PT2437742E - Novas composições para tratamento de cmt e enfermidades relacionadas - Google Patents

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cas
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Ilya Chumakov
Daniel Cohen
Serguei Nabirochkin
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Pharnext
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Description

ΡΕ2437742 1
DESCRIÇÃO
"NOVAS COMPOSIÇOES PARA TRATAMENTO DE CMT E ENFERMIDADES RELACIONADAS" A presente invenção relaciona-se com composições e sua utilização para o tratamento da doença de Charcot-Marie-Tooth e enfermidades relacionadas. A doença de Charcot-Marie-Tooth ("CMT") é uma polineuropatia periférica genética órfã. Afetando aproxi-madamente 1 em 2500 indivíduos, esta doença é a doença hereditária mais comum do sistema nervoso periférico. Seu início tipicamente ocorre durante a primeira ou segunda década de vida, embora possa ser detectada na infância. O curso da doença é crónico com gradual degeneração neuromuscular. A doença é incapacitadoracom casos acompanhados de dor neurológica e incapacidade muscular extrema. CMT é uma das melhores estudadas patologias genéticas com aproximadamente 30000 casos na França. Enquanto uma maioria dos pacientes com CMT abriga uma duplicação de um fragmento do cromossomo 17 contendo um gene de mielina: PMP22 (forma CMT1A), duas dúzias de genes têm sido implicadas em diferentes formas de CMT. Consequentemente, embora monogênica na origem, esta patologia manifesta heterogeneidade clínica devido a possíveis genes moduladores. Os genes mutados em pacientes 2 ΡΕ2437742 com CMT estão agrupados em torno de vias moleculares fortemente conectadas afetando a diferenciação das células de Schwann ou neurónios ou mudando a interação destas células nos nervos periféricos.
Minerando dados públicos disponíveis, descrevendo mecanismos moleculares e manifestações patológicas da doença CMTlA, nos permitiu priorizar uns poucos módulos celulares funcionais - regulação da transcrição do gene PMP22, dobramento/degradação da proteína PMP22, célula de Schwann proliferação e apoptose, morte dos neurónios, deposição e remodelação da matriz extracelular, resposta imune - como potenciais alvos legítimos para intervenções terapêuticas relevantes de CMT. 0 impacto combinado desses módulos funcionais desregulados no início e na progressão das manifestações patológicas de Charcot-Marie-Tooth justifica uma eficácia potencial do tratamento combinatório de CMT. 0 pedido de patente internacional n° W02009/ 068659 descreve um método de identificação de fármacos candidatos para tratamento da doença de Charcot-Marie-Tooth pela construção de um modelo dinâmico da patologia e das vias celulares funcionais alvo que são relevantes na regulação da doença de CMT. O pedido de patente internacional n° W02009/ 068658 descreve composições do tratamento da doença de Charcot-Marie-Tooth que compreende pelo menos dois 3 ΡΕ2437742 compostos selecionados do grupo de múltiplos fármacos candidatos.
Sumário da invenção 0 objetivo da presente invenção é fornecer novas combinações terapêuticas para o tratamento da CMT e enfermidades relacionadas. A invenção, portanto, relaciona-se a composições e métodos para o tratamento da CMT e enfermidades relacionadas, em particular neuropatia tóxica e esclerose lateral amiotrófica, usando combinações de fármacos em particular. 0 objeto da invenção relaciona-se com uma composição como definida nas reivindicações. Mais particularmente, a invenção relaciona-se com uma composição compreendendo Baclofeno, D-Sorbitol e Naltrexona, para administração simultânea, separada ou sequencial a um indivíduo mamífero.
Esta invenção também revela uma composição compreendendo Baclofeno, Sorbitol e um composto selecionado de Pilocarpina, Metimazol, Mifepristone, Naltrexona,
Rapamicina, Flurbiprofeno e Cetoprofeno, seus sais ou pró-drogas, para administração simultânea, separada ou sequencial a um indivíduo mamífero. A invenção também revela uma composição compreendendo (a) rapamicina, (b) mifepristone ou naltrexona, e 4 ΡΕ2437742 (c) um modulador PMP22 para administração simultânea, separada ou sequencial a um indivíduo mamífero.
Por exemplo, o modulador PMP22 é selecionado de Acetazolamida, Albuterol, Amilorida, Aminoglutetimida, Amiodarona, Aztreonam, Baclofeno, Balsalazide, Betaína, Betanecol, Bicalutamida, Bromocriptina, Bumetanida, Buspi-rona, Carbacol, Carbamazepina, Carbimazole, Cevimelina, Ciprofloxacina, Clonidina, Curcumina, Ciclosporina A, Diazepam, Diclofenaco, Dinoprostona, Dissulfiram, D-Sorbitol, Dutasteride, Estradiol, Exemestano, Felbamato, Fenofibrato, Finasterida, Flumazenil, Flunitrazepam, Flur-biprofeno, Furosemida, Gabapentina, Galantamina, Halo-peridol, Ibuprofeno, Isoproterenol, Cetoconazol, Cetopro-feno, L-carnitina, Liotironina (T3), Lítio, Losartan, Loxapina, Meloxicam, Metaproterenol, Metaraminol, Metformi-na, Metacolina, Metimazol, Metilergonovina, Metoprolol, Metirapona, Miconazol, Mifepristone, Nadolol, Naloxona, Naltrexona, Norfloxacina, Pentazocina, Fenoxibenzamina, Fenilbutirato Pilocarpina, Pioglitazona, Prazosina, Propil-tiouracil, Raloxifeno, Rapamicina, Rifampicina, Sinvasta-tina, Espironolactona, Tacrolimus, Tamoxifeno, Trealose Trilostano, ácido Valpróico, seus sais ou pró-drogas.
Esta invenção também revela uma composição compreendendo Rapamicina e mifepristone para administração simultânea, separada ou sequencial a um indivíduo mamífero.
Um objeto ainda da presente invenção é uma 5 ΡΕ2437742 composição como revelada acima ainda compreendendo um ou vários excipientes farmaceuticamente aceitáveis ou veiculoes (isto é, uma composição farmacêutica).
Um outro objeto da presente invenção relaciona-se a uma composição como revelada acima para o tratamento da CMT ou uma enfermidade relacionada.
Um objeto ainda da presente invenção relaciona-se ao uso de uma combinação de compostos como revelada acima para fabricação de um medicamento para o tratamento de CMT ou uma enfermidade relacionada.
Esta invenção também revela um método para tratar CMT ou uma enfermidade relacionada, o método compreendendo a administração em um sujeito necessitado uma quantidade efetiva de uma composição como definida acima.
Um objeto ainda da presente invenção é um método de preparação de uma composição farmacêutica, o método compreendendo misturar os compostos acima em um excipiente ou veiculo apropriado.
Esta invenção também revela um método de tratamento de CMTla em um sujeito, o método compreendendo a administração em um sujeito necessitado uma quantidade efetiva de um composto ou combinação de compostos como revelada acima. 6 ΡΕ2437742
Esta invenção também revela um método de tratamento de neuropatia tóxica em um sujeito, método compreendendo a administração em um sujeito necessitado uma quantidade efetiva de um composto ou combinação de compostos como revelada acima.
Esta invenção também revela um método de tratamento de ALS em um sujeito, método compreendendo a administração em um sujeito necessitado uma quantidade efetiva de um composto ou combinação de compostos como revelada acima.
Qualquer um dos diversos usos ou métodos de tratamento revelados no presente documento também pode incluir uma etapa opcional de diagnóstico de um paciente como tendo CMT ou uma enfermidade relacionada, particularmente CMTlA, ou identificação de um indivíduo como em risco de desenvolver CMT ou uma enfermidade relacionada, particularmente CMTlA. A este respeito, esta invenção também revela um método de tratamento de CMT, particularmente CMTla, o método compreendendo (1) avaliar se um sujeito tem CMT, particularmente CMTla e (2) tratar o sujeito tendo CMT, particularmente CMTla com uma quantidade efetiva de uma combinação de compostos como descrito acima. Determinando se um sujeito tem CMT, particularmente CMTla, pode ser feito por vários testes conhecidos por si na matéria, tais como ensaios de DNA. 7 ΡΕ2437742 A invenção pode ser usada para o tratamento da CMT ou uma enfermidade relacionada em qualquer objeto de mamífero, particularmente objetos de humanos, mais preferivelmente CMTla.
Legenda para como Figuras
Figura 1. Efeito sinérgico da combinação de drogas, dose 1: efeito de A) Mix7 (dose 1, dia 10), B) D-Sorbitol (SRB, 500μΜ, dia 10), C) (R/S)-Baclofeno (BCL, 5μΜ, dia 10) e D) Naltrexona (NTX, 5μΜ, dia 10) na expressão de MBP. *: p<0,05: significativamente diferente do controle (=ácido ascórbico) (ANOVA com 1 fator seguido por teste post hoc de Fisher) ; ns: não estatisticamente diferente
Figura 2. Efeito sinérgico da combinação de drogas, dose 6 A) Mix7 (dose 6, dia 10), B) SRB (160 nM, dia 10), C) BCL (1.6 nM, dia 10) e D) NTX (1.6 nM, dia 10) na expressão MBP. *:p<0,05: significativamente diferente do controle (=ácido ascórbico) (ANOVA com 1 fator seguido por teste post-hoc de Fisher); ns: não estatisticamente diferente
Figura 3. Efeito positivo de Mix7 (7 doses) A) no dia 10 e B) no dia 11 em co- incubação com ácido ascórbico em PMP22 TG co-culturas na expressão MBP em percentagem do controle (= ácido ascórbico). ANOVA com 1 fator seguido por teste post-hoc de Fisher. 8 ΡΕ2437742
Figura 4. Efeito positivo em ratos machos do tratamento de 3 e 6 semanas com Mixl medidos usando testes de barra. Latências foram medidas como a média de dois primeiros ensaios dos testes (barras brancas representam o controle ratos tratados com placebo; barras pretas representam ratos transgénicos tratados com placebo; barras cinza representam ratos transgénicos tratados com Mixl. ** p<0,01. Estatísticas são realizadas com o teste de Student bilateral).
Figura 5. Efeito positivo no marcha dos ratos machos das 3 e 6 semanas (respectivamente gráfico da esquerda e direita, tratamento com composição Mixl (barras brancas representam marcha fluido; barras cinza representam marcha não fluido; barras pretas representam ratos com uma incapacidade severa para marcha. Estatísticas são realizadas com o teste de Student bilateral).
Figura 6. Efeito positivo em ratos machos da composição Mixl em ratos usando teste plano inclinado (25°) . Os ratos foram examinados após 3, 6, 9 e 12 semanas de tratamento (barras brancas representam o controle dos ratos tratados com placebo; barras pretas representam ratos transgénicos tratados com placebo; barras cinza representam ratos transgénicos tratados com Mixl. *p<0,05. As estatísticas são realizadas com o teste de Student bilateral). 9 ΡΕ2437742
Figura 7. Efeito positivo nos ratos fêmeas das 3 semanas de tratamento com a composição Mix2 em ratos, usando teste plano inclinado (barras brancas representam o controle ratos tratados com placebo; barras pretas representam ratos transgénicos tratados com placebo; barras cinza representam ratos transgénicos tratados com Mix2. ** p<0,01. Estatísticas são realizadas com o teste de Student bilateral).
Figura 8. Efeito protetor em ratos machos de Mixl na neuropatia induzida por oxaliplatina (barras brancas representam ratos tipo selvagem tratados com placebo; barras pretas representam ratos tipo selvagem tratados com produto de referência gabapentina; barras cinza representam ratos tipo selvagem tratados tratado com Mixl. * p<0,05; ** p<0,01. Estatísticas são realizadas com o teste de Student bilateral).
Figura 9. Redução significativa da expressão de RN A pmp22 em animais transgénicos tratados comparados a ratos transgénicos PMP22, observados após 9 semanas de tratamento com o Mix7-dose 3 (MPZ como gene de referência, Sereda et al, 1996) (p=0,0015). A integração do transgene e a superexpressão do gene pmp22 têm sido também confirmada; RNA pmp22 em ratos transgénicos PMP22 foi 1,8 vezes superexpresso comparado a seus tipos selvagem companheiros de ninhada controles (ρ<1,10-4). A extração de RNA pmp22 foi realizada nos nervos ciáticos de ratos machos de 16 semanas (n=18 para o Tipo Selvagem, n=20 para os ratos 10 ΡΕ2437742 transgénicos e n=18 para TG tratado com Mix7-dose 3) . Análise estatística foi realizada usando o teste t de Welch.
Figura 10. Uma análise de cluster foi realizada no teste plano inclinado a 35° (para distribuir pelas classes de performances pobre, intermediária e boa em todos os pontos da avaliação (3, 6 e 9 semanas de tratamento analisados juntos) . Uma diferença significativa foi observada entre WT e placebo TG: 68% do WT pertenciam ao grupo de boa performance e somente 5% do placebo TG pertencia a este grupo (p=0,0003) . Mix7-dose 2 e dose 3 melhoraram como performances dos ratos TG. Análises estatísticas foram realizadas aplicando um teste de tendência de nível de significância de 5% (n=18 para placebo de ratos WT, n=20 para placebo de ratos TG, n=17 para TG tratado com Mix7-dose 2, n=18 para TG tratado com
Mix7-dose 3).
Figura 11. A queda de latências dos ratos TG no teste de barra após 9 semanas de tratamento com Mix7-dose 3 foram analisados usando um modelo de Cox com um estimador de variância sanduíche, e comparados ao placebo TG referência aplicando um teste log rank de nível de significância de 5% . Mix7-dose 3 significativamente aumenta queda de latência dos ratos TG após 9 semanas de tratamento.
