método B), em que um ácido nucleico que codifica o VLP selecionado do grupo de proteínas de envelope virai, proteínas estruturais virais, proteínas de cápside virai e proteínas de revestimento virai é introduzido em a planta de forma transitória. Em alternativa, o ácido nucleico está integrado de forma estável dentro de um genoma da planta. A presente invenção proporciona um método de preparação de VLP derivadas de plantas como descrito acima (Método B) compreendendo ainda um passo de purificação das VLP derivadas da planta a partir da fração apoplasto. 0 passo de purificação pode compreender filtrar a fração apoplasto utilizando filtração em profundidade para produzir um extracto clarificado, seguido de cromatografia do extrato clarificado utilizando uma resina de permuta catiónica.
As VLP derivadas da planta podem incluir VLPs compreendendo um ou mais polipéptidos HA da gripe. 0 polipéptido HA da gripe também pode ser um polipéptido HA quimérico. As VLP derivadas de plantas podem ainda compreender atividade hemaglutinante. A matéria vegetal ou vegetal pode ser obtida por crescimento, colheita ou crescimento e colheita da planta. Δ matéria da planta pode incluir parte ou a totalidade da planta, ou uma ou mais de uma folhas, hastes ou raízes. A presente invenção também proporciona um método (C) de preparação de VLP derivadas de plantas, compreendendo a obtenção de uma matéria vegetal ou vegetal compreendendo VLPs derivadas de plantas, digerindo a matéria da planta usando uma composição de enzima degradante de parede celular para produzir uma fração digerida e filtragem fração para produzir uma fração filtrada e recuperação das VLP derivadas da planta da fração filtrada. A composição enzimática pode compreender uma ou mais de uma pectinase, uma ou mais de uma celulase, ou uma ou mais de uma pectinase e uma ou mais de uma celulase. Além disso, se desejado, a composição enzimática não inclui uma lipase ou protéase, ou a composição não inclui uma lipase ou protéase adicionada. A VLP derivada de planta pode ser uma VLP derivada de planta quimérica. A VLP derivada da planta pode ser selecionada do grupo de proteínas de envelope virai, proteínas estruturais virais, proteínas de cápside virai e proteínas de revestimento viral. As VLP derivadas da planta podem compreender a hemaglutinina da gripe. A presente invenção proporciona um método de preparação de VLP derivadas de plantas como descrito acima (Método C), em que um ácido nucleico que codifica o VLP selecionado do grupo de proteínas de envelope virai, proteínas estruturais virais, proteínas de cápside virai e proteínas de revestimento viral é introduzido em a planta de forma transitória. Alternativamente/ o ácido nucleico está integrado de forma estável dentro de um genoma da planta. A presente invenção proporciona um método de preparação de VLP derivadas de plantas como descrito acima (Método C) compreendendo ainda um passo de separação das VLP na fração filtrada dos restos celulares e materiais insolúveis. 0 passo de separação pode ser realizado por centrifugação, por filtração em profundidade ou por incomparável centrifugação e filtração em profundidade para produzir uma fração clarificada. As VLP derivadas da planta podem ser adicionalmente purificadas por cromatografia, por exemplo, o extrato clarificado pode ser purificado utilizando uma resina de permuta catiónica.
As VLP derivadas da planta podem incluir VLPs compreendendo um ou mais polipéptidos HA da gripe. 0 polipéptido HA da gripe também pode ser um polipéptido HA quimérico. As VLP derivadas de plantas podem ainda compreender atividade hemaglutinante. A matéria vegetal ou vegetal pode ser obtida por crescimento, colheita ou crescimento e colheita da planta. A matéria da planta pode incluir parte ou a totalidade da planta, ou uma ou mais de uma folhas, hastes ou raizes.
Sem pretender ser limitado pela teoria, as VLP feitas em plantas, que compreendem lipídios derivados da planta, podem induzir uma reação imune mais forte do que as VLPs feitas em outros sistemas de fabricação e que a reação imune induzida por estas VLPs produzidas em plantas é mais forte quando comparada à reação imune induzida por vacinas de vírus inteiros vivas ou atenuadas. A composição de um extrato de proteína obtido a partir de uma célula hospedeira é complexa e tipicamente compreende componentes intercelulares e intracelulares juntamente com uma proteína ou supraestrutura de interesse a ser isolada. A preparação de uma fração apoplástica, seguida de um passo para segregar as proteínas e componentes intracelulares, é vantajosa uma vez que a proteína ou a supraestrutura de interesse pode ser enriquecida e aumentar a eficiência dentro de um processo de fabricação. Ter um processo mais simples, que compreende menos etapas eficientes, pode resultar em aumentos significativos de rendimento e redução de custos. Verificou-se também que o processo de digerir a parede celular usando enzimas degradantes da parede celular aumenta o rendimento da proteína VLP, mesmo que os protoplastos não permaneçam intactos durante o procedimento de extração. Sem querer estar vinculado pela teoria, o passo da digestão da parede celular pode afrouxar os componentes poliméricos da parede das células e auxiliar na liberação das VLPs de outra forma associadas na parede celular. Este protocolo também pode minimizar a contaminação das VLPs nos componentes intracelulares. Métodos para digerir a parede celular da planta são conhecidos, e misturas de cocktail enzimático que digerem paredes celulares podem variar.
Os métodos aqui descritos resultam em menos interrupção e contaminação de um extrato de VLP derivado de plantas quando comparados com métodos para a preparação de VLPs derivadas de plantas envolvendo homogeneização, mistura ou moagem. Os métodos aqui descritos proporcionam uma fração apoplasto do tecido vegetal e que podem manter a integridade dos protoplastos e seus componentes. 0 método como aqui descrito é eficaz na purificação de VLPs, mesmo que os protoplastos, ou uma porção de protoplastos, percam sua integridade e não estejam mais intactos.
Esses métodos fornecem um maior rendimento de VLPs quando comparados aos métodos de extração de VLP envolvendo técnicas padrão de rutura de tecido, por exemplo, homogeneização, mistura ou moagem. 0 maior rendimento pode ser devido, em parte, a uma redução das forças de cisalhamento que perturbam a integridade estrutural das VLPs e/ou o envelope lipidico. A preparação de VLPs a partir de uma fração apoplástica pode ser vantajosa, uma vez que as frações apoplásticas são significativamente reduzidas ou isentas de proteínas citoplasmáticas. Portanto, a separação de VLP de outras proteínas e matéria, incluindo monómeros de HA, trímeros ou fragmentos de HA, na fração apoplásica é facilmente realizada. No entanto, também podem ser obtidos rendimentos aumentados de VLP utilizando os métodos aqui descritos, mesmo que a preparação de protoplastos, ou uma porção da preparação de protoplastos, não esteja intacta.
As VLP da presente invenção são também caracterizadas como exibindo uma maior atividade hemaglutinante do que as obtidas usando técnicas padrão de rutura de tecido. Esta atividade hemaglutinante melhorada pode resultar de um maior rendimento de VLP intactas (menos monómeros de HA ou trímeros livres em solução), um maior rendimento de VLPs intactas com envelopes de lípidos intactos ou uma combinação destes.
As vacinas feitas com VLPs fornecem a vantagem, quando comparadas às vacinas feitas de vírus inteiros, de que não são infeciosas. Portanto, a contenção biológica não é um problema e não é necessária para a produção. As VLP produzidas em plantas oferecem uma vantagem adicional, permitindo que o sistema de expressão seja cultivado em estufa ou campo, sendo, portanto, significativamente mais económico e adequado para aumentar a escala.
Além disso, as plantas não compreendem enzimas envolvidas na síntese e na adição de resíduos de ácido siálico às proteínas. As VLPs podem ser produzidas na ausência de neuraminidase (NA), e não há necessidade de co-expressar NA, ou para tratar células produtoras ou extrair com sialidase (neuraminidase), para garantir a produção de VLP em plantas
Este resumo da invenção não descreve necessariamente todas as caracteristicas da invenção.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
Estas e outras caracteristicas da invenção tornar-se-ão mais evidentes a partir da descrição a seguir em que se faz referência aos desenhos anexos em que: A Figura 1 mostra uma representação esquemática da cassete de expressão baseada em CPMVHT (construção 685) para a expressão da hemaglutinina H5 A/Indonesia/5/05. A Figura 2 mostra A) a sequência de ácido nucleico (SEQ ID NO: 1) de uma porção de construção para expressar H5/ Indo (número de construção 685) de Pad (a montante do promotor 35S) para Asei (imediatamente a jusante do terminador NOS) . A sequência de codificação de H5 de A/ Indonesia/5/2005 está sublinhada. A Figura 2B mostra a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 2) de H5 A/Indonésia/ 5/05 hemaglutinina codificada pela construção número 685. A Figura 3 mostra a caracterização das estruturas contendo hemaglutinina (HA) por cromatografia de exclusão por tamanho (SEC). Após centrifugação do extrato de planta digerido, o sedimento foi ressuspenso e fracionado por SEC. A Figura 3A mostra o teor total de proteína solúvel por fração (triângulos sólidos, % do eixo Y máximo, lado esquerdo, determinado usando o método de Bradford). A atividade hemaglutinante das frações coletadas (barras sólidas, eixo Y do lado direito) também é mostrada. A Figura 3B mostra análise de SDS-PAGE de frações eluídas de SEC. As frações foram precipitadas por acetona e ressuspensas em 1/40 de volume de tampão de carga de amostra redutora antes da análise. 0 gel foi corado com 0,1% de solução de Coomassie R-250. VLPs purificados foram executados como um controlo. A banda correspondente ao monómero HAO é indicada por uma seta. MW - Padrões de peso molecular (kDa); C - VLPs purificadas (controlo); as linhas 7 a 10 e 14 a 16 correspondem ao número de frações eluidas da análise de SEC, mostrado na Figura 3A. A Figura 4 mostra uma comparação dos perfis proteicos obtidos após digestão enzimática e por homogeneização mecânica usando um homogeneizador Comitrol™. As amostras foram tratadas em tampão de carga de amostra desnaturante e as proteínas foram separadas por análise SDS-PAGE de frações de eluição. Os géis foram corados com 0,1% de solução de Coomassie R-250. MW - Padrões de peso molecular (kDa); pista 1 - 25 μΐ de mistura de enzimas; pista 2 - 25 μΐ de digestão enzimática do tecido vegetal e da pista 3 - 5 μΐ de extrato obtido com o homogeneizador Comitrol. A Figura 5 mostra a sequência de ácido nucleico (SEQ ID NO: 9) de uma cassete de expressão HA compreendendo promotor de plastocianina de alfafa e 5' UTR, sequência de codificação de hemaglutinina de H5 de A/Indonesia/5/2005 (Construção # 660), plastacianina de alfafa 3' UTR e sequências de terminação. A Figura 6 mostra a captura de HA-VLP na resina de permuta catiónica formando diretamente a separação de HA-VLP na fração apoplástica. As amostras foram tratadas em tampão de carga de amostra desnaturante não redutor e as proteínas foram separadas por SDS-PAGE. Os géis foram corados com 0,1% de solução de Coomassie R-250. Pista 1: fração apoplásica após centrifugação, pista 2-3: fração apoplásica após microfiltração sucessiva; Pista 4: carga da troca catiónica; Pista 5: Fluxo através da fração da troca catiónica. Pista 6; eluição de troca catiónica, concentrada 10X; Pista 7: padrões de peso molecular (kDa). A Figura 7 mostra o perfil de análise de rastreamento de Nanoparticle (NTA) de H5/Indo VLP (A) e HL/Cal VLP (B) após esclarecimento sem adição de NaCl ao tampão de digestão e de Hl/Cal VLP (C) com esta adição. As experiências NTA foram realizados com NanoSight LM20 (NanoSight, Amesbury, Reino Unido). O instrumento está equipado com um laser azul (405 nm), uma câmara de amostra e um o-ring de fluoroelastómero de Viton. Os vídeos foram gravados à temperatura ambiente e analisados usando o software NTA 2.0. As amostras foram gravadas por 60 seg. O obturador e o ganho foram escolhidos manualmente para que a resolução de partículas ideal fosse obtida. A Figura 8 mostra um Western blot de extrato de H3/Brisbane VLP gerado por digestão enzimática utilizando diferentes tampões. Pista 1) Padrão de HA recombinante puro (5 pg, de Immune Technology Corp. IT-003-0042p) A pista 2 a 5 contém 7 μΐ de extrato enzimático centrifugado realizado nos seguintes tampões: Pista 2) Mannitol 600 mM + citrato 125 mM + NaMPO 4 75 mM + 25 mM de EDTA + 0,04% de bisulfito pH 6,2, Pista 3) 600 mM manitol + 125 mM citrato + 75 mM de NaPO 4 + 50 mM de EDTA + 0,04% de bisulfito pH 6,2, Pista 4) 200 mM manitol + 125 mM citrato + 75 mM NaPO 4 + 25 mM EDTA + 0,03% bissulfito pH 6,2, pista 5) manitol 200 mM + citrato 125 mM + NaPO 4 75 mM + EDTA 50 mM + bissulfito 0,03% pH 6,2. A seta representa o sinal de imunodeteção de HA0.
