UA106755C2

UA106755C2 - Двозаміщені фталазини - антагоністи провідного шляху hedgehog

Info

Publication number: UA106755C2
Application number: UAA201114996A
Authority: UA
Inventors: Філіп Артур Хіпскінд; Барвін Кумар Пейтел; Такако Уілсон
Original assignee: Елі Ліллі Енд Компані
Priority date: 2009-06-19
Filing date: 2010-06-15
Publication date: 2014-10-10
Also published as: IL216599A; ES2409054T3; MY156667A; JO2931B1; CL2011003147A1; CN102459233B; HN2011003139A; AR077014A1; ECSP11011541A; TN2011000627A1; DK2443104T3; EA201270049A1; ZA201108587B; EA019059B1; CR20110658A; US20100324048A1; JP2012530705A; HK1164872A1; HRP20130408T1; SI2443104T1

Abstract

Цей винахід пропонує нові 1,4-двозаміщені фталазини формули (І)які є інгібіторами провідного шляху hedgehog і корисні у лікуванні онкологічних захворювань.

Description

Цей винахід стосується антагоністів провідного шляху педдепод і, більш конкретно, нових 1,4- двозаміщених фталазинів та їх терапевтичного застосування. Сигнальний провідний шлях

Неддепод (НІ) відіграє значну роль у формуванні ембріональної системи та підтриманні стану тканини у дорослих шляхом спрямування диференціації та проліферації клітин. Групу педдепод- (НИ)-протеїнів, до якої входять Бопіс Нейдепод (5), Іпаіїап Неддепод (Іпп) та Оеєзегі Неддепод (ОПП), складають секретовані глікопротеїни, які зазнають посттрансляційних модифікацій, в тому числі автокаталітичного розщеплення та приєднання холестерину до амінотермінального пептиду з утворенням фрагмента, який має сигнальну активність. НИ зв'язується з 12-прохідним трансмембранним протеїном Ріс (Рісп1 та Рісп2), тим самим полегшуючи опосередковане Рісп пригнічення агента ЗтооїПепей (Зіто). Активація 5то запускає послідовність внутрішньоклітинних процесів, які завершуються стабілізацією факторів транскрипції сії (11, сіі2 та СІїЗ) та експресії

Сії-залежних генів, відповідальних за проліферацію клітин, виживання клітин, ангіогенез та інвазію.

Передача сигналів за участю НИ останнім часом викликає значний інтерес у зв'язку з виявленням факту, що аберантна активація передачі сигналу за участю 5пПп призводить до виникнення різноманітних пухлин, наприклад, раку підшлункової залози, медулобластоми, базально-клітинного раку, дрібноклітинного раку легенів та раку простати. У М/О2005/033288 розкриті деякі 1,4-двозаміщені фталазини, вказані як антагоністи Ппейдепйод. Так само, у

МО2008/110611 розкриті певні 1,4-двозаміщені фталазини, які мають відношення до діагностики і лікування патологій, зв'язаних з провідним шляхом педдепод. У УМО2009/002469 розкриті певні 1,4- двозаміщені фталазини, які запропоновані, як факультативний засіб для лікування всіх видів злоякісних пухлин, розвиток яких пов'язаний із хибним функціонуванням сигнальної системи

Ппеддепод.

Втім, існує потреба у сильнодіючих інгібіторах провідного шляху педдепод - особливо таких, що мають бажаний токсикологічний профіль. Цей винахід пропонує нові 1,4-двозаміщені фталазини як сильнодіючі антагоністи цього провідного шляху. Конкретні сполуки за цим винаходом забезпечують бажану взаємодію лікарських препаратів між собою, та відповідні профілі безпечності за умов оборотного та/або необоротного інгібування СУРЗА4.

Цей винахід пропонує сполуку формули І

В в 2-5 ; - В?

Ще М М

М М-М в в вВ'

Формула І де Е! означає водень або метил; К2 означає водень або метил; КЗ, В", І», НЄ? або КЕ" незалежно один від одного означають водень, фтор, хлор, ціаногрупу, трифторометил, трифторометокси, дифторометокси, метилсульфоніл або трифторометилсульфоніл, за умови, що принаймні три з КУ,

ВУ, В», Не та Б" являють собою водень; або фармацевтично прийнятну сіль цієї сполуки.

Цей винахід пропонує також фармацевтичну композицію, яка містить сполуку Формули І або її фармацевтично прийнятну сіль разом із фармацевтично прийнятним наповнювачем, носієм або розріджувачем.

Цей винахід пропонує метод лікування раку, обраного з групи, яка складається з раку мозку, базально-клітинного раку, раку стравоходу, раку шлунка, раку шлунково-кишкового тракту, раку підшлункової залози, раку жовчних шляхів, раку простати, раку молочної залози, дрібноклітинного раку легенів, недрібноклітинного раку легенів, лімфоми В-клітин, множинної мієломи, раку яєчників, колоректального раку, раку печінки, раку нирки, меланоми, злоякісних новоутворень голови і шиї, мезотеліоми, саркоми м'яких тканин, саркоми кісток, лейкемії та раку яєчка у ссавців, який включає введення до організму ссавця ефективної кількості сполуки формули І або її фармацевтично прийнятної солі.

Крім того, цей винахід пропонує сполуку формули І або її фармацевтично прийнятну сіль для застосування у терапії. Також цей винахід пропонує сполуку формули | або її фармацевтично прийнятну сіль для застосування у лікуванні раку. Зокрема, згаданий рак обраний з групи, яка складається з раку мозку, базально-клітинного раку, раку стравоходу, раку шлунка, раку шлунково- кишкового тракту, раку підшлункової залози, раку жовчних шляхів, раку простати, раку молочної залози, дрібноклітинного раку легенів, недрібноклітинного раку легенів, лімфоми В-клітин, множинної мієломи, раку яєчників, колоректального раку, раку печінки, раку нирки, меланоми, злоякісних новоутворень голови і шиї, мезотеліоми, саркоми м'яких тканин, саркоми кісток, лейкемії та раку яєчка.

Цей винахід також пропонує застосування в терапії сполуки формули І або її фармацевтично прийнятної солі. Крім того, цей винахід пропонує застосування сполуки формули! або її фармацевтично прийнятної солі для виготовлення лікарського засобу для лікування раків. Зокрема,

згаданий рак обраний з групи, яка складається з раку мозку, базально-клітинного раку, раку стравоходу, раку шлунка, раку шлунково-кишкового тракту, раку підшлункової залози, раку жовчних шляхів, раку простати, раку молочної залози, дрібноклітинного раку легенів, недрібноклітинного раку легенів, лімфоми В-клітин, множинної мієломи, раку яєчників, колоректального раку, раку печінки, раку нирки, меланоми, злоякісних новоутворень голови і шиї, мезотеліоми, саркоми м'яких тканин, саркоми кісток, лейкемії, та раку яєчка.

Крім того, цей винахід пропонує фармацевтичну композицію, яка містить сполуку формули І або її фармацевтично прийнятну сіль як активний інгредієнт для лікування раку, обраного з групи, яка складається з раку мозку, базально-клітинного раку, раку стравоходу, раку шлунка, раку шлунково- кишкового тракту, раку підшлункової залози, раку жовчних шляхів, раку простати, раку молочної залози, дрібноклітинного раку легенів, недрібноклітинного раку легенів, лімфоми В-клітин, множинної мієломи, раку яєчників, колоректального раку, раку печінки, раку нирки, меланоми, злоякісних новоутворень голови і шиї, мезотеліоми, саркоми м'яких тканин, саркоми кісток, лейкемії та раку яєчка.