Figura 12. A força de aperto dos grupos do tipo 11 ΡΕ2437742 selvagem, transgénicos placebo e animais transgénicos tratados com Mix7-dose 3 diariamente por 9 semanas foi modelada usando um modelo de Cox com um estimador de variância sanduíche durante todas como vezes depois do tratamento (3, 6 e 9 semanas) e comparados ao placebo TG referência aplicando um teste log rank -teste de nível de significância de 5% . Os valores p correspondentes foram apresentados nas curvas de Kaplan-Meier. A redução significativa da força de aperto das patas dianteira dos ratos transgénicos placebo foi observada (linha preta lisa, n=21) comparados a ratos WT (linha cinza lisa, p=l,45.10-5, n=19) . 0 tratamento com Mix7-dose 3 significativamente aumentou a força das patas dianteira (linha preta tracejada; p=0,03, n=18).
Figura 13. Um teste de correlação de Pearson mostrou uma correlação significativa entre o tempo de queda de latência no teste de barra (após 9 semanas de tratamento) e o nível de expressão do RNA pmp22: p=l,6.10~4 (WT, placebo TG e TG tratado com o Mix7-dose 3 analisados juntos); p=0,07 (placebo TG e TG tratado com o Mix7-dose 3 analisados juntos).
Quanto menor era a expressão do RNA pmp22, melhor eram como performances nos testes de barra. Os ratos machos eram de 16 semanas (n=18 para ratos WT, círculos brancos; n=20 para o placebo TG, círculos pretos e n=18 para TG tratado com o Mix7-dose3, triângulos brancos). 12 ΡΕ2437742
Figura 14. Um teste de correlação de Pearson mostrou uma correlação significativa entre o tempo de queda de latência no teste de barra (após 9 semanas de tratamento) e a velocidade de condução do nervo sensitivo (NCV) : p=l,34.1CT6 (WT, placebo TG e TG tratado com Mix7-dose3 analisados juntos) e p=0,04 (placebo TG e TG tratado com Mix7-dose3 analisados juntos). Quanto maior era a velocidade de condução, melhor eram como performances nos testes de barra. Os ratos machos eram de 16 semanas (n=18 para ratos WT, círculos brancos; n=20 para o placebo TG, círculos pretos e n=18 para TG tratado com o Mix7-dose3, triângulos brancos).
Descrição detalhada da invenção A presente invenção fornece novas abordagens terapêuticas para o tratamento da CMT ou enfermidades relacionadas. A invenção revela novas combinações de drogas que permite uma efetiva correção de tais doenças e podem ser usadas em qualquer objeto de mamífero.
Dentro do contexto desta invenção, CMT inclui CMTlA, CMT1B, CMT1C, CMTlD, CMTlX, CMT2A, CMT2B, CMT2D, CMT2E, CMT2-P0, CMT4A, CMT4B1, CMT4B2, CMT4D, CMT4F, CMT 4, ou AR-CMT2A, mais preferivelmente CMTla.
Dentro do contexto da presente invenção, o termo "enfermidade relacionada à CMT" designa outras doenças associadas com expressão anormal do PMP22 levando a anormal 13 ΡΕ2437742 mielinização e perda de neurónios. 0 termo "enfermidade relacionada à CMT" mais particularmente inclui doença de Alzheimer (AD), demência senil do tipo AD (SDAT), doença de Parkinson, demência de corpos de Lewis, demência vascular, autismo, comprometimento cognitivo leve (MCI), perda de memória associada à idade (AAMI) e problema associado com o envelhecimento, parkinsonismo pós-encefalítico, esquizofrenia, depressão, doença bipolar e outros transtornos de humor, doença de Huntington, doença do neurónio motor incluindo esclerose lateral amiotrófica (ALS), esclerose múltipla, neuropatias idiopáticas, neuropatia diabética, neuropatia tóxica incluindo neuropatia induzida por tratamentos com drogas, neuropatias provocadas por HIV, radiação, metais pesados e estados de deficiência de vitamina, neurodegeneração com base em príon, incluindo doença de Creutzfeld-Jakob (CJD), encefalopatia espongi-forme bovina (BSE), GSS, FFI, sindrome de Kura e Alper.
Em uma modalidade preferida, "enfermidade relacionada à CMT" designa a neuropatia tóxica, particularmente neuropatias induzidas por drogas, ou ALS.
Como usado no presente documento, "tratamento" de uma enfermidade inclui a terapia, a prevenção, a profilaxia, o retardamento ou a redução da dor provocada pela enfermidade. 0 termo tratamento inclui em particular o controle da progressão da doença e sintomas associados.
Além disso, o termo "composto" designa os 14 ΡΕ2437742 compostos químicos como especificamente denominado no pedido, assim como qualquer composição farmacêutica com aceitável sal, hidrato, éster, éter, isómeros, racematos, conjuqados, suas pró-droqas aceitáveis. Os compostos listados neste pedido também podem ser identificados com seu número CAS correspondente.
Portanto, os compostos preferidos usados na invenção são Baclofeno (CAS 1134-47-0) e seus possíveis sais, enantiómeros, racematos, pró-drogas e derivados; Sorbitol (CAS 50-70-4) e seus possíveis sais, enantiómeros, racematos, pró-drogas e derivados; Naltrexona (CAS 16590-41-3) e seus possíveis sais, enantiómeros, racematos, pró-drogas e derivados; Mifepristone (CAS 84371-65-3) e seus possíveis sais, enantiómeros, racematos, pró-drogas e derivados; Pilocarpina (CAS 54-71-7) e seus possíveis sais, enantiómeros, racematos, pró-drogas e derivados; Metimazol (CAS 60-56-0) e seus possíveis sais, enantiómeros, racematos, pró-drogas e derivados; Cetoprofeno (CAS 22071-15-4) e seus possíveis sais, enantiómeros, racematos, pró-drogas e derivados; Flurbiprofeno (5104-49-4) e seus possíveis sais, enantiómeros, racematos, pró-drogas e derivados e Rapamicina (CAS 53123-88-9) e seus possíveis sais, enantiómeros, racematos, pró-drogas e derivados. Compostos adicionais revelados na invenção são Acetazolamida (CAS 59-66-5) e seus possíveis sais, enantiómeros, pró-drogas e derivados; Albuterol (CAS 18559-94-9) e seus possíveis sais, enantiómeros, pró-drogas e derivados; Amilorida (CAS 2016-88-8) e seus possíveis sais, 15 ΡΕ2437742
enantiómeros, pró-drogas e derivados; Aminoglutetimida (CAS 125-84-8) e seus possíveis sais, enantiómeros, pró-drogas e derivados; Amiodarona (CAS 1951-25-3) e seus possíveis sais, enantiómeros, pró-drogas e derivados; Aztreonam (CAS 78110-38-0) e seus possíveis sais, enantiómeros, pró-drogas e derivados; Baclofeno (CAS 1134-47-0) e seus possíveis sais, enantiómeros, pró-drogas e derivados; Balsalazide (CAS 80573-04-2) e seus possíveis sais, enantiómeros, pró-drogas e derivados; Betaína (CAS 107-43-7) e seus possíveis sais, enantiómeros, pró-drogas e derivados; Betanecol (CAS 674-38-4) e seus possíveis sais, enantiómeros, pró-drogas e derivados; Bicalutamida (CAS 90357-06-5) e seus possíveis sais, enantiómeros, pró-drogas e derivados; Bromocriptina (CAS 25614-03-3) e seus possíveis sais, enantiómeros, pró-drogas e derivados; Bumetanida (CAS 28395-03-1) e seus possíveis sais, enantiómeros, pró-drogas e derivados; Buspirona (CAS 36505- 84-7) e seus possíveis sais, enantiómeros, pró-drogas e derivados; Carbacol (CAS 51- 83-2) e seus possíveis sais, enantiómeros, pró-drogas e derivados; Carbamazepina (CAS 298-46-4) e seus possíveis sais, enantiómeros, pró-drogas e derivados; Carbimazole (CAS 22232-54-8) e seus possíveis sais, enantiómeros, pró-drogas e derivados; Cevimelina (CAS 107233-08-9) e seus possíveis sais, enantiómeros, pró-drogas e derivados; Ciprofloxacina (CAS 85721-33-1) e seus possíveis sais, enantiómeros, pró-drogas e derivados; Clonidina (CAS 4205-90-7) e seus possíveis sais, enantiómeros, pró-drogas e derivados; Curcumina (CAS 458-37-7) e seus possíveis sais, enantiómeros, pró-drogas e derivados; Ciclosporina A (CAS 16 ΡΕ2437742 59865-13-3) e seus possíveis sais, enantiómeros, pró-drogas e derivados; Diazepam (CAS 439-14-5) e seus possíveis sais, enantiómeros, pró-drogas e derivados; Diclofenaco (CAS 15307-86-5) e seus possíveis sais, enantiómeros, pró-drogas e derivados; Dinoprostona (CAS 363-24-6) e seus possíveis sais, enantiómeros, pró-drogas e derivados; Disulfiram (CAS 97- 77-8) e seus possíveis sais, enantiómeros, pró-drogas e derivados; D-Sorbitol (CAS 50- 70-4) e seus possíveis sais, enantiómeros, pró-drogas e derivados; Dutasteride (CAS 164656-23-9) e seus possíveis sais, enantiómeros, pró-drogas e derivados; Estradiol (CAS 50-28-2) e seus possíveis sais, enantiómeros, pró-drogas e derivados; Exemestano (CAS 107868-30-4) e seus possíveis sais, enantiómeros, pró-drogas e derivados; Felbamato (CAS 25451-15-4) e seus possíveis sais, enantiómeros, pró-drogas e derivados; Fenofibrato (CAS 49562-28-9) e seus possíveis sais, enantiómeros, pró-drogas e derivados; Finasterida (CAS 98319-26-7) e seus possíveis sais, enantiómeros, pró-drogas e derivados; Flumazenil (CAS 78755-81-4) e seus possíveis sais, enantiómeros, pró-drogas e derivados; Flunitrazepam (CAS 1622-62-4) e seus possíveis sais, enantiómeros, pró-drogas e derivados; Flurbiprofeno (CAS 5104-49-4) e seus possíveis sais, enantiómeros, pró-drogas e derivados; Furosemida (CAS 54-31- 9) e seus possíveis sais, enantiómeros, pró-drogas e derivados; Gabapentina (CAS 60142-96-3) e seus possíveis sais, enantiómeros, pró-drogas e derivados; Galantamina (CAS 357-70-0) e seus possíveis sais, enantiómeros, pró-drogas e derivados; Haloperidol (CAS 52-86-8) e seus possíveis sais, 17 ΡΕ2437742
enantiómeros, pró-drogas e derivados; Ibuprofeno (CAS 15687-27-1) e seus possíveis sais, enantiómeros, pró-drogas e derivados; Isoproterenol (CAS 7683-59-2) e seus possíveis sais, enantiómeros, pró-drogas e derivados; Cetoconazol (CAS 65277-42-1) e seus possíveis sais, enantiómeros, pró-drogas e derivados; Cetoprofeno (CAS 22071-15-4) e seus possíveis sais, enantiómeros, pró-drogas e derivados; L-carnitine (CAS 541-15-1) e seus possíveis sais, enantiómeros, pró-drogas e derivados; Liotironina (T3) (CAS 6893-02-3) e seus possíveis sais, enantiómeros, pró-drogas e derivados; Lítio (CAS 7439-93- 2) e seus possíveis sais, enantiómeros, pró-drogas e derivados; Losartan (CAS 114798-26-4) e seus possíveis sais, enantiómeros, pró-drogas e derivados; Loxapina (CAS 1977-10-2) e seus possíveis sais, enantiómeros, pró-drogas e derivados; Meloxicam (CAS 71125-38-7) e seus possíveis sais, enantiómeros, pró-drogas e derivados; Metaproterenol (CAS 586-06-1) e seus possíveis sais, enantiómeros, pró-drogas e derivados; Metaraminol (CAS 54-49-9) e seus possíveis sais, enantiómeros, pró-drogas e derivados; Metformina (CAS 657-24-9) e seus possíveis sais, enantiómeros, pró-drogas e derivados; Metacolina (CAS 55-92-5) e seus possíveis sais, enantiómeros, pró-drogas e derivados; Metimazol (CAS 60-56-0) e seus possíveis sais, enantiómeros, pró-drogas e derivados; Metilergonovina (CAS 113-42-8) e seus possíveis sais, enantiómeros, pró-drogas e derivados; Metoprolol (CAS 37350-58-6) e seus possíveis sais, enantiómeros, pró-drogas e derivados; Metirapona (CAS 54-36-4) e seus possíveis sais, enantiómeros, pró-drogas e derivados; Miconazol (CAS 18 ΡΕ2437742 enantiómeros, 22916-47-8) e seus possíveis sais, enantiómeros, pró-drogas e derivados; Mifepristone (CAS 84371-65-3) e seus possíveis sais, enantiómeros, pró-drogas e derivados; Nadolol (CAS 42200-33-9) e seus possíveis sais, enantiómeros, pró-drogas e derivados; Naloxona (CAS 465-65-6) e seus possíveis sais, enantiómeros, pró-drogas e derivados; Naltrexona (CAS 16590-41-3) e seus possíveis sais, enantiómeros, pró-drogas e derivados; Norfloxacina (CAS 70458-96-7) e seus possíveis sais, enantiómeros, pró-drogas e derivados; Pentazocina (CAS 359-83-1) e seus possíveis sais, enantiómeros, pró-drogas e derivados; Fenoxibenzamina (CAS 59-96-1) e seus possíveis sais, enantiómeros, pró-drogas e derivados; Fenilbutirato (CAS 1821-12-1) e seus possíveis sais, enantiómeros, pró-drogas e derivados; Pilocarpina (CAS 54-71- 7) e seus possíveis sais, enantiómeros, pró-drogas e derivados; Pioglitazona (CAS 111025-46-8) e seus possíveis sais, enantiómeros, pró-drogas e derivados; Prazosina (CAS 19216-56-9) e seus possíveis sais, enantiómeros, pró-drogas e derivados; Propiltiouracil (CAS 51-52-5) e seus possíveis sais, enantiómeros, pró-drogas e derivados; Raloxifeno (CAS 84449-90-1) e seus possíveis sais, enantiómeros, pró-drogas e derivados; Rapamicina (CAS 53123-88-9) e seus possíveis sais, enantiómeros, pró-drogas e derivados; Rifampina (CAS 13292-46-1) e seus possíveis sais, enantiómeros, pró-drogas e derivados; Sinvastatina (CAS 79902-63-9) e seus possíveis sais, enantiómeros, pró-drogas e derivados; Espironolactona (CAS 52-01-7) e seus possíveis sais, enantiómeros, pró-drogas e derivados; Tacrolimus (CAS 104987-11-3) e seus possíveis sais, enantiómeros, pró-drogas e derivados; 19 ΡΕ2437742
Tamoxifeno (CAS 10540- 29-1) e seus possíveis sais, enantiómeros, pró-drogas e derivados; Trealose (CAS 99- 20-7) e seus possíveis sais, enantiómeros, pró-drogas e derivados; Trilostano (CAS 13647-35-3) e seus possíveis sais, enantiómeros, pró-drogas e derivados; ácido Valpróico (CAS 99-66-1) e seus possíveis sais, enantiómeros, pró-drogas e derivados. O termo "combinação" designa a tratamento em que várias drogas são co-administradas em um objeto para causar um efeito biológico. Em uma terapia combinada, como drogas pode ser administradas juntas ou separadamente, ao mesmo tempo ou sequencialmente. Além disso, como drogas podem ser administradas através de diferentes rotas e protocolos. A invenção agora revela a identificação e atividades de combinações de drogas em particular que fornece um tratamento eficiente para CMT. Mais especi-ficamente, a invenção revela novas combinações ternárias que fornecem um efeito significante in vitro e in vivo na CMT ou enfermidades relacionadas. A este respeito, a invenção revela uma composição compreendendo Baclofeno, Sorbitol e um composto selecionado de Pilocarpina, Metimazol, Mifepristone, Naltrexona, Rapa-micina, Flurbiprofeno e Cetoprofeno, sais, enantiómeros, racematos, ou suas pró-drogas.
