EA019059B1

EA019059B1 - Дизамещенные фталазиновые антагонисты пути hedgehog

Info

Publication number: EA019059B1
Application number: EA201270049A
Authority: EA
Inventors: Филип Артур Хипскинд; Бхарвин Кумар Пател; Уилсон (урожденная Такакува), Такако
Original assignee: Эли Лилли Энд Компани
Priority date: 2009-06-19
Filing date: 2010-06-15
Publication date: 2013-12-30
Also published as: IL216599A; ES2409054T3; MY156667A; JO2931B1; CL2011003147A1; CN102459233B; HN2011003139A; AR077014A1; ECSP11011541A; TN2011000627A1; DK2443104T3; EA201270049A1; ZA201108587B; CR20110658A; US20100324048A1; JP2012530705A; HK1164872A1; HRP20130408T1; SI2443104T1; PT2443104E

Abstract

В настоящем изобретении предложены новые 1,4-дизамещенные фталазиновые антагонисты пути hedgehog, подходящие для лечения рака.

Description

Настоящее изобретение относится к антагонистам пути Небдебод и более конкретно к новым 1,4дизамещенным фталазинам и их терапевтическому применению. Сигнальный путь Небдебод (Нб) играет важную роль в формировании эмбриональных структур и поддержании жизнедеятельности тканей у взрослых за счет определения направления дифференцировки и пролиферации клеток. Семейство белков Небдебод (Нб), включающее 8ошс Небдебод (866). 1пб1ап Небдебод (166) и Эе^ей Небдебод (Ω66). представляет собой секретируемые гликопротеины, которые подвергаются посттрансляционным модификациям, включая автокаталитическое расщепление и присоединение холестерина к пептиду с концевой аминогруппой с образованием фрагмента, обладающего сигнальной активностью. Нб связывается с включающим двенадцать трансмембранных доменов трансмембранным белком Р1сб (Р1сб1 и Р1с62), тем самым уменьшая Р1сб-опосредованную супрессию белка 8тоо1бепеб (8то). Активация 8то запускает ряд внутриклеточных явлений, завершающийся стабилизацией факторов транскрипции Об (С61, С62 и С63) и экспрессией Сб-зависимых генов, которые ответственны за пролиферацию клеток, выживаемость клеток, ангиогенез и инвазию.

Сигнальный путь Нб в последнее время привлекает значительный интерес, основанный на обнаружении того факта, что нарушенная активация передачи сигнала 866 приводит к образованию различных опухолей, например рака поджелудочной железы, медуллобластомы, базально-клеточной карциномы, мелкоклеточного рака легких и рака простаты. В νΟ 2005033288 предложены конкретные 1,4дизамещенные фталазиновые соединения, которые, как утверждается, являются антагонистами Небдебод. Аналогичным образом, в νθ 2008110611 предложены конкретные 1,4-дизамещенные фталазиновые соединения, относящиеся к диагностике и лечению патологий, связанных с путем Небдебод. В νθ 2009002469 предложены конкретные 1,4-дизамещенные фталазиновые соединения, которые, как утверждается, являются возможным способом лечения всех опухолей, возникающих в результате нарушений сигнального пути Небдебод.

В настоящее время по-прежнему существует необходимость в высокоактивных ингибиторах пути Небдебод, в частности ингибиторах, обладающих желаемыми токсикологическими характеристиками. В настоящем изобретении предложены новые 1,4-дизамещенные фталазины, которые являются высокоактивными антагонистами указанного пути. Конкретные соединения согласно настоящему изобретению обеспечивают желаемое взаимодействие лекарство-лекарство и связанные с этим показатели безопасности в отношении способности обратимого и/или необратимого механизм-зависимого ингибирования СУР3А4.

В настоящем изобретении предложено соединение формулы I

Формула I где Я¹ представляет собой водород или метил;

Я² представляет собой водород или метил;

Я³, Я⁴, Я⁵, Я⁶ или Я⁷ независимо представляют собой водород, фтор, хлор, циано, трифторметил, трифторметокси, дифторметокси, метилсульфонил или трифторметилсульфонил при условии, что по меньшей мере три из Я³, Я⁴, Я⁵, Я⁶ и Я⁷ представляют собой водород, или его фармацевтически приемлемая соль.

В настоящем изобретении также предложена фармацевтическая композиция, содержащая соединение формулы I или его фармацевтически приемлемую соль в комбинации с фармацевтически приемлемым наполнителем, носителем или разбавителем.

В настоящем изобретении также предложен способ лечения рака, выбранного из группы, состоящей из рака мозга, базально-клеточной карциномы, рака пищевода, рака желудка, рака ЖКТ, рака поджелудочной железы, рака желчевыводящих путей, рака простаты, рака груди, мелкоклеточного рака легких, немелкоклеточного рака легких, В-клеточной лимфомы, множественной миеломы, рака яичников, колоректального рака, рака печени, рака почки, меланомы, рака головы и шеи, мезотелиомы, саркомы мягких тканей, саркомы кости, лейкемии и рака яичек, у млекопитающего, включающий введение млекопитающему эффективного количества соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли.

Дополнительно, в настоящем изобретении предложено соединение формулы I или его фармацевтически приемлемая соль для применения в терапии. Также в настоящем изобретении предложено соединение формулы I или его фармацевтически приемлемая соль для применения при лечении рака. В частности, рак выбран из группы, состоящей из рака мозга, базально-клеточной карциномы, рака пищевода, рака желудка, рака ЖКТ, рака поджелудочной железы, рака желчевыводящих путей, рака простаты, рака груди, мелкоклеточного рака легких, немелкоклеточного рака легких, В-клеточной лимфомы, множественной миеломы, рака яичников, колоректального рака, рака печени, рака почки, меланомы, рака головы и шеи, мезотелиомы, саркомы мягких тканей, саркомы кости, лейкемии и рака яичек.

- 1 019059

В настоящем изобретении также предложено применение соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли в терапии. Дополнительно, в настоящем изобретении предложено применение соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли для производства лекарственного средства для лечения рака. В частности, рак выбран из группы, состоящей из рака мозга, базальноклеточной карциномы, рака пищевода, рака желудка, рака ЖКТ, рака поджелудочной железы, рака желчевыводящих путей, рака простаты, рака груди, мелкоклеточного рака легких, немелкоклеточного рака легких, В-клеточной лимфомы, множественной миеломы, рака яичников, колоректального рака, рака печени, рака почки, меланомы, рака головы и шеи, мезотелиомы, саркомы мягких тканей, саркомы кости, лейкемии и рака яичек.

Кроме того, в настоящем изобретении предложена фармацевтическая композиция, содержащая соединение формулы I или его фармацевтически приемлемую соль в качестве активного ингредиента для лечения рака, выбранного из группы, состоящей из рака мозга, базально-клеточной карциномы, рака пищевода, рака желудка, рака ЖКТ, рака поджелудочной железы, рака желчевыводящих путей, рака простаты, рака груди, мелкоклеточного рака легких, немелкоклеточного рака легких, В-клеточной лимфомы, множественной миеломы, рака яичников, колоректального рака, рака печени, рака почки, меланомы, рака головы и шеи, мезотелиомы, саркомы мягких тканей, саркомы кости, лейкемии и рака яичек.

