ES2641191T3 - Nuevas composiciones para tratar la CMT y trastornos relacionados - Google Patents

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ES2641191T3 ES14176796.2T ES14176796T ES2641191T3 ES 2641191 T3 ES2641191 T3 ES 2641191T3 ES 14176796 T ES14176796 T ES 14176796T ES 2641191 T3 ES2641191 T3 ES 2641191T3
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Serguei Nabirochkin
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Abstract

Una composición que comprende rapamicina y mifepristona, sales, enantiómeros o racematos de las mismas, para la administración simultánea, por separado o secuencial a un sujeto mamífero.

Description

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DESCRIPCION
Nuevas composiciones para tratar la CMT y trastornos relacionados
La presente invencion se refiere a composiciones y a su uso para el tratamiento de la enfermedad de Charcot-Marie- Tooth y trastornos relacionados.
La enfermedad de Charcot-Marie-Tooth (“CMT”) es una polineuropatfa periferica genetica huerfana. Afectando a aproximadamente a 1 de cada 2.500 individuos, esta enfermedad es el trastorno hereditario mas comun del sistema nervioso periferico. Su aparicion se produce normalmente durante la primera o segunda decada de vida, aunque puede detectarse en la infancia. La evolucion de la enfermedad es cronica con degeneracion neuromuscular gradual. La enfermedad es invalidante con casos de dolor neurologico acompanante y discapacidad muscular extrema. La CMT es una de las patologfas geneticas mejor estudiadas, con aproximadamente 30.000 casos en Francia. Aunque la mayona de los pacientes con CMT alojan una duplicacion de un fragmento del cromosoma 17 que contiene un gen de mielina: PMP22 (forma CMT1A), dos docenas de genes han sido implicados en diferentes formas de la CMT. Por consiguiente, aunque es de origen monogenico, esta patologfa manifiesta heterogeneidad clmica debido a posibles genes moduladores. Los genes mutados en pacientes con CMT se agrupan alrededor de vfas moleculares estrechamente conectadas que afectan la diferenciacion de las celulas de Schwann o neuronas o cambian la interaccion de estas celulas en nervios perifericos.
La explotacion de datos publicamente disponibles que describen mecanismos moleculares y manifestaciones patologicas de la enfermedad de CMT1A permitio a los inventores priorizar unos cuantos modulos celulares funcionales - la regulacion de la transcripcion del gen PMP22, el plegamiento/degradacion de la protema PMP22, la proliferacion y apoptosis de celulas de Schwann, la muerte de neuronas, la deposicion y remodelacion de la matriz extracelular, la respuesta inmunitaria - como potenciales dianas legttimas de las intervenciones terapeuticas relevantes para la CMT. El impacto combinado de estos modulos funcionales desregulados sobre la aparicion y la progresion de manifestaciones patologicas de la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth justifica una potencial eficacia del tratamiento combinatorio para la CMT.
La solicitud de patente internacional WO2009/068659 describe un metodo de identificacion de candidatos a farmacos para el tratamiento de la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth construyendo un modelo dinamico de la patologfa y eligiendo como diana vfas celulares funcionales que son relevantes en la regulacion de la enfermedad de CMT.
La solicitud de patente internacional WO2009/068668 describe composiciones para el tratamiento de la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth que comprenden al menos dos compuestos seleccionados del grupo de multiples candidatos a farmacos.
El documento EP0778023 se refiere al uso de rapamicina y de ciertos derivados de la misma, como agente neuroprotector, especialmente con relacion a la toxicidad del glutamato. Slavik et al., 2006 se refieren al uso de rapamicina sola en el ambito de un ensayo abierto en pacientes con esclerosis multiple, con el fin de determinar el mecanismo de accion del farmaco in vivo. Pomara et al., 2002 se refieren a un ensayo para examinar los efectos de un antagonista del receptor de glucocorticoides central tal como mifepristona en la cognicion en la enfermedad de Alzheimer.
Sumario de la invencion
El fin de la presente invencion es proporcionar nuevas combinaciones terapeuticas para tratar CMT y trastornos relacionados. Por tanto, la invencion se refiere a nuevas composiciones y sus usos para tratar CMT, especialmente CMT1A, y trastornos relacionados, en particular neuropatfa toxica y esclerosis lateral amiotrofica, usando combinaciones de farmacos particulares.
El objeto de la presente invencion se refiere a una composicion como se define en las reivindicaciones.
Mas particularmente, la invencion se refiere a una composicion que comprende rapamicina y mifepristona, sales, enantiomeros o racematos de las mismas, para la administracion simultanea, por separado o secuencial a un sujeto mairnfero. Un objetivo de esta invencion se refiere mas espedficamente a una composicion que ademas comprende un compuesto seleccionado entre acetazolamida, albuterol, amilorida, aminoglutetimida, amiodarona, aztreonam, baclofeno, balsalazida, betama, betanecol, bicalutamida, bromocriptina, bumetanida, buspirona, carbacol, carbamazepina, carbimazol, cevimelina, ciprofloxacina, clonidina, curcumina, ciclosporina A, diazepam, diclofenaco, dinoprostona, disulfiram, D-sorbitol, dutasterida, estradiol, exemestano, felbamato, fenofibrato, finasterida, flumazenilo, flunitrazepam, flurbiprofeno, furosemida, gabapentina, galantamina, haloperidol, ibuprofeno, isoproterenol, ketoconazol, ketoprofeno, L-carnitina, liotironina (T3), litio, losartan, loxapina, meloxicam, metaproterenol, metaraminol, metformina, metacolina, metimazol, metilergonovina, metoprolol, metirapona, miconazol, mifepristona, nadolol, naloxona, naltrexona, norfloxacina, pentazocina, fenoxibenzamina, fenilbutirato, pilocarpina, pioglitazona, prazosina, propiltiouracilo, raloxifeno, rapamicina, rifampina, simvastatina, espironolactona, tacrolimus, tamoxifeno, trehalosa, trilostano, acido valproico, sus sales o profarmacos.
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Otro objetivo de esta invencion es una composicion que comprende rapamicina y mifepristona, y un compuesto seleccionado entre pilocarpina, baclofeno, metimazol, sales, enantiomeros o racemates de los mismos, para administracion simultanea, por separado o secuencial a un sujeto mairnfero.
Otro objeto de la presente invencion es una composicion como se ha descrito anteriormente que comprende ademas uno o varios excipientes o vehteulos farmaceuticamente aceptables (es decir, una composicion farmaceutica).
Otro objeto de la presente invencion se refiere a una composicion como se ha descrito anteriormente para tratar la CMT o un trastorno relacionado.
Otro objeto de la presente invencion se refiere al uso de una combinacion de compuestos como se ha descrito anteriormente para la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de la CMT o un trastorno relacionado.
La invencion describe tambien un metodo para tratar la CMT o un trastorno relacionado, comprendiendo el metodo administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de una composicion como se ha definido anteriormente.
Esta invencion tambien describe un metodo de preparacion de una composicion farmaceutica, comprendiendo el metodo mezclar los compuestos anteriores con un excipiente o vehteulo apropiado.
Esta invencion describe tambien un metodo para tratar CMT1A en un sujeto, comprendiendo el metodo administrar al sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de un compuesto o combinacion de compuestos como se ha descrito anteriormente.
Esta invencion describe tambien un metodo para tratar neuropatfa toxica en un sujeto, comprendiendo el metodo administrar al sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de un compuesto o combinacion de compuestos como se ha descrito anteriormente.
Esta invencion describe tambien un metodo para tratar la esclerosis lateral amiotrofica (ELA) en un sujeto, comprendiendo el metodo administrar al sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de un compuesto o combinacion de compuestos como se ha descrito anteriormente.
Cualquiera de los diversos usos o metodos de tratamiento descritos en la presente memoria puede incluir tambien una etapa opcional de diagnostico de un paciente que tiene CMT o un trastorno relacionado, particularmente CMT1A, o de identificacion de un individuo en riesgo de desarrollar CMT o un trastorno relacionado, particularmente CMT1A.
A este respecto, la invencion describe tambien un metodo para tratar CMT, particularmente CMT1A, comprendiendo el metodo: (1) determinar si un sujeto tiene CMT, particularmente CMTlA, y (2) tratar el sujeto que tiene CMT, particularmente CMT1A, con una cantidad eficaz de una combinacion de compuestos como se ha descrito anteriormente. La determinacion de si un sujeto tiene CMT, particularmente CMT1A, puede hacerse por diversas pruebas conocidas per se en la tecnica, tales como ensayos de DNA.
La invencion se puede usar para tratar CMT o un trastorno relacionado en cualquier sujeto mamffero, particularmente sujetos humanos, mas preferiblemente CMT1A.
Leyenda de las figuras de los dibujos
Figura 1. Efecto sinergico de la combinacion de farmacos, dosis 1: efecto de A) Mezcla 7 (dosis 1, dfa 10), B) D- sorbitol (SRB, 500 |iM, dfa 10), C) (R/S)-baclofeno (BCL, 5 |iM, dfa 10) y D) naltrexona (NTX, 5 |iM, dfa 10) sobre la expresion de MBP. *: p<0,05: significativamente diferente del control (=acido ascorbico) (ensayo ANOVA de una via seguido de ensayo de Fisher a posteriori); ns: estadfsticamente no diferente.
Figura 2. Efecto sinergico de la combinacion de farmacos, dosis 6: A) Mezcla 7 (dosis 6, dfa 10), B) SRB (160 nM, dfa 10), C) BCL (1,6 nM, dfa 10) y D) NTX (1,6 nM, dfa 10) sobre la expresion de MBP. *: p<0,05: significativamente diferente del control (=acido ascorbico) (ensayo ANOVA de una via seguido de ensayo de Fisher a posteriori); ns: estadfsticamente no diferente.
Figura 3. Efecto positivo de la Mezcla 7 (7 dosis) A) en el dfa 10 y B) en el dfa 11, en co-incubacion con acido ascorbico en co-cultivos de PMP22 TG sobre la expresion de MBP en porcentaje de control (= acido ascorbico). Ensayo ANOVA de una via seguido de ensayo de Fisher a posteriori.
Figura 4. Efecto positivo sobre ratas macho del tratamiento de 3 y 6 semanas con la Mezcla 1 medido usando la prueba de la barra. Las latencias se midieron como la media de los dos primeros ensayos de las pruebas (las barras blancas representan ratas de control tratadas con placebo; las barras negras representan ratas transgenicas tratadas con placebo; las barras grises representan ratas transgenicas tratadas con la Mezcla 1. **: p<0,01. Las estadfsticas se realizan con la prueba de Student bilateral).
Figura 5. Efecto positivo sobre el modo de andar de ratas macho del tratamiento de 3 y 6 semanas (respectivamente
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la grafica izquierda y derecha) con la composicion de la Mezcla 1 (las barras blancas representan el modo de andar fluido; las barras grises representan el modo de andar no fluido; las barras negras representan ratas con una grave incapacidad para andar. Las estadfsticas se realizan con la prueba de Student bilateral).
Figura 6. Efecto positivo sobre ratas macho de la composicion de la Mezcla 1 en ratas usando la prueba del plano inclinado (25°). Las ratas se examinaron despues de 3, 6, 9 y 12 semanas de tratamiento (las barras blancas representan ratas de control tratadas con placebo; las barras negras representan ratas transgenicas tratadas con placebo; las barras grises representan ratas transgenicas tratadas con la Mezcla 1. *: p<0,05. Las estadfsticas se realizan con la prueba de Student bilateral).
Figura 7. Efecto positivo sobre ratas hembra del tratamiento de 3 semanas con la composicion de la Mezcla 2 en ratas usando una prueba del plano inclinado (las barras blancas representan ratas de control tratadas con placebo; las barras negras representan ratas transgenicas tratadas con placebo; las barras grises representan ratas transgenicas tratadas con la Mezcla 2. **: p<0,01. Las estadfsticas se realizan con la prueba de Student bilateral).
Figura 8. Efecto protector sobre ratas macho de la Mezcla 1 sobre neuropatfa inducida por oxaliplatino (las barras blancas representan ratas de tipo natural (abreviadamente WT por la expresion inglesa Wild Type) tratadas con placebo; las barras negras representan ratas de tipo natural tratadas con el producto de referencia gabapentina; las barras grises representan ratas de tipo natural tratadas con la mezcla 1. *: p<0,05; **: p<0,01. Las estadfsticas se realizan con la prueba de Student bilateral).
Figura 9. Disminucion significativa de la expresion de RNA de PMP22 en animales transgenicos tratados en comparacion con ratas transgenicas PMP22, observada despues de 9 semanas de tratamiento con la dosis 3 de la Mezcla 7 (MPZ como gen de referencia, Sereda et al., 1996) (p = 0,0015). Tambien se han confirmado la integracion transgenica y la sobre-expresion del gen PMP22; el RNA de PMP22 en ratas PMP22 transgenicas se sobre-expreso 1,8 veces en comparacion con sus controles de companeros de camada de tipo natural (p < 1.10-4). La extraccion de RNA de PMP22 se realizo en nervios ciaticos de ratas macho de 16 semanas (n=18 para el tipo natural, n=20 para las ratas transgenicas y n=18 para ratas transgenicas (TG) tratadas con la dosis 3 de la Mezcla 7). El analisis estadfstico se realizo usando la prueba de la t de Welch.
Figura 10. Se realizo un analisis de agrupacion en la puntuacion de la prueba del plano inclinado a 35° (para distribuir en las clases de rendimiento malo, intermedio y bueno) en todos los puntos de tiempo de la evaluacion (se analizaron juntas 3, 6 y 9 semanas de tratamiento). Se observo una diferencia significativa entre ratas WT y TG con placebo: 68 % de las WT pertenedan al grupo de rendimiento bueno y solo el 5 % de las TG con placebo pertenedan a este grupo (p=0,0003). La dosis 2 y la dosis 3 de la Mezcla 7 mejoraron los rendimientos de ratas TG. Los analisis estadfsticos se realizaron aplicando una prueba de tendencia al 5% de nivel de significancia (n=18 para ratas WT con placebo, n=20 para ratas TG con placebo, n=17 para ratas TG tratadas con la dosis 2 de la Mezcla 7, n=18 para ratas TG tratadas con la dosis 3 de la Mezcla 7).