Em particulara invenção revela uma composição 20 ΡΕ2437742 compreendendo Baclofeno, Sorbitol e um composto selecionado de Pilocarpina, Metimazol, Mifepristone, Naltrexona, e Cetoprofeno.
Na modalidade mais preferida, a presente invenção relaciona-se a uma composição compreendendo Naltrexona, Baclofeno e D-Sorbitol para administração simultânea, separada ou sequencial a um indivíduo mamífero.
Preferivelmente, nas composições acima, Sorbitol é D-Sorbitol e Baclofeno é RS- Baclofeno ou S-Baclofeno, mais preferivelmente RS-Baclofeno. A invenção também revela uma composição compreendendo: (a) rapamicina, (b) mifepristone ou naltrexona, e (c) um modulador PMP22, para administração simultânea, separada ou sequencial a um indivíduo mamífero. A invenção também revela uma composição compreendendo: (a) rapamicina, (b) mifepristone, e (c) um modulador PMP22, para administração simultânea, separada ou sequencial a um indivíduo mamífero. 21 ΡΕ2437742 0 modulador ΡΜΡ22 pode ser qualquer composto que modula a via PMP22 em uma célula e essencialmente causa ou contribui para normalização da organização da mielina e/ou inibição da perda de neurónio. 0 modulador PMP22 pode ser selecionado de Acetazolamida, Albuterol, Amilorida, Amino-glutetimida, Amiodarona, Aztreonam, Baclofeno, Balsalazide, Betaina, Betanecol, Bicalutamida, Bromocriptina, Bumetani-da, Buspirona, Carbacol, Carbamazepina, Carbimazole, Cevi-melina, Ciprofloxacina, Clonidina, Curcumina, Ciclosporina A, Diazepam, Diclofenaco, Dinoprostona, Dissulfiram, D-Sorbitol, Dutasteride, Estradiol, Exemestano, Felbamato, Fenofibrato, Finasterida, Flumazenil, Flunitrazepam, Flur-biprofeno, Furosemida, Gabapentina, Galantamina, Halope-ridol, Ibuprofeno, Isoproterenol, Cetoconazol, Cetoprofeno, L- carnitine, Liotironina (T3), Litio, Losartan, Loxapina, Meloxicam, Metaproterenol, Metaraminol, Metformina, Metaco-lina, Metimazol, Metilergonovina, Metoprolol, Metirapona, Miconazol, Mifepristone, Nadolol, Naloxona, Naltrexona, Norfloxacina, Pentazocina, Fenoxibenzamina, Fenilbutirato Pilocarpina, Pioglitazona, Prazosina, Propiltiouracil, Ra-loxifeno, Rapamicina, Rifampicina, Sinvastatina, Espiro-nolactona, Tacrolimus, Tamoxifeno, Trealose Trilostano, ácido Valpróico seus sais ou suas pró-drogas.
Por exemplo, o composto (c) é selecionado de pilocarpina, metimazol e Baclofeno. A este respeito, uma composição compreende: (a) rapamicina, (b) mifepristone, e 22 ΡΕ2437742 (c) um composto selecionado de pilocarpina, metimazol e Baclofeno para administração simultânea, separada ou sequencial a um indivíduo mamífero.
Exemplos específicos de tais composições incluem composições compreendendo:
Rapamicina ; mifepristone e pilocarpina;
Rapamicina ; mifepristone e Baclofeno;
Rapamicina ; mifepristone e metimazol; ou
Rapamicina ; Naltrexona e metimazol. A secção experimental mostra que estas combinações de droqas em particular são capazes de corrigir de forma eficiente expressão de PMP2 in vitro, para restaurar a mielinização normal e integridade do neurónio, e portanto, para melhorar a CMT em animais in vivo. Os resultados também mostram que estas combinações podem proteger os animais de neuropatia induzida por quimioterapia. Como um resultado, estas composições podem ser usadas para prevenir ou reduzir neuropatia induzida por quimioterapia, desse modo permitindo os pacientes receberem quimioterapia por períodos mais logos. A invenção também revela uma composição compreendendo Naltrexona, Baclofeno e ainda inibidor PMP22 distinto como definida acima.
Um objeto ainda da presente invenção é uma composição como revelada acima ainda compreendendo um ou 23 ΡΕ2437742 vários excipientes farmaceuticamente aceitáveis ou veiculoes (isto é, uma composição farmacêutica).
Um outro objeto da presente invenção relaciona-se a uma composição como revelada acima para o tratamento da CMT ou uma enfermidade relacionada.
Um objeto ainda da presente invenção relaciona-se ao uso de uma combinação de compostos como revelada acima para fabricação de um medicamento para o tratamento de CMT ou uma enfermidade relacionada. A invenção também revela um método para tratar CMT ou uma enfermidade relacionada, o método compreendendo a administração em um sujeito necessitado uma quantidade efetiva de uma composição como definida acima.
Um objeto ainda da presente invenção é um método de preparação de uma composição farmacêutica, o método compreendendo misturar os compostos acima em um excipiente ou veículo apropriado. A invenção também revela um método de tratamento de CMTla em um sujeito, o método compreendendo a administração em um sujeito necessitado uma quantidade efetiva de um composto ou combinação de compostos como revelada acima. A invenção também revela um método de tratamento 24 ΡΕ2437742 de neuropatia tóxica em um sujeito, método compreendendo a administração em um sujeito necessitado uma quantidade efetiva de um composto ou combinação de compostos como revelada acima. A invenção também revela um método de tratamento de ALS em um sujeito, método compreendendo a administração em um sujeito necessitado uma quantidade efetiva de um composto ou combinação de compostos como revelada acima. A terapia de acordo com a invenção pode ser realizada como combinação de droga e/ou em conjunto com qualquer outra terapia. Isso pode ser fornecido em casa, no consultório médico, em uma clinica, em um departamento ambulatorial do hospital, ou em um hospital, de modo que o médico pode observar os efeitos da terapia de perto e fazer quaisquer ajustes que sejam necessários. A duração da terapia depende do estágio da doença que está sendo tratada, a idade e a condição do paciente, e como o paciente responde ao tratamento.
Adicionalmente, uma pessoa que tenha um maior risco de desenvolver uma enfermidade neuropática adicional (por exemplo, uma pessoa que é geneticamente predisposto a ou tenha, por exemplo, diabetes, ou estando sob tratamento para condição oncológica, etc.) pode receber tratamento profilático para aliviar ou para atrasar uma eventual resposta neuropática. 25 ΡΕ2437742 A dosagem, frequência e modo de administração de cada componente a combinação pode ser controlada independentemente. Por exemplo, uma droga pode ser administrada oralmente enquanto a segunda droga pode ser administrada por via intramuscular. A terapia combinada pode ser dada em ciclos de aplicação de não aplicação, que incluem períodos de descanso de modo que o copo do paciente tenha uma chance para a recuperação de quaisquer efeitos colaterais até agora imprevistos. Como drogas também podem ser formuladas juntas de tal forma que uma administração fornece ambas como drogas.
Formulação de Composições Farmacêuticas A administração de cada droga da combinação pode ser por qualquer meio adequado que resulte em uma concentração da droga que, combinada com o outro componente, é capaz de melhorar a condição do paciente (que pode ser determinada, por exemplo, in vitro por um efeito na elevada expressão de PMP22 ao atingir os nervos periféricos).
Embora seja possível para os ingredientes ativos da combinação serem administrados como o químico puro, é preferível apresentá-los como uma composição farmacêutica, também referida neste contexto como formulação farmacêutica. Composições possíveis incluem aquelas adequadas para administração oral, retal, tópica (incluindo transdérmico, 26 ΡΕ2437742 bucal e sublingual), ou parenteral (incluindo subcutânea, intramuscular, intravenosa e intradérmica).
Mais comummente estas formulações farmacêuticas são prescritas para o paciente em "pacotes para o paciente" contendo um número de unidades de dosagem ou outros meios para administração de doses unitárias medidas para uso durante um distinto periodo de tratamento em um único pacote, usualmente uma embalagem blister. Os pacotes para o paciente têm uma vantagem sobre como prescrições tradicionais, onde um farmacêutico divide um suprimento de um fármaco de um paciente a partir de um fornecimento a granel, em que o paciente sempre tem acesso à bula contida no pacote do paciente, normalmente perdida em prescrições tradicionais. A inclusão da bula tem sido mostrada para melhorar a complacência do paciente com como instruções do médico. Portanto, a invenção ainda inclui uma formulação farmacêutica, como descrita anteriormente no presente documento, em combinação com material embalado de modo adequado para como ditas formulações. Em tal pacote para o paciente o uso pretendido de uma formulação para o tratamento combinado pode ser inferido por instruções, instalações, provisões, adaptações e/ou outros meios para ajudar a usar a formulação mais adequada para o tratamento. Tais medidas tornam um pacote para o paciente especificamente adequado e adaptado para o uso para o tratamento com a combinação da presente invenção. A droga pode estar contida em qualquer quantidade 27 ΡΕ2437742 apropriada em qualquer substância veiculoa adequada, e pode estar presente em uma quantidade de 1-99% por peso do peso total da composição. A composição pode ser fornecida em uma forma de dosagem que é adequada para a rota de administração oral, parenteral (por exemplo, por via intravenosa, por via intramuscular) , retal, cutânea, nasal, vaginal, inalante, pele (emplastro), ou ocular. Portanto, a composição pode ser na forma de, por exemplo, comprimidos, cápsulas, comprimidos, pós, granulados, suspensões, emulsões, soluções, géis incluindo hidrogéis, pastas, pomadas, cremes, emplastros, remédio líquidos, dispositivos osmó-ticos de fornecimento, supositórios, enemas, injetáveis, implantes, sprays, ou aerossóis.
Como composições farmacêuticas podem ser formuladas de acordo com a prática farmacêutica convencional (veja, por exemplo, Remington: The Science e Practice of Pharmacy (20th ed.), ed. A. R. Gennaro, Lippincott Williams & Wilkins, 2000 e Encyclopedia of Farmacêuticos Technology, eds. J. Swarbrick e J. C. Boylan, 1988-1999, Mareei Dekker, New York).
Composições farmacêuticas de acordo com a invenção podem ser formuladas para liberar a droga ativa substancialmente imediatamente após a administração ou a qualquer tempo predeterminado ou período de tempo após a administração.
As formulações de libertação controlada incluem 28 ΡΕ2437742 (i) formulações que criam uma concentração substancialmente constante da droga dentro do corpo durante um prolongado período de tempo; (ii) formulações que após um predeterminado intervalo de tempo criam uma concentração substancialmente constante da droga dentro do corpo durante um prolongado período de tempo; (iii) formulações que sustentam a ação da droga durante um predeterminado período de tempo através de uma manutenção relativamente constante, efetivo do nível da droga no corpo com minimização concomitante dos indesejáveis efeitos colaterais associados com flutuações no nível do plasma da substância ativa da droga; (iv) formulações que concentre a ação da droga, por exemplo, por posicionamento espacial de uma de uma composição adjacente de libertação controlada ou no tecido ou órgão doente; e (v) formulações que visam a ação da droga pelo uso de veículoes ou derivados químicos para levar a droga para um tipo de célula alvo em particular. A administração de drogas na forma de a formulação de libertação controlada é especialmente preferida em casos em que a droga em combinação tem (i) um estreito índice terapêutico (isto é, a diferença entre a concentração do plasma levando a efeitos colaterais nocivos ou a reações tóxicas e a concentração do plasma levando a um efeito terapêutico é pequena; em geral, o índice terapêutico, TI, é definido como a relação de dose letal (LD50) com a dose efetiva média (ED50)); (ii) uma janela estreita absorção no trato gastrointestinal; ou (iii) uma meia-vida biológica muito curta de modo que doses 29 ΡΕ2437742 frequentes durante um dia são requeridas a fim de sustentar o nível do plasma em um nível terapêutico.