DESCRIÇÃO DETALHADA A presente invenção refere-se a métodos de preparação de partículas semelhantes a vírus derivadas de plantas (VLPs). Mais especificamente, a presente invenção é dirigida a métodos de preparação de VLPs compreendendo hemaglutinina de gripe (HA). A descrição a seguir é de uma forma de realização preferida. A presente invenção proporciona um método para a obtenção de uma proteína, ou supraestrutura de proteína de interesse. A proteína de interesse pode estar presente no compartimento apoplasto ou extracelular, correspondendo à porção de células vegetais, excluindo o compartimento de protoplastos/ esferoplastos. 0 método envolve a remoção, a digestão ou a digestão e a remoção da parede celulósica das células da planta que circunda as células da planta. Ao digerir a parede celular, os componentes poliméricos da parede celular são afrouxados, e a supraestrutura de proteína ou proteína de interesse pode ser mais prontamente liberada. Ao utilizar este método, a supraestrutura de proteína ou proteína de interesse é enriquecida, uma vez que o compartimento de protoplastos/esferoplastos que contém uma maior parte das proteínas e componentes da célula hospedeira é segregado do apoplasto. Conforme observado abaixo, o método aqui proporcionado ainda é eficaz na obtenção de uma supraestrutura de proteína ou proteína de interesse se, durante o processo, a integridade do compartimento protoplasto/esférico estiver perdida, se o compartimento protoplasto/esférico não estiver intacto e se uma porção de proteínas e componentes das células hospedeiras do compartimento protoplasto/esférico estiver presente na fração apoplasto.
Exemplos de supraestruturas de proteínas são estruturas constituídas por dois ou mais polipéptidos; os polipéptidos podem ser iguais ou diferentes; se diferentes, podem estar presentes numa proporção de cerca de 1:1 a cerca de 10:1 ou superior. A supraestrutura de proteínas pode ainda compreender um ou mais lípidos, fosfolípidos, ácidos nucleicos, membranas ou semelhantes. Os dois ou mais polipéptidos podem ser ligados por uma ligação covalente, uma ponte de dissulfureto, uma interação de carga, uma atração hidrofóbica, forças de van der waals, ligações de hidrogénio ou semelhantes. Um exemplo de uma supraestrutura de proteínas é uma partícula semelhante a vírus (VLP), que pode ser envolvida, ou não envolvida, por exemplo, uma proteína de envelope virai, uma proteína estrutural virai, uma proteína de cápside virai ou uma proteína de revestimento virai. A presente invenção também proporciona um método de preparação de partículas semelhantes a vírus derivadas de plantas (VLPs). 0 método envolve a obtenção de uma matéria vegetal ou vegetal compreendendo VLPs derivadas de plantas localizadas dentro do apoplasto; produzindo uma fração de protoplastos/esferoplastos e uma fração de apoplasto da matéria da planta, a fração de apoplasto compreendendo VLPs derivadas de plantas e recuperando a fração apoplasto. Se desejado, as VLP derivadas da planta podem ser purificadas a partir da fração apoplasto. A presente invenção também proporciona um método de preparação de VLPs compreendendo um envelope lipídico derivado de plantas. 0 método inclui a obtenção de uma planta ou matéria vegetal compreendendo VLPs, tratando a planta ou matéria vegetal com uma composição de enzima para produzir um ou mais de um complexo de proteína apoplástica e uma fração de protoplastos/esferoplastos e separando uma ou mais de uma proteína apoplástica complexo da fração de protoplastos. 0 um ou mais de um complexo de proteína apoplástica compreende os VLPs compreendendo um envelope lipídico derivado da planta. A presente invenção também proporciona um método de preparação de VLP derivadas de plantas, compreendendo a obtenção de uma matéria vegetal ou vegetal que compreende as VLP derivadas de plantas, digerindo a matéria vegetal usando uma composição de enzima degradante de parede celular para produzir uma fração digerida e filtrando a fração digerida para produzir uma fração filtrada e recuperar as VLP derivadas da planta da fração filtrada. Neste método, a integridade dos protoplastos pode não ser necessária.
Um protoplasto é uma célula vegetal que teve sua parede ou!!! p:âfçi;|i||él:iill| reiiifildá,. um|||||||: esferoplasto pode ter remoção parcial da parede celular. Um protoplasto, um esférico ou um protoplasto e esférico (protoplastos/esferoplastos) podem ser utilizados como aqui descrito, e os termos aqui utilizados são intercambiáveis. A parede celular pode ser interrompida e removida mecanicamente (por exemplo, via homogeneização, mistura), a parede celular pode ser completamente ou parcialmente digerida enzimatieamente, ou a parede celular pode ser removida usandouma combinação de métodos mecânicos e enzimáticos, por exemplo, homogeneização seguida de tratamento com enzimas para digestão da parede celular*
Os trabalhos de referência padrão que estabelecem os princípios gerais da cultura de tecidos vegetais, células vegetais cultivadas e produção de protoplastos, esferoplastos e semelhantes incluem: Introduction to Plant Tissue Culture, by MK Razdan 2nd 3d. (Science Publishers, 2003), ou veja, por exemplo, o seguinte URL: molecular-plant-biotechnology .info/plant-tissue-culture/protoplast-isolation.htm. Métodos e técnicas relacionadas à produção e manipulação de protoplastos (ou esferoplastos) são revistas, por exemplo, em Davey MR et al,, 2005 (Biotechnology Advances 23: 131-171) . Os trabalhos de referência padrão que estabelecem os métodos e princípios gerais de bioquímica de proteínas, biologia molecular e similares incluem, por exemplo, Ausubel et al, Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nova York (1998 e suplementos para 2001)); Sambrook et al, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, Nova York, 1989; Kaufman et al., Eds Handbook Of Molecular And Cellular Methods In Biology And Medicine, CRC Press, Boca Raton ,1395; McPherson, Ed., Directed Mutagenesis; A Practical Approach, IRL Press, Oxford, 1991.
As enzimas úteis para digerir ou degradar paredes celulares de plantas para libertação ou protoplastos ou esferoplastos são conhecidas pelos especialistas na técnica e podem incluir celulase (EC 3.2.1.4), pectinase (EC 3.2.1.15), xilanase (EC 3.2,1.8), quítinases {EC 3.2.1.14), hemicelulase, ou uma combinação destes. Exemplos não limitativos de enzimas adequadas incluem uma mistura de enzimas de componentes múltiplos compreendendo celulase, hemicelulase e pectinase, por exemplo MACEROZYME" (contendo aproximadamente: Celulase: 0,1 U/mg, Hemicelulase: 0,25 'J/mg e Pectinase: 0,S U/ mg). Outros exemplos de enzimas comerciais, misturas de enzimas e fornecedores estão listados na Tabela 1 (ver: Introduction to Plant Tissiie Culture, by MK Razdan 2nd Ed. ., Science Publishers, 2003)*
Nomes alternativos e tipos de eelulases incluem endo-1,4-p~ D-glucanase; P-l,4-glucanase; β-l,4-endoglucan hidrolase; celulase A; AP de celulosina; endoglucanase D; celulase alcalina; celulase A 3; celludextrinase; 9>5 celulase; avicelase; pancelase SS e 1,4- (1,3; 1,4) -PD- glucano 4-glucano-hidrolase. Os nomes alternativos e os tipos de pectinases (poligalacturonases) incluem a depolimerase de pectina; pectinase; endopolilgaluturonase; pectolase; pectina hidrolase; pectina po1igalacturonase; endo- poligalacturonase; poli-a-1,4-galacturonido gliceano- hidrolase; endogalacturonase; endo-D-galacturonase e glicano-hidrolase de poli (1,4-a-D-galacturonido). Os nomes alternativos e os tipos de xilanases incluem hemicelulase/ 4-xilano-hidrolase de endo- (1 4) -p-xilano; endo-1,4- xilanase; xilanase; β-l,4-xilanase; endo-1,4-xilanase; endo-p-1,4-xilanase; endo-1,4-p-D-xilanase; 1, 4-p-xilano xilanohidrolase; β-xilanase; 3-l,4-xilano xilano-hidrolase; endo-1,4-p-xilanase; β-D-xilanase. Nomes alternativos e tipos de quitinases incluem chitodextrinase; 1,4-p-poli-N- acetilglucosaminidase; poli-p-glucosaminidase; β-1,4-ρο1ί- N- acetil glucosamidinasa; poli [1,4- (N -acetil-p-D-glucosaminida)] glicano-hidrolase.
Tabela 1: Exemplos não limitantes de enzimas comercialmente disponíveis para isolamento de protoplastos
A escolha de uma determinada enzima ou combinação de enzimas, e as condições de concentração e de reação podem depender do tipo de tecido vegetal utilizado a partir do qual é obtida a fração de protoplastos e apoplasto compreendendo as VLPs. Uma mistura de celulase, hemicelulase e pectinase, por exemplo, uma pectinase MACEROZYME™ ou Multi feet, pode ser utilizada numa concentração que varia de 0,01% a 2,5% (v/ v), por exemplo 0,01, 0,02, 0,04, 0,06, 0,08 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, ou 2,5% (v/v), ou qualquer quantidade entre eles. MACEROZYME™ ou Multifect podem ser usados sozinhos, ou em combinação com outras enzimas, por exemplo, celulase, pectinase, hemicelulase ou uma combinação destes. A celulase pode ser utilizada numa concentração que varia de 0,1% a 5%, por exemplo 0,1, 0,25, 0,5, 0,75, 1,0, 1,25, 1. 5, 1,75, 2,0, 2,25, 2,5, 2,75. 3.0. 3,25, 3,5, 3,75, 4,0, 4,25, 4,5, 4,75, 5,0% (p/v) ou qualquer quantidade entre eles.
A solução de enzima {designada alternadamente como composição de degradação de parede celular, solução de digestão) geralmente compreenderá um sistema tampão ou tampão, um osmoticum e um ou mais de um sais, catiões divalentes ou outros aditivos. O tampão ou sistema de tampão é selecionado para manter um pH na gama adequada para a atividade enzimática e a estabilidade da (s) proteína (s), ou VLP, para purificar, por exemplo, na gama de cerca de pH 5,0 a cerca de 8,0, ou qualquer valor entre eles. O pH selecionado pode variar dependendo da VLP a recuperar, por exemplo, o pH pode ser 5,0, 5,2, 5,4, 5,6, 5,8, 6,0, 6,2, 6,4, 6,6, 6,8, 7,0, 7,2, 7,4, 7,6, 7,8, 8,0, ou qualquer pH entre eles. Exemplos de tampões ou sistemas de tampão incluem, mas não estão limitados a, MES, fosfato, citrato e semelhantes. Um ou mais tampões ou sistemas de tampão podem ser combinados numa solução enzimática (solução de digestão); um ou mais tampões podem estar presentes a uma concentração de 0 mM a cerca de 200 mM, ou qualquer quantidade entre eles, por exemplo 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180 ou 190 mM ou qualquer quantidade entre eles. Dependendo da adequação, um componente osmoticum pode ser adicionado se desejado. O osmoticum e a sua concentração são selecionados para aumentar a resistência osmótica da solução enzimática. Exemplos de osmoticum incluem manitol, sorbitol ou outros álcoois de açúcar, polietilenoglicol (PEG) de diferentes comprimentos de polímero e semelhantes. Os intervalos de concentração de osmoticum podem variar dependendo das espécies de plantas, do tipo de osmoticum usado e do tipo de tecido vegetal selecionado (espécie ou órgão de origem, por exemplo, folha ou caule) - geralmente o intervalo é de 0M a cerca de 0,8 M, por exemplo 0,05, 0,1, 0,15, 0,2, 0,25, 0,3. 0,35, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 ou 0,75 M, ou qualquer quantidade entre eles, por exemplo, 0, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600 nM de manitol, ou qualquer quantidade entre eles. A concentração de osmoticum também pode ser expressa como uma percentagem (p/v). Para alguns tipos de plantas ou tecidos, pode ser benéfico empregar uma preparação ligeiramente hipertónica, o que pode facilitar a separação da membrana plasmática celular da planta da parede celular. O osmoticum também pode ser omitido durante a digestão.
Outro parâmetro para a digestão da planta é a temperatura. A temperatura pode ser controlada se desejado durante o processo de digestão. O intervalo de temperatura útil deve estar entre 4°C e 40°C ou qualquer temperatura entre eles, por exemplo, de cerca de 4°C a cerca de 15°C, ou qualquer quantidade entre eles, ou de cerca de 4°C a cerca de 22°C, ou qualquer temperatura entre eles. Dependendo da temperatura escolhida, os outros parâmetros experimentais de digestão podem ser ajustados para manter condições de extração ótimas.
