PT2443104E

PT2443104E - Antagonistas do caminho hedgehog de ftalazina dissubstituída

Info

Publication number: PT2443104E
Application number: PT107267569T
Authority: PT
Inventors: Philip Arthur Hipskind; Takako Wilson-Nee-Takakuwa; Bharvin Kumar Patel
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 2009-06-19
Filing date: 2010-06-15
Publication date: 2013-05-07
Also published as: AU2010260244A1; KR20120024783A; TN2011000627A1; US20100324048A1; JP2012530705A; IL216599A0; PL2443104T3; KR101389165B1; HK1164872A1; HRP20130408T1; JP5596139B2; CA2764542C; CN102459233B; MX2011014029A; SI2443104T1; AU2010260244B2; DK2443104T3; HN2011003139A; PE20121050A1; ZA201108587B

Description

ΡΕ2443104 1 DESCRIÇÃO "ANTAGONISTAS DO CAMINHO HEDGEHOG DE FTALAZINA DISSUBSTITUIDA" A presente invenção diz respeito a antagonistas do caminho Hedgehog e, mais especificamente, a novas ftala-zinas 1,4-dissubstituídos e seu uso terapêutico. 0 caminho de sinalização Hedgehog (Hh) desempenha um importante papel na formação do padrão embrionário e manutenção de tecido adulto, orientando a diferenciação e proliferação celular. A familia de proteínas Hedgehog (Hh), que inclui Sonic Hedgehog (Shh), Indian Hedgehog (Ihh) e Desert Hedgehog (Dhh), são glicoproteínas segregadas que são submetidas a modificações pós-translacionais, incluindo a clivagem auto-catalítica e o acoplamento de colesterol ao péptido amino-terminal de modo a formar o fragmento que possui atividade de sinalização. Hh liga-se à proteína da transmembrana de 12 passagens Ptch (Ptchl e Ptch2), aliviando assim a supressão mediada por Ptch de Smoothened (Smo). A ativação de Smo desencadeia uma série de eventos intracelulares que culminam na estabilização dos fatores de transcrição Gli (Glil, Gli2 e Gli3) e a expressão de genes dependentes de Gli, que são responsáveis pela proliferação celular, sobrevivência celular, angiogénese e invasão. 2 ΡΕ2443104 A sinalização de Hh tem atraído recentemente considerável interesse com base na descoberta de que a ativação aberrante da sinalização de Shh conduz à formação de vários tumores, por exemplo, cancro pancreático, medulo-blastoma, carcinoma basocelular, cancro do pulmão de pequenas células e cancro da próstata. W02005033288 revela certos compostos 1,4-dissubstituídos de ftalazina afirmados como sendo antagonistas de Hedgehog. De modo semelhante, W02008110611 revela certos compostos de ftalazina 1,4-dissubstituídos relacionados com o diagnóstico e tratamento de patologias relacionadas com o caminho de Hedgehog. W02009002469 revela certos compostos de ftalazina 1,4-dissubstituídos que são declarados como sendo uma opção de tratamento para todos os tumores conduzidos por sinalização de Hedgehog inapropriada.

Existe ainda uma necessidade de inibidores potentes do caminho de Hedgehog, particularmente aqueles tendo perfis de toxicologia desejáveis. A presente invenção proporciona novas ftalazinas 1,4-dissubstituídas que são antagonistas potentes deste caminho. Os compostos particulares da presente invenção proporcionam a interação fárma-co-fármaco desejável e perfis de segurança relacionados com respeito à potencial de inibição do CYP3A4 reversível e/ou irreversível à base do mecanismo. A presente invenção proporciona um composto de

Fórmula I 3 ΡΕ2443104

Fórmula I em que R1 representa hidrogénio ou metilo; R2 representa hidrogénio ou metilo; R3, R4, R5, R6 ou R7 representam, independentemente, hidrogénio, flúor, cloro, ciano, trifluorometilo, trifluoro-metoxi, difluorometoxi, metilsulfonilo ou trifluorometil-sulfonilo, com a condição de que pelo menos três de R3, R4, R5, R6 e R7 representem hidrogénio; ou um seu sal farmaceuticamente aceitável. A presente invenção também proporciona uma composição farmacêutica compreendendo um composto de Fórmula I, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, em combinação com um excipiente, agente de suporte ou diluente farmaceu-ticamente aceitável.

Além disso, a presente invenção proporciona um composto de Fórmula I, ou um seu sal f armaceuticamente aceitável, para utilização em terapia. Além disso, esta invenção proporciona um composto de Fórmula I, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, para utilização no tratamento do cancro. Em particular, o cancro é selecionado a partir do grupo constituído por cancro do cérebro, carcinoma basocelular, cancro do esófago, cancro do estômago, 4 ΡΕ2443104 cancro gástrico, cancro pancreático, cancro do trato biliar, cancro da próstata, cancro da mama, cancro do pulmão de pequenas células, cancro do pulmão de não pequenas células, linfoma de células B, mieloma múltiplo, cancro do ovário, cancro colorretal, cancro do figado, cancro do rim, melanoma, cancro da cabeça e do pescoço, mesotelioma, sarcoma dos tecidos moles, sarcomas ósseos, leucemia e cancro testicular.

Adicionalmente, a presente invenção proporciona a utilização de um composto de Fórmula I, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, para o fabrico de um medicamento para o tratamento do cancro. Em particular, o cancro é selecionado a partir do grupo constituído por cancro do cérebro, carcinoma basocelular, cancro do esófago, cancro do estômago, cancro gástrico, cancro pancreático, cancro do trato biliar, cancro da próstata, cancro da mama, cancro do pulmão de pequenas células, cancro do pulmão de não pequenas células, linfoma de células B, mieloma múltiplo, cancro do ovário, cancro colorretal, cancro do fígado, cancro do rim, melanoma, cancro da cabeça e pescoço, mesotelioma, sarcoma dos tecidos moles, sarcomas ósseos, leucemia e cancro testicular.

Além disso, a presente invenção proporciona uma composição farmacêutica compreendendo um composto de Fórmula I, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, como ingrediente ativo para o tratamento do cancro selecionado a partir do grupo constituído por cancro do cérebro, o ΡΕ2443104 carcinoma basocelular, cancro do esófago, cancro do estômago, cancro gástrico, cancro pancreático, cancro do trato biliar, cancro de próstata, cancro de mama, cancro do pulmão de pequenas células, cancro do pulmão de não pequenas células, linfoma de células B, mieloma múltiplo, cancro de ovário, cancro colorretal, cancro de figado, cancro de rim, melanoma, cancro da cabeça e do pescoço, mesotelioma, sarcomas dos tecidos moles, sarcomas ósseos, leucemia e cancro testicular.