Qualquer número de estratéqias pode ser adotado a fim de obter libertação controlada em que a taxa de libertação supere a taxa de metabolismo da droga em questão. A libertação controlada pode ser obtida pela seleção apropriada de vários parâmetros de formulação e ingredientes, incluindo, por exemplo, vários tipos de composições de libertação controlada e revestimentos. Portanto, a droga é formulada com excipientes apropriados em uma composição farmacêutica que, após a administração, libera a droga de uma maneira controlada (unidade de comprimido única ou múltipla ou composições cápsula, soluções de óleo, suspensões, emulsões, microcápsulas, microesferas, nanopartícuias, emplastros, e lipossomas).
Formas de Dosagem Sólidas para Uso Oral
Formulações para uso oral incluem comprimidos contendo os ingrediente(s) ativo(s) em uma mistura com não tóxicos excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Estes excipientes podem ser, por exemplo, diluentes inertes ou preenchimentos (por exemplo, sacarose, celulose microcris- talina, amidos incluindo amido de batata, carbonato de cálcio, cloreto de sódio, fosfato de cálcio , sulfato de cálcio ou fosfato de sódio); agentes de granulação e desintegração (por exemplo, derivados de celulose incluindo celulose microcristalina, amidos incluindo amido de batata, 30 ΡΕ2437742 croscarmelose sódica, alginatos, ou ácido algínico); agentes de ligação (por exemplo, acácia, ácido algínico, alginato de sódio, gelatina, amido, amido pré-gelatinizado, celulose microcristalina, carboximetilcelulose de sódio, metilcelulose, hidroxipropil metilcelulose, etilcelulose, polivinilpirrolidona, ou polietilenoglicol); e agentes lubrificantes, deslizantes, e antiaderentes (por exemplo, ácido esteárico, sílicas, ou talco). Outros excipientes farmaceuticamente aceitáveis podem ser corantes, agentes aromatizantes, plastificantes, humectantes, agentes tampo-nantes, e afins.
Os comprimidos podem ser não revestidos ou eles podem ser revestidos por meio de técnicas conhecidas, opcionalmente para adiar desintegração e absorção no trato gastrointestinal e assim fornecendo uma ação sustentada por um longo período. O revestimento pode ser adaptado para liberar a substância de droga ativa in um padrão predeterminado (por exemplo, a fim de alcançar uma formulação de libertação controlada) ou pode ser adaptado para não liberar a substância de droga ativa até depois da passagem pelo estômago (revestimento entérico). O revestimento pode ser um revestimento de açúcar, um revestimento de filme (por exemplo, com base em hidroxipropilmetil-celulose, metilcelulose, metil-hidroxietilcelulose, hidro-xipropilcelulose, carboximetilcelulose, copolímeros de acrilato, polietilenoglicóis e/ou polivinilpirrolidona), ou um revestimento entérico (por exemplo, com base em copolímero de ácido metacrílico, ftalato de acetato de 31 ΡΕ2437742 celulose, ftalato de hidroxipropil metilcelulose, acetato succinato de hidroxipropilmetilcelulose, ftalato acetato de polivinila, goma-laca, e/ou etilcelulose). Um material de atraso de tempo tal como, por exemplo, monoestearato de glicerilo ou diestearato glicerilo pode ser empregado.
Como composições de comprimido sólido podem incluir um revestimento adaptado para proteger a composição de mudanças químicas indesejadas, (por exemplo, degradação química anterior a libertação da substância de droga ativa). 0 revestimento pode ser aplicado na forma de dosagem sólida de modo semelhante como descrito na Encyclopedia of Farmacêuticos Technology.
Como drogas podem ser misturadas juntas no comprimido, ou podem ser particionadas. Por exemplo, uma primeira droga está contida no interior do comprimido, e uma segunda droga está do lado de fora, de tal forma que uma porção substancial da segunda droga é liberada antes da libertação da primeira droga.
Formulações para uso oral também pode ser apresentadas como comprimidos mastigáveis, ou como cápsulas duras de gelatina em que o ingrediente ativo é misturado com um diluente sólido inerte (por exemplo, amido de batata, celulose microcristalina, carbonato de cálcio, fosfato de cálcio ou caulim), ou como cápsulas moles de gelatina em que o ingrediente ativo é misturado com água ou um óleo médio, por exemplo, parafina líquida, ou azeite. 32 ΡΕ2437742 Pós e granulados podem ser preparados usando os ingredientes mencionados acima em comprimidos e cápsulas de um modo convencional.
Composições de libertação controlada para uso oral podem, por exemplo, ser construídas para liberar a droga ativa pelo controle da dissolução e/ou da difusão da substância de droga ativa. A libertação controlada por dissolução ou difusão pode ser alcançada pelo revestimento apropriado de um comprimido, cápsula, pelete, ou granulado da formulação de drogas, ou pela incorporação da(s) droga(s) em uma matriz apropriada. 0 revestimento de libertação controlada pode incluir uma ou mais substâncias de revestimento mencionadas acima e/ou, por exemplo, goma-laca, cera de abelha, glico-wax, cera de mamona, cera de carnaúba, álcool estearílico, monoestearato de glicerilo, diestearato glicerilo, glicerol palmitoestearato, etilcelulose, resinas acrílicas, dl ácido polilático, butirato de acetato de celulose, cloreto de polivinila, acetato de polivinila, vinilpirrolidona, poli-etileno, polimetacrilato, metilmetacrilato, 2-hidroxime-tacrilato, hidrogéis de metacrilato, 1,3 butileno glicol, metacrilato de etileno glicol, e/ou polietilenoglicóis. Em uma formulação de matriz de libertação controlada, o material da matriz pode também incluir, por exemplo, metilcelulose hidratada, cera de carnaúba e álcool estearílico, carbopol 934, silicone, triestearato de glicerilo, metil acrilato-metil metacrilato, cloreto de polivinila, polietileno, e/ou fluorocarbono halogenado. 33 ΡΕ2437742
Uma composição de libertação controlada contendo um ou mais das drogas das combinações reivindicadas também pode ser na forma de um comprimido ou cápsula flutuante (isto é, um comprimido ou cápsula que, sobre administração oral, flutua em cima do conteúdo gástrico por um certo periodo de tempo). Uma formulação da(s) droga(s) de um comprimido flutuante pode ser preparada pela granulação de uma mistura da(s) droga(s) com excipientes e 20-75% p/p de hidrocolóides, tais como hidroxietilcelulose, hidroxipro-pilcelulose, ou hidroxipropilmetilcelulose. Os grânulos obtidos podem então ser comprimidos em comprimidos. Em contato com o suco gástrico, o comprimido forma uma barreira em gel substancialmente impermeável a água em torno da sua superfície. Esta barreira em gel toma parte em manter uma densidade de menos de um, assim permitindo o comprimido permanecer flutuante no suco gástrico. Líquidos para Administração Oral Pós, pós dispersível ou granulados adequados para a preparação de uma suspensão aquosa pela adição de água são convenientes formas de dosagens para administração oral. Formulação como uma suspensão fornece o ingrediente ativo em uma mistura com um agente humectante ou de dispersão, agente de suspensão, e um ou mais conservantes. Agentes de suspensão adequados são, por exemplo, carboximetilcelulose de sódio, metilcelulose, alginato de sódio, e afins. 34 ΡΕ2437742
Composições Parenterais A composição farmacêutica também pode ser administrada por via parentérica por injeção, infusão ou implante (intravenosa, intramuscular, subcutânea, ou afins) em formas de dosagens, formulações, ou via dispositivos de fornecimento adequados ou implantes contendo veículos farmaceuticamente aceitáveis convencionais, não tóxicos e adjuvantes. The formulação e preparação de tais composições são bem conhecidas daqueles técnicos no assunto de formulação farmacêutica.
Composições para uso parenteral podem ser fornecidas em forma de dosagens unitárias (por exemplo, em ampolas de dose única), ou em frascos contendo várias doses e em que um conservante adequado pode ser adicionado (veja abaixo). A composição pode ser em forma de uma solução, uma suspensão, uma emulsão, um dispositivo de infusão, ou um dispositivo de administração por implante ou pode ser apresentada como um pó seco para ser reconstituído com água ou um outro veículo adequado antes do uso. Além da(s) droga(s) ativa(s), a composição pode incluir veículoes e/ou excipientes aceitáveis e adequados a via parentérica. A(s) droga(s) ativa(s) pode(m) ser incorporada(s) em microesferas, microcápsulas, nanopartícuias, lipossomas, ou afins para libertação controlada. A composição pode incluir agentes de suspensão, de solubilização, de estabilizantes, de ajuste de pH, e/ou agentes de dispersão. 35 ΡΕ2437742
As composições farmacêuticas de acordo com a invenção podem ser em uma forma adequada para uma injeção esterilizada. Para preparar tal composição, a(s) adequada(s) droga (s) ativa(s) são dissolvidas ou suspensas em um veiculo liquido parentérico aceitável. Entre veículos e solventes aceitáveis que podem ser empregados estão água, água ajustada a um pH adequado pela adição de uma quantidade apropriada de ácido clorídrico, hidróxido de sódio ou um tampão adequado, 1,3-butanediol, solução de Ringer e solução isotónica de cloreto de sódio. A formulação aquosa pode também conter um ou mais conservantes (por exemplo, metil, etil ou n-propil p-hidroxibenzoato). Em casos onde uma das drogas é somente moderadamente ou levemente solúvel em água, uma dissolução melhorada ou agente de solubilização pode ser adicionado, ou o solvente pode incluir 10-60% p/p de propilenoglicol ou afins. A libertação controlada de composições paren-terais pode ser na forma de suspensões aquosas, microes-feras, microcápsulas, microesferas magnéticas, soluções de óleo, suspensões oleosas, ou emulsões. Alternativamente, a(s) droga(s) ativa(s) pode(m) ser incorporada(s) em veículos biocompatíveis, lipossomas, nanopartículas, implantes ou dispositivos de infusão. Materiais para o uso na preparação de microesferas e/ou microcápsulas são, por exemplo, polímeros biodegradáveis/bioerodíveis tal como poligalactina, poli-(isobutil cianoacrilato), poli(2-hidroxietil-L- glutamina). Veículoes biocompatíveis que 36 ΡΕ2437742 podem ser usados quando formulando uma formulação de libertação controlada parenteral são carbohidratos (por exemplo, dextranos), proteínas (por exemplo, albuminas), lipoproteínas ou anticorpos. Materiais para o uso em implantes podem ser não biodegradáveis (por exemplo, poli-dimetil siloxano) ou biodegradáveis (por exemplo, poli (ca-prolactona), poli(ácido glicólico) ou poli(orto ésteres)).
Composições Retais
Para aplicação retal, formas de dosagens adequadas para uma composição incluem supositórios (tipo emulsão ou suspensão), e cápsulas retais de gelatina (soluções ou suspensões). Em uma típica formulação de supositório, a(s) droga(s) ativa(s) é(são) combinada(s) com uma base de supositório farmaceuticamente apropriada e aceitável tal como manteiga de cacau, ácidos graxos esterifiçados, gelatina glicerinada, e várias bases solúveis ou dispersíveis em água como polietilenoglicóis. Vários aditivos, intensificadores ou surfactantes podem ser incorporados.
Composições Tópicas e Percutâneas
As composições farmacêuticas também podem ser administradas topicamente na pele para absorção percutânea em forma de dosagens ou formulações contendo convencionalmente veículoes e excipientes farmacêuticos não tóxicos aceitáveis incluindo microesferas e lipossomas. As for- 37 ΡΕ2437742 mulações incluem cremes, pomadas, loções, linimentos, géis, hidrogéis, soluções, suspensões, bastões, sprays, pastas, emplastros, e outros tipos de sistemas transdérmico de administração da droga. Os veiculoes ou excipientes farma-ceuticamente aceitáveis podem incluir agentes emulsi-ficantes, antioxidantes, agentes tamponantes, conservantes, humectantes, intensificadores de penetração, agentes quelantes, agentes formadores de gel, bases de pomada, perfumes, e agentes de proteção da pele.
Os agentes emulsificantes podem ser gomas de ocorrência natural (por exemplo, goma acácia ou goma adragante)
Os conservantes, humectantes, intensificadores de penetração podem ser parabenos, tal como metil ou propil p-hidroxibenzoato, e cloreto de benzalcônio, glicerina, propilenoglicol, ureia, etc.
As composições farmacêuticas descritas acima para administração tópica na pele também pode ser usada em conexão com administração tópica na ou perto da parte do corpo que é para ser tratada. As composições podem ser adaptadas para aplicação direta ou para aplicação por meios de dispositivos de fornecimento de droga especiais tais como curativos ou alternativamente emplastros, acolchoados, esponjas, faixas, ou outras formas de material flexível adequado. 38 ΡΕ2437742
Dosagens e duração do tratamento
Será considerado que as drogas da combinação podem ser administradas concomitantemente, quer na mesma ou diferente formulação farmacêutica ou sequencialmente. Se existe administração sequencial, o adiamento em administrar um dos ingredientes ativos não deve ser tal que perca o beneficio do eficaz efeito da combinação dos ingredientes ativos. Um requisito mínimo para uma combinação de acordo com esta descrição é que a combinação deve ser destinada ao uso combinado com o benefício do eficaz efeito da combinação dos ingredientes ativos. 0 uso pretendido de uma combinação pode ser inferido por instalações, provisões, adaptações e/ou outros meios para ajudar usar a combinação de acordo com a invenção.
Quantidades terapeuticamente efetivas das drogas que são matéria desta invenção podem ser usadas juntas para a preparação de um medicamento útil para reduzir o efeito do aumento da expressão do gene PMP22; restauração da mielinização normal e integridade do nervo, prevenindo ou reduzindo o risco de desenvolver a doença de CMT, parando ou retardando a progressão da doença de CMT uma vez que tenha torna-se clinicamente manifestada, e prevenindo ou reduzindo o risco de uma primeira ou subsequente ocorrência de um evento neuropático.