Конкретные соединения формулы I или их фармацевтически приемлемые соли представляют собой соединения, в которых:

(a) В¹ представляет собой метил;

(b) В² представляет собой метил;

(c) В³, В⁴, В⁵, В⁶ или В⁷ независимо представляют собой водород, фтор, хлор, трифторметил или метилсульфонил;

(б) В³, В⁴, В⁵, В⁶ или В⁷ независимо представляют собой водород, фтор или трифторметил;

(е) по меньшей мере два из В³, В⁴, В⁵, В⁶ и В⁷ независимо представляют собой фтор, хлор, трифторметил или метилсульфонил при условии, что В³ и В⁷ одновременно не являются водородом;

(ί) по меньшей мере два из В³, В⁴, В⁵, В⁶ и В⁷ независимо представляют собой фтор или трифторметил при условии, что В³ и В⁷ одновременно не являются водородом;

(д) В⁴, В⁶ и В⁷ представляют собой водород;

(11) В³ и В⁵ независимо представляют собой фтор, хлор, трифторметил или метилсульфонил; В⁴, В⁶ и В⁷ представляют собой водород;

(ί) В³ и В⁵ независимо представляют собой фтор или трифторметил; В⁴, В⁶ и В⁷ представляют собой _В6 _В3 _В6 водород;

О) В¹ представляет собой метил и В² представляет собой метил;

(k) В¹ представляет собой метил; В² представляет собой метил и В³, В⁴, В⁵, В⁶ или В⁷ независимо представляют собой водород, фтор, хлор, трифторметил или метилсульфонил;

(l) В¹ представляет собой метил; В² представляет собой метил и В³, В⁴, В⁵, В⁶ или В⁷ независимо представляют собой водород, фтор или трифторметил;

(т) В¹ представляет собой метил; В² представляет собой метил и по меньшей мере два из В³, В⁴, В⁵, и В⁷ независимо представляют собой фтор, хлор, трифторметил или метилсульфонил при условии, что и В⁷ одновременно не являются водородом;

(п) В¹ представляет собой метил; В² представляет собой метил и по меньшей мере два из В³, В⁴, В⁵, и В⁷ независимо представляют собой фтор или трифторметил при условии, что В³ и В⁷ одновременно не являются водородом;

(о) В¹ представляет собой метил; В² представляет собой метил и В⁴, В⁶ и В⁷ представляют собой во дород;

(р) В¹ представляет собой метил; В² представляет собой метил; В³ и В⁵ независимо представляют собой фтор, хлор, трифторметил или метилсульфонил и В⁴, В⁶ и В⁷ представляют собой водород;

(с.|) В¹ представляет собой метил; В² представляет собой метил; В³ и В⁵ независимо представляют собой фтор или трифторметил и В⁴, В⁶ и В⁷ представляют собой водород.

Следует понимать, что используемые выше и далее в описании настоящего изобретения следующие термины, если не указано иное, имеют следующие значения.

Фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или наполнитель представляет собой среду, общепринятую в области доставки биологически активных агентов млекопитающим, например людям.

Фармацевтически приемлемые соли относится к сравнительно нетоксичным неорганическим и органическим солям соединений согласно настоящему изобретению.

Терапевтически эффективное количество или эффективное количество означает количество соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли согласно настоящему изобретению или фармацевтической композиции, содержащей соединение формулы I или его фармацевтически приемлемую соль согласно настоящему изобретению, которое приводит к биологическому или медицинскому ответу или желаемому терапевтическому воздействию на ткань, организм, животное, млекопитающее или человека, ожидаемому исследователем, ветеринаром, лечащим врачом или другим практикующим врачом.

- 2 019059

Предполагается, что термины лечение, лечить, лечащий и т.д. включают замедление или обращение прогрессирования нарушения. Указанные термины также включают уменьшение, облегчение, ослабление, устранение или снижение одного или более симптомов нарушения или состояния, даже если нарушение или состояние фактически не устраняется и даже если прогрессирование нарушения или состояния как таковое не замедляется или не обращается.

В рамках стандартной номенклатуры, используемой в настоящем описании, первой описывают терминальную часть указанной боковой цепи, затем соседние функциональные группы в направлении места присоединения. Например, заместитель метилсульфонил эквивалентен СН₃-80₂-.

Соединения согласно настоящему изобретению способны взаимодействовать, например, с рядом неорганических и органических кислот, с образованием фармацевтически приемлемых солей присоединения кислот. Указанные фармацевтически приемлемые соли и общепринятые способы их получения хорошо известны в данной области техники. См., например, П. Шталь с соавторами (Р. 81ай1, с1 а1.), ΗΑΝΏΒΟΟΚ 0Р РНАКМАСЕиТ1САЬ 8АЬТ8: РК.0РЕК.Т1Е8, ЗЕЬЕСТЮЫ ΛΝΏ И8Е (УСНАЖйеуУСН, 2002); С.М. Бердж с соавторами (8.М. Вегде, е1 а1.), Рйагтасеи11са1 8а118, 1оигпа1 οί Рйагтасеи11са1 8с1епсе5, Уо1. 66, Νο. 1, 1аииагу 1977.

Соединения согласно настоящему изобретению предпочтительно входят в состав фармацевтических композиций с применением фармацевтически приемлемого носителя, разбавителя или наполнителя и вводятся с помощью различных способов. Предпочтительно такие композиции предназначены для перорального или внутривенного введения. Указанные фармацевтические композиции и способы их получения хорошо известны в данной области техники. См., например, КЕМШСТ0№ ТНЕ 8СIЕNСЕ ΑΝΏ РКАСТ1СЕ 0Е РНАКМАСУ (А. Дженнаро с соавторами (А. Сеииаго, е1 а1.), еб§., 19⁴¹¹ еб., Маск РиЫЕЫид Со., 1995).

Фактически вводимое соединение определяет лечащий врач с учетом имеющих значение обстоятельств, включающих состояние, подвергаемое лечению, выбранный способ введения, фактическое вводимое соединение или соединения, возраст, вес и ответ индивидуального пациента и степень тяжести симптомов у пациента. Суточные дозировки, как правило, находятся в диапазоне от примерно 0,1 до примерно 10 мг/кг массы тела. В некоторых случаях дозировки ниже нижнего предела указанного диапазона могут быть более чем достаточными, при этом в других случаях возможно применение даже больших дозировок.

Соединения формулы I или их соли можно получить с помощью различных методик, известных в данной области техники, а также способов, описанных далее на схеме, в примерах получения и примерах. Конкретные стадии синтеза каждого из описанных способов можно объединять различным образом для получения соединений формулы I или их фармацевтически приемлемых солей.