Catiões, sais ou ambos podem ser adicionados para melhorar a estabilidade da membrana plasmática, por exemplo, catiões divalentes, tais como Ca2+ ou Mg2+, pelo 0,5-50mM, ou qualquer quantidade entre aquelas, sais, por exemplo, CaCl2, NaCl, CuSOí, KNO3 e semelhantes, de cerca de 0 a cerca de 750 mM, ou qualquer quantidade entre eles, por exemplo 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 ou 750 mM. Podem também ser adicionados outros aditivos, incluindo um quelante, por exemplo, mas não limitado a, EDTA, EGTA, de cerca de 0 a cerca de 200 mM, ou qualquer quantidade entre eles, por exemplo 5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200 mM ou qualquer quantidade entre eles, um agente redutor para evitar a oxidação tal como, mas não limitado a, bissulfito de sódio ou ácido ascórbico, a 0,005-0,4% ou qualquer quantidade entre eles, por exemplo 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,15, 0,2, 0,25, 0,3, 0,35, 0,4% ou qualquer quantidade entre eles, inibidores enzimáticos específicos (ver abaixo) e, se desejado, um inibidor da senescência foliar, por exemplo, cicloheximida, cinetina ou uma ou mais poliaminas. A solução de digestão também pode compreender um ou mais manitol de cerca de 0 a cerca de 600 mM, NaCl de cerca de 0 a cerca de 500 mM, EDTA de cerca de 0 a cerca de 50 mM, celulase de cerca de 1% a cerca de 2% v/v, pectinase a partir de cerca de 0 a cerca de 1% v/v, de metabissulfito de sódio a partir de cerca de 0,03 a cerca de 0,04%, citrato de cerca de 0 a cerca de 125 mM ou NaPOs a partir de cerca de 0 a 75 mM. A matéria da planta pode ser tratada para melhorar o acesso das enzimas ou composição enzimática à parede celular da planta. Por exemplo, a epiderme da folha pode ser removida ou "descascada" antes do tratamento com uma composição enzimática. A matéria da planta pode ser cortada em pedaços pequenos (raanualmente, ou com um dispositivo de corte ou trituração, como um cortador de Urschel); a matéria de planta cortada pode ainda ser infiltrada com uma composição enzimática sob um vácuo parcial (Nishimura e Beevers 1978, Plant Physiol 62: 40-43; Newell et al., 1998, J. Exp Botany 49: 817-827). A perturbação mecânica da matéria vegetal também pode ser aplicada aos tecidos vegetais (Giridhar et al., 1989. Protoplasma 151: 151-157) antes ou durante o tratamento com uma composição enzimática.
Pode ser desejado usar uma composição enzimática que não possui, ou que tenha lipases ou protéases inativadas. Em algumas formas de realização, uma ou mais protéases, ou inibidores de lipase podem ser incluídos na composição da enzima. Exemplos de inibidores de lipase incluem RHC80267 (SigmaAldrich); Exemplos de inibidores de protéase incluem o E-64, Na2 EDTA, pepstatina, aprotinina, PMSF, Pefabloc, Leupeptina, bestatina e semelhantes.
Pode ser utilizado qualquer método adequado de mistura ou agitação da matéria vegetal na composição enzimática. Por exemplo, a matéria da planta pode ser suavemente girada ou agitada numa bandeja ou panela ou através de um agitador rotativo, caido em um tambor rotativo ou oscilante. Devem ser tomadas precauções para minimizar o dano de protoplastos (e/ou esferoplastos) até serem removidos da sopa de digestão. O recipiente de digestão deve ser selecionado em conformidade.
Como um exemplo não limitativo, uma composição de enzima compreendendo 1,5% de celulase (Onozuka R-10) e 0,375% MACEROZYME™ em manitol 500 mM, a 10 m de CaCl 2 e MES 5 mM (pH 5,6) pode ser utilizado para a produção protoplastos (ou esferoplastos) a partir de alguns tecidos de Nicotiana. Conforme aqui descrito, a concentração de manitol também pode ser variada de cerca de 0 a cerca de 500 mM, ou qualquer quantidade entre eles. Um especialista na técnica, provido com a informação aqui descrita, poderá determinar uma composição enzimática adequada para a idade e a estirpe de Nicotiana sp, ou para outras espécies utilizadas para a produção de VLPs.
Após a rutura da parede celular ou a digestão parcial da parede celular, obtém-se uma fração de protoplastos (que inclui protoplastos e/ou esferoplastos) e uma "fração apoplasto". Em alternativa, pode ser obtida uma "fração digerida". Conforme observado abaixo, a integridade da fração de protoplastos pode não ser necessária para produzir altos rendimentos de proteína como aqui descrito, portanto, uma fração apoplasto ou uma fração digerida pode ser usada para a extração de proteínas, por exemplo, mas não limitado a VLPs, proteínas do envelope virai, proteínas estruturais virais, proteínas da cápside virai, proteínas do revestimento virai.
Por "fração de apoplasto" entende-se uma fração que é obtida após digestão enzimática ou digestão enzimática parcial, usando enzimas degradantes da parede celular da matéria vegetal na presença de um osmoticum e/ou outros ingredientes que podem ser usados para auxiliar na manutenção integridade do protoplasto. A fração apoplasto pode compreender alguns componentes decorrentes de protoplastos interrompidos (ou esferoplastos). Por exemplo, a fração de apoplasto pode compreender de cerca de 0 a cerca de 50% (v/v) ou qualquer quantidade entre eles, dos componentes da fração de protoplastos, ou 0, 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50% (v/v) ou qualquer quantidade entre os componentes da fração de protoplastos.
Por uma "fração digerida" entende-se a fração que permanece após a digestão enzimática, ou a digestão enzimática parcial, usando enzimas degradantes da parede celular da matéria da planta, no entanto, a integridade do protoplasto não é necessária e a fração digerida pode compreender intacta, interrompido, ou ambos os protoplastos intactos e interrompidos. A composição que compreende as enzimas de degradação da parede celular utilizadas para produzir a fração digerida pode compreender um osmoticum, ou o osmoticum pode estar presente numa quantidade reduzida quando comparado com a quantidade presente nos procedimentos padrão utilizados para obter protoplastos, ou o osmoticum pode estar ausente de a composição. A fração digerida compreende a fração de apoplasto e a fração de protoplastos/ esferoplastos, no entanto, a fração de protoplastos/ esferoplastos pode ou não estar intacta. A fração digerida contém componentes intracelulares e componentes extracelulares. Os componentes intracelulares podem ser encontrados na forma de protoplastos/esferoplastos se um osmoticum é usado para manter o protoplasto/esferoplastos intactos. Se nenhum osmoticum for utilizado na solução de digestão, os protoplastos/esferoplastos podem ser interrompidos e os componentes intracelulares e extracelulares podem ser combinados na fração digerida. Conforme descrito aqui, as VLPs podem ser separadas dos componentes da fração digerida usando qualquer técnica adequada. Sem querer ser vinculado pela teoria, o passo da digestão da parede celular pode afrouxar os componentes poliméricos da parede das células e auxiliar na liberação de VLPs, caso contrário preso dentro da parede celular. Este protocolo também minimiza a contaminação das VLPs, com os componentes intracelulares. As VLPs podem ser separadas de detritos celulares após digestão enzimática usando centrifugação a baixa velocidade seguida por filtração, filtração em profundidade, sedimentação, precipitação por exemplo, mas não limitado a precipitação de sulfato de amónio, ou uma combinação delas para obter uma fração separada compreendendo as proteínas ou a supraestrutura de proteínas de interesse.
Se for usado um osmoticum, a fração de protoplastos/ esferoplastos, ou fração que contém protoplastos, pode ser separada da fração apoplasto usando qualquer técnica adequada, por exemplo, sem limitação, centrifugação, filtração, filtração em profundidade, sedimentação, precipitação ou uma combinação para obter uma fração separada compreendendo as VLPs e/ou compreendendo protoplastos/ esferoplastos que compreendem as VLPs. A fração de protoplastos {e esferoplastos), ou fração compreendendo protoplastos, pode ser separada da fração de apoplasto usando qualquer técnica adequada, por exemplo, sem limitação, centrifugação, filtração, filtração em profundidade, sedimentação, precipitação ou uma combinação delas para obter uma fração separada. A fração separada pode ser, por exemplo, um sobrenadante (se centrifugada, sedimentada ou precipitada), ou um filtrado (se for filtrada) e é enriquecida para VLPs. A fração separada pode ser processada adicionalmente para isolar, purificar, concentrar ou uma combinação destes, as VLPs, por exemplo, etapas de centrifugação adicionais, precipitação, passos cromatográficos (por exemplo, exclusão de tamanho, cromatografia de permuta iónica), filtração de fluxo tangencial ou uma combinação do mesmo. A presença de VLP purificadas pode ser confirmada, por exemplo, nativa ou SDS-PAGE, análise ocidental usando um anticorpo de detecção apropriado, eletroforese capilar ou qualquer outro método como seria evidente para um especialista na técnica. O apoplasto é a porção da célula vegetal fora da membrana plasmática, e inclui a parede celular e espaços intercelulares da planta. Embora seja preferido que a integridade dos protoplastos (e/ou esferoplastos) seja mantida durante a digestão e processamento posterior, não é necessário que os protoplastos permaneçam intactos para enriquecer as VLPs.
Durante a sintese, as VLPs são excretadas fora da membrana plasmática. As VLPs são de um tamanho médio de cerca de 20 nm a 1 um, ou qualquer quantidade entre elas, por exemplo, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 120, 130, 140, 150 160, 170, 180, 190 ou 200 nm, ou qualquer quantidade entre eles, por exemplo 100 nm, e pode incluir uma membrana lipidica. Devido ao seu tamanho, uma vez sintetizado, as VLP podem permanecer presas entre a membrana plasmática e a parede celular e podem ser inacessíveis para isolamento ou purificação adicional usando métodos mecânicos padrão usados para obter proteínas vegetais. A fim de maximizar os rendimentos, minimizar a contaminação da fração VLP com proteínas celulares, manter a integridade das VLPs e, em algumas formas de realização, o envelope ou membrana lipidica associado, podem ser úteis métodos de interrupção da parede celular para libertar as VLPs que minimizam o dano mecânico ao protoplasto (e/ou esferoplastos), tais como os métodos enzimáticos aqui descritos. No entanto, não é necessário que a integridade de todos os protoplastos seja mantida durante o procedimento.
Uma VLP produzida em uma planta de acordo com alguns aspetos da invenção pode ser complexada com lipídios derivados de plantas. 0 VLP pode compreender uma forma de precursor HA0, ou os domínios HA1 ou HA2 retidos em conjunto por uma forma de pontes dissulfureto. Os lípidos derivados de plantas podem estar na forma de uma bicamada lipidica e podem ainda compreender um envelope que envolve a VLP. Os lipídios derivados da planta podem compreender componentes lipídicos da membrana plasmática da planta em que a VLP é produzida, incluindo, mas não se limitando a, fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE), glicosfingolípidos, fitosteróis ou uma combinação destes. Um lípido derivado de plantas pode alternativamente ser referido como um "lípido vegetal". Exemplos de fito esteróis são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, estigmasterol, sitosterol, 24-metil colesterol e colesterol (Mongrand et al., 2004, J. Biol Chem 279: 36277-86). É desejável a dobragem correta de proteínas estruturais virais, como o HA, e a formação de trímeros de HA é desejada para montagem de VLPs. VLPs e, em particular, VLPs compreendendo um envelope lipídico derivado da planta, podem proporcionar uma resposta imune superior quando administrada a um indivíduo, em relação à administração do monómero de proteína estrutural.
Em algumas formas de realização, a expressão do polipéptido pode ser direcionada para qualquer espaço intracelular ou extracelular, organelo ou tecido de uma planta. A fim de localizar o polipéptido expresso a uma localização particular, o ácido nucleico que codifica o polipéptido pode ser ligado a uma sequência de ácido nucleico que codifica um péptido de sinal. Um péptido de sinal pode alternativamente ser referido como um péptido de transito ou sequência de sinal. Os péptidos de sinal ou sequências peptídicas para dirigir a localização de um polipéptido expresso para o apoplasto incluem, mas não estão limitados a um péptido sinal de amilase de arroz (McCormick 1999, Proc Natl Acad Sei USA 96: 703-708), péptido de sinal de proteína dissulfureto isomerase (PDI) possuindo a sequência de aminoácidos: MAKNVAIFGLLFSLLLLVPSQIFAEE; SEQ ID NO. 10, proteína relacionada à patogénese das plantas (PRP; Szyperski et al. PNAS 95: 2262-2262), por exemplo, proteína 2 relacionada à patogénese de plantas do tabaco (PRP), péptido sinal de anticorpo monoclonal humano {SP) ou qualquer péptido de sinal de hemaglutinina nativo.