Figura 11. Las latencias de cafda de ratas TG en la prueba de la barra despues de 9 semanas de tratamiento con la dosis 3 de la Mezcla 7 se analizaron usando un modelo de Cox con un estimador de la varianza de tipo sandwich y se compararon con las de las ratas TG con placebo de referencia aplicando una prueba del orden logantmico al 5 % de nivel de significancia. La dosis 3 de la Mezcla 7 aumento significativamente la latencia de cafda de ratas TG despues de 9 semanas de tratamiento.
Figura 12. La fuerza de agarre de grupos de animales de tipo natural, transgenicos con placebo y transgenicos tratados con la dosis 3 de la Mezcla 7 diariamente durante 9 semanas se modelizo usando un modelo de Cox con un estimador de la varianza de tipo sandwich con respecto a todos los tiempos despues de tratamiento (3, 6 y 9 semanas) y se compararon con la de las ratas TG con placebo de referencia aplicando una prueba del orden logantmico al 5% de nivel de significancia. Los valores de p correspondientes estaban presentes en curvas de Kaplan-Meier. Se observo una disminucion significativa de la fuerza de agarre de las patas delanteras de ratas transgenicas con placebo (lmea continua negra, n=21) en comparacion con la de las ratas WT (lmea continua gris, p=1,45.10-5, n=19). El tratamiento con la dosis 3 de la Mezcla 7 aumento significativamente la fuerza de las patas delanteras (lmea de puntos negra; p=0,03, n=18).
Figura 13. Una prueba de correlacion de Pearson mostro una correlacion significativa entre el tiempo de latencia de cafda en la prueba de la barra (despues de 9 semanas de tratamiento) y el nivel de expresion de RNA de PMP22: p=1,6.10-4 (ratas WT, TG con placebo y TG tratadas con la dosis 3 de la Mezcla 7 analizadas juntas); p=0,07 (ratas TG con placebo y TG tratadas con la dosis 3 de la Mezcla 7 analizadas juntas). Cuanto menor era la expresion de RNA de PMP22, mejores fueron los rendimientos de la prueba de la barra. Las ratas macho teman 16 semanas (n=18 para ratas WT, drculos blancos; n=20 para ratas TG con placebo, drculos negros y n=18 para ratas TG tratadas con la dosis 3 de la Mezcla 7, triangulos blancos).
Figura 14. Una prueba de correlacion de Pearson mostro una correlacion significativa entre el tiempo de latencia de cafda en la prueba de la barra (despues de 9 semanas de tratamiento) y la velocidad de conduccion del nervio sensible (NCV): p=1,34.10-6 (ratas Wt, TG con placebo y TG tratadas con la dosis 3 de la Mezcla 7 analizadas juntas) y p=0,04 (ratas TG con placebo y TG tratadas con la dosis 3 de la Mezcla 7 analizadas juntas). Cuanto mayor
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era la velocidad de conduccion, mejores fueron los rendimientos en la prueba de la barra. Las ratas macho teman 16 semanas (n=18 para ratas WT, drculos blancos; n=20 para ratas TG con placebo, drculos negros y n=18 para ratas TG tratadas con la dosis 3 de la Mezcla 7, triangulos blancos).
Descripcion detallada de la invencion
La presente invencion proporciona nuevos enfoques terapeuticos para tratar la CMT o trastornos relacionados. La invencion describe nuevas combinaciones de farmacos que permiten una correccion eficaz de tales enfermedades y pueden usarse en cualquier sujeto mairnfero.
Dentro del contexto de la presente invencion, la CMT incluye CMT1A, CMT1B, CMT1C, CMT1D, CMT1X, CMT2A, CMT2B, CMT2D, CMT2E, CMT2-P0, CMT4A, CMT4B1, CMT4B2, CMT4D, CMT4F, CMT4 o AR-CMT2A, mas preferiblemente CMT1A.
Dentro del contexto de la presente invencion, el termino “trastorno relacionado con la CMT” designa otras enfermedades asociadas con la expresion anomala del gen PMP22 que conduce a la mielinizacion anomala y perdida de neuronas. El termino “trastorno relacionado con la CMT” incluye mas particularmente enfermedad de Alzheimer (EA), demencia senil de tipo EA (DSTA), enfermedad de Parkinson, demencia de cuerpos de Lewis, demencia vascular, autismo, deterioro cognitivo leve (DCL), deterioro de la memoria asociado a la edad (DMAE) y problemas asociados con el envejecimiento, parkinsonismo postencefalico, esquizofrenia, depresion, enfermedad bipolar y otros trastornos del humor, enfermedad de Huntington, enfermedades de las neuronas motoras, incluyendo esclerosis lateral amiotrofica (ELA), esclerosis multiple, neuropatfas idiopaticas, neuropatfa diabetica, neuropatfa toxica, incluyendo neuropatfa inducida por tratamientos con farmacos, neuropatfas provocadas por VIH, radiacion, metales pesados y estados de deficiencia de vitaminas, neurodegeneracion basada en priones, incluyendo enfermedad de Creutzfeld-Jakob (ECJ), encefalopatfa espongiforme bovina (EEB), smdrome de Gerstmann- Straussler-Scheinker (GSS), insomnio familiar fatal (IFF) y smdrome de Kuru y Alper.
En una realizacion preferida, “trastorno relacionado con la CMT” designa una neuropatfa toxica, particularmente neuropatfas inducidas por farmacos, o ELA.
Como se usa en la presente memoria, “tratamiento” de un trastorno incluye la terapia, prevencion, profilaxis, retraso o reduccion del dolor provocado por el trastorno. El termino tratamiento incluye en particular el control de la progresion de la enfermedad y smtomas asociados.
Tambien el termino “compuesto” designa los compuestos qmmicos que se mencionan espedficamente en la solicitud, asf como cualquier composicion farmaceuticamente aceptable con sus sales, hidratos, esteres, eteres, isomeros, racematos, conjugados y profarmacos. Los compuestos enumerados en la presente solicitud tambien pueden identificarse con su numero CAS correspondiente.
Por tanto, los compuestos preferidos usados en la invencion son rapamicina (CAS 53123-88-9) y sus posibles sales, enantiomeros, racematos, profarmacos y derivados; mifepristona (CAS 84371-65-3) y sus posibles sales,
enantiomeros, racematos, profarmacos y derivados; pilocarpina (CAS 54-71-7) y sus posibles sales, enantiomeros, racematos, profarmacos y derivados; baclofeno (CAS 1134-47-0) y sus posibles sales, enantiomeros, racematos, profarmacos y derivados; metimazol (CAS 60-56-0) y sus posibles sales, enantiomeros, racematos, profarmacos y derivados. Otros compuestos descritos en la invencion son sorbitol (CAS 50-70-4) y sus posibles sales, enantiomeros, racematos, profarmacos y derivados; naltrexona (CAS 16590-41-3) y sus posibles sales,
enantiomeros, racematos, profarmacos y derivados; ketoprofeno (CAS 22071-15-4) y sus posibles sales,
enantiomeros, racematos, profarmacos y derivados; flurbiprofeno (CAS 5104-49-4) y sus posibles sales,
enantiomeros, racematos, profarmacos y derivados. Otros compuestos usados en la invencion son acetazolamida (CAS 59-66-5) y sus posibles sales, enantiomeros, profarmacos y derivados; albuterol (CAS 18559-94-9) y sus posibles sales, enantiomeros, profarmacos y derivados; amilorida (CAS 2016-88-8) y sus posibles sales, enantiomeros, profarmacos y derivados; aminoglutetimida (CAS 125-84-8) y sus posibles sales, enantiomeros, profarmacos y derivados; amiodarona (CAS 1951-25-3) y sus posibles sales, enantiomeros, profarmacos y derivados; aztreonam (CAS 78110-38-0) y sus posibles sales, enantiomeros, profarmacos y derivados; baclofeno (CAS 1134-47-0) y sus posibles sales, enantiomeros, profarmacos y derivados; balsalazida (CAS 80573-04-2) y sus posibles sales, enantiomeros, profarmacos y derivados; betama (cAs 107-43-7) y sus posibles sales, enantiomeros, profarmacos y derivados; betanecol (CAS 674-38-4) y sus posibles sales, enantiomeros, profarmacos y derivados; bicalutamida (CAS 90357-06-5) y sus posibles sales, enantiomeros, profarmacos y derivados; bromocriptina (CAS 25614-03-3) y sus posibles sales, enantiomeros, profarmacos y derivados; bumetanida (CAS 28395-03-1) y sus posibles sales, enantiomeros, profarmacos y derivados; buspirona (CAS 36505-84-7) y sus posibles sales, enantiomeros, profarmacos y derivados; carbacol (CAS 51-83-2) y sus posibles sales, enantiomeros, profarmacos y derivados; carbamazepina (CAS 298-46-4) y sus posibles sales, enantiomeros, profarmacos y derivados; carbimazol (CAS 22232-54-8) y sus posibles sales, enantiomeros, profarmacos y derivados; cevimelina (CAS 107233-08-9) y sus posibles sales, enantiomeros, profarmacos y derivados; ciprofloxacina (CAS 85721-33-1) y sus posibles sales, enantiomeros, profarmacos y derivados; clonidina (CAS 4205-90-7) y sus posibles sales, enantiomeros, profarmacos y derivados; curcumina (CAS 458-37-7) y sus posibles sales, enantiomeros, profarmacos y derivados; ciclosporina A (CAS 59865-13-3) y sus posibles sales, enantiomeros, profarmacos y derivados; diazepam (CAS 439-14-5) y sus
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posibles sales, enantiomeros, profarmacos y derivados; diclofenaco (CAS 15307-86-5) y sus posibles sales, enantiomeros, profarmacos y derivados; dinoprostona (CAS 363-24-6) y sus posibles sales, enantiomeros, profarmacos y derivados; disulfiram (CAS 97-77-8) y sus posibles sales, enantiomeros, profarmacos y derivados; D- sorbitol (CAS 50-70-4) y sus posibles sales, enantiomeros, profarmacos y derivados; dutasterida (CAS 164656-23-9) y sus posibles sales, enantiomeros, profarmacos y derivados; estradiol (CAS 50-28-2) y sus posibles sales, enantiomeros, profarmacos y derivados; exemestano (CAS 107868-30-4) y sus posibles sales, enantiomeros, profarmacos y derivados; felbamato (CAS 25451-15-4) y sus posibles sales, enantiomeros, profarmacos y derivados; fenofibrato (CAS 49562-28-9) y sus posibles sales, enantiomeros, profarmacos y derivados; finasterida (CAS 9831926-7) y sus posibles sales, enantiomeros, profarmacos y derivados; flumazenilo (CAS 78755-81-4) y sus posibles sales, enantiomeros, profarmacos y derivados; flunitrazepam (CAS 1622-62-4) y sus posibles sales, enantiomeros, profarmacos y derivados; flurbiprofeno (CAS 5104-49-4) y sus posibles sales, enantiomeros, profarmacos y derivados; furosemida (CAS 54-31-9) y sus posibles sales, enantiomeros, profarmacos y derivados; gabapentina (CAS 60142-96-3) y sus posibles sales, enantiomeros, profarmacos y derivados; galantamina (CAS 357-70-0) y sus posibles sales, enantiomeros, profarmacos y derivados; haloperidol (CAS 52-86-8) y sus posibles sales, enantiomeros, profarmacos y derivados; ibuprofeno (CAS 15687-27-1) y sus posibles sales, enantiomeros, profarmacos y derivados; isoproterenol (CAS 7683-59-2) y sus posibles sales, enantiomeros, profarmacos y derivados; ketoconazol (CAS 65277-42-1) y sus posibles sales, enantiomeros, profarmacos y derivados; ketoprofeno (CAS 22071-15-4) y sus posibles sales, enantiomeros, profarmacos y derivados; L-carnitina (CAS 541-15-1) y sus posibles sales, enantiomeros, profarmacos y derivados; liotironina (T3) (CAS 6893-02-3) y sus posibles sales, enantiomeros, profarmacos y derivados; litio (CAS 7439-93-2) y sus posibles sales, enantiomeros, profarmacos y derivados; losartan (CAS 114798-26-4) y sus posibles sales, enantiomeros, profarmacos y derivados; loxapina (CAS 1977-10-2) y sus posibles sales, enantiomeros, profarmacos y derivados; meloxicam (CAS 71125-38-7) y sus posibles sales, enantiomeros, profarmacos y derivados; metaproterenol (CAS 586-06-1) y sus posibles sales, enantiomeros, profarmacos y derivados; metaraminol (CAS 54-49-9) y sus posibles sales, enantiomeros, profarmacos y derivados; metformina (CAS 657-24-9) y sus posibles sales, enantiomeros, profarmacos y derivados; metacolina (CAS 55-92-5) y sus posibles sales, enantiomeros, profarmacos y derivados; metimazol (CAS 60-56-0) y sus posibles sales, enantiomeros, profarmacos y derivados; metilergonovina (CAS 113-42-8) y sus posibles sales, enantiomeros, profarmacos y derivados; metoprolol (CAS 37350-58-6) y sus posibles sales, enantiomeros, profarmacos y derivados; metirapona (CAS 54-36-4) y sus posibles sales, enantiomeros, profarmacos y derivados; miconazol (CAS 22916-47-8) y sus posibles sales, enantiomeros, profarmacos y derivados; mifepristona (CAS 84371-65-3) y sus posibles sales, enantiomeros, profarmacos y derivados; nadolol (CAS 42200-33-9) y sus posibles sales, enantiomeros, profarmacos y derivados; naloxona (CAS 465-65-6) y sus posibles sales, enantiomeros, profarmacos y derivados; naltrexona (CAS 16590-41-3) y sus posibles sales, enantiomeros, profarmacos y derivados; norfloxacina (CAS 70458-96-7) y sus posibles sales, enantiomeros, profarmacos y derivados; pentazocina (CAS 359-83-1) y sus posibles sales, enantiomeros, profarmacos y derivados; fenoxibenzamina (CAS 59-96-1) y sus posibles sales, enantiomeros, profarmacos y derivados; fenilbutirato (CAS 1821-12-1) y sus posibles sales, enantiomeros, profarmacos y derivados; pilocarpina (CAS 54-71-7) y sus posibles sales, enantiomeros, profarmacos y derivados; pioglitazona (CAS 111025-46-8) y sus posibles sales, enantiomeros, profarmacos y derivados; prazosina (CAS 19216-56-9) y sus posibles sales, enantiomeros, profarmacos y derivados; propiltiouracilo (CAS 5152-5) y sus posibles sales, enantiomeros, profarmacos y derivados; raloxifeno (CAS 84449-90-1) y sus posibles sales, enantiomeros, profarmacos y derivados; rapamicina (CAS 53123-88-9) y sus posibles sales, enantiomeros, profarmacos y derivados; rifampina (CAS 13292-46-1) y sus posibles sales, enantiomeros, profarmacos y derivados; simvastatina (CAS 79902-63-9) y sus posibles sales, enantiomeros, profarmacos y derivados; espironolactona (CAS 52-01-7) y sus posibles sales, enantiomeros, profarmacos y derivados; tacrolimus (CAS 104987-11-3) y sus posibles sales, enantiomeros, profarmacos y derivados; tamoxifeno (CAS 10540-29-1) y sus posibles sales, enantiomeros, profarmacos y derivados; trehalosa (CAS 99-20-7) y sus posibles sales, enantiomeros, profarmacos y derivados; trilostano (CAS 13647-35-3) y sus posibles sales, enantiomeros, profarmacos y derivados; acido valproico (CAS 9966-1) y sus posibles sales, enantiomeros, profarmacos y derivados.