Os compostos particulares de Fórmula I, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, são aqueles em que: (a) R1 representa metilo; (b) R2 representa metilo; (c) R3, R4, R5, R6 ou R7 representam independentemente hidrogénio, flúor, cloro, trifluorometilo ou metilsulfonilo; (d) R3, R4, R5, R6 ou R7 representam independentemente hidrogénio, fluoro ou trifluorometilo; (e) pelo menos dois dos R3, R4, R5, R6 e R7 representam independentemente fluoro, cloro, trifluoro-metilo ou metilsulfonilo, com a condição de que R3 e R7 não representam simultaneamente hidrogénio; (f) pelo menos dois dos R3, R4, R5, R6 e R7 representam independentemente fluoro ou tri-fluorometilo, com a condição de que R3 e R7 não representam simultaneamente hidrogénio; 6 ΡΕ2443104 (g) R4, R6 e R7 representam hidrogénio; (h) R3 e R5 representam independentemente fluoro, cloro, trifluorometilo ou metilsulfonilo; e R4, R6 e R7 representam hidrogénio; (i) R3 e R5 representam independentemente fluoro ou trifluorometilo; e R4, R6 e R7 representam hidrogénio; (j) R1 representa metilo; e R2 representa metilo; (k) R1 representa metilo; R2 representa metilo; e R3, R4, R5, R6 ou representam independentemente hidrogénio, flúor, cloro, trifluorometilo ou metilsul-fonilo; (l) R1 representa metilo; R2 representa metilo; e R3, R4, R5, R6 ou R7 representam independentemente hidrogénio, fluoro ou trifluorometilo; (m) R1 representa metilo; R2 representa metilo; e pelo menos dois dos R3, R4, R5, R6 e R7 represen tam independentemente fluoro, cloro, trifluoro-metilo ou metilsulfonilo com a condição de que R3 e R7 não representem simultaneamente hidrogénio; (n) R1 representa metilo; R2 representa metilo; e pelo menos dois dos R3, R4, R5, R6 e R7 repre sentam independentemente fluoro ou trifluoro-metilo, com a condição de que R3 e R7 não representam simultaneamente hidrogénio; (o) R1 representa metilo; R2 representa metilo; e R4, R6 e R7 representam hidrogénio; 7 ΡΕ2443104 (p) R1 representa; R2 representa metilo; R3 e R5 representam independentemente fluoro, cloro, tri-fluorometilo ou metilsulfonilo; e R4, R6 e R7 representam hidrogénio; e (q) R1 representa metilo; R2 representa metilo; R3 e R5 representam independentemente fluoro ou tri-fluorometilo; e R4, R6 e R7 representam hidrogénio .

Tal como utilizado acima, e ao longo da descrição da invenção, os seguintes termos, a menos que indicado em contrário, devem ser entendidos como tendo os seguintes significados:

Um "agente de suporte, diluente, ou excipiente farmaceuticamente aceitável" é um meio geralmente aceite na técnica para a entrega de agentes biologicamente ativos a mamíferos, por exemplo, seres humanos. "Sais farmaceuticamente aceitáveis" refere-se a sais inorgânicos e orgânicos relativamente não-tóxicos de compostos da presente invenção. "Quantidade terapeuticamente eficaz" ou "quantidade eficaz" significa a quantidade do composto de Fórmula I, ou de um seu sal farmaceuticamente aceitável, da presente invenção ou uma composição farmacêutica contendo um composto de Fórmula I, ou um seu sal farmaceuticamente ΡΕ2443104 aceitável, da presente invenção, que irá desencadear a resposta biológica ou médica do desejado efeito terapêutico sobre um tecido, sistema, animal, mamifero ou humano que está a ser procurada pelo investigador, veterinário, médico ou outro clinico.

Os termos "tratamento", "tratar", "tratando" e semelhantes, são destinados a incluir o abrandamento ou reversão da progressão de uma doença. Estes termos também incluem o alivio, melhora, atenuação, eliminação ou redução de um ou mais sintomas de uma desordem ou condição, mesmo se a desordem ou condição não for efetivamente eliminada e mesmo se a progressão da desordem ou condição não é em si retardada ou invertido.

Sob a nomenclatura padrão utilizada ao longo desta revelação, a porção terminal da cadeia lateral designada é descrita primeiro, seguida pela funcionalidade adjacente em direção ao ponto de ligação. Por exemplo, um substituinte metilsulfonilo é equivalente a CH3-SO2-. M. Berge et al.

Os compostos da presente invenção são capazes de reação, por exemplo, com numerosos ácidos inorgânicos e orgânicos para formar sais de adição de ácido farmaceuticamente aceitáveis. Tais sais farmaceuticamente aceitáveis e metodologia comum para a sua preparação são bem conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, P. Stahl et al., HANDBOOK OF PHARMACEUTICAL SALTS: PROPERTIE SELECTION AND USE, VCHA/Wiley-VCH, 2002; S. 9 ΡΕ2443104 "Pharmaceutical Salts" in Journal of Pharmaceutical Sciences, 66(1) (Janeiro de 1977).

Os compostos da presente invenção são preferencialmente formulados na forma de composições farmacêuticas utilizando um agente de suporte, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável, e administrados por uma variedade de vias. Preferivelmente, tais composições são para administração oral ou intravenosa. Tais composições farmacêuticas e processos para a sua preparação são bem conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, REMINGTON: THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY, 19a ed., Gennaro et al., eds., Mack Publishing Co., 1995. 0 composto atualmente administrado será determinado por um médico nas circunstâncias relevantes, incluindo a condição a ser tratada, a via de administração escolhida, o composto ou compostos atuais administrados, a idade, peso e resposta do paciente individual, e da gravidade dos sintomas do paciente. As dosagens por dia normalmente caem dentro do intervalo de cerca de 0,1 a cerca de 10 mg/kg de massa corporal. Em alguns casos, os niveis de dosagem abaixo do limite inferior da gama acima mencionada podem ser mais do que adequados, enquanto noutros casos doses ainda maiores podem ser empregues.

Os compostos de Fórmula I, ou os seus sais, podem ser preparados por uma variedade de procedimentos conhe- 10 ΡΕ2443104 eidos na técnica, bem como as descritas no Esquema, Preparações e Exemplos abaixo. Os passos específicos de síntese para cada uma das vias descritas podem ser combinados de maneiras diferentes para preparar compostos de Fórmula I, ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis.

Os substituintes, a menos que seja indicado o contrário, são conforme previamente definidos. Os reagentes e materiais de partida estão geralmente prontamente disponíveis a um perito vulgar na técnica. Outros podem ser feitos por técnicas padrão de química orgânica e heterocíclica, técnicas que são análogas às sínteses de compostos semelhantes estruturalmente conhecidos, e os procedimentos descritos nas Preparações e Exemplos que se seguem, incluindo quaisquer novos procedimentos. A nomeação das seguintes Preparações e Exemplos é feita usando o recurso de nomeação Struct = Name em ChemDraw® Ultra 10.0.

