PT2344539E - Tratamento da leucemia linfoblástica aguda pediátrica - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

"TRATAMENTO DA LEUCEMIA LINFOBLÁSTICA AGUDA PEDIÁTRICA" A invenção presente diz respeito a uma construção de anticorpo biespecifico de cadeia singela CD19xCD3 para utilização num método para o tratamento, a melhoria ou a eliminação da leucemia linfoblástica aguda pediátrica (ALL) num doente pediátrico com ALL que dele necessite.

Com o tratamento corrente de ALL em crianças, as taxas de sobrevivência isenta de acontecimentos são de cerca de 75 %. Portanto, a recaída ainda é frequente. Os problemas na gestão das recaídas da ALL são a resistência das células leucémicas e a tolerância diminuída dos doentes a uma segunda série de tratamento depois de já terem recebido uma terapia intensiva da linha da frente, resultando menor taxa de remissão bem como maior incidência de recaídas subsequentes e num resultado geral inferior. A poliquimioterapia intensificada é portanto correntemente essencial para a indução de uma segunda remissão completa. Dependendo de uma série de factores prognosticantes, a remissão pode ser mantida com quimioterapia e irradiação craniana apenas ou com intensificação do tratamento por transplantação de células estaminais (Henze G, von Stackelberg A, Relapsed acute lymphoblastic leukemia. Em:

Childhood Leukemias, C-H Pui, editor, Cambridge: Cambridge University Press; 2006, págs. 473-486).

Embora se tenha conseguido um progresso muito grande no tratamento de crianças com leucemia linfoblástica aguda (ALL) (veja-se por exemplo Mõricke et al., Blood 111 (2008), pág. 4477; Moghrabi et al., Blood 109 (2007), pág. 896), as recaidas de ALL são ainda a quarta doença maligna pediátrica mais comum (Gaynon, Cancer 82 (1998), pág. 1387) . Em particular para doentes com uma recaída que aparece na medula óssea adentro dos três primeiros anos após o diagnóstico, a terapia para estes doentes é não satisfatória e a transplantação de células estaminais alogénicas é a única via curativa até à data. Uma recaída quimiorrefractária após a transplantação de células estaminais hematopoiéticas (HSCT) está associada a um prognóstico desfavorável, embora as infusões de linfócitos de doadores após a transplantação (DLI) possa induzir remissões em poucos doentes através da indução de um efeito de Enxerto contra a Leucemia (GvL) (Loren et al., BMT 41 (2008), pág. 483) . Uma segunda HSCT pode ser uma opção e têm sido descritos alguns sobreviventes de longo prazo. No entanto, o estado da doença antes da HSCT tem valor previsional para o resultado após a transplantação e sabe-se que os doentes com doença morfológica ou teores em MRD persistentes >10~4 de blastos leucémicos apresentam um risco muito elevado de recaída com um resultado muito desfavorável (Bader et al., J. Clin. Oncol. 27 (2009), págs. 377-84). Nestas condições, o estado da doença antes da segunda HSCT tem a maior importância e devem fazer-se todos os esforços para conseguir outra remissão. Apesar da utilização de agentes quimioterapêuticos recentemente introduzidos contra a leucemia refractária (Jeha, Semin. Hematol. 46 (2009), 76-88), os doentes com recaída após HSCT apresentam amiúde uma doença refractária e estes doentes são muito susceptíveis a toxicidade relacionada com a quimioterapia. Para estes doentes são necessárias estratégias não quimioterapêuticas e menos tóxicas para induzir uma remissão nestes doentes.

Atentos os inconvenientes mencionados acima das terapias convencionais para a ALL pediátrica, ainda existe uma necessidade de um regime de tratamento melhorado. A invenção presente diz respeito a uma construção de um anticorpo de cadeia singela biespecífico CD19xCD3 para utilização num método de tratamento, melhoria ou eliminação da leucemia linfoblástica aguda (ALL) pediátrica num doente pediátrico com ALL que dela necessite. Esta via imunológica utilizando anticorpos que actuam envolvendo células T proporciona pela primeira vez um tratamento não quimioterapêutico e menos tóxico para doentes pediátricos com ALL.

Recentemente, demonstrou-se num estudo de fase I a actividade clinica significativa do anticorpo biespecífico de cadeia singela CD19xCD3 (blinatumomab) em recaídas de linfoma sem ser de Hodgkin de células B e positivo para CD19 (NHL), tendo sido observadas regressões impressionantes parciais e completas de tumores (Bargou et ai., Science 321 (2008): 974-7). Anderson et al. (Blood J. 80 (1992): 2826-34) descrevem um heteroconjugado biespecifico entre um anticorpo anti-CD19 e um anticorpo anti-CD3, que se afirma despoletar a lise de células de leucemia linfoblástica aguda.

Num ensaio clinico adicional, ainda em curso, um tratamento com o anticorpo biespecifico de cadeia singela CD19xCD3 mencionado resultou na eliminação de células de leucemia refractária em pacientes adultos não transplantados positivos para MRD sofrendo de ALL CD19+.

Verificou-se agora de uma forma surpreendente em duas utilizações motivadas por compaixão que o referido anticorpo biespecifico de cadeia singela CD19xCD3 é não apenas adequado para o tratamento de ALL em pacientes adultos não transplantados, mas também no de recaídas de ALL pediátrica (ou em crianças) refractária à terapia convencional para ALL, incluindo quimioterapia e transplantação de células geminais alogénicas hematopoiéticas (HSCT).

Neste caso, os inventores reportam acerca do poderoso efeito anti-leucémico do anticorpo biespecifico CD19xCD3 em duas crianças (doravante denominadas doente 1 e 2) com leucemia linfoblástica aguda de precursor B (ALL), que haviam tido uma recaída quimio-refractária após uma transplantação de células estaminais alogénicas hematopoiéticas (HSCT) provenientes de doadores emparelhados, não relacionados e haploidênticos.

Antes do tratamento com o anticorpo biespecífico de cadeia singela CD19xD3, o doente 1 foi previamente tratado com HSCT alogénica e múltiplas quimioterapias. No entanto, estas terapias convencionais de ALL pediátrica falharam de tal forma que o doente recaía repetidamente, apresentando em consequência um prognóstico extremamente desfavorável. Em quanto se segue, o doente pediátrico com ALL recebeu 15 micrograma/m2/24 h do anticorpo biespecífico de cadeia singela CD19xCD3 a título de uma infusão contínua durante cinco semanas. Durante o tratamento com anticorpo, o doente apresentou uma expansão de linfócitos T CD8+ derivados do doador sem quaisquer sinais de doença de enxerto contra o hospedeiro (GvHD). Esta expansão de células T estava associada a uma eliminação rápida dos blastos leucémicos do doente e 10 dias depois do início do tratamento com o anticorpo, não se conseguiam detectar nenhuns blastos na medula óssea do doente, para além do nível de detecção de doença mínima residual (MRD) de 1 célula em cada 10.000. O doente permaneceu negativo quanto a MRD ao longo de todo o tratamento com o anticorpo. O doente foi sujeito a uma segunda transplantação de células estaminais provenientes da sua mãe haploidêntica 2 semanas após o final do tratamento com o anticorpo biespecífico de cadeia singela CD19xCD3 e permaneceu negativo para o MRD a partir dessa altura (estado em Novembro de 2009). 0 doente 2 de quinze anos de idade foi diagnosticado como portador de cromossoma de Filadélfia com ALL com precursor B positiva para CD19 em Abril de 2001. Depois de uma quimioterapia, foi-lhe administrada uma HSCT a partir de um irmão com HLA idêntico em Outubro de 2001. Em 2002, uma recaída a nível da medula óssea foi diagnosticada e conseguiu-se mais uma remissão com matinib e quimioterapia. Recebeu então uma segunda HSCT de um doador não relacionado com HLA idêntico em Outubro de 2004. Em Março de 2008, foi-lhe diagnosticada uma segunda recaída e ele foi tratado com quimioterapia de pequena dose e Dasatinib devido a resistência a Imatinib. Depois de uma quimioterapia adicional com Clofarabina e Citosina/Arabinosido, conseguiu uma remissão molecular e recebeu uma terceira HSCT alogénica do seu pai haploidêntico com 3 de entre 6 alelos diferentes de HLA, com um tratamento com Dasatinib após o transplante. Devido a hemorragia gastrointestinal e cardiomiopatia dilatativa, parou-se o Dasatinib 5 meses depois da transplantação. Em Abril de 2009, foi-lhe diagnosticada uma recaída combinada no sistema nervoso central (SNC) com 7xl09 blastos/L no SNC e 3 % de blastos na medula óssea. Tratou-se então o doente com Nilotinib, quimioterapia intratecal e irradiação fraccionada do SNC com 18 Gy. Três meses depois deste tratamento, a medula óssea do doente continuava positiva para MRD a um nível de 1,1 x 1CT3 enquanto o SNC parecia isento de blastos. Uma análise do quimerismo no sangue periférico revelou uma hematopoiese completa derivada do doador, do seu pai haploidêntico.

Tratou-se então o doente com o agente singelo blinatumomab a 15 pg/m2/dia durante 4 semanas por infusão continua sem quaisquer efeitos colaterais. Uma aspiração de medula óssea no final do tratamento revelou uma remissão completa com uma MRD não detectável na medula óssea, inferior a <lxlCT4. Tal como o doente 1, o doente 2 não demonstrou quaisquer sinais de GvHD durante nem depois do tratamento com blinatumomab. Ele está hoje em dia bem e vai à escola.