El termino “combinacion” designa un tratamiento en el que varios farmacos se co-administran a un sujeto para producir un efecto biologico. En una terapia combinada, los farmacos pueden ser administrados juntos o por separado, al mismo tiempo o secuencialmente. Por tanto, los farmacos pueden ser administrados por diferentes vfas y protocolos.
La invencion describe ahora la identificacion y actividades de combinaciones de farmacos particulares que proporcionan un tratamiento eficaz para la CMT. Mas espedficamente, la invencion describe nuevas combinaciones ternarias que proporcionan un efecto significativo in vitro e in vivo sobre la CMT o trastornos relacionados.
A este respecto, la invencion describe una composicion que comprende baclofeno, sorbitol y un compuesto seleccionado de pilocarpina, metimazol, mifepristona, naltrexona, rapamicina, flurbiprofeno y ketoprofeno, sus sales, enantiomeros, racematos o profarmacos.
En particular, la invencion describe una composicion que comprende baclofeno, sorbitol y un compuesto seleccionado de pilocarpina, metimazol, mifepristona, naltrexona y ketoprofeno. Tambien describe una composicion que comprende naltrexona, baclofeno y D-sorbitol para administracion simultanea, por separado o secuencial a un sujeto mairnfero.
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Preferiblemente, en las composiciones anteriores, el sorbitol es D-sorbitol y el baclofeno es RS-baclofeno o S- baclofeno, mas preferiblemente RS-baclofeno.
La invencion describe tambien una composicion que comprende:
(a) rapamicina,
(b) mifepristona o naltrexona, y
(c) un modulador de PMP22,
para administracion simultanea, por separado o secuencial a un sujeto mairnfero.
Esta invencion describe tambien una composicion que comprende:
(a) rapamicina,
(b) mifepristona, y
(c) un modulador de PMP22,
para administracion simultanea, por separado o secuencial a un sujeto mamffero.
El modulador de PMP22 puede ser cualquier compuesto que module la via de PMP22 en una celula y produzca o contribuya esencialmente a la normalizacion de la organizacion de mielina y/o la inhibicion de la perdida de neuronas. El modulador de PMP22 puede seleccionarse de acetazolamida, albuterol, amilorida, aminoglutetimida, amiodarona, aztreonam, baclofeno, balsalazida, betama, betanecol, bicalutamida, bromocriptina, bumetanida, buspirona, carbacol, carbamazepina, carbimazol, cevimelina, ciprofloxacina, clonidina, curcumina, ciclosporina A, diazepam, diclofenaco, dinoprostona, disulfiram, D-sorbitol, dutasterida, estradiol, exemestano, felbamato, fenofibrato, finasterida, flumazenilo, flunitrazepam, flurbiprofeno, furosemida, gabapentina, galantamina, haloperidol, ibuprofeno, isoproterenol, ketoconazol, ketoprofeno, L-carnitina, liotironina (T3), litio, losartan, loxapina, meloxicam, metaproterenol, metaraminol, metformina, metacolina, metimazol, metilergonovina, metoprolol, metirapona, miconazol, mifepristona, nadolol, naloxona, naltrexona, norfloxacina, pentazocina, fenoxibenzamina, fenilbutirato, pilocarpina, pioglitazona, prazosina, propiltiouracilo, raloxifeno, rapamicina, rifampina, simvastatina, espironolactona, tacrolimus, tamoxifeno, trehalosa, trilostano, acido valproico y sus sales o profarmacos.
En una realizacion preferida, el compuesto (c) se selecciona de pilocarpina, metimazol y baclofeno. A este respecto, la composicion mas preferida de esta invencion comprende:
(a) rapamicina,
(b) mifepristona, y
(c) un compuesto seleccionado de pilocarpina, metimazol y baclofeno, para administracion simultanea, por separado o secuencial a un sujeto mamffero.
Ejemplos espedficos de tales composiciones incluyen composiciones que comprenden:
- rapamicina; mifepristona y pilocarpina;
- rapamicina; mifepristona y baclofeno;
- rapamicina; mifepristona y metimazol; o
- rapamicina; naltrexona y metimazol.
El apartado experimental muestra que estas combinaciones de farmacos particulares pueden corregir eficazmente la expresion de PMP22 in vitro para restaurar la mielinizacion normal y la integridad de neuronas y, por tanto, para mejorar la CMT en animales in vivo. Los resultados tambien muestran que estas combinaciones pueden proteger animales de neuropatfa inducida por quimioterapia. Como resultado, estas composiciones se pueden usar para prevenir o reducir la neuropatfa inducida por quimioterapia, permitiendo asf que los pacientes reciban quimioterapia durante periodos prolongados.
Esta invencion describe tambien una composicion que comprende naltrexona, baclofeno y otro inhibidor de PMP22 distinto, como se define anteriormente.
Otro objeto de la presente invencion es una composicion, como se ha descrito anteriormente, que comprende ademas uno o varios excipientes o vehfculos farmaceuticamente aceptables (es decir, una composicion farmaceutica).
Otro objeto de la presente invencion se refiere a una composicion, como se ha descrito anteriormente, para tratar la CMT o un trastorno relacionado.
Otro objeto de la presente invencion se refiere al uso de una combinacion de compuestos, como se ha descrito anteriormente, para la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de la CMT o un trastorno relacionado.
Esta invencion describe tambien un metodo para tratar la CMT o un trastorno relacionado, comprendiendo el metodo
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administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de una composicion como se ha definido anteriormente.
Otro objeto de la presente invencion es un metodo de preparacion de una composicion farmaceutica, comprendiendo el metodo mezclar los compuestos anteriores con un excipiente o veldculo apropiado.
La presente invencion describe tambien un metodo para tratar la CMT1A en un sujeto, comprendiendo el metodo administrar al sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de un compuesto o combinacion de compuestos como se ha descrito anteriormente.
Esta invencion describe ademas un metodo para tratar neuropatfa toxica en un sujeto, comprendiendo el metodo administrar al sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de un compuesto o combinacion de compuestos como se ha descrito anteriormente.
Esta invencion describe tambien un metodo para tratar ELA en un sujeto, comprendiendo el metodo administrar al sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de un compuesto o combinacion de compuestos como se ha descrito anteriormente.
La terapia de acuerdo con la invencion puede realizarse como combinacion de farmacos y/o conjuntamente con cualquier otra terapia. Puede proporcionarse en el hogar, el consultorio medico, una clmica, un departamento de consultas externas de un hospital o un hospital, de manera que el medico pueda observar los efectos de la terapia estrechamente y hacer cualquier ajuste que sea necesario.
La duracion de la terapia depende de la fase de la enfermedad que este tratandose, la edad y afeccion del paciente, y de como el paciente responde al tratamiento.
Adicionalmente, una persona que tiene un mayor riesgo de desarrollar un trastorno neuropatico adicional (por ejemplo, una persona que esta geneticamente predispuesta a tener o tiene, por ejemplo, diabetes, o que esta en tratamiento para una afeccion oncologica, etc.) puede recibir tratamiento profilactico para aliviar o para retardar la eventual respuesta neuropatica.
La dosificacion, la frecuencia y el modo de administracion de cada componente de la combinacion pueden controlarse independientemente. Por ejemplo, un farmaco puede ser administrado por via oral, mientras que el segundo farmaco puede ser administrado intramuscularmente. La terapia de combinacion se puede administrar en ciclos intermitentes que incluyen periodos de descanso de manera que el cuerpo del paciente tiene la oportunidad de recuperarse de cualquier efecto secundario imprevisto. Los farmacos tambien pueden formularse juntos de forma que una administracion suministre ambos farmacos.
Formulacion de composiciones farmaceuticas
La administracion de cada farmaco de la combinacion puede ser por cualquier medio adecuado que de como resultado una concentracion del farmaco que, combinada con el otro componente, pueda mejorar la afeccion del paciente (que puede ser determinada, por ejemplo, in vitro por un efecto sobre la expresion elevada de PMP22 tras alcanzar los nervios perifericos).
Aunque es posible que los ingredientes activos de la combinacion se administren como agentes qmmicos puros es preferible presentarlos como una composicion farmaceutica, tambien denominada en este contexto formulacion farmaceutica. Composiciones posibles incluyen las adecuadas para administracion oral, rectal, topica (incluyendo transdermica, bucal y sublingual) o parenteral (incluyendo subcutanea, intramuscular, intravenosa y intradermica).
Mas comunmente, estas formulaciones farmaceuticas se prescriben al paciente en “envases personalizados” que contienen varias unidades de dosificacion u otros medios para la administracion de dosis unitarias medidas para su uso durante un periodo de tratamiento distinto en un envase individual, normalmente un envase blister. Los envases personalizados tienen la ventaja con respecto a las prescripciones tradicionales en que el farmaceutico divide la cantidad prescrita al paciente de un producto farmaceutico desde un producto a granel, ya que el paciente siempre tiene acceso al prospecto contenido en el envase personalizado, que normalmente falta en las prescripciones tradicionales. Se ha mostrado que la inclusion de un prospecto mejora el cumplimiento del paciente con las instrucciones del medico. Por tanto, la invencion incluye ademas una formulacion farmaceutica, como se ha descrito anteriormente en esta memoria, en combinacion con material de envase adecuado para dichas formulaciones. En dicho envase personalizado, el uso previsto de una formulacion para el tratamiento de combinacion puede deducirse por instrucciones, medios, provisiones, adaptaciones y/u otros medios para ayudar a usar la formulacion lo mas adecuadamente para el tratamiento. Tales medios hacen que un envase personalizado sea espedficamente adecuado y adaptado para su uso para el tratamiento con la combinacion de la presente invencion.
El farmaco puede estar contenido en cualquier cantidad apropiada en cualquier sustancia de vehfculo adecuada, y puede estar presente en una cantidad del 1-99% en peso del peso total de la composicion. La composicion puede ser proporcionada en una forma de dosificacion que sea adecuada para la via de administracion oral, parenteral (por ejemplo, intravenosa, intramuscular), rectal, cutanea, nasal, vaginal, inhaladora, dermica (parche) u ocular. Por tanto, la composicion puede estar en forma de, por ejemplo, comprimidos, capsulas, pfldoras, polvos, granulos,
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suspensiones, emulsiones, soluciones, geles que incluyen hidrogeles, pastas, pomadas, cremas, apositos, banos, dispositivos de administracion osmotica, supositorios, enemas, inyectables, implantes, pulverizaciones o aerosoles.
Las composiciones farmaceuticas se pueden formular de acuerdo con la practica farmaceutica convencional (vease, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (20th ed.), ed. A. R. Gennaro, Lippincott Williams & Wilkins, 2000 and Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, eds. J. Swarbrick and J. C. Boylan, 1988-1999, Marcel Dekker, New York).
Las composiciones farmaceuticas de acuerdo con la invencion pueden formularse para liberar el principio activo sustancial e inmediatamente tras la administracion o en cualquier momento predeterminado o periodo de tiempo despues de la administracion.
Las formulaciones de liberacion controlada incluyen: (i) formulaciones que crean una concentracion sustancialmente constante del farmaco dentro del cuerpo durante un periodo de tiempo prolongado; (ii) formulaciones que despues de un tiempo de desfase predeterminado crean una concentracion sustancialmente constante del farmaco dentro del cuerpo durante un periodo de tiempo prolongado; (iii) formulaciones que mantienen la accion del farmaco durante un periodo de tiempo predeterminado conservando un nivel de farmaco eficaz relativamente constante en el cuerpo con minimizacion concomitante de efectos secundarios no deseables asociados a fluctuaciones en el nivel de plasma del principio activo; (iv) formulaciones que localizan la accion del farmaco, por ejemplo, por colocacion espacial de una composicion de liberacion controlada adyacente al tejido u organo enfermo o dentro de ellos; y (v) formulaciones que dirigen la accion del farmaco usando vehmulos o derivados qmmicos para administrar el farmaco a un tipo de celula diana particular.
La administracion de farmacos en forma de una formulacion de liberacion controlada se prefiere especialmente en casos en los que el farmaco en combinacion tenga: (i) un mdice terapeutico estrecho (es decir, la diferencia entre la concentracion en plasma que conduce a efectos secundarios perjudiciales o reacciones toxicas y la concentracion en plasma que conduce a un efecto terapeutico es pequena; en general, el mdice terapeutico, IT, se define como la relacion entre la dosis letal mediana (DL50) y la dosis eficaz mediana (DE50)); (ii) una estrecha ventana de absorcion en el tracto gastrointestinal; o (iii) una semivida biologica muy corta de manera que se requiera la dosificacion frecuente durante un dfa con el fin de mantener el nivel en plasma a un nivel terapeutico.
Pueden seguirse distintas estrategias con el fin de obtener la liberacion controlada en la que la velocidad de liberacion exceda la velocidad de metabolismo del farmaco en cuestion. La liberacion controlada se puede obtener por seleccion apropiada de diversos parametros e ingredientes de formulacion que incluyen, por ejemplo, diversos tipos de composiciones y recubrimientos de liberacion controlada. Por tanto, el farmaco se formula con excipientes apropiados en una composicion farmaceutica que, tras la administracion, libera el farmaco en una forma controlada (composiciones de comprimido o capsula unitarias individuales o multiples, soluciones en aceite, suspensiones, emulsiones, microcapsulas, microesferas, nanopartmulas, parches y liposomas).