Em alguns exemplos, um polipéptido expresso pode se acumular em espaço intercelular ou extracelular especifico (tal como apoplasto), organelo ou tecido, por exemplo quando o polipéptido é expresso e segregado na ausência de um péptido sinal ou péptido de trânsito. 0 termo "partícula semelhante a virus" (VLP) ou "partículas semelhantes a vírus" ou "VLPs" refere-se a estruturas que se auto-montam e compreendem proteínas de superfície virai, por exemplo, uma proteína HA de gripe ou uma proteína HA de gripe quimérica. VLPs e VLP quiméricas são geralmente morfologicamente e antigenicamente semelhantes aos viriões produzidos numa infeção, mas carecem de informação genética suficiente para replicar e, portanto, não são infeciosas. As VLP e as VLP quiméricas podem ser produzidas em células hospedeiras adequadas, incluindo células hospedeiras de plantas, e se desejado purificar adicionalmente.
Enquanto as VLP de gripe e as VLP de gripe quiméricas são aqui exemplificadas, os métodos aqui descritos podem ser usados para quaisquer VLP derivadas de plantas que localizam ou são segregadas para o apoplasto.
Por "proteína quimérica" ou "polipéptido quimérico", entende-se uma proteína ou um polipéptido que compreende sequências de aminoácidos de duas ou mais do que duas fontes, por exemplo, mas não limitado a dois ou mais tipos ou subtipos de gripe, que são fundidos como um único polipéptido. A proteína ou polipéptido quimérico pode incluir um péptido de sinal que é o mesmo (ou seja, nativo) como, ou heteróloga com o restante do polipéptido ou proteína. A proteína quimérica ou o polipéptido quimérico podem ser produzidos como um transcrito a partir de uma sequência de nucleótidos quimérica e permanecem intactos, ou se necessário, a proteína quimérica ou o polipéptido quimérico podem ser clivados após a síntese. A proteína quimérica intacta, ou porções clivadas da proteína quimérica, podem se associar para formar uma proteína multimérica. Uma proteína quimérica ou um polipéptido quimérico também pode incluir uma proteína ou polipéptido compreendendo subunidades que estão associadas através de pontes dissulfureto (isto é, uma proteína multimérica). Por exemplo, um polipéptido quimérico compreendendo sequências de aminoácidos de duas ou mais do que duas fontes podem ser processadas em subunidades e as subunidades associadas através de pontes dissulfureto para produzir uma proteína quimérica ou um polipéptido quimérico. 0 polipéptido pode ser a hemaglutinina da gripe (HA), e cada uma das duas ou mais de duas sequências de aminoácidos que compõem o polipéptido podem ser obtidas a partir de HA diferentes para produzir uma HA quimérica ou HA de gripe quimérica. Uma HA quimérica também pode incluir uma sequência de aminoácidos compreendendo péptido de sinal heterólogo (uma pré-proteína HA quimérica) que é clivada após a síntese. Exemplos de proteínas HA que podem ser utilizadas na invenção aqui descrita podem ser encontradas na WO 2009/009876; WO 2009/076778; WO 2010/003225. Um ácido nucleico que codifica um polipéptido quimérico pode ser descrito como um "ácido nucleico quimérico", ou uma "sequência de nucleótidos quimérica". Uma partícula semelhante a vírus composta por HA quimérica pode ser descrita como uma "VLP quimérica". VLP quiméricos são descritos mais detalhadamente no número de pedido do PCT PCT/CA2010/000983 apresentado em 25 de junho de 2010, e Pedido Provisório US 61/220.161 (apresentado em 24 de junho de 2009) . VLPs podem ser obtidos a partir da expressão de HA nativo ou quimérico. 0 HA das VLP preparadas de acordo com um método proporcionado pela presente invenção, incluem sequências conhecidas e sequências de HA variantes que podem ser desenvolvidas ou identificadas. Além disso, as VLP produzidas como aqui descrito não compreendem neuraminidase (NA) ou outros componentes, por exemplo, Ml (proteína Μ), M2, NS e semelhantes. No entanto, NA e Ml podem ser co-expressas com HA se desejem VLPs que compreendam HA e NA.
Geralmente, o termo "lípido" refere-se a moléculas que ocorrem de forma solúvel em gordura (lipofílica). Uma VLP quimérica produzida numa planta de acordo com alguns aspetos da invenção pode ser complexada com lípidos derivados de plantas. Os lípidos derivados de plantas podem estar na forma de uma bicamada lipidica e podem ainda compreender um envelope que envolve a VLP. Os lipídios derivados da planta podem compreender componentes lipidicos da membrana plasmática da planta onde a VLP é produzida, incluindo fosfolípidos, tri-, di- e monoglicerídeos, bem como esteróis lipossolúveis ou metabolitos que compreendem esteróis. Exemplos incluem fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE), fosfatidilinositol, fosfatidilserina, glicosfingolipidos, fitoesteróis ou uma combinação destes. Um lípido derivado de plantas pode alternativamente ser referido como um "lípido vegetal". Mongrand et al., 2004, J. Biol Chem 279: 36277-86). Como um especialista na técnica entenderá prontamente, a composição lipidica da membrana plasmática de uma célula pode variar com a cultura ou condições de crescimento da célula ou organismo, ou espécies, a partir das quais a célula é obtida.
As membranas celulares geralmente compreendem bicamadas lipídicas, bem como proteínas para várias funções. As concentrações localizadas de lipídios particulares podem ser encontradas na bicamada lipidica, denominada "jangadas lipídicas". Estes microdomínios de jangada lipidica podem ser enriquecidos em esfingolipidos e esteróis. Sem querer se unir à teoria, as balsas lipídicas podem ter papéis significativos em endo e exocitose, entrada ou saída de vírus ou outros agentes infeciosos, transdução de sinal entre células, interação com outros componentes estruturais da célula ou organismo, como intracelular e matrizes extracelulares.
As VLPs que compreendem um envelope lipídico foram descritas anteriormente na WO 2009/009876; WO 2009/076778 e WO 2010/003225. Com referência ao vírus da gripe, o termo "hemaglutinina" ou "HA" tal como aqui utilizado refere-se a uma glicoproteína estrutural de partículas virais da gripe. O HA da presente invenção pode ser obtido a partir de qualquer subtipo. Por exemplo, o HA pode ser do subtipo Hl, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, Hll, H12, H13, H14, H15 ou Hl6, ou de tipos de gripe B ou C. O HA recombinante da presente invenção também pode compreender uma sequência de aminoácidos com base na sequência de qualquer hemaglutinina. A estrutura da hemaglutinina da gripe é bem estudada e demonstra um alto grau de conservação na estrutura secundária, terciária e quaternária. Esta conservação estrutural é observada mesmo que a sequência de aminoácidos possa variar (ver, por exemplo, Skehel e Wiley, 2000 Ann Rev Biochem 69: 531-69; Vaccaro et al 2005). As sequências de nucleótidos que codificam HA são bem conhecidas e estão disponíveis, por exemplo, a partir do banco de dados BioDefense e de saúde pública (agora Banco de Pesquisa de Influenza; Squires et al., 2008 Nucleic Acids Research 36: D497-D503), por exemplo, na URL: biohealthbase.org/GSearch/home.do?decorator=Influenza) ou os bancos de dados mantidos pelo Centro Nacional de Informação sobre Biotecnologia (NCBI, por exemplo, no URL: ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez ? db = nuccore & cmd = search & term = influenza). A presente invenção também se refere a métodos para preparar, isolar ou preparar e isolar VLPs, incluindo VLP de virus de gripe que infetam seres humanos ou animais hospedeiros, por exemplo primatas, cavalos, porcos, aves, ovelhas, aves aquáticas aviárias, aves migratórias, patos, gansos, aves, frango, camelo, canino, cães, felinos, gatos, tigres, leopardos, civetas, visões, marracas de pedras, furões, animais domésticos, gado, ratos, ratinhos, focas, baleias e similares. Alguns vírus da gripe podem infetar mais de um animal hospedeiro. A variação de aminoácidos é tolerada em hemaglutininas de vírus da gripe. Esta variação prevê novas tensões que estão a ser identificadas continuamente. A infeção entre as novas estirpes pode variar. No entanto, a formação de trimeros de hemaglutinina, que posteriormente formam VLPs, é mantida. A presente invenção também inclui métodos de preparação de quaisquer VLP derivadas de plantas, independentemente do subtipo ou sequência de HA, ou HA quimérica compreendendo o VLP ou a espécie de origem. 0 dobramento correto das hemaglutininas pode ser importante para a estabilidade da proteína, a formação de multímeros, a formação de VLPs e a função do HA (capacidade de hemaglutinação), entre outras características das hemaglutininas da gripe. 0 dobramento de uma proteína pode ser influenciado por um ou mais fatores, incluindo, mas não se limitando a, a sequência da proteína, a abundância relativa da proteína, o grau de aglomeração intracelular, a disponibilidade de cofatadores que podem se unir ou ser associadas temporariamente com a proteína dobrada, parcialmente dobrada ou desdobrada, a presença de uma ou mais proteínas de chaperona ou semelhantes.
As proteínas de choque térmico (Hsp) ou as proteínas do stress são exemplos de proteínas de chaperona, que podem participar em vários processos celulares, incluindo síntese de proteínas, tráfico intracelular, prevenção de desdobragem, prevenção de agregação de proteínas, montagem e desmontagem de complexos proteicos, dobragem de proteína e desagregação de proteína. Exemplos de tais proteínas de chaperona incluem, mas não estão limitados a Hsp60, Hsp65, Hsp 70, Hsp90, HsplOO, Hsp20-30, HsplO, Hspl00-200, HsplOO, Hsp90, Lon, TF55, FKBPs, ciclofilinas, ClpP, GrpE, ubiquitina, calnexina e isomerases de dissulfureto de proteínas (ver, por exemplo, Macario, AJL, Cold Spring Harbor Laboratory Res. 25: 59-70. 1995; Parsell, DA & Lindquist, S. Ann. Rev. Genet. 27: 437-496 (1993); Patente US 5232833). As proteínas de chaperona, por exemplo, mas não limitadas a Hsp40 e Hsp70, podem ser utilizadas para garantir a dobragem de um HA quimérico (número de aplicação PCT PCT/CA2010/ 000983 apresentado em 25 de junho de 2010, e Pedido Provisório US 61/220.161, apresentado em 24 de junho de 2009; WO 2009/009876 e WO 2009/076778) . Também pode ser utilizada a isomerase de dissulfureto de proteínas (PDI; N° de acesso Z11499) .
Uma vez recuperadas, as VLPs podem ser avaliadas quanto à estrutura, potência de tamanho ou atividade, por exemplo, ensaio de hemaglutinação, microscopia eletrónica, dispersão de luz, cromatografia de exclusão de tamanho, HPLC, análise de Western blot ou eletroforese. Estes e outros métodos para avaliar o tamanho, a concentração, a atividade e a composição das VLP são conhecidos na técnica.
Para cromatografia de exclusão de tamanho preparativa, uma preparação que compreende VLP pode ser obtida pelos métodos aqui descritos, e o material insolúvel removido por centrifugação. A precipitação com PEG também pode ser benéfica. A proteína recuperada pode ser quantificada usando métodos convencionais (por exemplo, Bradford Assay, BCA), e o extrato passa através de uma coluna de exclusão de tamanho, usando, por exemplo, SEPHACRYL™, SEPHADEX ™, ou meio similar, e as frações coletadas. Blue Dextran 2000 ou uma proteína adequada, pode ser usado como um padrão de calibração. O extrato também pode ser passado através de uma coluna de troca de catiões e as frações ativas são coletadas. Após cromatografia, as frações podem ser analisadas adicionalmente por eletroforese proteica, imunotransferência ou ambas, para confirmar a presença de VLPs e o complemento proteico da fração.
Pode ser utilizado um ensaio de hemaglutinação para avaliar a atividade hemaglutinante das frações contendo VLP, utilizando métodos bem conhecidos na técnica. Sem querer se unir à teoria, a capacidade de HA para se ligar ao RBC de diferentes animais é impulsionada pela afinidade da HA nos ácidos sialicos «2,3 ou a2,3 e pela presença destes ácidos siálicos na superfície do RBC. O vírus HA e equino e aviário de vírus da gripe aglutina eritrócitos de várias espécies, incluindo perus, galinhas, patos, cobaias, humanos, ovelhas, cavalos e vacas; enquanto os HA humanos se ligarão a eritrócitos de peru, galinhas, patos, cobaias, humanos e ovelhas (Ito T. et al, 1997, Virology, 227: 493-499; Medeiros R et al., 2001. Virology 289: 74-85).