Conforme aqui usados, os termos seguintes têm os significados indicados: "Et20" refere-se a éter dietílico; " DMF" refere-se a dimetilformamida, "DMSO" refere-se a dimetilsulf óxido, "DMAC" refere-se a N, iV-dimetilacetamida", "NMP" refere-se a IV-metilpirrolidina, "MeOH" refere-se a metanol, "boc" ou "t-boc" refere-se a terc-butoxicarbonilo, e "IC5o" refere-se à concentração de um agente que produz 50% da resposta inibitória máxima possível para aquele agente. 11 ΡΕ2443104

Esquema

Um composto de Fórmula I pode ser preparado de acordo com as reações conforme delineadas no Esquema.

No Passo 1, uma ftalazina di-halossubstituida (1) (X=C1 ou Br) é feita reagir com uma 4-amino protegido por Boc-piperidina (2) numa substituição aromática nucleofilica (SNAr) para produzir uma halo-piperidil-ftalazina de fórmula (3) . A reação prossegue num solvente aprótico dipolar tal como DMF, DMAC ou NMP, na presença de uma base orgânica ou inorgânica. Preferivelmente, a reação tem lugar no seio de NMP, na presença de carbonato de potássio, a uma temperatura de 50-140 0 C.

No Passo 2 uma halo-piperidil-ftalazina de 12 ΡΕ2443104 fórmula (3) é submetida a uma reação de acoplamento cruzado de Suzuki com um éster ou ácido pirazol-borónico (4) . Por exemplo, uma halo-piperidil-ftalazina (3) é combinada éster de pinacol do ácido l-metil-lií-pirazole-5-borónico na presença de um catalisador de paládio, tal como tetra-quis (trifenilfosfina)paládio e uma base inorgânica, tal como bicarbonato de sódio. A reação prossegue numa mistura solvente de tolueno/etanol/água para dar a pirazolilo-ftalazina de fórmula (5). 0 Passo 3, é uma desproteção de boc simples realizada sob condições acidicas, tais como HC1 em éter dietilico ou dioxano para dar a aminopiperidinil-ftalazina de fórmula geral (6). Os métodos para a introdução e remoção dos grupos de proteção de azoto e oxigénio são bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Greene e Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3a Ed., John Wiley and Sons, Nova Iorque, (1999)).

No Passo 4, a aminopiperidinil-ftalazina de fórmula (6) é acilada para dar a piperidinilo-amida de Fórmula I. Num método, a amina é feita reagir com um cloreto de benzoilo apropriadamente substituído num solvente inerte, tal como diclorometano, na presença de uma base orgânica tal como trietilamina ou di-isopropil-etilamina. Alternativamente, a amida é formada utilizando um ácido benzóico apropriadamente substituido. Um éster ativo é formado usando difenilfosfinato de pentafluorofenilo seguido por reação 13 ΡΕ2443104 com a amina. A reação prossegue numa mistura solvente de DMF/DMSO a uma temperatura de cerca de -10 a 100 °C na presença de uma base orgânica, tal como trietilamina ou di-isopropiletilamina.

Preparação 1 1-(4-Cloroftalazin-l-il)piperidin-4-il(metil)carbamato de terc-butilo

Aquecer uma mistura de carbonato de potássio (21,23 g, 153,6 mmol), 1,4-dicloroftalazina (26 g, 128 mmol) e éster de terc-butilo do ácido metil-piperidin-4-ilcarbâmico (30,01 g, 134,4 mmol) em iV-metilpirrolidina (200 mL) a 80 °C durante a noite. Verter a mistura reacional em água, extrair com diclorometano, secar sobre Na2S04 e concentrar sob pressão reduzida. Adicionar éter dietilico e separar por filtração o sólido resultante (4-cloroftalazin-l-ol da impureza do material de partida). Concentrar o filtrado. Purificar o resíduo resultante por cromatografia flash sobre gel de sílica (hexano:acetato de etilo=2:l) para proporcionar o composto mencionado em título na forma dum sólido branco (17,66 g, 37%). ES/MS m/z (37C1) 377,0 (M+l) . PE2443104 14

Preparação 2 1-(4-Cloroftalazin-l-il)piperidin-4-ilcarbamato de terc-butilo

Preparar o composto mencionado em título seguindo essencialmente o procedimento descrito na Preparação 1, utilizando éster de terc-butilo do ácido piperidin-4-il--carbâmico. Arrefecer a mistura de reação e verter sobre água (500 mL) . Extrair com acetato de etilo, lavar com água, secar sobre Na2S04 e remover os solventes sob pressão reduzida para proporcionar o composto mencionado em título na forma dum sólido amarelo (36 g, 97%). ES/MS m/z 363,0 (M+l). PREPARAÇÃO 3

Metil (1-(4- (l-metil-l.ff-pirazol-5-il) ftalazin-l-il) -piperidin-4-il)carbamato de terc-butilo

Colocar carbonato de sódio (3,82 g, 36,09 mmol), 1- (4-cloroftalazin-l-il)piperidin-4-il(metil)carbamato de terc-butilo (6,8 g, 18,04 mmol) e éster de pinacol de ácido l-metil-lfí-pirazole-5-borónico (5,63 g, 27,1 mmol) num ba- 15 ΡΕ2443104 Ião com uma mistura de tolueno (50 mL) , etanol (17 mL) e água (17 mL) . Desgaseificar a mistura durante 10 min com azoto gasoso. Adicionar tetraquis(trifenilfosfina)paládio (0,4 g, 0,35 mmol) e aquecer a mistura a 74 °C durante a noite. Arrefecer a mistura à temperatura ambiente e diluir com diclorometano. Lavar a porção orgânica com água salgada, secar sobre Na2SC>4 e concentrar sob pressão reduzida. Purificar o resíduo resultante por cromatografia flash sobre gel de sílica (hexano: acetato de etilo:NH3 2 M em MeOH = 20:5:1) para proporcionar o composto mencionado em título na forma duma espuma amarela (5,33 g, 70%). ES/MS m/z 423,2 (M+l).

Procedimento alternativo para preparar metil(1-(4-(1-metil--l.ff-pirazol-5-il) ftalazin-l-il) piperidin-4-il)-carbamato de terc-butilo: Preparações 4-6

Preparação 4 1,4-Dibromoftalazina

» X

xJ /.......\ &,% ...... % 8

Carregar um tubo de pressão com pentabrometo de fósforo (24,5 g, 54,1 mmol) e 2,3-di-hidro-ftalazina-l,4--diona (5,00 g, 30,8 mmol). Selar o tubo e aquecer a 140 °C durante 6-7 h. Deixar arrefecer durante a noite. Cuidadosamente abrir o tubo, devido à pressão. Guiar para fora o sólido e verter em água gelada. Deixar em agitação ΡΕ2443104 em água gelada e recolher o sólido resultante por filtração sob vácuo. Secar numa estufa de vácuo para se obter o produto final (8,31 g, 93%). ES/MS (79Br, 81Br) m/z 288,8 (M+). Refa: Can. J. Chem., 43 (1965) 2708.

