KR20120027353A - Ｃｍｔ 및 관련 장애를 치료하기 위한 신규 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 샤르코-마리-투스 질환(Charcot-Marie-Tooth disease) 및 관련 장애를 치료하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.

Description

ＣＭＴ 및 관련 장애를 치료하기 위한 신규 조성물 {NEW COMPOSITIONS FOR TREATING CMT AND RELATED DISORDERS}
본 발명은 샤르코-마리-투스 질환 및 관련 장애를 치료하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
샤르코-마리-투스 질환 (Charcot-Marie-Tooth disease; "CMT")은 소아 유전 말초 다발성 신경장애(peripheral poly neuropathy)이다. 2,500명 중 약 1명에게 발병하는, 본 질환은 말초 신경 장애의 가장 흔한 유전 장애이다. 이 장애는 전형적으로 비록 유년기에 탐지될 수 있음에도 불구하고 10대 또는 20대에 발병한다. 본 질환의 원인은 점진적 신경근 변성증 (gradual neuromuscular degeneration)이 만성화되는 것이다. 본 질환은 동반하는 신경성 통증 및 극심한 근육 장애 증상으로 입증된다. CMT는 프랑스에서 약 30,000 명에 대한 유전적 병리원에 대해 가장 많이 연구된 분야이다. 대다수의 CMT 환자가 미엘린(myelin) 유전자(PMP22; CMT1A 형)를 포함하는 크로모좀 (chromosome) 17 단편의 중첩(duplication)을 품고 있는 반면에, 24개 유전자가 상이한 형태의 CMT와 관련된다. 따라서 기원상 단일 유전자임에도 불구하고, 이 병태는 가능한 조절 유전자로 기인한 임상적 이질성을 나타낸다. CMT 환자에서의 변이된 유전자는 슈완세포 (Schwann cells) 또는 신경세포의 분화에 영향을 미치거나 말초 신경에서의 이러한 세포들의 상호작용을 변화시키는 주변으로 밀집하고 단단하게 연계된 분자 경로들이다.
CMT1A 질병의 분자 기전 및 병리학적 증상을 설명하는 공중에 입수 가능한 데이타의 수집을 기반으로 하여, 몇 개의 기능적인 세포성 모듈(cellular modules) (1) PMP22 유전자 전사 조절, (2) PMP22 단백질 접힘(folding)/분해(degradation), (3) 슈완세포 증식 및 세포 사멸, (4) 세포외 매트릭스 (matrix) 고착 및 리모델링(remodelling), (5) 면역 반응의 순으로 CMT-관련 치료학적 간섭을 위한 잠재적으로 합리적인 목표로서 우선 순위를 매길 수 있다. 이러한 비조절된 기능적 요소들의 시발점상의 조합된 충격 및 샤르코-마리-투스 질환의 병적 증상의 진행은 조합적인 CMT 치료법이 잠재적으로 효율성을 나타냄을 정당화한다.
국제특허출원 제 PCT/EP2008/066457호는 병리학적 역동 모델 구축 및 CMT 질환 조절과 관련된 기능성 세포 경로의 목표화(targeting)를 통하여 샤르코-마리-투스 질환 치료를 위한 약물 후보물질들을 동정하는 방법을 개시한다. 국제특허출원 제 PCT/EP2008/066468호는 다중 약물 후보물질 군으로부터 선택된 3개 이상의 화합물을 포함하는 샤르코-마리-투스 질환의 치료를 위한 조성물을 개시한다.
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본 발명의 목적은 CMT 및 관련 장애를 치료하기 위한 새로운 치료학적 조합을 제공하는 것이다. 따라서, 본 발명은 CMT 및 관련 장애, 특히, 특정 약물 조합을 이용한 중독성 신경병증 (toxic neuropathy) 및 근위축성 측삭경화증(amyotrophic lateral sclerosis)을 치료하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 보다 상세하게는, 포유동물 객체에 동시적(simultaneous), 개별적 (separate) 또는 일련적(sequential)인 투여를 위한, 바클로펜(Baclofen), 소르비톨(Sorbitol) 및 필로카핀(Pilocarpine), 메티마졸(Methimazole), 미페프리스톤(Mifepristone), 날트렉손(Naltrexone), 라파마이신 (Rapamycine), 플루비프로펜(Flurbiprofen) 및 케토프로펜( Ketoprofen)으로부터 선택된 화합물, 이의 염 또는 전구체(prodrugs)를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 또 다른 특정한 목적은 포유동물 객체에 동시적(simultaneous), 개별적 (separate) 또는 일련적(sequential)인 투여를 위한, 바클로펜(Baclofen), 소르비톨(Sorbitol) 및 날트렉손(Naltrexone)을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 목적은 CMT 및 관련 장애를 치료하기 위한 새로운 치료학적 조합을 제공하는 것이다. 따라서, 본 발명은 CMT 및 관련 장애, 특히, 특정 약물 조합을 이용한 중독성 신경병증 (toxic neuropathy) 및 근위축성 측삭경화증(amyotrophic lateral sclerosis; ALS)을 치료하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 보다 상세하게는, 포유동물 객체에 동시적(simultaneous), 개별적 (separate) 또는 일련적(sequential)인 투여를 위한, 바클로펜(Baclofen), 소르비톨(Sorbitol) 및 필로카핀(Pilocarpine), 메티마졸(Methimazole), 미페프리스톤(Mifepristone), 날트렉손(Naltrexone), 라파마이신 (Rapamycine), 플루비프로펜(Flurbiprofen) 및 케토프로펜( Ketoprofen)으로부터 선택된 화합물, 이의 염 또는 전구체(prodrugs)를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 특정한 목적은 포유동물 객체에 동시적(simultaneous), 개별적 (separate) 또는 일련적(sequential)인 투여를 위한, 바클로펜(Baclofen), 소르비톨(Sorbitol) 및 날트렉손(Naltrexone)을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 특정한 목적은 포유동물 객체에 동시적(simultaneous), 개별적 (separate) 또는 일련적(sequential)인 투여를 위한, (a) 라파마이신(rapamycin), (b) 미페프리스톤(mifepristone) 또는 날트렉손(naltrexone), 및 (c) PMP22 조절제(modulator)를 함유하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 특정한 구현예로서, 상기 PMP22 조절제(modulator)는 아세타졸아미드(Acetazolamide), 알부테롤(Albuterol), 아밀로리드(Amiloride), 아미노글루테치미드(Aminoglutethimide), 아미오다론(Amiodarone), 아즈트레오남(Aztreonam), 바클로펜(Baclofen), 발살라지드(Balsalazide), 베타인(Betaine), 베탄콜(Bethanechol), 비칼루타미드(Bicalutamide), 브로모크립틴(Bromocriptine), 부메타니드(Bumetanide), 부스피론(Buspirone), 카바콜(Carbachol), 카바마제핀(Carbamazepine), 카르비마졸(Carbimazole), 세피멜린(Cevimeline), 시프로플록사신(Ciprofloxacin), 클로니딘(Clonidine), 쿠르쿠민(Curcumin), 시클로스포린(Cyclosporine) A, 디아제팜(Diazepam), 디클로페낙(Diclofenac), 디노프로스톤 (Dinoprostone), 디설피람(Disulfiram), D-소르비톨(Sorbitol), 두타스테리드(Dutasteride), 에스트라디올(Estradiol), 엑세메스탄(Exemestane), 펠바메이트(Felbamate), 페노피브레이트(Fenofibrate), 피나스테리드(Finasteride), 플루마제닐(Flumazenil), 플루니트라제팜(Flunitrazepam), 플루비프로펜(Flurbiprofen), 퓨로세미드(Furosemide), 가바펜틴(Gabapentin), 갈란타민(Galantamine), 할로페리돌(Haloperidol), 이부프로펜(Ibuprofen), 이소프로테레놀(Isoproterenol), 케토코나졸(Ketoconazole), 케토프로펜(Ketoprofen), L-카르니틴(carnitine), 리오티로닌(Liothyronine; T3), 리튬(Lithium), 로사르탄(Losartan), 록사핀(Loxapine), 멜록시캄(Meloxicam), 메타프로테레놀(Metaproterenol), 메타라미놀(Metaraminol), 메트포르민(Metformin), 메타콜린(Methacholine), 메티마졸(Methimazole), 메틸에르고노빈(Methylergonovine), 메토프롤롤(Metoprolol), 메티라폰(Metyrapone), 미코나졸(Miconazole), 미페프로스톤(Mifepristone), 나돌롤(Nadolol), 날록손(Naloxone), 날트렉손(Naltrexone); 노르플록사신(Norfloxacin), 펜타조신(Pentazocine), 페녹시벤자민(Phenoxybenzamine), 페닐부티레이트(Phenylbutyrate), 필로카핀(Pilocarpine), 피오글리타존(Pioglitazone), 프라조신(Prazosin), 프로필티오우라실(Propylthiouracil), 랄록시펜(Raloxifene), 라파마이신(Rapamycin), 리팜핀(Rifampin), 심바스타틴(Simvastatin), 스피로노락톤(Spironolactone), 타클로리무스(Tacrolimus), 타목시펜(Tamoxifen), 트레할로스(Trehalose), 트릴로스탄(Trilostane), 또는 발프로익산(Valproic acid)으로부터 선택된 화합물, 이의 염 또는 전구체(prodrugs)이다.
본 발명의 또 다른 특정한 목적은 포유동물 객체에 동시적(simultaneous), 개별적 (separate) 또는 일련적(sequential)인 투여를 위한, 라파마이신(rapamycin) 및 미페프리스톤(mifepristone)를 함유하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상술한 조성물이외에 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제(excipients) 또는 담체(carrier)를 함유하는(즉, 약학조성물) 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 CMT 또는 관련 장애를 치료하기 위한 상술한 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 CMT 또는 관련 장애를 치료하기 위한 약제 제조를 위한 상술한 화합물들의 조합의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 효과적인 양의 상술한 조성물을 이를 필요로 하는 객체에게 투여함을 포함하는 CMT 또는 관련 장애를 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 화합물들을 적절한 부형제(excipients) 또는 담체(carrier)에 혼합함을 포함하는, 약학 조성물의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 보다 구체적인 목적은 효과적인 양의 상술한 화합물 또는 상기 화합물 조합을 이를 필요로 하는 객체에게 투여함을 포함하는, 객체의 CMT1a을 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 구체적인 목적은 효과적인 양의 상술한 화합물 또는 상기 화합물들의 조합을 이를 필요로 하는 객체에게 투여함을 포함하는, 객체의 중독성 신경변증(toxic neuropathy)을 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 구체적인 목적은 효과적인 양의 상술한 화합물 또는 상기 화합물들의 조합을 이를 필요로 하는 객체에게 투여함을 포함하는, 객체의 ALS을 치료하는 방법에 관한 것이다.
본원에서 개시된 다양한 용도 또는 방법 중 어느 것도 또한 CMT 또는 관련 장애, 특히 CMT1A를 갖는 환자를 진단; 또는 CMT 또는 관련 장애, 특히 CMT1A로 발전할 위험성이 있는 개인을 동정하는 선택적인 단계를 포함할 수 있다.
이와 관련하여, 본 발명의 또 다른 목적은 (1) 객체가 CMT, 특히 CMT1a을 갖는지 여부를 측정하는 단계; (2) 효과적인 양의 상술한 바와 같은 화합물들 조합으로 CMT, 특히 CMT1a을 갖는 객체를 치료하는 단계를 포함하는, CMT, 특히 CMT1a를 치료하는 방법을 제공하는 것이다. 객체가 CMT, 특히 CMT1a을 갖는지 여부를 측정하는 상기 단계는 당업계에 잘 알려진, DNA 어세이법(assay)과 같은 다양한 시험법으로 수행가능하다.
본 발명은 어떠한 포유동물 객체, 특히 인간 객체에서의 CMT 또는 관련 장애, 보다 바람직하게는 CMT1a를 치료하는 방법으로 사용가능하다.
본 발명은 샤르코-마리-투스 질환(Charcot-Marie-Tooth disease) 및 관련 장애를 치료하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것으로, 본 발명은 CMT 또는 관련 장애의 치료 및 예방에 유용하다.
본 발명의 상기한 목적들 및 장점들은 하기한 발명의 상세한 설명뿐만 아니라, 명세서 전반에 걸친 설시되는 일부들을 의미하는 참고 기호 및 이에 제한되지 않은 첨부되는 하기 도에 대한 설명란을 고려한다면 보다 명확히 설명될 것이다.
도 1은 약물 조합, 용량(dose) 1의 상승 효과를 나타낸 도이며[MBP 발현에 미치는 (A) Mix7 (용량 1, 10일), (B)d-소르비톨(SRB, 500, 10일), (C) (R/S)-바클로펜(BCL, 5, 10일) 및 (D)날트렉손 (NTX, 5, 10일)의 효과; *:p<0.05:대조군(아스코르빈산)과 유의적으로 상이함, 피셔 포스트-혹 검정법(Fisher Post-hoc test)후 일-원(One-Way) ANOVA 검정법 수행];
도 2은 약물 조합, 용량(dose) 6의 상승 효과를 나타낸 도이며[MBP 발현에 미치는 (A) Mix7 (용량 6, 10일), (B) SRB (160nM, 10일), (C) BCL (1.6nM, 10일) 및 (D) NTX (1.6nM, 10일)의 효과; *:p<0.05: 대조군(아스코르빈산)과 유의적으로 상이함, 피셔 포스트-혹 검정법(Fisher Post-hoc test)후 일-원(One-Way) ANOVA 검정법 수행, ns: 통계학적으로 상이하지 않음];
도 3은 대조군(아스코르빈산) 백분율 대비 MBP 발현 상에서 PMP22 TG 공동-배양물에서의 아스코르빈산과의 배양 (A) 10일째 및 (B) 11일째 Mix7 (7 용량)의 양성 효과를 나타낸 도이며[ 피셔 포스트-혹 검정법(Fisher Post-hoc test)후 일-원(One-Way) ANOVA 검정법 수행];
도 4은 막대시험법(bar test)을 이용한 측정시 Mix1과의 3 및 6주 처치시의 수컷 래트 (rat)에 대한 양성 효과를 나타낸 도이며[잠재기(latencies)는 2개의 최초시험 결과의 평균으로 측정하고, 백색 막대(white bar)는 플라세보(placebo)로 처치한 대조군 래트를 표시하고, 흑색 막대(black bars)는 플라세보로 처치한 유전자변형 래트를 표시하고, 회색 막대(grey bar)는 Mix1으로 처치한 유전자 변형 래트를 표시하고, ** p<0.01. 통계는 스튜던트의 양측 검정법(Student bilateral test)으로 구현];
도 5은 Mix1 조성물의 3 및 6주째(좌측 및 우측 그래프)의 수컷 래트의 보행에 미치는 양성 효과를 나타낸 도이며[백색 막대(white bar)는 부드러운 보행(fluid gait)을 표시하고, 회색 막대(grey bar)는 부드럽지 않은 보행을 표시하고, 흑색 막대(black bars)는 보행상에 심각한 장애를 나타내는 래트를 표시하고, 통계는 스튜던트의 양측 검정법(Student bilateral test)으로 구현];
도 6은 경사면 시험법(inclined plane test; 25°)을 이용한 측정시 Mix1 조성물의 수컷 래트 (rat)에 대한 양성 효과를 나타낸 도이며[백색 막대(white bar)는 플라세보(placebo)로 처치한 대조군 래트를 표시하고, 흑색 막대(black bars)는 플라세보로 처치한 유전자변형 래트를 표시하고, 회색 막대(grey bar)는 Mix1으로 처치한 유전자 변형 래트를 표시하고, ** p<0.05. 통계는 스튜던트의 양측 검정법(Student bilateral test)으로 구현];
도 7은 경사면 시험법(inclined plane test)을 이용한 측정시 Mix1 조성물의 3주 암컷 래트 (rat)에 대한 양성 효과를 나타낸 도이며[백색 막대(white bar)는 플라세보(placebo)로 처치한 대조군 래트를 표시하고, 흑색 막대(black bars)는 플라세보로 처치한 유전자변형 래트를 표시하고, 회색 막대(grey bar)는 Mix2로 처치한 유전자 변형 래트를 표시하고, ** p<0.01. 통계는 스튜던트의 양측 검정법(Student bilateral test)으로 구현];
도 8은 옥살리플라틴 (oxaliplatin)-유도 긴경병증에 대한 Mix1의 수컷 래트 (rat)에 대한 보호 효과를 나타낸 도이며[백색 막대(white bar)는 플라세보(placebo)로 처치한 야생형(wild type) 래트를 표시하고, 흑색 막대(black bars)는 참고용 산물(reference product)인 가바펜틴(gabapentin)으로 처치한 야생형래트를 표시하고, 회색 막대(grey bar)는 Mix1으로 처치한 야생형 래트를 표시하고, ** p<0.05. 통계는 스튜던트의 양측 검정법(Student bilateral test)으로 구현];
도 9은 Mix7-용량(dose) 3으로 처치된 9주후 관찰된 유전자변형 동물에서, PMP22 유전자 변형 래트와 비교시에 PMP22 RNA 발현상의 유의적인 감소현상을 나타낸 도이며[참고용 유전자 MPZ, 세레다 등의 문헌참고(Sereda et al, 1996) (p = 0.0015); PMP 22 유전자의 전이유전자(transgene) 완성 및 과발현도 확인되었고; 유전자 변형 PMP22 래트에서의 pmp22 RNA는 이의 야생형 한배새끼 대조군과 비교시 1.8 배 과발현되었고 (p < 1.10-4), pmp22 RNA 추출은 16 주령 수컷 래트의 좌골신경상에서 수행되었으며 (n=18:야생형, n=20: 유전자변형 래트 및 n=18: Mix7-dose3로 처치된 TG임), 통계는 웰시의 t-시험법(test)으로 구현];
도 10은 경사면 시험 점수법(inclined plane test score; 35°)상에서 수행된 군집분석법(clustering analysis) 결과를 나타낸 도이며 [측정 모든 시점, 즉, 분석된 처치 3, 6 및 9주째에서 불량(poor), 중간(intermediate) 및 우수 행동 분류(good performance classes)에서 분류되고, 유의적 상이성은 WT 및 TG 플라세보 사이에서 관찰되었고: WT의 68%는 우수 행동 군에 속하고 TG 플라세보의 5%만이 이 군에 속하고 (p=0,0003), Mix7-용량(dose) 2 및 용량 3은 TG 래트의 행동을 개선시켰으며 통계학적 분석은 5% 유의수준에서 추세검정법(trend-test)을 적용하였으며 (n=18: WT 플라세보 래트, n=20: TG 플라세보 래트, n=17: Mix7-용량(dose) 2으로 처치된 TG, n=18: Mix7-용량3으로 처치된 TG)];.