Formas de dosificacion solida para uso oral
Las formulaciones para uso oral incluyen comprimidos que contienen el(los) ingrediente(s) activo(s) en una mezcla con excipientes no toxicos farmaceuticamente aceptables. Estos excipientes pueden ser, por ejemplo, diluyentes o cargas inertes (por ejemplo, sacarosa, celulosa microcristalina, almidones incluyendo el almidon de patata, carbonato de calcio, cloruro de sodio, fosfato de calcio, sulfato de calcio o fosfato de sodio); agentes de granulacion y de disgregacion (por ejemplo, derivados de celulosa incluyendo la celulosa microcristalina, almidones incluyendo el almidon de patata, croscarmelosa sodica, alginatos o acido algmico); agentes aglutinantes (por ejemplo, goma arabiga, acido algmico, alginato de sodio, gelatina, almidon, almidon pregelatinizado, celulosa microcristalina, carboximetilcelulosa sodica, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, etilcelulosa, polivinilpirrolidona o polietilenglicol); y agentes lubricantes, deslizantes y antiadhesivos (por ejemplo, acido estearico, sflices o talco). Otros excipientes farmaceuticamente aceptables pueden ser colorantes, agentes aromatizantes, plastificantes, humectantes, agentes de tamponamiento y similares.
Los comprimidos pueden estar sin recubrir o pueden ser recubiertos mediante tecnicas conocidas, opcionalmente para retrasar la disgregacion y absorcion en el tracto gastrointestinal y asf proporcionar una accion mantenida durante un periodo mas largo. El recubrimiento se puede adaptar para liberar el principio activo en un patron predeterminado (por ejemplo, con el fin de lograr una formulacion de liberacion controlada) o se puede adaptar para no liberar el principio activo hasta despues de pasar el estomago (recubrimiento enterico). El recubrimiento puede ser un recubrimiento de azucar, un recubrimiento de pelmula (por ejemplo, basado en hidroxipropilmetilcelulosa, metilcelulosa, metilhidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, carboximetilcelulosa, copolfmeros de acrilato, polietilenglicoles y/o polivinilpirrolidona), o un recubrimiento enterico (por ejemplo, basado en copolfmero de acido metacnlico, acetato-ftalato de celulosa, ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa, acetato-succinato de
hidroxipropilmetilcelulosa, poli(acetato- ftalato de vinilo), goma laca y/o etilcelulosa). Puede emplearse un material de retardo del tiempo tal como, por ejemplo, monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo.
Las composiciones de comprimidos solidos pueden incluir un recubrimiento adaptado para proteger la composicion de cambios qmmicos no deseados (por ejemplo, degradacion qmmica antes de la liberacion del principio activo). El
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recubrimiento puede aplicarse a la forma de dosificacion solida de un modo similar al descrito en Encyclopedia of Pharmaceutical Technology.
Los farmacos pueden estar mezclados en el comprimido, o estar repartidos. Por ejemplo, un primer farmaco esta contenido dentro del comprimido y un segundo farmaco esta fuera, de forma que una porcion sustancial del segundo farmaco es liberada antes de la liberacion del primer farmaco.
Las formulaciones para uso oral se pueden presentar tambien como comprimidos masticables o como capsulas de gelatina dura en las que el principio activo esta mezclado con un diluyente solido inerte (por ejemplo, almidon de patata, celulosa microcristalina, carbonato de calcio, fosfato de calcio o caolm) o como capsulas de gelatina blanda en las que el principio activo esta mezclado con agua o un medio oleoso, por ejemplo, parafina lfquida o aceite de oliva. Los polvos y granulados pueden prepararse usando los ingredientes mencionados anteriormente en comprimidos y capsulas de un modo convencional.
Las composiciones de liberacion controlada para uso oral pueden, por ejemplo, estar preparadas para liberar el principio activo controlando la disolucion y/o la difusion del principio activo.
La disolucion o difusion de liberacion controlada pueden lograrse mediante el recubrimiento apropiado de una formulacion de comprimido, capsula, pelet o granulado de farmacos, o incorporando el o los farmacos en una matriz apropiada. Un recubrimiento de liberacion controlada puede incluir una o mas de las sustancias de recubrimiento mencionadas anteriormente y/o, por ejemplo, goma laca, cera de abeja, Glycowax, cera de ricino, cera de carnauba, alcohol esteanlico, monoestearato de glicerilo, diestearato de glicerilo, palmitoestearato de glicerol, etilcelulosa, resinas acnlicas, acido dl-polilactico, acetato-butirato de celulosa, poli(cloruro de vinilo), poli(acetato de vinilo), vinilpirrolidona, polietileno, polimetacrilato, metacrilato de metilo, 2-hidroximetacrilato, hidrogeles de metacrilato, 1,3- butilenglicol, metacrilato de etilenglicol y/o polietilenglicoles. En una formulacion de matriz de liberacion controlada, el material de la matriz puede incluir tambien, por ejemplo, metilcelulosa hidratada, cera de carnauba y alcohol esteanlico, Carbopol 934, silicona, triestearato de glicerilo, acrilato de metilo-metacrilato de metilo, poli(cloruro de vinilo), polietileno y/o fluorocarburo halogenado.
Una composicion de liberacion controlada que contiene uno o mas de los farmacos de las combinaciones reivindicadas puede estar tambien en forma de un comprimido o capsula flotante (es decir, un comprimido o capsula que, tras la administracion por via oral, flota sobre la parte superior del contenido gastrico durante un cierto periodo de tiempo). Una formulacion de comprimido flotante del(de los) farmaco(s) puede prepararse granulando una mezcla del(de los) farmaco(s) con excipientes y el 20-75% en peso/peso de hidrocoloides, tales como hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa o hidroxipropilmetilcelulosa. Los granulos obtenidos pueden entonces transformarse en comprimidos. En contacto con el jugo gastrico, el comprimido forma una barrera de gel sustancialmente impermeable al agua alrededor de su superficie. Esta barrera de gel participa en el mantenimiento de una densidad inferior a uno, permitiendo asf que el comprimido permanezca flotando en el jugo gastrico.
L^quidos para administracion por v^a oral
Polvos, polvos dispersables o granulos adecuados para la preparacion de una suspension acuosa mediante adicion de agua son formas de dosificacion convenientes para administracion por via oral. La formulacion como una suspension proporciona el principio activo en una mezcla con un agente dispersante o humectante, agente de puesta en suspension y uno o mas conservantes. Agentes de puesta en suspension adecuados son, por ejemplo, carboximetilcelulosa sodica, metilcelulosa, alginato de sodio y similares.
Composiciones parenterales
La composicion farmaceutica se puede administrar tambien parenteralmente por inyeccion, infusion o implantacion (intravenosa, intramuscular, subcutanea o similares) en formas de dosificacion, formulaciones o por dispositivos de administracion o implantes adecuados que contienen vehfculos y adyuvantes farmaceuticamente aceptables no toxicos convencionales. La formulacion y preparacion de tales composiciones son muy conocidas por los expertos en la tecnica de formulacion farmaceutica.
Las composiciones para uso parenteral se pueden proporcionar en formas de dosificacion unitarias (por ejemplo, en ampollas de una sola dosis) o en viales que contienen varias dosis y a los que puede anadirse un conservante adecuado (vease mas adelante). La composicion puede estar en forma de una solucion, una suspension, una emulsion, un dispositivo de infusion o un dispositivo de administracion para implantacion o se puede presentar como un polvo seco que ha de ser reconstituido con agua u otro vehfculo adecuado antes de su uso. Aparte del(de los) principio(s) activo(s), la composicion puede incluir vehfculos y/o excipientes parenteralmente aceptables adecuados. El(los) principio(s) activo(s) puede(n) incorporarse en microesferas, microcapsulas, nanopartfculas, liposomas o similares para la liberacion controlada. La composicion puede incluir agentes de puesta en suspension, solubilizantes, estabilizantes, de ajuste del pH y/o agentes dispersantes.
Las composiciones farmaceuticas de acuerdo con la invencion pueden estar en la forma adecuada para inyeccion esteril. Para preparar dicha composicion, el(los) farmaco(s) activo(s) adecuado(s) se disuelve(n) o se pone(n) en
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suspension en un vefnculo Kquido parenteralmente aceptable. Entre los vefnculos y disolventes aceptables que se pueden emplear estan agua, agua ajustada a un pH adecuado por adicion de una cantidad apropiada de acido clorfndrico, hidroxido sodico o un tampon adecuado, 1,3-butanodiol, solucion de Ringer y solucion isotonica de cloruro sodico. La formulacion acuosa puede contener tambien uno o mas conservantes (por ejemplo, p- hidroxibenzoato de metilo, etilo o n-propilo). En los casos en los que uno de los farmacos solo sea moderada o ligeramente soluble en agua se puede anadir un agente potenciador de la disolucion o solubilizante, o el disolvente puede incluir 10-60% en peso/peso de propilenglicol o similares.
Las composiciones parenterales de liberacion controlada pueden estar en forma de suspensiones acuosas, microesferas, microcapsulas, microesferas magneticas, soluciones oleosas, suspensiones oleosas o emulsiones. Alternativamente, el(los) farmaco(s) activo(s) se puede(n) incorporar en vefnculos, liposomas, nanopartfculas, implantes biocompatibles o dispositivos de infusion. Materiales para su uso en la preparacion de microesferas y/o microcapsulas son, por ejemplo, polfmeros biodegradables/bioerosionables, tales como poligalactina, poli(cianoacrilato de isobutilo), poli(2-hidroxietil-L-glutamina). Los vefnculos biocompatibles que se pueden usar cuando se prepara una formulacion parenteral de liberacion controlada son hidratos de carbono (por ejemplo, dextranos), protemas (por ejemplo, albumina), lipoprotemas o anticuerpos. Los materiales para su uso en implantes pueden ser no biodegradables (por ejemplo, polidimetilsiloxano) o biodegradables (por ejemplo, poli(caprolactona), poli(acido glicolico) o poli(orto-esteres)).
Composiciones rectales
Para administracion rectal, las formas de dosificacion adecuadas para una composicion incluyen supositorios (tipo en emulsion o suspension) y capsulas de gelatina rectales (soluciones o suspensiones). En una formulacion de supositorio tfpica, el(los) farmaco(s) activo(s) se combina(n) con una base de supositorio farmaceuticamente aceptable apropiada, tal como manteca de cacao, acidos grasos esterificados, gelatina glicerinada y diversas bases solubles o dispersables en agua como polietilenglicoles. Se pueden incorporar diversos aditivos, potenciadores o tensioactivos.
Composiciones percutaneas y topicas
Las composiciones farmaceuticas tambien se pueden administrar topicamente a la piel para absorcion percutanea en formas de dosificacion o formulaciones que contienen vefnculos y excipientes farmaceuticos aceptables convencionalmente no toxicos que incluyen microesferas y liposomas. Las formulaciones incluyen cremas, pomadas, lociones, linimentos, geles, hidrogeles, soluciones, suspensiones, barras, pulverizaciones, pastas, apositos y otros tipos de sistemas de administracion de farmacos transdermicos. Los vefnculos o excipientes farmaceuticamente aceptables pueden incluir agentes emulsionantes, antioxidantes, agentes de tamponamiento, conservantes, humectantes, promotores de la penetracion, agentes quelantes, agentes formadores de gel, bases de pomada, perfumes y agentes protectores de la piel.
Los agentes emulsionantes pueden ser gomas que existen en la naturaleza (por ejemplo, goma arabiga o goma tragacanto)
Los conservantes, humectantes, promotores de la penetracion pueden ser parabenos, tales como p-hidroxibenzoato de metilo o propilo y cloruro de benzalconio, glicerina, propilenglicol, urea, etc.
Las composiciones farmaceuticas descritas anteriormente para administracion topica a la piel se pueden usar tambien sobre la parte del cuerpo que se ha de tratar o proxima a ella. Las composiciones se pueden adaptar para aplicacion directa o para aplicacion por medio de dispositivos especiales de administracion de farmacos, tales como vendajes o alternativamente apositos, almohadillas, esponjas, tiras u otras formas de material flexible adecuado.
Dosificaciones y duracion del tratamiento
Se apreciara que los farmacos de la combinacion se pueden administrar simultaneamente, tanto en la misma formulacion farmaceutica como en formulaciones farmaceuticas diferentes o secuencialmente. Si hay administracion secuencial, el retraso en administrar uno de los ingredientes activos no debena ser tal como para perder el beneficio del efecto eficaz de la combinacion de los ingredientes activos. Un requisito mmimo para una combinacion de acuerdo con esta descripcion es que la combinacion no debe estar prevista para uso combinado con el beneficio del efecto eficaz de la combinacion de los ingredientes activos. El uso previsto de una combinacion puede deducirse de capacidades, provisiones, adaptaciones y/u otros medios para ayudar al uso de la combinacion de acuerdo con la invencion. Cantidades terapeuticamente eficaces de los farmacos que son objeto de la presente invencion pueden usarse juntas para la preparacion de un medicamento util para reducir el efecto del aumento de la expresion del gen PMP22; la restauracion de la mielinizacion normal e integridad nerviosa, la prevencion o reduccion del riesgo de desarrollar la enfermedad de CMT, la detencion o ralentizacion de la progresion de la enfermedad de CMT una vez que se ha manifestado clmicamente y la prevencion o reduccion del riesgo de una primera o posterior recidiva de un evento neuropatico.
Aunque los farmacos activos de la presente invencion se pueden administrar en dosis divididas, por ejemplo, dos o
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tres veces al dfa, se prefiere una dosis diaria unica de cada farmaco en combinacion, siendo lo mas preferido una dosis diaria unica de todos los farmacos en una unica composicion farmaceutica (forma de dosificacion unitaria).
La administracion puede realizarse una a varias veces al dfa durante varios dfas a varios anos e incluso puede ser durante toda la vida del paciente. En la mayona de los casos estara indicada la administracion cronica o al menos a largo plazo repetida periodicamente.
• El termino “forma de dosificacion unitaria” se refiere a unidades ffsicamente discretas (tales como capsulas, comprimidos o jeringuillas cargadas) adecuadas como dosificaciones unitarias para sujetos humanos, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de material o materiales activos calculados para producir el efecto terapeutico deseado, en asociacion con el vehfculo farmaceutico requerido.
La cantidad de cada farmaco en la combinacion preferida para una dosificacion unitaria depended de varios factores que incluyen la via de administracion, el peso corporal y la edad del paciente, la gravedad de la lesion neuropatica producida por la enfermedad de CMT o el riesgo de potenciales efectos secundarios considerando el estado de salud general de la persona que ha de tratarse.