Preparação 5 1-(4-Bromoftalazin-l-il)piperidin-4-il-(metil)carbamato de terc-butilo / % \ V / \\ J /""v\ / V /—0· \

Combinar 1,4-dibromoftalazina (0,70 g, 2,38 mmol), N-metilpirrolidona (7,0 mL), carbonato de potássio (395 mg, 2,86 mmol) e éster de terc-butilo do ácido metil-piperidin-4-il-carbâmico (532 mg, 2,38 mmol). Aquecer a 80 °C durante a noite. Arrefecer e verter em água. Recolher o sólido e secar numa estufa de vácuo à temperatura ambiente durante a noite para se obter o produto final (0,96 g, 95%). ES/MS m/z (81Br) 421,0 (M+l).

Preparação 6

Metil(1-(4-(l-metil-l.ff-pirazol-5-il)-ftalazin-1--il)piperidin-4-il)carbamato de terc-butilo

17 ΡΕ2443104

Carregar um tubo de reação com 1-(4-bromo-ftalazin-l-il)piperidin-4-il(metil)carbamato de terc-butilo (500 mg, 1,2 mmol), éster de pinacol do ácido l-metil-lH--pirazol-5-borónico (370 mg, 1,8 mmol), carbonato de sódio (252 mg, 2,4 mmol), tolueno (3,75 mL) , etanol (1,25 mL) e água (1,25 mL) . Desgaseificar a mistura de reação com azoto durante 10 min. Adicionar tetraquis(trifenilfosfina)paládio (137,1 mg, 118,7 ymol). Borbulhar azoto através da mistura reacional durante mais 10 min. Tapar o frasco de reação e aquecer a 90 °C durante a noite. Arrefecer a reação e filtrar através de uma almofada de gel de silica, eluindo com MeOH 5%:CH2Cl2. Concentrar as frações sob pressão reduzida. Purificar o resíduo resultante usando cromato-grafia sobre gel de sílica (NH3 2 N 2% em MeOH:CH2CÍ2) para se obter o produto final (345,6 mg, 69%). ES/MS m/z 423,2 (M+l).

Preparação 7 (1- (4- (l.ff-Pirazol-5-il) -ftalazin-l-il)piperidin-4—il-(metil)carbamato de terc-butilo

H

Preparar o composto mencionado em título seguindo essencialmente o procedimento descrito na Preparação 3, utilizando 1- (4-cloroftalazin-l-il)piperidin-4-il(metil)-carbamato de terc-butilo e éster de pinacol do ácido 18 ΡΕ2443104 líí-pirazol-3-borónico para proporcionar 580 mg, (67%). ES/MS m/z 409,2 (M+l).

Preparação 8 (1-(4- (l-Metil-l/f-pirazol-5-il) ftalazin-l-il)piperidin-4--ilcarbamato de terc-butilo

f % \ / % rui. í-^ \ i \ J N ísi-^ Nd # í ·> \ H

Preparar o composto mencionado em titulo seguindo essencialmente o procedimento descrito na Preparação 3, utilizando 1-(4-cloroftalazin-l-il)piperidin-4-ilcarbamato de terc-butilo para se obterem 5,92 g (94%). ES/MS m/z 308,8 (M+) .

Preparação 9 W-Metil-1- (4- (l-metil-l.ff-pirazol-5-il) ftalazin-1--il)piperidin-4-amina

fS / %

H N \

Dissolver metil(1-(4-(l-metil-lH-pirazol-5-il)-ftalazin-l-il)piperidin-4-il)carbamato de terc-butilo (7,77 g, 18,39 mmol) em diclorometano (100 mL). Adicionar um excesso 19 ΡΕ2443104 de cloreto de hidrogénio 1 M em éter dietilico (20 mL, 80 mmol) à solução e agitar à temperatura ambiente durante 2 h. Concentrar sob pressão reduzida. Purificar o resíduo resultante por cromatografia flash sobre gel de sílica (diclorometano:NH3 2 M em MeOH=10:l) para dar o composto mencionado em título na forma duma espuma amarela (5,83 g, 98%). ES/MS m/z 323,2 (M+l).

Preparar os intermediários na tabela abaixo seguindo essencialmente o procedimento descrito na Preparação 9, com a exceção de que a amina protegida por t-Boc apropriada é desprotegida usando HC1 4 M em dioxano.

Prsp. N2 Nome químico Estrutura ES/MS m/z 10 1- (4- (lfí-pirazol-5-il)ftalazin-l-il)-N-metilpiperidin-4-and.na / \ H II y-(v Λ—N )—N m-n ^^ H 309,2 (M9 11 1-(4-(l-metil-lH-pirazol-5-il) ftalazin-l-il)-piperidin-4-amina N"N n-n n—f \ 408,8 (M9

Exemplo 1 4-Fluoro-W-metil-W- (1-(4- (l-metil-l.ff-pirazol-5-il) -ftalazina-l-il)piperidin-4-il)-2-(trifluorometil)benzamida

F F i =i Φ-Κ D >—v. 1 20 ΡΕ2443104

Tratar uma solução de N-metil-1-(4-(1-metil-lH--pirazol-5-il)ftalazin-l-il)piperidin-4-amina (2,8 g, 8,68 mmol) e trietilamina (3,36 mL, 26,1 mmol) em CH2CI2 (30 mL) com cloreto de 4-fluoro-2-(trifluorometil)benzoílo (2,14 mL, 10,42 mmol). Agitar durante 3 h à temperatura ambiente. Concentrar a mistura de reação sob pressão reduzida. Purificar o resíduo resultante por cromatografia flash sobre gel de sílica (hexano: acetato de etilo:NH3 2 M em MeOH = 20:5:1) para proporcionar a base livre na forma de uma espuma amarela (3,83 g, 86%). ES/MS m/z 513,0 (M+l).

Exemplo la

Hidrocloreto de 4-fluoro-N-metil-N- (1-(4-(l-metil-lH--pirazol-5-il)ftalazina-l-il)piperidin-4-il)-2— -(trifluorometil)benzamida

Dissolver 4-fluoro-N-metil-N-(1-(4-(1-metil-lH--pirazol-5-il)-ftalazin-l-il)piperidin-4-il)-2-(trifluoro-metil)-benzamida (7,13 g, 13,91 mmol) em diclorometano (100 mL) e adicionar excesso de HC1 1 N em éter dietilico (30 mL, 30 mmol). Remover os solventes sob pressão reduzida para produzir o composto mencionado em titulo (7,05 g, 92%). ES/MS m/z 513,0 (M+l). RMN revelou uma mistura 2:1 de rotâmeros de amida. Rotâmero maior; 1H-RMN (400 MHz, DMSO- d6) : δ 8,34 (m, 1H), 8,2 6 (m, 2H) , 7, 95 (m, 1H) , 7,75 (m 1H) , 7,64 (m, 2H) , 7 , 55 (m, 1H) , 6 ,72 (d, IH, J = 2 Hz) 5,15 (br, 1H), 4,71 (m, 1H) , 4,22 (m, 2H) , 3, 84 (s, 3H) 21 ΡΕ2443104 3,4 8 (m, 2H) , 2, 65 (s , 3H) , 2, 19 (m, 2H) , 1,89 (m, 2H) . Rot âmero meno. r; 1 H- RMN (400 MHz, DMSO- d6) : δ 8,27 (m, 1H) , 8,2 4 (m, 2H) , 7, 94 (m , 1H) , 7, 73 (m, 1H) , 7, 63 (m, 3H) , 6,7 0 (d, IH, J = 2 Hz) , 5,1 .5 (br, 1H) , 4,71 (m, 1H) , 4,07 (m, 2H) , 3, 81 (s, 3H) , 3,16 (m, 2H) , 2, ,92 (s, 3H) , 1, 90 (m, 2H) r 1, 62 (m, 2H) .