Um ensaio de inibição de hemaglutinação (HI, ou HAI) também pode ser usado para demonstrar a eficácia de anticorpos induzidos por uma vacina, ou a composição de vacina que compreende HA quimérica ou VLP quimérica pode inibir a aglutinação de glóbulos vermelhos (RBC) por HA recombinante. Os títulos de anticorpos inibitórios de hemaglutinação de amostras de soro podem ser avaliados por HAI de microtitulação (Aymard et al 1973). Podem ser utilizados eritrócitos de várias espécies, por exemplo, cavalo, peru, frango ou similares. Este ensaio fornece informações indiretas sobre a montagem do trímero de HA na superfície do VLP, confirmando a boa apresentação de sítios antigénicos em HAs.
Os títulos de HAI de reatividade cruzada também podem ser usados para demonstrar a eficácia de uma resposta imune a outras estirpes de vírus relacionadas ao subtipo de vacina. Por exemplo, o soro de um indivíduo imunizado com uma composição de vacina que compreende uma hemaglutinina quimérica que compreende um HDC de um primeiro tipo ou subtipo de influenza pode ser utilizado num ensaio HAI com uma segunda estirpe de vírus inteiro ou partículas de vírus, e o título de HAI é determinado.
Os métodos para a transformação e regeneração de plantas transgênicas, células vegetais, matéria vegetal ou sementes compreendendo VLPs são estabelecidos na técnica e conhecidos pelos especialistas na técnica. 0 método de obtenção de plantas transformadas e regeneradas não é crítico para a presente invenção.
Por "transformação" entende-se a transferência interespecífica de informação genética (sequência de nucleotídeos) que se manifesta genotipicamente, fenotipicamente ou ambas. A transferência interespecífica de informação genética de uma construção quimérica para um hospedeiro pode ser hereditária (isto é, integrada no genoma do hospedeiro) e a transferência de informação genética considerada estável, ou a transferência pode ser transitória e a transferência de informação genética não é hereditária.
Pelo termo "matéria vegetal", entende-se qualquer material derivado de uma planta. A matéria da planta consiste em uma planta inteira, tecido ou qualquer fração dela. Além disso, a matéria vegetal pode compreender componentes de plantas intracelulares, componentes de plantas extracelulares, extratos líquidos ou sólidos de plantas ou uma combinação destes. Além disso, a matéria vegetal consiste em plantas, tecidos, um extrato líquido ou uma combinação destes, de folhas de plantas, hastes, frutas, raizes ou uma combinação delas. A matéria da planta pode compreender uma planta ou porção da mesma que não tenha sido submetida a nenhuma etapa de processamento. Uma porção de uma planta pode incluir matéria vegetal. As plantas ou a matéria vegetal podem ser colhidas ou obtidas por qualquer método, por exemplo, toda a planta pode ser usada, ou as folhas ou outros tecidos especificamente removidos para uso nos métodos descritos.
As construções da presente Invenção podem ser introduzidas em células de plantas usando plasmideos de Ti, plasmideos Ri, vetores de vírus vegetais, transformação direta de ADN, microinjeção, eletroporação, infiltração e semelhantes. Para comentários de tais técnicas, veja, por exemplo, Weissbach and Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academy Press, New York VIU., pp, 421-463 (1988); Geierson and Corey, Plant Molecular Biology, 2d Ed. (1988); and Miki and Iyer, Fundamentals of Gene Transfer in Plants, In Plant Metabolism, 2d Ed. DT, Dennis, DH Turpin, DD Lefebrve, DR layzell (eels), !lMdi:|ÍhlÍsS;IéY:||||||lllÍ|Í|h (1997:) . Outros métodos incluem a absorção direta de ADN, o uso de lipossomas, eletroporação, por exemplo, usando protoplastos, microinjeção, microprojéteis ou bigodes e infiltração a vácuo. Veja, por exemplo, Bilang, et al. (Gene 100: 247-250 (1991), Scheid et al, (Mol. Gen. Genet. 228: t ......iipif:)' I jlidéÉÉhíf:" :é te -' :á:l', IPláht: ...... 1987), Neuhause et al.), Klein et al., Nature 327: 70-73 (1987); Howell et al, (Science 208: 1265, 1980), Horsch et al. (Science 227: 1229-1231, 1985), DeBlock et al., Plant Physiology 91; 694-701, 1989), Methods for Plant Molecular Biology (Weissbach and Weissbach, eds., Academic Press Inc., 1988), Methods in Plant Molecular Biology (Schuler and Zielinski, eds., Academic Press Inc., 1989), Liu and Lomonossoff (J. Virol Meth, 105:343-348, 2002), Patentes US 4945050; 5036006; 5100792; 6403865; 5625136.
Os métodos de expressão transitória podem ser utilizados para expressar as construções da presente invenção (ver Liu e Lomonossoff, 2002, Journal of Virological Methods, 105: 343-348). Em alternativa, um método de expressão transitória baseado no vácuo, conforme descrito nas Publicações PCT WO 00/063400, WO 00/037663pode ser usado. Estes métodos podem incluir, por exemplo, mas não estão limitados a um método de Agro-inoculação ou Agro-infiltração, no entanto, outros métodos transitórios também podem ser utilizados como mencionado acima. Com Agro-inoculação ou Agro-infiltração, uma mistura de Agrobacteria compreendendo o ácido nucleico desejado entra nos espaços intercelulares de um tecido, por exemplo as folhas, porção aérea da planta (incluindo haste, folhas e flor), outra porção da planta (caule, raiz, flor) ou toda a planta. Depois de atravessar a epiderme, o Agrobacterium infeta e transfere cópias de t-ADN para as células. O t-ADN é transcrito episomicamente e o mARN traduzido, levando à produção da proteína de interesse em células infetadas, no entanto, a passagem de t-ADN dentro do núcleo é transitória.
As VLP de gripe preparadas por métodos da presente invenção podem ser utilizadas em conjunto com uma vacina contra a gripe existente, para suplementar a vacina, torná-la mais eficaz ou reduzir as administrações necessárias. Como seria sabido para uma pessoa habilitada na técnica, a vacina pode ser dirigida contra um ou mais de um vírus da gripe. Exemplos de vacinas adequadas incluem, mas não estão limitados a, aquelas comercialmente disponíveis dos produtos farmacêuticos Sanofi-Pasteur, ID Biomedical, Merial,
Sinovac, Chiron, Roche, MedImmune, GlaxoSmithKline, iérpher ·$]ϊ1:;ίΐ11ϊ;^
Se desejado, as VIP da presente invenção podem ser misturadas com um adjuvante adequado como seria conhecido para um especialista na técnica. Além. disso, o VLP pode ser utilizado numa composição de vacina compreendendo uma dose eficaz do VLP para o tratamento de um organismo alvo, como definido acima. Além disso, o VLP produzido de acordo com a presente invenção pode ser co-expresso com outros componentes de proteína ou reconstituído com outros componentes de proteína VLP ou influenza, por exemplo, neuraminidase (NA), Ml e M2. Também pode ser co-expresso ou reconstituído com outros VLP feitos de proteínas vacinais, tais como antigénios de malária, antígenos do HIV, antigenos do virus sincicial respiratório (RSV) e semelhantes.
As sequências aqui descritas estão resumidas abaixo*
A presente invenção será ainda ilustrada nos seguintes exemplos. No entanto, deve ser entendido que estes exemplos são apenas para fins ilustrativos, e não devem ser utilizados para limitar o âmbito da presente invenção de qualquer maneira.
Conjunto de cassetes de expressão
As construções que podem ser usadas para a produção de VLPs são descritas no Pedido Provisório US 61/220.161 (apresentado em 24 de junho de 2009) , WO 2009/009876, WO 2009/076778 e WO2010 / 003225. As construções também podem incluir as enumeradas na Tabela 2. A montagem dessas construções é descrita na WO 2009/009876, WO 2009/076778, W02010/003225 e US 61/220,161. No entanto, outras construções compreendendo HA conhecidas, incluindo, mas não se limitando a, as fornecidas na Tabela 2, e combinadas com elementos e promotores reguladores semelhantes ou diferentes, também podem ser usadas para a produção de VLPs como aqui descrito.
Tabela 2: exemplos não limitativos de construções que podem ser utilizadas para a produção de hemaglutinina.
As cassetes de expressão de CPMV-ííT incluíram o promotor 35S para controlar a expressão de um ARNm compreendendo uma sequência de codificação de interesse flanqueada, em 5'pelos nucleótidos 1-512 do RNA2 do vírus do mosaico do Cowpea (CPMV) com ATG mutado nas posições 115 e 161 e em 3', pelos nucleotideos 3330-3481 da CPMV RNA2 (correspondente ao 3' UTR) seguido do terminador NOS Plasmídeo pBD-C5-lLC, (Sainsbury et al. 2008; Plant Biotechnology Journal 6: 82-92 e a Publicação PCT WO 2007/135480) , foi usada para a montagem de cassetes de expressão CPMV-ΗΤ com base hemaglutinina. A mutação de ATGs na posição 115 e 161 do RNA2 da CPMV foi feita utilizando um. método de ligação de PCR baseado em Darveau et al. (Methods in Neuroscience 26: 77-85 (1995)). Foram realizadas duas PCR separadas utilizando pBD-C5-lLC como modelo. Os iniciadores para a primeira amplificação foram pBinPlus.2613c (SEQ ID NO: 3) e Mut-ATG115.r (SEQ ID NO: 4). Os iniciadores para a segunda amplificação foram Mut-ATGl61. c (SEQ ID NO: 5) e LC-C5-1.110r (SEQ ID NO: 6). Os dois fragmentos foram então misturados e utilizados como modelo para uma terceira amplificação usando pBinPlus.2613c (SEQ ID NO: 3) e LC-C5-1.10r (SEQ ID NO: 6) como iniciadores. 0 fragmento resultante foi digerido com Pad e Apal e clonado em pBD-C5-lLC digerido com a mesma enzima. A cassete de expressão gerada foi denominada 828.
Montagem de H5 A/Indonésia/5/2005 na cassete de expressão CEWT-HT (número de construção 685) . A montagem desta cassete é descrita na WO 2009/009876/ WO 2009/076778 e W02010 / 003325.
Resumidamente, a sequência de codificação de H5 de A/ Indonésia/5/2005 foi clonada em CPMV-HT da seguinte forma: os locais de restrição Apal (imediatamente a montante do ATG inicial) e StuI (imediatamente a jusante de um codão de parada) foram adicionados à hemaglutinina sequência de codificação através da realização de uma amplificação por PCR com iniciadores Apal-H5 (A-Indo).lc (SEQ ID NO: 7) e H5 (A-Indo) -StuI.1707r (SEQ ID NO: 8) usando a construção número 660 (D'Aoust et al., Plant Biotechnology Journal 6: 930-940 (2008)) como modelo. A construção 660 compreende um promotor de plastocianina de alfafa e 5'UTR, sequência de codificação de hemaglutinina de H5 de A/Indonesia/5/2005 (Construção # 660), UTR de plastocianina de alfafa e sequências de terminação (SEQ ID NO: 9; Fig. 5). O fragmento resultante foi digerido com enzimas de restrição Apal e StuI e clonado na construção número 828, anteriormente digerido com as mesmas enzimas. A cassete resultante foi denominada número de construção 685 (Fig. 1, 2).