До конкретних сполук, що описуються формулою І, або їх фармацевтично прийнятних солей належать сполуки, у складі яких: (а) К1 означає метил; (р) К2 означає метил; (с) КЗ, К4, К5, Кб або К7/ незалежно одне від одного означають водень, фтор, хлор, трифторометил або метилсульфоніл; (4) КЗ, К4, К5, Кб або К7 незалежно один від одного означають водень, фтор або трифторометил; (є) щонайменше двоє з таких замісників, як КЗ, К4, К5, Кб та К7, незалежно один від одного означають фтор, хлор, трифторометил або метилсульфоніл, за умови, що КЗ та К7 не є одночасно атомами водню; () щонайменше двоє з таких замісників, як КЗ, К4, К5, Кб та К7, незалежно один від одного означають фтор або трифторометил, за умови, що КЗ та К7 не є одночасно атомами водню; (9) К4, Кб та К7 означають водень; (п) КЗ та К5 незалежно один від одного означають фтор, хлор, трифторометил або метилсульфоніл, а К4, Кб та К7 означають водень; () КЗ та К5 незалежно один від одного означають фтор або трифторометил, а К4, Кб та К7 означають водень; (Ї) К1 є метилом та Ка2 є метилом; (К) К1 означає метил, К2 означає метил, а КЗ, К4, К5, Кб або К7 незалежно один від одного означають водень, фтор, хлор, трифтрометил або метилсульфоніл; () К1 означає метил, К2 означає метил, а КЗ, К4, К5, Кб або К7 незалежно один від одного означають водень, фтор або трифторометил; (т) К1 означає метил, К2 означає метил, а щонайменше двоє з таких замісників як КЗ, К4, К5,

Еб та К7, незалежно один від одного означають фтор, хлор, трифторометил або метилсульфоніл, за умови, що КЗ та К7 не є одночасно атомами водню; (п) К1 означає метил, К2 означає метил, а щонайменше двоє з таких замісників як КЗ, К4, К5,

Еб та К7, незалежно один від одного означають фтор або трифторометил, за умови, що КЗ та К7 не є одночасно атомами водню; (0) К1 означає метил, К2 означає метил, а К4, Кб та К7 означають водень; (р) К1 означає метил, К2 означає метил, КЗ та К5 незалежно один від одного означають фтор, хлор, трифторометил або метилсульфоніл, а К4, Еб та К7 означають водень; (4) К1 означає метил, К2 означає метил, КЗ та К5 незалежно один від одного означають фтор або трифторометил, а К4, б та К7 означають водень.

Терміни і визначення як застосовані вище, так і на протязі всього опису цього винаходу, якщо не зазначено інше, слід розуміти як такі, що мають наведені нижче значення.

Терміном "фармацевтично прийнятний носій, розріджувач або наповнювач" позначають середовище, яке вважається загальновизнаним у цій галузі засобом введення біологічно активних речовин до організму ссавців, наприклад людини.

Термін "фармацевтично прийнятні солі" стосується відносно нетоксичних неорганічних та органічних солей сполук за цим винаходом. "Терапевтично ефективна кількість" або "ефективна кількість" означає кількість сполуки формули | або її фармацевтично прийнятної солі за цим винаходом, або фармацевтичну композицію, яка містить сполуку формули І або її фармацевтично прийнятну сіль за цим винаходом, яка здатна викликати певну біологічну або медичну реакцію або бажаний терапевтичний вплив на тканини, органу або організму тварини, ссавця або людини, що його передбачив дослідник, ветеринар, лікар або інший медичний працівник.

Терміни "курс лікування", "лікувати", "процес лікування" тощо, у цьому описі означають сповільнення або обернення розвитку (прогресування) хвороби. Ці терміни також передбачають полегшення, поліпшення, послаблення, часткове або повне зняття одного або більше симптомів захворювання або хворобливого стану навіть у випадку, коли хворобу або хворобливий стан фактично не усунено, і навіть якщо прогресування хвороби або хворобливого стану як таких не сповільнено і не обернено.

Відповідно до стандартних правил номенклатури, вживаних у цьому описі, передусім описують кінцеву частину бокового ланцюга із подальшим описом суміжної частини у напрямку до точки приєднання ланцюга. Наприклад, замісник метилсульфоніл є еквівалентом фрагмента СНз-505-.

Сполуки за цим винаходом здатні вступати у реакцію, наприклад, із численними неорганічними або органічними кислотами з утворенням фармацевтично прийнятних солей - продуктів приєднання кислот. Такі фармацевтично прийнятні солі і способи їхнього приготування добре відомі фахівцям у відповідній галузі (див., наприклад, Р. еїайі, еї аї, НАМОВООК ОЄ РНАВМАСЕШТІСАЇ 5АЇТ5:

РВОРЕВТІЕ5, 5ЕГЕСТІОМ АМО БЕ (СОЛІ У ФАРМАЦІЇ - ВЛАСТИВОСТІ, АСОРТИМЕНТ,

КРИТЕРІЇ ВІДБОРУ І ЗАСТОСУВАННЯ: ДОВІДНИК), (МСНАЛМІЇЄу-МСН, 2002); 5.М. Вегоє, еї аї., "Рпаптасешіса! Зайве" ("Солі у фармації"), Уоигпаї ої Ріаптасешііса! 5сіепсе5, Мої! 66, Мо. 1, дапиагу 1977).

Сполуки за цим винаходом переважно включають до складу фармацевтичних композицій із застосуванням фармацевтично прийнятного носія, розріджувача або наповнювача і вводять до організму різноманітими шляхами. Переважно, такі композиції призначені для для перорального або внутрішньовенного введення. Такі фармацевтичні композиції та способи їх виготовлення добре відомі у відповідній галузі (див., наприклад, ВЕМІМЕТОМ: ТНЕ 5СІЕМСЕ АМО РВАСТІСЕ ОРГ

РНАВМАСУ (ТЕОРЕТИЧНІ ЗАСАДИ І ПРАКТИКА ФАРМАЦІЇ) (А. Сеппаго, еї аї., еав., 1917 ва., Маск

Рибіївпіпа Со., 1995)).

Практична форма застосування сполуки визначатиметься лікарем-терапевтом залежно від обставин, в тому числі стану, який належить лікувати, обраного шляху введення, фактичної природи сполуки, яку вводитимуть, віку, ваги тіла та індивідуальної чутливості (реакції) конкретного пацієнта, а також тяжкості симптомів захворювання. Добова доза зазвичай становить від приблизно 0,1 мг/кг до приблизно 10 мг/кг ваги тіла. У деяких випадках більш ніж достатньою може виявитися доза, нижча за нижчу межу зазначеного діапазону, натомість у інших випадках цілюом припустимим є застосування ще більших доз.

Сполуки Формули І або їх солі можуть бути виготовлені різноманітними методами, відомими у галузі, а також способами, показаними на Схемах, розкритими в описах Підготовчих синтезів та у

Прикладах, наведених нижче. Для одержання сполук Формули | або їх солей конкретні стадії синтезів для кожного з описаних методів можна комбінувати різними способами або пов'язувати зі стадіями, показаними на різних схемах.