Preparar as amidas na tabela abaixo seguindo essencialmente os procedimentos descritos nos Exemplos 1 e 1-a, usando a piperidinilftalazina e cloreto de benzoilo substituído apropriados.

Ex. Ne Nane químico Estrutura ES/MS m/z 2 Hidrocloreto de 2-fluoro-iV-metil-W- (1-(4-(1-metil-lH-pirazol-5-il)ftalazin-1-il)piperidin-4-il)-3-(tri fluorometil)benzamida F F HC! F y~f "N n—n v—-/ \ \ 513,0 (M+l) 3 Hidrocloreto de N-metil-N- (1-(4-(l-metil-lH-pirazol-5-il)ftalazin-l-il)piperidin-4-il) -4-(trifluorometoxi)-benzamida Q m n-n O-, 511,0 (M+l) 4 Hidrocloreto de N-metil-N- (1-(4-(l-metil-lH-pirazol-5-il)ftalazin-l-il)piperidin-4-il) -2-(trifluorometoxi)-benzamida F F y~F f~\ HC) ^ 0 513,0 (M+l) 5 Hidrocloreto de 5-fluoro-i\7-metil-W- (1-(4-(1-metil-lH-pirazol-5-il)ftalazin-1-il)piperidin-4-il)-2-(tri fluorometil)benzamida F F HCi rvrvo-^M H S|'—* \ p \ 513,0 (M+l) ΡΕ2443104 22 (continuação)

Ex. Ne Nane químico Estrutura ES/MS m/z 6 Hidrocloreto de 3, 5-dicloro-I\7-metil-W- (1-(4-(1-metil-lH-pirazol-5-il)ftalazin-1-i1)piperidin-4-i1)benzamida /^\ HCi yC! "N ''-f \ q (35C1) 495,0 (M+l) 7 Hidrocloreto de 4-ciano-W-metil-W- (1-(4-(1-metil-lH-pirazol-5-il)ftalazin-1-i1)piperidin-4-i1)benzamida f~\ ** n-n \ 526,2 (M+l) 8 Hidrocloreto de N- (1-(4-(1H-pirazol-5-il)ftalazin-l-il)-piperidin-4-il) -4-fluoro-i\7-metil-2-(trifluorometil) -benzamida F F β~\ F~X jjV.....ζi( H 499,0 (M+l) 9 Hidrocloreto de N-(1-(4-(1- metil-lH-pirazol-5- il)ftalazin-l-il)piperidin-4- il) -4-(trifluorometoxi)- benzamida /Λ HCi V \ / Q /**\ \ 497,0 (M+l) 10 Hidrocloreto de N- (1-(4- (1-metil-lff-pirazol-5-il) -ftalazin-l-il)piperidin-4-il)-2-(trifluorometoxi)benzamida F F HCÍ 0 'N N-N \-> H 497,0 (M+l) 11 Hidrocloreto de 5-fluoro-A?-(1-(4-(l-metil-lH-pirazol-5-il)-ftalazin-l-il)piperidin-4-il)-2-(trifluorometil)benzamida F F f~\ HCÍ rV-O-O-^ÍM N '—' H p 499,0 (M+l) 12 Hidrocloreto de 4-fluoro-A?-(1-(4-(l-metil-lH-pirazol-5-il)-ftalazin-l-il)piperidin-4-il)-2-(trifluorometil)benzamida F F Λ—a HCi F~V íKn^íi x~7 \ 499,0 (M+l) 13 Hidrocloreto de 4-ciano-W- (1-(4-(l-metil-lH-pirazol-5-il)ftalazin-l-il)piperidin-4-il)benzamida /~\ ™ Q N N-N '—/ H 438,0 (M+l) 23 ΡΕ2443104

Exemplo 14

Hidrocloreto de 4-cloro-N-metil-W- (1- (4- (1-metil-líí--pirazol-5-il)-ftalazin-l-il)piperidin-4-il)-2— -(metilsulfonil)-benzamida

Dissolver iV-metil-1- (4- (l-metil-lií-pirazol-5-il) --ftalazin-l-il)piperidin-4-amina (100 mg, 0,31 mmol), ácido 4-cloro-2-(metilsulfonil)benzóico (87 mg, 0,37 mmol) e di-isopropiletilamina (0,26 mL, 1,5 mmol) em DMF:DMSO = 4:1 (2 mL) a 60 °C. Arrefecer até 0 °C e adicionar difenilfos-finato de pentafluorofenilo (250 mg, 0,65 mmol) em DMF:DMSO =1:1 (1 mL) à solução. Agitar a mistura a 60 °C durante a noite. Arrefecer a mistura reacional até à temperatura ambiente e diluir com CH2CI2, lavar com água salgada, secar sobre Na2S04 e concentrar sob pressão reduzida. Purificar o residuo resultante por cromatografia flash sobre gel de silica (hexano:acetato de etilo: NH3 2 M em MeOH = 20:5:1) para produzir o produto. Adicionar excesso de HC1 1 N em éter dietílico (1 mL, 10 mmol) ao produto isolado e remover o solvente para proporcionar o composto mencionado em titulo (150 mg, 84%). ES/MS m/z 539,0 (M+l).

Preparar as amidas na tabela abaixo seguindo - 24 - ΡΕ2443104 essencialmente o procedimento descrito no Exemplo 14, usando a piperidinilftalazina e o ácido benzóico substituído apropriados.