Supressores de silenciamento. 0 silenciamento de genes pós-transcrição (PTGS) pode estar envolvido na limitação da expressão de transgenes em plantas e a co-expressão de um supressor de silenciamento do virus da batata Y (HcPro) pode ser usada para contrariar a degradação especifica de mARN de transgene (Brigneti et al., 1998). Os supressores alternativos de silenciamento são bem conhecidos na técnica e podem ser utilizados como aqui descrito (Chiba et al., 2006, Virology 346: 7-14), por exemplo, mas não limitado a, TEV-pl/HC-Pro (vírus echo-virus do tabaco-pl/HC-Pro), BYV-p21, pl9 do vírus do entupimento do busto de tomate (TBSV pl9), proteína da cápside do vírus do crinkle do tomate (TCV-CP), 2b do vírus do mosaico do pepino; CMV-2b), p25 do vírus da batata X (PVX-p25), pall do vírus da batata M (PVM-pll), pall do vírus da batata S (PVS-pll), pl6 do vírus do Scorch Blueberry, (BScV-pl6), P23 do vírus da tristeza do Citrus (CTV-p23), p24 do vírus-2 associado ao rolo da Grapevine, (GLRaV-2 p24), plO do vírus A da videira (GVA-plO) , pl4 do virus B da Grapevina (GVB-pl4), plO do vírus latente de Heracleum (HLV-plO), ou pl6 do vírus latente comum do alho (GCLV-pl6). Por conseguinte, um supressor de silenciamento, por exemplo, mas não limitado a HcPro, TEV-pl/ HC-Pro, BYV-p21, TBSV pl9, TCV-CP, CMV-2b, PVX-p25, PVM-pll, PVS-pll, BScV-pl6, CTV-p23, GLRaV-2 p24, GBV-pl4, HLV-plO, GCLV-pl6 ou GVA-plO, podem ser co-expressos juntamente com a sequência de ácido nucleico que codifica a proteína de interesse para assegurar ainda níveis elevados de produção de proteína dentro de uma planta. A construção de pl9 é descrita em descrito na WO 2010/0003225. Resumidamente, a sequência de codificação da proteína pi9 do virus do choque do busto de tomate (TBSV) foi ligada à cassete de expressão de plastocianina de alfafa pelo método de ligadura baseado em PCR apresentado em Darveau et al. (Methods in Neuroscience 26: 77-85 (1995)). Em uma primeira rodada de PCR, um segmento do promotor de plastocianina foi amplificado usando iniciadores Plasto-443c: GTATTAGTAATTAGAATTTGGTGTC (SEQ ID NO: 11) e supP 19-plasto.r CCTTGTATAGCTCGTTCCATTTTCTCTCAAGATG (SEQ ID NO: 12) com a construção 660 (descrita na WO 2010/0003225) como modelo. Em paralelo, outro fragmento contendo a sequência de codificação de pl9 foi amplificado com iniciadores supPl9-lc ATGGAACGAGCTATACAAGG (SEQ ID NO: 13) e SupPl9-SacI.r AGTCGAGCTCTTACTCGCTTTCTTTTTCGAAG (SEQ ID NO: 14) usando a construção 35S: pl9 como descrito em Voinnet et al. (The Plant Journal 33: 949-956 (2003))) como modelo. Os produtos de amplificação foram então misturados e utilizados como modelo para uma segunda rodada de amplificação (reação de montagem) com iniciadores Plasto-443c e SupPl9-SacI.r. O fragmento resultante foi digerido com BamHI (no promotor de plastocianina) e Saci (no final da sequência de codificação pl9) e clonado na construção número 660, previamente digerido com as mesmas enzimas de restrição para dar o número de construção R472. Os plasmídeos foram utilizados para transformar Agrobacteium tumefaciens (AGL1; ATCC, Manassas, VA 20108, EUA) por eletroporação (Mattanovich et al., 1989) . A integridade de todas as estirpes de A. tumefaciens foi confirmada pelo mapeamento de restrição. A estirpe de A, tumefaciens compreendendo R472 é denominada "AGLl / R472". A construção de HcPro (35HcPro) foi preparada como descrito em Hamilton et al. (2002). Todos os clones foram sequenciados para confirmar a integridade das construções. Os plasmideos foram utilizados para transformar Agrobacteium tumefaciens (AGLl; ATCC, Manassas, VA 20108, EUA) por eletroporação (Mattanovich et al., 1989) . A integridade de todas as estirpes de A. tumefaciens foi confirmada pelo mapeamento de restrição.
Preparação de biomassa vegetal, inóculo, agro-infiltração e colheita
As plantas de Nicotiana benthamiana foram cultivadas a partir de sementes em apartamentos preenchidos com um substrato comercial de musgo de turfa. As plantas foram autorizadas a crescer na estufa sob um fotoperiodo 16/8 e um regime de temperatura de 25°C dia/20° C de noite. Três semanas após a semeadura, plantadas individuais foram colhidas, transplantadas em potes e deixadas para crescer na estufa por três semanas adicionais nas mesmas condições ambientais. Após seis semanas, as plantas têm um peso médio de 80 g e 30 cm de altura. A estirpe AGLl de Agrobacterium foi transfectada (eletroporação) com construções como identificado abaixo, utilizando os métodos descritos por D'Aoust et al 2008 (Plant Biotechnology Journal 6: 930-940). O Agrobacterium transfectado foi cultivado em meio YEB suplementado com 10 mM de ácido 2-(N-morfolino) etanosulfónico (MES), 20 μΜ de acetosiringona, 50 pg/ml de canamicina e 25 pg/ml de carbenicilina pH 5,6 a uma ODeoo entre 0,6 e 1,6. Suspensões de Agrobacterium foram centrifugadas antes da utilização e ressuspenderam-se em meio de infiltração (10 mM de MgCls e MES 10 mM pH 5, 6) .
As plantas foram agro-infiltradas como descrito em D*Aoust et al (supra) . Resumidamente, para infiltração no vácuo, as suspensões de A. tumefaciens foram centrifugadas, ressuspensas no meio de infiltração e armazenadas durante a noite a 4..eC.,:,:.N.a,dia da infiltração, os 10:teS:,:.:de.,..cul:tura:,:,fQr:am:,:,:,: diluidos ; v;oi;mmdlllÍllliÍllÍP'tS é. Ébríi§§|i|^^ do uso. Plantas inteiras de N. benthamianaforam colocados de cabeça para baixo na suspensão bacteriana num tanque de aço inoxidável estanque ao ar sob um vácuo de 2D-40 Torr por 2 minutos. Salvo indicação em contrário, todas as infiltrações llfiiáp:· bèalu.zddás com© ddil^iiiilÉbádâdlllidiP transformada coir R472 {estirpe AGL1/R472) a uma proporção de 1:1. Após a infiltração no vácuo, as plantas foram devolvidas à estufa para um período de incubação de 4-6 dias até a llipyfeitã:.
Amostragem de folhas e extração de proteína total (homogeneização mecânica)
Após a incubação de 4, 5, 6, 7 e 8 dias, a parte aérea das plantas foi colhida e usada imeáiatamente. Aa prdteinás solúveis totais foram extraídas por homogeneização do tecido vegetal em 3 volumes de Tris 50 mM frio pH 8,0, NaCl 0,15 M contendo 1% Trifcion X-1QG e 0,004% de métabissulfito de sódio. D tecido vegetal foi mecanicamente homogeneizado usando um POLYTRGfP*, moendo com argamassa, e pilão, ou com um COMITROL™ em 1 volume de Tris frio 50 mM Tris pH 8, HaCi 0,15 M. 0 tampão utilizado com o CGMITRGL ™ também continha 0,04% de métabissulfito de sódio. Após a homogeneização, a suspensão de material vegetal moído foi oentrifugada a S :0.&0 g durante 5 min a 4°C e os extratos brutos (sobrenadaste) mantiveram para análise. O teor de proteína total de extratos brutos clarificados foi determinado pelo ensaio de Bradford (Bio-Rad# Hércules#- CA) utilizando albumina de soro bovino como. padrão de referência *
Extração d® VI#P p&x digestão de parede celular O tecido foliar foi recolhido das plantas Nicotiana benthamiana e cortado em partes de 1 cm2. As peças de folha foram embebidas em manitol 500 mM durante 30 minutos à temperatura ambiente (RT). A solução de manitol foi então removida e alterada cora a mistura enzimática (mistura de ceiulases de Trichoderma vi ride (Onozuka R-10# 3% v/v) e uma mistura de pectinases de Rhizopus sp. (MÀCER0ZYME'"4; 0# 75% v/ v; ambos da Yakult Pharmaceuticals) em solução protoplãtica (manitol 500 mM, 10 mM de CaCla e 5 mM de MES/KOH (pH 5# 6)} . A proporção utilizada foi de 20 g de pedaços de folhas por 100 ml de solução. Esta preparação foi espalhada uniformemente em um raso vaso (~llxl8 cm) e incubado durante 16 horas em um agitador rotativo a 40 rpm e 26°C.
Era alternativa# a extração de VLP pode ser realizada da seguinte forma: as plantas foram agro-infiltradas com AGLl/ # MS' -çdmb: ;1*. 'Ú teci|||||illlp:b foi recolhido das plantas de AT. benthamiana no dia 6 pós-infiltraçâo e cortado em ~ 1 cm2. Pectinase Multifectada FE# Multifect CX CG e Multifect CX B (Genencor) foram adicionados a 1,0% cada (v/v) em um Mannitol 600 mM# Citrate 75 mM# tampão 0#04% de hissulfito de sódio pH 6#0 usando uma proporção de 1:2,5 (p/v) de biomassa fresca; tampão de digestão. A biomassa foi digerida durante 15 h â temperatura -ámblèntê num- iiiiii
Após a incubação, os detritos foliares foram removidos por filtração {filtro de nylon de 250 ou 400 utilizando albumina de soro bovino como padrão de referência utilizando albumina de soro bovino como padrão de referência ura de malha) . Os protoplastos em suspensão foram recolhidos por centrifugação a 200xg (15 min), seguido de centrifugação do sobrenadante a SOOOxg (15 min) para esclarecer ainda mais o sobrenadante. Alternativamente, pode ser utilizado um único passo de centrifugação a 5000 xg durante 15 minutos. Setenta ml do sobrenadante foram então centrifugados a 70 000 xg durante 30 minutos. O sedimento resultante foi ressuspenso em 1,7 mL de PBS e analisado imediatamente ou congelado.
Análise de Proteínas
Um teste de hemaglutinação para H5 foi baseado em um método descrito por Nayak e Reichl (2004) . Resumidamente, as duas diluições em série das amostras de teste (100 pL) foram feitas em placas de microtitulação de 96 poços com fundo em V contendo 100 pL de PBS, deixando 100 pL de amostra diluida por poço. Cem microlitros de uma suspensão de glóbulos vermelhos de peru de 0,25% (Bio Link Inc., Syracuse, NY) foram adicionados a cada poço e as placas foram incubadas durante 2 h à temperatura ambiente. 0 recíproco da maior diluição mostrando hemaglutinação completa foi registrado como atividade de hemaglutinação. Em paralelo, um padrão de HA5 recombinante (A/Vietnam/1203/2004 H5N1) (Protein Science Corporation, Meriden, CT) foi diluído em PBS e funcionou como um controlo em cada placa.
ELISA O padrão HA5 foi preparado com partículas de tipo vírus purificadas que foram interrompidas por tratamento com 1% de Triton X-100 seguido por agitação mecânica em um Lisser de Tecido (Qiagen) durante 1 min. As placas de microtitulação de 96 poços de fundo em U foram revestidas com 10 pg/mL de anticorpo de captura (Immune Technology Corporation, # IT- 003-0051) em tampão de revestimento de carbonato-bicarbonato 50 mM (pH 9,6) durante 16-18 horas a 4°c. Todas as lavagens foram realizadas com PBS 0,01 M (solução salina tamponada com fosfato), pH 7,4 contendo 0,1% de Tween-20. Após a incubação, as placas foram lavadas três vezes e bloqueadas com 1% de caseina em PBS durante 1 hora a 37°C. Após o passo de bloqueio, as placas foram lavadas três vezes. 0 padrão HA5 foi diluído em um extrato simulado (preparado a partir de tecido foliar infiltrado com AGLl / R472 sozinho) para gerar uma curva padrão de 500 a 50 ng/mL. As amostras para quantificar foram tratadas em 1% de Triton X-100 antes do carregamento da microplaca. As placas foram ainda incubadas durante 1 hora a 37 °C. Após a lavagem, foi adicionado anticorpo policlonal de ovelha criado contra HA5 (CBER/FDA) diluído 1:1000 e as placas foram incubadas durante 1 hora a 37°C. Após a lavagem, adicionou-se um anticorpo anti-ovino de coelho conjugado com peroxidase de rábano 1:1000 e as placas foram incubadas durante 1 hora a 37'C. Após as lavagens finais, as placas foram incubadas com substrato SureBlue TMB peroxidase (KPL) durante 20 minutos à temperatura ambiente. A reação foi interrompida pela adição de IN HC1 e os valores de A450 foram medidos usando um leitor de placas Multiskan Ascent (Thermo Scientific).
Exemplo 1: extração enzimática de tecido vegetal liberta altas quantidades de HA com uma atividade relativa elevada. A quantidade e a atividade relativa de HA obtida a partir do método de extração enzimática presente foram comparadas com a de HA obtidas a partir de métodos comuns de extração mecânica. Plantas N. benthamianaas foram infiltradas com AGLl/685 e as folhas foram colhidas após um período de incubação de cinco a seis dias. Os homogeneizados de folhas foram preparados da seguinte forma: dois gramas de folhas foram homogeneizados com um homogeneizador Polytron; 4 g de folhas foram moídas com uma argamassa e um pilão; e 25 kg de folhas foram homogeneizadas com um processador COMITROL™ (Urschel Laboratories) num tampão de extração (Tris 50 mM, NaCl 150 mM, pH 8,0, razão de 1:1 p/v) . A extração enzimática foi realizada como segue: vinte gramas de folhas colhidas foram submetidas a digestão com pectinases de Macerozyme e celulases Onozuka R-10 como descrito acima. Após a digestão, os detritos foliares foram removidos por filtração (filtro de nylon, malha de 250 μπι) . Os protoplastos em suspensão foram removidos por centrifugação a 200xg (15 min), e o sobrenadante foi ainda clarificado por centrifugação a 5000xg (15 min). A quantidade e atividade relativa de HA em cada um desses extratos de plantas é mostrada na Tabela 3. A quantidade de HA obtida a partir do método de extração enzimática é significativamente maior do que a obtida a partir dos métodos mecânicos.