Adicionalmente, la informacion farmacogenomica (el efecto del genotipo sobre el perfil farmacocinetico, farmacodinamico o de eficacia de un agente terapeutico) sobre un paciente particular puede afectar a la dosificacion usada.
Excepto cuando se responde a casos de la enfermedad de CMT especialmente perjudiciales que pueden requerir mayores dosificaciones, o cuando se tratan ninos para los que se deben elegir dosificaciones menores, la dosificacion preferida de cada farmaco en la combinacion se encontrara normalmente dentro del intervalo de dosis que no esta por encima del normalmente prescrito para el tratamiento de mantenimiento a largo plazo o que se demuestra que es seguro en los largos estudios clmicos de fase 3.
Por ejemplo,
• para rapamicina, de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 |ig/kg por dfa, normalmente de 1 a 50 |ig/kg, por ejemplo, entre 5 y 30 |ig/kgMa.
• para mifepristona, de aproximadamente 1 a aproximadamente 300 |ig/kg por dfa, normalmente de 10 a 200 |ig/kg, por ejemplo, entre 10 y 80 |ig/kgMa.
• para naltrexona, de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 |ig/kg por dfa, normalmente de 1 a 50 |ig/kg, por ejemplo, entre 1 y 20 |ig/kgMa.
• para pilocarpina, de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 |ig/kg por dfa, normalmente de 1 a 50 |ig/kg, por ejemplo, entre 1 y 20 |ig/kgMa.
• para baclofeno, de aproximadamente 1 a aproximadamente 300 |ig/kg por dfa, normalmente de 10 a 200 |ig/kg, por ejemplo, entre 20 y 100 |ig/kgMa.
• para metimazol, de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 |ig/kg por dfa, normalmente de 1 a 50 |ig/kg, por ejemplo, entre 1 y 20 |ig/kgMa.
La dosificacion mas preferida se corresponded con cantidades del 1% hasta el 10% de las normalmente prescritas para tratamiento de mantenimiento a largo plazo.
Se entendera que la cantidad del farmaco realmente administrada sera determinada por un medico, teniendo en cuenta las circunstancias relevantes que incluyen la afeccion o afecciones que se han de tratar, la composicion exacta que se ha de administrar, la edad, peso y respuesta del paciente individual, la gravedad de los smtomas del paciente y la via de administracion elegida. Por tanto, los intervalos de dosificacion anteriores pretenden proporcionar orientacion y soporte generales para las ensenanzas contenidas en la presente memoria, pero no pretenden limitar el alcance de la invencion.
Ejemplos
A. Preparacion de combinaciones de farmacos
Se prepararon las siguientes combinaciones de farmacos:
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Molecula Dosis
Sorbitol 2,1 mg/kg/dfa
Mezcla 1
S-Baclofeno (-) 60 |ig/kg/dfa
Naltrexona 7 |ig/kg/dfa
Molecula Dosis
Mezcla 2
Rapamicina 15 |ig/kg/dfa
Mifepristona
40 |ig/kg/dfa
Molecula Dosis
Rapamicina 15 |ig/kg/dfa
Mezcla 3
Mifepristona 40 |ig/kg/dfa
Pilocarpina 7 |ig/kg/dfa
Molecula Dosis
Rapamicina 15 |ig/kg/dfa
Mezcla 4
Mifepristona 40 |ig/kg/dfa
Baclofeno 60 |ig/kg/dfa
Molecula Dosis
Rapamicina 15 |ig/kg/dfa
Mezcla 5
Mifepristona 40 |ig/kg/dfa
Metimazol 4,2 |ig/kg/dfa
Molecula Dosis
Rapamicina 15 |ig/kg/dfa
Mezcla 6
Naltrexona 7 |ig/kg/dfa
Metimazol 4,2 |ig/kg/dfa
Molecula Dosis 1 Dosis 2 Dosis 3
Sorbitol 10,5 mg/kg/dfa 2,1 mg/kg/dfa 1,05 mg/kg/dfa
Mezcla 7
(RS)-Baclofeno 0,3 mg/kg/dfa 60 |ig/kg/dfa 30 |ig/kg/dfa
Naltrexona 35 |ig/kg/dfa 7 |ig/kg/dfa 3,5 |ig/kg/dfa
B. Experimentos in vitro
1. Ensayos de expresion de PMP22 en celulas de Schwann tratadas con las Mezclas 1-6
1.1 Cultivo celular
1.1.1: Celulas de Schwann primarias de rata comercialmente disponibles
Se descongelan viales de cultivo primario de celulas de Schwann (CS) de rata (Sciencell n° R1700) y se siembra su contenido a la densidad de 10.000 celulas/cm2 en “medio de celulas de Schwann Sciencell” (medio basal de Sciencell n° R1701) en matraces de 75 cm2 previamente recubiertos con poli-L-lisina. El medio de cultivo esta compuesto por medio basal, 5% de suero de bovino fetal (SBF) (3H-Biomedical AB n° 1701-0025), 1% de suplemento de crecimiento para celulas de Schwann (3H Biomedical AB n° 1701-1752), 1% de gentamicina (Sigma n° G1397) y 10 |iM de forskolina (Sigma n° F6886) para promover su proliferacion.
Despues de alcanzar la confluencia (4 a 10 dfas dependiendo del lote de celulas), las celulas de Schwann se purifican por agitacion suave o por inmunoprecipitacion con Thy 1.1 que permite el aislamiento de las CS de los fibroblastos adherentes para producir cultivos que tienen al menos el 95% de pureza. Entonces, las CS se cuentan (metodo con azul de triptano) y se siembran en un matraz de 75 cm2 previamente recubierto con poli-L-lisina en el mismo medio de CS. En la confluencia, las celulas se lavan, se tripsinizan (tripsina-EDTA diluido 1x de Invitrogen n° 1540054), se diluyen en PBS (sin calcio ni magnesio), se cuentan y se cultivan en placas de 12 pocillos (140.000 celulas/pocillo) en medio de celulas de Schwann de Sciencell con 5% de SBF, 1% de suplemento de crecimiento
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celular (CGS), 40 |ig/ml de gentamicina y 4 |iM de forskolina.
1.1.2 Celulas de Schwann primarias de rata de encargo
Se establecen cultivos de celulas de Schwann (CS) primarias de nervios ciaticos de ratas recien nacidas Sprague- Dawley (entre P0 y P2). Todas las ratas recien nacidas se sacrifican y se afslan en una placa de Petri. La diseccion se realiza bajo condiciones esteriles.
La piel dorsal se elimina de la pata trasera y del torso inferior. El nervio ciatico se afsla y se transfiere a una placa de cultivo que contiene medio Leibovitz enfriado con hielo (L15, Invitogen n° 11415) complementado con 1% de solucion de penicilina/estreptomicina (50 UI/mL y 50 |ig/mL, respectivamente; Invitrogen n° 15070) y 1% de albumina de suero de bovino (BSA, Sigma A6003). Ambos nervios por rata se transfieren a un tubo de 15 mL que contiene L15 enfriado con hielo. Luego, el medio L15 se elimina y se sustituye por 2,4 mL de DMEM (Invitrogen n° 21969035) con 10 mg/mL de colagenasa (Sigma n° A6003). Los nervios se incuban en este medio durante 30 minutos a 37°C. Luego, el medio se elimina y ambos nervios se disocian por tripsina (10% de tripsina-EDTA 10x, Invitrogen n° 15400054) diluida en PBS sin calcio ni magnesio (Invitrogen n° 2007-03) durante 20 min a 37°C. La reaccion se detiene por adicion de DMEM que contiene DNasa I de calidad II (0,1 mg/mL de Roche Diagnostic n° 104159) y suero de bovino fetal (10% de SBF, Invitrogen n° 10270). La suspension de celulas se trituro con una pipeta de 10 mL y se hizo pasar a traves de un filtro a un tubo de 50 mL (unidades de filtro de 13 mm Swinnex, Millipore, con filtros de malla de nailon de 20 |im, Fisher). La suspension de celulas se centrifuga a 350 g durante 10 min a temperatura ambiente (TA) y los sedimentos se ponen en suspension en DMEM con 10% de SBF y 1% de penicilina/estreptomicina. Las celulas se cuentan (metodo con azul de triptano) y se siembran en placas de cultivo de tejido primario de 100 mm Falcon a la densidad de 5.105 a 106 celulas/placa.
Despues de un dfa de cultivo, el medio se cambia con DMEM, 10% de SBF, 1% de penicilina/estreptomicina y 10 |iM de citosina-b-D-arabinofuranosido (Sigma n° C1768). El medio se elimina 48 horas despues y las celulas se lavan tres veces con DMEM. Luego, se anade el medio de crecimiento de CS, compuesto por DMEM, 10% de SBF, 1% de penicilina/estreptomicina, 2 |iM de forskolina (Sigma n° F6886), 10 |ig/mL de extracto de pituitaria de bovino (PEX, Invitrogen n° 13028). El medio se cambia cada 2-3 dfas.
Despues de 8 dfas de cultivo (4 a 10 dfas dependiendo de los lotes de celulas), las celulas de Schwann alcanzan la confluencia y el cultivo, que contiene una gran cantidad de fibroblastos contaminantes, se purifica por el metodo de inmunoprecipitacion con Thy 1.1. Despues de esta purificacion, las celulas se ponen en suspension en medio de crecimiento a 10.000 celulas/cm2 en matraces de 75 cm2 previamente recubiertos con poli-L-lisina. Una vez alcanzan la confluencia, las celulas se lavan, se tripsinizan (tripsina-EDTA), se cuentan y se siembran en placas de 12 pocillos (100.000 celulas/pocillo).
1.1.3 Incubacion de farmacos
Despues de ser sembradas las celulas en placas de 12 pocillos, el medio se cambia por un medio definido que consiste en una mezcla de DMEM-F12 (Invitrogen n° 21331020) complementado con 1% de suplemento N2 (Invitrogen n° 17502), 1% de L-glutamina (Invitrogen n° 25030024), 2,5% de SBF (Sciencell n° 0025), 0,02 |ig/mL de corticosterona (Sigma n° C2505), 4 |iM de forskolina y 50 |ig/mL de gentamicina. Los factores de crecimiento no se anaden a este medio, para promover la diferenciacion de CS.
24 horas despues, el medio se cambia por un medio definido (DMEM-F12) complementado con 1% de insulina- transferrina-selenio-X (ITS, Invitrogen n° 51300), 16 |ig/mL de putrescina (Sigma n° P5780), 0,02 |ig/mL de corticosterona y 50 |ig/mL de gentamicina. En esta etapa, ni progesterona ni forskolina estan presentes en el medio.
Un dfa despues, las celulas de Schwann se estimulan por combinaciones de farmacos durante 24 horas (3 pocillos/afeccion). La preparacion de cada compuesto se realiza justo antes de su adicion al medio de cultivo celular.
Los farmacos se anaden a un medio definido compuesto por DMEM-F12 con 1% de insulina-transferrina-selenio-X (ITS, Invitrogen n° 51300), 16 |ig/mL de putrescina, 0,02 |ig/mL de corticosterona, 10 nM de progesterona y 50 |ig/mL de gentamicina. La ausencia de forskolina durante la estimulacion con farmacos evita la saturacion de adenilato-ciclasa.
1.2. Purificacion de celulas de Schwann por inmunoprecipitacion con Thy 1.1
Para prevenir la contaminacion del cultivo con fibroblastos, se purifican las celulas de Schwann usando el protocolo de inmunoprecipitacion con Thy 1.1 (ATCC TIB-103™).
Placas de Petri de 100 mm para bacterias previamente recubiertas con anticuerpo se preparan del siguiente modo: estas placas se lavan tres veces con PBS y se tratan con 20 mL de solucion de Tris-HCl 50 mM, pH 9,5, con 10 |ig/mL de anticuerpo IgM MU anti-raton de cabra (Jackson ImmunoResearch n° 115-005-020) durante la noche a 4°C; luego se lavan 3 veces con PBS y se tratan con una solucion de PBS con 0,02% de BSA y el lfquido sobrenadante obtenido del cultivo del hibridoma T11D7e2 (ATCC n° TIB-103) que contiene el anticuerpo IgM Thy 1.1
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durante 2 horas a temperatura ambiente. Finalmente, las placas se lavan tres veces con PBS antes de ser anadidas las suspensiones celulares.
Las CS se desprenden con tripsina-EDTA. Tan pronto como la mayona de las celulas esten en suspension, la tripsina se neutraliza con DMEM-10% de SBF y las celulas se centrifugan. El sedimento de celulas disociadas se vuelve a poner en suspension en 15 mL de medio con 0,02% de BSA a la densidad de 0,66x106 celulas por mL (maximo) y se transfieren a una placa de Petri (aproximadamente 6,6 millones de celulas/10 mL/placa de 100 mm).
La suspension de celulas se incuba en la placa de Petri previamente recubierta con Thy 1.1 durante 45 minutos a 37°C con agitacion suave cada 15 minutos para prevenir la union no espedfica. La mayona de las celulas de fibroblasto que expresan Thy 1.1 se adhieren a la placa. Al final de la incubacion, la suspension de celulas se recupera y se centrifuga. Esta suspension de celulas contiene en teona solo celulas de Schwann. Las celulas se centrifugan y el sedimento de celulas se pone en suspension en medio de crecimiento con 10 |iM de forskolina a 16.000 celulas/cm2 en un matraz T de 75 cm2 tratado con poli-L-lisina.
1.3 Reaccion en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa cuantitativa (Q-RT-PCR)
La RT-PCR cuantitativa se usa para comparar los niveles de mRNA de PMP22 despues de la estimulacion con farmacos, con respecto al mRNA de L13A ribosomico constitutivo en cultivo primario de celulas de Schwann de rata.
Despues de lavar con PBS esterilizado fno, los RNA totales de cada muestra de celulas se extraen y se purifican de CS usando el microkit Qiagen RNeasy (Qiagen n° 74004). Los acidos nucleicos se cuantifican por el espectrofotometro Nanodrop usando 1 |iL de muestra de RNA. La integridad del RNA se determina en un aparato BioAnalyzer (Agilent).
Los RNA se transcriben de forma inversa en cDNA segun el protocolo convencional. Los moldes de cDNA para la amplificacion por PCR se sintetizan a partir de 200 ng de RNA total usando la transcriptasa inversa SuperScript II (Invitrogen n° 18064-014) durante 60 minutos a 42°C en presencia de oligo(dT), en un volumen final de 20 |iL.