Якщо не вказано інше, замісники відповідають наведеним вище визначенням. Реагенти та вихідні матеріали, як правило, є легко доступними для фахівця у галузі. Інші реагенти та вихідні матеріали можуть бути одержані стандартними методами хімії органічних та гетероциклічних сполук, методами, аналогічними способам синтезу відомих структурно аналогічних сполук, та методами, розкритими нижче в описах Препаративних методик та у Прикладах, в тому числі будь- якими новими методами. Пойменування наступних препаративних методик і прикладів здійснювали за допомогою функції Бігисі-Мате у складі прикладного пакету СпетОгам/?" ШОПга 10.0.

В контексті цього опису наведені нижче терміни застосовані у вказаних значеннях: "ЕБО" - діетиловий ефір, "ОМЕ" - диметилформамід, "ОМ5БО" - диметилсульфоксид"ОМАС" - М,М- диметилацетамід, "ММР" - М-метилпіролідін, "МеоОН" - метанол, "рос" або Ч-рос" - трет- бутгоксикарбоніл; "ІС50" - концентрація засобу, яка спричиняє 5095 максимальної інгібувальної реакції, можливої для цього засобу.

Схема о - "ши в / ї- Стадія 1 - Й -а се а нина В

Ч-М Ше ІМ- Е2

ТВ) сг) (З о -

Стадія 2 - Стадія З ле. сусу(єує тях а-воМем мА кі тв

Її в : т мем 9- (5) "о

В ев о - : - Ре

ПТК свлия СУ (У

Момь-м "в: Мем о к- ев "ви ви в) формула

Сполуку формули І можна одержати за реакціями, які подані на схемі.

На стадії 1 дигалогенопохідне фталазину (1) (ХАСІ або Вг) вводять у реакцію нуклеофільного ароматичного заміщення (З5МАГг) із піперидином, захищеним групою 4-аміно-рос (2), із одержанням галогенопохідного піперидилфталазину формули (3). Реакція відбувається у середовищі диполярного апротонного розчинника, такого як ОМЕ, ОМАС або ММР, у присутності органічної або неорганічної основи. За варіантом, якому надається перевага, реакція відбувається у середовищі

ММР у присутності карбонату калію, при температурі 50-14020.

На стадії 2 галогенопохідне піперидилфталазину формули (3) зазнає реакції крос-сполучення

Сузукі зі складним ефіром піразолборонової кислоти або вільною кислотою (4). Наприклад, галогенопохідне піперидилфталазину формули (3) сполучають із пінаколовим складним ефіром 1- метил-1Н-піразол-5-боронової кислоти у присутності паладієвого каталізатора, такого як тетракіс(трифенілфосфін)паладію, і неорганічної основи, такої як бікарбонат натрію. Реакція відбувається у змішаному розчиннику толуол"етанол:вода із утворенням піразолілфталазину формули (5).

Стадія З полягає просто у знятті захисту групою рос, яке здійснюють у умовах кислого середовища, такого як розчин НС! в діетиловому ефірі або діоксані, одержуючи амінопіперидинілфталазин формули (6). Методи введення і зняття захисту азот- та кисень- вміщуючих захисних груп добре відомі у галузі (див., наприклад, Сгеепе апа Ууцїв5, Ргоїесіїме Сгоиреь іп Огдапіс Зупіпезі5 (Захисні групи в органічному синтезі), З Еда., дхопп УмМієу апа бопв5, Мем/ Могк, (1999)).

На стадії 4 амінопіперидинілфталазин формули (6) ацилюють, одержуючи піперидиніламід формули!. За одним із методів амін вводять у реакцію із відповідним чином заміщеним бензоїлхлоридом у середовищі інертного розчинника, такого як дихлорметан, у присутності органічної основи, такої як триетиламін або діїзопропілетиламін. У альтернативному варіанті амід одержують, виходячи з відповідним чином заміщеної бензойної кислоти. Складний ефір, що виступає в ролі адилюючого реагента, одержують із пентафторофенілдифенілфосфінату, і потім вводять у реакцію з аміном. Реакція відбувається у змішаному розчиннику ОМЕ:ОМ5О при помірній температурі (приблизно від 102С до 1002С) у присутності органічної основи, такої як триетиламін або діізопропілетиламін.

Препаративна методика 1 трет-бутил-1-(4-хлорофталазин-1-іл)піперидин-4-іл(метил)карбамат о - -- У о ск, Ок м-М у;

Суміш карбонату калію (21,23 г, 153,6 ммоль), 1,4-дихлорофталазину (26 г, 128 ммоль) і трет- бутилового складного ефіру метилпіперидин-4-іл-карбамінової кислоти (30,01 г, 134,4 ммоль) у вигляді розчину в

М-метилпіролідині (200 мл) гріють протягом ночі при 802С. Реакційну суміш виливають у воду, екстрагують дихлорометаном, висушують над Маг5О»4, і згущують під зниженим тиском. Додають діетиловий ефір, і відділяють фільтруванням твердий осад (4-хлорофеталазін-1-ол, зі сторонніх домішок у вихідному матеріалі). Фільтрат згущують. Залишок, що утворився, очищують флеш- хроматографією на силікагелі (елюент - гексан'етилацетат-2:1), одержуючи сполуку, вказану у заголовку, у вигляді білої твердої речовини (17,66 г, 3795). Мас-спектр (ЕБ/М5 (Мас-спектроскопія з електророзпиленням)): т/з (3721) 377,0 (М--1).

Препаративна методика 2 трет-бутил-1-(4-хлорофталазін-1-іл)/упіперидин-4-іл-карбамат о У - -о

Ми Н

Сполуку, вказану у заголовку, одержують із дотриманням препаративної методики 1, але виходячи з трет-бутилового складного ефіру піперидин-4-іл-карбамінової кислоти. Реакційну суміш охолоджують і виливають у воду (500 мл). Екстрагують етилацетатом, промивають екстракт водою, висушують над Ма»5Ох, і випаровують розчинник у вакуумі, одержуючи сполуку, вказану у заголовку, у вигляді жовтої твердої речовини (36 г, 97965). Мас-спектр (ЕБ/М5): т/2 363,0 (М'-1).

Препаративна методика З трет-бутилметилі(1-(4-(1-метил-1 Н-піразол-5-ілуфталазин-1-іл)піперидин-4-іл)укарбамат ке У - о д--Ох т МАМ

Х

У колбу, що містить суміш толуолу (50 мл), етанолу (17 мл) і води (17 мл), вносять карбонат натрію (3,82г, 36,09 ммоль), трет-бутил-1-(4-хлорофталазин-1-іл)піперидин-4-іл(метил)карбамат (6,8 г, 18,04 ммоль) та пінаколовий складний ефір 1-метил-1Н-піразол-5-боронової кислоти (5,3 г, 27,1 ммоль). Суміш знекиснюють, витісняючи повітря азотом протягом 10 хв. Додають тетракіс(трифенілфосфін)паладій (0,4 г, 0,35 ммоль), і нагрівають суміш протягом ночі при 74260.

Охолоджують реакційну суміш до температури навколишнього середовища, і розводять діхлорометаном. Шар органічних продуктів промивають ропою, висушують над Ма»5Ох, і згущують під зниженим тиском. Залишок, що утворився, очищують флеш-хроматографією на силікагелі (елюент - гексан'етилацетат:2 М розчин МНз у МеоН-20:5:1), одержуючи сполуку, вказану у заголовку, у вигляді жовтої піни (5,33 г, 70965). Мас-спектр (ЕБ/М5): т/2 423,2 (М1).