Заместители, если не указано иное, являются такими, как определено ранее. Реагенты и исходные вещества, как правило, легкодоступны среднему специалисту в данной области техники. Другие реагенты и исходные вещества можно получить с помощью стандартных способов органической и гетероциклической химии, способов, аналогичных синтезу известных соединений со сходной структурой, и способов, описанных в примерах получения и примерах, которые представлены далее, включая любые новые способы. Названия соединений в примерах получения и примерах были получены при помощи инструмента 81гис1=№ипе в СйетЭгате® ИИга 10.0.

Используемые в настоящем описании следующие термины имеют указанные значения: Е1₂0 относится к диэтиловому эфиру; ДМФ относится к диметилформамиду; ДМСО относится к диметилсульфоксиду; ЭМАС относится к Ν,Ν-диметилацетамиду; НМР относятся к Ν-метилпирролидину; МеОН относится к метанолу; Бос или 1-Ьос относится к трет-бутоксикарбонилу; 1С₅₀ относится к концентрации агента, которая приводит к 50% от максимального ингибиторного ответа, возможного для данного агента.

- 3 019059

Схема

Соединение формулы I может быть получено согласно реакциям, приведенным на схеме.

На стадии 1 дигалогензамещенный фталазин (1) (Х=С1 или Вг) взаимодействует с 4-амино-Ьосзащищенным пиперидином (2) в ходе реакции нуклеофильного ароматического замещения (8ΝΑγ) с получением галогенпиперидилфталазина формулы (3). Реакцию проводят в биполярном апротонном растворителе, таком как ДМФ, ЭМАС или ΝΜΡ, в присутствии органического или неорганического основания. Предпочтительно реакцию проводят в ΝΜΡ в присутствии карбоната калия при температуре, равной 50-140°С.

На стадии 2 галогенпиперидилфталазин формулы (3) подвергают реакции кросс-сочетания по Сузуки с пиразолбороновым эфиром или кислотой (4). Например, галогенпиперидилфталазин (3) объединяют с пинаколиновым эфиром 1-метил-1Н-пиразол-5-бороновой кислоты в присутствии палладиевого катализатора, такого как тетракис-(трифенилфосфин)палладий, и неорганического основания, такого как бикарбонат натрия. Реакция протекает в смеси растворителей толуол/этанол/вода с образованием пиразолилфталазина формулы (5).

Стадия 3 представляет собой простое удаление защитной Ьос-группы, проводимое в кислой среде, например, НС1 в диэтиловом эфире или диоксане, с получением аминопиперидинилфталазина формулы (6). Способы введения и удаления азот- и кислородзащитных групп хорошо известны в данной области техники (см., например, Грин и Вутс (Сгеепе апб \Уи15). Рго1сс1|ус Сгоирз ίη Огдашс 8уп1йе818, 3^гб Еб., бо1т \УПеу апб 8опз, №\ν Уогк, (1999)).

На стадии 4 аминопиперидинилфталазин формулы (6) ацилируют с получением пиперидиниламида формулы I. Согласно одному из способов амин подвергают взаимодействию с соответствующим образом замещенным бензоилхлоридом в инертном растворителе, таком как дихлорметан, в присутствии органического основания, такого как триэтиламин или диизопропилэтиламин. В качестве альтернативы, амид получают с применением соответствующим образом замещенной бензойной кислоты. Активный сложный эфир получают с применением пентафторфенилдифенилфосфината с последующим взаимодействием с амином. Реакцию проводят в смеси растворителей ДМФ/ДМСО при температуре, равной примерно от -10 до 100°С, в присутствии органического основания, такого как триэтиламин или диизопропиламин.

Пример получения 1.

трет-Бутил 1 -(4-хлорфталазин-1 -ил)пиперидин-4-ил(метил)карбамат

Нагревали смесь карбоната калия (21,23 г, 153,6 ммоль), 1,4-дихлорфталазина (26 г, 128 ммоль) и трет-бутилового эфира метилпиперидин-4-илкарбаминовой кислоты (30,01 г, 134,4 ммоль) в Νметилпирролидине (200 мл) при 80°С в течение ночи. Выливали реакционную смесь в воду, экстрагировали дихлорметаном, сушили над №1₂8О₄ и концентрировали при пониженном давлении. Добавляли диэтиловый эфир и отфильтровывали полученное твердое вещество (примесь 4-хлорфталазин-1-ола из исходного вещества). Концентрировали фильтрат. Очищали полученный остаток путем флэшхроматографии на силикагеле (гексан:этилацетат=2:1) с получением титульного соединения в виде белого твердого вещества (17,66 г, 37%).

- 4 019059

Е8/МС т/ζ (³⁷С1) 377,0 (М+1).

Пример получения 2.

трет-Бутил 1 -(4-хлорфталазин-1 -ил)пиперидин-4-илкарбамат

Получали титульное соединение по существу согласно способу, описанному в примере получения 1, применяя трет-бутиловый эфир пиперидин-4-илкарбаминовой кислоты. Охлаждали реакционную смесь и выливали в воду (500 мл). Экстрагировали в этилацетате, промывали водой, сушили над Ыа₂8О₄и удаляли растворители при пониженном давлении с получением титульного соединения в виде желтого твердого вещества (36 г, 97%).

Е8/МС т/ζ 363,0 (М+1).

Пример получения 3.

трет-Бутил метил( 1 -(4-( 1 -метил-1Н-пиразол-5-ил)фталазин-1 -ил)пиперидин-4-ил)карбамат

Помещали карбонат натрия (3,82 г, 36,09 ммоль), трет-бутил 1-(4-хлорфталазин-1-ил)пиперидин-4ил(метил)карбамат (6,8 г, 18,04 ммоль) и пинаколиновый эфир 1-метил-1Н-пиразол-5-бороновой кислоты (5,63 г, 27,1 ммоль) в колбу со смесью толуола (50 мл), этанола (17 мл) и воды (17 мл). Дегазировали смесь в течение 10 мин газообразным азотом. Добавляли тетракис-(трифенилфосфин)палладий (0,4 г, 0,35 ммоль) и нагревали смесь при 74°С в течение ночи. Охлаждали смесь до температуры окружающей среды и разбавляли дихлорметаном. Промывали органическую часть солевым раствором, сушили над Ыа₂8О₄ и концентрировали при пониженном давлении. Очищали полученный остаток путем флэшхроматографии на силикагеле (гексан:этилацетат:2 М ΝΗ₃ в МеОН=20:5:1) с получением титульного соединения в виде желтой пены (5,33 г, 70%).

Е8/МС т/ζ 423,2 (М+1).

Альтернативный способ получения трет-бутил метил(1-(4-(1-метил-1Н-пиразол-5-ил)фталазин-1ил)пиперидин-4-ил)карбамата.

Примеры получения 4-6.

Пример получения 4.