Embora as drogas ativas da presente invenção possam ser administradas em doses divididas, por exemplo 39 ΡΕ2437742 duas ou três vezes diariamente, uma única dose diária de cada droga na combinação é preferida, com uma única dose diária de todas as drogas em uma única composição farmacêutica (unidade de forma de dosagem) sendo a mais preferida. A administração pode ser uma a várias vezes diariamente por vários dias a vários anos, e pode ainda ser para a vida do paciente. Crónica ou pelo menos periodicamente repetida, a administração por longa duração será indicada na maioria dos casos. • 0 termo "unidade de forma de dosagem" refere-se a unidades fisicamente discretas (tal como cápsulas, comprimidos, ou cilindros de seringa carregados) adequadas como dosagens unitárias para objetos humanos, cada unidade contendo uma predeterminada quantidade do material ou materiais ativos calculados para produzir o efeito terapêutico desejado, em associação com os veiculoes farmacêuticos requeridos. A quantidade de cada droga na combinação preferida para uma unidade de dosagem dependerá de vários fatores incluindo a via de administração, o peso do corpo e a idade do paciente, a gravidade do dano neuropático causado pela doença de CMT ou o risco dos potenciais efeitos colaterais considerando o estado de saúde geral da pessoa a ser tratada.
Adicionalmente, a farmacogenómica (o efeito do 40 ΡΕ2437742 genótipo no perfil farmacocinético, farmacodinâmico ou de eficácia de um terapêutico) informação sobre um paciente em particular pode afetar a dosagem usada.
Exceto quando respondendo a casos da doença de CMT especialmente comprometidos quando altas dosagens podem ser requeridas, ou quando tratando crianças quando baixas dosagens devem ser escolhidas, a dosagem preferida de cada droga na combinação usualmente se encontrarão dentro da faixa de doses não acima do usualmente prescrito para a manutenção do tratamento de longa duração ou provou ser seguro na grande fase 3 dos estudos clínicos.
Por exemplo, • para Rapamicina, de cerca de 1 a cerca de 100 yg/kg por dia, tipicamente de 1 a 50 yg/kg, por exemplo, entre 5 e 30 yg/kg/dia. • para Mifepristone , de cerca de 1 a cerca de 300 yg/kg por dia, tipicamente de 10 a 200 yg/kg, por exemplo, entre 10 e : 80 yg/kg/dia. • para Naltrexona, de cerca de 1 a cerca de 100 yg/kg por dia, tipicamente de 1 a 50 yg/Kg, por exemplo, entre 1 e 20 yg/kg/dia. • para Pilocarpina, de cerca de 1 a cerca de 100 yg/kg por dia, tipicamente de 1 a 50 yg/Kg, por exemplo, entre 1 e 20 yg/kg/dia. • para Baclofeno, de cerca de 1 a cerca de 300 yg/kg por dia, tipicamente de 10 a 200 yg/kg, por exemplo, entre 20 e 100 yg/kg/dia. 41 ΡΕ2437742 • para Metimazol, de cerca de 1 a cerca de 100 yg/kg por dia, tipicamente de 1 a 50 yg/kg, por exemplo, entre 1 e 20 yg/kg/dia. A dosagem mais preferida corresponderá a quantidades del% até a 10% daquelas usualmente prescritas para a manutenção do tratamento de longa duração .
Será entendido que as quantidades da droga administradas na realidade serão determinadas por um médico, à luz de circunstâncias relevantes incluindo a condição ou condições a ser tratada, a exata composição a ser administrada, a idade, o peso, e a resposta individual do paciente, a gravidade dos sintomas do paciente, e a escolha da rota de administração. Por isso, as faixas de dosagem acima se destinam a fornecer orientações gerais e apoio para os ensinamentos no presente documento, mas não são destinadas a limitar o âmbito da invenção.
Exemplos A. Preparação das combinações de drogas
As seguintes combinações de drogas foram preparadas:
Molécula dose Mixl Sorbitol 2,1 mg/kg/dia S-Baclofeno (-) 60 yg/kg/dia Naltrexona 7 yg/kg/dia 42 ΡΕ2437742
Molécula dose Μ±χ2 Rapamicina 15 yg/kg/dia Mifepristone 40 yg/kg/dia
Molécula dose Mix3 Rapamicina 15 yg/kg/dia Mifepristone 40 yg/kg/dia Pilocarpina 7 yg/kg/dia
Molécula dose M±x4 Rapamicina 15 yg/kg/dia Mifepristone 40 yg/kg/dia Baclofeno 60 yg/kg/dia
Molécula dose M±x5 Rapamicina 15 yg/kg/dia Mifepristone 40 yg/kg/dia Metimazol 4,2 yg/kg/dia
Molécula dose M±x6 Rapamicina 15 yg/kg/dia Naltrexona 7 yg/kg/dia Metimazol 4,2 yg/kg/dia
Molécula dose 1 dose 2 dose 3 Mix7 Sorbitol 10,5 mg/kg/dia 2,1 mg/kg/dia 1,05 mg/kg/dia (RS) Baclofeno 0,3 mg/kg/dia 60 yg/kg/dia 30 yg/kg/dia Naltrexona 35 yg/kg/dia 7 yg/kg/dia 3,5 yg/kg/dia 43 ΡΕ2437742 B. Experiências in vitro 1. Ensaios de expressão de PMP2 em células de Schwann tratadas com Mixl-6 1.1. Cultura de células 1.1.1: Células de Schwann primárias de rato comercialmente disponíveis
Frascos de cultura primária de células de Schwann (SC) de rato (Sciencell # R1700) são descongeladas e semeadas na densidade de 10 000 células/cm2 em "Sciencell meio de célula de Schwann" (meio basal de Sciencell #R1701) em poli-L-lisina frascos 75 cm2 prerevestidos. O meio de cultura é composto de meio basal, 5% Soro fetal bovino (3H-Biomedical AB #1701-0025), 1% suplemento de crescimento de célula de Schwann (3H Biomedical AB #1701-1752), 1%
Gentamicina (Sigma #G1397) e 10μΜ de Forscolina (Sigma # F6886) para promover sua proliferação.
Depois de atingir confluência (4 a 10 dias dependendo do lote de células), as células de Schwann são purificadas pela agitação suave ou por thy 1.1 immuno-panning que permite o isolamento de SC dos fibroblastos aderentes, para produzir culturas que são pelo menos 95% pura. SC são então contadas (método Tryptan blue) e semeadas em poli-L-lisina frascos 75 cm2 prerevestidos no 44 ΡΕ2437742 mesmo meio SC. Na confluência, as células são rinsadas, tripsinizadas (tripsina-EDTA lx diluída de Invitrogen #1540054), diluída em PBS sem cálcio e magnésio) contadas e plaqueadas em placa 12 poços (140 000 células/ poço) em Sciencell meio de célula Schwann com 5% de FBS, 1% de suplemento de crescimento de célula (CGS), 40yg/ml of gentamicina e 4μΜ Forscolina. 1.1.2 Células de Schwann de rato primária feitas sob medida
Culturas primária de célula de Schwann (SC) são estabelecidas a partir de nervos ciáticos de ratos Sprague-Dawley (entre PO e P2). Todos os ratos recém-nascidos são sacrificados e isolados em uma placa de Petri. A dissecção é realizada sob condições estéreis. A pele dorsal é removida da pata posterior e do tronco inferior. O nervo ciático é isolado e transferido para uma placa de cultura contendo Leibovitz gelado (L15, Invitrogen #11415) suplementado com solução 1% penici-lina/estreptomicina (50UI/ml e 50yg/ml, respectivamente; Invitrogen #15070) e 1% de albuminas de soro bovino (BSA, Sigma A6003). Ambos os nervos por ratos são transferidos em um tubo de 15ml contendo LI5 gelado. O meio LI5 é então removido e trocado por 2,4ml de DMEM (Invitrogen #21969035) com lOmg/ml de colagenase (Sigma #A6003). Os nervos são incubados neste meio por 30 minutos a 37°C. O meio é então removido e ambos os nervos são dissociados por tripsina 45 ΡΕ2437742 (10% tripsina EDTA lOx, Invitrogen #15400054) diluída em PBS sem cálcio e magnésio (Invitrogen # 2007-03) por 20min a 37°C. A reação é interrompida pela adição de DMEM contendo DNase I grade II (0,1 mg/ml Roche diagnostic #104159) e soro fetal bovino (FCS 10%, Invitrogen #10270). A suspensão de célula foi triturada com uma pipeta de lOml e por um filtro em um tubo de 50ml (Swinnex 13mm unidades de filtro, Millipore, com filtro 20ym nylon-mesh, Fisher). A suspensão de células é centrifugada a 350g por lOmin a temperatura ambiente (RT) e os peletes são suspensos em DMEM com 10% FCS e 1% penicilina/estreptomicina. As células são contadas (método Tryptan blue) e semeadas em tubo Falcon lOOmm, a cultura de tecido primária plaqueia a densidade de 5.105 a 106 células/placa.
Após um dia de cultura, o meio é mudado com DMEM, 10% FCS, 1% penicilina/estreptomicina e 10μΜ de citosina b-D-arabinofuranoside (Sigma #C1768). 48hrs depois, o meio é eliminado e as células são lavadas três vezes com DMEM. O meio de crescimento para SC é então adicionado, composto de DMEM, 10% FCS, 1% penicilina/estreptomicina, 2μΜ de Forscolina (Sigma #F6886), 10μg/ml of extrato de pituitária bovina (PEX, Invitrogen #13028). O meio é trocado a cada 2-3 dias.
Após 8 dias de cultura (4 a 10 dias dependendo do lote de células), células de Schwann alcançam confluência e a cultura, contendo uma grande quantidade de contaminação de fibroblastos, é purificada pelo método thy 1.1 46 ΡΕ2437742 immunopanning. Após esta purificação, as células são suspensas em meio de crescimento a 10 000 células/cm2 em poli-L-lisina frascos 75 cm2 prerevestidos. Uma vez eles alcançam confluência, células são rinsadas, tripsinizadas (tripsina-EDTA) , cotadas e plaqueadas em placa 12 poços (100 000 células/ poço). 1.1.3 Incubação da droga
Após células sendo plaqueadas em placa 12 poços, o meio é trocado por um meio definido consistindo em uma mistura de DMEM-F12 (Invitrogen # 21331020) complementado por 1% de suplemento N2 (Invitrogen # 17502), 1% L-Glutamina (Invitrogen #25030024) 2,5% FBS (Sciencell #0025), 0,02yg/ml de corticosterona (Sigma # C2505), 4μΜ Forscolina e 50yg/ml of gentamicina. Fatores de crescimento não são adicionados a este meio, para promover SC diferenciação 24 horas depois, o meio é trocado por um meio definido (DMEM-F12) complementado com 1% Insulina-Transferrina-Selênio - X (ITS, Invitrogen # 51300), 16yg/ml de Putrescina (Sigma # P5780) , 0,02 yg/ml de corticosterona e 50yg/ml de gentamicina. Nesta fase, nem progesterona ou Forscolina estão presente no meio.
Um dia depois, as células de Schwann são estimuladas pelas combinações de drogas durante 24hrs (3 poços/condição). A preparação de cada composto é realizada pouco antes de sua adição ao meio de cultura celular. 47 ΡΕ2437742
As drogas são adicionados a um meio definido composto de DMEM-F12, com 1 % Insulina-Transferrina-Selênio - X (ITS, Invitrogen # 51300), 16yg/ml de Putrescina, 0,02 yg/ml de corticosterona, lOnM Progesterona e 50yg/ml de gentamicina. A ausência de Forscolina durante a estimulação com a droga evita adenilato ciclase saturação. 1.2. Purificação das células de Schwann por Thyl.l immunopanning
Para prevenir contaminação da cultura por fibroblastos, células de Schwann são purificadas usando o clone Thyl.l (ATCC TIB-103™) protocolo immunopanning.
Placas de Petri lOOmm bactéria com anticorpos prerevestidos são preparadas como do seguinte modo: estas placas são lavadas três vezes com PBS e tratadas com 20ml de solução Tris HC1 50 mM, pH 9,5, com 10 yg/ml de IgM MU anticorpo de cabra Anti- camundongo (Jackson ImmunoResearch #115-005-020) de um dia para o outro a 4°C; então rinsado 3 vezes com PBS e tratada com uma solução de PBS com 0, 02% de BSA e o sobrenadante é obtido da cultura de hibridoma TlD7e2 (ATCC #TIB-103) contendo o Thyl.l IgM anticorpo para 2 horas a temperatura ambiente. Finalmente, as placas são lavadas três vezes com PBS antes das suspensões de células serem adicionadas. SC são destacadas com tripsina EDTA. Assim que a 48 ΡΕ2437742 maioria das células está em suspensão, a tripsina é neutralizada com DMEM-10% FBS e as células são centrifugadas. 0 pelete das células dissociadas é ressuspenso em 15ml de meio com 0,02% BSA a densidade de Ο,ββχΙΟ6 células por ml (máximo) e transferido para a placa de Petri (cerca de 6, 6 milhões de células/lOml/placa de lOOmm). A suspensão de células é incubada na placa de Petri com Thy 1.1 revestidos durante 45 min a 37 °C com agitação suave a cada 15 min para prevenir ligação não especifica. A maioria das células de fibroblastos expressando Thyl.1 adere na placa. No final da incubação, a suspensão de células é recuperada e centrifugada. Esta suspensão de células contém em teoria somente células de Schwann. As células são centrifugadas e o pelete de células é suspenso em meio de crescimento com ΙΟμΜ de Forscolina a 16 000 células/cm2 em frasco T75 cm2 tratado com Poly-L-Lisina. 1.3 Quantitativo de transcriptase reversa reação em cadeia da polimerase (Q- RT-PCR) RT-PCR quantitativo é usado para comparar os níveis de PMP22 mRNA após estimulação droga, em relação ao mRNA L13A Ribossomal de manutenção em célula de Schwann de cultura primária de rato.