Estes dados demonstram de um modo convincente que os anticorpos biespecificos comprometendo células T podem induzir um efeito forte de Enxerto contra Leucemia (GvL) na ausência de GvHD em doentes pediátricos com recaídas e ALL de precursor B refractária à terapia após uma HSCT alogénica. Portanto, prefere-se no tratamento de doentes pediátricos descrito neste documento que uma construção de um anticorpo biespecífico de cadeia singela CD19xCD3 induza um efeito de enxerto contra a leucemia (GvL). Além disto, o tratamento é bem tolerado pelos doentes pediátricos. Nestas condições, os métodos desta invenção proporcionam uma opção de tratamento surpreendentemente melhor para a leucémica linfoblástica aguda (ALL) pediátrica, em especial, para os casos nos quais a ALL pediátrica seja refractária em relação à terapia convencional para ALL, incluindo quimioterapia e/ou HSCT alogénica. Portanto, e em mais uma concretização da invenção presente, as construções que vão envolver células T, de anticorpos biespecificos de cadeia singela proporcionadas neste documento (anti CD19xCD3) também podem ser empregadas em doentes pediátricos que hajam sido submetidos a transplantação de células estaminais hematopoiéticas (alogénicas) (HSCT). Tal como se ilustra neste documento, mesmo os doentes pediátricos apresentando uma recaída da sua ALL após uma HSCT proveniente de um doador emparelhado não relacionado ou haploidêntico e/ou os doentes pediátricos que eram refractários à quimioterapia podem ser tratados com sucesso pelos métodos descritos neste documento. Os doentes exemplificados tais como os documentados neste documento denotavam uma resposta anti-leucémica impressionante à intervenção farmacêutica tal como se descreve neste documento e tornaram-se negativos para MRD na ausência de quaisquer sinais de GvHD (doença de enxerto contra hospedeiro). Embora a sobrevivência de crianças com ALL tenha melhorado notavelmente nas últimas décadas, as ALL que recaem são ainda a principal causa do falhanço de tratamentos. Para os doentes na 2a recaída, a HSCT alogénica é a única via curativa até à data. Uma das acções principais anti-leucémicas da HSCT é a indução de um efeito GvL. Infelizmente, a ocorrência de GvL está amiúde associada a GvHD, que é ainda uma das principais causas de morbidez e de mortalidade após a HSCT. Portanto, a indução de GvL na ausência de uma GvHD é um tópico de investigação intensiva. Uma via para a indução de um efeito GvL são as infusões de linfócitos de doadores após o transplante (DLI), que se utiliza preferivelmente para o tratamento de recaídas de ALL após uma HSCT. Embora a DLI seja muito eficaz no tratamento de CML (Kolb, Blood 76 (1990), 2462), ela é menos eficaz no tratamento após o transplante de recaídas de ALL (Loren, BMT 41 (2008), 483) e leva amiúde à ocorrência de GvHD.

Os métodos farmacêuticos e medicinais da invenção presente proporcionam uma nova via para a indução de GvL sem GvHD. Esta via é a activação in vivo de linfócitos derivados do doador após a HSCT, utilizando doses pequenas do anticorpo biespecífico de cadeia singela CD19xCD3 que compromete células T, dirigindo os linfócitos T contra os blastos CD19+ de ALL do doente. Este anticorpo denotou actividades anti-linfoma e anti-leucémica impressionante na situação autóloga, mas nunca foi testado em recaídas de ALL pediátrica após a HSCT. Os dois doentes pediátricos descritos nos exemplos denotaram recaída das suas ALL após uma HSCT proveniente de doadores emparelhados, não relacionados ou haploidênticos, e eram refractárias à quimioterapia. Os doentes mostraram uma resposta anti-leucémica impressionante depois do início do tratamento e tornaram-se negativos para MRD na ausência de quaisquer sinais de GvHD. A acção imunológica do anticorpo biespecífico de cadeia singela CD19xCD3 é independente da apresentação de antigénio peptídico, e esta é com a maior probabilidade a razão pela qual apesar da extensiva expansão in vivo de células T derivadas do doador, não foi induzida GvHD. Doses pequenas do anticorpo biespecífico de cadeia singela CD19xCD3 eram suficientes para eliminar os blastos de ALL nos doentes, até teores inferiores aos da detecção por MRD. Deste modo, o modo de comprometimento das células T pelo qual actua este anticorpo é muito diferente do dos anticorpos convencionais, que obrigam a doses muito maiores e que não conseguem comprometer as células T pela parte Fc da molécula do anticorpo devido à inexistência de receptores de Fc nas células T. Através do anticorpo biespecifico de cadeia singela CD19xCD3, as células T efectivadoras muito eficazes podem tornar-se citotóxicas em relação a blastos ALL sem a indução de uma resposta imunológica alorreactiva de que resulte GvHD. Os inventores decidiram levar a cabo uma segunda HSCT alogénica proveniente de um doador haploidêntico no doente 1 depois dele se tornar negativo para MRD. Até à data (Novembro de 2009), este doente continua a estar negativo para MRD. A partir da experiência clinica inicial nestes dois doentes com recaídas refractárias da ALL após transplante, concluiu-se que o anticorpo biespecifico de cadeia singela CD19xCD3 consegue induzir remissões completas impressionantes sem GvHD. Portanto, o tratamento com o anticorpo biespecifico de cadeia singela CD19xCD3 nas circunstâncias de antes do transplante para a diminuição imunológica da carga leucémica e para o tratamento de recaídas após o transplante constituem novas possibilidades terapêuticas para doentes pediátricos com ALL avançada. 0 método da invenção presente proporciona a seguintes vantagens principais: 1. Tal como se demonstra nos exemplos que se seguem, a administração do anticorpo biespecifico de cadeia singela CD19xCD3 pode ser utilizada para a terapia da leucemia linfoblástica aguda (ALL) pediátrica em recaída e/ou refractária. 0 anticorpo biespecifico de cadeia singela CD19xCD3 pode substituir as terapias convencionais para a leucémica linfoblástica aguda (ALL) pediátrica, (tais como a quimioterapia) em doentes pediátricos não elegíveis para transplantação de células estaminais alogénicas, mas não só. Ele também pode ser utilizado para transformar doentes pediátricos com ALL elegíveis para a referida transplantação até a um estado negativo para MRD. Este aspecto da invenção é importante porque os doentes negativos para MRD apresentam um menor risco de recaída depois da transplantação do que os doentes positivos para MRD. No cenário do melhor caso, a terapia pediátrica de ALL com o anticorpo biespecifico de cadeia singela CD19xCD3 torna supérfluas a quimioterapia e/ou a HSCT. 2. Sabe-se que os doentes pediátricos com doença morfológica ou teores MRD persistentes de >1CT4 blastos leucémicos apresentam um risco muito grande de recaída e têm perspectivas de resultados que são muito desfavoráveis (Bader et al.f J. Clin. Oncol. 27 (2009), págs. 377-84). As crianças tratadas com o anticorpo biespecífico de cadeia singela CD19xCD3 denotavam uma resposta anti-leucémica impressionante a seguir ao início do tratamento e tornavam-se negativas para MRD durante o tratamento, na ausência de quaisquer sinais de GvHD. Os métodos farmacêuticos da invenção proporcionam portanto uma via terapêutica para o tratamento, a melhoria ou a eliminação da MRD na ALL pediátrica, diminuindo deste modo ou mesmo abolindo o risco de uma recaída para o doente. O potencial curativo da HSCT alogénica depende do teor em MRD antes da transplantação. O tratamento com o anticorpo biespecífico de cadeia singela CD19xCD3 pode ser utilizado para transformar os mencionados doentes pediátricos de alto risco até um estado negativo para MRD. Deste modo, o MRD na ALL refractária de crianças pode ser tratado pelo anticorpo biespecífico de cadeia singela CD19xCD3 logo à primeira vez. 3. Os métodos farmacêuticos da invenção mostram não apenas um poderoso efeito anti-leucémico como também são menos tóxicos e provocam menos efeitos adversos do que a terapia pediátrica convencional para ALL, incluindo a quimioterapia e/ou a HSCT alogénica. Até à data ainda não foram observados quaisquer efeitos colaterais a longo termo após um tratamento com o anticorpo biespecifico de cadeia singela CD19xCD3. Em contraste, as terapias pediátricas convencionais para ALL são muito agressivas e estão portanto associadas a riscos de saúde consideráveis para os doentes pediátricos. Além disto, têm sido reportados efeitos ulteriores após as terapias convencionais para ALL nas crianças (veja-se por exemplo Hudson MM, Late complications after leukemia therapy. Em: Childhood Leukemias, C-H Pui editor, Cambridge: Cambridge University Press; 2006, págs. 750-773; Schmoll, Hoffken, Possinger: Kompendium Internistische Onkologie, S. 2660 ff.; 4. Auflage, Springer Medizin Verlag Heidelberga; http ://www. cancer . gov/cancertopics/pdg/treatment /lateeffects/HealthProfessional) . De facto, os tratamentos pediátricos convencionais para ALL utilizam regimes de tratamento ainda mais agressivos do que os utilizados nas vias terapêuticas dos regimes de tratamento para ALL em adultos. No entanto, tal como é evidente a partir da taxa de recaídas de cerca de 25 % na ALL pediátrica, nem mesmo estas terapias agressivas são suficientes para uma cura final dos doentes com ALL. Nestas condições, é ainda mais surpreendente que o tratamento de ALL refractária e/ou de recaídas de ALL em doentes pediátricos com o anticorpo biespecífico de cadeia singela CD19xCD3 seja capaz de tornar os referidos doentes em negativos para MRD, proporcionando novas hipóteses terapêuticas para estes doentes de alto risco. Este é um resultado que não poderia ter sido conseguido com a terapia convencional para ALL pediátrico, tal como com quimioterapia e/ou HSCT. 4. Por exemplo, os doentes pediátricos com ALL Ph+ (bcr/abl) têm um risco muito elevado de recaída, de entre todos os subtipos de ALL (veja-se adiante). Embora uma HSCT alogénica seja hoje em dia considerada como o tratamento a escolher na ALL Ph+ pediátrica, cerca de um terço dos doentes transplantados recai. Além disto, tal como se descreve em mais pormenor adiante, os recém-nascidos (<12 meses) com ALL apresentam um risco maior de falhanço do tratamento convencional ou padrão para a ALL, sendo o prognóstico mais desfavorável o dos que apresentam transposições genéticas MLL (t(4;ll)). Os resultados que se mostram para o doente 2 nos exemplos que se seguem e os dados obtidos no ensaio clínico mencionado acima e que está a decorrer, de tratamento de doentes adultos (não-transplantados) com ALL, sugerem que mesmo a ALL Ph+ ALL (bcr/abl) e a ALL com transposições genéticas MLL podem ser tratadas com sucesso por administração do anticorpo biespecifico de cadeia singela CD19xCD3. A administração do anticorpo biespecifico de cadeia singela CD19xCD3 proporciona portanto uma nova via terapêutica para doentes pediátricos com ALL Ph+ ou com ALL e transposições genéticas t(4;ll), em particular para doentes pediátricos com ALL com doença residual minima (MRD) . Isto significa doença residual minima (MRD) definida por exemplo por PCR ou análise FACS. 5. Devido à sua actividade citotóxica muito elevada, apenas doses muito pequenas do anticorpo biespecifico de cadeia singela CD19xCD3 são suficientes para o tratamento bem-sucedido da ALL pediátrica, o que permite a eliminação de células de leucemia mesmo na medula óssea. 6. 0 tratamento com o anticorpo biespecifico de cadeia singela CD19xCD3 tem uma duração inferior quando se compara coma terapia convencional da ALL. A terapia convencional da ALL pediátrica por quimioterapia leva em geral 2 a 3 anos, enquanto se observa uma resposta muito rápida dos doentes pediátricos ao anticorpo biespecifico de cadeia singela CD19xCD3, tal como consta dos exemplos que se seguem. Além disto, a resposta é de longa duração: 0 doente 1 permaneceu negativo quanto a MRD mais do que 12 meses depois da transplantação; vejam-se os exemplos seguintes. 7. Os doentes pediátricos com ALL com recaídas apresentam amiúde doença quimio-refractária e estes doentes são muito susceptíveis a toxicidade relacionada com a quimioterapia, um tratamento com o anticorpo biespecífico de cadeia singela CD19xCD3 proporciona pela primeira vez uma estratégia não quimioterapêutica e menos tóxica para induzir remissões nesses doentes.