도 11은 Mix7-용량 3 처치 9주후 막대 시험법에서 TG 래트의 낙상 반응시간(fall latencies)을 샌드위치 분산 추정량 (sandwich variance estimator)을 갖는 콕소 모델법 (Cox model)을 이용하여 분석한 결과를 나타낸 도로서, 5% 유의 수준에서 로그 순위 검정법 (log rank-test)을 적용하여 참고용 TG 플라세보와 비교되었으며, Mix7-용량(dose) 3 처치 9주후에 TG 래트의 낙상 반응시간을 증가시킴을 나타낸 도이며 ;.
도 12은 Mix7-용량 3로 9주간 처치된 야생형, 유전자변형 플라세보 및 유전자변형 동물들의 악력(grip strength)을 처치 후(3, 6 및 9주) 내내 샌드위치 분산 추정량 (sandwich variance estimator)을 갖는 콕소 모델법 (Cox model)을 이용하여 분석한 결과를 나타낸 도로서, 5% 유의 수준에서 로그 순위 검정법 (log rank-test)을 적용하여 참고용 TG 플라세보와 비교되었으며, 상응하는 p-값이 카플란-마이어 곡선(Kaplan-Meier curves A) 상에서 나타난 것으로 유전자 변형 플라세보 래트의 앞발 악력(흑색 평행 선, n=21)이 WT 래트(회색 평행선, p=1.45.10-5, n=19)과 비교시 유의적인 감소가 나타난 도이며 [Mix7-용량(dose) 3 처치로 앞발 악력이 유의적으로 증가함을 나타냄, 흑색 점선; p=0.03, n=18)];
도 13은 막대시험법에서 낙상 반응시간(처치 9주후) 및 pmp22 RNA 발현 수준간의 유의적인 상관관계를 나타낸 피어슨 상관 관계 시험법(Pearson correlation test)를 나타낸 도이며 [p=1,6.10-4, WT, TG 플라세보 및 분석된 Mix7- 용량 3 처치 TG); p=0,07 (TG 플라세보 및 분석된 Mix7- 용량 3 처치 TG)이며, pmp22 RNA 발현이 낮아질수록 막대시험 수행능력은 좋아짐을 나타냈고, 수컷 래트는 16 주령이고 (n=18: WT 래트, 백색 원(white circles); n=20: TG 플라세보, 흑색 원(black circles) 및 n=18: Mix7-dose3으로 처치된 TG, 백색 삼각형 (white triangles)].; 도 14은 막대시험법에서 낙상 반응시간(처치 9주후) 및 감각신경의 전도속도 (NCV)간의 유의적인 상관관계를 나타낸 피어슨 상관 관계 시험법(Pearson correlation test)를 나타낸 도이다 [p=1,34.10-6: WT, TG 플라세보 및 분석된 Mix7-dose3으로 처치된 TG 및 p=0,04: TG 플라세보 및 분석된 Mix7-dose3으로 처치된 TG이며, 상기 전도속도가 빠를수록 막대시험 수행능력은 좋아짐을 나타냈고, 수컷 래트는 16 주령이고 (n=18: WT 래트, 백색 원(white circles); n=20: TG 플라세보, 흑색 원(black circles) 및 n=18: Mix7-dose3으로 처치된 TG, 백색 삼각형 (white triangles)].
본 발명은 CMT 또는 관련 장애를 치료하기 위한 새로운 치료학적 접근법을 제공한다. 본 발명은 상기 질환을 효과적으로 치료가 가능하고 어떠한 포유동물 객체에서도 사용가능한 약물 또는 약물 조합의 새로운 용도를 개시한다.
본 발명의 범위 내에서, 용어 “CMT"는 CMT1A, CMT1B, CMT1C, CMT1D, CMT1X, CMT2A, CMT2B, CMT2D, CMT2E, CMT2-P0, CMT4A, CMT4B1, CMT4B2, CMT4D, CMT4F, CMT4, 또는 AR-CMT2A, 보다 바람직하게는 CMT1a을 포함한다.
본 발명의 범위 내에서, 용어 “CMT 관련 장애 (CMT related disorder)"는 미엘린 단백질의 비정상 수초화(myelination) 및 신경세포 소실을 초래하는 PMP22의 비정상 발현을 수반하는 기타 질환을 의미한다. 본 발명의 용어 “CMT 관련 장애 (CMT related disorder)"는 보다 구체적으로는 알츠하이머 질환 (Alzheimer’s disease, AD), AD 형 노인성 치매증 (SDAT), 파킨슨 질환 (Parkinson’s disease), 루이스 체 치매증 (Lewis body dementia), 혈관성 치매증 (vascular dementia), 자폐증 (autism), 경도 인지 장애 (mild cognitive impairment; MCI), 노화성 기억 장애 (age-associated memory impairment; AAMI) 및 노화에 따른 장애, 뇌염후 파킨슨 증후군 (post-encephalitic Parkinsonism), 정신분열증 (schizophrenia), 우울증 (depression), 조울증 (bipolar disease) 및 기타 감정 장애, 헌팅톤 질환 (Huntington’s disease), 근위축성 측색 경화증 (amyotrophic lateral sclerosis, ALS)을 포함하는 운동신경원 질환 (motor neurone disease), 다발성 경화증 (multiple sclerosis), 특발성 신경병증 (idiopathic neuropathies), 당뇨병성 신경병증 (diabetic neuropathy), 약물 치료에 기인한 신경병증을 포함하는 중독성 신경병증 (toxic neuropathy), HIV, 방사선, 중금속 및 비타민 결핍 상태로 인한 신경병증 (neuropathies), 크로이츠펠트-야콥병 (Creutzfeld-Jakob disease, CJD), 광우병 (bovine spongiform encephalopathy, BSE), GSS, FFI, Kuru 및 알퍼 증훈군 (Alper’s syndrome)을 포함하는 프리온-기원 신경퇴화증 (prion-based neurodegeneration)을 의미한다.
본 발명의 바람직한 구현예로서, CMT 관련 장애는 중독성 신경병증, 특히 약물-유도성 신경병증 또는 ALS를 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "장애의 치료법"(treatment)는 상기 장애에 의하여 야기되는 통증의 치료(therapy), 예방 (prevention), 예방조치 (prophylaxis), 지연 (retardation) 또는 경감 (reduction)을 포함한다. 용어 "치료법(treatment)"는 특히 질환 진행 및 수반된 증상의 조절을 포함한다.
또한 상기 용어 "화합물(compound)"은 본원에서 특별하게 명명된 화학적 화합물뿐문 아니라 이의 허용가능한 염(salt), 수화물 (hydrate), 에스테르 (ester), 에테르 (ether), 이성체 (isomers), 라세믹체 (racemate), 접합체 (conjugates), 전구체(pro-drugs)를 의미한다. 본원에서 나열된 화합물들은 이에 상응하는 CAS 번호(number)로 동정된다.
따라서, 본원에서 사용되는 바람직한 화합물들은 바클로펜(Baclofen; CAS 1134-47-0) 및 이의 가능한 염(salts), 이성체(enantiomers), 라세미체(racemates), 전구체(prodrugs) 및 유도체(derivatives); 소르비톨(Sorbitol; CAS 50-70-4) 및 이의 가능한 염(salts), 이성체(enantiomers), 라세미체(racemates), 전구체(prodrugs) 및 유도체(derivatives); 날트렉손(Naltrexone; CAS 16590-41-3) 및 이의 가능한 염(salts), 이성체(enantiomers), 라세미체(racemates), 전구체(prodrugs) 및 유도체(derivatives); 미페프로스톤(Mifepristone, CAS 84371-65-3) 및 이의 가능한 염(salts), 이성체(enantiomers), 라세미체(racemates), 전구체(prodrugs) 및 유도체(derivatives); 필로카핀(Pilocarpine, CAS 54-71-7) 및 이의 가능한 염(salts), 이성체(enantiomers), 라세미체(racemates), 전구체(prodrugs) 및 유도체(derivatives); 메티마졸(Methimazole, CAS 60-56-0) 및 이의 가능한 염(salts), 이성체(enantiomers), 라세미체(racemates), 전구체(prodrugs) 및 유도체(derivatives); 케토프로펜(Ketoprofen, CAS 22071-15-4) 및 이의 가능한 염(salts), 이성체(enantiomers), 라세미체(racemates), 전구체(prodrugs) 및 유도체(derivatives); 플루비프로펜(Flurbiprofen, 5104-49-4) 및 이의 가능한 염(salts), 이성체(enantiomers), 라세미체(racemates), 전구체(prodrugs) 및 유도체(derivatives); 및 라파마이신(Rapamycin, CAS 53123-88-9) 및 이의 가능한 염(salts), 이성체(enantiomers), 라세미체(racemates), 전구체(prodrugs) 및 유도체(derivatives)들이다.
본 발명에 사용되는 추가적인 화합물들은 아세타졸아미드(Acetazolamide; CAS 59-66-5) 및 이의 가능한 염(salts), 이성체(enantiomers), 라세미체(racemates), 전구체(prodrugs) 및 유도체(derivatives); 알부테롤(Albuterol; CAS 18559-94-9) 및 이의 가능한 염(salts), 이성체(enantiomers), 라세미체(racemates), 전구체(prodrugs) 및 유도체(derivatives); 아밀로리드 (Amiloride; CAS 2016-88-8) 및 이의 가능한 염(salts), 이성체(enantiomers), 라세미체(racemates), 전구체(prodrugs) 및 유도체(derivatives); 아미노글루테치미드 (Aminoglutethimide; CAS 125-84-8) 및 이의 가능한 염(salts), 이성체(enantiomers), 라세미체(racemates), 전구체(prodrugs) 및 유도체(derivatives); 아미오다론 (Amiodarone; CAS 1951-25-3) 및 이의 가능한 염(salts), 이성체(enantiomers), 라세미체(racemates), 전구체(prodrugs) 및 유도체(derivatives); 아즈트레오남 (Aztreonam; CAS 78110-38-0) 및 이의 가능한 염(salts), 이성체(enantiomers), 라세미체(racemates), 전구체(prodrugs) 및 유도체(derivatives); 바클로펜 (Baclofen; CAS 1134-47-0) 및 이의 가능한 염(salts), 이성체(enantiomers), 라세미체(racemates), 전구체(prodrugs) 및 유도체(derivatives); 발살라지드 (Balsalazide; CAS 80573-04-2) 및 이의 가능한 염(salts), 이성체(enantiomers), 라세미체(racemates), 전구체(prodrugs) 및 유도체(derivatives); 베타인 (Betaine; CAS 107-43-7) 및 이의 가능한 염(salts), 이성체(enantiomers), 라세미체(racemates), 전구체(prodrugs) 및 유도체(derivatives); 베탄콜 (Bethanechol; CAS 674-38-4) 및 이의 가능한 염(salts), 이성체(enantiomers), 라세미체(racemates), 전구체(prodrugs) 및 유도체(derivatives); 비칼루타미드 (Bicalutamide; CAS 90357-06-5) 및 이의 가능한 염(salts), 이성체(enantiomers), 라세미체(racemates), 전구체(prodrugs) 및 유도체(derivatives); 브로모크립틴 (Bromocriptine; CAS 25614-03-3) 및 이의 가능한 염(salts), 이성체(enantiomers), 라세미체(racemates), 전구체(prodrugs) 및 유도체(derivatives); 부메타니드 (Bumetanide; CAS 28395-03-1) 및 이의 가능한 염(salts), 이성체(enantiomers), 라세미체(racemates), 전구체(prodrugs) 및 유도체(derivatives); 부스피론 (Buspirone; CAS 36505-84-7) 및 이의 가능한 염(salts), 이성체(enantiomers), 라세미체(racemates), 전구체(prodrugs) 및 유도체(derivatives); 카르바콜 (Carbachol; CAS 51-83-2) 및 이의 가능한 염(salts), 이성체(enantiomers), 라세미체(racemates), 전구체(prodrugs) 및 유도체(derivatives); 카르바마제핀 (Carbamazepine; CAS 298-46-4) 및 이의 가능한 염(salts), 이성체(enantiomers), 라세미체(racemates), 전구체(prodrugs) 및 유도체(derivatives); 카르비마졸 (Carbimazole; CAS 22232-54-8) 및 이의 가능한 염(salts), 이성체(enantiomers), 라세미체(racemates), 전구체(prodrugs) 및 유도체(derivatives); 세비멜린 (Cevimeline; CAS 107233-08-9) 및 이의 가능한 염(salts), 이성체(enantiomers), 라세미체(racemates), 전구체(prodrugs) 및 유도체(derivatives); 시프로플로록사신 (Ciprofloxacin; CAS 85721-33-1) 및 이의 가능한 염(salts), 이성체(enantiomers), 라세미체(racemates), 전구체(prodrugs) 및 유도체(derivatives); 클로니딘 (Clonidine; CAS 4205-90-7) 및 이의 가능한 염(salts), 이성체(enantiomers), 라세미체(racemates), 전구체(prodrugs) 및 유도체(derivatives); 쿠르쿠민 (Curcumin; CAS 458-37-7) 및 이의 가능한 염(salts), 이성체(enantiomers), 라세미체(racemates), 전구체(prodrugs) 및 유도체(derivatives); 시클로스포린 (Cyclosporine) A (CAS 59865-13-3) 및 이의 가능한 염(salts), 이성체(enantiomers), 라세미체(racemates), 전구체(prodrugs) 및 유도체(derivatives); 디아제팜 (Diazepam; CAS 439-14-5) 및 이의 가능한 염(salts), 이성체(enantiomers), 라세미체(racemates), 전구체(prodrugs) 및 유도체(derivatives); 디클로페낙 (Diclofenac; CAS 15307-86-5) 및 이의 가능한 염(salts), 이성체(enantiomers), 라세미체(racemates), 전구체(prodrugs) 및 유도체(derivatives); 디노프로스톤 (Dinoprostone; CAS 363-24-6) 및 이의 가능한 염(salts), 이성체(enantiomers), 라세미체(racemates), 전구체(prodrugs) 및 유도체(derivatives); 디설피람 (Disulfiram; CAS 97-77-8) 및 이의 가능한 염(salts), 이성체(enantiomers), 라세미체(racemates), 전구체(prodrugs) 및 유도체(derivatives); D-소르비톨 (Sorbitol; CAS 50-70-4) 및 이의 가능한 염(salts), 이성체(enantiomers), 라세미체(racemates), 전구체(prodrugs) 및 유도체(derivatives); 두타스테리드 (Dutasteride; CAS 164656-23-9) 및 이의 가능한 염(salts), 이성체(enantiomers), 라세미체(racemates), 전구체(prodrugs) 및 유도체(derivatives); 에스트라디올 (Estradiol; CAS 50-28-2) 및 이의 가능한 염(salts), 이성체(enantiomers), 라세미체(racemates), 전구체(prodrugs) 및 유도체(derivatives); 엑세메스탄 (Exemestane; CAS 107868-30-4) 및 이의 가능한 염(salts), 이성체(enantiomers), 라세미체(racemates), 전구체(prodrugs) 및 유도체(derivatives); 펠바메이트 (Felbamate; CAS 25451-15-4) 및 이의 가능한 염(salts), 이성체(enantiomers), 라세미체(racemates), 전구체(prodrugs) 및 유도체(derivatives); 페노피브레이트 (Fenofibrate; CAS 49562-28-9) 및 이의 가능한 염(salts), 이성체(enantiomers), 라세미체(racemates), 전구체(prodrugs) 및 유도체(derivatives); 피나스테리드 (Finasteride; CAS 98319-26-7) 및 이의 가능한 염(salts), 이성체(enantiomers), 라세미체(racemates), 전구체(prodrugs) 및 유도체(derivatives); 플루마제닐 (Flumazenil; CAS 78755-81-4) 및 이의 가능한 염(salts), 이성체(enantiomers), 라세미체(racemates), 전구체(prodrugs) 및 유도체(derivatives); 플루니트라제팜 (Flunitrazepam; CAS 1622-62-4) 및 이의 가능한 염(salts), 이성체(enantiomers), 라세미체(racemates), 전구체(prodrugs) 및 유도체(derivatives); 플루비프로펜 (Flurbiprofen; CAS 5104-49-4) 및 이의 가능한 염(salts), 이성체(enantiomers), 라세미체(racemates), 전구체(prodrugs) 및 유도체(derivatives); 푸로세미드 (Furosemide; CAS 54-31-9) 및 이의 가능한 염(salts), 이성체(enantiomers), 라세미체(racemates), 전구체(prodrugs) 및 유도체(derivatives); 가바펜틴 (Gabapentin; CAS 60142-96-3) 및 이의 가능한 염(salts), 이성체(enantiomers), 라세미체(racemates), 전구체(prodrugs) 및 유도체(derivatives); 갈란타민 (Galantamine; CAS 357-70-0) 및 이의 가능한 염(salts), 이성체(enantiomers), 라세미체(racemates), 전구체(prodrugs) 및 유도체(derivatives); 