Após rinsado com PBS frio e esterilizado, o total 49 ΡΕ2437742 de RNAs de cada amostra de célula é extraído e purificada de SC usando o Qiagen RNeasy micro kit (Qiagen #74004). Os ácidos nucleicos são quantificados pelo espectrofotômetro Nanodrop usando Ιμΐ de amostra de RNA. A integridade do RNA é determinada através de um aparelho BioAnalyzer (Agilent). RNAs são reverso transcritos em cDNA de acordo com protocolo padrão. Os moldes de cDNA para amplificação por PCR são sintetizados a partir 200ng de RNA total usando SuperScript II transcriptase reversa (Invitrogen # 18064-014) para 60 min a 42°C na presença de oligo (dT) , em um volume final de 20μ1. cDNAs são submetidos a amplificação por PCR usando o sistema «LightCycler® 480» (Roche Molecular Systems Inc.) Cada cDNA é diluído cinco vezes antes de ser usado para amplificação por PCR. 2,5μ1 destes cDNAs entra na solução de reação de PCR (volume final de 10μ1). Experimentos preliminares assegurou que a quantificação foi feita na fase exponencial do processo de amplificação para ambas sequências e que a expressão do gene referência foi uniforme nas diferentes condições de cultura. A reação PCR é realizada pela amplificação de 500nM do iniciador direto de rato PMP22 (NM_017037), 5-GGAAACGCGAATGAGGC-3 (SEQ ID NO: 1), e 500nM do iniciador reverso 5-GTTCTGTTTGGTTTGGCTT-3 (SEQ ID NO: 2) (amplificação de 148-bp). Um fragmento 152-bp do 50 ΡΕ2437742 RNA(NM_173340) ribossomal RPL13A é amplificado em paralelo em reações separadas para normalização dos resultados pelo uso de 500nM de iniciador direto 5-CTGCCCTCAAGGTTGTG-3 (SEQ ID NO: 3), e de 500nM de iniciador reverso 5-CTTCTTCTTCCGGTAATGGAT-3 (SEQ ID NO: 4). Nós usamos FRET chemistry para realizar a análise RT-Q-PCR. As sondas FRET são compostas de 0,3μΜ de Pmp22-FL-5-GCTCTGAGCGTGCATAGGGTAC (SEQ ID NO: 5) ou Rpll3A-FL- 5-TCGGGTGGAAGTACCAGCC (SEQ ID NO: 6), rotulados em sua extremidade 3' como um doador fluoróforo corante (fluoresceina). 0,15μΜ de sondas Red640 são definidas como segue: Pmp22-red-5’-AGGGAGGGAGGAAGGAAACCAGAAA (SEQ ID NO: 7) ou Rpll3A-red-5’-TGACAGCTACTCTGGAGGAGAAACGGAA (SEQ ID NO: 8), rotulados em sua extremidade 5' com um aceptor fluoróforo corante (Rodamina Red 640).
Cada reação PCR continha 2,5μ1 de molde de cDNA em um volume final de 10μ1 do master mix kit (Roche #04-887301001) .
As seguintes condições de PCR são usadas: lOseg a 95°C, lOseg a 63°C e 12seg a 72°C e 30seg a 40°C (quarenta ciclos de amplificação) . Os relativos níveis de expressão do gene de PMP2 são medidos pela determinação da razão entre os produtos gerados a partir do gene alvo PMP22 e o padrão interno endógeno RPL13A. 51 ΡΕ2437742 1.4 Análise da expressão de proteína PMP22 por citometria de fluxo (FACS) 8 hrs, 24 hrs e 48 hrs após incubação das drogas, os sobrenadantes são recuperados, centrifugados e congelados. SC são destacadas com tripsina-EDTA. Assim gue a maioria das células está em suspensão, a tripsina é neutralizada usando DMEM com 10% de FCS.
Os sobrenadantes com células são recuperados e centrifugados. Os peletes de células são transferidos em microtubos, lavados em PBS uma vez e fixados com uma solução especifica (AbCys #Reagent A BUF09B). 10 minutos depois, as células são rinsadas uma vez com PBS e mantidas a 4°C.
Cinco dias após a fixação da célula, todas as preparações de células com diferentes tempos de incubação são rotuladas usando o seguinte protocolo.
As células são centrifugadas a 7000 rpm por 5 minutos e os peletes são suspensos em uma solução de permeabilização (AbCys #Reagent B BUF09B) e rotulados com PMP22 anticorpo primário (Abeam #ab61220, 1/50) para lhr a temperatura ambiente. A células são então centrifugadas a 7000 rpm para 5 minutos e peletes de células são rinsados uma vez em PBS. Um anticorpo secundário é adicionado, acoplado a Alexa Fluor 488 (IgG de cabra anti-coelho, Sondas Moleculares #A11008, 1/100), para uma hora a 52 ΡΕ2437742 temperatura ambiente. As células são então centrifugadas a 7000 rpm para 5 minutos e peletes de células são rinsados uma vez em PBS. A rotulagem é aumentada adicionando um anticorpo terciário acoplado a Alexa Fluor 488 (IgG de galinha anti-cabra, Sondas Moleculares #A21467, 1/100) para uma hora incubação, a temperatura ambiente. As células são então rinsadas uma vez em PBS. O controle sem qualquer anticorpo (células não rotuladas) é realizado para determinar o nivel de autofluorescência e adaptado a sensibilidade dos fotomultiplicadores. O controle com ambos os anticorpos secundário e terciário, mas sem anticorpo primário, é realizado para avaliar ligação não especifica de anticorpos. A aquisição e a análise de dados são realizadas com uma matriz de citômetro FACS e software para matriz FACS (Becton Dickinson) em 5000 células. A Dispersão Dianteira (FSC) correlacionada com o volume da célula (tamanho) e Dispersão Lateral (SSC) dependendo da complexidade interna das células (granularidade) são analisados. Para expressão de PMP22, a análise é realizada no total de células e a percentagem de células positivas é calculada. As células positivas são células com intensidade de fluorescência maior do que o controle com anticorpo secundário.
A fim de quantificar o número de SC, células no meio controle são analisadas usando anticorpos anti-SlOO
Protein. 53 ΡΕ2437742
As células são preparadas de acordo com o seguinte protocolo: células de Schwann são marcadas com anticorpo anti-SlOO Protein (Dako #S0311, 1/100) por lhr a temperatura ambiente. Este anticorpo é rotulado de acordo com protocolo descrito acima para imunomarcação de PMP22, mas sem incubação com anticorpo terciário. 1.5. Incubação e atividade da droga
As drogas são incubadas para 24 hrs ou 48 hrs no mesmo meio definido que descrito acima (3 poços/condição) na ausência de Forscolina para evitar saturação e estimulação de adenilato ciclase, mas na presença de lOnM de progesterona. Após incubação da droga, os sobrenadantes são recuperados e as células de Schwann são congeladas para análise RT-Q-PCR.
Estas experiências estão resumidos na Tabela 1.
Tabela 1
Combinação expressão de PMP2 Mixl infra-regulação Mix2 infra-regulação Mix3 infra-regulação Mix4 infra-regulação Mix5 infra-regulação Mix6 infra-regulação 54 ΡΕ2437742
2. Avaliação do efeito sinergético de compostos no Mix7 em um modelo de co-cultura para CMT
Um modelo de co-cultura foi usado como um modelo in vitro de CMTlA. Este modelo de mielinização consiste em co-cultivar neurónios sensoriais e células de Schwann de machos PMP22 Transgénicos (TG) dissociadas Gânglios da Raiz Dorsal (DRG). 0 objetivo deste estudo é avaliar o efeito de 3 compostos teste (+/-Baclofeno, Naltrexona e Sorbitol) e a Mix7 (uma mistura destas 3 drogas) no processo de mielinização. 0 efeito dos 3 compostos testes e sua mistura na mielinização são avaliados por meio da avaliação da expressão Proteína Básica da Mielina (MBP) na presença de ácido ascórbico. 2.1 Materiais e Métodos Fêmeas de ratos prenhes com 15 dias de gestação são mortas por deslocamento cervical. Os embriões são removidos do útero e estão em estágio similar de desenvolvimento fetal. 2.1.1 Genotipagem
Um pedaço de cada cabeça do embrião (3 mm ) é colocado em um tubo de 2 ml livre de DNase. 0 DNA é 55 ΡΕ2437742 extraído com o SYBR Green Extract-N-Amp tissue PCR kit (Sigma, ref XNATG- 1KT). 120μ1 da solução de extração (Kit Sigma, ref XNATG-1KT) foi colocada em cada pedaço de cabeça do embrião. As cabeças são incubadas por 10 min a temperatura ambiente. No final desta incubação, as cabeças são incubadas por 5 min a 95 °C na solução de extração. Imediatamente após esta última incubação, 100 μΐ de solução neutralizante são adicionados, cada extrato de DNA é diluído em 1/40 com água estéril ultrapura (Biosolve, ref: 91589) e armazenado a +4°C até o uso. A genotipagem dos embriões de fêmeas (F) e de machos (M) é realizada durante a dissecção dos DRG, com o kit Fast SYBR Green Master Mix (Applied Biosystem, 4385612). O gênero de cada embrião é determinado usando o gene SRY do macho. Os primers SRY são fornecidos por Phamext (SRY-F (SEQ ID NO:9): 5'- GAGAGAGGCACAAGTTGGC-3'; SRY-R (SEQ ID NO: 10): 5'- GCCTCCTGGAAAAAGGGCC-3'). Os primers SRY são diluídos em 3μΜ de água estéril ultrapura (Biosolve, ref: 91589) . Uma mistura para PCR é preparada com água ultrapura (4μ1 por amostra), 3μΜ de primer (2μ1 por amostra) e Master Mix (10 μΐ por amostra) . Em uma placa PCR 96 poços, 16 μΐ da mistura PCR é depositada em cada poço. 4μ1 de cada DNA diluído é adicionado de acordo com um plano de depósito. O PCR é executado usando o 7500 fast RT-PCR system (Applied Biosystem), com o seguinte programa:
Início: 95°C - 20 seg 45 ciclos: 95°C - 10 seg, 65°C - 10 seg, 72°C - 30 seg (aquisição de dados). 56 ΡΕ2437742
Curva de Fusão (Melt) : 95°C - 15 seg, 64°C - lmin, 90°C - 30 seg (contínua aquisição de dados), 60°C 15 seg. Os gráficos de amplificação e curvas de fusão são analisados com o 7500 software (Applied Biosystems).
Os resultados para cada amostra são comparados ao controle negativo (água ultrapura) e ao controle positivo (TG/Machos e WT/Fêmea) , para concluir sobre o genótipo de cada embrião. 2.1.2 Co-culturas de neurónios sensoriais e células de Schwann Gânglios da raiz dorsal de rato são cultivados como previamente descrito por Cosgaya et al., 2002 e Rangaraju et al., 2008.
Cada embrião é despachado em uma placa de petri numerada (35 mm de diâmetro). A cabeça do embrião é cortada e colocada em um tubo de 1,5 ml livre de DNAase; o DNA é extraído com o Extract-N-Amp Tissue Kit (Sigma Aldrich). A genotipagem (Machos (M) e fêmea (F) , tipo selvagem e PMP22 transgénicos) é realizada com o kit Fast SYBR Green Master Mix (Applied Biosystem). Esta genotipagem é realizada em paralelo da dissecção de gânglios da raiz dorsal (DRG), de modo que ao final da dissecção, somente um tipo de cultura (DRG de transgénicos machos) é feito. DRG de cada embrião é coletado, colocado em meio de Leibovitz (L15, Invitrogen) gelado. No final de dissecção, DRG de TGM são agrupados e 57 ΡΕ2437742 dissociados por tripsinização (tripsina EDTA, 0,05%; Invitrogen) por 20 min a 37°C. A reação é interrompida pela adição de DMEM contendo 10% de soro fetal bovino (FBS) na presença de DNAase I (Roche). A suspensão é triturada com uma pipeta de 10 ml. As células são então centrifugadas a 350 x g por 10 min a temperatura ambiente. O pelete das células dissociadas é ressuspenso em meio neurobasal (Invitrogen) contendo 2% de B27 (Invitrogen), 1% de penicilina-estreptomicina (Invitrogen), 1 % de L Glutamina e 50 ng/ml NGF (Sigma) . Este meio é o meio neuronal. As células viáveis são contadas em um citômetro Neubauer usando o teste de exclusão trypan blue (Sigma) e semeadas na base de 10 000 células por poço em placas de 96 poços (Greiner) tratadas com poli-L-lisina. As placas são mantidas a 37 °C em uma incubadora umidif içada, em uma atmosfera de ar (95%)-C02 (5%). Metade do meio de cultura neuronal padrão é mudado a cada dois dias. As culturas são mantidas em meio neurobasal padrão por 7 dias para permitir as células de Schwann para preencher para preencher os neurites do neurónio sensorial. No dia 7, as culturas são alimentadas com meio neuronal padrão suplementado ou não com 50 yg/ml de ácido ascórbico a fim de iniciar formação de lâmina basal e mielinização. 2.1.3. Incubação da droga
No dia 7, o seguinte compostos de teste (sozinhos ou em combinação) são adicionado no meio com 50 yg/ml ácido ascórbico: 58 ΡΕ2437742 (RS)-Baclofeno
Naltrexona D-Sorbitol
Mix7= a combinação dos 3 compostos individuais.
Estes compostos ou combinação de composto são testado nas seguintes concentrações (Tabela 2):
Tabela 2: Concentração de drogas individuais ou em combinação usadas para estudos in vitro da expressão de MBP em co-culturas de TG DRG/SC.