8. Tal como se demonstra no ensaio clínico em curso que se mencionou acima relativo a ALL em doentes adultos, o tratamento com o anticorpo biespecífico de cadeia singela CD19xCD3 resultou na eliminação das células leucémicas quimio-refractárias em doentes adultos não transplantados positivos para MRD, com ALL CD19+. Enquanto nestes doentes as células T citotóxicas em acção eram derivadas do doente, não existiam dados anteriores acerca da utilização do anticorpo biespecífico de cadeia singela CD19xCD3 após uma HSCT alogénica num quadro envolvendo a mobilização de células T derivadas do doador. Neste trabalho, os inventores reportam pela primeira vez a poderosa indução de um efeito GvL na ausência de GvHD, induzido pelo anticorpo biespecifico de cadeia singela CD19xCD3 mobilizando células T derivadas do doador em dois doentes pediátricos com recaídas quimio-refractárias de ALL CD19+ após uma HSCT alogénica.

Em suma, o tratamento com o anticorpo biespecifico de cadeia singela CD19xCD3 proporciona uma terapia nova e melhor da ALL pediátrica, em especial para ALL pediátrica refractária e/ou com recaídas.

Numa concretização preferida dos métodos farmacêuticos da invenção, a leucemia linfoblástica aguda pediátrica ou da infância (ALL) é ALL pediátrica da linhagem B, preferivelmente leucemia linfoblástica aguda pediátrica de precursor B ALL, mais preferivelmente pró-B ALL pediátrica, pré-B ALL, ou ALL comum (cALL). Ainda mais preferível a ALL pediátrica de precursor B é ALL comum (CALL). A grande maioria dos casos de ALL pediátricos ou na infância (>85 %) são do fenótipo celular de precursor B (Schultz et al., Blood 109 (2007): 926-935). Uma vez que o anticorpo biespecifico de cadeia singela CD19xCD3 descrito neste documento está dirigido contra o marcador CD19 associado a células B, o anticorpo referido é especialmente adequado a título de agente terapêutico para a leucemia linfoblástica aguda pediátrica de linhagem B, mais preferivelmente para ALL pediátrica de precursor B. Pode classificar-se ainda a ALL pediátrica de precursor B em pró-B ALL pediátrica, pré-B ALL pediátrica e ALL comum (cALL) (veja-se por exemplo Behm F.G., Immunophenotyping. Em: Childhood Leukemias, C-H Pui editor, Cambridge:

Cambridge University Press; 2006, págs. 150-209) . A leucemia linfoblástica aguda pediátrica (ALL), incluindo a leucemia linfoblástica aguda pediátrica de precursor B e outros tipos de ALL pediátrica com linhagem B (célula) , e os tratamentos para ela estão revistos em Pui CH, Clin. Adv. Hematol. Oncol. 4 (2006): 884-6; Pui CH, Evans WE, N.

Engl. J. Med. 354 (2006) : 166-178; Pui CH et al.r Lancet 371 (2008) : 1030-1043; Pui CH, Jeha S, Nat. Ver. Drug

Discov. 6 (2007): 149-165). Pode também encontrar-se mais informação acerca de ALL pediátrica, por exemplo em http://www.cancer.gov ou em http ://www. leukemia- lymphoma . org.

De um ponto de vista histórico, o Pediatric Oncology Group (POG) e o Children 's Cancer Group (CCG) adoptaram um conjunto comum de critérios de risco numa conferência internacional suportada pelo National Cancer Institute (Smith M, et al., J. Clin. Oncol. 14 (1996), 18-24), em 1993. Os critérios do NCI eram baseados em factores que tinham aceitação internacional e reprodutibilidade: idade, contagens iniciais de células brancas do sangue (WBC), e a presença de doença extramedular na altura do diagnóstico. Para refinar ainda mais a terapia, tanto o POG como o CCG utilizaram também factores de risco adicionais que haviam denotado ter um impacto nas perspectivas do doente (por exemplo ploidia, cariotipo dos blastos, e resposta morfológica precoce) . Em 2000, o CCG e o POG juntaram-se para formar o Children's Oncology Group (COG). Esta união permitiu a análise de dados clínicos, biológicos, e de respostas precoces para a previsão de sobrevivência isenta de eventos (EFS) na leucemia linfoblástica aguda (ALL), o desenvolvimento de um novo sistema de classificação e um algoritmo para o tratamento. De entre 11.779 crianças (com idades de entre 1 e 21,99 anos) com diagnósticos novos de ALL com precursor B que em seguida deram entrada no CCG (Dezembro de 1988 a Agosto de 1995, n = 4.986) e no POG (Janeiro de 1986 a Novembro de 1999, n = 6.793), o estudo analisou retrospectivamente 6.238 doentes (do CCG 1.182; do POG, 5.056) com dados citogenéticos informativos (Schultz et al., Blood 109 (2007): 926-935). Definiram-se quatro grupos de risco como sendo o de risco muito elevado (VHR; com EFS de 5 anos de 45 % ou menos) , de risco inferior (com EFS de 5 anos de pelo menos 85 %) , padrão e de risco elevado (aqueles que sobravam nos grupos de risco respectivos do National Cancer Institute [NCI]). Os critérios para VHR incluíam hipodiploidia extrema (menos do que 44 cromossomas), t(9;22) e/ou BCR/ABL, e falha na indução. Os doentes de pequeno risco eram os do grupo de risco padrão do NCI que apresentavam quer t(12;21) (TEL/AML1), quer trissomias simultâneas dos cromossomas 4, 10, e 17. Mesmo com diferenças de tratamento, existia uma concordância elevada entre as análises do CCG e do POG. 0 esquema de classificação do risco do COG está a ser utilizado para dividir a ALL de precursor B em grupos de risco inferior (27 %) , padrão (32 %) , elevado (37 %) , e muito elevado (4 %) , com base na idade, contagem de células brancas do sangue (WBC), citogenética, resposta da medula no dia 14, e doença minima residual (MRD) no fim da indução por cirtometria de fluxo em ensaios do COG.

Correntemente, a atribuição de tratamento baseada no risco é utilizada para a leucemia linfoblástica aguda pediátrica ou de crianças (ALL). Esta metodologia permite atribuir uma terapia modesta às crianças que têm um historial de bons resultados, evitando-lhes tratamentos mais intensivos e tóxicos, enquanto permite que as crianças com uma probabilidade menor de sobrevivência a longo termo no seu historial sejam tratadas com terapia mais intensiva que pode aumentar as suas probabilidades de cura. Verificou-se que as crianças mais velhas e os adolescentes (>10 anos) e os recém nascidos (<12 meses) apresentam prognósticos menos favoráveis do que as crianças com entre 1 e 9, na altura do diagnóstico, e são em geral empregues tratamentos mais agressivos para estes doentes (Nachman J, Br. J. Haematol. 130 (2005): 166-73). O tratamento com o anticorpo biespecifico de cadeia singela CD19xCD3 proporciona agora uma terapia melhor, menos tóxica, para estas populações de doentes pediátricos, isto é, crianças mais velhas e adolescentes (>10 anos) e recém-nascidos (<12 meses), com resultados menos favoráveis na terapia convencional de ALL, tal como quimioterapia e/ou HSCT. 0 tratamento bem-sucedido de crianças com ALL obriga ao controlo da doença sistémica (por exemplo na medula, no fígado e no baço, nos nodos linfáticos) bem como a prevenção ou o da doença extramedular, em especial no sistema nervoso central (SNC) Só 3 % dos doentes apresentam envolvimento detectável do SNC pelos critérios convencionais, no diagnóstico (>5 WBC/microlitro de células linfoblásticas presentes). A não ser quando uma terapia específica seja dirigida ao SNC, no entanto, 50 % a 70 % ou mais das crianças desenvolverão eventualmente uma leucemia declarada no SNC. É portanto recomendado hoje em dia que todas as crianças com ALL recebam terapia de combinação sistémica em conjunto com alguma forma de profilaxia para o SNC. Hoje em dia, a maior parte dos locais trata os doentes com leucemia diagnosticada no SNC (>5 WBC/pL com blastos; SNC3) , e aqueles com fenótipo de células T e contagem WBC elevada aquando do diagnóstico, por terapia intratecal e irradiação craniana subsequente. Deste modo, um tratamento com o anticorpo biespecífico com cadeia singela CD19xCD3 é levado a cabo preferivelmente em combinação com a profilaxia para o SNC, tal como terapia intratecal e/ou irradiação craniana. O tratamento convencional ou padrão para crianças com ALL divide-se em estádios: terapia de indução da remissão, de consolidação ou de intensificação, e de manutenção (ou de continuação), sendo em geral proporcionada em cada estádio uma terapia de santuário do SNC. É utilizada para todos os doentes uma fase de intensificação da terapia após a indução da remissão. A intensidade tanto da terapia de indução como das terapias após a indução é determinada pelos factores clínicos e biológicos de prognóstico, utilizados para um tratamento com base na avaliação do risco e de alguns tipos de resposta inicial. Esta avaliação pode incluir a percentagem de blastos na medula no dia 7 e/ou no dia 14, uma contagem de blastos no sangue periférico no dia 8, e determinações da doença mínima residual na medula óssea e/ou no sangue periférico durante ou no final da indução (Pui CH, Evans WE, N. Engl. J. Med. 354 (2006) : 166-78) . A duração da terapia para crianças com ALL varia entre 2 e 3 anos. Em contraste, é possível observar uma resposta muito rápida ao tratamento com anticorpo biespecífico com cadeia singela CD19xCD3 nos doentes pediátricos, tal como se ilustra nos exemplos que se seguem. Além disto, o doente 1 continuou negativo para MRD até à data (Novembro 2009), indicando que era possível conseguir-se uma cura a longo termo.