할로페리돌 (Haloperidol; CAS 52-86-8) 및 이의 가능한 염(salts), 이성체(enantiomers), 라세미체(racemates), 전구체(prodrugs) 및 유도체(derivatives); 이부프로펜 (Ibuprofen; CAS 15687-27-1) 및 이의 가능한 염(salts), 이성체(enantiomers), 라세미체(racemates), 전구체(prodrugs) 및 유도체(derivatives); 이소프로테레놀 (Isoproterenol; CAS 7683-59-2) 및 이의 가능한 염(salts), 이성체(enantiomers), 라세미체(racemates), 전구체(prodrugs) 및 유도체(derivatives); 케토코나졸 (Ketoconazole; CAS 65277-42-1) 및 이의 가능한 염(salts), 이성체(enantiomers), 라세미체(racemates), 전구체(prodrugs) 및 유도체(derivatives); 케포르포펜 (Ketoprofen; CAS 22071-15-4) 및 이의 가능한 염(salts), 이성체(enantiomers), 라세미체(racemates), 전구체(prodrugs) 및 유도체(derivatives); L-카르니틴 (carnitine) (CAS 541-15-1) 및 이의 가능한 염(salts), 이성체(enantiomers), 라세미체(racemates), 전구체(prodrugs) 및 유도체(derivatives); 리오티로닌 (Liothyronine) (T3) (CAS 6893-02-3) 및 이의 가능한 염(salts), 이성체(enantiomers), 라세미체(racemates), 전구체(prodrugs) 및 유도체(derivatives); 리튬 (Lithium; CAS 7439-93-2) 및 이의 가능한 염(salts), 이성체(enantiomers), 라세미체(racemates), 전구체(prodrugs) 및 유도체(derivatives); 로사르탄 (Losartan; CAS 114798-26-4) 및 이의 가능한 염(salts), 이성체(enantiomers), 라세미체(racemates), 전구체(prodrugs) 및 유도체(derivatives); 록사핀 (Loxapine; CAS 1977-10-2) 및 이의 가능한 염(salts), 이성체(enantiomers), 라세미체(racemates), 전구체(prodrugs) 및 유도체(derivatives); 멜록시캄 (Meloxicam; CAS 71125-38-7) 및 이의 가능한 염(salts), 이성체(enantiomers), 라세미체(racemates), 전구체(prodrugs) 및 유도체(derivatives); 메타프로테레놀 (Metaproterenol; CAS 586-06-1) 및 이의 가능한 염(salts), 이성체(enantiomers), 라세미체(racemates), 전구체(prodrugs) 및 유도체(derivatives); 메타라미놀 (Metaraminol; CAS 54-49-9) 및 이의 가능한 염(salts), 이성체(enantiomers), 라세미체(racemates), 전구체(prodrugs) 및 유도체(derivatives); 메트포르민 (Metformin; CAS 657-24-9) 및 이의 가능한 염(salts), 이성체(enantiomers), 라세미체(racemates), 전구체(prodrugs) 및 유도체(derivatives); 메타콜린 (Methacholine; CAS 55-92-5) 및 이의 가능한 염(salts), 이성체(enantiomers), 라세미체(racemates), 전구체(prodrugs) 및 유도체(derivatives); 메티마졸 (Methimazole; CAS 60-56-0) 및 이의 가능한 염(salts), 이성체(enantiomers), 라세미체(racemates), 전구체(prodrugs) 및 유도체(derivatives); 메틸에르고노빈 (Methylergonovine; CAS 113-42-8) 및 이의 가능한 염(salts), 이성체(enantiomers), 라세미체(racemates), 전구체(prodrugs) 및 유도체(derivatives); 메토프롤롤(Metoprolol; CAS 37350-58-6) 및 이의 가능한 염(salts), 이성체(enantiomers), 라세미체(racemates), 전구체(prodrugs) 및 유도체(derivatives); 메티라폰 (Metyrapone; CAS 54-36-4) 및 이의 가능한 염(salts), 이성체(enantiomers), 라세미체(racemates), 전구체(prodrugs) 및 유도체(derivatives); 미코나졸 (Miconazole; CAS 22916-47-8) 및 이의 가능한 염(salts), 이성체(enantiomers), 라세미체(racemates), 전구체(prodrugs) 및 유도체(derivatives); 미페프로스톤 (Mifepristone; CAS 84371-65-3) 및 이의 가능한 염(salts), 이성체(enantiomers), 라세미체(racemates), 전구체(prodrugs) 및 유도체(derivatives); 나돌롤 (Nadolol; CAS 42200-33-9) 및 이의 가능한 염(salts), 이성체(enantiomers), 라세미체(racemates), 전구체(prodrugs) 및 유도체(derivatives); 날록손 (Naloxone; CAS 465-65-6) 및 이의 가능한 염(salts), 이성체(enantiomers), 라세미체(racemates), 전구체(prodrugs) 및 유도체(derivatives); 날트렉손 (Naltrexone; CAS 16590-41-3) 및 이의 가능한 염(salts), 이성체(enantiomers), 라세미체(racemates), 전구체(prodrugs) 및 유도체(derivatives); 노르플록사신 (Norfloxacin; CAS 70458-96-7) 및 이의 가능한 염(salts), 이성체(enantiomers), 라세미체(racemates), 전구체(prodrugs) 및 유도체(derivatives); 펜타조신 (Pentazocine; CAS 359-83-1)및 이의 가능한 염(salts), 이성체(enantiomers), 라세미체(racemates), 전구체(prodrugs) 및 유도체(derivatives); 페녹시벤자민 (Phenoxybenzamine; CAS 59-96-1) 및 이의 능한 염(salts), 이성체(enantiomers), 라세미체(racemates), 전구체(prodrugs) 및 유도체(derivatives); 페닐부티레이트 (Phenylbutyrate; CAS 1821-12-1) 및 이의 가능한 염(salts), 이성체(enantiomers), 라세미체(racemates), 전구체(prodrugs) 및 유도체(derivatives); 필로카핀 (Pilocarpine; CAS 54-71-7) 및 이의 가능한 염(salts), 이성체(enantiomers), 라세미체(racemates), 전구체(prodrugs) 및 유도체(derivatives); 피오글리타존 (Pioglitazone; CAS 111025-46-8) 및 이의 가능한 염(salts), 이성체(enantiomers), 라세미체(racemates), 전구체(prodrugs) 및 유도체(derivatives); 프라조신 (Prazosin; CAS 19216-56-9) 및 이의 가능한 염(salts), 이성체(enantiomers), 라세미체(racemates), 전구체(prodrugs) 및 유도체(derivatives); 프로필티오우라실 (Propylthiouracil; CAS 51-52-5) 및 이의 가능한 염(salts), 이성체(enantiomers), 라세미체(racemates), 전구체(prodrugs) 및 유도체(derivatives); 랄록시펜 (Raloxifene; CAS 84449-90-1) 및 이의 가능한 염(salts), 이성체(enantiomers), 라세미체(racemates), 전구체(prodrugs) 및 유도체(derivatives); 라파마이신 (Rapamycin; CAS 53123-88-9) 및 이의 가능한 염(salts), 이성체(enantiomers), 라세미체(racemates), 전구체(prodrugs) 및 유도체(derivatives); 리팜핀 (Rifampin; CAS 13292-46-1) 및 이의 가능한 염(salts), 이성체(enantiomers), 라세미체(racemates), 전구체(prodrugs) 및 유도체(derivatives); 심바스타틴 (Simvastatin; CAS 79902-63-9) 및 이의 가능한 염(salts), 이성체(enantiomers), 라세미체(racemates), 전구체(prodrugs) 및 유도체(derivatives); 스피로노락톤 (Spironolactone; CAS 52-01-7) 및 이의 가능한 염(salts), 이성체(enantiomers), 라세미체(racemates), 전구체(prodrugs) 및 유도체(derivatives); 타클로리무스 (Tacrolimus; CAS 104987-11-3) 및 이의 가능한 염(salts), 이성체(enantiomers), 라세미체(racemates), 전구체(prodrugs) 및 유도체(derivatives); 타목시펜 (Tamoxifen; CAS 10540-29-1) 및 이의 가능한 염(salts), 이성체(enantiomers), 라세미체(racemates), 전구체(prodrugs) 및 유도체(derivatives); 트레할로스 (Trehalose; CAS 99-20-7) 및 이의 가능한 염(salts), 이성체(enantiomers), 라세미체(racemates), 전구체(prodrugs) 및 유도체(derivatives); 트릴로스탄 (Trilostane; CAS 13647-35-3) 및 이의 가능한 염(salts), 이성체(enantiomers), 라세미체(racemates), 전구체(prodrugs) 및 유도체(derivatives); 발프로익산 (Valproic acid; CAS 99-66-1) 및 이의 가능한 염(salts), 이성체(enantiomers), 라세미체(racemates), 전구체(prodrugs) 및 유도체(derivatives)들이다.
또한 상기 용어 "조합 (combination)"은 생물학적 효과가 유발하게 하기 위해 2개 이상 약물을 객체에 공동투여되는 치료를 의미한다. 조합치료법으로서, 상기 2개 이상 약물들은 동시에 또는 연속적으로 같이 또는 개별적으로 투여될 수 있다. 또한 상기 2개 이상 약물들은 서로 상이한 투여경로 및 프로토콜을 통하여 투여가능하다.
본 발명은 CMT의 효과적인 치료를 위한 특정 약물 조합의 동정 및 활성을 개시한다. 보다 상세하게는, 본 발명은 CMT 또는 관련 장애에 대한 시험관내 및 생체내 시험에서 유의적인 효과를 제공하는 신규 3성분 조합을 개시한다.
이와 관련하여, 본 발명은 바클로펜(Baclofen), 소르비톨 (Sorbitol) 및 필로카핀(Pilocarpine), 메티마졸 (Methimazole), 미페프리스톤(Mifepristone), 날트렉손(Naltrexone), 라파마이신 (Rapamycine), 플루비프로펜(Flurbiprofen) 및 케토프로펜(Ketoprofen)으로부터 선택된 화합물, 이의 염(salts), 이성체(enantiomers), 라세미체(racemates), 전구체(prodrugs) 및 유도체(derivatives)를 함유하는 조성물에 관한 것이다.
보다 상세하게는, 본 발명은 바클로펜(Baclofen), 소르비톨 (Sorbitol) 및 필로카핀(Pilocarpine), 메티마졸 (Methimazole), 미페프리스톤(Mifepristone), 날트렉손(Naltrexone) 및 케토프로펜(Ketoprofen)으로부터 선택된 화합물을 함유하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 가장 바람직한 구현예로서, 본 발명은 포유동물 객체에 동시적(simultaneous), 개별적 (separate) 또는 일련적(sequential)인 투여를 위한, 날트렉손(Naltrexone), 바클로펜(Baclofen), 및 소르비톨 (Sorbitol)을 함유하는 조성물에 관한 것이다.
상술한 조성물에서, 바람직하게는, 상기 소르비톨은 D-소르비톨(Sorbitol)이고 상기 바클로펜(Baclofen)은 RS-바클로펜(Baclofen) 또는 S-바클로펜(Baclofen), 보다 바람직하게는 RS-바클로펜인 것이다.
본 발명의 또 다른 바람직한 목적으로서, 본 발명은 포유동물 객체에 동시적(simultaneous), 개별적 (separate) 또는 일련적(sequential)인 투여를 위한, (a) 라파마이신, (b) 미페프리스톤(mifepristone) 또는 날트렉손(naltrexone) 및 (c) PMP22 조절제(modulator)를 함유하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 바람직한 목적으로서, 본 발명은 포유동물 객체에 동시적(simultaneous), 개별적 (separate) 또는 일련적(sequential)인 투여를 위한, (a) 라파마이신, (b) 미페프리스톤(mifepristone) 및 (c) PMP22 조절제(modulator)를 함유하는 조성물에 관한 것이다.
상기 PMP22 조절제(modulators)는 세포에서 PMP22 경로를 조절하고 미엘린(myelin) 구성의 정상화 및/또는 신경세포의 소실에 필수적으로 영향을 미치거나 기여할 수 있는 임의의 화합물일 수 있다.
상기 PMP22 조절제(modulators)는 아세타졸아미드(Acetazolamide), 알부테롤 (Albuterol), 아밀로이드 (Amiloride), 아미노글루테치미드(Aminoglutethimide), 아미오다론 (Amiodarone), 아즈트레오남(Aztreonam), 바클로펜(Baclofen), 발살라지드 (Balsalazide), 베타인(Betaine), 베탄콜(Bethanechol), 비칼루타미드(Bicalutamide), 브로모크립틴(Bromocriptine), 부메타미드(Bumetanide), 부스피론(Buspirone), 카르바콜(Carbachol), 카바마제핀(Carbamazepine), 카르비마졸(Carbimazole), 세비멜린(Cevimeline), 시프로플록사신(Ciprofloxacin), 클로니딘(Clonidine), 쿠르쿠민(Curcumin), 시클로스포린(Cyclosporine) A, 디아제팜(Diazepam), 디클로페낙(Diclofenac), 디노프로스톤(Dinoprostone), 디설피람(Disulfiram), D-소르비톨(Sorbitol), 두타스테리드(Dutasteride), 에스트라디올(Estradiol), 엑세메스탄(Exemestane), 펠바메이트(Felbamate), 페노피브레이트(Fenofibrate), 피나스테리드(Finasteride), 풀루마제닐(Flumazenil), 풀루니트라제팜(Flunitrazepam), 풀루비프로펜(Flurbiprofen), 퓨로세미드(Furosemide), 가바펜틴(Gabapentin), 갈란타민(Galantamine), 할로페리돌(Haloperidol), 이부프로펜(Ibuprofen), 이소프로테레놀(Isoproterenol), 케토코나졸(Ketoconazole), 케토프로펜(Ketoprofen), L-카르니틴(carnitine), 리오티로닌(Liothyronine) (T3), 리튬(Lithium), 로사르탄(Losartan), 록사핀(Loxapine), 멜록시캄(Meloxicam), 메타프로테레놀(Metaproterenol), 메타라미놀(Metaraminol), 메트포르민(Metformin), 메타콜린(Methacholine), 메티마졸(Methimazole), 메틸에르고노빈(Methylergonovine), 메토프롤롤(Metoprolol), 메티라폰(Metyrapone), 미코나졸(Miconazole), 미페프리스톤(Mifepristone), 날돌롤(Nadolol), 날록손(Naloxone), 날트렉손(Naltrexone); 노르플록사신(Norfloxacin), 펜타조신(Pentazocine), 페녹시벤자민(Phenoxybenzamine), 페닐부티레이트(Phenylbutyrate), 필로카핀(Pilocarpine), 피오글리타존(Pioglitazone), 프라조신(Prazosin), 프로필티오우라실(Propylthiouracil), 랄록시펜(Raloxifene), 라파마이신(Rapamycin), 리팜핀(Rifampin), 심바스타틴(Simvastatin), 스피로노락톤(Spironolactone), 타크롤리무스(Tacrolimus), 타목시펜(Tamoxifen), 트레할로스(Trehalose), 트릴로스탄(Trilostane), 발프로익산(Valproic acid)으로부터 선택된 화합물, 이의 염 또는 전구체일 수있다.
본 발명의 바람직한 구현예로서, 상기 화합물(c)는 필로카핀, 메티마졸 및 바클로펜으로 선택된 것이다. 이와 관련하여, 본 발명의 가장 바람직한 조성물은 포유동물 객체에 동시적(simultaneous), 개별적 (separate) 또는 일련적(sequential)인 투여를 위한, (a) 라파마이신 (rapamycin), (b) 미페프리스톤(mifepristone) 및 (c) 필로카핀, 메티마졸 및 바클로펜으로 선택된 화합물을 함유하는 조성물을 포함하는 것이다.
상기 조성물의 구체적인 예로는 (1) 라파마이신(Rapamycin), 미페프리스톤(mifepristone) 및 필로카핀(pilocarpin); (2) 라파마이신(Rapamycin), 미페프리스톤(mifepristone) 및 바클로펜(Baclofen); (3) 라파마이신(Rapamycin), 미페프리스톤(mifepristone) 및 메티마졸(d methimazole) 또는 (4) 라파마이신(Rapamycin), 날트렉손(Naltrexone) 및 메티마졸(methimazole) 조합을 포함하는 것이다.
본 발명의 실험예는 이러한 특정한 약물 조합들이 시험관내에서 정상적 수초화(myelination) 및 신경 완벽성(neuron integrity)를 회복시키기 위하여 PMP22 발현을 효율적으로 교정시켜 결국 생체 내 동물실험에서 CMT를 개선할 수 있다. 또한 이러한 결과는 동물들을 화학요법-유발 신경병증(chemotherapy-induced neuropathy) 발생을 차단할 수 있다. 결론적으로, 이러 한 조합 조성물은 화학요법-유발 신경병증(chemotherapy-induced neuropathy) 발생을 방지하거나 감소시켜 환자에게 보다 장기간의 화학요법을 치료받을 수 있게 한다.