Dose 1 Dose 2 Dose 3 Dose 4 Dose 5 Dose 6 Dose 7 Drogas Naltrexona 5μΜ ΙμΜ 200ηΜ 40ηΜ 8ηΜ 1,6ηΜ 320ρΜ Individuais D-Sorbitol 500μΜ ΙΟΟμΜ 20μΜ 4μΜ 800ηΜ ΙβΟηΜ 32ηΜ (RS) -Baclofeno 5μΜ ΙμΜ 200ηΜ 40ηΜ 8ηΜ 1,6ηΜ 320ρΜ Naltrexona 5μΜ ΙμΜ 200ηΜ 40ηΜ 8ηΜ 1,6ηΜ 320ρΜ Mix7 D-Sorbitol 500 μΜ ΙΟΟμΜ 20μΜ 4μΜ 800ηΜ 160ηΜ 32ηΜ (RS)-Baclofeno 5μΜ ΙμΜ 200ηΜ 40ηΜ 8ηΜ ί, 6ηΜ 320ρΜ
Os compostos teste são incubados em 5 diferentes tempos: 5, 9, 10, 11 e 13 dias.
Três culturas separadas e independentes de DRG (de embriões ratos TG machos) são feitas. Estas condições são avaliadas na presença de ácido ascórbico, 6 poços por condição. A solução pronta para uso de todos os compostos teste é extemporaneamente preparada de uma solução estoque, armazenada a -20°C. Esta solução é preparada uma vez a semana. Metade do meio neuronal padrão suplementado com 59 ΡΕ2437742 compostos teste e ácido ascórbico (cada na concentração IX) são mudadas a cada dois dias. 2.1.4 Protocolo de marcação
Após 5, 9, 10, 11 e 13 dias de incubação, as células são fixadas em uma solução fria de etanol (95%) e ácido acético (5%) por lOmin. As células são permea-bilizadas e bloqueadas com PBS contendo 0,1% saponina e 10% soro de cabra por 15 min. Então, as células são incubadas com um marcador especifico de mielina: anticorpo policlonal anti-proteina básica de mielina (MBP), anticorpo (Sigma 118K0431).
Este anticorpo é revelado com Alexa Fluor 568 IgG de cabra anti-coelho e Alexa Fluor 488 IgG de cabra anti-camundongo (Sonda Molecular 687621, 623962). Os núcleos dos neurónios são rotulados por um marcador fluorescente (Hoechst solução, SIGMA ref B1155). 2.1.5. Processamento de dados
Por poço, 20 fotos são tiradas usando InCell AnalyzerTM 1000 (GE Healthcare) com aumento de 20x. Todas as imagens são tiradas nas mesmas condições. Análises do comprimento total dos axônios mielinizados foram automaticamente feitos (comprimento e área ao redor dos axônios) usando Developer software (GE Healthcare). Todos os valores serão expressos como meio +/- meio s.e. Análises 60 ΡΕ2437742 estatísticas são feitas nas diferentes condições (ANOVA seguida por teste PLSD de Fisher quando permitido). 2.2. Resultados
Efeito sinergético das drogas na eficácia do Mix7
Um importante efeito sinergético das drogas que compõem a combinação do Mix7 é observado na expressão de MBP. De fato, no dia 10 (=17 dias de cultura), a combinação de (RS)- Baclofeno, Naltrexona e D-Sorbitol significativamente aumenta a expressão de MBP nas doses 1 e 6 como mostrado nas Figuras IA e 2A. Por outro lado, as drogas acima usadas individualmente não têm efeito substancial comparadas ao controle (Figuras 1B-D e 2B-D).
Um efeito significante na expressão MBP é também registrado após 10 dias de incubação nas doses 2, 3, 4, 5 e 7 do Mix7 (Figura 3A).
Este efeito é ainda observado no dia 11 com as doses 2-7 (Figura 3B) na forma de uma curva clara em forma sino.
C. Experiências in vivo em modelo animal com CMT Nós testamos os compostos para efeito terapêutico em um rato modelo. 61 ΡΕ2437742
Os grupos experimentais são formados com ratos jovens de ambos os gêneros separadamente. Os ratos são designados para os grupos seguindo a programação de randomização com base no peso do corpo. Em alguns experimentos a randomização é com base nas performances dos ratos nos testes de barra. Ambos os gêneros são representados por grupos controle separados que são numericamente iguais ou maiores que os grupos do tratamento.
Os ratos são tratados cronicamente com drogas -alimentados à força ou injetados por Alzet bomba osmótica subcutânea (DURECT Corporation Cupertino, CA) , dependendo da biodisponibilidade de cada droga durante 3 ou 6 semanas. Em todos os experimentos in vivo realizados, o Mix7 é administrado por gavagem.
Os animais são pesados por duas vezes por semana a fim de ajustar as doses ao crescente peso do corpo. Se a bomba osmótica e escolhida para a administração do tratamento, as doses da droga são calculadas com base na média estimada do peso do corpo dos animais esperado para sua idade no período da duração da bomba (6 semanas) . As bombas são reimplantadas se necessário, com o protocolo de anestesia apropriado.
Testes de comportamento
Cada três ou quatro semanas os animais são 62 ΡΕ2437742 submetidos a um teste de comportamento. Cada teste é conduzido pelo mesmo pesquisador na mesma sala e ao mesmo periodo do dia; essa homogeneidade é mantida durante todo o experimento. Todos os tratamentos e determinação de genótipo são desconhecidos para o pesquisador. "Teste de barra" e "Força de aperto" tem sido principalmente usado para acessar a performance ao longo estudo. 0 programa dos testes de barra pode mudar como o crescimento do animal (a fim de evitar a influencia devido a aprendizagem, por exemplo). 0 ensaio da força de aperto permite detecção de diferenças sutis na performance de aperto que parece ser composto da força muscular, estado de sensibilidade (por exemplo, sensações táteis dolorosas podem mudar os valores medidos da força), componente comportamental ("motivação"). Os valores diferem entre os membros dianteiros e posteriores e depender muito da idade dos animais. 0 teste de força de aperto mede a força com que um animal segura em aperto com suas patas dianteiras ou suas patas traseiras separadamente. Um dinamômetro é colocado com um punho para medir a força (Força Gauge FG-5000A) . 0 rato é mantido pelo experimentador de uma forma que ele agarra o punho seja com suas patas dianteiras ou com suas patas traseiras e puxa gentilmente o rato para trás ate que ele libera o punho. A força medida quando o animal libera o punho é registrada. 63 ΡΕ2437742
Dois testes sucessivos medindo a força das patas dianteiras e dois testes sucessivos medindo a força das patas traseiras por animal são processados; somente a pontuação máxima (uma para patas dianteiras e uma para patas traseiras) é notada (em N). 0 Teste de Barra
Os testes de barra avaliam a capacidade dos ratos de segurar em uma barra fixa. Os ratos Pmp22 que exibem fraqueza muscular apresentam um déficit de performance neste teste (Sereda et al, 1996) . 0 rato é colocado sobre suas quatro patas no meio da barra (diâmetro: 2,5cm; comprimento : 50cm; 30cm acima da mesa). Os testes são realizados consecutivamente; o número e a duração dos testes nos nossos experimentos dependeram dos lotes dos animais. Esta variabilidade nos testes tem sido introduzida a fim de determinar a programação apropriada para a melhor detecção da deficiência motora nos ratos com CMT no curso dos experimentos. índices de performance são registrados em cada sessão: - 0 número de testes necessários para segurar por 60 seg (ou 30 seg para o lote 1, sessão 1 e 2) na vara. - O tempo gasto na barra (isto é, a latência de queda) em cada teste e a média na sessão. Nos procedimentos experimentais onde a sessão termina após o rato ter ficado por um tempo de corte, isto é, 30 ou 60s, na barra, uma 64 ΡΕ2437742 performance do tempo de corte (30 s ou 60 s) é atribuído aos testes não completados (por exemplo, para o lote 8, para um animal que permanece na barra menos que 10 seg nos testes 1, 2 e 3, então por 60seg nos testes 4 e 5, 60s é atribuído para os testes 6 a 10) . - O número de quedas.
Avaliação geral de saúde
Peso do corpo, sinais evidentes (aparência da pelagem, postura do corpo, marcha, tremor etc.) dos animais são monitorados em todo o experimento. A escala de classificação é utilizada para registrar: 0= normal, 1= anormal. A marcha
Cada rato é observado em uma nova gaiola de rato (dimensões 55x33xl8cm) sem palha por cinco minutos. A marcha dos ratos é avaliada com 4 parâmetros: - Pontuação 0: marcha normal (fluida) - Pontuação 1: marcha anormal (não fluida ou o rato tem um leve coxear) - Pontuação 2: incapacidade moderada (o rato arrasta uma perna e é capaz de endireita-la e andar) - Pontuação 3: incapacidade grave (o rato arrasta uma ou ambas suas patas traseiras e é incapaz de endireita-las) . 65 ΡΕ2437742
Teste de plano inclinado 0 aparelho deslizante tinha um plano Plexiglass 30x50cm que pode ser inclinado em um ângulo de 0o (horizontal) a 60°. Cada rato foi inicialmente colocado no plano inclinado de ângulo 25° em uma posição de cabeça para cima (orientado para cima); dois testes separados por lmin são realizadas. 30 min depois, o mesmo experimento e realizado no plano inclinado de ângulo 35°, e então no plano inclinado de ângulo 40°. Durante este tempo o rato foi devolvido à sua gaiola. 0 plano é limpo após cada teste.
As performances dos ratos são avaliadas por 4 pontuações diferentes: -Pontuação 0: sem escorregamento -Pontuação 1: um pequeno escorregamento (uma ou duas patas) -Pontuação 2: um escorregamento moderado (4 patas), mas não até o fim do plano -Pontuação 3: o rato escorrega até bem a parte inferior do plano.
Testes adicionais
Quando apropriado, os ratos são submetidos a uma avaliação eletrofisiológica, medição histológica e o nivel de expressão do RNA pmp22 no nervo ciático é quantificado. 66 ΡΕ2437742
Quantificação de RNA pmp22 no nervo ciático pelo RT-PCR quantitativo O RNA total foi isolado dos nervos ciáticos esquerdos usando Qiazol (ref N°79306, Qiagen Gmbh, Germany) seguido pelo método de purificação de etapa única com RNeasy Mini Kit (ref N° 74106, Qiagen Gmbh, Germany) descrito pelo protocolo do fabricante (Qiagen-RNeasy Fibrous tissue Handbook). A contaminação de DNA foi removida pela digestão com DNase I livre de RNase pelo uso do DNA-free kit (Qiagen-Rnase-free DNase set 1500 Kunits, ref N° 1023460) .
As concentrações de RNA são estimadas por Nano-Drop ND-1000 e um teste de controle de qualidade foi feito por Agilent RNA 6000 nano-chips em um Agilent 2100 Bioanalyzer. A transcrição reversa e o PCR em tempo real: RT-PCR quantitativo (RT-Q-PCR) foi realizada da seguinte forma: 80ng do RNA total foi reverso transcrito usando SuperScript™ II Transcriptase Reversa (Invitrogen, Carlsbad, CA) com Oligo(dT)12-18 (Invitrogen, Carlsbad, CA) em um volume de reação de 20 μΐ. PCR em tempo real foi realizada com um sistema térmico ciclador rápido (LightCycler® 480 II, 384-Poço, Roche, Switzerland). As amplificações são realizadas em um 67 ΡΕ2437742 volume total de 10μ1 com a concentração de primers otimizada entre 130nM e ΙμΜ. Primers e moldes são suplementados com LightCycler® 480 SYBR Green I Master (2x conc. Roche,Cat. Ref N° 04 887 352 001). Nucleot ídeos,
MgCl2, Taq DNA polimerase e tampão estão incluídos na mistura. Um protocolo de amplificação incorporou uma incubação inicial a 95°C por lOmin para a ativação da Taq DNA polimerase seguido de 45 ciclos, com uma desnaturação a
95°C por lOs, anelamento a 60°C por 40s e extensão a 72°C por lOs (a detecção do produto fluorescente foi realizada ao final do período extensão a 72°C por um único modo de aquisição) e finalizado por um ciclo de curva de fusão com desnaturação a 95°C por 5s, anelamento a 63°C por 60s e 95°C (de 63°C a 95°C a taxa de rampa é 0,ll°C/s e a detecção do produto fluorescente foi contínua). Para confirmar a especificidade da amplificação, o produto da PCR de cada par de primer foi submetido a uma análise da curva de fusão. Uma quantificação relativa foi realizada com base no Crossing point (valor Cp) para cada uma das amostras de PCR. O ponto em que a fluorescência de uma amostra aumenta acima da fluorescência do plano de fundo é chamado de "Crossing point" (Cp) da amostra. O gene
Proteína Zero da Mielina (MPZ) de Rattus norvegicus foi usado para normalização (Sereda et al, 2006). As sequências dos primers (sintetizados por Eurofins MWG Operon, Germany) usadas para a análise RT-Q-PCR são: PMP22 - direto: 5'-TGTACCACATCCGCCTTGG-3' (SEQ ID NO: 11) e 68 ΡΕ2437742 ΡΜΡ22 - reverso: 5'-GAGCTGGCAGAAGAACAGGAAC-3' (SEQ ID NO: 12). MPZ - direto: 5' -TGTTGCTGCTGTTGCTCTTC-3' (SEQ ID NO: 13) e MPZ - reverso: 5'-TTGTGAAATTTCCCCTTCTCC-3' (SEQ ID NO: 14) .
Resultados A composição Mixl melhora as performances nos testes de barra em todo procedimento do tratamento (Fig. 4) .
Mixl melhora a pontuação da marcha de ratos transgénicos após 3 e 6 semanas de tratamento como mostrado na Figura 5.
Mixl aumenta as performances de ratos transgénicos após 3, 6, 9 e 12 semanas de tratamento no teste de plano inclinado a 25° descrito na Figura 6.