Los cDNA se someten a amplificacion por PCR usando el sistema “LightCycler® 480” (Roche Molecular Systems Inc.). Cada cDNA se diluye cinco veces antes de ser usado para la amplificacion por PCR. 2,5 |iL de estos cDNA entran en la solucion de reaccion de PCR (volumen final de 10 |iL). Los experimentos preliminares garantizaron que la cuantificacion se hizo en la fase exponencial del proceso de amplificacion para ambas secuencias y que la expresion del gen de referencia fue uniforme en las diferentes condiciones de cultivo.
La PCR se realiza por amplificacion de 500 nM de cebador directo de PMP22 de rata (NM_017037), 5- GGAAACGCGAATGAGGC-3 (SEQ ID NO: 1) y 500 nM de cebador inverso 5-GTTCTGTTTGGTTTGGCTT-3 (SEQ ID NO: 2) (amplificacion de 148 pb). Un fragmento de 152 pb de RNA ribosomico de RPL13A (NM_173340) se amplifica en paralelo en reacciones separadas para la normalizacion de los resultados usando 500 nM de cebador directo 5-CTGCCCTCAAGGTTGTG-3 (SeQ ID NO: 3) y 500 nM de cebador inverso 5- CTTCTTCTTCCGGTAATGGAT-3 (SEQ ID NO: 4).
Los inventores usaron qrnmica de FRET para realizar el analisis por Q-RT-PCR. Las sondas de FRET estan compuestas por 0,3 |iM de PMP22-FL-5-GCTCTGAGCGTGCATAGGGTAC (SEQ ID NO: 5) o RpL13A-FL-5- TCGGGTGGAAGTACCAGCC (SEQ ID NO: 6), marcados en su extremo 3' con un colorante fluoroforo donador (fluorescema). 0,15 |iM de sondas Red640 se definen del siguiente modo: PMP22-red-5'-
AGGGAGGGAGGAAGGAAACCAGAAA (SEQ ID NO: 7) o RpL13A-red-5'-
TGACAGCTACTCTGGAGGAGAAACGGAA (SEQ ID NO: 8), marcadas en su extremo 5' con un colorante fluoroforo aceptor (Rojo Rodamina 640).
Cada PCR contema 2,5 |iL de molde de cDNA en un volumen final de 10 |iL de kit de mezcla madre (Roche n° 04887301001).
Se usan las siguientes condiciones de PCR: 10 segundos a 95°C, 10 segundos a 63°C y 12 segundos a 72 °C y 30 segundos a 40°C (cuarenta ciclos de amplificacion). Los niveles relativos de expresion del gen PMP22 se miden determinando la relacion entre los productos generados a partir del gen PMP22 diana y el patron interno endogeno RpL13A.
1.4 Analisis de expresion de protemas de PMP22 por citometria de flujo (FACS)
8 horas, 24 horas y 48 horas despues de la incubacion de los farmacos, los lfquidos sobrenadantes se recuperan, centrifugan y congelan. Las CS se desprenden con tripsina-EDTA. Tan pronto como la mayona de las celulas esten en suspension, la tripsina se neutraliza usando DMEM con 10% de SBF.
Los lfquidos sobrenadantes con celulas se recuperan y se centrifugan. Los sedimentos de celulas se transfieren a microtubos, se lavan una vez con PBS y se fijan con una solucion espedfica (AbCys n° de Reactivo A BUF09B). 10 minutos despues, las celulas se lavan una vez con PBS y se mantienen a 4°C.
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Cinco d^as despues de la fijacion de las celulas, se marcan todas las preparaciones de celulas con diferentes tiempos de incubacion usando el siguiente protocolo.
Las celulas se centrifugan a 7000 rpm durante 5 minutos y los sedimentos se ponen en suspension en una solucion de permeabilizacion (AbCys n° de Reactivo B BUF09B) y se marcan con anticuerpo PMp22 primario (Abcam n° ab61220, 1/50) durante 1 hora a temperatura ambiente. Luego, las celulas se centrifugan a 7000 rpm durante 5
minutos y los sedimentos de celulas se lavan una vez con PBS. Se anade un anticuerpo secundario, acoplado a
Alexa Fluor 488 (IgG anti-conejo de cabra, Molecular Probes n° A11008, 1/100), durante una hora a temperatura ambiente. Luego, las celulas se centrifugan a 7000 rpm durante 5 minutos y los sedimentos de celulas se lavan una vez con PBS. El marcaje se aumenta anadiendo un anticuerpo terciario acoplado a Alexa Fluor 488 (IgG anti-cabra de pollo, Molecular Probes n° A21467, 1/100) durante una hora de incubacion, a temperatura ambiente. A continuacion, las celulas se lavan una vez con PBS. Se realiza un control sin ningun anticuerpo (celulas sin marcar) para determinar el nivel de autofluorescencia y se adapta la sensibilidad de los fotomultiplicadores. Se realiza un control con anticuerpos tanto secundarios como terciarios, pero sin anticuerpo primario, para determinar la union no espedfica de anticuerpos.
La adquisicion y el analisis de datos se realizan con un citometro FACS Array y el programa informatico para FACS Array (Becton Dickinson) en 5000 celulas. Se analizan la dispersion frontal (FSC por sus iniciales en ingles) que
guarda relacion con el volumen de celulas (tamano) y la dispersion lateral (SSC por sus iniciales en ingles) que
depende de la complejidad interna de las celulas (granularidad). Para la expresion de PMP22, el analisis se realiza dentro de las celulas totales y se calcula el porcentaje de celulas positivas. Las celulas positivas son celulas con intensidad de fluorescencia superior a las del control con anticuerpo secundario.
Con el fin de cuantificar el numero de CS, las celulas en el medio de control se analizan usando anticuerpos anti- protema S100.
Las celulas se preparan segun el siguiente protocolo: las celulas de Schwann se tinen con anticuerpo anti-protema S100 (Dako n° S0311, 1/100) durante 1 hora a temperatura ambiente. Este anticuerpo se marca segun el protocolo descrito anteriormente para la inmunotincion de PMP22, pero sin incubacion con anticuerpo terciario.
1.5. Incubacion y actividad de farmacos
Los farmacos se incuban durante 24 horas o 48 horas en el mismo medio definido que se ha descrito antes (3 pocillos/afeccion) en ausencia de forskolina para prevenir la saturacion de la estimulacion por adenilato-ciclasa, pero en presencia de 10 nM de progesterona. Despues de la incubacion de los farmacos, se recuperan los lfquidos sobrenadantes y las celulas de Schwann se congelan para el analisis por Q-RT-PCR.
Estos experimentos se resumen en la Tabla 1.
Tabla 1
Combinacion
Expresion de PMP22
Mezcla 1
Sub-regulacion
Mezcla 2
Sub-regulacion
Mezcla 3
Sub-regulacion
Mezcla 4
Sub-regulacion
Mezcla 5
Sub-regulacion
Mezcla 6
Sub-regulacion
2. Determinacion del efecto sinergico de compuestos en la Mezcla 7 en un modelo de co-cultivo para CMT
Se uso un modelo de co-cultivo como modelo in vitro de CMT1A. Este modelo de mielinizacion consiste en co- cultivar neuronas sensitivas y celulas de Schwann de ganglios de la rafz dorsal (GRD) disociados transgenicos (TG) de PMP22, de un varon.
El objetivo de este estudio es determinar el efecto de 3 compuestos de ensayo (+/-baclofeno, naltrexona y sorbitol) y la Mezcla 7 (una mezcla de estos 3 farmacos) sobre el proceso de mielinizacion. El efecto de los 3 compuestos de ensayo y su mezcla sobre la mielinizacion, se determinan evaluando la expresion de la protema basica de mielina (abreviadamente en lo sucesivo MBP, por la expresion inglesa Myelin Basic Protein) en presencia de acido ascorbico.
2.1 Materiales y metodos
Ratas hembra prenadas de 15 dfas de gestacion se sacrifican por dislocacion cervical. Los embriones se retiran del utero y estan en una fase de desarrollo fetal similar.
2.1.1 Genotipado
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Un trozo de cada cabeza de embrion (3 mm3) se coloca en un tubo de 2 mL libre de DNasa. El DNA se extrae con el kit de PCR de tejido SYBR Green Extract-N-Amp (Sigma, ref XNATG-1KT). Sobre cada trozo de cabeza de embrion se colocaron 120 |iL de solucion de extraccion (Kit Sigma, ref XNATG-1KT). Las cabezas se incuban durante 10 minutos a temperature ambiente. Al final de esta incubacion, las cabezas se incuban durante 5 minutos a 95°C en la solucion de extraccion. Inmediatamente despues de esta ultima incubacion se anaden 100 |iL de solucion neutralizante, cada extracto de DNA se diluye a 1/40 con agua ultrapura esteril (Biosolve, ref: 91589) y se conserva a +4°C hasta su uso. El genotipado de embriones hembra (H) y macho (M) se realiza durante la diseccion del GRD, con el kit Fast SYBR Green Master Mix (Applied Biosystem, 4385612). El sexo de cada embrion se determina usando el gen SRY macho. Los cebadores de SRY son suministrados por Pharnext (SRY-F (SEQ ID NO: 9): 5'- GAGAGAGGCACAAGTTGGC-3'; SRY-R (SEQ ID NO: 10): 5'- GCCTCCTGGAAAAAGGGCC-3'). Los cebadores de SRY se diluyen a 3 |iM en agua ultrapura esteril (Biosolve, ref: 91589). Se prepara una mezcla para PCR con agua ultrapura (4 |iL por muestra), cebador a 3 |iM (2 |iL por muestra) y mezcla maestra (10 |iL por muestra). En una placa de 96 pocillos de PCR, se depositan en cada pocillo 16 |iL de mezcla de PCR. Se anaden 4 |iL de cada DNA diluido segun un deposito plano. La PCR se ejecuta usando el sistema de PCR 7500 fast RT-PCR (Applied Biosystem), con el siguiente programa:
Comienzo: 95°C - 20 segundos
45 ciclos: 95°C -10 segundos, 65°C -10 segundos, 72°C - 30 segundos (adquisicion de datos).
Curva de fusion: 95°C - 15 segundos, 64°C - 1 minuto, 90°C - 30 segundos (adquisicion continua de datos), 60°C - 15 segundos. Las graficas de la amplificacion y las curvas de fusion se analizan con el programa informatico 7500 (Applied Biosystems).
Los resultados para cada muestra se comparan con un control negativo (agua ultrapura) y con un control positivo (TG/macho y WT/hembra) para conseguir el genotipo de cada embrion.
2.1.2 Co-cultivos de neuronas sensitivas y de celulas de Schwann
Ganglios de la rafz dorsal de rata se cultivan como han descrito previamente Cosgaya et al., 2002 y Rangaraju et al., 2008.
Cada embrion se acondiciona en placas de Petri numeradas (35 mm de diametro). La cabeza de embrion se corta, se coloca en un tubo de 1,5 mL libre de DNasa; el DNA se extrae con el kit de tejido Extract-N-Amp (Sigma Aldrich). El genotipado (macho (M) y hembra (H), de tipo natural y PMP22 transgenico) se realiza con el kit Fast SYBR Green Master Mix (Applied Biosystem). Este genotipado se realiza en paralelo de la diseccion de los ganglios de la rafz dorsal (GRD), de manera que al final de la diseccion solo se hace un tipo de cultivo (GRD de macho transgenico). El GRD de cada embrion se recoge, se coloca en medio de Leibovitz enfriado con hielo (L15, Invitrogen). Al final de la diseccion, los GRD de TGM se reunen y se disocian por tripsinizacion (tripsina-EDTA, 0,05%; Invitrogen) durante 20 minutos a 37°C. La reaccion se detiene mediante la adicion de DMEM que contiene 10% de suero de bovino fetal (SBF) en presencia de DNasa I (Roche). La suspension se tritura con una pipeta de 10 mL. Luego, las celulas se centrifugan a 350 x g durante 10 minutos a temperatura ambiente. El sedimento de celulas disociadas se vuelve a poner en suspension en medio neurobasal (Invitrogen) que contiene 2% de B27 (Invitrogen), 1% de penicilina- estreptomicina (Invitrogen), 1% de L-glutamina y 50 ng/mL de Factor de crecimiento nervioso (FCN) (Sigma). Este medio es el medio neuronal. Se cuentan las celulas viables en un citometro Neubauer usando el ensayo de exclusion con azul de tripano (Sigma) y se siembran sobre la base de 10.000 celulas por pocillo en placas de 96 pocillos (Greiner) tratadas con poli-L-lisina. Las placas se mantienen a 37°C en un incubador humidificado, en una atmosfera de aire (95%)-CO2 (5%). La mitad del medio de cultivo neuronal estandar se cambia cada dos dfas. Los cultivos se mantienen en medio neurobasal estandar durante 7 dfas para permitir que las celulas de Schwann pueblen las neuritas de las neuronas sensitivas. El dfa 7, los cultivos se alimentan con medio neuronal estandar complementado o no con 50 |ig/mL de acido ascorbico con el fin de iniciar la formacion y mielinizacion de la lamina basal.
2.1.3. Incubacion de farmacos
El dfa 7, los siguientes compuestos de ensayo (solos o en combinacion) se anaden al medio con 50 |ig/mL de acido ascorbico:
■ (RS)-Baclofeno
■ Naltrexona
■ D-Sorbitol
■ Mezcla 7 = la combinacion de los 3 compuestos individuales.
Estos compuestos o combinacion de compuestos se ensayan a las siguientes concentraciones (Tabla 2):
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Tabla 2: Concentracion de farmacos individuales o en combinacion usados para estudios in vitro de la expresion de MBP en co-cultivos de GRD TG/CS.
Dosis 1 Dosis 2 Dosis 3 Dosis 4 Dosis 5 Dosis 6 Dosis 7
Farmacos individuales
Naltrexona 5 |iM 1 |iM 200 nM 40 nM 8 nM 1,6 nM 320 pM
D-Sorbitol
500 |iM 100 |iM 20 |iM 4 |iM 800 nM 160 nM 32 nM
(RS)-Baclofeno
5 |iM 1 |iM 200 nM 40 nM 8 nM 1,6 nM 320 pM
Mezcla 7
Naltrexona 5 |iM 1 |iM 200 nM 40 nM 8 nM 1,6 nM 320 pM
D-Sorbitol
500 |iM 100 |iM 20 |iM 4 |iM 800 nM 160 nM 32 nM
(RS)-Baclofeno
5 |iM 1 |iM 200 nM 40 nM 8 nM 1,6 nM 320 pM
Los compuestos de ensayo se incuban durante 5 tiempos diferentes: 5, 9, 10, 11 y 13 dfas. Se hacen tres cultivos de GRD (de embriones tG de ratas macho) separados e independientes. Estas condiciones se determinan en presencia de acido ascorbico, 6 pocillos por afeccion. La solucion lista para uso de todos los compuestos de ensayo se prepara extemporaneamente a partir de una disolucion madre, se conserva a -20 °C. Esta solucion se prepara una vez a la semana. La mitad del medio neuronal estandar complementado con compuestos de ensayo y acido ascorbico (cada uno a la concentracion 1X) se cambia cada dos dfas.