Tabela 3: Quantidades comparativas e atividades relativas de ΗΆ obtidas por extração mecânica e enzimática de folhas de plantas. Todos os dados foram ajustados para ter em conta as diferenças de volume de liquido adicionado para cada método de extração. O método de extração Comitrol™ foi escolhido como valor padrão para a finalidade da presente análise conparativa.
Exemplo 2: digestão enzimática do tecido vegetal liberta HA organizado em VLPs.
Foi utilizada uma combinação de centrifugação diferencial e cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) para demonstrar que o HA obtido pelo método de extração enzimática aqui descrito foi organizado como VLPs. As plantas de N. benthamiana foram agro-infiltradas com AGLl/685 como descrito no Exemplo 1. As folhas foram coletadas das plantas 6 dias após a infiltração, cortadas em pedaços de ~ lcm2 e depois digeridas, filtradas grosseiramente e centrifugadas como descrito no Exemplo 1.
As amostras clarificadas foram então centrifugadas a 70 000 xg para permitir a segregação de VLPs. 0 sedimento de centrifugação, contendo as VLPs, foi ressuspenso suavemente em 1/50 de volume de solução salina tamponada com fosfato (PBS, fosfato de sódio 0,1 M, NaCl 0,15 M, pH 7,2) antes de ser carregada numa coluna SEC.
As colunas SEC de 32 ml de esferas de alta resolução SEPHACRYL™ S-500 (S-500 HR: GE Healthcare, Uppsala, Suécia, Cat. No. 17-0613-10) foram preparadas com tampão de equilibrio/eluição (Tris 50 mM, 150 mM NaCl, pH 8) . A cromatografia SEC foi realizada com o carregamento de uma amostra de 1,5 mL de VLP na coluna equilibrada e a sua eluição com 45 mL de tampão de equilibrio/eluição. 0 eluato foi recolhida em frações de 1,7 mL e o teor de proteína de cada fração foi avaliado misturando 10 pL da fração de eluente com 200 pL de reagente de corante de proteína Bio-Rad diluído (Bio-Rad, Hercules, CA) . Cada separação foi precedida por uma calibração com o Blue Dextran 2000 (GE Healthcare Bio-Science Corp., Piscataway, NJ, EUA).
Análise de Proteína das Frações Eluídas SEC 0 teor de proteína total de extratos brutos clarificados foi determinado pelo ensaio de Bradford (Bio-Rad, Hercules, CA) utilizando albumina de soro bovino como padrão de referência. As proteínas apresentadas nas frações de eluição SEC foram precipitadas com acetona (Bollag et al., 1996), ressuspensas em 0,25 volume ou 0,05 volume de tampão de carga da amostra desnaturante (Tris 0,1 M pH 6,8, azul de bromofenol a 0,05%, 12,5% de glicerol, 4% SDS e 5% de beta-mercaptoetanol) para análise SDS-PAGE ou análise de imunoblot, respetivamente. A separação por SDS-PAGE foi realizada sob condições redutoras e Coomassie Brillant Blue R-250 foi utilizado para a coloração de proteínas. O ensaio de hemaglutinação para H5 foi realizado com base em um método descrito por Nayak e Reichl (2004) . Resumidamente, foram feitas diluições duplas sucessivas das amostras de teste (100 pL) em placas de microtitulação de 96 poços com fundo em V contendo 100 pL de PBS, deixando 100 pL de amostra diluída por poço. Cem microlitros de uma suspensão de glóbulos vermelhos de peru de 0,25% (Bio Link Inc., Syracuse, NY) foram adicionados a cada poço e as placas foram incubadas durante 2 h à temperatura ambiente. O recíproco da maior diluição mostrando hemaglutinação completa foi registado como atividade de hemaglutinação. Em paralelo, um padrão de H5 recombinante (A/Vietnam/1203/2004 H5N1) (Protein Science Corporation, Meriden, CT) foi diluído em PBS e funcionou como um controle em cada placa. A Figura 3A mostra que a atividade de hemaglutinação é concentrada nas frações correspondentes ao volume vazio da coluna, confirmando que a atividade de hemaglutinação é originária de uma organização estrutural de alto peso molecular. A análise de SDS-PAGE (Fig. 3B) revelou que essas mesmas frações de volume vazio (frações 7-10) também apresentam o maior conteúdo de HA, sendo que uma banda correspondente ao monómero HA0 é detetável em aproximadamente 75 kDa.
Exemplo 3: digestão enzimàtica do tecido vegetal liberta HA-VLPs com menos contaminantes
As plantas de N. benthamiana foram agro-infiltradas com AGL1/685 como descrito no Exemplo 1. As folhas foram coletadas no dia 6 pós-infiltração, cortadas em - 1 cm2, digeridas, filtradas grosseiramente e centrifugadas como descrito no Exemplo 1. A digestão enzimàtica controlada das folhas removeu as paredes celulares, pelo menos, parcialmente, permitindo assim a libertação de proteínas e componentes presentes no espaço entre a parede celular e a membrana plasmática no meio de extração. Uma vez que a maioria das proteínas e componentes intracelulares ainda estavam intactas e contidas nos protoplastos principalmente intactos, um passo de centrifugação inicial permitiu a sua remoção, proporcionando assim uma solução resultante que inclui enzimas degradantes da parede celular, além das proteínas e componentes da planta extracelular (fração apoplásica), como mostrado na Figura 4. A Figura 4 mostra uma análise SDS-PAGE da solução resultante obtida após a digestão enzimàtica controlada do tecido das folhas como descrito anteriormente, com a linha 1 mostrando a mistura de enzima utilizada e a pista 2 mostrando a solução resultante após a digestão enzimàtica. 0 conteúdo proteico de um extrato bruto de Comitrol™ é fornecido na pista 3 para comparação. A taxa de biomassa: tampão para o extrato apresentado na pista 2 foi de 1:5 (p/v) enquanto era 1:1 (p/ v) para a pista 3. Cada uma das pistas 2 e 3 contém proteínas derivadas de uma quantidade equivalente de material de partida. Para aproximadamente a mesma relação tampão: planta, um extrato de planta mecânica continha uma concentração de proteína de aproximadamente 3,5-4 mg/ml enquanto que o extrato de planta enzimàtica obtido de acordo com o presente método apresentou uma concentração de proteína de aproximadamente 1 mg/ml. O principal contaminante presente na pista 3 foi RubisCo (Ribulose-1,5-bisphosphate carboxilase oxigenase), que é constituído por dois tipos de subunidades de proteínas: uma cadeia larga (L, cerca de 55 kDa) e uma cadeia pequena (S, cerca de 13 kDa). Um total de oito dímeros de grande cadeia e oito pequenas cadeias costumam montar um com o outro em um complexo maior RubisCo 540 kDa. Embora este contaminante de proteína vegetal seja encontrado em grande quantidade em extratos de plantas provenientes do método de extração mecânica (veja a seta na Figura 4) , está praticamente ausente em extratos de plantas obtidos pelo método de digestão enzimática aqui descrito. Portanto, o presente método permite a eliminação deste importante contaminante de proteínas vegetais, entre outros, numa fase inicial do processo.
Exemplo 4: digestão enzimática do tecido vegetal liberta ΗΆ-VLP em condições em que pode ser capturada diretamente em uma resina de troca de catiões.
As plantas de N. benthamiana foram agro-infiltradas com AGLl/685 como descrito no Exemplo 1. As folhas foram recolhidas no dia 6 pós-infiltração, cortadas em pedaços de - 1 cm2 e digeridas durante 15 h à temperatura ambiente em um agitador orbital. O tampão de digestão continha 1,0% (v/ v) Multifect Pectinase FE, 1,0% (v/v) Multifect CX CG or e 1,0% (v/v) Multifect CX B (todos de Genencor) , cada um em uma solução de manitol 600 mM, citrato 75 mM, tampão de bissulfito de sódio 0,04% a pH 6,0 utilizando uma relação de biomassa: tampão de digestão de 1: 2,5 (p/v).
Após a digestão, a fração apoplásica foi filtrada através de um filtro de nylon de 400 pm para remover o tecido vegetal não digerido grosseiro (<5% da biomassa inicial). O extrato filtrado foi então centrifugado à temperatura ambiente durante 15 min a 5000xg para remover protoplastos e contaminantes intracelulares (proteínas, ADN, membranas, vesículas, pigmentos, etc.)· Em seguida, o sobrenadante foi filtrado em profundidade (para esclarecimento) usando um filtro de fibra de vidro de 0,65 pm (Sartopore2/Sartorius Stedim) e um filtro de 0,45/0,2 pm, antes de ser submetido a cromatografia. A fração apoplástico clarificado foi carregado sobre uma coluna de permuta catiónica (Poros HS Applied Biosystems) equilibrada com um tampão de equilíbrio/eluição (50 mM NaP04, 100 mM de NaCl, 0,005% Tween 80 pH 6,0). Uma vez que o UV foi de volta a zero, o extrato foi eluído em etapa com o tampão de equilíbrio/eluição contendo concentrações crescentes de NaCl (500 mM) . Quando necessário, as frações cromatográficas foram concentradas 10 vezes usando dispositivos Amicon™ equipados com MWCO de 10 kDa. A análise de proteínas foi realizada como descrito em exemplos anteriores.
Sob as condições acima mencionadas, a maioria das enzimas e proteínas vegetais não se ligou à resina de permuta catiónica enquanto a HA-VLP se ligava, proporcionando assim um enriquecimento considerável em HA-VLPs na fração eluída (Figura 6). Além disso, como mostrado na Figura 6, pista 4 e 5, as celulases e pectinases não se ligaram à coluna de permuta catiónica a um pH abaixo de 7. Consequentemente, a recuperação de HA-VLP, com base na atividade de hemaglutinação de HA, foi de 92% anterior para carregar na coluna de troca de catiões e de 66% na fração eluída. Um fator de purificação de 194 foi medido na fração eluída a partir da resina de permuta catiónica.
Exemplo 5: adição de NaCl ao tampão de digestão
As plantas de N. benthamiana foram agro-infiltradas com estirpes de Agrobacterium AGLl portadoras de uma construção que expressa uma hemaglutinina de interesse (Hl/ Cal WT, B/Flo, H5/Indo ou Hl/Cal X179A) como descrito no Exemplo 1. As folhas foram recolhidas no dia 6 pós-infiltração, cortada em partes de ~ 1 cm2 e digerida de acordo com o Exemplo 4, exceto quando indicado abaixo. A filtração, a centrifugação e o esclarecimento foram realizados como descrito no Exemplo 4. 0 NaCl foi adicionado ao tampão de digestão para avaliar o seu efeito potencial na taxa de recuperação HA-VLP. As vantagens suspeitas foram a prevenção potencial da associação não especifica de HA com células vegetais ou com partículas em suspensão que são removidas durante o esclarecimento e efeito potencial na realização e/ou manutenção e/ou melhoria da estabilidade coloidal do HA-VLP. A adição de NaCl 500 mM ao tampão de digestão resultou em um aumento do rendimento de recuperação de HA-VLP por grama de biomassa após remoção de protoplastos e detritos celulares por centrifugação. No entanto, esse aumento apenas foi observado com as colhidas Hl/Cal WT e B/Flo, enquanto o rendimento de recuperação para H5 não foi significativamente aumentado por esta abordagem (Tabela 4).
Tabela 4: Efeito da adição de NaCl ao passo de digestão no rendimento de recuperação de HA-VLP (medido por unidade de atividade de hemaglutinaçâo, dil: reciproco de diluição)
A adição de NaCl 500 mM durante a digestão resultou ainda num aumento da libertação de HA-VLP durante a digestão, que por sua vez resultou em uma taxa de recuperação aumentada após o esclarecimento para as estirpes Hl/Cal WT e Hl/Cal X-179A (Tabela 5), mas não para a estirpe H5/Indo.
Tabela 5: Efeito da adição de NaCl ao passo de digestão no rendimento de recuperação HA-VLP (medido pela unidade de atividade de hemaglutinação) após o passo de esclarecimento.
0 estado de associação do HA-VLP, com e sem adição de NaCl durante a digestão enzimática, foi estudado utilizando NANOparticle Tracking Analysis (NTA) para H5/Indo e Hl/Cal WT (Figura 7A e 7B, respetivamente). Uma preparação monodispersa de partículas foi observada para H5 quando a digestão foi realizada na ausência de NaCl, enquanto a preparação de Hl/Cal mostrou um conjunto muito maior de espécies de partículas. A adição de NaCl ao tampão de digestão reduziu a auto-associação HA-VLP para Hl/Cal, como mostrado pela distribuição de partículas bastante monodispersa encontrada na Figura 7C. 0 número de partículas a 150 nm para Hl/Cal WT-VLPs foi aumentado (cerca de 5 vezes) pela adição de 500 mM de NaCl ao tampão de digestão.