Os subgrupos de doentes com prognóstico desfavorável com a terapia corrente convencional ou padrão podem necessitar de um tratamento diferente. Por exemplo, os recém-nascidos com ALL apresentam um risco mais elevado de falhanço do tratamento, sendo o prognóstico mais desfavorável nos que apresentam transposições genéticas MLL (Rubnitz JE, et al.: Blood 84 (1994): 570-3; Biondi A, et al., Blood 96 (2000) : 24-33; Pui CH, et al., Lancet 359 (2002) : 1909-15; Silverman LB, et al. , Cancer 80 (1997) : 2285-95) . Estas crianças são tratadas em geral usando regímenes concebidos especificamente para recém-nascidos (Silverman, et al., (1997), loc. cit., Chessells JM, et al., J. Haematol. 117 (2002) : 306-14; Reaman GH, et al., J. Clin. Oncol. 17 (1999): 445-55; Pieters R, et al., Lancet 370 (2007) : 240-50) . Os regímenes correntes para recém- nascidos empregam vias de tratamento intensificado e podem proporcionar um melhor controlo da doença em comparação com as metodologias anteriores menos intensivas, mas o resultado a longo termo e a toxicidade não são conhecidos (Reaman (1999), loc. cit.; Pieters (2007), loc. cit.; Kosaka Y, et al., Blood 104 (2004) : 3527-34; Hilden JM, et al., Blood 108 (2006) : 441-51) . Algumas crianças (com mais do que 1 ano) com ALL podem apresentar uma probabilidade de remissão a longo termo inferior a 50 % com a terapia corrente (por exemplo t [ 9;22] ALL positiva de cromossoma Filadélfia, doentes hipodiplóides, e os com falha da indução inicial). Para estes doentes, uma transplantação de medula óssea alogénica de um irmão com antigénios (HLA) de leucócitos humanos emparelhados é considerada durante a primeira remissão (Snyder DS, et al., Leukemia 13 (1999): 2053-8; Aricò M, et al., N. Engl. J. Med. 342 (2000) : 9 98 — 1006; Schrauder A, et al., J. Clin. Oncol. 24 (2006) : 5742-9) . Um transplante de um irmão com HLA emparelhado, no entanto, não provou ser um benefício para doentes definidos como sendo de risco elevado apenas através da sua contagem WBC, do seu género, e da sua idade (Ribera JM, et al., J. Clin. Oncol. 25 (2007): 16-24).

Uma vez que a mielossupressão e a imunossupressão generalizada são uma consequência antecipada tanto da leucemia como do seu tratamento com quimioterapia, os doentes têm que ser vigiados de perto durante os tratamentos convencionais da ALL pediátrica. Têm que estar imediatamente disponíveis instalações adequadas, tanto para o suporte hematológico como para o tratamento de complicações, tanto infecciosas como outras, ao longo de todas as fases do tratamento da leucemia. Cerca de 1 % dos doentes morrem durante a terapia de indução e mais entre 1 % e 3 % morrem durante a primeira remissão, de complicações relacionadas com o tratamento (Christensen MS, et al., Br. J. Haematol. 131 (2005) : 50-8) . O tratamento com o anticorpo biespecífico de cadeia singela CD19xCD3 proporciona uma terapia alternativa e menos tóxica da ALL pediátrica, em especial para ALL refractária e/ou recaídas de ALL pediátrica. O tratamento referido evita os inconvenientes das terapias convencionais de ALL em crianças, tais como falhanços do tratamento, toxicidade e efeitos adversos a longo termo. É portanto uma alternativa muito eficiente mas menos tóxica e com menor risco para a saúde, em relação à quimioterapia e/ou à HSCT alogénica.

Portanto, noutra concretização dos métodos farmacêuticos da invenção, a referida leucemia linfoblástica aguda (ALL) é ALL refractária e/ou uma recaída de ALL. A ALL pediátrica pode ser refractária à quimioterapia ou à transplantação de células estaminais alogénicas hematopoiéticas (HSCT) ou à quimioterapia e à transplantação de células estaminais alogénicas hematopoiét icas (HSCT) . A ALL pode ser uma recaída de ALL ou uma recaída de ALL refractária à terapia convencional de ALL, incluindo quimioterapia e/ou transplantação de células geminais hematopoiéticas (HSCT). No entanto, também se encontra no âmbito da invenção que a ALL seja uma ALL diagnosticada de novo. Nestas condições, o tratamento com o anticorpo biespecífico de cadeia singela CD19xCD3 pode ser utilizado como primeira terapia (da linha da frente), quer por si só, quer em combinação com HSCT. 0 termo "ALL refractária pediátrica", tal como se utiliza neste documento, significa resistência da ALL pediátrica a terapia convencional ou padrão da ALL, tal como quimioterapia e/ou HSCT. Hoje em dia, a taxa de recaída na ALL pediátrica é de cerca de 25 %. Por outras palavras: A terapia convencional ou padrão da ALL não é capaz em última análise de curar todos os doentes pediátricos. 0 termo "recaída de ALL pediátrica", tal como se utiliza neste documento, denota terem voltado os sinais e os sintomas da doença ALL depois de um doente pediátrico ter conseguido uma remissão. Por exemplo, a seguir a um tratamento convencional de ALL utilizando quimioterapia e/ou HSCT, um doente com ALL pode entrar em remissão sem nenhum sinal ou sintoma de ALL, permanece em remissão durante um par de anos, mas depois sofre uma recaída e tem que ser mais uma vez tratado da ALL.

Os doentes pediátricos com recaídas de ALL têm amiúde uma doença refractária. Estes doentes são muito susceptíveis a toxicidade relacionada com a quimioterapia, que pode ser evitada por tratamento com o anticorpo biespecífico de cadeia singela CD19xCD3. 0 termo "terapia padrão" ou "terapia convencional", tal como se utiliza neste documento, refere-se a uma terapia da ALL pediátrica com recurso a quimioterapia e/ou a HSCT. A leucemia linfoblástica aguda pediátrica (ALL), incluindo a leucemia linfoblástica aguda pediátrica de precursor B e outros tipos de ALL pediátrica com linhagem de células B, e os seus tratamentos, foram revistas em, por exemplo, Pui CH, Clin. Adv. Hematol. Oncol. 4 (2006): 884-6; Pui CH, Evans WE, N. Engl. J. Med. 354 (2006) : 166-178; Pui CH et al., Lancet 371 (2008) : 1030-1043; Pui CH, Jeha S, Nat. Ver. Drug Discov. 6 (2007) : 149-165); Henze G, von Stackelberg A, Relapsed acute lymphoblastic leukemia. Em: Childhood Leukemias, C-H Pui editor Cambridge: Cambridge University Press; 2006, págs. 473-486). Também se pode encontrar mais informação acerca da ALL pediátrica por exemplo em http://www.cancer.gov ou em http ://www. leukemia-lymphoma.org. 0 termo "anticorpo biespecifico de cadeia singela" ou "anticorpo de cadeia singela e biespecifico", ou termos relacionados com estes de acordo com a invenção presente, significam construções de anticorpos resultando de se juntarem pelo menos duas regiões variáveis de anticorpos numa única cadeia polipeptidica isenta das porções constante e/ou Fc presentes na imunoglobulina inteira. 0 anticorpo biespecifico de cadeia singela tal como se refere neste documento é funcional, isto é, citotoxicamente activo, como um monómero, e portanto é claramente distinguível dos diacorpos ou dos tandabs descritos na técnica e que apenas são funcionais como dímeros ou multímeros. Um "agente de ligação", tal como se utiliza neste documento, liga o domínios V com a mesma especificidade, enquanto um "agente espaçador", tal como se utiliza neste documento, liga os domínios V com especificidades diferentes. Por exemplo, um anticorpo biespecifico de cadeia singela pode ser uma construção com no total duas regiões variáveis de anticorpo, por exemplo duas regiões VH, cada uma delas capaz de se ligar especificamente a um antigénio separado, e ligadas uma à outra através de um agente de ligação curto (em geral menos do que 10 aminoácidos), que é um polipéptido sintético, de tal modo que as duas regiões variáveis de anticorpo com o seu espaçador interposto existirem como uma cadeia polipeptidica singela e contígua. Outro exemplo de um anticorpo biespecífico de cadeia singela pode ser uma cadeia polipeptídica singela com três regiões variáveis de anticorpo. Neste caso, duas regiões variáveis de anticorpo, por exemplo uma VH e uma VL, podem constituir uma scFv, em que as duas regiões variáveis do anticorpo estejam ligadas uma à outra através de um agente de ligação polipeptídico sintético, sendo este último em geral obtido por engenharia genética de modo a ser minimamente imunogénico enquanto se mantém com resistência máxima à proteólise. Esta scFv é capaz de se ligar especificamente a um antigénio específico, e está ligada a mais uma região variável de anticorpo, por exemplo uma região VH, capaz de se ligar a um antigénio diferente daquele a que se liga a scFv. Ainda mais outro exemplo de um anticorpo biespecífico de cadeia singela pode ser uma cadeia polipeptídica singela com quatro regiões variáveis de anticorpo. Neste caso, as duas primeiras regiões variáveis de anticorpo, por exemplo uma região VH e uma região VL, podem formar uma scFv capaz de se ligar a um antigénio, enquanto a segunda região VH e a segunda região VL podem formar uma segunda scFv capaz de se ligar a outro antigénio. Numa única cadeia polipeptídica contígua, podem estar vantajosamente separadas regiões variáveis individuais de anticorpo com uma especificidade, por um agente de ligação polipeptídico tal como se descreveu acima, podendo as respectivas scFv estar vantajosamente separadas por uma cadeia polipeptídica curta de um espaçador, tal como se descreveu acima. Encontram-se exemplos não limitativos de anticorpos de cadeia singela biespecí f icos, bem como métodos para os produzir, em WO 99/54.440, WO 2004/106.381, WO 2007/068.354, Mack, J. Immunol. (1997), 158, 3965-70; Mack, PNAS, (1995), 92, 7021-5; Kufer, Cancer Immunol. Immunother., (1997), 45, 193-7; Loftier, Blood, (2000), 95(6) 2098-103; Briihl, J.

Immunol., (2001), 166, 2420-2426.