Альтернативний спосіб синтезу трет-бутилметил(1-(4-(1-метил-1Н-піразол-5-іл)уфталазин-1- іл)упіперидин-4-іл)карбамату:

Препаративні методики 4-6

Препаративна методика 4 1,4-Дибромофталазин щ с --

У товстостінну пробірку-реактор для роботи під тиском вносять пентабромід фосфору (24,5 г, 54,1 ммоль) і 2,3-дігідро-фталазин-1,4-діон (5,00 г, 30,8 ммоль). Пробірку заварюють, і нагрівають при 1402С протягом 6-7 год, після чого залишають до ранку для охолодження. Обережно відкривають пробірку (можливий підвищений тиск або вакуум! Тверду речовину виймають зсередини і вносять у крижану воду. Розмішуючи, дають продукту розійтися у крижаній воді, і відділяють тверду речовину, що утворилася, фільтруванням у вакуумі. Висушують у вакуумній сушильній шафі, одержуючи кінцевий продукт (8,31 г, 9395). Мас-спектр (ЕБ/М5): т/2 (ВГ, 8'ВІ) 288,8 (Му). Джерело: Сап. У. Спет. 1965, 43, 2708.

Препаративна методика 5 трет-бутил-1-(4-бромофталазин-1-іл)піперидин-4-іл(метил)укарбамат о У - У-о

В-ЖКки Ох

М-М х

Готують суміш 1,4-дибромофталазину (0,70 г, 2,38 ммоль),

М-метилпіролідону (7,0 мл), карбонату калію (395 мг, 2,86 ммоль) і трет-бутилового складного ефіру метилпіперидин-4-іл-карбамінової кислоти (532 мг, 2,38 ммоль), і гріють її протягом ночі при 8020.

Реакційну суміш охолоджують і виливають у воду. Відділяють осад твердої речовини, і висушують протягом ночі у вакуумній сушильній шафі при температурі навколишнього середовища, одержуючи кінцевий продукт (0,96 г, 9595). Мас-спектр (ЕБ/М5): т/з (ВІ) 421,0 (М--1).

Препаративна методика 6 трет-бутилметилі(1-(4-(1-метил-1 Н-піразол-5-ілуфталазин-1-іл)піперидин-4-іл)укарбамат у у. - (в)

ОО

Мем ООМ-М х

Х

У товстостінну пробірку-реактор вносять трет-бутил-1-(4-бромофталазин-1-іл)піперидин-4- іл(метил)карбамат (500 мг, 1,2 ммоль), пінаколовий складний ефір 1-метил-1Н-піразол-5-боронової кислоти (370 мг, 1,8 ммоль), карбонат натрію (252 мг, 2,4 ммоль), толуол (3,75 мл), етанол (1,25 мл) і воду (1,25 мл). Суміш знекиснюють, витісняючи повітря азотом протягом 10 хв. Додають тетракіс(трифенілфосфін)паладій (137,1 мг, 118,7 мкмоль). Барботують азот крізь реакційну суміш ще 10 хв. Реактор закорковують і нагрівають протягом ночі при 902С. Потому реакційну суміш охолоджують і фільтрують крізь шар силікагелю із наступним елююванням СНесСіг, що містить 590

Меон. Фракції продукту згущують у вакуумі. Залишок, що утворився, очищують хроматографією на силікагелі (елюент - 295 2 М розчину МНз у МеоН:СНосіг), одержуючи кінцевий продукт (345,6 мг, 6995). Мас-спектр (ЕБ/М5): п/з: 423,2 (М-А1).

Препаративна методика 7 трет-бутил-1-(4-(1Н-піразол-5-ілуфталазин-1-іл)піперидин-4-іл(метил)укарбамат

У у. (в)

ОО

МеМОМ-М х

Н

Сполуку, вказану у заголовку, одержують із дотриманням препаративної методики 3, але виходячи з трет-бутил-1-(4-хлорофталазин-1-іл)піперидин-4-ілі(метил)карбамату та пінакольного складного ефіру 1Н-піразол-З-боронової кислоти. Вихід 580 мг (6795). Мас-спектр (ЕБ/М5): т/2 409,2 (М-.н1).

Препаративна методика 8 трет-бутил-1-(4-(1-метил-1 Н-піразол-5-ілуфталазин-1-іл)піперидин-4-іл-карбамат

У у. - (в) 2-

ЗМО М-М Н

Х

Сполуку, вказану у заголовку, одержують із дотриманням препаративної методики 3, але виходячи з трет-бутил-1-(4-хлорофталазин-1-іл)/піперидин-4-ілкарбамату. Вихід 5,92 г (9495). Мас- спектр (ЕБ/М5): т/7 308,8 (МУ).

Препаративна методика 9

М-метил-1-(4-(1-метил-1 Н-піразол-5-ілуфталазин-1-іл)піперидин-4-амін т-р Н

МемоОМ-КМ х

Х

Розчиняють у діхлорометані (100 мл) трет-бутилметил (1-(4-(1-метил-1Н-піразол-5-ілуфталазин- 1-іл)піперидин-4-іл)укарбамат (7,77 г, 18,39 ммоль). До розчину додають із надлишком 1 М розчин хлороводню у діетиловому ефірі (20 мл, 80 ммоль), і перемішують протягом 2 год при кімнатній температурі. Реакційну суміш згущують у вакуумі. Залишок, що утворився, очищують флеш- хроматографією на силікагелі (елюент - діхлорометан:2 М МНз у МеОНн-10:1), одержуючи сполуку, вказану у заголовку, у вигляді жовтої піни (5,83 г, 9895). Мас-спектр (ЕБ/М5): т/2 323,2 (М-1).

Проміжні сполуки, подані нижче у таблиці, одержують із дотриманням препаративної методики 9, за винятком того, що захисну групу із відповідного аміну, захищеного І-Вос, знімають за допомогою 4 М розчину НСЇІ у діоксані. 1-(4-(1Н-піразол-5-ілуфталазин- - Н 309,2 1-іл)у-М-метилпіперидин-4-амін | х чо ОА (М-ю) мем оМ-М х

Н

1-(4-(1-метил-1Н- піразол-5- -- 408.8 11 у)фталазин-1-іл)піперидин-4- | хх М чи (МУ) амін М-. ХМ й 2

М М-М

Приклад 1 4-фтор-М-метил-М-(1-(4-(1-метил-1 Н-піразол-5-ілуфталазин-1-іл)піперидин-4-іл)-2- (трифторометил)бензамід

Е Е

Е

(Ф) о-«ТІ Е 0-х

М М-М х

М

До розчину / М-метил-1-(4-(1-метил-1Н-піразол-5-іл)уфталазин-1-іл)упіперидин-4-аміну (2,8 г, 8,68 ммоль) і триєтиламіну (3,36 мл, 26,1 ммоль) у СНоСі» (30 мл) додають 4-фторо-2- (трифторометил)бензоїлхлорид (2,14 мл, 10,42 ммоль). Перемішують З години при температурі навколишнього середовища. Реакційну суміш згущують під зниженим тиском. Залишок, що утворився, очищують флеш-хроматографією на силікагелі (елюент - гексан'етилацетат:2 М МНз у меон-20:5:1), одержуючи основу цільової сполуки у вигляді жовтої піни (3,83 г, 8695). Мас-спектр (ЕБ/М5): т/2 513,0 (М--1).