1,4-Дибромфталазин

В пробирку, стойкую к давлению, помещали пентабромид фосфора (24,5 г, 54,1 ммоль) и 2,3дигидрофталазин-1,4-дион (5,00 г, 30,8 ммоль). Герметизировали пробирку и нагревали при 140°С в течение 6-7 ч. Оставляли охлаждаться на ночь. Осторожно открывали пробирку из-за избыточного давления. Отделяли твердое вещество и выливали в ледяную воду. Оставляли перемешиваться в ледяной воде и собирали полученное твердое вещество путем вакуумного фильтрования. Сушили в вакуумируемом сушильном шкафу с получением конечного продукта (8,31 г, 93%).

Е8/МС (⁷⁹Вг, ⁸¹Вг) т/ζ 288,8 (М+).

Ссылка: Сап. 1. СЬет. 1965, 43, 2708.

Пример получения 5.

трет-Бутил 1 -(4-бромфталазин-1 -ил)пиперидин-4-ил(метил)карбамат

Объединяли 1,4-дибромфталазин (0,70 г, 2,38 ммоль), Ν-метилпирролидон (7,0 мл), карбонат калия (395 мг, 2,86 ммоль) и трет-бутиловый эфир метилпиперидин-4-илкарбаминовой кислоты (532 мг, 2,38 ммоль). Нагревали при 80°С в течение ночи. Охлаждали и выливали в воду. Собирали твердое вещество и сушили в вакуум-сушильном шкафу при температуре окружающей среды в течение ночи с получением конечного продукта (0,96 г, 95%).

Е8/МС т/ζ (⁸¹Вг) 421,0 (М+1).

- 5 019059

Пример получения 6.

Помещали в реакционную ампулу трет-бутил 1-(4-бромфталазин-1-ил)пиперидин-4ил(метил)карбамат (500 мг, 1,2 ммоль), пинаколиновый эфир 1-метил-1Н-пиразол-5-бороновой кислоты (370 мг, 1,8 ммоль), карбонат натрия (252 мг, 2,4 ммоль), толуол (3,75 мл), этанол (1,25 мл) и воду (1,25 мл). Дегазировали реакционную смесь азотом в течение 10 мин. Добавляли тетракис(трифенилфосфин)палладий (137,1 мг, 118,7 мкмоль). Дополнительно продували азот через реакционную смесь в течение 10 мин. Закрывали реакционную емкость и нагревали при 90°С в течение ночи. Охлаждали реакционную смесь и фильтровали через подложку силикагеля, элюируя 5% МеОН:СН₂С1₂.

Концентрировали фракции при пониженном давлении. Очищали полученный остаток с помощью хроматографии на силикагеле (2% 2Н ПН₃ в МеОН:СН₂С1₂) с получением конечного продукта (345,6 мг, 69%).

Е8/МС т/ζ 423,2 (М+1).

Пример получения 7.

трет-Бутил 1-(4-(1Н-пиразол-5-ил)фталазин-1-ил)пиперидин-4-ил (метил)карбамат

Н

Получали титульное соединение по существу согласно способу, описанному в примере получения 3, применяя трет-бутил 1-(4-хлорфталазин-1-ил)пиперидин-4-ил(метил)карбамат и пинаколиновый эфир 1Н-пиразол-3-бороновой кислоты с получением 580 мг (67%).

Е8/МС т/ζ 409,2 (М+1).

Пример получения 8.

трет-Бутил 1 -(4-( 1 -метил-1Н-пиразол-5-ил)фталазин-1 -ил)пиперидин-4-илкарбамат

Получали титульное соединение по существу согласно способу, описанному в примере получения 3, применяя трет-бутил-1-(4-хлорфталазин-1-ил)пиперидин-4-илкарбамат с получением 5,92 г (94%).

Е8/МС т/ζ 308,8 (М⁺).

Пример получения 9.

Ν-Метил-1 -(4-( 1 -метил-1Н-пиразол-5-ил)фталазин-1-ил)пиперидин-4-амин

Растворяли трет-бутил-метил( 1 -(4-( 1 -метил-1Н-пиразол-5-ил)фталазин-1 -ил)пиперидин-4ил)карбамат (7,77 г, 18,39 ммоль) в дихлорметане (100 мл). К раствору добавляли избыток 1 М хлороводорода в диэтиловом эфире (20 мл, 80 ммоль) и перемешивали при температуре окружающей среды в течение 2 ч. Концентрировали при пониженном давлении. Очищали полученный остаток путем флэшхроматографии на силикагеле (дихлорметан:2 М ΝΠ₃ в МеОН=10:1) с получением титульного соединения в виде желтой пены (5,83 г, 98%).

Е8/МС т/ζ 323,2 (М+1).

Промежуточные соединения, представленные далее в таблице, получали по существу согласно способу, описанному в примере получения 9, с тем исключением, что с соответствующего т-Ьоезамещенного амина снимают защиту с применением 4 М НС1 в диоксане.

- 6 019059

Пример получения	Химическое название	Структура	ЕЗ/МС т/ ζ
10	1-(4-(1Н-пиразол-5- ил)фталазин-1-ил)-Νметилпиперидин-4-амин	^Μ'Ν Ν-Ν ^λ/ ' Н	309,2 (Μ+>
11	1-(4-( 1-метил-1Нпиразол-5-ил)фталазин-1ил)пиперидин-4-амин	^νν ν-ν ^λ/\	408,8 (Μ*)

Пример 1.

4-Фтор-Ы-метил-Н-(1-(4-(1-метил-1Н-пиразол-5-ил)фталазин-1-ил)пиперидин-4-ил)-2(трифторметил)бензамид

Обрабатывали раствор N-метил- 1-(4-(1-метил-1Н-пиразол-5-ил)фталазин-1 -ил)пиперидин-4-амина (2,8 г, 8,68 ммоль) и триэтиламина (3,36 мл, 26,1 ммоль) в СН₂С1₂ (30 мл) 4-фтор-2(трифторметил)бензоилхлоридом (2,14 мл, 10,42 ммоль).

Перемешивали в течение 3 ч при температуре окружающей среды. Концентрировали реакционную смесь при пониженном давлении. Очищали полученный остаток путем флэш-хроматографии на силикагеле (гексан:этилацетат:2 М ΝΗ₃ в МеОН=20:5:1) с получением свободного основания в виде желтой пены (3,83 г, 86%).

Е8/МС т/ζ 513,0 (М+1).

Пример 1а.

Гидрохлорид 4-фтор-№метил-№(1-(4-(1-метил-1Н-пиразол-5-ил)фталазин-1-ил)пиперидин-4-ил)-2(трифторметил)бензамида.

Растворяли 4-фтор-№метил-№(1-(4-(1-метил-1Н-пиразол-5-ил)фталазин-1-ил)пиперидин-4-ил)-2(трифторметил)бензамид (7,13 г, 13,91 ммоль) в дихлорметане (100 мл) и добавляли избыток 1н. НС1 в диэтиловом эфире (30 мл, 30 ммоль). Удаляли растворители при пониженном давлении с получением титульного соединения (7,05 г, 92%).