2.1.4 Protocolo de tincion
Despues de 5, 9, 10, 11 y 13 dfas de incubacion, las celulas se fijan por una solucion fna de etanol (95%) y acido acetico (5%) durante 10 minutos. Las celulas se permeabilizan y se bloquean con PBS que contiene 0,1% de saponina y 10% de suero de cabra durante 15 minutos. Luego, las celulas se incuban con un marcador espedfico de mielina: el anticuerpo policlonal anti-protema basica de mielina (MBP) (Sigma 118K0431).
Este anticuerpo se revela con Alexa Fluor 568- IgG anti-conejo de cabra y Alexa Fluor 488- IgG anti-raton de cabra (Molecular Probe 687621, 623962). Los nucleos de neuronas se marcan con un marcador fluorescente (solucion de Hoechst, SIGMA ref B1155).
2.1.5. Procesamiento de datos
Por pocillo se toman 20 fotograffas usando InCell Analyzer™ 1000 (GE Healthcare) con 20 aumentos. Todas las imagenes se toman en las mismas condiciones. El analisis de la longitud total de axones mielinizados se hizo automaticamente (longitud y area alrededor de los axones) usando el programa informatico Developer (GE Healthcare). Todos los valores se expresaran como media +/- error estandar de la media (eem). Los analisis estadfsticos se hacen en diferentes condiciones (ensayo ANOVA seguido de ensayo PLSD de Fisher cuando se permita).
2.2. Resultados
Efecto sinergico de farmacos en la eficacia de la Mezcla 7
Un efecto sinergico importante de los farmacos que componen la combinacion de la Mezcla 7 se observa sobre la expresion de MBP. De hecho, el dfa 10 (= 17 dfas de cultivo), la combinacion de (RS)-baclofeno, naltrexona y D- sorbitol aumenta significativamente la expresion de MBP a la dosis 1 y 6 como se muestra en las Figuras 1A y 2A. En contraste, los farmacos anteriormente usados individualmente no tienen efecto sustancial en comparacion con el control (Figuras 1B-D y 2B-D).
Tambien se registra un efecto significativo sobre la expresion de MBP despues de 10 dfas de incubacion a las dosis 2, 3, 4, 5 y 7 de la Mezcla 7 (Figura 3A).
Este efecto se observa todavfa el dfa 11 con las dosis 2-7 (Figura 3B) como una curva claramente en forma de campana.
C. Experimentos in vivo en el modelo animal de CMT
Los inventores ensayaron los compuestos para el efecto terapeutico en un modelo de rata.
Los grupos experimentales se forman con ratas jovenes de ambos sexos por separado. Las ratas se asignan a los grupos tras el programa de aleatorizacion basado en el peso corporal. En algunos experimentos, la aleatorizacion se basa en los rendimientos de las ratas en el ensayo de la barra. Ambos sexos se representan por grupos de control separados que son numericamente iguales o mayores que los grupos de tratamiento.
Las ratas se tratan cronicamente con farmacos - alimentacion forzada o se inyectan por la bomba subcutanea
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osmotica Alzet (DURECT Corporation Cupertino, CA), dependiendo de cada biodisponibilidad de farmaco durante 3 o 6 semanas. En todos los experimented in vivo realizados, la Mezcla 7 se administra por sonda nasogastrica.
Los animales se pesan dos veces a la semana con el fin de ajustar las dosis al peso corporal en aumento. Si se elige la bomba osmotica para la administracion del tratamiento, las dosis del farmaco se calculan basandose en el peso corporal medio estimado de los animales que se espera para su edad con respecto al periodo de duracion del bombeo (6 semanas). Las bombas se reimplantan si fuera necesario, con el protocolo de anestesia apropiado.
Ensayos de comportamiento
Cada tres o cuatro semanas los animales se someten a un ensayo de comportamiento. Cada ensayo es realizado por el mismo investigador en la misma sala y a la misma hora del dfa; esta homogeneidad se mantiene durante todo el experimento. Todos los tratamientos y la determinacion del genotipo son ciegos para el investigador. El “ensayo de la barra” y la “fuerza de agarre” se han usado principalmente para acceder al rendimiento durante todo el estudio. El programa del ensayo de la barra puede cambiar a medida que crece el animal (con el fin de prevenir el sesgo debido, por ejemplo, al aprendizaje).
El ensayo de la fuerza de agarre permite la deteccion de ligeras diferencias en el rendimiento del agarre que parecen estar compuestas por la fuerza muscular, estado de sensibilidad (por ejemplo, sensaciones tactiles dolorosas pueden cambiar los valores medidos de la fuerza), componente de comportamiento (“motivacion”). Los valores difieren entre las extremidades delanteras y traseras y dependen enormemente de la edad de los animales.
El ensayo de la fuerza de agarre mide la fuerza con la que un animal se sujeta a un agarrador con sus patas delanteras o sus patas traseras por separado. Se coloca un dinamometro con un agarrador para medir la fuerza (Force Gauge FG-5000A). La rata es sujetada por el experimentador de forma tal que sujete el agarrador con sus patas delanteras o con sus patas traseras y tira suavemente de la rata hacia atras hasta que suelte el agarrador. Se registra la fuerza medida cuando el animal suelta el agarrador.
Por animal se realizan dos ensayos sucesivos que miden la fuerza de las patas delanteras y dos ensayos sucesivos que miden la fuerza de las patas traseras; solo se registra la puntuacion maxima (una para las patas delanteras y otra para las patas traseras) (en N).
El ensayo de la barra
El ensayo de la barra determina la capacidad de la rata para sujetarse en una barra fija. Ratas con PMP22 que muestran debilidad muscular presentan un deficit de rendimiento en este ensayo (Sereda et al., 1996). La rata se coloca sobre su cuatros patas en el centro de la barra (diametro: 2,5 cm; longitud: 50 cm; 30 cm por encima de la mesa). Los ensayos se realizan consecutivamente; el numero y la duracion de los ensayos en los experimentos de los inventores dependfa de los lotes de los animales. Se ha introducido esta variabilidad en el ensayo con el fin de determinar el programa apropiado para la mejor deteccion de la deficiencia motora de las ratas con CMT en el transcurso de los experimentos.
Los indices de rendimiento se registran en cada sesion:
- El numero de ensayos necesario para mantenerse durante 60 segundos (o 30 segundos para el lote 1, sesion 1 y 2) sobre la barra.
- El tiempo pasado sobre la barra (es decir, la latencia de cafda) en cada ensayo y el valor medio en la sesion. En los metodos experimentales en los que la sesion termina despues de que la rata haya permanecido durante un tiempo de corte, es decir, 30 o 60 segundos, sobre la barra, se asigna un rendimiento del tiempo de corte (30 segundos o 60 segundos) a ensayos no completados (por ejemplo: para el lote 8, para un animal que permanece sobre la barra menos de 10 segundos en los ensayos 1, 2 y 3, luego durante 60 segundos en los ensayos 4 y 5, 60 segundos se asigna a los ensayos 6 a 10).
- El numero de cafdas.
Determinacion de la salud general
Durante todo el experimento se monitorizan los pesos corporales, signos evidentes (aspecto del pelaje, postura del cuerpo, modo de andar, temblor, etc.) de los animales. La escala de puntuacion se usa para registrar: 0 = normal, 1 = anormal.
El modo de andar
Cada rata se observa en una nueva jaula para ratas (dimensiones 55 x 33 x 18 cm) sin lecho durante cinco minutos. El modo de andar de las ratas se evalua con 4 parametros:
- Puntuacion 0: modo de andar normal (fluido)
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- Puntuacion 1: modo de andar anormal (no fluido o la rata tiene una ligera cojera)
- Puntuacion 2: incapacidad moderada (la rata arrastra una pata y puede ponerla recta y caminar)
- Puntuacion 3: incapacidad grave (la rata arrastra una o ambas patas traseras pero no puede ponerla(s) recta(s)).
Ensayo del plano inclinado
El aparato de deslizamiento tema un plano de Plexiglas de 30 x 50 cm que podna inclinarse a un angulo desde 0° (horizontal) hasta 60°. Cada rata se coloco inicialmente en el plano inclinado con un angulo de 25° en la posicion con la cabeza hacia arriba (orientacion cabeza hacia arriba); se realizan dos ensayos separados durante 1 minuto. Despues de 30 minutos, se realiza el mismo experimento en un plano inclinado con un angulo de 35°, luego en un plano inclinado 40°. Durante este tiempo, la rata se devolvio a su jaula. El plano se limpia despues de cada ensayo.
Los rendimientos de las ratas se evaluan con 4 puntuaciones diferentes:
- Puntuacion 0: sin deslizamiento
- Puntuacion 1: un poco de deslizamiento (una o dos patas)
- Puntuacion 2: un deslizamiento moderado (4 patas), pero no hasta el final del plano
- Puntuacion 3: la rata se desliza hasta muy al final del plano.
Ensayos adicionales
Cuando convenga, las ratas se someten a evaluacion electrofisiologica, medicion histologica y se cuantifica el nivel de expresion del RNA de PMP22 en el nervio ciatico.
Cuantificacion del RNA de PMP22 en el nervio ciatico por RT-PCR cuantitativa
Se aislo RNA total de nervios ciaticos izquierdos usando Qiazol (ref N° 79306, Qiagen GmbH, Alemania) seguido del metodo de purificacion de una sola etapa con el RNeasy Mini Kit (ref N° 74106, Qiagen GmbH, Alemania) descrito por el protocolo del fabricante (Qiagen-RNeasy Fibrous tissue Handbook). La contaminacion de DNA se elimino por digestion con DNasa I libre de RNasa usando el kit libre de DNA (Qiagen-RNase-free Dnase set 1500 Kunits, ref N° 1023460).
Las concentraciones de RNA se estiman por NanoDrop ND-1000 y se hizo un ensayo de control de calidad por nanochips Agilent RNA 6000 en el bioanalizador Agilent 2100. Transcripcion inversa y PCR en tiempo real: se realizo RT-PCR cuantitativa (Q-RT-PCR) del siguiente modo: 80 ng de RNA total se transcribieron de forma inversa usando la transcriptasa inversa Superscript™ II (Invitrogen, Carlsbad, CA) con Oligo(dT)12-18 (Invitrogen, Carlsbad, CA ) en un volumen de reaccion de 20 |iL.
La PCR en tiempo real se realizo con un sistema de ciclador termico rapido (LightCycler® 480 II, 384-Well, Roche, Suiza). Las amplificaciones se realizan en un volumen total de 10 |iL con concentracion de cebadores optimizada entre 130 nM y 1 |iM. Los cebadores y el molde se complementan con LightCycler® 480 SYBR Green I Master (2x conc. Roche, Cat. Ref N° 04 887 352 001). Los nucleotidos, MgCh, DNA-polimerasa de Taq y el tampon estan incluidos en la mezcla. Un protocolo de amplificacion incorporo una incubacion inicial a 95°C durante 10 minutos para la activacion de la DNA-polimerasa de Taq seguido de 45 ciclos, con una desnaturalizacion a 95°C durante 10 segundos, reasociacion a 60°C durante 40 segundos y extension hasta 72°C durante 10 segundos (la deteccion del producto fluorescente se realizo al final del periodo de extension a 72°C por un modo de adquisicion sencillo) y termino por un ciclo de curva de fusion con desnaturalizacion a 95°C durante 5 segundos, reasociacion a 63°C durante 60 segundos y 95°C (desde 63°C hasta 95°C la tasa de la rampa es 0,11°C/segundo y la deteccion del producto fluorescente fue continua). Para confirmar la especificidad de la amplificacion, el producto de PCR de cada par de cebadores se sometio a un analisis de curvas de fusion. La cuantificacion relativa se realizo basandose en el punto de cruce (valor Cp) para cada una de las muestras de la PCR. El punto al que la fluorescencia de una muestra sube por encima de la fluorescencia de referencia se llama el “punto de cruce (Cp)” de la muestra. Se uso el gen de la protema cero de la mielina (MPZ) de Rattus norvegicus para la normalizacion (Sereda et al., 2006). Las secuencias de los cebadores (sintetizadas por Eurofins MWG Operon, Alemania) usadas para el analisis por Q-RT- PCR son:
PMP22 - directo: 5'-TGTACCACATCCGCCTTGG-3' (SEQ ID NO: 11) y PMP22 - inverso: 5'-GAGCTGGCAGAAGAACAGGAAC-3' (SEQ ID NO: 12).
MPZ - directo: 5'-TGTTGCTGCTGTTGCTCTTC-3' (SEQ ID NO: 13) y MPZ - inverso: 5'-TTGTGAAATTTCCCCTTCTCC-3' (SEQ ID NO: 14).
Resultados
La composicion de la Mezcla 1 mejora los rendimientos del ensayo de la barra durante el metodo de tratamiento (Fig. 4).
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La Mezcla 1 mejora la puntuacion del modo de andar de ratas transgenicas despues de 3 y 6 semanas de tratamiento, como se muestra en la Figura 5.
La Mezcla 1 aumenta los rendimientos de ratas transgenicas despues de 3, 6, 9 y 12 semanas de tratamiento en el ensayo del plano inclinado 25° descrito en la Figura 6.
La Figura 7 ilustra el efecto positivo de la Mezcla 2 sobre la puntuacion del modo de andar de ratas transgenicas a 25, 35 y 40° en el ensayo del plano inclinado.
La Mezcla 7 (dosis 3) disminuye significativamente la expresion de RNA del gen PMP22 en el nervio ciatico de ratas transgenicas con PMP22 (Figura 9).