Приклад Та 4-фторо-М-метил-м-(1-(4-(1-метил-1 Н-піразол-5-іл)уфталазин-1-іл)піперидин-4-іл)-2- (трифторометил)бензаміду гідрохлорид

Розчиняють у діхлорометані (100 мл) 4-фторо-М-метил-М-(1-(4-(1-метил-1Н-піразол-5- іл)уфталазин-1-іл)піперидин-4-іл)-2-(трифторометил)бензамід (7,13 г, 13,91 ммоль), і до розчину додають із надлишком їн розчин хлороводню у діетиловому ефірі (30 мл, 30 ммоль). Розчинник випаровують під зниженим тиском, одержуючи сполуку, вказану у заголовку (7,05 г, 92905). Мас- спектр (ЕБ/М5): т/2 513,0 (М.-1). Спектри ЯМР свідчать про співіснування суміші ротамерів аміду у пропорції 2:11. Для головного ротамера "Н ЯМР (400 МГц, ОМ50О-ав): 5 8,34 (т, 1Н), 8,26 (т, 2Н), 7,95 (т, 1Н), 7,75 (т, 1Н), 7,64 (т, 2Н), 7,55 (т, 1Н), 6,72 (й, 1Н, 9-2 Гу), 5,15 (Ббг, 1Н), 4,71 (т, 1Н), 4,22 (т, 2Н), 3,84 (5, ЗН), 3,48 (т, 2Н), 2,65 (5, ЗН), 2,19 (т, 2Н), 1,89 ( т, 2Н). Для другорядного ротамера "Н ЯМР (400 МГц, ОМ5О-ав): 6 8,27 (т, 1Н), 8,24 (т, 2Н), 7,94 (т, 1Н), 7,73 (т, 1Н), 7,63 (т, ЗН), 6,70 (й, 1Н, 9-2 Гц), 5,15 (Ббг, 1Н), 4,71 (т, 1Н), 4,07 (т, 2Н), 3,81 (5, ЗН), 3,16 (т, 2Н), 2,92 (5, ЗН), 1,90 (т, 2Н), 1,62 (т 2Н).

Аміди, подані нижче у таблиці, одержують із дотриманням препаративної методики, наведеної у

Прикладії та Прикладіїа, виходячи 3 відповідного піперидинілфталазину і заміщеного бензоїлхлориду.

Ме ЕЗ5І- прикладу Хімічна назва Будова мо,

Е Е

2-фторо-М-метил-М-(1-(4-(1- НСІ Е Е метил-1Н-піразол-5-іл)уфталазин- -е (о) 5ІЗ30 2 1-іл)упіперидин-4-іл)-3- - : . Шх ) ( і (МА) (трифторометил)бензаміду М. хи МО гідрохлорид у мМ х

М-метил-м-(1-(4-(1-метил-1 Н- НС ЕЕ піразол-5-іл)уфталазин-1- о дк 5110

З іл)упіперидин-4-іл)-4- 5/7 чад; (Ма) (трифторометокси)бензаміду М х гідрохлорид Х

Е Е

М-метил-М-(1-(4-(1-метил-1Н- в піразол-5-ілуфталазин- 1- НС о 14 4 іл)упіперидин-4-іл)-2- о 511,0 . - (МА) (трифлтрометокси)бензаміду Щх МО-к гідрохлорид М що х

Е Е

Б-фторо-М-метил-М-(1-(4-(1- НСІ Е метил-1Н-піразол-5-ілуфталазин- (в) 5ІЗ0 1-іл)піперидин-4-іл)-2- Х - М 4 (трифторометил)бензаміду | , МО-к (Ми)

М. гідрохлорид ц М-Мм х Е

НОСІ СІ

З,о-дихлоро-М-метил-М-(1-(4-(1- о (35С) метил-1Н-піразол-5-іл)уфталазин- Х 4950 1-іл)/піперидин-4-іл)бензаміду ці хи Мк (Ма) гідрохлорид й М-М х СІ . Неї 4-ціано-М-метил-М-(1-(4-(1-метил- -ве о Боб 7 1Н-піразол-5-ілуфталазин-1- - -м ї "нт іл; 7 У. -;-- (мМ іл)упіперидин-4-іл)бензаміду М М И-М М гідрохлорид мм х я) і

М-(1-(4-(1Н-піразол-5-у)фталазин- вач 1-іл)піперидин-4-іл)-4-фторо-М- а 1990 метил-2- Х - Е (Ма ) (трифторометил)бензаміду ц ЧУ Мк гідрохлорид Мо Мм-м х

М-(1-(4-(1-метил-1Н-піразол-5- Но у ілуфталазин-1-іл)піперидин-4-іл)- х - 7-9 497,0 4-(трифторометокси)бензаміду М. що М (МА) гідрохлорид ум й

Ме ЕЗ5І- прикладу Хімічна назва Будова М5, т/2

ЕЕ

У

М-(1-(4-(1-метил-1 Н-піразол-б- НСІ о іл)уфталазин-1-іл)піперидин-4-іл)- о 497,0 2-( трифторометокси)бензаміду Х - У У (Ми) гідрохлорид ц (ЧУ МО що М-М Н ух

Е Е

Б-фторо-М-(1-(4-(1-метил-1 Н- НСІ Е піразол-5-іл)уфталазин-1- о) 499,0 11 іл)упіперидин-4-іл)-2- Х - (Ми) (трифторометил)бензаміду цВ хх МО гідрохлорид М М-М н Е

Е Е

4-фторо-М-(1-(4-(1-метил-1 Н- НСІ Е піразол-5-іл)уфталазин-1- Го! 499,0 12 іл)упіперидин-4-іл)-2- п - Е (Ми) (трифторометил)бензаміду М. ХХ й МО гідрохлорид ії ММ Н : НСІ 4-ціано-М-(1 -(4-(1-метил-1 Н- о 438,0 13 піразол-5-ілуфталазин-1- М /- 4 Й-- (Ман) іл)упіперидин-4-іл)бензаміду М. ХХ й МО-х гідрохлорид МоМмм Н

Приклад 14 4-хлоро-М-метил-М-(1-(4-(1-метил-1 Н-піразол-5-іл)уфталазин-1-іл)піперидин-4-іл)-2- (метилсульфоніл)бензаміду гідрохлорид о, /

НС 075 ) - 0 ну

Мем о М-М х

Х

При температурі 60С готують розчин М-метил-1-(4-(1-метил-1Н-піразол-5-іл)уфталазин-1- іл)упіперидин-4-аміну (100 мг, 0,31 ммоль), 4-хлоро-2-(метилсульфоніл)бензенкарбонової кислоти (87 мг, 0,37 ммоль) і діїзопропілетиламіну (0,26 мл, 1,5 ммоль) у суміші ОМЕ:ОМ50:-4:1(2 мл).