Exemplo 6: Controlo da liberação de pigmentos
As plantas de N. benthamiana foram agro-infiltradas com estirpes de Agrobacterium AGL1 portadoras de uma construção que expressa uma hemaglutinina de interesse (H5/ Indo) como descrito no Exemplo 1. As folhas foram recolhidas no dia 6 pós-infiltração, cortadas em ~ 1 cm2 e digeridas como descrito no Exemplo 4, com adição de 500 mM de NaCl ou 500 mM de NaCl e 25 mM de EDTA ao tampão de digestão. A filtração, a centrifugação e o esclarecimento foram realizados como descrito no Exemplo 4. A libertação de componentes com uma cor verde durante o passo de digestão enzimática levou à preparação purificada de VLP com uma coloração esverdeada. A composição da solução de digestão de parede celular foi, portanto, investigada e ajustada para obter uma preparação purificada com VLP com uma coloração verde reduzida e, portanto, toma pureza aumentada. Sem querer ser vinculado pela teoria, uma vez que o Ca2+ desempenha um papel critico na retenção de constituintes das lamelas do meio da parede celular, e dado o facto de que geralmente existe uma alta concentração de Ca2+ na parede celular da planta, a adição de Ca2+ de EDTA-piloto poderia facilitar a despolimerização enzimática da parede celular, preservando assim organelos intracelulares intactas, tais como cloroplastos, e impedindo a libertação de componentes de pigmentos verdes.
Conforme mostrado na Tabela 6, a adição de EDTA 25 mM ao tampão de digestão permitiu a redução da coloração verde da preparação de H5-VLP purificada, conforme avaliado medindo a diferença na absorção da preparação (D0672mn- ODesonm) . Quando os constituintes verdes foram liberados em grande quantidade, ou não foram adequadamente removidos, a preparação de VLP exibiu um AOD> 0,040.
Tabela 6: Efeito da adição de EDTA 25 mH ao tampão de digestão na coloração verde das preparações de H5-VLP.
Exemplo 7: Composições alternativas de tampão de digestão
As plantas de N. benthamiana foram agro-infiltradas com estirpes de Agrobacterium AGLl portadoras de uma construção que expressa uma hemaglutinina de interesse (H5/ Indo) como descrito no Exemplo 1. As folhas foram recolhidas no dia 6 pós-infiltração, cortadas em ~ 1 cm2 e digeridas de acordo com Exemplo 4, com modificação do tampão de digestão para incluir 0,5%, 0,75% ou 1% v/v de Pectinase Multifectada FE, celulase CX-CG Multifect e celulase Multifect CX B como observado nas Tabelas 7-9. A filtração, centrifugação e clarificação foram como descrito no Exemplo 4.
Conforme mostrado nas seguintes tabelas 7 e 8, demonstrou-se que a pectinase não é essencial no tampão de digestão. Níveis semelhantes de H5/Indo ou Hl/Cal WT VLP podem ser extraídos com o presente método na presença ou ausência de pectinase. Além disso, verificou-se que reduzir a concentração de celulase em comparação com exemplos anteriores não teve impacto significativo na qualidade da extração (Tabela 9).
Tabela 7; Libertação de H5/Indo VLP por digestão de folhas de N. bmnthaaxana. Todas as condições foram testadas em repetições. {Concentração em HÃ-VLF medida pela atividade de hemaglutinação, dil: reciproco de diluição)
Tabela 8: Libertação da Hl/Cal WT ¥LF por digestão de folhas de N\ bmnthmtilanã, Todas aa condições foram testadas em repetições. {Concentração em HA-VLP medida pela atividade de hemaglxstlnação? dil: reciproco de diluição)
Tabela 9: Libertação de HX/CaX WT ¥XsP por digestão d® folhas da N, Èmnthami^na, Todas as condições foram testadas em repetições. (Concentração em H&amp;-VLP medida por atividade de ham&amp;gXatinação , díloivel: reciproco de diluição)
Exenqplo 8: digestão enzimàtica em condições próximas ao pH neutro
Controlar o pK durante a digestão pode ser crítico para a extração de algumas VLPs. Tendo em conta que a despolimerização da parede celular ocorrendo durante a etapa de digestão pode libertar açúcares ácidos que podem acidificar a solução {isto é, de pH 6 a 5) na presença de tampões apropriados e que. alguns VLPs (tais como os que compreendem H3/Bris e B/Elo HA) já demonstraram uma forte sensibilidade a condições ligeiramente ácidas, o impacto de tal acidificação potencial sobre o rendimento de VLP produzido foi investigado.
As plantas de N. benthamiana foram ágro-infiltradas com estirpes de Agrobacterium AGLl portadoras de uma construção que expressa uma hemaglutinina de interesse (B/ Fio, H5/T.ndo, H3/Bris.) como descrito no Exemplo 1. As folhas foram recolhidas no dia 6 pós-infíltração, cortadas em partes ~ 1 cm2 e digeridas de acordo com o Exemplo 4, com modificação das condições de digestão para incluir 500 mM de NaCl; EDTA de 25 ou 50 mM; 0,03 ou 0,04% de bissulfito de sódio; 0, 100, 200 ou 600 mM de manitol, 75, 125 ou 150 mM de citrato; e/ou 75 mM NaPO«; com o pH do tampão de digestão ajustado conforme estabelecido nas Tabelas 10-14. A filtração, centrifugação e clarificação foram como descrito no Exemplo 4. Várias composições tampão de digestão foram testadas para atingir um pH de aproximadamente 5,5 até a extremidade da digestão enzimática, incluindo concentração aumentada de citrato (efeito tampão entre pH 3,0 e 5,4) e adição de fosfato de sódio (efeito tampão a pH acima de 6,0). A Tabela 10 mostra que as VLPs da estirpe B foram extraídas de forma mais eficiente quando o pH pós-digestão foi próximo de pH 6,0.
Tabela 10: Efeito da composição do tampão de digestão sobre o rendimento de extração de VLPs B/Flo.
Em seguida, o efeito de iniciar a digestão a um pH mais alto para atingir o valor final do pH próximo de pH 6,0 foi testado. Conforme mostrado na Tabela 11, a digestão da parede celular da planta com tais condições quase neutras foi possível e não prejudicou o rendimento de extração para VLP H5/Indo.
Tabela 11: Efeito do pH inicial do tampão de digestão sobre o rendimento de extração de VLP H5/Indo.
Outros componentes da solução de digestão também mostraram ser modificáveis sem afetar negativamente o rendimento de extração de VLPs. A Tabela 12 ilustra modificações que podem ser aplicadas à solução de digestão para aumentar o rendimento de extração de VLPs B/Flo, ao obter um pH pós-digestão de 5,4-5,7. Tais modificações incluem o aumento da concentração de citrato e adicionando um PO4 tamp.
Verificou-se que o aumento da concentração de EDTA geralmente conduziu a um extrato mais acidificado e a menores rendimentos de extração de VLP.
Tabela 12: Efeito de vários componentes de tampão de digestão no rendimento de extração de VLPs B/Flo.
A composição tampão foi ainda modificada para melhorar o rendimento de extração de VLP H3/Brisbane {Tabela 13)
Tabela 13: Efeito das concentrações de manitol e bissulfito de sódio na solução de digestão sobre o rendimento de extração de VLP H3/Bris.
Conforme mostrado nas Tabelas 12 e 13, a concentração de manitol pode ser reduzida para 200 mM sem afetar significativamente o rendimento de extração de VLPs. A redução adicional das concentrações de manitol a 100 mM, e mesmo a omissão total de manitol a partir da solução de digestão, não afetou significativamente o nível de HA-VLP obtido (Tabela 14).
Tabela 14: Liberado de H5/Indo VLP a partir da digestão de biamassa realizada em tampões com diferentes concentrações de manitol.
Exemplo 9: Adequação da digestão enzimática a uma ampla variedade de HA-VLPs 0 método de digestão enzimática para biomassa vegetal aqui descrito tem potencial para ser aplicado na extração de uma ampla variedade de HA-VLPs. Adicionando-se à extração de HA-VLPs que incluem H5/Indo, Hl/Cal WT VLP, H3/Bris e B/Flo mostrado nos exemplos anteriores, o método aqui descrito também mostrou ser adequado para a extração de HA-VLP de Hl/ Bris e Hl/NC sensorial, como mostrado na Tabela 15.
Tabela 15: Libertação de VLP sazonal Hl/Bris e Hl/NC a partir da digestão de N, Banthamiana agro-infiltrado sai. (concentração em HA medida por atividade de hemaglutinação, dil: reciproco de diluição)
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Claims (14)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Método de preparação de partículas semelhantes a vírus derivadas de plantas (VLPs), que compreende: a. obtenção de uma matéria vegetal ou vegetal compreendendo VLPs localizadas em apoplasto, em que a matéria vegetal consiste em plantas inteiras, folhas de plantas, hastes, frutas, raízes ou uma combinação delas; b. produzir uma fração de protoplastos/esferoplastos e uma fração apoplasto; por tratamento da planta ou matéria vegetal com uma mistura enzimática de vários componentes que degrada a parede celular consistindo em celulase, ou a mistura de enzimas multi-componente que degrada a parede celular compreendendo uma ou mais de uma celulase e uma pectinase, em que a proporção de celulase para pectinase é de 1:1 a 1:0,25; e C. recuperar a fração apoplasto, a fração apoplasto compreendendo as VLP derivadas de plantas.
  2. 2. Método da reivindicação 1, em que a proporção de celulase para pectinase é de 1:1, 1:0,75, 1:0,5 ou 1:0,25.
  3. 3. Método da reivindicação 1, em que a mistura de enzimas multi-componentes que degrada a parede celular compreende ainda um tampão ou sistema de tampão que mantém o pH na gama de 5 a pH 7,8, um osmoticum ou uma combinação de ambos.
  4. 4. Método da reivindicação 1, em que o passo de produção (passo b) produz uma fração de protoplastos/ esferoplastos e um ou mais de um complexo de proteína apoplástica que compreende as VLPs; e o passo de recuperação (passo c) compreende separar o um ou mais de um complexo de proteína apoplástica da fração de protoplastos/esferoplastos.
  5. 5. Método da reivindicação 1, em que o passo de produção (passo b) compreende a digestão da planta ou matéria vegetal utilizando a mistura de enzimas multi-componentes que degradam a parede celular para produzir uma fração digerida; e o passo de recuperação {passo c) compreende a filtração da fração digerida para produzir uma fração filtrada e a recuperação das VLP derivadas da planta da fração filtrada.
  6. 6. Método de qualquer uma das reivindicações 1-5, em que a mistura de enzimas multi-componentes que degrada a parede celular não inclui uma ou mais de uma lipase ou uma protéase.
  7. 7. Método de qualquer uma das reivindicações 1-6 em que no passo de obtenção (passo a), a planta é transformada com uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína selecionada a partir do grupo de uma proteína de envelope virai, uma proteína estrutural virai, uma proteína de cápside virai e uma proteína de revestimento viral, e a matéria vegetal ou vegetal é colhida, de preferência o ácido nucleico codifica a hemaglutinina da gripe.
  8. 8. Método da reivindicação 1, em que a concentração de uma ou mais de uma pectinase está entre 0,01% v/v a 2,5% v/ v ou em que a concentração de uma ou mais de uma celulase está entre 0,1% a 5 % p/v.
  9. 9. Método de qualquer uma das reivindicações 1-8, em que o ácido nucleico é introduzido na planta de uma maneira transitória ou em que o ácido nucleico é integrado de forma estável dentro de um genoma da planta.
  10. 10. Método de qualquer uma das reivindicações 1 a 9 em que no passo de obtenção (passo a), a planta é cultivada e a matéria vegetal ou vegetal colhida.
  11. 11. Método de qualquer uma das reivindicações 1-10, em que as VLP derivadas da planta não incluem a neuraminidase ou a proteína M.
  12. 12. Método de qualquer uma das reivindicações 1 a 11, em que a matéria da planta é selecionada do grupo de folhas.
  13. 13. Método de qualquer uma das reivindicações 1 a 12, compreendendo ainda um passo de d) purificar as VLP derivadas da planta a partir da fração, de preferência o passo de purificação compreende filtrar a fração utilizando filtração em profundidade para produzir um extrato clarificado, seguido por cromatografia de o extrato clarificado utilizando uma resina de permuta catiónica.
  14. 14. Método da reivindicação 5 compreendendo ainda um passo d) de separação das VLP na fração filtrada dos detritos celulares e materiais insolúveis, de preferência o passo de separação é realizado por centrifugação e/ou por filtração em profundidade.
PT108181900T 2009-09-22 2010-09-21 Método de preparação de vlps derivados de plantas PT2480658T (pt)

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