Figura 7 ilustra o efeito positivo do Mix2 na pontuação da marcha de ratos transgénicos a 25, 35 e 40° no teste de plano inclinado .
Mix7 (dose 3) reduz significativamente a expressão do gene RN A pmp22 no nervo ciático de ratos transgénicos pmp22 (Figura 9). 69 ΡΕ2437742
As performances dos ratos pmp22 tratados com Mix7 (dose 2 e dose 3) são melhoradas no teste de plano inclinado a 35° (Figura 10). Mais especificamente, 29 e 33% dos ratos pertencem ao grupo de boa performance, comparados a 5% para o grupo placebo TG, e 29 e 11% dos ratos pertencem ao grupo de performance pobre comparados a 60% para o grupo placebo TG. O valor p (contra o placebo TG) é igual a 0,0152 para o ratos TG tratados com Mix7-dose 2 e o valor p é igual a 0,002 para o ratos TG tratados com Mix7-dose 3 (contra o placebo TG).
Mix7-dose 3 aumenta significativamente o tempo de latência de queda dos ratos pmp22 nos testes de barra após 9 semanas de tratamento (Figura 11): linha tracejada preta, p=4,56.1CT2, n=18. Diferença significativa entre placebo de ratos TG (linha preta lisa, n=20) e placebo de ratos WT (linha cinza lisa, p=3,82.10~7, n=18) é também observada. A Figura 12 ilustra a melhora da força de aperto dos ratos pmp22 tratados com o Mix7-dose 3. A Figura 13 mostra a correlação significativa entre os tempo de latência dos testes de barra (após 9 semanas de tratamento com o Mix7-dose 3) e o nivel de expressão de RNA pmp22. A Figura 14 exibe a correlação significativa entre os tempo de latência dos testes de barra após 9 semanas de tratamento com Mix7-dose 3 e a velocidade de condução do nervo sensitivo (cauda). 70 ΡΕ2437742
Resultados semelhantes são obtidos para outras combinações (veja Tabela 3).
Tabela 3
Combinação Fenótipo da doença em rato PMP22 Mixl melhora Mix2 melhora Mix3 melhora Mix4 melhora Mix5 melhora Mix6 melhora
Estes dados mostram que, in vivo, as combinações e regimes desta invenção permitem efetivo tratamento de CMT. D. Efeito da neuropatia tóxica em um modelo in vivo
Os tratamentos ou regimes da droga são oralmente administrados do dia antes da primeira injeção intraperitoneal de Oxaliplatina 3mg/kg (D -1) até o dia antes do último dia de teste (D16). Os animais que pertencem ao grupo tratado com Oxaliplatina são dosados diariamente com água destilada (10 ml/kg). Os animais são dosados com o tratamento teste e água destilada diariamente durante as manhãs enquanto que a Oxaliplatina é administrada à tarde. 71 ΡΕ2437742
Durante os dias de teste (isto é, Dl, D4, D10), o tratamento e a água destilada são administrados após o teste. Em relação ao dia de teste (D4), incluindo a administração de compostos e veículos e injeção de Oxaliplatina, o tratamento e água destilada são administrados antes da injeção de Oxaliplatina após o teste. Os animais do grupo de tratamento de referência são dosados somente durante os dias de teste (isto é, Dl, D4, D10 e Dl 7) . A alodinia ao frio é avaliada medindo as respostas a estimulação térmica não nociceptiva (teste de acetona) no Dl (em torno de 24h após a primeira injeção de Oxaliplatina 3 mg/kg (efeito agudo de Oxaliplatina) , no D4 e D10 (efeito crónico de Oxaliplatina) e no D17 (efeito residual de Oxaliplatina um semana após de conclusão do tratamento). 0 teste é feito usando o teste de acetona 2h após a administração da referência. A substância referência é Gabapentina, 100 mg/kg por os (uma vez ao dia x 4 dias de teste) .
Teste de acetona A alodinia ao frio é avaliada usando o teste de acetona. Neste teste, a latência da retratação da pata traseira é medidas após aplicação de uma gota de acetona na 72 ΡΕ2437742 superfície plantar de ambas as patas traseiras (tempo de reação) e a intensidade da resposta é marcada (pontuação do frio). 0 tempo de reação do efeito de o resfriamento da acetona é medido com 20seg (corte) após a aplicação da acetona. As respostas a acetona são também classificados na seguinte escala de 4 pontos: 0 (sem resposta); 1 (retratação rápida, sacudida da pata); 2 (retratação demorada ou sacudida acentuada da pata); 3 (sacudida repetida da pata com lambida ou mordida).
Seis testes por rato são realizados. Para cada grupo experimental, os resultados são expressos como a cumulativa pontuação do frio definida como a soma das pontuações 6 para cada rato junto ± SEM. A pontuação mínima sendo 0 (sem response a qualquer um dos 6 testes) e a pontuação máxima possível sendo 18 (sacudida repetida da pata com lambida ou mordida em cada dos seis testes).
Fonte de Gabapentina: Zhejiang Chiral Medicine
Chemicals, China
Fonte de Oxaliplatina: Sigma, France
Os resultados estão representados na Figura 8. Eles mostram claramente um efeito protetivo da composição desta invenção na neuropatia induzida por oxaliplatina. 73 ΡΕ2437742 E. Efeito de ALS em um modelo in vivo
Animal modelo Nós escolhemos o rato modelo SODlG93A (gerado por Howland et al) para imitar a patologia Esclerose Lateral Amiotrófica. Este modelo superexpressa o gene mutado S0D1 na medula espinhal, muitas regiões do cérebro bem como tecidos periféricos. 0 inicio da doença neuromotora deste modelo é de cerca de 115 dias; aparece como a marcha anormal do membro traseiro. Em poucos dias, surge a paralisia do membro traseiro.
Procedimentos experimentais Nós obtivemos colónias pelo cruzamento de ratos SOD1g93a com fêmeas de ratos Sprague Dawley. Os ratos SOD1g93a heterozigotos são identificados com reação de cadeia polimerase (PCR) do DNA da cauda com primers específicos para hSODl [1]. Os animais são mantidas em uma sala com controle de iluminação (luzes acesas 0500-1900 h) e temperatura (23±1°C), e é dado livre acesso a comida e água. Todo os procedimentos com animais no presente estudo são realizadas de acordo com o orientações padrão de cuidados com animais. A medição do peso do corpo foi realizada toda semana e testes de comportamento começaram em uma idade de 60 dias e continuou até o ponto final. Os tratamentos são 74 ΡΕ2437742 administradas todos os dias por via oral ou subcutânea a partir da idade de 5 semanas. 1. Teste de observação: caracterização do aspecto geral:
Cada rato foi observado em uma nova gaiola de rato (dimensões 55x33xl8cm) sem palha por cinco minutos. 5 diferentes parâmetros são registrados: A marcha - Pontuação 0 : marcha normal (fluida) - Pontuação 1 : marcha anormal (não fluida ou o rato tem um leve coxear) - Pontuação 2 : incapacidade moderada (o rato arrasta uma perna e é capaz de endireita-la e andar) - Pontuação 3 : incapacidade grave (o rato arrasta uma ou ambas suas patas traseiras e é incapaz de endireita-las) O aspecto da pelagem - Pontuação 0 : pelagem sedosa e limpa - Pontuação 1 : piloereção ou pelagem suja O tremor - Pontuação 0 - Pontuação 1 : sem tremor : tremor 75 ΡΕ2437742 A posição do corpo - Pontuação 0 : normal - Pontuação 1: anormal (achatadas ou dorso arqueado) A posição das patas traseiras - Pontuação 0 : normal - Pontuação 1 : patas traseiras espalhadas 2. 0 teste de pontuação motora: caracterização do déficit motor
Este teste avalia a capacidade dos ratos de se endireitarem em 30 seg de ser virado em qualquer lado (reflexo de endireitamento) (Gale et al) .
Um sistema de pontuação não paramétrica foi usado seguindo estes critérios (Matsumoto et al, Thonhoff et al):
Pontuação 0: o rato é incapaz de se endireitar de qualquer lado em 30 seg - Pontuação 1: o rato é incapaz de se endireitar de somente um lado em 30 seg - Pontuação 2: o rato é capaz de se endireitar de ambos lados em 30 seg mas é incapaz de levantar na gaiola; está sempre arrastando algumas partes do corpo - Pontuação 3: o rato é capaz de se endireitar de ambos 76 ΡΕ2437742 lados em 30 seg, é incapaz de levantar na gaiola mas não está arrastando algumas partes do corpo - Pontuação 4: o rato é capaz de se endireitar de ambos lados em 30 seg, é capaz de levantar na gaiola mas tem visíveis déficits funcionais - Pontuação 5: o rato é capaz de se endireitar de ambos lados em 30 seg, é capaz de levantar na gaiola e não tem visíveis déficits funcionais. O ponto final da doença é fixado na Pontuação 0; o rato é então sacrificado. 3. Teste de plano inclinado: caracterização do déficit motor O aparelho deslizante tinha um plano Plexiglass 30x50cm que pode ser inclinado em um ângulo de 0o (horizontal) a 60°. Cada rato foi inicialmente colocado no plano inclinado de ângulo 25° em uma posição de cabeça para cima (orientado para cima); dois testes separados por lmin são realizadas. 30 min depois, o mesmo experimento é realizado no plano inclinado de ângulo 35°, e então no plano inclinado de ângulo 40°. Durante este tempo o rato foi devolvido à sua gaiola. 0 plano é limpo após cada teste.
As performances dos ratos são avaliadas por 4 pontuações diferentes: 77 ΡΕ2437742 - Pontuação 0: sem escorregamento
Pontuação 1: um pequeno escorregamento (uma ou duas patas) - Pontuação 2: um escorregamento moderado (4 patas), mas não até o fim do plano -Pontuação 3: o rato escorrega até bem a parte inferior do plano. 4. O teste da tela de arame: caracterização da capacidade motora em situação dificil
Uma tela de arame foi colocada em contato com uma caixa no topo (em um ângulo de 70°) e a borda de uma mesa na parte inferior. Cada rato foi colocado na parte inferior da tela de arame e ele foi motivado a subir, colocando a seus companheiros de ninhada no topo da caixa. Cada rato foi treinado uma vez por semana (3 testes). O parâmetro registrado foi o tempo de latência para chegar ao topo da tela de arame. 5. O teste de campo aberto: caracterização da atividade locomotora A atividade locomotora foi medida em uma caixa Plexiglass (45x45x30 cm, Acti-Track por BIOSEB, Lyon, France) com 16 feixes de fotocélula seguindo os dois eixos, 1 e 5 cm acima do chão. 78 ΡΕ2437742 A atividade espontânea e exploratória de cada rato foi avaliada durante 3 horas. 4 parâmetros são registrados (a distância total percorrida, o número da criação, a percentagem da distância percorrida e a percentagem do tempo gasto no centro do campo aberto).
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<223> iniciador direto_Pmp22-FL <400> 5 gctctgagcg tgcatagggt ac 22
<210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Sequência artificial <22 0> <223> iniciador direto Rpll3A-FL <400> 6 tcgggtggaa gtaccagcc 19
<210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Sequência artificial 90 ΡΕ2437742 <22 0> <223> iniciador reverso Pmp22-red <4 0 0> 7 agggagggag gaaggaaacc agaaa 25 <210> <211> 8 28 <212> <213> DNA Sequência artificial <22 0> <223> iniciador reverso-Rpll3A-red <400> 8 tgacagctac tctggaggag aaacggaa <210> <211> <212> <213> 9 19 DNA sequência artificial <22 0> <223> SRY - direto <4 0 0> 9 gagagaggca caagttggc 19 <210> <211> 10 19 <212> <213> DNA sequência artificial <22 0> <223> SRY - reverso <4 0 0> 10 gcctcctgga aaaagggcc 19 <210> <211> 11 19 <212> <213> DNA sequência artificial <22 0> <223> PMP22-direto <4 0 0> 11 tgtaccacat ccgccttgg 19 <210> <211> 12 22 <212> <213> DNA sequência artificial 91 ΡΕ2437742 <22 0> <223> ΡΜΡ22 - reverso <4 0 0> 12 gagctggcag aagaacagga ac 22
<210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> sequência artificial <22 0> <223> MPZ - direto <4 0 0> 13 tgttgctgct gttgctcttc 20
<210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> sequência artificial <22 0> <223> MPZ - reverso <4 0 0> 14 ttgtgaaatt tccccttctc c 21
Lisboa, 24 de outubro de 2014

Claims (8)

  1. ΡΕ2437742 1 REIVINDICAÇÕES 1. Uma composição compreendendo baclofeno, D-sorbitol e naltrexona, seus sais, enantiómeros ou racematos, para administração simultânea, separada ou sequencial a um indivíduo mamífero.
  2. 2. A composição da reivindicação 1, que compreende ainda um excipiente ou veículo farmaceuticamente adequado.
  3. 3. Uma composição de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que os ditos compostos são formulados com uma biomolécula, uma micela ou lipídios formadores de lipossoma ou emulsões de óleo em água, ou nanopartículas ou micropartículas peguiladas ou sólidas para administração oral ou parenteral ou intratecal.
  4. 4. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, que é uma formulação líquida adequada para administração oral.
  5. 5. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, para utilização no tratamento da doença de Charcot-Marie-Tooth ("CMT"), neuropatia tóxica ou Esclerose Lateral Amiotrófica ("ALS") num indivíduo mamífero. 2 ΡΕ2437742
  6. 6. A composição da reivindicação 5, para utilização no tratamento da CMTl num indivíduo mamífero.
  7. 7. A composição para utilização da reivindicação 5 ou 6, em que o indivíduo mamífero é um indivíduo humano.
  8. 8. Baclofeno, D-sorbitol e naltrexona, seus sais, enantiómeros ou racematos, para administração simultânea, separada ou sequencial para utilização no tratamento da doença de CMT, neuropatia tóxica ou ALS, num indivíduo mamífero. Lisboa, 24 de outubro de 2014
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