Ex. Ne Nane químico Estrutura ES/MS m/z 15 Hidrocloreto de N-metil-N- (1-(4-(l-metil-lH-pirazol-5-il)ftalazin-l-il)piperidin-4-il)-2-(metilsulfonil)benzamida O 't'·' f~\ HCI N-N ^^ \ 505,0 (M+l) 16 Hidrocloreto de 5-fluoro-Aí-metil-W- (1-(4-(l-metil-lH-pirazol-5-il)ftalazin-l-il) -piperidin-4-il) -2-(metlsulfonil)benzamida 0 6 λ HCí i f \ 476,0 (M+l) 17 Hidrocloreto de N-metil-N- (1-(4-(l-metil-lH-pirazol-5-il)-ftalazin-l-il)piperidin-4-il)-2-(trifluorometilsulfonil)-benzamida F Q UF HCS λ λ Ο—S F 13..........?νΖ}···· N N N~N Nv \ 559,0 (M+l) 18 Hidrocloreto de 2-cloro-4-fluoro-AÍ-metil-W- (1- (4- (1-me-til-lH-pirazol-5-il)ftalazin-l-il) piperidin-4-il) benzamida £~\ HCf Cí \ (35C1) 479,0 (M+l) 19 Hidrocloreto de 2-ciano-W-metil-W- (1-(4-(l-metil-lH-pirazol-5-il)ftalazin-l-il)-piperidin-4-il)benzamida N HCt \ íí^>.....^.....n 452,0 (M+l) 20 Hidrocloreto de 4-(difluoro-metoxi)-N-matil-N- (1-(4-(1-me-til-lH-pirazol-5-il)ftalazin-l-il) piperidin-4-il) benzamida f\ HCI 0 fyHq^NK>° \ 493,0 (M+l) 21 Hidrocloreto de N-(1-(4-(1-metil-lH-pirazol-5-il)ftalazin-l-il) piperidin-4-il) -2-(metilsulfonil)benzamida o, / rf~~\ HCt cr^. \ 491,0 (M+l) 25 ΡΕ2443104 (continuação)

Ex. N2 Nane químico Estrutura ES/MS m/z 22 Hidrocloreto de 4-cloro-N- (1-(4- (l-metil-líf-pirazol-5-il)ftalazin-l-il)piperidin-4-il)-2-(metilsulfonil)benzamida 07 jr\ na D*s !«—N ^.....* H (35C1) 525,0 (M+l) 23 Hidrocloreto de N- (1-(4-(1-me-til-lH-pirazol-5-il)ftalazin-l-il)piperidin-4-il)-2-(tri-fluorometilsulfonil)benzamida f F o /, λ HO fT\—4 7—h \~n '—S N~N ^-' H 545,0 (M+l) 24 Hidrocloreto de 2-cloro-4-fluoro-N-(1-(4-(l-metil-lH-pirazol-5-il)ftalazin-1-il)piperidin-4-il)benzamida f~\ HCí Cl rvn-Nr>K>F h~h x—' H \ (35C1) 465,0 (M+l)

Hedgehog tem sido apontado como um fator de sobrevivência para os cancros seguintes: carcinoma basocelu- lar, cancros do trato gastrointestinal superior (esófago, estômago, pâncreas e vias biliares), cancro da próstata, cancro de mama, cancro do pulmão de pequenas células, cancro do pulmão de não pequenas células, linfoma de células B, mieloma múltiplo, cancro gástrico, cancro de ovário, cancro colorretal, cancro de fígado, melanoma, cancro da cabeça e pescoço, mesotelioma, sarcomas de tecidos moles, sarcomas ósseos, leucemia, cancro testicular, cancro renal e cancro no cérebro.

Os elementos do caminho Hedgehog têm sido afirmados como sendo alvos de fármacos potenciais para o tratamento de cancros. A linha celular Daoy estabelecida a partir do tumor de meduloblastoma (ATCC, HTB-186), responde 26 ΡΕ2443104 a ligandos de Hh. Quando estas células são tratadas com meio condicionado por Shh adicionado exogenamente, o caminho de sinalização de Hh é ativado e resulta numa aumento da expressão de GUI. Ciclopamina, um alcaloide isolado a partir do «corn lily» Veratrum californicum é um antagonista de Hedgehog fraco e tem sido mostrado a suprimir a expressão de GUI em resposta à estimulação de Shh. Observações recentes sugerem que a ciclopamina inibe o crescimento de células de meduloblastoma cultivadas e aloenxertos. Usando este sistema de modelo celular Daoy, inibidores potentes dos caminhos de sinalização de Hedgehog podem ser identificados. Uma vez que os compostos da presente invenção são antagonistas de Hedgehog, eles são adequados para o tratamento dos tipos de tumores acima mencionados.

Determinação da IC50 da Actividade Biológica: Ensaio Funcional para a Medição da Inibição de GUI em células

Daoy 0 protocolo de ensaio que se segue e os respetivos resultados demonstram ainda mais a utilidade e a eficácia dos compostos e métodos da presente invenção. Os ensaios funcionais proporcionam o suporte para a afirmação de que os compostos da presente invenção exibem a capacidade para inibir a sinalização de Shh. Todos os ligandos, solventes e reagentes empregues no ensaio seguinte estão prontamente disponíveis a partir de fontes comerciais ou podem ser prontamente preparados por um perito na técnica. 27 ΡΕ2443104 A atividade biológica é determinada utilizando um ensaio funcional em células cancerosas neuronais Daoy e mede os niveis de ácido ribonucleico GUI através de um sistema de ensaio de bDNA (ácido desoxirribonucleico ramificado) (Panomics, Inc., Fremont, CA). GUI foi originalmente descoberto numa linhagem celular de glioblastoma e codifica uma proteína de dedo de zinco que é ativada por sinalização de Shh. A resposta máxima é obtida através da indução da transcrição de GUI nas células Daoy com meio condicionado (rim embrionário humano, células HEK-293 que expressam estavelmente Shh recombinante) durante 24 horas e, em seguida, medindo a quantidade de transcrição de GUI estimulada. A resposta minima é a quantidade de transcrição de GUI inibida com um composto de controlo em células Daoy que tinham sido estimuladas com meios condicionados (rim embrionário humano, células HEK-293 que expressam estavelmente Shh recombinante) durante 24 horas. 0 sistema de ensaio de bDNA utiliza a tecnologia de DNA de cadeia ramificada para permitir a amplificação de um ácido ribonucleico alvo (transcrição). A tecnologia emprega três tipos de sondas de cDNA específicas de GUI curtas híbridas sintéticas que determinam a especificidade do transcrito alvo [extensores de captura (CEs), extensores de etiquetas (LEs) e bloqueadores (BLs)] que hibridam como um complexo com os transcritos alvos para amplificar o sinal de hibridização. A adição de um substrato quimiolumi-génico durante o passo de amplificação permite a deteção utilizando luminescência. 28 ΡΕ2443104

As células Daoy foram cultivadas até à confluência em frascos T225 de cultura de tecidos em meio de crescimento Daoy contendo Meio Essencial Minimo (MEM) mais 10% de soro fetal bovino (FBS) com aminoácidos não essenciais 0,1 nM e piruvato de sódio 1 mM. As células são removidas dos frascos T225 usando tripsina ácido etileno-diaminotetra-acético (EDTA), centrifugadas, ressuspensas em meio e em seguida contadas.