Tal como se utiliza neste documento, "CD3" denota um antigénio que está expresso nas células T, preferivelmente células T humanas, fazendo parte do complexo receptor multimolecular das células T, sendo o CD3 constituído por cinco cadeias diferentes: CD3-épsilon, CD3-gama, CD3-delta, CD3-eta e CD3 zeta. Quando se amontoa o CD3 nas células T, por exemplo devido a anticorpos anti-CD3, gera-se uma activação das células T semelhante à ligação a um antigénio mas independente da especificidade clonal do subconjunto de células T. Deste modo, o termo "anticorpo biespecífico de cadeia singela CD19xCD3", tal como se utiliza neste documento, diz respeito a uma construção específica para CD3, capaz de se ligar ao complexo CD3 humano expresso nas células T humanas e capaz de induzir a eliminação/lise de células alvo, em que as referidas células alvo transportam/apresentam um antigénio que está ligado à outra parte, que não se liga a CD3 do anticorpo biespecífico de cadeia singela. A ligação ao complexo CD3 por agentes de ligação específicos para CD3 (por exemplo um anticorpo biespecífico de cadeia singela tal como é administrado consoante os métodos farmacêuticos da invenção) leva à activação das células T tal como se sabe na técnica; veja-se, por exemplo, WO 99/54.440 ou WO 2007/068.354. Deste modo, uma construção apropriada para os métodos farmacêuticos da invenção é vantajosamente capaz de eliminar/lisar células alvo in vivo e/ou in vitro. As células alvo correspondentes incluem células que expressam um antigénio tumoral, tal como CD19, que é reconhecido pela segunda especificidade (isto é, pela porção que não se liga a CD3 do anticorpo biespecifico de cadeia singela) da construção mencionada. Preferivelmente, a referida segunda especificidade é para CD19 humano que já foi descrito em WO 99/54.440, WO 2004/106.381 ou em WO 2007/068.354. De acordo com esta concretização, cada porção especifica para um antigénio, do anticorpo biespecifico de cadeia singela, inclui uma região de anticorpo VH e uma região de anticorpo VL. Uma variante vantajosa deste anticorpo biespecifico de cadeia singela é, do terminal N para o terminal C: VL (CD19)-VH (CD19)-VH (CD3)-VL(CD3) .

No significado da invenção, o termo "ligando-se especificamente" ou os termos relacionados tais como "especificidade" devem ser entendidos como sendo caracterizados sobretudo por dois parâmetros: um parâmetro qualitativo (o epitopo de ligação, ou ao qual um anticorpo se liga) e um parâmetro quantitativo (a afinidade de ligação, ou a intensidade com a qual este anticorpo se liga aonde se liga). Pode determinar-se vantajosamente qual o epitopo ao qual um anticorpo se liga recorrendo, por exemplo, a metodologia FACS, ELISA, mapeamento de epítopos por manchas de péptidos, ou espectroscopia de massa. A força com que o anticorpo se liga a um epítopo bem determinado pode ser vantajosamente determinada por exemplo recorrendo às metodologias Biacore e/ou ELISA bem conhecidas. Uma combinação destas técnicas permite calcular uma relação sinal:ruído como medida representativa da especificidade da ligação, o sinal representa a força da ligação do anticorpo ao epítopo de interesse, enquanto o ruído representa a força da ligação do anticorpo a outros epítopos não relacionados, diferentes do epítopo de interesse. Uma relação sinal:ruído de por exemplo pelo menos 50, mas preferivelmente de cerca de 80, para o respectivo epítopo de interesse e tal como determinada por exemplo por Biacore, ELISA ou FACS, pode ser tomada como ma indicação de que o anticorpo avaliado se liga ao epítopo de interesse de um modo específico, isto é, que se trata de um "ligante específico". O termo "ligar-se a/interactuar com" também pode dizer respeito a um epítopo conformacional, a um epítopo estrutural ou a um epítopo descontínuo constituído por duas ou mesmo mais regiões das moléculas alvo humanas ou de suas partes. Define-se um epítopo conformacional como duas ou mais sequências discretas de aminoácidos separadas na sequência primária, que se aproximam na superfície da molécula quando o polipéptido se dobra à proteína nativa (Sela, (1969) Science 166, 1365 e Laver, (1990) Cell 61, 553-6) . O termo "epítopo descontínuo" significa epítopos não lineares que são montados a partir de resíduos provenientes de regiões distantes da cadeia polipeptidica. Estes resíduos aproximam-se à superfície da molécula quando a cadeia polipeptidica se dobra a uma estrutura tridimensional, para constituir um epítopo conformacional/estrutural. 0 termo "tratamento", tal como se utiliza neste documento, significa no seu sentido mais lato procedimentos ou aplicações medicinais que se destinam a aliviar uma doença. No caso presente, a administração do Anticorpo biespecífico de cadeia singela CD19xCD3 (preparado para administração a um doente pediátrico com ALL), tal coo se descreve neste documento, destina-se ao tratamento, melhoria ou eliminação da doença ALL pediátrica. 0 termo "melhoria", tal como se utiliza neste documento, é sinónimo de melhora. Quando o estado de um doente pediátrico com ALL denota melhoria, o doente está claramente melhor - existe alguma melhora do seu estado clínico. Por exemplo, pode ser uma melhoria do estado do doente com ALL, quando se conseguir uma estabilização da doença ALL, isto é quando a doença ALL já não manifestar progressão. Este estádio de doença também é denominado doença estável. Uma melhoria também pode ser atingir um melhor estado MRD por parte do doente pediátrico com ALL. Por exemplo, antes do tratamento com o anticorpo biespecífico de cadeia singela CD19xCD3, podem ser detectáveis 100 células de leucemia em cada 104 células de medula óssea para o doente pediátrico com ALL. Devido ao tratamento com o anticorpo biespecífico de cadeia singela CD19xCD3, o número de células leucémicas pode ser diminuído para 10 células leucémicas ou mesmo menos células leucémicas (por exemplo menos do que uma célula leucémica) em cada 104 células de medula óssea neste exemplo de caso. O termo "eliminação", tal coo se utiliza neste documento, significa a remoção das células leucémicas do corpo de um doente pediátrico com ALL. Tal como se mostra no exemplo que se segue, a administração do anticorpo biespecífico de cadeia singela CD19xCD3 é capaz de transformar a leucemia linfoblástica aguda positiva para MRD (ALL) a um estado negativo para MRD, isto é um estado em que não existe MRD detectável (<1CT4, isto é menos do que 1 célula de leucemia detectável por 104 células de medula óssea). Neste caso, atingiu-se uma remissão molecular completa. O termo "administração", tal como se utiliza neste documento, significa a administração de uma dose eficaz do ponto de vista terapêutico do anticorpo biespecífico de cadeia singela CD19xCD3 mencionado acima (preferivelmente o que corresponde à SEQ ID NO.l) a um indivíduo, isto é, a um doente humano pediátrico. Uma "quantidade eficaz do ponto de vista terapêutico" significa uma dose que produza os efeitos para os quais é administrada, isto é, suficiente para matar as células de leucemia linfoblástica aguda. Preferivelmente, a dose administrada do anticorpo biespecífico de cadeia singela CD19xCD3 leva à eliminação de todas as células de leucemia linfoblástica aguda do corpo do doente pediátrico, resultando num estado de ALL negativa para MRD, tal como se define neste documento. A dose exacta dependerá do objectivo do tratamento, e poderá ser identificada por um indivíduo com conhecimentos da técnica utilizando metodologias conhecidas. 0 médico assistente e os factores clínicos determinaram o regime de dosagem. Tal como se sabe nas técnicas medicinais, as dosagens para um determinado doente pediátrico dependem de muitos factores, incluindo a dimensão do doente pediátrico, a área superficial do seu corpo, a sua idade, a sua massa corporal, o composto específico que se encara administrar, o seu género, a altura e a via de administração, o seu estado geral de saúde, e dos outros fármacos que estejam a ser-lhe administrados durante o mesmo período.

Uma dose típica pode ser, por exemplo, adentro das gamas descritas nas concretizações dos métodos da invenção e dos exemplos anexos; no entanto, doses mais pequenas ou maiores em relação a esta gama exemplificativa são também encaradas, em particular atentos os factores mencionados acima. 0 termo "infusão contínua" refere-se a uma infusão que se deixa prosseguir permanentemente ao longo de um período de tempo, isto é, sem interrupção. "Infusão continua" refere-se à infusão administrada em permanência. Portanto, no contexto da invenção, os termos "permanente" e "contínuo" são utilizados como sinónimos. Adentro do significado atribuído na invenção, por exemplo o termo "administrado por infusão contínua durante (pelo menos) 4 semanas" ou outros semelhantes, denotam uma situação na qual o anticorpo biespecífico de cadeia singela CD19xCD3 utilizado nos métodos farmacêuticos consoante a invenção é administrado continuamente ao corpo de um doente pediátrico ao longo de um período de (pelo menos) 4 semanas de uma forma prolongada, constante, ao longo da totalidade do período de tempo necessário segundo os meios farmacêuticos e os métodos da invenção. Os esquemas para administração contínua do anticorpo biespecífico de cadeia singela CD19xCD3 são descritos em mais pormenor no WO 2007/068.354. Não ocorre durante o período total de tempo que dura a administração de acordo com os métodos farmacêuticos da invenção, nenhuma interrupção da introdução do anticorpo biespecífico de cadeia singela CD19xCD3, não ocorrendo nenhuma transição entre um estado no qual este anticorpo está a ser administrado ao corpo do doente pediátrico, e um estado no qual este anticorpo já não está a ser administrado ao corpo do doente pediátrico, ou não ocorre significativamente, devido a razões que não sejam a de voltar a encher o sistema de infusão com o anticorpo biespecífico de cadeia singela CD19xCD3 que se está a administrar, ou intervenções medicinais que se tornem necessárias, e outras semelhantes. Tanto quanto o referido enchimento significa uma interrupção temporária da introdução do anticorpo administrado, esta administração deve ainda ser considerada como "não interrompida" ou "permanente", no sentido dós métodos farmacêuticos consoante a invenção. Na maior parte dos casos, uma vez que a duração dessa interrupção para enchimento será em geral curta ou mesmo infinitesimal em comparação com o período de tempo durante o qual se planeou o regime da administração do anticorpo ao corpo do doente pediátrico consoante os métodos farmacêuticos da invenção. Nos termos da invenção, pode entender-se um ciclo de tratamento como uma infusão continua do anticorpo biespecífico de cadeia singela CD19xCD3 ao doente com ALL durante um período de (pelo menos) 4 semanas, seguindo-se um intervalo isento de tratamento, de 2 semanas. 0 termo "pelo menos", tal como se utiliza neste documento, significa que a infusão continua também pode ser levada a cabo durante um período de tempo maior do que 4 semanas, por exemplo durante 5, 6, 7 ou 8 semanas ou ainda mais tempo, seguindo-se um intervalo isento de tratamento, de 2 semanas. Pode dar-se o caso de na determinação do MRD dos doentes pediátricos tratados, após um período de (pelo menos) 4 semanas de administração contínua (ou um ciclo de tratamento), se observe uma resposta mínima ou parcial mas não uma negatividade para MRD. Nestas circunstâncias, pode prolongar-se a administração contínua durante mais uma, duas, três, quatro ou mesmo até dez ciclos de tratamento para se conseguir um resultado terapêutico melhor, por exemplo uma resposta hematológica completa, ou mesmo uma resposta molecular completa. Preferivelmente, a referida resposta molecular completa será uma negatividade para MRD (tal como se define adiante neste documento), que diminui o risco de recaídas da doença ALL. Por exemplo, verificou-se que a negatividade para MRD ou baixos teores de MRD em doentes pediátricos com ALL antes de uma HSCT alogénica diminui o risco de uma recaída (Bader P, et al.r J. Clin. Oncol. 27 (2009) : 377-384) . Tal como se ilustra nos exemplos que se seguem, pode conseguir-se uma negatividade para MRD por tratamento dos doentes pediátricos com ALL com o anticorpo biespecífico de cadeia singela CD19xCD3.