Охолоджують розчин до 02С, і додають пентафторофенілдифенілфосфінат (250 мг, 0,65 ммоль) у суміші ОМЕ:ОМ5О -1:1 (1 мл). Перемішують протягом ночі при 602С. Охолоджують реакційну масу до температури навколишнього середовища, розводять СНоСі», промивають ропою, висушують над

Маг5О і згущують у вакуумі. Залишок, що утворився, очищують флеш-хроматографією на силікагелі (елюент - гексан:'етилацетат:2 М МНз у МеОоН-20:5:1), одержуючи цільовий продукт. До виділеного продукту додають із надлишком їн розчин хлороводню у дієтиловому ефірі (1 мл, 10 ммоль), і видаляють розчинник, одержуючи сполуку, вказану у заголовку (150 мг, 8495). Мас-спектр (ЕБ/М5): т/2 539,0 (М--1).

Прикладі 14, виходячи з відповідного піперидинілфталазину і заміщеної бензенкарбонової кислоти. приклад т/:

прикладу т/2

ІФ)

М-метил-М-(1-(4-(1-метил-1 Н- Неї о-7 піразол-5-іл)уфталазин-1- (в) 5ОБО іл)упіперидин-4-іл)-2- х - (Ма) (метилсульфоніл)бензаміду ЦІ хи О- гідрохлорид Що М-М х (9; 5-фторо-М-метил-М-(1 -(4-(1-метил- НС 0-87 1Н-піразол-5-ілуфталазин-1- (о; 4760 16 іл)упіперидин-4-іл)-2- х - (Ма) (метилсульфоніл)бензаміду Й (ЧО я гідрохлорид 7 М-М і: Е (9) Ї Е

М-метил-М-(1-(4-(1-метил-1 Н- Не ок піразол-5-іл)уфталазин-1- о 5БО 0 17 ілупіперидин-4-іл)-2- У Ми) (трифторометилсульфоніл)бензаміду ьх чо КО гідрохлорид Шк МАМ х

Неї СІ 2-хлоро-4-фторо-М-метил-М-(1-(4-(1- о (35СІ) 18 метил-1Н-піразол-5-іл)уфталазин-1- х - Е 4790 іл)піперидин-4-іл)бензаміду ЦІ ЧИ М (Маї ) гідрохлорид М МАМ

М

2-ціано-М-метил-М-(1-(4-(1-метил-1 Н- НС о 19 піразол-5-іл)уфталазин-1- -- 452,0 іл)упіперидин-4-іл)бензаміду ех КО (Ми) гідрохлорид ММ Ск х

Х

Е

4-(дифторометокси)-М-метил-М-(1- На Е (4-(1-метил-1Н-піразол-5- - НО 493,0 іл)уфталазин-1-іл)/піперидин-4- ЦД ХХ й 0-х (Ми) іл)бензаміду гідрохлорид Мом

О, /

М-(1-(4-(1-метил-1Н-піразол-5- не о78 24 іл)уфталазин-1-іл)піперидин-4-іл)-2- У 491,0 (метилсульфоніл)бензаміду ех ки ОА (Ми) гідрохлорид Мк МАМ Н

Х о, / 4-хлоро-М-(1-(4-(1-метил-1 Н-піразол- неї 075 (5СІ)

Б-іл)уфталазин-1-іл)піперидин-4-іл)-2- 9 22 й ї - СІ 525,0 (метилсульфоніл)бензаміду Шх ! ХО И-М М (Ми) гідрохлорид Мем МАМ н

Х

Е Е о.

М-(1-(4-(1-метил-1 Н-піразол-5- НС 078 23 іл)уфталазин-1-іл)піперидин-4-іл)-2- (о) 545,0 (трифторометилсульфоніл)бензаміду х - (Ми) гідрохлорид цЩ хоОИ-М ї

М М-М прикладу т/2

НС що 2-хлоро-4-фторо-М-(1-(4-(1-метил- о (35С) 24 1Н-піразол-5-ілуфталазин-1- ж /- Оу 4650 іл)упіперидин-4-іл)бензаміду ЩІ хх / М (Ма) гідрохлорид МОМ

Провідний шлях Неддейпод бере участь як фактор виживання у розвитку таких раків як базально- клітинний рак; раки верхнього відділу шлунково-кишкового тракту (стравоходу, шлунка, підшлункової залози та жовчних шляхів); рак простати; рак молочної залози; дрібноклітинний рак легенів; недрібноклітинний рак легенів; лімфома В-клітин; множинна мієлома; рак шлунка; рак яєчників; рак ободової та прямої кишки; рак печінки; меланома; злоякісні новоутворення голови і шиї, мезотеліома, саркоми м'яких тканин, саркоми кісток, лейкемія, рак яєчка, рак нирки, а також рак мозку.

З'ясовано, що елементи провідного шляху Педдепйод є потенціальними мішенями для фармацевтичних засобів лікування раку. Знайдена у медулобластомних пухлинах (АТСС, НТВ-186) клітинна лінія Юасу реагує на ліганди НІ. При обробленні цих клітин введеним екзогенно

Зпп-кондиціонованим середовищем активується провідний шлях Ні, що призводить до посиленої експресії СІ1. Циклопамін - алкалоїд, виділений з чемериці каліфорнійської Мегайгит саійогпісит, є слабким антагоністом пейдепод, і було показано, що він пригнічує експресію сії як реакцію на стимуляцію 5. Дослідження останнього часу свідчать, що циклопамін інгібує ріст культивованих клітин та аллотрансплантантів медулобластоми. Застосовуючи цю модель клітин Юасу, можна розпізнати ефективні інгібітори провідних шляхів педдепод. Оскільки сполуки за цим винаходом є антагоністами педдепод, вони є придатними для лікування вищезазначених типів пухлин.

Визначення біологічної активності ІСво: Функціональний тест із одержанням кількісної оцінки інгібування С1ІЇї1 у клітинах лінії басу

Наведені нижче загальна схема і результати проведення тесту свідчать про доцільність і ефективність використання сполук і методів, що є об'єктами цього винаходу. Функціональні проби підтверджують, що сполуки за цим винаходом виявляють здатність до інгібування провідного шляху

ЗПП. Усі ліганди, розчинники та реагенти, використовувані в описаних нижче випробуваннях, є наявними на ринку або можуть бути без утруднень виготовлені фахівцем у цій галузі.

Біологічну активність визначали, застосовуючи функціональну пробу з використанням нейронних ракових клітин Обасу та вимірювання рівнів рибонуклеїнової кислоти сії з використанням системи випробування на ОМА (розгалужену деоксирибонуклеїнову кислоту) (Рапотісв, Іпс., Егетопі, СА).

СІЇ1 був раніше відкритий у лінії клітин гліобластоми, і він кодує протеїн 7іпс їпдег, який активується провідним шляхом 5пПп. Максимальний відгук одержують шляхом індукування транскрипції СІ у клітинах Юасу за допомогою кондиціонованого середовища (мезонефросу людини, або клітин НЕК- 293, які стабільно експресують рекомбінантний ЗПЙ) протягом 24 год з подальшим визначенням кількості стимульованого транскрипту С1ї1. Мінімальним відгуком є кількість транскрипту СІ, інгібованого досліджуваною сполукою у клітинах Юаосу, які були стимульовані кондиціонованим середовищем (мезонефросу людини, або клітин НЕК-293, які стабільно експресують рекомбінантний ЗПЙ) протягом 24 год.