As células Daoy são em seguida semeadas a 50 000 células por cavidade em meio de crescimento em placas de cultura de tecidos claras de 96 cavidades Costar e deixadas a incubar durante a noite a 37 °C sob dióxido de carbono a 5% (CO2) . As células são lavadas uma vez com salina tamponada por fosfato (PBS), seguido pela adição de 100 yL de meio condicionado de Shh (Shh-CM) para estimular os niveis de expressão de GUI. Shh-CM é diluído até se alcançar a estimulação máxima usando o meio de crescimento de controlo - FBS 0,1%/DMEM (Meio de Eagle Modificado por Dulbecco) . As células Daoy tratadas com Shh-CM são em seguida tratadas com várias concentrações de inibidores de Hedgehog que vão desde cerca de 1 μΜ a 0,1 nM. Os compostos de ensaio são deixados a incubar durante 24 horas a 37 °C, sob 5% de CO2. A medição do transcrito de GUI é executada usando o ensaio de GUI Quantigene 2.0 conforme descrito pelo fabricante (Panomics, Inc.). Preparar um tampão de 29 ΡΕ2443104 mistura de lise diluída (DLM) que inclui proteinase K. Após uma incubação de 24 horas com o composto, as células são lavadas uma vez com PBS e 180 pL de DLM são adicionados as células. A placa de células contendo o tampão de lise é selada e colocada a 55 °C durante 30 a 45 minutos. Os lisados celulares resultantes são em seguida triturados 5 vezes. Um conjunto de sonda de trabalho contendo sondas de GUI é feito por diluição das sondas no DLM de acordo com as instruções do fabricante, e em seguida 20 pL do conjunto de sonda de trabalho são adicionados às placas de ensaio de bDNA juntamente com 80 pL dos lisados de Daoy. As placas são seladas e incubadas durante a noite a 55 °C. As placas de bDNA são em seguida processadas de acordo com as instruções do fabricante. O sinal é quantificado por leitura das placas num leitor Perkin Elmer Envision de deteção de luminescência. O sinal luminescente é diretamente proporcional à quantidade de transcrito alvo presente na amostra.

Os dados de sinal luminescente do ensaio funcional são usados para calcular a CI50 para o ensaio in vitro. Os dados são calculados com base nos valores de controlo máximo (células Daoy tratadas com Shh-CM) e o valor de controlo mínimo (células Daoy tratadas com Shh-CM e uma concentração inibitória de um composto de controlo, 1 pM de N-(3-(lA-benzo[d]imidazol-2-il)-4-clorofenil)-3, 5--dimetoxibenzamida). Um ajustamento de curva logística de quatro parâmetros é utilizado para gerar os valores CI50 usando programas de software ActivityBase versão 5.3, equação 205 (Assay Guidance Manual Version 5.0, Eli Lilly and Company e NIH Chemical Genomics Center, 2008). 30 ΡΕ2443104

Seguindo o protocolo descrito, os compostos aqui exemplificados exibem uma CI50 < 40 nM. Por exemplo, o composto do Exemplo la tem uma CI50 de cerca de 2,4 nM com um erro padrão de 0,5 (n=7, calculado como uma média geométrica e erro padrão geométrico) no ensaio descrito acima. Estes resultados fornecem prova de que os compostos da presente invenção são antagonistas potentes de Hedgehog e, como tal, são úteis como agentes anticancerígenos.

Ensaio de Inibição de CYP3A4

Amostras de incubação são preparados pela adição de uma preparação microssómica de figado humano ao inibidor de teste (concentrações finais de 0,05 mg/mL de proteína, inibidor 10 μΜ em NaPCq 100 mM, pH 7,4) e misturou-se. As amostras são pré-incubadas durante aproximadamente cinco minutos a 37 °C. Após o período de pré-incubação, a reação é iniciada com a adição de uma solução contendo NADPH e midazolam, como substrato de enzima (concentração final NADPH 1 mM, midazolam 5 μΜ) . Após a adição da solução de NADPH, as amostras são incubadas durante 3 minutos a aproximadamente 37 °C. Após o período de incubação, a reação é parada pela adição de 50 pL de metanol (e um padrão interno para cromatografia) e as amostras são bem misturadas. Após extinção da reação, a mistura é centrifugada a cerca de 4000 rpm durante 15 minutos a cerca de 5 °C e analisadas por análise de LC/MS. 31 ΡΕ2443104

As amostras são analisadas usando HPLC/MS com um gradiente de eluição em colunas C18 convencionais curtas (Fase Móvel de Carga - H2O Milli-Q®/metanol 95/5 (v/v) com 1% de ácido acético. Fase Móvel B - H20 Milli-Q®/metanol 80/20 (v/v) com 1% de ácido acético. Fase Móvel C - H20

Milli-Q®/metanol 5/95 (v/v) com 1% de ácido acético. Fase Móvel de Lavagem - H20 Milli-Q®/acetonitrilo 75/25 (v/v)).

As amostras são injetadas num Analisador de Massa Espectral para Monitorização Seletiva de Iões (SIM) a uma massa de 342,1 (1-OH-midazolam) e 346, 1 (padrão interno a- hidroximidazolam-d4) usando Turbolon Spray sob condições positivas. Os dados são apresentados como % de inibição da formação de 1-OH-midazolam na presença de uma concentração de inibidor de 10 μΜ.

Seguindo o protocolo descrito, o Exemplo la exibe 13,5% de inibição de CYP3A4. Os compostos, tais como o Exemplo la, que demonstram um baixo potencial de inibição reversível de CYP3A4 têm uma probabilidade reduzida de interações negativas com outras medicações que poderiam resultar em mudanças de dosagem da medicação ou uma necessidade de interromper a medicação num paciente. Por conseguinte, tais compostos são desejáveis e têm perfis de segurança melhorados.

Inibição de CYP3A Baseada em Mecanismo In Vitro O composto do Exemplo la é avaliado como um 32 ΡΕ2443104 inibidor de CYP3A à base de mecanismo com o objetivo de obtenção de constantes cinéticas de kinact e Ki para esta interação. (Kinact é a constante de velocidade máxima de formação de complexo de enzima inativa. Ki é a concentração na meia-inativação máxima). 0 composto é incubado com microssomas de figado humano (combinação de microssomas de figado humano com elevada expressão de atividade do CYP3A4) numa incubação in vitro de duas fases: uma reação de inativação, que permite ao inibidor inativar a enzima, e um ensaio de atividade, que avalia a atividade remanescente da proteína microssómica usando 1'-hidroxilação de midazolam como sonda.