본 발명의 또 다른 목적은 날트렉손(Naltrexone), 바클로펜(Baclofen) 및 상술한 바와 같은 추가적인 특정의 PMP22 저해제(inhibitor)를 함유하는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상술한 조성물이외에 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제(excipients) 또는 담체(carrier)를 함유하는(즉, 약학조성물) 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 CMT 또는 관련 장애를 치료하기 위한 상술한 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 CMT 또는 관련 장애를 치료하기 위한 약제 제조를 위한 상술한 화합물들의 조합의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 효과적인 양의 상술한 조성물을 이를 필요로 하는 객체에게 투여함을 포함하는 CMT 또는 관련 장애를 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 화합물들을 적절한 부형제(excipients) 또는 담체(carrier)에 혼합함을 포함하는, 약학 조성물의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 보다 구체적인 목적은 효과적인 양의 상술한 화합물 또는 상기 화합물 조합을 이를 필요로 하는 객체에게 투여함을 포함하는, 객체의 CMT1a을 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 구체적인 목적은 효과적인 양의 상술한 화합물 또는 상기 화합물들의 조합을 이를 필요로 하는 객체에게 투여함을 포함하는, 객체의 중독성 신경변증(toxic neuropathy)을 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 구체적인 목적은 효과적인 양의 상술한 화합물 또는 상기 화합물들의 조합을 이를 필요로 하는 객체에게 투여함을 포함하는, 객체의 ALS을 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 치료법은 임의의 기타 치료법과의 연계하고/연계하거나 약물 조합 또는 단독으로서 수행가능하다. 이는 의사가 가깝게 치료 효과를 관찰하고 필요한 어떠한 추가 처치도 가능하도록 가정, 병원, 임상병원, 병원외 환자 병동 또는 병원에서 수행가능하다.
본 치료법의 기간은 치료할 병의 위중 정도, 환자의 나이 및 상태, 치료에 대한 환자의 반응정도에 의존한다.
추가적으로, 추가적인 신경병 장애로 진행할 위험성이 큰 개인 (예를 들어, 유전적으로 예를 들어, 당뇨병이 예정되거나 앓고 있거나, 발암 상태 치료요법 하에 있는 사람)은 궁극적으로 신경병성 반응의 유발을 경감시키거나 또는 지연시키기 위한 예방학적 치료법을 수용할 수도 있다.
상기 조합의 개개 구성요소의 투여용량, 빈도 및 투여경로는 각각 독립적으로 조절가능하다. 예를 들어, 제 2차 약물이 근육내로 투여되는 반면에 제 1차 약물은 경구 투여될 수도 있다. 상기 조합 치료법은 환자 신체가 예기치 못한 부작용으로부터 회복될 기회를 주기 위하여 휴식 기간을 포함시키는 것과 같은 단속적 주기가 부여될 수도 있다. 상기 약물은 또한 한 번의 약물 투여가 모두의 약물을 전달하도록 같이 포함시켜 제형화될 수 있다.
약학 조성물의 제형화
상기 조합 치료법에서 개개 약물의 투여는 기타 구성요소와 조합하여 환자 상태를 개선(예를 들어, 시험관내 실험에서, 말초신경에 미치는 PMP22의 상승된 발현에 대한 효과로 측정가능한)시킬 수 있는 정도의 약물 농도가 될 수 있는, 어떠한 적합한 수단으로도 가능하다.
상기 조합의 활성 성분이 순수 화학물질 형태로서 투여되도록 함도 가능하지만, 본원에서 약학 제형(pharmaceutical formulation)으로도 지칭되는 약학조성물(pharmaceutical composition) 형태로서 투여됨이 바람직하다.
가능한 조성물로는 경구투여(oral), 직장투여(rectal), 국소투여(topical) (경피투여, 구강투여 및 설하투여 포함), 또는 비경구투여 (parenteral) (피하 투여, 근육내 투여, 정맥내 투여 및 피내투여) 에 적합한 조성물을 포함하는 것이다.
보다 통상적으로, 이러한 제형들은 단일 패키지(single package), 대개, 블리스터 팩(blister pack)으로 떨어진 치료 기간동안 사용하기 위한 계량 투여단위 용량으로 투여하기 위한 몇몇 투여 단위 또는 기타 수단을 포함하는 "환자용 팩 (patient packs)"형태로 환자에게 처방된다. 환자용 팩은 통상적으로 종래처방법으로는 분실할 수 있는 처방을 혼자용 팩에 포함된 패키지 삽입물 (package insert)로의 접근이 쉽도록 한 점에서 약사가 환자에게 대용량을 소분하는 기존 종래 처방법보다 우수한 장점을 갖는다. 패키지 삽입물의 내포물은 의사 지시에 따른 환자의 순응도를 개선시키는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 본 발명은 본원에서 전술한 바대로, 상기 제형에 적합한 포장 재료와 조합한 약학제형을 추가로 포함한다. 이러한 환자용 팩에서, 조합 치료법을 위한 의도된 사용은 치료에 가장 적합한 제형을 이용하여 도움을 주기 위한 지시내용, 사용법, 규정, 적용법 및/또는 기타 수단에 의하여 추론될 수 있을 것이다. 이러한 척도들은 환자용 팩을 본 발명의 조합에 의한 치료 용도에 구체적으로 적합하고 적용되도록 할 수 있게 한다.
본 약물은 임의의 적당한 양의 임의의 적합한 담체 물질을 포함할 수 있으며 상기 조성물 총 중량의 1-99% 함량으로 존재할 수 있다. 상기 조성물은 경구투여(oral), 비경구투여(parenteral) (예를 들어 정맥내 투여(intravenously), 근육내 투여(intramuscularly)), 직장투여(rectal), 경피투여 (cutaneous), 비강투여 (nasal), 질내투여 (vaginal), 흡입투여(inhalant), 피부투여(skin; 패취형(patch)), 또는 안구내 투여 (ocular administration) 경로 투여용으로 적합한 투여 형태로 제공될 수 있다. 따라서, 상기 조성물은 예를 들어, 정제(tablets), 캡슐제 (capsules), 환제 (pills), 산제(powders), 과립제 (granulates), 현탁제(suspensions), 에멀젼제(emulsions), 액제 (solutions), 히드로겔(hydrogels) 포함 겔제(gels), 반죽형(pastes), 연고(ointments), 크림(creams), 반창고 (plasters), 드렌치형(drenches), 삼투성 전달 기구 (osmotic delivery devices), 좌제 (suppositories), 관장제 (enemas), 주사제(injectables), 임플란트제 (implants), 스프레이제 (sprays), 또는 에어로졸제(aerosols)의 형태일 수 있다.
상기 약학 조성물은 고전적인 약학 기법에 따른 제형화가 가능하다 (예를 들어, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (20th Ed.), ed. A. R. Gennaro, Lippincott Williams & Wilkins, 2000 and Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, eds. J. Swarbrick and J. C. Boylan, 1988-1999, Marcel Dekker, New York 참고).
본 발명에 따른 약학 조성물은 실질적으로 투여 즉시 또는 투여후 임의의 예정된 시간 또는 투여후 방출 계획 시점에서 방출되도록 제형화가 가능하다.
본 발명의 서방형 제형으로는 (i) 신체 내에서 초과 기간 또는 연장된 기간 동안 실질적으로 고정된 약물 농도를 창제하는 제형; (ii) 예정된 지체된 시간 이후에, 신체 내에서 초과 기간 또는 연장된 기간 동안 실질적으로 고정된 약물 농도를 창제하는 제형; (iii) 약물 활성 물질의 혈장 농도상의 변동에 수반되는 바람직하지 않은 부작용의 수반되는 최소화 목적으로 신체 내에서 상대적으로 고정되고 유효한 약물 농도를 유지함으로서 예정된 기간 동안 약물 작용을 유지시키는 제형; (iv) 예를 들어, 병든 조직 또는 기관 내 또는 이들에 인접한 장소로의 서방성 조성물을 공간상 위치시키는 것과 같이 약물 작용을 국소화시키는 제형; 및 (V) 약물의 특정 목표 세포 유형으로 전달하기 위하여 담체 또는 화학적 유도체를 이용함으로서 약물 작용을 목표화하는 제형을 포함하는 것이다.
서방형 형태의 약물 투여는 특히 바람직하게는 약물이 단독 또는 조합하여 (i) 좁은 치료 지수 (therapeutic index) (즉, 위해한 부작용 또는 독 작용을 초래하는 형장 농도 및 치료학적 효과를 초래하는 혈장 농도간의 차이가 작은 것으로; 대개, 치료 지수 (therapeutic index, TI),는 중간 유효량(median effective dose, ED50)에 대한 중간 치사량 (median lethal dose, LD50)의 비율로 정의된다); (ii) 위장관에서의 좁은 흡수 창(absorption window); 또는 (iii) 일일 동안 투여 빈도가 치료학적 수준으로 혈장 농도가 유지되게 하기 위하여 요구되도록 매우 단기간의 생물학적 반감기를 갖는 것이다.
방출 속도가 문제의 약물의 농도 대사율을 초과한 서방성 방출을 위하여 수많은 방법이 모색가능하다. 서방형 방출은 예를 들어, 다양한 형태의 서방성 조성물 및 코팅법을 포함하는, 다양한 제형 매개변수 및 성분을 적절하게 선택함으로서 수득가능하다. 따라서, 본 약물은 투여시 약물을 조절가능하게 (단일 또는 복수 단위 정제 또는 캡슐제 (capsule) 조성물, 오일 액제(oil solutions), 현탁제(suspensions), 에멀젼 (emulsions), 미세캡슐제(microcapsules), 미세구(microspheres), 나노입자(nanoparticles), 패취(patches), 및 리포좀 (liposomes)) 방출할 수 있도록 적절한 부형제로 약학 조성물로 제형화가 가능하다.
경구 투여용 고체상 투여 형태
경구용 제형은 비독성의 약학적으로 허용가능한 부형제와 함께 혼합된 활성 성분(들)을 포함하는 정제를 포함한다. 이러한 부형제 (excipients)로는 예를 들어, 무활성 희석제(diluents) 또는 충진제 (fillers) (예를 들어, 수크로스(sucrose), 미세결정성 셀룰로오스 (microcrystalline cellulose), 감자 전분을 포함하는 전분(starches), 탄산 칼슘 (calcium carbonate), 염화 나트륨 (sodium chloride), 인산 칼슘 (calcium phosphate), 황산 칼슘 (calcium sulfate), 또는 인산 나트륨 (sodium phosphate)); 과립화제 (granulating) 및 붕해제 (disintegrating agents) (예를 들어, 미세결정성 셀룰로오스를 포함한 셀룰로오스 유도체 (cellulose derivatives), 감자 전분을 포함한 전분(starches), 크로스카멜로오스 나트륨 (croscarmellose sodium), 알지네이트 (alginates), 또는 알긴 산 (alginic acid)); 결합제 (binding agents) (예를 들어, 아카시아(acacia), 알긴 산 (alginic acid), 알긴산 나트륨 (sodium alginate), 젤라틴 (gelatin), 전분(starch), 전호화분 녹말 (pregelatinized starch), 미세결정성 셀룰로오스(microcrystalline cellulose), 카복시메틸셀룰로오스 (carboxymethylcellulose sodium), 메틸셀룰로오스 (methylcellulose), 히드록시프로필 메틸셀룰로오스 (hydroxypropyl methylcellulose), 에틸 셀룰로오스 (ethylcellulose), 폴리비닐피롤리돈 (polyvinylpyrrolidone), 또는 폴리에틸렌 글리콜 (polyethylene glycol)); 및 윤활제(lubricating agents), 활택제(glidants), 및 항점착제(antiadhesives) (예를 들어, 스테아린 산(stearic acid), 실리카(silicas), 또는 탈크(talc))일 수 있다. 기타 약학적으로 허용가능한 부형제로는 착색제(colorants), 착향제 (flavoring agents), 가소제(plasticizers), 가습제(humectants), 완충제(buffering agents), 및 유사체가 있다.
상기 정제는 코팅되지 않을 수도 있으며 또한 임의적으로, 위장관에서의 붕해 작용 및 흡수작용을 지연시켜 보다 장기간 지연된 작용을 발휘할 수 있도록 당업계에 잘 알려진 기술로 코팅될 수 있다. 상기 코팅은 예정된 양상(예를 들어, 서방성 제형을 달성하기 위하여)으로 약물 활성 성분을 방출하도록 적용가능하고 또는 위장관 통과 후까지(장용성 코팅) 약물 활성 성분이 방출되지 않도록 적용가능하다. 상기 코팅은 당 코팅(sugar coating), 필름 코팅(film coating) (예를 들어, 히드록시프로필 메틸 셀룰로오스 (hydroxypropyl methylcellulose), 메틸셀룰로오스 (methylcellulose), 메틸히드록시에틸셀룰로오스 (methyl hydroxyethylcellulose), 히드록시프로필셀룰로오스 (hydroxypropylcellulose), 카복시메틸셀룰로오스 (carboxymethylcellulose), 아크릴레이트 공중합체 (acrylate copolymers), 폴리에틸렌 글리콜 (polyethylene glycols) 및/또는 폴리비닐피롤리돈 (polyvinylpyrrolidone) 소재의), 장용성 코팅(enteric coating) (예를 들어, 메타크릴 산 공중합체 (methacrylic acid copolymer), 셀룰로오스 프탈레이트 (cellulose acetate phthalate), 히드록시프로필 메틸셀룰로오스프탈레이트 (hydroxypropyl methylcellulosephthalate), 히드록시프로필 메틸셀룰로오스 아세테이트 숙시네이트 (hydroxypropyl methylcellulose acetate succinate), 폴리비닐 아세테이트 프탈레이트 (polyvinyl acetate phthalate), 쉘락 (shellac) 및/또는 에틸셀룰로오스(ethylcellulose) 소재의)일 수가 있다. 예를 들어 글리세릴 모노스테아레이트 (glyceryl monostearate) 또는 글리세릴 디스테아레이트 (glyceryl distearate)와 같은 시간 지연용 소재가 적용가능하다.
고체상 정제 조성물은 조성물이 원치 않는 화학적 변화 (예를 들어, 약물 활성 성분의 방출 전에 화학적 분해)가 발생하지 않도록 보호하도록 적용된 코팅을 포함할 수 있다. 상기 코팅은 저서 (Encyclopedia of Pharmaceutical Technology)에 개시된 바와 유사하게 고체상 투여 형태로 적용될 수 있다.
2개 약물은 정제 내에서 상호 혼합되거나 분배될 수도 있다. 예를 들어, 제 1차 약물은 정제 내면에 포함되고, 제 2차 약물은 제 1차 약물이 방출되기 전에 제 2차 약물의 실질적 부분이 방출되도록 정제 외부에 포함시킬 수도 있다.
또한 경구용 제형은 활성 성분이 비활성 고체상 희석제 (예를 들어, 감자전분, 미세결정성 셀룰로오스, 탄산 칼슘, 인산 칼슘 또는 카올린(kaolin)과 혼합된 저작성 정제(chewable tablets), 또는 경질 젤라틴 캡슐 (hard gelatin capsules); 또는 활성 성분이 물 또는 오일상 매체, 예를 들어, 액상 파라핀 (liquid paraffin), 또는 올리브 오일(olive oil)과 혼합된 연질 젤라틴 캡슐 (soft gelatin capsules)의 형태로 제공될 수 있다. 산제 및 과립제는 고전적 방법으로 상술한 성분을 정제 및 캡슐제 하부에 이용하여 제조가능하다.
경구용 서방성 조성물은 예를 들어, 약물 활성 물질의 용해 및/또는 확산을 조절함으로서 활성 약물을 방출하도록 설계할 수도 있다.
용해 또는 확산 조절용 방출은 약물의 정제, 캡슐제, 펠렛 (pellet) 또는 과립화 제형을 적절하게 코팅시키거나 약물을 적절한 매트릭스(matrix)에 혼입시켜 달성가능하다. 서방성 코팅제는 상술한 하나 이상의 코팅용 물질 및/또는 예를 들어, 쉘락(shellac), 밀납(beeswax), 글리코왁스 (glycowax), 케스터왁스 (castor wax), 카나우바 왁스 (carnauba wax), 스테아릴 알콜 (stearyl alcohol), 글리세릴 모노스테아레이트 (glyceryl monostearate), 글리세릴 디스테아레이트 (glyceryl distearate), 글리세릴 팔미토스테아레이트 (glycerol palmitostearate), 에틸셀룰로오스 (ethylcellulose), 아크릴성 수지 (acrylic resins), dl-폴리락트 산(polylactic acid), 셀룰로오스 아세테이트 부티레이트 (cellulose acetate butyrate), 폴리비닐 클로리드 (polyvinyl chloride), 폴리비닐 아세테이트 (polyvinyl acetate), 비닐 피롤리돈 (vinyl pyrrolidone), 폴리에틸렌 (polyethylene), 폴리메타크릴레이트 (polymethacrylate), 메틸메타크릴레이트 (methylmethacrylate), 2-히드록시메타크릴레이트 (hydroxymethacrylate), 메타크릴레이트 히드로겔 (methacrylate hydrogels), 1,3- 부틸렌 글리콜 (butylene glycol), 에틸렌 글리콜 메타크릴레이트 (ethylene glycol methacrylate), 및/또는 폴리에틸렌 글리콜 (polyethylene glycols)을 포함할 수 있다. 서방성 방출 매트릭스 제형(controlled release matrix formulation)에서, 상기 메트릭스 소재로는 에를 들어, 함수 메틸셀룰로오스 (hydrated metylcellulose), 카나우바 왁스 (carnauba wax) 및 스테아릴 알콜 (stearyl alcohol), 카보폴 (carbopol) 934, 실리콘 (silicone), 글리세릴 트리스테아레이트 (glyceryl tristearate), 메틸 아크렐레이트(methyl acrylate)-메틸 메타크릴레이트 (methyl methacrylate), 폴리비닐 클로리드 (polyvinyl chloride), 폴리에틸렌 (polyethylene), 및/또는 할로겐화 플로오로카본 (halogenated fluorocarbon)을 포함할 수 있다.