Portanto, numa concretização dos métodos farmacêuticos da invenção, o ou os ciclos de tratamento durante os quais se administra continuamente o anticorpo biespecífico de cadeia singela CD19xCD3 ao doente pediátrico com ALL, é ou são seguidos por uma HSCT alogénica. Por outras palavras: Nesta concretização preferida o método da invenção aplica-se antes da transplantação alogénica de células estaminais (HSCT), para transformar a ALL positiva para MRD a um estado negativo para MRD. Deste modo, o risco de uma recaída é significativamente diminuído.

Noutra concretização do método da invenção, o método utiliza-se após uma transplantação de células estaminais hematopoiéticas alogénicas (HSCT). O processo da transplantação pode ser seguido por mais um ou mais ciclos de tratamento com o anticorpo biespecífico de cadeia singela CD19xCD3. Esta concretização é importante nos casos de ALL pediátrica com recaída, em que os doentes já receberam quimioterapia e HSCT. Devido à falha destas terapias convencionais, a doença pode recair e ser agora curada pela administração do anticorpo referido. Além disto, o tratamento pelo anticorpo biespecífico de cadeia singela CD19xCD3 pode ser utilizado a título de terapia de consolidação depois da HSCT, para evitar outra recaída da doença ALL.

Os exemplos que se seguem também proporcionam dados acerca da utilização do anticorpo biespecífico de cadeia singela CD19xCD3 após uma HSCT alogénica, em que as células T mobilizadas são derivadas do doador. Conseguiu observar-se uma indução poderosa de um efeito de enxerto contra leucemia (GvL) na ausência da doença de enxerto contra o hospedeiro (GvHD), induzida pelo tratamento com o anticorpo biespecífico de cadeia singela CD19xCD3 em dois doentes com recaída quimiorrefractária de uma ALL CD19+ após uma HSCT hematopoiética alogénica. Portanto, noutra concretização preferida dos métodos farmacêuticos da invenção, o doente pediátrico com ALL pode ser tratado com o anticorpo biespecífico de cadeia singela CD19xCD3 depois de ter recebido uma HSCT alogénica.

Num cenário de caso melhor possível encara-se que o tratamento de doentes pediátricos com ALL usando o anticorpo biespecífico de cadeia singela CD19xCD3 seja capaz de substituir a terapia convencional da ALL pediátrica, tal como quimioterapia e/ou transplantação de células estaminais hematopoiéticas alogénicas (HSCT).

Tal como se mostra nos exemplos que se seguem, o tratamento dos doentes com leucemia linfoblástica aguda pediátrica (ALL) com o anticorpo biespecífico de cadeia singela CD19xCD3 é capaz de eliminar as células de leucemia linfoblástica aguda do corpo dos doentes até níveis inferiores ao limite da detecção. Preferivelmente, o objectivo terapêutico principal da administração do anticorpo biespecífico de cadeia singela CDl9xCD3, quer por si só, quer em combinação com uma HSCT alogénica, a um doente pediátrico com ALL, é a transformação de um estado positivo para MRD num estado negativo para MRD, resultando numa sobrevivência isenta de leucemia, tal como se define adiante neste documento. Tal como se demonstra neste documento, os doentes pediátricos co ALL positivos para MRD tornaram-se em negativos para MRD depois do primeiro ciclo de tratamento no qual se administrou continuamente o anticorpo biespecífico de cadeia singela CD19xCD3 durante cinco semanas (doente 1) ou durante quatro semanas (doente 2) . No doente 1, o ciclo de tratamento foi seguido por uma HSCT haplóide. Até Novembro de 2009, este paciente mantém-se em remissão completa negativa ara MRD, isto é, isento de tumor.

Continuando a administração ininterrupta do anticorpo biespecífico de cadeia singela CD19xCD3 de acordo com os métodos farmacêuticos da invenção durante períodos de tempo mais longos permite que a activação de células T vantajosa que se mencionou nos exemplos exerça o seu efeito durante tempo suficiente para vantajosamente eliminar todas as células de leucemia linfoblástica aguda do corpo. Uma vez que a taxa de administração do anticorpo biespecífico de cadeia singela administrado ininterruptamente é mantida pequena, a aplicação do agente terapêutico pode ser continuada durante mais tempo sem risco de efeitos colaterais nocivos para o doente. 0 anticorpo biespecífico de cadeia singela CD19xCD3 tal como é utilizado neste documento é vantajosamente preparado sob a forma de uma composição farmacêutica para administração a um doente pediátrico humano ao qual se diagnosticou uma leucemia linfoblástica aguda (ALL). A referida ALL pode ser uma ALL diagnosticada na altura, uma ALL refractária à quimioterapia e/ou à transplantação de células estaminais hematopoiéticas alogénica (HSCT), uma recaída de ALL ou uma recaída de uma ALL refractária à quimioterapia e/ou à transplantação de células estaminais hematopoiéticas alogénica (HSCT).

Numa concretização preferida dos métodos farmacêuticos da invenção, a referida leucemia linfoblástica aguda pediátrica (ALL) é uma leucemia linfoblástica aguda pediátrica de linhagem B (ALL), preferivelmente uma leucemia linfoblástica aguda pediátrica de precursor B. A grande maioria dos casos de ALL pediátrica (> 8 5 %) são células do fenótipo precursor B. Foram propostas diversas classificações da ALL com linhagem B (veja-se por exemplo Schultz et al. , Blood 109 (2007) : 926-935). Para se modular a intensidade da terapia relativamente ao risco de recaída de um doente, estratificam-se hoje em dia os doentes com ALL de precursor B em grupos de risco "pequeno", "padrão", "grande" ou "muito grande" utilizando parâmetros laboratoriais e clínicos: idade do doente, género, contagem de células brancas do sangue (WBC) quando a doença se apresenta, e a presença ou a ausência de anormalidades citogenéticas específicas. As anormalidades citogenéticas que ocorrem frequentemente e ajudam a definir estes grupos de risco incluem por exemplo: t(12;21)[TEL-AML1]; t(l;19;)[E2A-PBX]; t(4;ll) [AF4-MLL]; t(9;22) [BCR-ABL]; hiperdiploidia (ou trissomia dos cromossomas 4, 10, e 17), e hipodiploidia; veja-se por exemplo Schultz et al. ; Bader et al., loc. cit. Utilizando os dados de diversos estudos, foi desenvolvido um sistema de classificação e implementou-se, como COG AALL03B1 (Classificação da Leucemia Linfoblástica Aguda) (Raetz et al., Personalized Med. 2 (2005), 349-361; Schultz et al., Blood 109 (2007) : 926-935) . Uma vez que o anticorpo biespecífico de cadeia singela CD19xCD3 descrito neste documento é dirigido contra o marcador associado a células B, CD19, este anticorpo é especialmente adequado como agente terapêutico para a leucemia linfoblástica pediátrica com linhagem B, preferivelmente para as ALL de precursor B. As ALL de precursor B pediátricas podem ser subdivididas ainda em ALL pediátrica pró-B, ALL pré-B, e ALL comum (cALL) . Tal como se mostra nos exemplos que se seguem, o tratamento consoante os métodos da invenção do doente 1 com sete anos de idade com ALL comum refractária contra qualquer outro tratamento e portanto provavelmente fatal, resultou não só numa remissão hematológica completa mas também numa remissão molecular completa. Por outras palavras: já não se conseguia detectar nenhuma doença residual mínima neste doente depois do tratamento com o anticorpo biespecífico de cadeia singela CD19xCD3. De um modo especialmente preferido, a leucemia linfoblástica aguda pediátrica (ALL) é uma ALL de precursor B, mais preferivelmente cALL. De uma forma importante, o anticorpo biespecífico de cadeia singela CD19xCD3 é capaz de matar não só as células de ALL com TCR ou transposições de imunoglobulina, mas também as células de ALL com diversas outras anormalidades citogenéticas: Por exemplo, verificou-se no doente 2 descrito nos exemplos que se seguem bem como em doentes adultos com ALL que o anticorpo referido é capaz de tratar uma ALL caracterizada por transposições de imunoglobulina ou de TCR, translocações t(4;ll) ou transcritos de fusão bcr/abl (Ph+). Em especial ALL Ph+ e ALL com translocações t(4;ll) tinham sido descritas como sendo extremamente difíceis de tratar por terapia convencional de ALL mas conseguiam ser tratadas com sucesso com o anticorpo biespecífico de cadeia singela CD19xCD3. Os dados mencionados indicam que o anticorpo biespecífico de cadeia singela CD19xCD3 é capaz de tratar diversas formas de ALL incluindo por exemplo as ALL caracterizadas por t (12;21) [TEL-AML1] ; t (1;19;) [E2A-PBX] ; t (4;11) [AF4-MLL] ; t(9;22)[BCR-ABL]; hiperdiploidia (ou trissomia dos cromossomas 4, 10, e 17), hipodiploidia bem como transposições de imunoglobulina ou de TCR; veja-se também a Tabela 1. 0 diagnóstico da ALL pediátrica é baseado em caracteristicas morfológicas, citoquimicas e imunológicas das células, incluindo a morfologia dos linfoblastos em plaqueamentos contrastados de Wright-Giemsa de medula óssea, contraste positivo para desoxinucleótido transferase terminal (TdT), contraste negativo para mieloperoxidase, e expressão à superfície celular de 2 ou mais antigénios de diferenciação linfóide para células precursoras B. A fenotipificação imunológica foi descrita, por exemplo, por Behm F.G. (Immunophenotyping. Em: Childhood Leukemias, C-H Pui editor, Cambridge: Cambridge University Press; 2006, págs. 150-209), e pode ser levada a cabo por exemplo por imunofluorescência indirecta, imunohistoquímica e/ou citometria de fluxo. O termo "doente", tal como se utiliza neste documento, refere-se a um doente humano. O termo "ALL pediátrica" ou "doente com ALL pediátrica", tal como se refere neste documento, denota jovens com entre um mês e 18 anos de idade. A idade indicada deve ser entendida como a idade dos jovens aquando do diagnóstico de qualquer uma das doenças ALL. Os jovens podem ser mais em particular agrupados em subgrupos de recém-nascidos (1 a 12 meses de idade) , crianças mais jovens com 1 a 9 anos, e crianças menos jovens e adolescentes (>10 a 18 anos de idade) . Tal com o se utiliza neste documento, um intervalo de tempo que é definido como "X a Y" significa o mesmo que um intervalo de tempo definido como "entre X e Y". Ambos estes intervalos de tempo incluem em particular o limite superior e também o limite inferior. Isto significa por exemplo que um intervalo de tempo de "entre um mês e 18 anos" inclui tanto "um mês" como "18 anos". Preferivelmente, o doente que se vai tratar consoante a invenção presente terá no máximo 18 anos de idade (incluindo doentes com 18 anos).