Е8/МС т/ζ 513,0 (М+1).

Данные ЯМР показали наличие смеси амидных ротамеров в соотношении 2:1.

Основной ротамер:

Ή ЯМР (400 МГц, ДМСО-6₆): δ 8,34 (м, 1Н), 8,26 (м, 2Н), 7,95 (м, 1Н), 7,75 (м, 1Н), 7,64 (м, 2Н), 7,55 (м, 1Н), 6,72 (д, 1Н, 1=2 Гц), 5,15 (уш., 1Н), 4,71 (м, 1Н), 4,22 (м, 2Н), 3,84 (с, 3Н), 3,48 (м, 2Н), 2,65 (с, 3Н), 2,19 (м, 2Н), 1,89 (м, 2Н).

Побочный ротамер:

Ή ЯМР (400 МГц, ДМСО-6₆): δ 8,27 (м, 1Н), 8,24 (м, 2Н), 7,94 (м, 1Н), 7,73 (м, 1Н), 7,63 (м, 3Н), 6,70 (д, 1Н, 1=2 Гц), 5,15 (уш., 1Н), 4,71 (м, 1Н), 4,07 (м, 2Н), 3,81 (с, 3Н), 3,16 (м, 2Н), 2,92 (с, 3Н), 1,90 (м, 2Н), 1,62 (м, 2Н).

Амиды, представленные далее в таблице, получали по существу согласно способам, описанным в примере 1 и 1а, с применением соответствующего пиперидинилфталазина и замещенного бензоилхлорида.

- 7 019059

№ При- мера	Химическое название	Структура	ЕЗ/МС πι/ζ
2	Гидрохлорид 2-фтор-М- метил-М- (1-(4-(1-метил1Н-пиразол-5- ил)фталазин-1- ил)пиперидин-4-ил)-3- (трифторметил)бензамида	Е Е НС1 Р У-Р 'Ν Ν-Ν X—^/ \	513,0 (Μ+1)
3	Гидрохлорид Ν-метил-М(1-(4-(1-метил-1Лпиразол-5-ил)фталазин1-ил)пиперидин-4-ил)-4(трифторметокси}бензамида	ά X нс! Р ,^р '<___о р Н '/—λ ?—Ν Ν 7_ί- -Ν ν-ν '	511, 0 (Μ+1)

4	Гидрохлорид М-метил-М(1-(4-(1-метил-1Япиразол-5-ил)фталазин1-ил)пиперидин-4-ил)-2(трифторметокси)бензамида	Р Р О ™ _о V. ГНП-СжН} ^Ы-М ы-ы х_У \	511,0 (Μ+1)
5	Гидрохлорид 5-фтор-М- метил-Ν- (1-(4-(1-метил1Л-пиразол-5- ил)фталазин-1- ил)пиперидин-4-ил)-2(трифторметил)бензамида	о ” «Ά пТ-у-гуТм ^Ν'Ν ν-Ν \ Р	513,0 (Μ+1)
6	Гидрохлорид 3,5-ДИХЛОр- М-метил“АГ- (1- (4- ίίметил -1 Н-пиразол-5ил)фталазин-1- ил)липеридин-4- ил)бензамида	/=У НС) С1 ^Ν'Ν М-Ν ⁷ \ +_С[	(²⁵С1) 4 95,0 (Μ+1)
7	Гидрохлорид 4-циано-Мметил-М- (1-(4- (1-метил1Я-пиразол-5ил)фталазин-1- ил)пиперидин-4- ил)бензамида	~\ на С \ о ίί ’ —‘ — N Ж ''^^^Ν ^ΝΗ ν-Ν ν_/	526,2 (Μ+1)
8	Гидрохлорид Ν-(1-(4- (1Н-пиразол~5- ил)фталазин-1- ил)пиперидин-4-ил)-4фтор-М-метил-2- (трифторметил)бензамида	О ” Ж ^Ν “Η Ν—Η X—/ \ Η	499,0 (Μ+1)
9	Гидрохлорид Ν-(1-(4-ίίметил-! И-пиразол-5ил)фталазин-1- ил)пиперидин-4-ил)-4- (трифторметокси)бензамида	Ο ο ^ΡΙρ ^Ν-Μ >Ι-Ν χ—ζ Η \	497,0 (Μ+1)

- 8 019059

10	Гидрохлорид 77-(1-(4-(1метил-Ш-пиразол-5ил)фталазин-1- ил)пилеридин-4-ил)-2- (трифторметокси)бензамида	Р Р НС1 о ^ν~Ν Ν-м \—/ Н	497,0 (М+1)
11	Гидрохлорид 5-фтор-77- (1-(4-(1-метил-1Япиразол-5-ил)фталазин1-ил)пиперидин-4-ил)-2(трифторметил)бензамида	Р Е НС1 Ν Ν^_Η \—/ Ц р	499,0 (М+1)
12	Гидрохлорид 4-фтор-И- (1-(4-(1-метил-1Нпиразол-5-ил)фталазин1-ил)пиперидин-4-ил)-2(трифторметил)бензамида	Р Р НС1 ^ν'Ν ν-ν Η	499,0 (М+1)
13	Гидрохлорид 4-циано-71(1-(4-(1-метил-1Нпиразол-5-ил)фталазин1-ил)пилеридин-4- ил)бензамида	Г~'\ НС1 X / θ '^Г='\ Г'·—N )— N ~ ^М 'Ν Η-Ν И	433,0 (М+1)

Пример 14.

Гидрохлорид 4-хлор-П-метил-П-(1-(4-(1-метил-1Н-пиразол-5-ил)фталазин-1-ил)пиперидин-4-ил)-2(метилсульфонил)бензамида

\

Растворяли Ы-метил-1-(4-(1-метил-1Н-пиразол-5-ил)фталазин-1-ил)пиперидин-4-амин (100 мг, 0,31 ммоль), 4-хлор-2-(метилсульфонил)бензойную кислоту (87 мг, 0,37 ммоль) и диизопропилэтиламин (0,26 мл, 1,5 ммоль) в ДМФ:ДМСО=4:1 (2 мл) при 60°С. Охлаждали до 0°С и к раствору добавляли дифенилфосфинат пентафторфенила (250 мг, 0,65 ммоль) в ДМФ:ДМСО=1:1 (1 мл). Перемешивали смесь при 60°С в течение ночи. Охлаждали реакционную смесь до температуры окружающей среды и разбавляли СН₂С1₂, промывали солевым раствором, сушили над Ыа₂8О₄ и концентрировали при пониженном давлении. Очищали полученный остаток путем флэш-хроматографии на силикагеле (гексан:этилацетат: 2 М ΝΗ₃ в МеОН=20:5:1) с получением продукта. Добавляли избыток 1н. НС1 в диэтиловом эфире (1 мл, 10 ммоль) к выделенному продукту и удаляли растворитель с получением титульного соединения (150 мг, 84%).

Е8/МС т/ζ 539,0 (М+1).