У системі випробування на БОМА застосовується технологія з використанням розгалуженої ДНК для забезпечення ампліфікації рибонуклеїнової кислоти-мішені (транскрипту). У цій технології використовуються три типи синтетичних гібридних Сіі1-специфічних зондів СОМА, які визначають специфічність транскрипту-мішені (розширювачів захоплення (СЕ5), розширювачів мічення (ГЕв5) та блокаторів (Ві 5), які у формі комплекса гібридизуються з транскриптами-мішенями з метою підсилення сигналу гібридизації. Додання хемілюміногенного субстрату на стадії ампліфікації дозволяє для детектування використовувати люмінесценцію.

Клітини Юасу вирощують до злиття у склянках для тканинних культур типу 1225 у середовищі для вирощування Юабсу, яке містить мінімальне базове середовище (МЕМ) плюс 1095 сироватки крові плоду корови (ЕВ5) з 0,1 нМ замінних амінокислот та 1 мМ пірувату натрію. Клітини видаляють із склянок 1225 з застосуванням трипсину та етилендіамінтетраоцтової кислоти (ЕОТА), центрифугують, знов суспендують у середовищі та підраховують.

Потім клітини Оабсу висівають у кількості 50000 клітин на лунку у ростовому середовищі у 96- лункові прозорі планшети Совіаг для культивування тканин та піддають інкубуванню протягом ночі при 372С в атмосфері 595 діоксиду вуглецю (СО»2). Промивають клітини один раз сольовим розчином з фосфатним буфером (РВ5), після чого додають 100 мкл кондиціонованого середовища 5Пйп (5Пп-

СМ) для стимулювання рівнів експресії (Ії. Розводять 5ПП-СМ для досягнення максимальної стимуляції, застосовуючи стандартне ростове середовище - 0,195 ЕВБ/ОМЕМ (модифіковане за

Дюльбекко середовище Еадіє). Потім клітини Юасу, оброблені 5ПЙ-СМ, обробляють різними концентраціями інгібіторів педдепод у діапазоні концентрацій від приблизно 1 мкМ до 0,1 нМ. Суміші з досліджуваними сполуками інкубують протягом 24 год при 372С в атмосфері 595 СО»

Визначення кількості транскрипту ії виконують, застосовуючи пробу на сїі1ї типу

Опцапіїдепе 2.0 згідно з описом виробника (Рапотісв, Іпс.). Виготовляють розведений буфер лізисної суміші (СМ), який містить протеїназу-К. Після інкубування протягом 24 год з досліджуваною сполукою клітини промивають один раз РВ5, та додають до клітин 180 мкл 0! М. Планшет з клітинами, який містить лізисний буфер, закривають та витримують при 552С протягом 30-45 хв.

Одержані лізати клітин потім розтирають 5 разів. Робочий набір зондів, який містить зонди СІ, виготовляють шляхом розведення зондів у СІМ згідно з інструкціями виробника, після чого додають у планшети для проби на БОМА 20 мкл робочого набору зондів разом з 80 мкл лізатів рабу.

Планшети закривають та інкубують при 552С протягом ночі. Потім обробляють планшети для БОМА згідно з інструкціями виробника. Сигнал кількісно вимірюють шляхом сканування планшетів на приладі РегКіп ЕІтег Епмізіоп геадег, який реєструє люмінесценцію. Величина люмінісцентного сигнала є прямо пропорційною кількості транскрипту-мішені, присутнього у пробі.

Дані про сигнал люмінесценції, одержані при функціональній пробі, застосовують для обчислення ІСзхо при випробуванні іп міїго. Ці дані обчислюють на основі максимальних контрольних значень (для клітин бабу, оброблених ЗПП-СМ) та мінімального контрольного значення (для клітин расу, оброблених ЗПП-СМ та інгібувальною концентрацією контрольної сполуки - 1 мкм М-(3-(1Н- бензо|дЧ|імідазол-2-іл)-А4А-хлорфеніл)3,5-диметоксибензаміду). Для отримання значень /-ІСво застосовують чотирьохпараметрову логістичну криву з використанням програм АсіїміуВазе, версія 5.3, рівняння 205 (див. Абз5ау Сицідапсе Мапиа! Мегзіоп 5.0 (Практичний посібник з виконання біотестів, редакція5.0), 2008, Еїї Шу апа Сотрапу апа МІН Спетіса! СсСепотіс5 Сепіег (компанія "Еїї

ІШу « Со" у співпраці з Центром біохімічної генетики Національного інституту охорони здоров'я

США)).

При випробуванні за вищезазначеною методикою сполуки, взяті за приклади, виявили ІСвзо «40 НМ. Наприклад, сполука за Прикладом Та у випробуванні, описаному вище, показала ІСво приблизно 2,4 нМ зі стандартним відхиленням 0,50 (п-7, обчислено як середнє геометричне і геометричне стандартне відхилення). Ці результати свідчать, що сполуки за цим винаходом є антагоністами педдепооа і, отже, є корисними як протиракові засоби.

Тест на здатність до інгібування СУРЗА4

Проби для інкубування виготовляють шляхом додавання препарату мікросом людської печінки до досліджуваного інгібітора (кінцеві концентрації 0,05 мг/мл протеїну, 10 мкМ інгібітор у 100 мМ буфері МаРох, рН 7,4) та змішування. Проби попередньо інкубують протягом приблизно 5 хв при 372С. Після попереднього інкубування ініціюють реакцію шляхом додання розчину, який містить

МАОРН та мідазолам як субстрат ферменту (кінцева концентрація 1 мМ МАОРН, 5 мкМ мідазолам).

Після додання розчину МАОРН проби інкубують протягом З хв при температурі приблизно 3720.

Після інкубування реакцію припиняють шляхом додання 50 мкл метанолу (та внутрішнього стандарту для хроматографії), і ретельно перемішують проби. Після припинення реакції суміші центрифугують приблизно при 4000 об/хв протягом 15 хв при температурі приблизно 52С, і аналізують методом рідинної хроматографії з мас-спектрометрією (І.С/М5).

Проби аналізують методом НРІС/М5 з градієнтним елююванням на звичайних коротких колонках С18 (рухома фаза при завантаженні 95/5 МІіЇ-О? НгО/метанол (за об'ємом) з 195 оцтової кислоти. Рухома фаза В 80/20 МІіЇ-О? НгО/метанол (за об'ємом) з 195 оцтової кислоти. Рухома фаза

С 5/95 МІШ-О? НгО/метанол (за об'ємом) з 195 оцтової кислоти. Рухома фаза для ополіскування 75/25 МІП-О? НгО/ацетонітрил (за об'ємом).

Проби вводять у мас-спектральний аналізатор для селективного моніторінгу іонів (5ІМ) із масою 342,1 (1-ОН-мідазолам) та 346,1 (о-гідроксимідазолам-й4, внутрішній стандарт), застосовуючи систему Тигроїоп Зргау у позитивних умовах. Дані подано у формі відсотка (95) інгібування утворення 1-ОН-мідазоламу у присутності інгібітора в концентрації 10 мкМ.

Проведення тесту сполуки з Прикладу їа за описаною схемою виявляє 13,595 інгібування

СУРЗА4. Сполуки на зразок описаної у Прикладі 1а, які виказують незначну здатність до оборотного інгібування СУРЗА4, навряд чи спроможні негативно взаємодіяти з іншими препаратами (що потребувало б внесення змін у кількість або спосіб дозування, або взагалі припинення курсу лікування пацієнта). Отже, ці сполуки належать до таких, яким слід надавати перевагу, і характеризуються більш сприятливими профілями безпечності.