청구된 조합의 하나 이상의 약물을 함유한 서방성 조성물은 또한 부유성 정제 (buoyant tablet) 또는 캡슐제 (capsule) (즉, 경구 투여시, 특정한 기간 동안 위 내용물 상단에 부유하는 정제 또는 캡슐제)의 형태일 수 있다. 상기 약물의 부유성 정제 제형은 약물 혼합물을 부형제 및 20-75% w/w 함량의 ; 의 히드록시에틸셀룰로오스 (hydroxyethylcellulose), 히드록시프로필셀룰로오스 (hydroxypropylcellulose), 또는 히드록시프로필메틸셀룰로오스 (hydroxypropylmethylcellulose)과 같은 히드로콜로이드(hydrocolloids)로 과립화하여 제조가능하다. 상기 수득된 과립을 정제로 압축가능하다. 위액과 접촉시에, 상기 정제는 그 표면 주위에 실질적으로 수-불투과성 겔 방어벽(water-impermeable gel barrier)을 형성한다. 이러한 겔 방어벽은 정제가 위액에서 부유성을 유지하도록, 1 이하의 밀도를 유지시키는 작용을 갖는다.
경구투여용 액제
수첨가에 의한 액상 현탁액의 제조에 적당한 산제 (Powders), 분산성 산제 (dispersible powders), 또는 과립제(granules)가 경구 투여용으로 간편한 투여 형태이다. 현탁제로서의 제형은 활성 성분에 분산제(dispersing) 또는 습윤제(wetting agent), 현탁화제 (suspending agent), 및 하나 이상의 방부제(preservatives)와 혼합하여 제조한다. 적당한 현탁화제로는 예를 들어, 소듐 카복시메틸셀룰로오스 (sodium carboxymethylcellulose), 메틸셀룰로오스 (methylcellulose), 소듐 알지네이트 (sodium alginate) 등을 들 수 있다.
비경구용 조성물
또한 약학 조성물은 통상적인, 비독성 약학적으로 허용가능한 담체(carriers) 및 보체(adjuvants)를 함유하는 투여 형태, 제형 또는 적절한 전달 기구 또는 임플란트(implants)를 통하여 주사제(injection), 정맥내 주사(infusion) 또는 피하주입(implantation) (정맥내(intravenous), 근육내(intramuscular), 피하주사(subcutaneous) 등)에 의해 비경구적으로 투여 가능하다. 상기 조성물의 제형 및 제제는 약학 제형의 당업계에 종사하는 자에게 잘 알려져 있다.
비경구용 조성물이 몇 가지 용량을 함유하고 적절한 방부제가 첨가 가능한 단위 투여 용량 형태 (예를 들어 단일-용량 앰플 (single-dose ampules)), 또는 바이알(vials) 형태로 제공가능하다 (하기 참조). 상기 조성물은 액제 (solution), 현탁제 (suspension), 에멀젼 (emulsion), 피하주입용 정맥내 주사 기구 또는 전달 기구의 형태일 수 있거나 사용전 수분 또는 기타 적당한 운반체 (vehicle)로 재조립될 건조 산제 형태로 제공될 수 있다. 활성 약물(들)과 별개로, 상기 조성물은 적당한 비경구적으로 수용가능한 담체 및/또는 부형제를 포함할 수 있다. 상기 활성 약물(들)은 방출 조절을 위하여 미세구 (microspheres), 미세캡슐 (microcapsules), 나노입자 (nanoparticles), 리포좀 (liposomes), 등에 혼입가능하다. 상기 조성물은 현탁화제 (suspending), 가용화제 (solubilizing), 안정화제(stabilizing), pH-조절제 (adjusting agents), 및/또는 분산제 (dispersing agents)를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 멸균 주사용에 적합한 형태일 수 있다. 이러한 조성물을 제조하기 위하여, 적당한 활성 약물 (active drug(s))을 비경구용으로 수용 가능한 운반체로 용해 또는 현탁가능하다. 수분을 적용가능한 수용가능한 운반체 및 용매 중에서, 수분은 적당량의 염산, 수산화 나트륨 또는 적당한 완충액, 1,3-부탄디올(butanediol), 링거액 (Ringer's solution), 및 등장용 염화 나트륨 용액을 첨가함으로서 적당한 pH로 적정한다. 상기 수성 제형은 하나 이상의 방부제 (예를 들어, 메틸, 에틸 또는 n-프로필 p-히드록시벤조에이트)를 함유할 수도 있다. 상기 약물중 하나가 물에 매우 적게 또는 약간만 용해되는 경우에, 용해 증진제 또는 가용화제를 첨가가능하고 상기 용매는 10-60% w/w의 폴리에틸렌 글리콜 등을 함유할 수 있다.
서방성 비경구적 조성물은 수성 현탁액 (aqueous suspensions), 미세구 (microspheres), 미세캡슐 (microcapsules), 자기적 미세구 (magnetic microspheres), 오일 용액 (oil solutions), 오일 현탁액 (oil suspensions), 또는 현탁액 (emulsions)의 형태일 수 있다. 호환적으로, 상기 활성 약물은 생분해성 담체 (biocompatible carriers), 리포좀 (liposomes), 나노입자(nanoparticles), 임플란트 (implants), 또는 정맥 주사 기구 (infusion devices)로 혼입가능하다. 미세구 및/또는 미세캡슐 제조에 사용하기 위한 소재로는 예를 들어, 폴리갈락탄 (polygalactin), 폴리(poly)-(이소부틸 시아노아크릴레이트(isobutyl cyanoacrylate)), 폴리(poly)(2-히드록시에틸(hydroxyethyl)-L-글루타민(glutamnine))와 같은 생분해성(biodegradable)/생체흡수성(bioerodible) 중합체를 사용가능하다. 서방성 비경구적 제형을 제형화시 사용가능한 생분해성 담체로는 탄수화물 (carbohydrates) (예를 들어, 덱스트란(dextrans)), 단백질(proteins) (예를 들어, 알부민(albumin)), 지질단백질(lipoproteins), 또는 항체(antibodies)를 들 수 있다. 임플란트에 사용하기 위한 소재로는 비-생분해성 (non-biodegradable) (예를 들어, 폴리디메틸 실록산(polydimethyl siloxane)) 또는 생분해성 (biodegradable) (예를 들어, 폴리(카프로락톤)(poly(caprolactone)), 폴리(글리콜산)(poly(glycolic acid)) 또는 폴리(오르쏘 에스테르)(poly(ortho esters))일 수 있다.
직장투여용 조성물
직장투여을 위하여, 조성물을 위한 적당한 투여 형태로는 좌제 (에멀젼 또는 현탁제 형태), 및 직장용 젤라틴 캡슐 (rectal gelatin capsules) (액제 또는 현탁제)을 포함한다. 전형적인 좌제 제형으로서, 활성 약물(들)은 코코아 버터(cocoa butter), 에스테르화 지방산 (esterified fatty acids), 글리세린화 젤라틴 (glycerinated gelatin)과 같은 적절한 약학적으로 수용가능한 좌제 기제 및 포리에틸렌 글리콜과 같은 다양한 수용성 또는 분산용 기제와 조합된다. 다양한 첨가제, 개선제 또는 계면활성제가 혼입될 수 있다.
경피 및 국소용 조성물
또한 약학 조성물은 미세구 및 리포좀을 포함하는 통상적인 비-독성 약학적으로 허용가능한 담체 및 부형제를 함유하는 투여 형태 또는 제형으로 경피투여 흡수를 위하여 피부에 국소적으로 투여가능하다. 상기 제형은 크림제 (creams), 연고제 (ointments), 로션제 (lotions), 리니멘트제 (liniments), 겔제 (gels), 히드로겔제(hydrogels), 액제 (solutions), 현탁제(suspensions), 스틱제 (sticks), 스프레이제(sprays), 페이스트제 (pastes), 플라스터제 (plasters) 및 기타 경피 약물 전달 시스템(transdermal drug delivery systems)을 포함한다. 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제로는 유화제 (emulsifying agents), 항산화제 (antioxidants), 완충화제 (buffering agents), 방부제 (preservatives), 습윤제 (humectants), 투과 증진제 (penetration enhancers), 킬레이트화제 (chelating agents), 겔-형성화제 (gel-forming agents), 연고 기제(ointment bases), 방향제 (perfumes), 및 피부보호제 (skin protective agents)를 포함가능하다.
유화제는 자연 발생적 검(예를 들어 아카시아 검 또는 트라가칸트 검)일 수 있다.
방부제, 습윤제, 투과 증진제로는 메틸 또는 프로필 p-히드록시벤조에이트(hydroxybenzoate)와 같은 파라벤류(parabens), 및 벤잘코니움 클로리드 (benzalkonium chloride), 글리세린 (glycerin), 프로필렌 글리콜 (propylene glycol), 요소 (urea), 등일 수 있다.
피부상의 국소 투여를 위한 상기한 약학 조성물은 또한 치료할 신체 또는 신체일부와 근접한 곳에 국소 투여하는 데 사용가능하다. 상기 조성물은 직접 적용하거나 또는 드레싱제(dressings)과 같은 특수 약물 전달 기구 또는 호환적으로, 플라스터제 (plasters), 패드(pads), 스폰지(sponges), 스트립(strips), 또는 기타 적당한 탄성 물질로의 적용을 위해 적용가능하다.
치료용량 및 치료 기간
상기 조합의 약물들은 동일 또는 상이한 약학 제형으로 동시에 또는 연속적으로 투여가능함도 인지되어야 할 것이다. 만일 연속적 투여라면, 제 2차 (또는 추가적) 활성 성분의 투여 지연은 상기 활성 성분의 조합상의 이로운 효과를 소실하지 않아야 한다. 본 발명에 따른 최소한의 요건은 상기 조합이 상기 활성 성분의 조합상의 이로운 효과를 갖는 조합된 용도를 위해 의도되어야 하는 것이다.
본 발명의 조합의 의도된 용도는 본 발명의 따른 조합을 이용하는 것에 도움을 주는 설비, 규정, 적용 및/또는 기타 수단에 의하여 추론 가능하다.
본 발명의 주제인 치료학적으로 효과적인 양의 2개 이상의 약물들은 PMP22 유전자의 상승된 발현을 감소시키고, CMT1A 질환으로 발전할 위험성을 예방하거나 감소시키며, 일단 CMT1A 질환이 임상적으로 명백한 경우는 CMT1A 질환 진행을 중지시키거나 약화시키고, 신경병증 최초 또는 연속된 발병의 위험성을 예방 또는 감소시키기 위해 유용한 약제 제조를 위하여 같이 사용될 수 있다.
본 발명의 활성 약물을 예를 들어, 1일 2회 또는 3회의 분할된 용량으로 투여가능함에도 불구하고, 조합된 개개 약물을 1일 1회 투여함이 바람직하고, 단일 약학 조성물 (단위 투여 형태)의 1일 1회 투여하는 것이 가장 바람직하다.
투여 기간은 수일 동안 1회 또는 수회 투여가능하고, 심지어 환자가 일생동안 투여가능하다. 정기적 또는 적어도 주기적으로 반복적인 장기간 투여가 대부분 고지될 것이다.
본원에서 용어 " 단일 투여 형태(unit dosage form)"는 인간 객체를 위한 단일 투여량에 적합가능한 물리적으로 구분된 단위(예를 들어, 캡슐제, 정제 또는 적재된 주사 실린더 형태)를 의미하고, 개개 단위는 요구되는 약학 담체와 함께, 원하는 치료학적 효과를 달성하기 위하여 활성 물질 또는 계산된 활성 물질의 예정된 양을 포함하는 것이다.
단위 투여량을 위하여 바람직한 상기 조합의 개개 약물의 양은 치료할 개인의 전반적인 건강 상태를 고려하여, 투여 방법, 환자의 체중 및 연령, CMT 질환으로 야기된 신경병증성 손상의 심각도 또는 잠재적 부작용 위험성에 따라 좌우될 것이다.
추가적으로, 특정 환자에 대한 약제유전체학 (치료의 약물동력학, 약력학적 또는 유효성 양태의 유전자형 효과) 은 사용된 투여 용량에 영향을 미칠 수 있다.
보다 고용량의 투여가 요구되는 특히 손상된 CMT 질환 상황에 반응하는 경우 또는 보다 저용량이 선택되어야 하는 소아 치료 경우를 제외하고, 상기 조합의 개개 약물의 바람직한 투여용량은 장기간 치료요법 또는 임상 3상 시험에서 입증된 당업계에 통상적으로 처방되는 용량을 초과하지 않는 범위 이내이어야 할 것이다.
예를 들어,
(1) 라파마이신 (Rapamycin)은 경구투여시, 약 1 내지 약 100 μｇ/kg/일, 전형적으로
약 1 내지 약 50 μｇ/kg/일, 예를 들어, 약 5 내지 약 30 μｇ/kg/일 범위내이며,
(2) 미페프리스톤(Mifepristone)은 경구투여시, 약 1 내지 약 300 μｇ/kg/일, 전형적으로 약 10 내지 약 200 μｇ/kg/일, 예를 들어, 약 10 내지 약 80 μｇ/kg/일 범위내이며,
(3) 날트렉손(Naltrexone)은 경구투여시, 약 1 내지 약 100 μｇ/kg/일, 전형적으로 약 1 내지 약 50 μｇ/kg/일, 예를 들어, 약 1 내지 약 20 μｇ/kg/일 범위내이며,
(4) 필로카핀(Pilocarpin)은 경구투여시, 약 1 내지 약 100 μｇ/kg/일, 전형적으로 약 1 내지 약 50 μｇ/kg/일, 예를 들어, 약 1 내지 약 20 μｇ/kg/일 범위내이며,
(5) 바클로펜(Baclofen)은 경구투여시, 약 1 내지 약 300 μｇ/kg/일, 전형적으로 약 10 내지 약 200 μｇ/kg/일, 예를 들어, 약 20 내지 약 100 μｇ/kg/일 범위내이며,
(6) 메티마졸(Methimazole)은 경구투여시, 약 1 내지 약 100 μｇ/kg/일, 전형적으로 약 1 내지 약 50 μｇ/kg/일, 예를 들어, 약 1 내지 약 20 μｇ/kg/일 범위내이다.
가장 바람직한 투여용량은 장기간 유지 치료에 통상적으로 처방되는 용량의 1% 내지 10% 에 상응하는 양이다.
실제 투여되는 약물의 양은 병적 상태를 포함한 관련 상황 또는 치료할 대상의 상태, 투여될 정확한 조성물, 개개 환자의 연령, 체중 및 반응도, 환자 증상의 심각도, 및 투여 선택경로를 감안하여 의사에 의하여 결정되는 것으로 이해되어야 할 것이다. 결국, 상기 투여 용량 범위는 본원에서의 전반적인 지침 및 교시하고 있는 근거를 제공하도록 의도된 것이나, 본 발명의 범위는 이에 제한되지는 않는다.
하기의 예에 있어서, 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 이 실시예는 결코 본 발명의 범위를 한정하고자 함이 아닌 것으로 간주되어야 한다.
실시예 1. 시료조합의 준비
하기와 같이 약물 조합을 준비하였다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
실험예 1. Mix1-6으로 처치된 슈완세포(Schwann cell)에서의 PMP22 발현 어세이법(expression assay)
1-1. 세포배양
1.1.1 상업적으로 입수가능한 래트 일차성 슈완세포(Commercially available rat primary Schwann cells)
래트 슈완세포(SC) 일차성 배양물 (Sciencell # R1700) 바이알을 해동한 후, 폴리(poly)-L-리신으로 미리 코팅된 75 cm² 플라스크 속 배양액("Sciencell Schwann cell medium", Sciencell # R1701의 기본 배지)에서 10000 cells/cm2 밀도로 접종하였다. 상기 배양물은 증식을 촉진시키기 위하여 기초 배지에 5% 우태아혈청 (3H-Biomedical AB #1701-0025), 1% 슈완세포 성장 보조제 (3H Biomedical AB #1701-1752), 1% 겐타마이신 (시그마사 #G1397) 및 10포르스콜린(Forskolin, 시그마사 # F6886)으로 구성되었다.
충만도에 도달후 (세포 배치(batch)에 따라 4 내지 10 일), 슈완세포를 95% 이상 순도를 갖는 배양물을 제조하기 위하여, 부착된 섬유아세포로부터 SC 분리할 수 있는 부드러운 교반 또는 면역패닝법(thy1.1 immunopanning)으로 정제하였다. 그리고 SC를 판독하고(염색법: Tryptan blue 방법), 동일한 SC 배양물에서 폴리(poly)-L-리신으로 미리 코팅된 75 cm² 플라스크에서 접종하였다. 충만도에 도달시, 세포를 세척, 트립신처리(트립신-EDTA 1x 희석, Invitrogen #1540054), 칼슘 및 마그네슘 없이 PBS로 희석), 판독 및 5% FBS, 1% 세포 성장 보조제 (CGS), 40/ml 겐타마이신 및 4포르스콜린으로 처리된 슈완세포배지 (Sciencell Schwann cell)에서 12 웰-디쉬(well-dishes, 140세포/웰)로 플레이팅시켰다.
1.1.2 통상 방법으로 제조한 일차성 슈완세포 ( Custom -made rat primary Schwann cells)
일차성 슈완세포 배양물 (SC)을 스프라그-도울리 신생 래트 좌골 신경 (Sprague-Dawley newborn rats, P0 내지 P2)로부터 확립되었다. 모든 신생 래트를 희생시키고 페트리 디쉬(Petri dish)에서 분리하였다. 절편화는 멸균 조건하에서 수행하였다.