Амиды, представленные далее в таблице, получали по существу согласно способу, описанному в примере 14, с применением соответствующего пиперидинилфталазина и замещенной бензойной кисло ты.

- 9 019059

№ При- мера	Химическое название	Структура	Е5/МС т/ζ
15	Гидрохлорид Я-метил-Я(1-(4-(1-метил-1Япиразол-5-ил)фталазин1-ил)пиперидин-4-ил)-2(метилсульфонил)бензамида	О а /Г~\ НС1 о=$	505, 0 (М+1)
16	Гидрохлорид 5-φτορ-Ν- метил-АА- (1-(4-(1-метил1Я-пиразол-5- ил)фталазин-1- ил)пиперидин-4-ил)-2- (метилсульфонил)бензамида	О НС1 0=5' О ^Ν Ν Ν“Ν —^/ Е	476, 0 (М+1)
17	Гидрохлорид АН метил-ДГ- ¢1-(4-(1-метил-1Я— пиразол-5-ил)фталазин1-ил)пиперидин-4-ил)-2(трифторметилсульфонил) бензамида	„ 0 Р* ^НС1 0=5^ХЕ ^νν ν-ν ⁴—^{ζ х}	559,0 (М+1)

18	Гидрохлорид 2-хлор-4- фтор-Я-метил-М- (1-(4(1-метил-1 Я-пиразол-5ил)фталазин-1- ил)пиперидин-4- ил)бензамида	/ГЛ ^{НС\| С1}х ^Ν'Ν Ν-Ν '--‘	(³⁵С1) 479,0 (М+1)
19	Гидрохлорид 2-циано-Яметил-Я- (1-(4-( 1-метил1И-пиразол-5- ил)фталазин-1ил)пиперидин-4- ил)бензамида	ΉηΉ	452,0 (М+1)
20	Гидрохлорид 4- (дифторметокси)-Νметил-Я- (1- (4 - (1-метил1Я-пиразол-5- ил)фталазин-1- ил)пиперидин-4- ил)бензамида	на г ! 7 о /=\ >~^р ^Η Ν 'ы-ίί” ^λ4	493,0 _; (М+1)

- 10 019059

21	Гидрохлорид Я-(1-(4-(1- меτил-1Η-πиρазοл-5- ил) фталазин-1'- ил)пиперидин-4-ил)-2(метилсульфонил)бензамида	о./ ΛΛ ^нс‘ о°^>=\ Ν-Ν ^н	491,0 (М+1)
22	Гидрохлорид 4-хлор-М- (1-(4-(1-метил-1Япиразол-5-ил)фталазин1~ил)пиперидин-4-ил)-2(метилсульфонил)бензамида	О / НС1 П—Ν V-N ^Ν Ν Н-Ν '---' ^Н	(³⁵С1) 525,0 (М+1)
23	Гидрохлорид М-(1-(4-(1метил-1 Н-пиразол-бил) фталазин-1- . ил)пиперидин-4-ил)-2{трифторметилсульфонил) бензамида	Г 1= ОАР /Гу НС) _О96 Ν-Ν ^λ' ^н	545,0 (М+1)

24

Гидрохлорид 2-хлор-4- фтор-Ν- (1-(4-(1-метил1Я-пиразол-5- ил)фталазин-1- ил)пиперидин-4- ил)бензамида

НС1 О Ν-/ '_Ν__Ν \—/ Н

(³⁵С1) 465,0 (М+1)

Полагают, что Небдейод является фактором выживаемости следующих раковых заболеваний: базально-клеточной карциномы; раковых заболеваний верхних отделов ЖКТ (пищевода, желудка, поджелудочной железы и желчевыводящих путей); рака простаты, рака груди; мелкоклеточного рака легких; немелкоклеточного рака легких; В-клеточной лимфомы; множественной миеломы; рака ЖКТ; рака яичников; колоректального рака; рака печени; меланомы; рака головы и шеи; мезотелиомы; саркомы мягких тканей; саркомы кости; лейкемии; рака яичек; рака почки и рака мозга.

Полагают, что элементы пути Небдейод являются потенциальными мишенями для лекарственных средств для лечения раковых заболеваний. Клеточная линия Баоу, выделенная из опухоли медуллобластомы (АТСС, НТВ-186), проявляет ответ на лиганды Нй. Когда указанные клетки обрабатывают экзогенно добавляемой 8йй-кондиционированной средой, путь передачи сигнала Нй активируется и приводит к повышенной экспрессии 6111. Циклопамин, алкалоид, выделенный из кукурузной лилии УегаХгиш саИГогтсиш (черемица калифорнийская), является слабым антагонистом Небдейод и, как было показано, подавляет экспрессию 6111 в ответ на стимуляцию 8йй. Последние наблюдения позволяют предположить, что циклопамин подавляет рост культивируемых клеток медуллобластомы и аллотрансплантантов. С применением указанной модельной системы клеток Оаоу можно идентифицировать высокоактивные ингибиторы сигнальных путей Небдейод. Так как соединения согласно настоящему изобретению являются антагонистами Небдейод, они подходят для лечения вышеуказанных типов опухолей.

Определение биологической активности 1С₅₀: функциональное исследование для измерения ингибирования 6111 в клетках Оаоу.

Представленное далее исследование и его результаты дополнительно показывают применимость и эффективность соединений и способов согласно настоящему изобретению. Функциональные исследования подтверждают, что соединения согласно настоящему изобретению проявляют способность ингибировать сигнальный путь 8йй. Все лиганды, растворители и реагенты, применяемые в следующем исследовании, легкодоступны из коммерческих источников или могут быть легко получены специалистами в данной области техники.

Биологическую активность определяют с помощью функционального исследования раковых клеток нервной системы Оаоу и измерения содержания рибонуклеиновой кислоты 6111 с применением системы для исследования рДНК (разветвленной деоксирибонуклеиновой кислоты) (Рапошюз, 1пс., Егешоп!, СА). Первоначально 611 был открыт в клеточной линии глиобластомы; он кодирует белок цинковый палец, который активируется посредством сигнального пути 8йй. Максимальный ответ получают путем индуцирования транскрипции 6111 в клетках Оаоу с применением кондиционированной среды (почка эмбриона человека, клетки НЕК-293, устойчиво экспрессирующие рекомбинантный 8йй) в течение 24 ч, а

- 11 019059 затем измерения количества стимулированных транскриптов 0Й1. Минимальным ответом является количество транскриптов 0111, ингибируемых контрольным соединением в клетках Эаоу. которые стимулировали кондиционированной средой (почка эмбриона человека, клетки НЕК-293, устойчиво экспрессирующие рекомбинантный 3йй) в течение 24 ч.

В системе для исследования рДНК применяют технологию ДНК с разветвленной цепью для обеспечения амплификации рибонуклеиновой кислоты (транскрипта)-мишени. Технология предполагает применение трех типов синтетических гибридных коротких 0111-специфичных кДНК-зондов, которые определяют специфичность транскрипта-мишени (модификаторы захвата (МЗ), модификаторы-метки (ММ) и блокаторы (БЛ)), которые гибридизуются в виде комплекса с транскриптами-мишенями для амплификации сигнала гибридизации. Добавление хемилюмигенного субстрата в течение стадии амплификации обеспечивает возможность детектирования с применением люминесценции.