Los rendimientos de ratas con PMP22 tratadas con la Mezcla 7 (dosis 2 y dosis 3) estan mejorados en el ensayo del plano inclinado 35° (Figura 10). Mas espedficamente, el 29 y el 33% de ratas pertenecen al grupo de buen rendimiento en comparacion con el 5% para el grupo TG con placebo y el 29 y el 11% de las ratas pertenecen al grupo de escaso rendimiento en comparacion con el 60% para el grupo TG con placebo. El valor de p (frente al TG con placebo) es igual a 0,0152 para las ratas TG tratadas con la dosis 2 de la Mezcla 7 y el valor de p es igual a 0,002 para las ratas TG tratadas con la dosis 3 de la Mezcla 7 (frente al TG con placebo).
La dosis 3 de la Mezcla 7 aumenta significativamente el tiempo de latencia de cafda de ratas con PMP22 en el ensayo de la barra despues de 9 semanas de tratamiento (Figura 11): lmea de rayas negra, p=4,56.10-2, n=18. Tambien se observan diferencias significativas entre ratas TG con placebo (lmea continua negra, n=20) y ratas WT con placebo (lmea continua gris, p=3,82.10-7, n=18).
La Figura 12 ilustra la mejora de la fuerza de agarre de las ratas con PMP22 tratadas con la dosis 3 de la Mezcla 7.
La Figura 13 muestra la correlacion significativa entre el tiempo de latencia en el ensayo de la barra (despues de 9 semanas de tratamiento con la dosis 3 de la Mezcla 7) y el nivel de expresion de RNA de PMP22.
La Figura 14 muestra la correlacion significativa entre el tiempo de latencia en el ensayo de la barra despues de 9 semanas de tratamiento con la dosis 3 de la Mezcla 7 y la velocidad de conduccion del nervio sensible (cola).
Se obtienen resultados similares para otras combinaciones (vease la Tabla 3).
Tabla 3
Combinacion
Fenotipo de la enfermedad de rata con PMP22
Mezcla 1
Mejora
Mezcla 2
Mejora
Mezcla 3
Mejora
Mezcla 4
Mejora
Mezcla 5
Mejora
Mezcla 6
Mejora
Estos datos muestran que, in vivo, las combinaciones y regfmenes de la presente invencion permiten un tratamiento eficaz de la CMT.
D. Efecto in vivo en un modelo de neuropatia toxica
Los tratamientos o regfmenes con farmacos se administran por via oral a partir del dfa anterior a la primera inyeccion intraperitoneal de 3 mg/kg de oxaliplatino (D -1) hasta el dfa anterior al ultimo dfa de ensayo (D 16). A los animales que pertenecen al grupo tratado con oxaliplatino se les administra diariamente agua destilada (10 mL/kg). A los animales se les administra el tratamiento de ensayo y agua destilada diariamente durante la manana, mientras que el oxaliplatino se administra por la tarde.
Durante los dfas de ensayo (es decir, D1, D4, D10), el tratamiento y el agua destilada se administran despues del la ensayo. Con respecto al dfa de ensayo (D4), que incluye administraciones de compuestos y veldculos e inyeccion de oxaliplatino, el tratamiento y el agua destilada se administran antes de la inyeccion de oxaliplatino despues del ensayo. A los animales del grupo tratado de referencia solo se les administra durante los dfas de ensayo (es decir, D1, D4, D10 y D17).
Se determina la alodinia al frio midiendo las respuestas a estimulacion no nociceptiva termica (ensayo de la acetona) el D1 (alrededor de 24 horas despues de la primera inyeccion de 3 mg/kg de oxaliplatino (efecto agudo de oxaliplatino), el D4, D10 (efecto cronico de oxaliplatino) y el D17 (efecto residual de oxaliplatino una semana despues de completarse el tratamiento).
El analisis se realiza usando el ensayo de la acetona 2 horas despues de la administracion de la referencia. La
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sustancia de referencia es gabapentina, 100 mg/kg, por via oral (una vez al dfa x 4 dfas de ensayo).
Ensayo de la acetona
Se determina la alodinia al fno usando el ensayo de la acetona. En este ensayo, se mide la latencia de la retirada de las patas traseras despues de la aplicacion de una gota de acetona a la superficie plantar de ambas patas traseras (tiempo de reaccion) y se puntua la intensidad de la respuesta (puntuacion de fno).
El tiempo de reaccion al efecto del fno de la acetona se mide dentro de 20 segundos (corte) despues de la aplicacion de acetona. Las respuestas a la acetona tambien se clasifican en la siguiente escala de 4 puntos: 0 (sin respuesta); 1 (rapida retirada, sacudida de la pata); 2 (retirada prolongada o sacudida marcada de la pata); 3 (sacudida repetida de la pata con lametazos o mordiscos).
Se realizan seis ensayos por rata. Para cada grupo experimental, los resultados se expresan como la puntuacion de fno acumulada definida como la suma de las 6 puntuaciones para cada rata juntas ± EEM. Siendo la puntuacion minima 0 (sin respuesta a cualquiera de los 6 ensayos) y siendo la puntuacion maxima posible 18 (sacudidas y lametazos o mordiscos repetidos de las patas en cada uno de los seis ensayos).
Fuente de gabapentina: Zhejiang Chiral Medicine Chemicals, China
Fuente de oxaliplatino: Sigma, Francia
Los resultados se representan en la Figura 8. Muestran claramente un efecto protector de la composicion de la presente invencion sobre la neuropatfa inducida por oxaliplatino.
E. Efecto in vivo en un modelo de ELA
Modelo animal
Los inventores han elegido el modelo de rata SOD1G93A (generado por Howland et al.) para imitar la patologfa de la esclerosis lateral amiotrofica. Este modelo sobre-expresa el gen SOD1 mutado en la medula espinal, en muchas regiones cerebrales, asf como en tejidos perifericos. La aparicion de la enfermedad de las neuronas motoras en este modelo es aproximadamente a los 115 dfas; aparece como un modo de andar anormal de las extremidades traseras. En pocos dfas se produce la paralisis de la extremidad trasera.
Metodos experimentales
Los inventores obtuvieron colonias cruzando ratas SOD1G93A reproductoras con ratas hembra Sprague Dawley. Las ratas SOD1G93A heterocigoticas se identifican por la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) del DNA de la cola con cebadores espedficos para hSOD1 [1]. Los animales se mantienen en una sala con iluminacion (luces encendidas desde 05:00 hasta 19:00 horas) y temperatura (23±1°C) controladas y tienen libre acceso a alimento y agua. Todos los metodos en animales en el presente estudio se llevan a cabo segun las directrices estandares del cuidado animal. La medicion del peso corporal se realizo cada semana y los ensayos de comportamiento empezaron a una edad de 60 dfas y continuaron hasta el punto final. Los tratamientos se administran cada dfa por via oral o subcutanea a partir de la edad de 5 semanas.
1. Ensayo de observacion: caracterizacion del aspecto general
Cada rata se observo en una nueva jaula para ratas (dimensiones 55 x 33 x 18 cm) sin lecho durante cinco minutos. Se registran 5 parametros diferentes:
El modo de andar
- Puntuacion 0:
- Puntuacion 1
- Puntuacion 2:
- Puntuacion 3 recta(s))
El aspecto del pelaje
- Puntuacion 0: pelaje limpio y sedoso
- Puntuacion 1: piloereccion o pelaje sucio
El temblor
- Puntuacion 0: sin temblor
- Puntuacion 1: temblor
: modo de andar normal (fluido)
: modo de andar anormal (no fluido o la rata tiene una ligera cojera)
: incapacidad moderada (la rata arrastra una pata y puede ponerla recta y caminar)
: incapacidad grave (la rata arrastra una o ambas patas traseras pero no puede ponerla(s)
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La posicion del cuerpo
- Puntuacion 0: normal
- Puntuacion 1: anormal (aplanada o con la espalda arqueada)
La posicion de las patas traseras
- Puntuacion 0: normal
- Puntuacion 1: patas traseras extendidas
2. El ensayo de puntuacion motora: caracterizacion del deficit motor
Este ensayo evalua la capacidad de las ratas para enderezarse por sf mismas en el plazo de 30 segundos despues de haberse tumbado sobre cualquier lado (reflejo de enderezamiento) (Gale et al.).
Se uso un sistema de puntuacion no parametrico siguiendo estos criterios (Matsumoto et al., Thonhoff et al.):
- Puntuacion 0: la rata no puede enderezarse por sf misma desde cualquier lado en el plazo de 30 segundos
- Puntuacion 1: la rata no puede enderezarse por sf misma desde solo un lado en el plazo de 30 segundos
- Puntuacion 2: la rata puede enderezarse por sf misma desde ambos lados en el plazo de 30 segundos, pero no puede mantenerse de pie en la jaula; siempre esta arrastrando algunas partes de su cuerpo
- Puntuacion 3: la rata puede enderezarse por sf misma desde ambos lados en el plazo de 30 segundos, no puede mantenerse de pie en la jaula, pero no esta arrastrando ninguna parte del cuerpo
- Puntuacion 4: la rata puede enderezarse por sf misma desde ambos lados en el plazo de 30 segundos, puede mantenerse de pie en la jaula, pero tienen deficits funcionales visibles
- Puntuacion 5: la rata puede enderezarse por sf misma desde ambos lados en el plazo de 30 segundos, puede mantenerse de pie en la jaula y no tiene deficits funcionales visibles.
El punto final de la enfermedad se fija en la puntuacion 0; entonces la rata se sacrifica.
3. Ensayo del plano inclinado: caracterizacion del deficit motor
El aparato de deslizamiento tema un plano de Plexiglas de 30 x 50 cm que podfa estar inclinado un angulo desde 0° (horizontal) hasta 60°. Cada rata se coloco inicialmente en el plano inclinado con un angulo de 25° en la posicion con la cabeza hacia arriba (orientacion cabeza hacia arriba); se realizan dos ensayos separados por 1 minuto. Despues de 30 minutos, el mismo experimento se realiza en un plano inclinado 35°, luego en un plano inclinado 40°. Durante este tiempo, la rata se devolvio a su jaula. El plano se limpia despues de cada ensayo.
Los rendimientos de ratas se evaluan con 4 puntuaciones diferentes:
- Puntuacion 0: sin deslizamiento
- Puntuacion 1: un poco de deslizamiento (una o dos patas)
- Puntuacion 2: un deslizamiento moderado (4 patas), pero no hasta el final del plano
- Puntuacion 3: la rata se desliza hasta muy al final del plano.
4. El ensayo de la malla de alambre: caracterizacion de la capacidad motora en situacion diffcil
Se coloco una malla de alambre en contacto con una caja en la parte superior (a un angulo de 70°) y el borde de una mesa en la parte inferior. Cada rata se coloco en la parte inferior de la malla de alambre y se motivo para que ascendiera colocando a sus companeros de camada en la caja en la parte superior. Cada rata se entreno una vez a la semana (3 ensayos). El parametro registrado fue el tiempo de latencia para alcanzar la parte superior de la malla de alambre.
5. El ensayo de campo abierto: caracterizacion de la actividad locomotora
La actividad locomotora se midio en una caja de Plexiglas (45 x 45 x 30 cm, Acti-Track de BIOSEB, Lyon, Francia) con 16 rayos de celulas fotoelectricas siguiendo los dos ejes, 1 y 5 cm por encima del suelo.
La actividad espontanea y exploradora de cada rata se evaluo durante 3 horas.
Se registran 4 parametros (la distancia desplazada total, el numero de posturas erguidas, el porcentaje de distancia desplazada y de tiempo pasado en el centro del campo abierto).
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20

Claims (10)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    REIVINDICACIONES
    1. Una composicion que comprende rapamicina y mifepristona, sales, enantiomeros o racematos de las mismas, para la administracion simultanea, por separado o secuencial a un sujeto mairnfero.
  2. 2. La composicion de la reivindicacion 1, que ademas comprende un compuesto seleccionado entre acetazolamida, albuterol, amilorida, aminoglutetimida, amiodarona, aztreonam, baclofeno, balsalazida, betama, betanecol, bicalutamida, bromocriptina, bumetanida, buspirona, carbacol, carbamazepina, carbimazol, cevimelina, ciprofloxacina, clonidina, curcumina, ciclosporina A, diazepam, diclofenaco, dinoprostona, disulfiram, D-sorbitol, dutasterida, estradiol, exemestano, felbamato, fenofibrato, finasterida, flumazenilo, flunitrazepam, flurbiprofeno, furosemida, gabapentina, galantamina, haloperidol, ibuprofeno, isoproterenol, ketoconazol, ketoprofeno, L-carnitina, liotironina (T3), litio, losartan, loxapina, meloxicam, metaproterenol, metaraminol, metformina, metacolina, metimazol, metilergonovina, metoprolol, metirapona, miconazol, nadolol, naloxona, naltrexona, norfloxacina, pentazocina, fenoxibenzamina, fenilbutirato, pilocarpina, pioglitazona, prazosina, propiltiouracilo, raloxifeno, rifampina, simvastatina, espironolactona, tacrolimus, tamoxifeno, trehalosa, trilostano, acido valproico, sales, enantiomeros o racematos de las mismas, para la administracion simultanea, por separado o secuencial a un sujeto mai^ero.
  3. 3. La composicion de la reivindicacion 2 que comprende:
    (a) rapamicina,
    (b) mifepristona, y
    (c) un compuesto seleccionado entre pilocarpina, baclofeno y metimazol,
    sales, enantiomeros o racematos de los mismos, para administracion simultanea, por separado o secuencial a un sujeto marnffero
  4. 4. La composicion de la reivindicacion 2 o 3, que comprende rapamicina, mifepristona y pilocarpina, sales, enantiomeros o racematos de los mismos.
  5. 5. La composicion de la reivindicacion 2 o 3, que comprende rapamicina, mifepristona y baclofeno, sales, enantiomeros o racematos de los mismos.
  6. 6. La composicion de la reivindicacion 2 o 3, que comprende rapamicina, mifepristona y metimazol, sales, enantiomeros o racematos de los mismos.
  7. 7. La composicion de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que ademas comprende un excipiente o vehfculo farmaceuticamente adecuado.
  8. 8. La composicion de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para el uso en el tratamiento de la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth ("CMT"), una neuropatfa toxica o esclerosis lateral amiotrofica ("ELA").
  9. 9. El uso segun la reivindicacion 8, en el que la CMT es CMT1A.
  10. 10. La composicion o composicion para el uso segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dichos compuestos se formulan con una biomolecula, lfpidos formadores de micelas o liposomas o emulsiones de aceite en agua o nanopartfculas o micropartfculas pegiladas o solidas para la administracion oral o parenteral o intratecal.
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