등 부위 피부를 뒷발 및 몸통 하부로부터 제거하였다. 좌골 신경을 분리하고 1% 페니실린/스트렙토마이신 용액 (각각 50UI/ml 및 50μｇ/ml,; Invitrogen #15070) 및 1% 우 태아 알부민 (BSA, Sigma A6003)을 첨가한 빙냉 배지(Leibovitz, L15, Invitogen #11415) 함유 배양 디쉬에 이동하였다. 래트당 모든 신경을 빙냉 L15을 함유한 15ml 튜브에 옮겼다. 그리고 L15 배지를 제거하고 10mg/ml 콜라게나아제 (Sigma #A6003)를 첨가한 2.4ml DMEM (Invitrogen #21969035)으로 갈아 주었다. 신경을 37℃에서 30분간 배지에 배양하였다. 상기 배지를 제거하고 모든 신경들을 37℃에서 20분간 칼슘 및 마그네슘을 제거한 PBS (Invitrogen # 2007-03)로 희석한 트립신 (10% trypsin EDTA 10x, Invitrogen #15400054)으로 분해시켰다. 상기 반응을 DNase I (II 급, 0.1mg/ml Roche diagnostic #104159) 및 우 태아 혈청 (FCS 10%, Invitrogen #10270)을 포함한 DMEM을 첨가하여 정지시켰다. 세포 현탁액을 10ml 피펫으로 적정하였고 50ml 튜브 (Swinnex 13mm filter units, Millipore, 20nylon-mesh filters, Fisher)속 필터를 통하여 통과시켰다. 세포 현탁액을 상온에서 10분간 원심분리(350g)하였고 펠렛을 10% FCS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 첨가한 DMEM에서 현탁시켰다. 세포를 계수하고 (트립탄 블루 법: Tryptan blue method), 5x105 내지 106 세포/디쉬(dish)의 밀도에서 배양 플레이트(Falcon 100mm Primaria tissue culture plates)에 접종시켰다.
하룻밤 배양후, 배지를 DMEM, 10% FCS, 1% 페니실린/스트렙토마이신 및 10시토신 β-D-아라비노퓨라노시드 (cytosine b-D-arabinofuranoside, Sigma #C1768)으로 갈았다. 48시간 후에, 배지를 제거하고 세포를 DMEM으로 3회 세척하였다. DMEM, 10% FCS, 1% 페니실린/스트렙토마이신, 2μＭ포르스콜린(Forskolin, Sigma #F6886), 10μｇ/ml 우 피질 추출물 (bovine pituitary extract, PEX, Invitrogen #13028)로 구성된 SC 성장 배지를 첨가하였다. 상기 배지를 2-3일마다 갈아 주었다.
배양 8일후 (세포 배치(batch)에 따라 4 내지 10일), 슈완세포는 충만도(confluency)에 도달하고, 다수의 오염된 섬유아세포를 포함하는 배양물을 면역패닝법(thy1.1 immunopanning)으로 정제하였다. 정제후, 세포들을 폴리(poly)-L-리신으로 미리 코팅된 75 cm² 플라스크에서 10000 cells/cm2 의 밀도로 성장 배지에서 현탁시켰다. 충만도에 도달시, 세포를 세척, 트립신처리(트립신-EDTA), 판독 및 12 웰-디쉬 (100 000 cells/well)에 플레이팅시켰다.
1.1.3: 약물 배양
세포들을 12 웰-디쉬에서 플레이팅한 후에, 베지를 1% N2 보조제 (Invitrogen # 17502), 1% L-글루타민 (Invitrogen #25030024) 2.5% FBS (Sciencell #0025), 0.02 μｇ/ml 코르티코스테론(corticosterone, Sigma # C2505), 4μＭ 포르스콜린 및 50μｇ/ml 겐타마이신을 보충한 DMEM-F12 (Invitrogen # 21331020) 혼합물로 구성된 정제된 배지로 대체하였다. SC 분화를 촉진시키기 위하여 성장 인자는 상기 배지에 첨가하지 않았다.
24 시간 후, 배지를 1 % 인슐린-트랜스페린-셀레늄 (Insulin-Transferrin-Selenium) X (ITS, Invitrogen # 51300), 16μｇ/ml 푸트레신 (Putrescine, Sigma # P5780), 0.02 μｇ/ml 코르티코스테론 및 50μｇ/ml 겐타마이신을 보충한 정제된 배지(DMEM-F12) 로 대체하였다. 이 단계에서, 배지에는 프로게스테론 또는 포르스콜린도 넣지 않았다.
하루후, 슈완세포를 24시간 (3 wells/condition) 동안 약물들의 조합 또는 단독 약물로 자극시켰다. 개개 약물의 준비는 세포 배양 배지에 약물 첨가 전에 수행하였다.
약물을 1 % 인슐린-트랜스페린-셀레늄 (Insulin-Transferrin-Selenium) X (ITS, Invitrogen # 51300), 16μｇ/ml 푸트레신, 0.02 μｇ/ml 코르티코스테론, 10nM 프로게스테론 및 50μｇ/ml 겐타마이신으로 구성된 정제된 배지(DMEM-F12)에 첨가하였다. 약물 자극 동안에 포르스콜린을 제거하여 아데닐 시클라제 포화현상(adenylate cyclase saturation)을 회피할 수 있다.
1-2. 면역패닝법(thy1.1 immunopanning)으로 정제한 슈완 세포
섬유아세포 배양 오염을 방지하기 위하여, 슈완 세포를 클론(clone) Thy1.1 (ATCC TIB-103TM) 면역패닝법 프로토콜을 이용하여 정제하였다.
항체 전-코팅된 100mm 박테리아 페트리 디쉬를 하기와 같이 제조하였다: 이러한 디쉬들을 PBS로 3회 세척하고, 4℃에서 하룻밤동안 20ml Tris HCl 용액 (50 mM, pH 9.5), 및 10 μｇ/ml 염소 항-마우스 IgM MU 항체 (Jackson ImmunoResearch #115-005-020)로 처리하고 ; PBS로 3회 세척하고, 0.02% BSA을 넣은 PBS 용액 및 상온에서 2시간 동안 항체 (Thy1.1 IgM antibody)를 포함하는 배양물 (T11D7e2 hybridoma culture, ATCC #TIB-103) 로부터 얻은 상등액으로 처리하였다. 최종적으로, 플레이트들을 세포 현탁물을 첨가 전에 PBS로 3회 세척하였다.
SC 를 트립신 EDTA로 탈착시켰다. 대다수 세포를 현탁이 되자마자, 상기 트립신을 DMEM-10% FBS으로 중화시키고 세포를 원심분리하였다. 분해된 세포 펠렛을 ml 당 0.66x106 cells의 밀도 (최대치)에서 0.02% BSA를 넣은 15ml 배지에서 재현탁시키고, 페트리 디쉬 (약 6.6 백만 세포/10ml/100mm 디쉬)로 옮겼다.
세포 현탁물을 비특이적인 결합을 방지하고자 매일 15분간 37℃에서 45분간 부드럽게 교반하면서 디쉬 (Thy 1.1 코팅 페트리 디쉬)에서 배양하였다. Thy1.1을 발현하는 다수의 섬유아세포를 디쉬에 부착시킨다. 배양 종료시에, 세포 현탁물을 회수하고 원심분리하였다. 이러한 세포 현탁물은 이론상으로 슈완 세포만 포함한다. 세포를 원심분리하고 세포 펠렛을 폴리-L-리신 처리된 T75 cm2 플라스크에서 16,000 세포/cm2 밀도로 10μＭ포르스콜린을 넣은 성장 배지에서 현탁시켰다.
1.3. 정량적 역전사 중합 연쇄 반응 (Q- RT-PCR)
정량적 RT-PCR을 래트 슈완 세포 일차성 배양물에서의 하우스키핑(housekeeping) Ribosomal L13A mRNA와 관련한, 약물 자극 후의 의 PMP22 mRNA 수준을 비교하는 데 사용하였다.
차갑게 멸균된 PBS로 세척한 후에, 세포 시료로부터 총 RNA를 추출하고 키트(Qiagen RNeasy micro kit, Qiagen #74004)를 이용하여 SC로부터 정제하였다. 핵산은 1μｌ RNA 시료를 이용하여 기기(Nanodrop spectrophotometer)로 정량하였다. RNA 보전성(integrity)은 기기 (BioAnalyzer, Agilent)로 측정하였다.
RNAs를 표준 프로토콜에 따라 cDNA로 역전사시켰다. PCR 증폭을 위한 cDNA 주형을 20μｌ의 최종 부피로, oligo(dT) 존재하에 42℃에서 60분간 역전사 효소 (SuperScript II reverse-transcriptase, Invitrogen # 18064-014)를 이용하여 200ng의 총 RNA로부터 합성하였다.
cDNA를 (LightCycler？480) 시스템 (Roche Molecular Systems Inc.)을 이용하여 PCR 증폭을 수행하였다. 개개 cDNA를 PCR 증폭에 사용하기 전에 5배 희석하였다. 이러한 2.5μｌ cDNA을 PCR 반응용액에 넣었다 (최종 부피: 10μｌ). 예비실험 결과는 정량화가 양쪽 서열에 대한 증폭 과정의 증식기에 완료되고 참고용 유전자의 발현이 서로 상이한 배양 조건에서 일정함을 확인하였다.
PCR 반응을 래트 PMP22 (NM_017037), 5-GGAAACGCGAATGAGGC-3 [서열번호(SEQ ID. NO):1]의 500nM 정방향 프라이머(forward primer) 및 500nM 5-GTTCTGTTTGGTTTGGCTT-3 ([서열번호(SEQ ID. NO):2]148-bp의 증폭)의 500nM 역방향 프라이머(forward primer)의 증폭으로 수행하였다. RPL13A ribosomal (NM_173340) RNA의 152-bp 단편(fragment)을 500nM 정방향 프라이머 5-CTGCCCTCAAGGTTGTG-3 [서열번호(SEQ ID. NO):3], 및 500nM 역방향 프라이머 5- CTTCTTCTTCCGGTAATGGAT-3 [서열번호(SEQ ID. NO):4]을 이용하여, 결과 정상화를 위하여 분리된 반응을 평행하게 증폭시켰다.
본 발명자들은 RT-Q-PCR 분석법 수행을 위하여 FRET 화학법을 사용하였다. FRET 프로브(probe)들은 이들의 3‘-말단이 공여 형광 염색제(donor fluorophore dye, Fluorescein)로 표지된, 0.3μＭ Pmp22-FL-5-GCTCTGAGCGTGCATAGGGTAC [서열번호(SEQ ID. NO):5] 또는 Rpl13A-FL- 5-TCGGGTGGAAGTACCAGCC [서열번호(SEQ ID. NO):6]으로 구성되었다. 0.15μＭ Red640 브로브들은 하기와 같이 정의된다: 이들의 3‘-말단이 수용 형광 염색제(acceptor fluorophore dye, Rhodamine Red 640)로 표지된, Pmp22-red-5'-AGGGAGGGAGGAAGGAAACCAGAAA [서열번호(SEQ ID. NO):7] 또는 Rpl13A-red-5'-TGACAGCTACTCTGGAGGAGAAACGGAA[서열번호(SEQ ID. NO):8].
개개 PCR 반응은 10μｌ 의 키트(master mix kit, Roche #04-887301001) 최종농도에서 2.5μｌ cDNA 주형을 포함시켰다.
PCR 조건은 하기와 같다: 95℃에서 10초, 63℃에서 10초 및 72℃에서 12초 및 40℃에서 30초 (40회 증폭 순환). PMP22 유전자 발현의 상대적인 수준은 목표 유전자 PMP22 및 내인성 내부 표준 RPL13A로부터 발생한 산물들 간의 비를 측정하여 확인하였다.
1.4. 유세포 분석법(FACS)에 의한 PMP22 단백질 발현 분석법
약물 배양 8시간, 24시간 및 48시간 후에, 상등액을 회수하고, 원심분리하고, 냉동시켰다. SC를 트립신-EDTA으로 탈착하였다. 대다수 세포가 현탁되자마자, 트립신을 10% FCS을 첨가한 DMEM을 이용하여 중화시켰다.
세포가 있는 상등액을 회수하고 원심분리하였다. 세포 펠렛을 미세 튜브로 옮기고, PBS로 1회 세척하고 특수 용액 (AbCys #Reagent A BUF09B)으로 고정화하였다. 10 분후, 세포를 PBS로 1회 세척하고 4℃로 유지하였다.
세포 고정화 5일째, 서로 상이한 배양 기간을 갖는 모든 세포 시료들을 하기한 프로토콜을 이용하여 표지화하였다.
세포를 5분간 7000 rpm에서 원심분리하고 펠렛을 투과용 용액 (AbCys #Reagent B BUF09B)으로 현탁하고 상온에서 1시간동안 1차 PMP22 항체 (Abcam #ab61220, 1/50) 로 표지화하였다. 그리고 세포를 5분간 7000 rpm에서 원심분리하고 세포 펠렛을 PBS로 1회 세척하였다. 2차 항체를 첨가하고, 상온에서 1시간 동안 Alexa Fluor 488 (goat anti-rabbit IgG, Molecular Probes #A11008, 1/100)로 결합시켰다. 그리고 세포를 5분간 7000 rpm에서 원심분리하고 세포 펠렛을 PBS로 1회 세척하였다. Alexa Fluor 488 (chicken anti-goat IgG, Molecular Probes #A21467, 1/100)으로 결합된 3차 항체를 첨가하고 1시간 동안 상온 배양하여 표지를 증가시켰다. 그리고 세포를 PBS로 1회 세척하였다. 항체가 없는 대조군 (비표지된 세포; unlabelled cells)은 자가형광도(autofluorescence) 수준을 측정하고 광증폭기 (photomultiplicators) 민감도를 적용하기 위하여 사용하였다. 1차 항체는 없이 2차 항체 및 3차 항체를 넣은 대조군을 항체의 비-특이적인 결합을 측정하기 위하여 수행하였다.
데이타 습득 및 분석은 5000개 세포에서 분석기(FACS Array cytometer) 및 프로그램(FACS Array software, Becton Dickinson)으로 수행하였다. 세포 내부 복잡도에 따른 (granularity) 세포 부피(크기) 및 측면 산란 검출도 (Side Scatter, SSC)와 관련된 산란 검출도 (Forward Scatter, FSC)를 분석하였다. PMP22의 발현을 위하여, 총 세포 내에서 분석을 수행하고 양성 세포 백분율을 계산하였다. 양성 세포는 2차 항체를 갖는 대조군보다 높은 형광 강도를 갖는 세포이다.
SC 수를 정량화하기 위하여, 대조군 배지중 세포를 항체 항-S100 단백질을 이용하여 분석하였다.
세포를 하기 프로토콜에 따라 제조하였다: 슈완 세포를 상온에서 1시간동안 항체 항-S100 단백질 (antibody anti-S100 Protein, Dako #S0311, 1/100)으로 염색하였다. 본 항체를 3차 항체로 배양하지 않고 면역염색(PMP22 immunostaining)을 위해 상술한 프로토콜에 따라 표지시켰다.
1.5 . 약물 배양 및 활성
약물을 아데닐 시클라제 포화현상(adenylate cyclase stimulation saturation)을 방지하고자, 10nM 프로게스테론은 존재하나 포르스콜린은 없이 상기한 바(3 wells/condition)와 동일하게 24시간 또는 48시간동안 배양하였다. 약물 배양 후에, 상등액을 회수하고 슈완세포를 RT-Q-PCR 분석을 위하여 냉동시켰다.
본 실험 결과는 하기 표 1과 같다.
조합(combination) PMP22 발현
Mix1 하위 조절
Mix2 하위 조절
Mix3 하위 조절
Mix4 하위 조절
Mix5 하위 조절
Mix6 하위 조절
실험예 2. CMT에 대한 공동배양 모델에서의 Mix7 화합물의 상승효과 측정
공동배양 (co-culture) 모델을 CMT1A 시험관내 시험(in vitro model)로서 사용하였다. 본 수초화(myelination)모델은 수컷 PMP22 유전자 변형(Transgenic; TG) 분리 배근신경절(Dorsal Root Ganglia; DRG)로부터 유래된 감각 신경세포 및 슈완세포(Schwann cells)를 공동배양하는 것으로 이루어진다.
본 연구의 목표는 수초화 과정에 미치는 3개 시험 화합물(+/-바클로펜, 날트렉손 및 소르비톨) 및 Mix7 (상기 3개 약물 조합)의 효과를 측정하는 것이다. 수초화에 대한 이러한 3개 시험 화합물 및 이의 조합의 효과는 아스코르빈 산 존재하에서의 미엘린 기본 단백질( Myelin Basic Protein; MBP) 발현을 평가함으로서 측정된다.
2.1.재료 및 방법
15 일 임신 암컷 래트를 경추탈골로 치사시켰다. 유사한 태아발달단계를 나타내는 태아들을 자궁에서 제거하였다.
2.1.1 유전자서열분석( Genotyping )
개개 태아머리 절편 (3 mm3)을 DNase가 제거된 2ml 튜브에 위치시켰다. DNA를 키트(SYBR Green Extract-N-Amp tissue PCR kit; Sigma, ref XNATG-1KT)로 추출하였다. 120μｌ추출물 용액(Kit Sigma, ref XNATG-1KT)을 개개 태아머리 절편에 넣었다. 상기 머리들을 상온에서 10분간 배양하였다. 배양 종결싯점에, 머리들을 추출용액에서 5분간 95℃에서 배양하였다. 최종 배양을 마치자 마자, 100μｌ중화 용액(neutralizing solution)을 첨가하고 개개 DNA 추출물을 멸균된 초순수 물 (Biosolve, ref: 91589) 로 희석(1/40)하고 사용시까지 +4℃에서 보관하였다. 암컷(F) 및 수컷(M) 태아의 유전자 서열분석을 기기(Fast SYBR Green Master Mix, Applied Biosystem, 4385612)를 이용하여 DRG 분리 동안에 수행하였다. 개 태아의 성별은 수컷 SRY 유전자를 이용하여 결정하였다. 상기 SRY 프라이머(primers)는 회사(Pharnext)에서 공급받아 사용하였다 (SRY-F ([서열번호(SEQ ID. NO):9].):5'-GAGAGAGGCACAAGTTGGC-3';SRY-R([서열번호(SEQ ID. NO):10]):5'-GCCTCCTGGAAAAAGGGCC-3'). 상기 SRY 프라이머들을 3μＭ 멸균된 초순수 물 (Biosolve, ref: 91589)로 희석시켰다. PCR를 위한 혼합물(mix)을 초순수물 (4μｌ/시료당), 3μＭ 프라이머 (2μｌ/시료당) 및 마스터 믹스(Master Mix; 10 μｌ/시료당)로 준비하였다. PCR 96 웰 프레이트(wells plate)에서, 16μｌ PCR 혼합물(mix)을 개개 웰에 첨가하였다. 4 μｌ개개의 희석된 DNA을 계획 순서대로 첨가하였다. PCR을 하기 프로그램으로 시스템(7500 fast RT-PCR system; Applied Biosystem)을 이용하여 수행하였다:
시작: 95℃ - 20 초
45 사이클(cycles): 95℃ - 10 초, 65℃ - 10 초, 72℃ - 30 초 (데이타 취득).