Клетки Эаоу выращивали до достижения конфлюэнтности в колбе для тканевых культур Т225 в среде роста Иаоу, содержащей минимальную поддерживающую среду (МЕМ) и 10% эмбриональную бычью сыворотку (ЭБС) с 0,1 нМ заменимых аминокислот и 1мМ пирувата натрия. Клетки удаляли из колб Т225 с применением трипсина-этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), центрифугировали, повторно суспендировали в среде, затем подсчитывали.

Клетки Эаоу затем помещали в количестве 50000 клеток на лунку в среду для роста в 96-луночные прозрачные планшеты для тканевых культур Сок1аг и оставляли инкубироваться на ночь при 37°С в 5% диоксида углерода (СО₂). Клетки промывали один раз фосфатно-солевым буфером (РВ3), затем добавляли 100 мкл 31111 кондиционированной среды (Зйй-СМ) для стимуляции уровня экспрессии 0111. Зйй-СМ разбавляли контрольной средой для роста - 0,1% ЭБС/ОМЕМ (модифицированная по способу Дульбекко среда Игла) - для достижения максимальной стимуляции. Клетки Иаоу, обработанные Зйй-СМ, затем обрабатывали ингибиторами Нейдейод в различных концентрациях в диапазоне от 1 мкМ до 0,1 нМ. Исследуемые соединения оставляли инкубироваться в течение 24 ч при 37°С в 5% СО2.

Измерение транскрипта 0Й1 проводили с применением исследования 0Й1 Онапйдепе 2.0 согласно описанию от производителя (Рапот1ск, 1пс.). Получали буфер для разбавленной лизисной смеси (ИБМ), который содержал протеиназу К. После 24-часового инкубирования с соединением клетки промывали один раз РВ3 и 180 мкл ЭБМ добавляли в клетки. Планшет для клеточных культур, содержащий лизисный буфер, герметизировали и помещали в 55°С в течение от 30 до 45 мин. Полученные клеточные лизаты затем растирали 5 раз. Набор рабочих зондов, содержащий зонды 0111, получали путем разбавления зондов в Эй-М согласно руководству производителя, затем 20 мкл набора рабочих зондов добавляли в планшеты для исследования рДНК вместе с 80 мкл лизатов Эаоу. Планшеты герметизировали и инкубировали в течение ночи при 55°С. Планшеты рДНК затем обрабатывали согласно руководству производителя. Сигнал количественно оценивали путем считывания планшетов на планшет-ридере Реткт Е1тег Епущюп с люминесцентным детектированием. Люминесцентный сигнал прямо пропорционален количеству транскрипта-мишени, присутствующего в образце.

Данные сигнала люминесценции, полученные в функциональном исследовании, применяли для вычисления 1С₅₀ в исследовании ш νίΙΐΌ. Данные рассчитывали на основании максимальных контрольных значений (для клеток Иаоу, обработанных Зйй-СМ) и минимального контрольного значения (для клеток Иаоу, обработанных Зйй-СМ и контрольным соединением в ингибирующей концентрации, 1мкМ N-(3(1Н-бензо[й]имидазол-2-ил)-4-хлорфенил)-3,5-диметоксибензамида). Четырехпараметровую логистическую кривую применяли для получения значений 1С₅₀ с использованием программного обеспечения АсЙУЙуВаке версии 5.3, уравнение 205 (Аккау Ошйапсе Мапиа1 Уеткюп 5.0, 2008, Ей ЬШу апй Сотрапу апй ΝΙΗ Сйет1са1 Оепотюк Сеп1ег).

Согласно описанному способу соединения, примеры которых приведены в настоящем патенте, обладают 1С₅₀, составляющей <40 нМ. Например, в описанном выше исследовании соединение согласно примеру 1а обладает 1С₅₀, составляющей примерно 2,4 нМ при стандартной ошибке, равной 0,5 (п=7, вычислена как среднее геометрическое и геометрическая среднеквадратичная ошибка). Указанные результаты подтверждают, что соединения согласно настоящему изобретению являются высокоактивными антагонистами Нейде1од и как таковые подходят для применения в качестве противораковых агентов.

Исследование ингибирования СУР3А4.

Образцы для инкубирования получали путем добавления микросомного препарата печени человека к исследуемому ингибитору (конечные концентрации 0,05 мг/мл белка, 10 мкМ ингибитора в 100 мМ буфере NаРΟ₄, рН 7,4) и перемешивали. Образцы предварительно инкубировали в течение примерно 5 мин при 37°С. После предварительного инкубирования инициировали реакцию путем добавления раствора, содержащего НАДФН и мидазолам, в качестве ферментного субстрата (конечная концентрация 1 мМ НАДФН, 5 мкМ мидазолама). После добавления раствора НАДФН образцы инкубировали в течение 3 мин при примерно 37°С. После инкубирования реакцию гасили путем добавления 50 мкл метанола (и внутреннего стандарта для хроматографии), образцы тщательно перемешивали. После гашения реакции смесь центрифугировали при примерно 4000 об/мин в течение 15 мин при примерно 5°С и анализировали путем ЖХ/МС-анализа.

Образцы анализировали путем ВЭЖХ/МС с градиентным элюированием на коротких традицион

- 12 019059 ных колонках С18 (загружаемая подвижная фаза при загрузке - 95/5 Μί11ί-Ο® Н₂О/метанол (об./об.) с 1% уксусной кислоты). Подвижная фаза В - 80/20 Μί11ί-Ο® Н₂О/метанол (об./об.) с 1% уксусной кислоты. Подвижная фаза С - 5/95 Μί11ί-Ο® Н₂О/метанол (об./об.) с 1% уксусной кислоты. Подвижная фаза для промывки - 75/25 Μίΐΐί-Ο® Н₂О/ацетонитрил (об./об.).

Образцы впрыскивали в спектральный масс-анализатор для мониторинга заданных ионов (8ΙΜ) с массой, равной 342,1 (1-ОН-мидазолам) и 346,1 (внутренний стандарт а-гидроксимидазолам-б4) с применением ТигЬо1оп 8ртау с детектированием положительных ионов. Данные представлены в виде % ингибирования образования 1-ОН-мидазолама в присутствии ингибитора в концентрации 10 мкМ.

Согласно описанному способу пример 1а показывает 13,5% ингибирование СУР3А4. Соединения, например, согласно примеру 1а, которые демонстрируют низкую способность обратимо ингибировать СУР3А4, обладают сниженной вероятностью негативных взаимодействий с другими лекарственными средствами, которые могут приводить к изменениям дозировки лекарственных средств или необходимости прекращения введения лекарственного средства пациенту. Таким образом, указанные соединения являются желательными и обладают улучшенными характеристиками безопасности.