Tal como se mostra nos exemplos que se seguem, o doente 1 tinha sete anos de idade quando foi tratado com o anticorpo biespecifico de cadeia singela CD19xCD3, tendo a ALL sido diagnosticada aos dois anos de idade. 0 doente 2 tinha quinze anos de idade quando foi tratado com o anticorpo biespecifico de cadeia singela CD19xCD3, tendo a ALL sido diagnosticada em 2001.

As definições acima aplicam-se mutatis mutandis ao termo "leucemia linfoblástica aguda pediátrica (ALL)", "ALL em crianças", ou a outros semelhantes. Por exemplo, deve entender-se a ALL pediátrica ou das crianças como a ALL diagnosticada num doente pediátrico com entre 1 mês (incluindo 1 mês) e 18 anos (incluindo 18 anos) de idade.

Embora se possa aplicar por si próprio o anticorpo biespecifico de cadeia singela CD19xCD3, tal como se utiliza neste, é preferida a administração num veiculo farmacêutico. São bem conhecidos na técnica exemplos de veículos farmacêuticos adequados e neles se incluem soluções em soro salino tamponizado com fosfato, em água, em lipossomas, com diversos tipos de agentes molhantes, soluções estéreis, etc. Podem formular-se composições que incluem estes veículos recorrendo aos métodos convencionais bem conhecidos. Podem administrar-se estas composições farmacêuticas ao doente pediátrico a uma dose adequada. 0 regime de dosagem será determinado pelo médico assistente atentos os factores clínicos. Tal como se sabe bem em medicina, as dosagens para um qualquer doente pediátrico dependem de muitos factores, incluindo a dimensão do doente, a área superficial do seu corpo, a sua idade, a sua massa corporal, o composto específico que se pretenda administrar, o seu género, a altura e a via de administração, o seu estado geral de saúde, e dos outros fármacos que estejam a ser-lhe administrados ao mesmo tempo. Incluem-se nas preparações para administração parentérica as soluções estéreis aquosas ou não aquosas, ou suspensões. Incluem-se nos exemplos de solventes não aquosos o propilenoglicol, o polietilenoglicol, e os ésteres orgânicos injectáveis tais como o oleato de etilo. Incluem-se nos veículos aquosos a água, as soluções aquosas, ou suspensões, incluindo soro salino e meios tamponizados. Incluem-se nos veículos parenterais solução de cloreto de sódio, de dextrose de Ringer, de dextrose e cloreto de sódio, ou de Ringer lactada. Incluem-se nos veículos endovenosos recargas de fluido e de nutrientes, recargas de electrólito (tais como as baseadas em dextrose de Ringer), e outras semelhantes. Também podem estar presentes conservantes e outros aditivos, tais como por exemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, e gases inertes, e outros semelhantes. Além disto, a composição pode incluir veículos proteicos, tais como por exemplo albumina de soro ou imunoglobulina, preferivelmente com origem humana. Encara-se que a composição possa conter, para além do anticorpo biespecífico de cadeia singela proteico, outros agentes biologicamente activos, dependendo da utilização pretendida para a composição farmacêutica. Estes agentes podem ser agentes que actuem como citostáticos, agentes que evitem a hiperuriquémia, agentes inibidores de reacções imunológicas (por exemplo corticosteróides, FK506), fármacos que actuem sobre o sistema circulatório e/ou agentes tais como moléculas co-estimuladoras de células T ou citoquinas conhecidas na técnica. Por exemplo, pode levar-se a cabo o tratamento com o anticorpo biespecífico de cadeia singela CD19xCD3 em combinação com quimioterapia intratecal tal como para profilaxia do SNC, corticóides, e/ou alopurinol.

Preferivelmente, formula-se o anticorpo biespecífico de cadeia singela CD19xCD3 tal como se define neste documento num tampão, com um estabilizador e um tensioactivo. 0 tampão pode ser um tampão de fosfato, citrato, sucinato ou acetato. 0 estabilizador pode ser um ou mais aminoácidos) e/ou um açúcar. Os tensioactivos podem ser detergentes, PEG, ou outros semelhantes. Mais preferivelmente, o anticorpo biespecífico de cadeia singela CD19xCD3 tal como se definiu neste documento é formulado em citrato, lisina, trehalose e Tween 80. A título de diluente para a composição farmacêutica da invenção, prefere-se soro salino isotónico e Tween 80.

Preferivelmente, nos métodos farmacêuticos da invenção, a composição farmacêutica é preparada para administração a um doente pediátrico humano ao qual se diagnosticou leucemia linfoblástica aguda (ALL). 0 sucesso da terapia com o anticorpo biespecifico de cadeia singela CD19xCD3 pode ser monitorizado por métodos padrão bem estabelecidos para as entidades respectivas na doença: Para a terapia de ALL a células B, pode utilizar-se Distinção de Células Activada por Fluorescência (FACS), aspiração de medula óssea e diversos parâmetros químicos clínicos específicos para a leucemia, bem como outros métodos padrão estabelecidos e conhecidos na técnica. Os métodos e os meios para a determinação do estado de doença residual mínima (MRD) estão descritos neste documento.

Pode determinar-se a actividade citotóxica do anticorpo biespecifico de cadeia singela CD19xCD3 por métodos conhecidos na técnica e métodos tais como os ilustrados por exemplo nos WO 99/54.440, WO 2004/106.381, WO 2007/068.354.

Numa concretização preferida dos métodos farmacêuticos da invenção, a ALL com precursor B do ou dos doentes pediátricos está recaída e/ou é refractária a o tratamento. Com o tratamento corrente da ALL pediátrica, a taxa de sobrevivência isenta de acontecimentos ronda os 75 %. Portanto, 25 % dos doentes recaem apesar do tratamento tóxico e com riscos para a saúde. Os problemas na gestão das recaídas da ALL são a resistência das células leucémicas e as menores tolerâncias dos doentes pediátricos a umo segundo episódio de tratamento depois de já haverem recebido terapia intensiva da linha de frente, resultando numa menor taxa de remissão bem como numa maior incidência de recaídas ulteriores e um resultado global inferior. É então essencial uma poliquimioterapia intensificada para induzir uma segunda remissão completa (Henze G, von Stackelberg A, Relapsed acute lymphoblastic leukemia. Em: Childhood Leukemias, C-H Pui editor, Cambridge: Cambridge University Press; 2006, págs. 473-486). O termo "refractária à quimioterapia e/ou à transplantação de células estaminais alogénicas", tal como se utiliza neste documento, significa que os doentes pediátricos com ALL são resistentes a estas terapias e portanto recaíram após um tratamento convencional de ALL. Também se encara que os pacientes pediátricos que recaíram depois do tratamento com o anticorpo biespecífico de cadeia singela CD19xCD3 recebam um ou mais ciclos de tratamento com o referido anticorpo para tornar as crianças tratadas negativas para MRD. Os doentes referidos podem então por exemplo receber uma segunda HSCT alogénica.

Tal como se mostra nos exemplos que se seguem, os métodos farmacêuticos da invenção são especialmente adequados para o tratamento de doentes pediátricos que sejam resistentes às terapias convencionais da ALL. Embora os doentes pediátricos destes exemplos hajam recebido fortes tratamentos prévios tanto com quimioterapia como por transplantação de células estaminais alogénicas, os doentes recaíram diversas vezes. Os doentes tinham portanto um prognóstico extremamente desfavorável. No entanto, depois do tratamento com o anticorpo biespecífico de cadeia singela CD19xCD3, os doentes ficaram negativos para MRD, isto é, denotavam uma remissão molecular completa. Por outras palavras: 0 tratamento eliminou células de leucemia linfoblástica aguda do corpo dos doentes pediátricos até menos do que o limite de detecção. De uma forma que é a mais importante, a medula óssea dos doentes pediátricos foi limpa de células leucémicas.

Numa concretização preferida dos métodos farmacêuticos da invenção, a leucemia linfoblástica aguda (ALL) do ou dos doentes pediátricos é refractária à quimioterapia e/ou à HSCT alogénica, no que toca ao MRD. Por outras palavras: o MRD nos doentes pediátricos com ALL é resistente à quimioterapia e/ou à HSCT alogénica.

Considera-se que os métodos farmacêuticos da invenção venham a ser também adequados para o tratamento de ALL pediátrica recém-diagnostiçada, na medida em que proporciona uma alternativa aos regimes de tratamento convencionais de ALL pediátrica, tais como quimioterapia e/ou HSCT alogénica.