Тест на необоротне інгібування СУРЗА іп міго

Сполуку з Прикладу 1 досліджували в ролі необоротного інгібітора СУРЗА, маючи на меті одержання кінетичних констант Кіласє та Кі для реакції необоротного інгібування (Кіпах означає максимальну константу швидкості утворення неактивного комплексу з ферментом; К, означає концентрацію, що відповідає напівінактивації). Згадану сполуку піддають інкубації разом із мікросомами печінки людини (для цього беруть популяцію мікросом печінки людини із виразною експресією СУРЗА4), яка складається з двох стадій інкубації іп міго: власне реакції інактивації, що полягає у взаємодії інгібітора з ферментом, і тесту на активність, який дає змогу одержати кількісну оцінку залишкової активності мікросомного білку за допомогою реакції 1'-гідроксилювання мідазоламу як аналітичного тесту.

Реакцію інактивації (з кінцевим об'ємом проби 100 мкл) проводили тричі. Для цього піддавали попередній інкубації при 37"С впродовж З хв три проби, які містили 100 мМ натрій-фосфатного буферу (рН 7,4), 1 мМ розчину етилендиамінтетраоцтової кислоти (ЕОТА) у присутності або за відсутності 1 мМ розчину МАОРН (нікотинамід-динуклеотидфосфату у відновленій формі), а також досліджувану сполуку у концентрації, яку варіювали в діапазоні від 0,75 мкМ до 24 мкМ. Реакцію інактивації ініціювали, додаючи популяцію мікросом із високою активністю до СУРЗА (постачальник - СеїіП2Оігесі, А!йвіїп ТХ, 0,5 мг/мл). У різні моменти часу (0, 2,5, 5, 10 та 30 хв), забирали на аналіз аліквоти реакційної суміші, в якій відбувалася інактивація, по 5 мкл кожна, і розводили у пропорції 1:20 у заздалегідь підігрітой до 372С інкубаційній системі (95 мкМ) проби на активність СУРЗА4, яка містила 1 мМ розчин МАОРН та мідазолам (100 мкМ). Цю суміш проби для визначення активності (з кінцевою концентрацією білку 0,025 мг/мл і розведенням інгібітора в пропорції 1:20), піддавали інкубації при 37"С впродовж іще однієї хвилини, перш ніж зупинити реакцію додаванням 50 мкл

Меон. Проби поєднували, і білок, що зазнав денатурації, осаджували центрифугуванням при 4000 об/хв впродовж 10 хв.

Кількісний аналіз 1-ОН-мідазоламу, що утворився, здійснювали методом рідинної хроматографії з тандемною мас-спектрометрією (РХ/МС/МС) з градієнтним елююванням, використовуючи для цього колонку з оберненою фазою Рпепотепех Зупегді Нудаго-ЕР діаметром 4 мкм (плинна фаза А - 95/5 (06.) суміш МІШ-СУ НгО/метанол із доданням 5 мМ ацетату амонію; плинна фаза В - 5/95 (об.) суміш МІіЇП-09 Но2О/метанол із доданням 5 мМ ацетату амонію; розчин для промивання голки дозатора А - 0,495 трифторооцтової кислоти у суміші 90/10 (об.) ацетонітрил/мій-Се НО; розчин для промивання голки дозатора В - 50/50 (06.) суміш МІіПЙ-СУ НгО/метанол). Пробу вводили у пристрій для спостереження за перебігом обраної реакції 5сіех АРІ 4000 при значенні аналітичної маси іона 342,0 (1-ОН-мідазолам) та 347,0 (о-гідроксимідазолам-й3 (внутрішній еталон); із застосуванням системи ТигроЇоп Зргау у позитивних умовах.

Міру зменшення утворення 1-ОН-мідазоламу (активності СУРЗАЯ4) при інкубації в присутності мікросом відкладають у одиницях логарифму відсотка залишкової активності СУРЗА4 залежно від тривалості попередньої інкубації (для кожної концентрації досліджуваної сполуки). Кінетичні параметри реакції інактивації визначають за допомогою програмного пакету М/пМопіїп Рготеззіопаї, апроксимуючи дані за наведеним нижче параметричним рівнянням:

Рівняння 1: Відсоток інгібування (5--10О(п-охе2. де ух, визначають таким чином:

Рівняння 2: Х-(Кіласс ІК).

Втрата активності сполуки з Прикладу 1а обіймає діапазон від 1195 до 2295 і не залежить від концентрації. Таким чином, оцінити величини Клас та Кі з рівняння 2 фізично неможливо. На підставі цих даних можемо зробити висновок, що сполука з Прикладу Та не є інгібітором, який діє необоротно, на СУРЗА4. Сполуки, такі як описані у Прикладі 1а, які майже або зовсім не виявляють здатності до необоротного інгібування СУРЗА4, навряд чи спроможні негативно взаємодіяти з іншими препаратами (що потребувало б внесення змін у кількість або спосіб дозування, або взагалі припинення курсу лікування пацієнта). Отже, ці сполуки належать до таких, яким слід надавати перевагу, і характеризуються більш сприятливими профілями безпечності.

Claims

1. Сполука, яка описується формулою ж де: В! - водень або метил; ВЕ" - водень або метил; та В В, В, КО або К/ незалежно один від одного являють собою водень, фтор, хлор, ціаногрупу, трифторометил, трифторометоксигрупу, дифторометоксигрупу, метилсульфоніл або трифторометилсульфоніл, за умови, що щонайменше три з В", В", В", ВО та В являють собою водень; або фармацевтично прийнятна сіль цієї сполуки.

2. Сполука за п. 1, яка відрізняється тим, що В - метил, або її фармацевтично прийнятна сіль.

3. Сполука за п. 1 або п. 2, яка відрізняється тим, що К" - метил, або її фармацевтично прийнятна сіль.

4. Сполука за будь-яким із пп. 1-3, яка відрізняється тим, що В, В, В, В та В" незалежно один від одного являють собою водень, фтор, хлор, трифторометил або метилсульфоніл, або її фармацевтично прийнятна сіль.

5. Сполука за будь-яким із пп. 1-4, яка відрізняється тим, що В, В, В, В та В" незалежно один від одного являють собою водень, фтор або трифторометил, або її фармацевтично прийнятна сіль.

6. Сполука за будь-яким із пп. 1-5, яка відрізняється тим, що К", КЕ" та В" є атомами водню, або її фармацевтично прийнятна сіль.

7. Сполука за будь-яким із пп. 1-6, яка являє собою 4-фторо-М-метил-М-(1-(4-(1-метил-1Н- піразол-5-1л)фталазин- 1-іл)піперидин-4-1л)-2-(трифторометил)бензамід, або її фармацевтично прийнятна сіль.

8. Сполука за будь-яким із пп. 1-7, яка являє собою гідрохлорид 4-фтор-М-метил-М-(1-(4-(1- метил-1Н-піразол-5-іл)фталазин- 1-1л)піперидин-4-і1л)-2-(трифторометил)бензаміду.

9. Фармацевтична композиція, яка містить сполуку за будь-яким із пп. 1-8 або її фармацевтично прийнятну сіль разом із фармацевтично прийнятним носієм, розріджувачем або наповнювачем.

10. Сполука за будь-яким із пп. 1-8 або її фармацевтично прийнятна сіль для застосування у терапії.

11. Сполука за будь-яким із пп. 1-8 або її фармацевтично прийнятна сіль для застосування у лікуванні раку.