Механизм-зависимое ингибирование СУР3А ίη νίίΓΟ.

Соединение согласно примеру 1а оценивали в качестве механизм-зависимого ингибитора СУР3А с целью получения кинетических констант к _инакт и Κ_Ι для указанного взаимодействия (к _инакт является максимальной константой скорости образования неактивного комплекса с ферментом. Κ_Ι представляет собой концентрацию при половине максимальной инактивации). Соединение инкубировали с микросомами печени человека (пул микросом печени человека с высокой экспрессией активности СУР3А4) в процессе двухстадийного инкубирования ίη νίΐτο: реакции инактивации, которая позволяет ингибитору инактивировать фермент, и анализ активности, в котором определяют остаточную активность микросомного белка с применением Т-гидроксилирования мидазолама в качестве зонда.

Реакционные смеси для инактивации (конечный объем 100 мкл), содержащие 100 мМ буфер фосфата натрия (рН 7,4), 1 мМ ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) в отсутствие или в присутствии 1 мМ НАДФН (никотинамид аденин динуклеотид фосфат, восстановленный) и исследуемое соединение с концентрацией в диапазоне 0,75-24 мкМ, предварительно инкубировали в течение 3 мин при 37°С в трех повторах. Реакции инактивации инициировали путем добавления пула микросом с высокой активностью СУР3А (Сс11хО|гсс1. ΛιΐδΙίη ТХ, 0,5 мг/мл). В различные временные интервалы (0, 2,5, 5, 10 и 30 мин) отбирали 5-мкл аликвоты реакционных смесей для подавления активности и разбавляли 1/20 в предварительно нагретой (37°С) инкубационной системе для анализа активности СУР3А4 (95 мкл), содержащей 1 мМ НАДФН и мидазолам (100 мкМ). Указанную смесь для исследования активности с конечной концентрацией белка, равной 0,025 мг/мл, и концентрацией ингибитора 1/20 дополнительно инкубировали (37°С) в течение 1 мин перед остановкой реакции путем добавления 50 мкл МеОН. Образцы перемешивали и денатурированный белок удаляли путем центрифугирования при 4000 об/мин в течение 10 мин.

Образование 1'-ОН мидазолама анализировали путем ЖХ/МС/МС с градиентным элюированием на колонке Рйепошепех 8упет§1 4μ Нубго-РР (подвижная фаза А - 95/5 Μίΐΐί-Ο® Н₂О/метанол (об./об.) с 5 мМ ацетата аммония, подвижная фаза В - 5/95 Μί11ί-Ο® Н₂О/метанол (об./об.) с 5 мМ ацетата аммония, растворитель для промывания иглы А - 0,4% трифторуксусной кислоты в 90/10 ацетонитрил/ΜίΙΙί-Ο® Н₂О (об./об.), растворитель для промывания иглы В - 50/50 Μίΐΐί-Ο® Н₂О/метанол (об./об.)). Образцы впрыскивали в 8с1ех АР1 4000 для мониторинга селективных реакций при массе, равной 342,0 (1-ОНмидазолам) и 347,0 (внутренний стандарт а-гидроксимидазолам-б3), с применением ТигЬо1оп 8ртау с детектированием положительных ионов.

Снижение образования 1'-ОН мидазолама (активности СУР3А4) в инкубированных микросомах наносили на график в виде логарифма процента остаточной активности СУР3А4 как функции времени предварительного инкубирования для каждой концентрации исследуемого соединения. Кинетические параметры подавления активности определяли с применением ^1пЫоп11п Рто1с88юпа1 с построением следующих уравнений по полученным данным:

Уравнение 1: ингибирование в процентах (1)=100,, ₀.,хе^,'^-?и', где λ определена как

Уравнение 2: λ=^ _инактх1)/(К₁+1).

Снижение активности в случае соединения согласно примеру 1а находится в диапазоне 11-22% и не зависит от концентрации. Следовательно, значения к _инакт и Κ_Ι в уравнении 2 невозможно определить. Основываясь на полученных данных, соединение согласно примеру 1а не является механизм-зависимым ингибитором СУР3А4. Соединения, такие как пример 1а, которые демонстрируют низкую или отсутствующую способность механизм-зависимого необратимого ингибирования СУР3А4, обладают сниженной вероятностью негативных взаимодействий с другими лекарственными средствами, которые могли бы приводить к изменениям дозировки лекарственных средств или необходимости прекращения введения лекарственного средства пациенту. Таким образом, такие соединения являются желательными и обладают улучшенными характеристиками безопасности.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Соединение формулы где Я¹ представляет собой водород или метил;

Я² представляет собой водород или метил;

Я³, Я⁴, Я⁵, Я⁶ или Я⁷ независимо представляют собой водород, фтор, хлор, циано, трифторметил, трифторметокси, дифторметокси, метилсульфонил или трифторметилсульфонил при условии, что по меньшей мере три из Я³, Я⁴, Я⁵, Я⁶ и Я⁷ представляют собой водород, или фармацевтически приемлемая соль указанного соединения.
2. Соединение по п.1, отличающееся тем, что Я¹ представляет собой метил, или его фармацевтически приемлемая соль.
3. Соединение по п.1 или 2, отличающееся тем, что Я² представляет собой метил, или его фармацевтически приемлемая соль.
4. Соединение по любому из пп.1-3, отличающееся тем, что Я³, Я⁴, Я⁵, Я⁶ и Я⁷ независимо представляют собой водород, фтор, хлор, трифторметил или метилсульфонил, или его фармацевтически приемлемая соль.
5. Соединение по любому из пп.1-4, отличающееся тем, что Я³, Я⁴, Я⁵, Я⁶ и Я⁷ независимо представляют собой водород, фтор или трифторметил, или его фармацевтически приемлемая соль.
6. Соединение по любому из пп.1-5, отличающееся тем, что Я⁴, Я⁶ и Я⁷ представляют собой водород, или его фармацевтически приемлемая соль.
7. Соединение по любому из пп.1-6, которое представляет собой 4-фтор-Ы-метил-Ы-(1-(4-(1-метил1Н-пиразол-5-ил)фталазин-1-ил)пиперидин-4-ил)-2-(трифторметил)бензамид, или его фармацевтически приемлемая соль.
8. Соединение по любому из пп.1-7, которое представляет собой гидрохлорид 4-фтор-Ы-метил-Ы-(1(4-(1-метил-1Н-пиразол-5-ил)фталазин-1-ил)пиперидин-4-ил)-2-(трифторметил)бензамида.
9. Фармацевтическая композиция, содержащая соединение по любому из пп.1-8 или его фармацевтически приемлемую соль в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем или наполнителем.
10. Антагонист пути Небдейод, представляющий собой соединение по любому из пп.1-8 или его фармацевтически приемлемую соль.
11. Применение соединения по любому из пп. 1 -8 или его фармацевтически приемлемой соли для лечения рака.

Евразийская патентная организация, ЕАПВ

Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2