용융곡선(Melt curve): 95℃ - 15 초, 64℃ - 1분, 90℃ - 30 초 (연속 데이터 취득), 60℃ - 15 초. 상기 증폭 구도 및 용융곡선은 소프트웨어(7500 software, Applied Biosystems)로 분석하였다.
개개시료에 대한 결과는 개개 태아의 유전형을 확인하기 위하여 음성 대조군(negative control; 초순수 물; ultrapure water), 및 양성대조군(positive control, TG/수컷 및 WT/암컷)과 비교하였다.
2.1.2 감각신경(Sensory neurons) 및 슈완 세포 공동-배양(Schwann cells co-cultures)
래트 척수신경절을 문헌(Cosgaya et al., 2002 및 Rangaraju et al., 2008)에 개시된 바와 같이 배양하였다.
개개 태아는 계산된 페트리 디쉬(numerating petri dish; 직경 35 mm)에 넣었다. 태아 머리를 절단하고, DNAase 제거 1.5 ml 튜브에 놓고; 상기 ADN을 키트(Extract-N-Amp Tissue Kit; Sigma Aldrich)로 추출하였다. 유전자분석(수컷 (M) 및 암컷 (F), 야생형 및 PMP22 유전자변형)을 키트(kit Fast SYBR Green Master Mix; Applied Biosystem)을 수행하였다. 이러한 유전자분석은 절단 종료싯점에 오로지 한 개 형태의 배양물(유전자 변형 수컷)만이 남도록 척수신경절(DRG) 절단과 병행하여 수행하였다. 개개 태아 DRG를 회수하고, 빙냉-배양액 (Leibovitz; L15, Invitrogen)에 놓았다. 절단 종료시에 TGM의 DRG에 회수하고 37℃에서 20분간 트립신화 (trypsinization, trypsin EDTA, 0.05%; Invitrogen)으로 용해시켰다. 상기 반응을 DNAase I (Roche) 존재하에 10% 우태아혈청(FBS)을 함유한 DMEM을 첨가하여 중지시켰다. 상기 현탁물을 10ml 피펫으로 적정하였다. 그리고 세포를 상온에서 10분간 원심분리(350xg)하였다. 용해된 세포의 펠렛(pellet)을 2% B27(Invitrogen), 1% 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin; Invitrogen), 1% L 글루타민 및 50ng/ml NGF (Sigma) 함유 배양액 (neurobasal medium, Invitrogen)에서 재현탁하였다. 본 배양물은 특수배양물(neuronal medium)이다. 생존 세포를 트립탄블루 배제 시험법(trypanblue exclusion test, Sigma)을 이용하여 계수기(Neubauer cytometer)에서 판독하였고 폴리-L-리신으로 처치된 6 웰-플레이트(Greiner)에서 10000 세포/웰로 접종하였다. 플레이트를 대기 (95%)-CO2(5%) 조건하의 습기찬 배양기에서 37°C로 유지하였다. 표준 신경배양액(standard neuronal culture medium)의 절반을 하루걸러 갈아주었다. 상기 배양물을 상기 배양물을 슈완세포에서 감각신경 돌기가 형성되도록 표준 신경배양액에서 7일간 유지시켰다. 7일째, 상기 배양물을 기저판 형성(basal lamina formation) 및 수초화를 촉발시키기 위하여 50 μｇ/ml 아스코르빈산 존재 또는 존재없이 신경 배양액에서 배양하였다.
2.1.3. 약물 배양 (Drug incubation)
7일째, 하기 시험 화합물 (단독 또는 조합)을 50 μｇ/ml 아스코르빈 산에 배양액에 첨가하였다:
(1) (RS)-바클로펜(Baclofen)
(2) 날트렉손(Natrexone)
(3) d-소르비톨(Sorbitol)
(4) Mix7= 3개 개개 화합물들의 조합.
이러한 화합물들 또는 화합물 조합을 하기 농도들로 시험하였다
(표 2):
TG DRG/SC 공동배양물에서의 MBP 발현의 시험관내 시험을 위해 사용된 개개 약물 또는 조합 농도.
용량 1 용량 2 용량 3 용량 4 용량 5 용량 6
개개약물 날트렉손 5μM 1μM 200nM 40nM 8nM 1.6nM 320pM
d-소르비톨 500μM 100μM 20μM 4μM 800nM 160nM 32nM
(RS)-바클로펜 5μM 1μM 200nM 40nM 8nM 1.6nM 320pM
Mix7 날트렉손 5μM 1μM 200nM 40nM 8nM 1.6nM 320pM
d-소르비톨 500 μM 100μM 20μM 4μM 800nM 160nM 32nM
(RS)-바클로펜 5μM 1μM 200nM 40nM 8nM 1.6nM 320pM
시험 화합물들을 5개의 상이한 시간대별에 배양하였다: 5, 9, 10, 11 및 13일.
DRG (TG 태아 수컷 래트유래)의 3개의 개별적이고 독립적인 배양을 수행하였다. 이러한 조건들은 6개 웰/조건으로 아스코르빈산 존재하에 측정하였다. 모든 시험 화합물들의 즉시사용형 용액은 -20℃에서 저장된 스톡 용액(stock solution)으로부터 일시적으로 준비하였다. 이 용액은 주 1회 준비하였다. 시험화합물 및 아스코르빈산(개개 농도 1X)이 첨가된 표준 신경 배양액의 절반을 하루 걸러 갈아 주었다.
2.1.4 염색 프로토콜(Staining protocol)
배양 5, 9, 10, 11 및 13 일 후에, 세포들을 10분간 에탄올 (95%) 및 아세트산 (5%) 빙냉 용액에 의하여 고정하였다. 상기 세포들을 15분간 0.1% 사포닌 및 10% 염소 혈청(goat serum)을 포함하는 PBS로 투과가능하게 하고 차단시켰다. 그리고, 상기 세포들을 미엘린(myelin)의 특이 마커(marker): 폴리클론 항체 항-미엘린 기초 단백질 항체 (polyclonal antibody anti-myelin basic protein (MBP) antibody; Sigma 118K0431)와 배양하였다.
본 항체를 항체(Alexa Fluor 568 goat anti-rabbit IgG 및 Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG; Molecular probe 687621, 623962)로 구현시켰다. 뉴론(neuron) 핵을 마커(fluorescent marker; Hoechst solution, SIGMA ref B1155)로 표지시켰다.
2.1.5. 데이터 처리 (Data processing)
각 웰당, 20 영상들(pictures)을 20x 배율로 기기(InCell Analyzer TM 1000; GE Healthcare)를 이용하여 촬영하였다. 모든 영상들은 동일한 조건하에서 촬영하였다. 미엘린화 액손(myelinated axons) 전체 길이에 대한 분석은 소프트웨어(Developer software; GE Healthcare)를 이용하여 자동적으로 수행하였다(액손 길이 및 주변 면적). 모든 수치는 평균(mean) +/- s.e. 평균(mean)으로 표시하였다. 통계 분석은 서로 상이한 조건들로 수행하였다 (ANOVA 뒤에 허용된 시험법(Fisher’s PLSD test)을 수행함).
2.2. 결 과
Mix7 유효성에 대한 약물의 상승적 효과
Mix7 조합으로 구성된 중요한 상승적인 효과가 MBP 발현에 대하여 관찰되었다. 사실상, 10일째 (= 배양 17일), (RS)-바클로펜, 날트렉손 및 d-소르비톨 조합은 도 1A 및 2A에 나타낸 바와 같이, 용량(dose) 1 및 6에서 MBP 발현을 증가시켰다. 대조적으로, 개별적으로 사용된 상기 약물들은 대조군과 비교시에 실질적인 효과가 나타나지 않았다 (도1B-D 및 2B-D).
MBP 발현에 대한 유의적인 효과도 Mix7의 용량들(doses) 2, 3, 4, 5 및 7에서의 배양 10일후에 기록되었다 (도 3A).
이러한 효과는 명백한 종모양 곡선 형태로 용량(dose) 2-7에서도 11일째에 관찰되었다 (도 3B).
실험예 3. CMT 동물 실험에서 생체내 시험
본 발명자들은 모델에서의 상기 화합물들의 치료효과를 시험하였다.
실험군은 암수 모두의 젊은 래트들로 각각 구성하였다. 상기 래트들을 체중을 토대로 한 하기 확률화 계획에 따라 할당하였다. 몇몇 실험에서, 상기 확률화는 막대시험법(bar-test)에서의 래트 행동에 기초하여 수행하였다.
모든 암수 래트들은 치료군과 숫적으로 동일하거나 큰 분리된 대조군으로 제시된다.
래트를 3 또는 6 주간 개개 약물의 생체이용률에 따라 약물로 정기적으로 강제 사료 투입 또는 펌프(Alzet 삼투압 경피 펌프, DURECT Corporation Cupertino, CA)에 의한 주사로 처치하였다. 수행된 모든 생체 내(in vivo) 실험에서 Mix7을 가비지(gavage)로 투여하였다.
성장하는 체중에 따라 투여량을 조정하기 위하여 주당 2회씩 동물 체중을 측정하였다. 만일 상기 삼투압 펌프가 치료적 투여법으로 위하여 선택되는 경우에는, 상기 약물의 투여량은 펌프 지속기간(6주)를 초과하는 연령으로 예측되는 계산된 평균 동물 체중을 근거로 하여 계산되었다. 상기 펌프는 적절한 마취 프로토콜에 따라 필요시 재-장착된다.
행동 시험( Behavioural tests )
개개 3주 또는 4주째, 상기 동물을 행동시험에 사용하였다. 각 시험은 동일한 실험 실 및 동일한 시간대에 동일한 연구원에 의하여 수행되었다: 이러한 일치성은 전체 실험과정 내내 유지되었다. 모든 처치법 및 유전자분석법은 연구원에게 맹검하에 수행되었다. "막대 시험법(Bar test)" 및 "악력 시험법(Grip strength)"을 전체 실험 내내 주로 시험에 사용하였다. 막대시험법의 시험계획은 예를 들어 기억력에 기인한 오차를 방지하고자 동물 성장에 따라 변화가능하다.
악력 시험법은 근력 (muscle force), 민감도 상태(sensitivity status) (예를 들어, 통증감각은 힘의 특정치를 변화시킬 수 있다) 및 행동 요소 (behavioural component, "동기화(motivation)")로 구성되는, 악력 수행상의 미묘한 차이를 탐지할 수 있게 한다. 그 수치는 앞발 및 뒷발 간에 차이를 나타내고 동물 연령에 크게 좌우된다.
본 악력 시험법은 동물이 앞발 또는 뒷발로 봉을 쥐는 행동을 지속하는 힘을 각각 측정하는 시험이다. 악력계를 힘을 측정하기 위해 그립(grip)에 설치한다 (Force Gauge FG-5000A). 래트를 앞발 또는 뒷발로 그립을 잡고 그립을 놓을 때까지 뒤로 래트를 부드럽게 잡아 당기도록 실험자가 지속하였다. 동물이 그립을 놓을 때 측정된 힘을 기록하였다.
동물 당 앞발 힘을 측정하는 2번의 연속적인 시험 및 뒷발 힘을 측정하는 2번의 연속적인 시험을 수행하였고 최대 수치(앞발에 대해 한번 및 뒷발에 대해 한번)만을 기록하였다(N 중).
막대시험법 ( The Bar test )
막대시험법(Bar Test)은 고정된 막대를 붙잡는 래트의 능력을 평가한다. 근육 약화를 나타내는 Pmp22 래트는 본 시험법에서 행동 결함을 나타낸다 (Sereda et al, 1996). 이 래트는 막대 (직경 : 2.5 cm, 길이 50 cm; 탁자위 30 cm) 중간에 네발로 위치하게 한다. 시험은 연속적으로 수행하고, 본 실험에서 시험 횟수 및 지속기간은 동물의 배취(batch)에 좌우된다. 본 실험의 가변성은 실험중 CMT 래트에서의 운동 결함을 가장 잘 감지하기에 적합한 계획을 결정하기 위하여 도입된다.
개개 세션(session)에서 기록된 수행 지수(Performance indices):
(1) 막대에서 60초간(또는 배취 1, 세션 1 및 2에 대해서 30초) 붙잡는데 필요한 시도수.
(2) 개개 시도 및 세션 평균에서 막대에서 소요된 시간(즉, 떨어지는 지연시간). 본 실험 과정중, 래트들이 막대에서 측정 한계 시간(cut-off time), 즉 30초 또는 60초 동안 머문후 세션이 종료되는 경우는 상기 측정 한계 시간(cut-off time, 즉 30초 또는 60초)은 시도이 완료되지 않는 것으로 간주함 (예를 들어, 시도(trial) 1, 2 및 3에서 10초 이하, 그리고 시도 4, 및 5에서 60초간의 머무름을 갖는 배취 8은 시도 6 내지 10으로 간주함).
(3) 떨어진 횟수.
전반적 건강 측정
동물의 체중, 명백한 신호 (털모양, 자세, 걸음걸이, 진전 등의 현상)을 실험 내내 조사하였다. 등급 크기는 기록을 위해 사용되었다: 0= 정상, 1= 비정상.
보행시험(gait)
개개 래트는 5분간 깨끗한 새로운 래트 케이지(직경 55x33x18cm)에서 관찰되었다. 래트들의 보행은 하기 4개의 변수로 평가하였다:
(1) 점수(Score) 0: 정상적 보행 (부드러운: fluid)
(2) 점수 (Score) 1: 정상적 보행 (부드럽지 않거나 래트가 약간 절룩거림)
(3) 점수(Score) 2: 중등 장애 (래트가 한쪽 다리를 끌고 똑바로 서거나 걸을 수 없음)
(4) 점수(Score) 3: 심각한 장애 (래트가 한쪽 또는 양측 뒷발을 끌고 똑바로 설 수 없음).
경사면 시험( inclined plane test )
경사 장치는 0° (수평) 내지 60° 각도로 경사가능한 30x50cm 투명 합성수지 평면(Plexiglas plane)이다. 각 래트는 처음은 머리를 위로 한 위치(머리를 상방향으로 한 배향)로 25°-각도 경사면에 위치시켰다; 1분 간격의 2회 시도를 수행함. 30분후에, 동일 실험을 35°-각도 경사면 후에 40°-각도 경사면으로 바꾸어 수행하였다. 이 기간 동안 래트를 케이지에 돌려보내고 평면을 개개 시도 후에 청소하였다.
래트들의 수행은 하기 4가지 점수로 평가하였다:
(1) 점수(Score) 0: 미끄러짐 없음(no slide)
(2) 점수 (Score) 1: 약간 미끄러짐(a little slide; 1 또는 2발)
(3) 점수(Score) 2: 중등정도 미끄러지나(4발) 면의 끝까지는 아님
(4) 점수(Score) 3: 래트가 면 최하단부까지 미끄러짐.
추가 실험
적절한 시점에, 래트들을 전기생리학적 평가 조직학적 측정법을 수행하고 좌골신경에서의 및 pmp22 RNA 발현 수준을 정량화하였다.
정량적 RT - PCR 에 의한 좌골신경에서의 pmp22 RNA 의 정량
전체 RNA를 기기(Qiazol; ref N°79306, Qiagen Gmbh, Germany)를 이용하여 좌골 신경으로부터 분리하고, 제조자 프로토콜(Qiagen-RNeasy Fibrous tissue Handbook)에 개시된 바와 같이 방법으로 키트(RNeasy Mini Kit; ref N° 74106, Qiagen Gmbh, Germany)로 1-단계 정제 방법을 수행하였다. DNA 오염은 키트(DNA-free kit; Qiagen-Rnase-free dnase set 1500 Kunits, ref N° 1023460)를 사용하여 RNase-free DNase I으로 분해시켜 제거하였다..
RNA 농도는 기기 (NanoDrop ND-1000)로 측정하고 품질관리용 시험은 분석기(Agilent 2100 Bioanalyzer) 연결 나노칩 (Agilent RNA 6000 nano chips)으로 수행하였다.
역 전사(Reverse transcription) 및 실시간 (real-time) PCR: Quantitative RT-PCR (RT-Q-PCR) 을 하기와 같이 수행하였다: 80 ng 전체 RNA를 20μl 반응 부피로 Oligo(dT)12-18 (Invitrogen, Carlsbad, CA)으로 효소 (SuperScript™ II Reverse Transcriptase; Invitrogen, Carlsbad, CA)를 이용하여 역전사를 수행하였다.
실시간 PCR은 시스템 (rapid thermal cycler system; LightCycler480 II, 384-Well, Roche, Switzerland)으로 수행하였다. 증폭(Amplifications)은 130nM 내지 1μＭ사이로 조정된 프라이머(primer) 농도로 10μｌ 총 부피로 수행되었다. 프라이머 및 가닥(template) 들에 LightCycler480 SYBR Green I Master (2× 농도. Roche, 제품번호 N° 04 887 352 001)을 첨가하였다. 뉴클레오티드(Nucleotides), MgCl2, Taq DNA 폴리머라제(polymerase) 및 완충액들은 혼합물(mix)에 포함되었다.