As reações de inativação (100 pL de volume final) contendo tampão de fosfato de sódio 100 mM (pH 7,4), EDTA 1 mM (ácido etilenodiaminotetra-acético) , na ausência ou na presença de NADPH 1 nM (nicotinamida-adenina-dinucleótido-fosfato, forma reduzida) , com concentrações que variam no intervalo 0,75 μΜ-24 μΜ de composto de teste, são pré-incubadas durante 3 minutos a 37 °C, em triplicado. As reações de inativação são iniciadas com a adição da combinação microssómica de elevada atividade do CYP3A (CellzDirect, Austin TX, 0,5 mg/mL). Em múltiplos instantes (0, 2,5, 5, 10 e 30 minutos), alíquotas de 5 pL das misturas de reação de inativação são retiradas e diluídas a 1/20 num sistema de incubação de ensaio de atividade do CYP3A4 pré-aquecido (37 °C) (95 pL) contendo NADPH 1 mM e midazolam (100 pM). Esta mistura de ensaio de atividade, a 0,025 mg/mL de concentração final de proteína e 1/20 da 33 ΡΕ2443104 concentração do inibidor, é incubada (37 °C) durante um minuto adicional antes da paragem da reação com a adição de 50 pL de MeOH. As amostras são misturadas e a proteina desnaturada é removida por centrifugação a 4000 rpm durante 10 minutos. A formação de 1'-OH-midazolam é analisada por LC/MS/MS com uma eluição de gradiente numa coluna Phenomenex Synergi 4μ Hydro-RP (Fase Móvel A - H20 Milli-Q®/metanol 95/5 (v/v) com acetato de amónio 5 mM, Fase Móvel B - Η20 Milli-Q®/metanol 5/95 (v/v) com acetato de amónio 5 mM, Solvente de Lavagem de Agulha A - ácido trifluoroacético 0,4% em acetonitrilo/H20 Milli-Q©/metanol 90/10 (v/v), Solvente de Lavagem de Agulha B - H20 Milli-Q®/metanol 50/50 (v/v)). As amostras são injetadas numa API Sciex 4000 para Monitorização Seletiva de Reações a uma massa de 342,0 (1-OH-midazolam) e 347,0 (padrão interno a-hidroximidazolam-d3) , utilizando Turbolon Spray sob condições positivas. A perda de formação de 1'-OH-midazolam (atividade do CYP3A4) nas incubações microssómicas é representada como a percentagem log de atividade do CYP3A4 restante como uma função do tempo de pré-incubação para cada concentração de composto de teste. Os parâmetros cinéticos para a inativação são determinados usando WinNonlin Professional para ajustar as seguintes equações para os dados:

Equação 1: percentagem de inibição (t> =100 (t=o)*e(_A't) 34 ΡΕ2443104

Onde λ é definido como

Equação 2: λ= (kinact*I) / (ΚΣ+Ι) A perda de atividade para o composto do Exemplo la varia desde 11% a 22% e não é dependente da concentração. Por conseguinte, os valores de kinact e Ki da Equação 2 não podem ser determinados. Com base nestes dados, o composto do Exemplo la não é um inibidor à base de mecanismo de CYP3A4. Os compostos, tais como Exemplo la, que demonstram pouca ou nenhum potencial de inibição de CYP3A4 irreversível à base de mecanismo têm uma reduzida probabilidade de interações negativas com outras medicações que poderia resultar em alterações de dosagem da medicação ou uma necessidade de parar a medicação num paciente. Assim, tais compostos são desejáveis e têm perfis de segurança melhorados.

Lisboa, 29 de abril de 2013

Claims

ΡΕ2443104 1 REIVINDICAÇÕES 1. Um composto da fórmula

em que R1 representa hidrogénio ou metilo; R2 representa hidrogénio ou metilo; e R3, R1, R2, R6 e R7 representam cada um independente mente hidrogénio, flúor, cloro, ciano, trifluorometilo, trifluorometoxi, difluorometoxi, metilsulfonilo ou trifluo-rometilsulfonilo, com a condição de que pelo menos três de R3, R1, R2, R6 e R7 representem hidrogénio; ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.
2. Um composto de acordo com a Reivindicação 1 em que R1 representa metilo, ou um seu sal farmacêuticamente aceitável.
3. Um composto de acordo com a Reivindicação 1 ou 2, em que R2 representa metilo, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável. 1 Um composto de acordo com qualquer uma das 2 Reivindicações 1-3, em que R3, R1, R2, R6 e R7 representam, 2 ΡΕ2443104 cada um independentemente, hidrogénio, flúor, cloro, tri-fluorometilo ou metilsulfonilo, ou um seu sal farmaceu-ticamente aceitável.
5. Um composto de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1-4, em que R3, R4, R5, R6 e R7 representam, cada um independentemente, hidrogénio, flúor ou trifluoro-metilo, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.
6. Um composto de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1-5, em que R4, R6 e R7 representam cada um hidrogénio, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.
7. Um composto de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1-6, o qual é 4-fluoro-IV-metil-IV- (1-(4-(1--metil-lH-pirazol-5-il)ftalazin-l-il)piperidin-4-il)-2- -(trifluorometil)-benzamida, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.
8. Um composto de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1-7, o qual é hidrocloreto de 4-f luoro-iV--metil-N- (1- (4- (l-metil-lfí-pirazol-5-il) ftalazin-l-il)pipe-ridin-4-il)-2- (trifluorometil)benzamida.
9. Uma composição farmacêutica compreendendo o composto de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1-8, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, em combinação com um agente de suporte, diluente ou excipiente farma-ceuticamente aceitável. ΡΕ2443104
10. Um composto de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1-8, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, para utilização em terapia.
11. Um composto de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1-8, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, para utilização no tratamento do cancro.
12. Um composto, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, para utilização de acordo com a Reivindicação 11, em que o cancro é cancro do cérebro, carcinoma basoce-lular, cancro do esófago, cancro do estômago, cancro gástrico, cancro pancreático, cancro do trato biliar, cancro da próstata, cancro da mama, cancro do pulmão de pequenas células, cancro do pulmão de não pequenas células, linfoma de células B, mieloma múltiplo, cancro do ovário, cancro colorretal, cancro do figado, cancro do rim, melanoma, cancro da cabeça e pescoço, mesotelioma, sarcoma dos tecidos moles, sarcomas ósseos, leucemia ou cancro testicular. Lisboa, 29 de abril de 2013 1 ΡΕ2443104 REFERENCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO Esta lista de referências citadas pelo requerente é apenas para conveniência do leitor. A mesma não faz parte do documento da patente Europeia. Ainda que tenha sido tomado o devido cuidado ao compilar as referências, podem não estar excluídos erros ou omissões e o IEP declina quaisquer responsabilidades a esse respeito. Documentos de patentes citadas na Descrição - «SO290SB332B8A 1 WO 2S0B0SE4S9 A . «83280811081? A Literatura que não é de patentes citada na Descrição * Λ STAHL »í si- HANBBOOK QF PUARMACEUTS- QAl SALTS: PROPERTES. SELECTiON AND USE. VCHAíWftey-VCH, 2902 * 'SM. 8£R0E ei «CL PfMrmsBRtáfcaS Sais. Jstttmí of Pfesrasecesá&af SBãawess, ias&swy 1977, ysi 88 {? * SREEME; «RfTS. Protecfiva Groujps sn Organic S^ifess.®, Jsfen Wb$ sad Soas, 1889 ♦ €m. J. Cftess., 1865, vot. 43,2708 » Asssy GtÉfance àSsasasi Vsssàafs 5,0, E§ L% mâ Conpany and ÍSH ChefsissS· G«sorcass Cmáert 2SS 1 RESAINGTON: THE SGSENGE AND PRACTCE OF PHARMADY. Mssk FuiSSsitíns Qo, 1805