증폭 프로토콜은 TaqDNA 폴리머라제(polymerase) 활성화를 위하여 10분간 95℃에서 초기 배양 중에 적용하였고 이후에 95℃에서 10초간 변성과정 (denaturation), 60℃에서 40초간 아닐링과정(annealing) 및 72℃에서 10초간 연장과정 (extension)을 45회(cycles)을 수행하고 (형광산물의 탐지는 1회 수집 모드(single acquisition mode)로 72℃ 연장 기간 종료 싯점에 수행되었다) 95℃에서 5초간 변성과정, 63℃에서 60초간 아닐링 과정 및 95℃로 용융 곡선(melting curve)의 사이클(cycle)로 종료시켰다 (63℃ 내지 95℃증감발율(ramp rate)은 0.11℃/s 이고 형광 산물의 탐지는 연속적임).
증폭 특이성을 확인하기 위하여, 개개 프라이머 쌍으로부터 얻은 PCR 산물에 대하여 용융 곡선 분석법(melting curve analysis)을 수행하였다. 상대적 정량화 (Relative quantification)를 개개 PCR 시료에 대하여 교차 포인트(crossing point; Cp 값) 를 토대로 수행하였다. 시료의 형광도가 배경 형광도(background fluorescence)보다 높은 포인트(point)를 시료 "교차점(crossing point; Cp)로 지칭하였다. 유전자 (Rattus norvegicus Myelin Protein Zero; MPZ)를 정상화에 사용하였다 (Sereda et al, 2006). RT-Q-PCR 분석법에 사용된 프라이머 서열은 (Eurofins MWGOperon으로 합성, Germany) 하기와 같다:
PMP22 정방향(forward): 5’-TGTACCACATCCGCCTTGG-3’ (서열 번호: 11) 및
PMP22 역방향(reverse): 5’-GAGCTGGCAGAAGAACAGGAAC-3’ (서열 번호: 12).
MPZ-정방향(forward): 5’-TGTTGCTGCTGTTGCTCTTC-3’ (서열 번호: 13) 및
MPZ-역방향(reverse): 5’-TTGTGAAATTTCCCCTTCTCC-3’ (서열 번호: 14).
결과
Mix1 조성물은 치료 과정 중 내내 막대시험 수행면에서 우수한 효능을 나타냈다 (도 4).
Mix1 은 도 5에 나타난 바와 같이, 치료 3 및 6주 후에 유전자 변형 래트의 보행 점수를 개선시켰다.
Mix1 은 도 6에 나타난 바와 같이, 25°각도의 경사면 시험법에서 치료 3, 6, 9 및 12 주 후에 유전자 변형 래트의 수행능력을 증가시켰다.
도 7은 경사면 시험법에서 25, 35 및 40°각도에서 유전자 변형 래트의 보행 점수에 대한 Mix2의 양성 효과를 나타낸 것이다.
Mix7 (용량 3)는 pmp22 유전자 변형 래트 좌골 신경에서의 pmp22 RNA 유전자 발현을 유의적으로 감소시켰다 (도 9).
Mix7 (용량 2 및 용량 3)로 처치된 pmp22 래트의 행동은 35°각도에서 경사면에서 개선되었다 (도 10). 보다 상세하게는, TG 플라세보(placebo) 군이 5%인데 비하여, 우수행동군(good performance group) 래트는 29 및 33%이며 TG 플라세보(placebo) 군이 60%인데 비하여, 우수행동군(good performance group) 래트는 29 및 11% 이었다. P-값(value) (TG 플라세보 대비)은 Mix7-용량 2으로 처치된 TG 래트에 대해서 0.0152이고 p-값은 (TG 플라세보 대비)은 Mix7-용량 3으로 처치된 TG 래트에 대해서 0.002이다.
Mix7-용량 3은 처치 9주 후에 막대시험법에서 pmp22 래트의 낙상 반응시간(fall latency time)을 증가시켰다 (도 11): 흑색 점선(black dashed line), p=4,56.10-2, n=18. TG 플라세보 래트 (흑색 평면 선(black plain line), n=20) 및 WT 플라세보 래트 (회색 평면 선(grey plain line), p=3,82.10-7, n=18) 사이에 유의적인 상이성도 관찰하였다.
도 12는 Mix7-용량 3으로 처치된 pmp22 래트의 악력상의 개선효과를 나타낸 도이다rats.
도 13은 막대시험 반응시간 (Mix7-용량 3으로 처치된 9주후) 및 pmp22 RNA 발현 수준 간의 유의적인 상관관계를 나타낸 도이다.
도 14는 막대시험 반응시간 (Mix7-용량 3으로 처치된 9주후) 및 감각신경 전도 속도(conduction velocity) 간의 유의적인 상관관계를 나타낸 도이다.
유사한 결과가 기타 조합에서도 나타났다 (표 3 참조).
조합 PMP22 래트 질환 유전형
Mix1 개선
Mix2 개선
Mix3 개선
Mix4 개선
Mix5 개선
Mix6 개선
이러한 데이터는 생체내(in vivo)에서 본 발명의 조합 및 처방은 CMT의 효과적인 치료법을 제공한다
실험예 4. 중독성 신경병증 동물 실험에서 생체내 시험
본 약물 치료 및 처방은 옥살리플라틴(Oxaliplatin 3mg/kg; D -1)의 최초 복강내 주사 하루 전부터 최종 시험 일(D16) 하루 전날까지 경구투여 하였다. 옥살리플라틴-처치군에 속하는 동물에게는 증류수(10 ml/kg)로 매일 투여되었다. 동물들에게 옥살리플라틴은 오후에 투여하는 반면에 아침에 매일 시험 처치 및 증류수 처치를 수행되었다.
시험일동안 (즉, D1, D4, D10), 처치(treament) 및 증류수를 시험 후에 투여되었다. 시험일 (D4)에 화합물들, 담체 투여 및 옥살리플라틴 주사에 포함하여, 처치 및 증류수를 시험 후에 옥살리플라틴 주사 전에 투여되었다. 참고-처치 군(reference-treated group) 동물에게는 시험일 동안에만(즉, D1, D4, D10 및 D17) 투여되었다.
냉이질통(Cold allodynia)을 D1 (옥살리플라틴 3 mg/kg 최초 주사후 24시간 경; 옥살리플라틴의 급성효과), D4, D10 (옥살리플라틴의 만성 효과) 및 D17 치료 완료 1주 후 옥살리플라틴의 잔존 효과)에 열성(thermal) 신경전달 비관련 자극(non-nociceptive stimulation; acetone test)에 대한 반응을 측정함으로서 평가되었다.
시험법은 참고약물(reference)의 투여 2시간 후에 아세톤 시험법(acetone test)를 이용하여 수행된다. 상기 참고약물은 가바펜틴(Gabapentin, 100 mg/kg, 경구(per os), 4 시험일 1일 1회)을 사용했다.
아세톤 시험법(Acetone test)
냉이질통은 아세촌 시험법을 이용하여 평가되었다. 본 시험에서, 뒷발 위축 반응시간은 양쪽 뒷발 발바닥(반응 시간)에 한 방울 아세톤을 적용한 후에 측정하고 반응 강도를 점수화하였다 (냉 점수: cold score).
아세톤의 냉각효과에 대한 반응 시간은 아세톤 적용 20초(종결시간) 내에서 측정하였다. 아세톤에 대한 반응도 또한 하기 4-점(point) 점수로 분류하였다: 0 (반응 무); 1 (신속한 위축, 발 튕김); 2 (연장된 위축 또는 현저한 발 튕김); 3 (핥기 또는 물기를 수반한 반복된 발 튕김).
래트를 이용한 6번 시도가 수행되었다. 개개 시험군에 대하여, 상기 결과를 각각의 래트에 대한 6개의 점수 합 ± SEM으로 정의되는 누적된 냉 점수(cumulative cold score)로 표시하였다. 최소 점수는 0 점 (6번 시도중 어떠한 시도에서도 반응무)이며 최대 점수는 18점 (6번 시도중 개개에서 반복된 발 튕김 및 핥기 또는 물기)이었다.
가바펜틴 (Gabapentin) 입수처: 중국(Zhejiang Chiral Medicine Chemicals, China)
옥살플라틴(Oxaliplatin) 입수처: 프랑스(Sigma, France)
결과는 도 8에 도시하였다. 이들은 옥살리플라틴-유도 신경병증에 대한 본 발명의 조성물의 보호 효과를 명백하게 나타냈다.
실험예 5. ALS 모델에서의 생체내 시험
동물 모델
본 발명자들은 근위축성 측삭 경화증 병리를 모방하기 위하여 SOD1G93A 래트 모델 (Howland DS et al, 2002에 따라 생산)을 선택하였다. 이 모델은 척수뿐만 아니라 다수 뇌 영역 및 말초 조직에서 변이된 SOD1 유전자를 과발현시킨다 (Howland DS et al, 2002). 이러한 모델의 운동신경 질환의 시발은 뒷발이 비정상적인 걸음걸이를 나타내는 약 115일 경이다 (Howland DS et al, 2002). 수일내에, 뒷발 마비가 발생한다.
실험 과정
본 발명자들은 스프라그 도울리 암컷 래트와 잡종교배한 SOD1G93A 래트 군체를 얻었다. 이형 접합적 (Heterozygous) SOD1G93A 래트를 hSOD1 (Howland DS et al, 2002)에 특이적인 프라이머(primer)로 테일(tail) DNA의 중합효소연쇄반응(PCR)로 동정하였다. 동물들은 조절된 조명 (0500 내지 1900 h 밝기) 및 온도 (23±1°C)가 유지되는 방에서 식이 및 음용수에 자유롭게 접근 가능토록 하였다. 본 연구에서 모든 동물 실험 과정은 동물 보호 표준 지침에 따라 수행되었다.
체중 측정은 매주 수행되었고 행동 시험은 60일 연령부터 시작하여 종말 점까지 수행하였다. 본 처치는 5주령부터 경구 또는 피하적 방법으로 매일 투여되었다.
관찰 시험법: 일반적 측면에서의 특징
개개 래트를 5분간 깨끗하게 새로운 케이지(크기: 55x33x18cm) 에서 관찰하였다. 5가지 매개변수들을 기록하였다:
1. 걸음 걸이
(1) 점수(Score) 0: 정상 걸음걸이 (유연한),
(2) 점수 1: 비정상 걸음걸이 (유연하지 않거나 또는 래트가 약간 다리를 절뚝거림),
(3) 점수 2: 중등정도 장애 (래트가 다리를 끌고 똑바로 세워 보행이 가능함),
(4) 점수 3: 심각한 장애 (래트가 한쪽 또는 양쪽 뒤다리를 끌 수 있으나 똑바로 세울 수 없음).
2. 털 모양 측면
(1) 점수 0: 털이 깨끗하고 비단같음,
(2) 점수 1: 털이 서있거나 더러움
3. 떠는 상태
(1) 점수 0: 떨지 않음,
(2) 점수 1: 떠는 상태
4. 신체 모습
(1) 점수 0: 정상,
(2) 점수 1: 비정상 (뻗어 있거나 허리를 굽히는 상태)
5. 뒷발 자세
(1) 점수 0: 정상,
(2) 점수 1: 뒷발을 뻗은 상태
운동 점수 시험법: 운동 결함 특성
본 시험법은 30초 이내에 어느 한측으로 돌아선 위치를 원래 위치로 자세를 고치는 능력을 평가한다(올바른 반사) (Gale K. et al, 1985).
비-매개변수적 점수화 시스템(non-parametrical scoring system)을 하기 기준들에 따라 이용하였다 (Matsumoto A. et al, 2006; Thonhoff JR et al, 2007):
(1) 점수(Score) 0: 래트가 30초 이내에 어느 한측으로 돌아선 위치를 원래 위치로 자세를 고칠 수 없음,
(2) 점수 1: 래트가 30초 이내에 한측만으로 돌아선 위치를 원래대로 위치로 자세를 고칠 수 없음,
(3) 점수 2: 래트가 30초 이내에 양측으로 돌아선 위치만을 원래대로 위치로 자세를 고칠 수 있으나 케이지에서 똑바로 서지 못하고 신체 일부를 항상 끄는 행동을 보임,
(4) 점수 3: 래트가 30초 이내에 양측으로 돌아선 위치만을 원래대로 위치로 자세를 고칠 수 있고 케이지에서 똑바로 서지 못하나 신체 일부를 끌지 않음,
(5) 점수 4: 래트가 30초 이내에 양측으로 돌아선 위치만을 원래대로 위치로 자세를 고칠 수 있고 케이지에서 똑바로 설 수 있으나 시각적으로 기능적 결함을 나타냄,
(6) 점수 5: 래트가 30초 이내에 양측으로 돌아선 위치만을 원래대로 위치로 자세를 고칠 수 있고 케이지에서 똑바로 설 수 있으며 시각적으로 기능적 결함이 없음.
질병의 종말 점은 점수 0으로 고정: 그리고 래트를 도살함.
경사면 시험법: 운동 결함상의 특징
미끄럼 장치는 0° (수평) 내지 60° 각으로 기울 수 있는 30x50 cm 투명 안전유리 평면을 포함한다. 개개 래트들은 거꾸로 된 자세로 25° 각으로 기울어진 면에 초기에 위치시키고; 1분 간격의 2회 시도를 수행하였다. 30분 후에, 동일한 실험을 35° 각도의 경사 및 이후 40° 각도의 경사 면에서 수행하였다. 이 기간 동안 래트들을 케이지로 귀환시켰다. 경사면들은 개개 시도 후에 청소하였다.
래트들의 업무 수행을 하기 4개의 상이한 점수로 평가하였다:
(1) 점수(Score) 0: 안 미끌어짐,
(2) 점수 1: 약간 미끌어짐 (1개 또는 2개 발)
(3) 점수 2: 중등정도 미끌어 지나 (4개 발) 경사면의 말단까지는 안 미끌어짐.
(4) 점수 3: 경사면의 말단까지 래트들이 미끌어짐.
철망 시험법: 어려운 상황에서의 운동 능력의 특성
철망의 박스와 접촉시켜 상단(70° 각도) 및 하단에서의 테이블 끝에 설치하였다 (Thonhoff JR et al, 2007). 개개 래트들을 철망 바닥에 위치시키고 박스 상단에 새끼들을 위치시켜 기어 오르도록 동기화시켰다. 개개 래트들은 주 1회 훈련시켰다 (3 회 시도).
기록된 매개변수는 철망의 상단에 도달하는 잠복 시간이다.
개방지 시험법: 보행성 운동 활성의 특징
보행운동(locomotor) 활성을 바닥 상단 1 및 5cm에 2개의 축을 갖고 16개 광전지-광선을 갖는 투명 안전유리 박스(45x45x30 cm, Acti-Track by BIOSEB, Lyon, France)에서 측정하였다.
개개 래트의 즉흥적이고 탐구적인 활성을 3시간 동안 평가하였다.
4개의 매개변수들이 기록되었다(전체 이동 거리, 앞발들기 횟수, 이동거리 및 개방지 중심에서 소비된 시간 백분율).
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Claims (13)

  1. 포유동물 객체에 동시적, 개별적 또는 일련적인 투여를 위한, 바클로펜, 소르비톨 및 필로카핀, 메티마졸, 미페프리스톤, 날트렉손, 라파마이신, 플루비프로펜 및 케토프로펜으로부터 선택된 화합물, 이의 염, 이성체, 라세미체, 전구체를 함유하는 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    날트렉손, 바클로펜 및 D-소르비톨을 함유하는 조성물.
  3. 포유동물 객체에 동시적, 개별적 또는 일련적인 투여를 위한, (a) 라파마이신, (b) 미페프리스톤 또는 날트렉손, 및 (c) 필로카핀, 메티마졸 및 바클로펜으로부터 선택된 화합물을 함유하는 조성물.
  4. 포유동물 객체에 동시적, 개별적 또는 일련적인 투여를 위한, (a) 라파마이신, (b) 미페프리스톤, 및 (c) 필로카핀, 메티마졸 및 바클로펜으로부터 선택된 화합물을 함유하는 조성물.
  5. 제 3항에 있어서,
    라파마이신, 미페프리스톤 및 필로카핀을 함유하는 조성물.
  6. 제 3항에 있어서,
    라파마이신, 미페프리스톤 및 바클로펜을 함유하는 조성물.
  7. 제 3항에 있어서,
    라파마이신, 미페프리스톤 및 메티마졸을 함유하는 조성물.
  8. 제 3항에 있어서,
    라파마이신, 날트렉손 및 메티마졸을 함유하는 조성물.
  9. 전술한 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 추가적으로 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체를 함유하는 조성물.
  10. 전술한 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 CMT 또는 관련 장애를 치료하기 위한 용도인 조성물.
  11. CMT 또는 관련 장애를 치료하기 위한 약제 또는 치료 처방 제조를 위한 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 조성물의 용도.
  12. 제 11항에 있어서,
    상기 조성물은 CMT, 중독성 신경병증 또는 ALS를 치료하기 위한 것인 용도.
  13. 제 1 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 화합물은 경구투여, 비경구투여 또는 척추강내 투여를 위하여 약물 용출 중합체(drug eluting polymer), 생분자(biomolecule), 미셀(micelle) 또는 리포좀-형성 지질(liposome-forming lipids) 또는 수중 유 에멀젼제, 또는 PEG화 (pegylated) 또는 고체상 나노입자(nanoparticle) 또는 미세입자(microparticle) 형태로 제형화된 조성물 또는 용도.



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