Em mais uma concretização preferida, a referida leucemia linfoblástica aguda (ALL) recai adentro de três anos do diagnóstico, preferivelmente adentro de dois anos do diagnóstico, ainda mais preferivelmente no ano a seguir ao diagnóstico. Preferivelmente, a recaída referida é uma recaída na medula óssea. 0 termo "quimioterapia", tal como se utiliza neste documento, denota a quimioterapia utilizada para o tratamento de leucemia linfoblástica aguda (ALL) pediátrica. A quimioterapia é o tratamento inicial preferido para a ALL pediátrica (veja-se por exemplo Pui CH, Eja S, Nat. Ver. Drug Discov. 6 (2007) : 149-165; Schmiegelow K, Gustaffson G. Acute lymphoblastic Leukemia. Em: Cancer in Children: Clinical Management. Voute PA,

Barret A, Stevens MCG, Caron HN (editores), Londres, UK, Oxford University Press, 2005, págs. 138-170; Schmoll, Hõffken, Possinger, loc. cit.) . A maior parte dos doentes pediátricos com ALL acabam por receber uma combinação de tratamentos diferentes. No tratamento da ALL pediátrica, não existem opções cirúrgicas, devido à distribuição das células malignas por todo o corpo. Em geral, a quimioterapia citotóxica para a ALL pediátrica combina múltiplos fármacos anti-leucémicos em diversas combinações. A quimioterapia para a ALL pediátrica é constituída por três fases: indução da remissão, intensificação, e terapia de manutenção. A quimioterapia também está indicada para proteger o sistema nervoso central da leucemia. O objectivo da indução da remissão é matar rapidamente a maior parte das células de tumor e levar o doente pediátrico até uma remissão hematológica completa. Isto é definido como uma presença de menos do que 5 % de blastos leucémicos na medula óssea (tal como determinados por microscopia com luz). Por exemplo, utilizam-se para induzir a remissão, por si sós ou em combinação, Clofarabina, Ciclofosfamida, VP16, Amsacrina, Prednisona, Melfalan, ou Citarabina. A intensificação recorre a doses elevadas endovenosas de quimioterapia com múltiplos fármacos para diminuir a carga de tumor. Utilizam-se nos protocolos típicos de intensificação a vincristina, a ciclofosfamida, citarabina, a daunoorrubicina, o etoposido, a tioguanina ou a mercaptopurina, administradas sob a forma de blocos em combinações diferentes. Uma vez que as células da ALL penetram por vezes no sistema Nervoso Central (SNC), a maior parte dos protocolos inclui a veiculação da quimioterapia até ao fluido do SNC, o que normalmente se denomina quimioterapia intratecal. Alguns centros oncológicos administram o fármaco via um reservatório de Ommaya (um dispositivo colocado cirurgicamente sob o escalpo e utilizado para veicular fármacos para o fluido do SNC e para extrair fluido do SNC para diversos testes) . Outros centros levam a cabo diversas perfurações lombares, consoante é necessário para os testes e para a entrega da medicação. Utilizam-se em geral para este objectivo o metotrexato ou a citarabina por via intratecal. 0 objectivo da terapia de manutenção é matar quaisquer células leucémicas residuais que não tenham sido aniquiladas durante os regimes de indução da remissão, e de intensificação. Embora essas células sejam poucas, elas provocarão uma recaída se não forem eliminadas. Com este objectivo, utilizam-se mercaptopurina diária, metotrexato oral semanal, um ciclo mensal de 5 dias de vincristina endovenosa. A duração da terapia de manutenção é de 3 anos para os rapazes, 2 anos para as raparigas e para os adultos. Trata-se a recaída no sistema nervoso por administração intratecal de hidrocortisona, metotrexato, e citarabina. Uma vez que os regimes de quimioterapia podem ser intensivos e prolongados (amiúde cerca de 2 anos nos protocolos GMALL UKALL, HyperCVAD ou CALGB; cerca de 3 anos para os indivíduos do sexo masculino sob protocolos COG) , muitos doentes são portadores de um cateter endovenoso inserido numa veia grande (denominado um cateter venoso central ou uma linha de Hickman) , ou um Portacath (um dispositivo para administração em forma de cone com uma protuberância em silicone que é cirurgicamente implantado sob a pele, em geral junto de uma clavícula). No entanto, a quimioterapia continua a ser um procedimento fortemente tóxico, em especial para doentes pediátricos.

Os doentes podem sofrer uma recaída da ALL a seguir à terapia inicial e/ou tornar-se refractários à quimioterapia a seguir ao tratamento. Os doentes com ALL pediátrica que são refractários à quimioterapia apresentam prognósticos notavelmente desfavoráveis. Em especial, o prognóstico para doentes pediátricos com ALL Ph+ ou ALL com translocações t(4;ll) tratados apenas com quimioterapia, é desfavorável. Uma vez que o método da invenção é capaz de tornar os doentes com ALL pediátrica negativos para MRD, é especialmente útil para o tratamento de doentes com ALL refractários à quimioterapia e/ou à HSCT alogénica. Nestas condições, o termo "refractário à quimioterapia e/ou à HSCT alogénica", tal como se utiliza neste documento, denota resistência das células de leucemia linfoblástica aguda à quimioterapia e/ou à HSCT alogénica. 0 termo "transplantação de células estaminais hematopoiéticas alogénicas (HSCT)", tal como se utiliza neste documento, significa transplantação de células estaminais hematopoiéticas (HSCT) ou transplantação de medula óssea que é um procedimento medicinal no domínio da hematologia e da oncologia que envolve a transplantação de células estaminais hematopoiéticas (HSC). Ele é na maior parte das vezes levado a cabo em doentes com doenças do sangue ou da medula óssea, ou sofrendo de determinados tipos de cancro, tal como ALL. A maior parte dos destinatários de HSCT são doentes com leucemia (por exemplo ALL que beneficiariam de um tratamento com doses elevadas de quimioterapia ou com irradiação do corpo inteiro. A HSCT alogénica em crianças com ALL foi descrita por exemplo em Schrauder A, et al. (Bone Marrow Transplantation 41 (2008) : Suppl2 S71-74). No entanto, a transplantação de células estaminais alogénicas continua a ser um procedimento arriscado, em especial para doentes pediátricos. O termo "elegível para transplantação de células estaminais hematopoiéticas alogénicas (HSCT)", tal como se utiliza neste documento, significa que a transplantação de células estaminais alogénicas é a terapia necessária para o doente com ALL pediátrica. Em casos nos quais o doente com ALL pediátrica é elegível para transplantação de células estaminais alogénicas, podem encarar-se os dois cenários seguintes. No primeiro, numa concretização dos métodos farmacêuticos da invenção, a administração do anticorpo biespecífico de cadeia singela CDl9xCD3 (por si só mas preferivelmente sob a forma de uma composição farmacêutica) pode ser utilizada para substituir a transplantação de células estaminais alogénicas que se utiliza a título de terapia convencional para doentes com ALL pediátrica elegíveis para transplantação. Portanto o método da invenção pode evitar os riscos para a saúde de todos os doentes com ALL pediátrica, associados à HSCT alogénica. Além disto, cerca de 30 % dos doentes com ALL pediátrica transplantados sofrem recaídas após a transplantação. Portanto o método da invenção pode ser utilizado pra tratar estes doentes. Na concretização alternativa, a infusão contínua do anticorpo biespecífico de cadeia singela CD19xCD3 no paciente com ALL pediátrica pode ser seguida por uma transplantação de células estaminais alogénicas. Nesta concretização, a administração de uma composição farmacêutica que inclua uma construção do anticorpo biespecífico de cadeia singela CD19xCD3 pode ser utilizada para transformar os doentes com ALL pediátrica elegíveis para a transplantação a um estado negativo para MRD antes de eles receberem a transplantação. Deste modo, o método da invenção pode ser utilizado para eliminar a MRD, o que leva a um menor risco de recaída do que no tratamento por transplantação de doentes positivos para MRD. Os exemplos que se seguem apresentam um doente pediátrico (doente 1) que foi primeiro transformado a um estado negativo para MRD por tratamento com o anticorpo biespecífico de cadeia singela CD19xCD3, seguindo-se a transplantação alogénica. Até à data (Novembro de 2009), este doente pediátrico ainda é negativo para MRD. O termo "não elegível para uma transplantação com células estaminais hematopoiéticas alogénicas (HSCT)", tal como é utilizado neste documento, significa aqueles doentes pediátricos para os quais uma transplantação com células estaminais alogénicas não é o tratamento de ALL recomendado, por exemplo, devido a razões medicinais. Poderia também acontecer que não estivesse disponível nenhum doador apropriado para a transplantação de células estaminais alogénicas.

Deste modo, numa concretização, a leucemia linfoblástica aguda (ALL) é refractária à quimioterapia e/ou à HSCT alogénica em doentes pediátricos não elegíveis ou já não elegíveis para uma HSCT alogénica. Por exemplo, um doente pediátrico pode estar num estado de saúde de tal modo mau que não se possa levar a cabo nenhuma transplantação de células estaminais alogénicas por razões medicinais. 0 doente 1 que se mostra nos exemplos que se seguem não era elegível para uma transplantação com células estaminais alogénicas antes do tratamento com o anticorpo biespecífico de cadeia singela CD19xCD3, devido ao seu mau estado de saúde. Num tal caso, o tratamento com o anticorpo biespecífico de cadeia singela CD19xCD3 proporciona uma nova via de tratamento para a ALL pediátrica.

Até este momento, a ALL significava uma sentença de morte para os doentes pediátricos refractários à quimioterapia e não elegíveis para uma HSCT alogénica. 0 método da invenção proporciona pela primeira vez uma terapia para esta população de doentes pediátricos na medida em que elimina a doença residual mínima (MRD) que de outro modo provocaria uma recaída e que por último mataria os doentes referidos.

Está adentro do âmbito dos métodos farmacêuticos da invenção, administrar-se a construção de anticorpo biespecífico de cadeia singela CD19xCD3 a doentes com ALL pediátrica que anteriormente receberam quimioterapia, por si só ou em combinação com uma transplantação de células estaminais alogénicas, e que em seguida recaíram.

Noutra concretização preferida, o método da invenção destina-se ao tratamento, melhoria ou eliminação da doença residual mínima (MRD) num doente pediátrico com leucemia linfoblástica aguda (ALL). 0 termo "doença residual mínima (MRD)", tal como se define neste documento, denota um termo que se utiliza depois de um tratamento, por exemplo com quimioterapêuticos, quando já não se conseguem encontrar células leucémicas na medula óssea pelos testes padrão, tais como testes por microscopia. Em vez destes, têm que ser utilizados testes mais sensíveis tais como citometria de fluxo (métodos baseados em FACS) ou a reacção da polimerase em cadeia (PCR), para se encontrarem provas de que restaram células de leucemia na medula óssea do doente com ALL pediátrica. Mais em particular, a presença de células leucémicas em quantidade menor que o limite de detecção citológica (5 % de células leucémicas) é definida como doença residual mínima (MRD). Quando não é detectável nenhuma MRD (<1CT4, isto é, detectar-se menos do que 1 célula de leucemia em cada 104 células de medula óssea), atingiu-se uma remissão molecular completa (negatividade para MRD ou estado negativo para MRD). Um "estado positivo para MRD", tal como se define neste documento, significa um sinal medido por PCR ou por FACS acima do seu limite de detecção ou limiar quantitativo. Um "estado negativo para MRD", tal como se define neste documento, significa que se está abaixo do limite de detecção e/ou abaixo do limiar quantitativo medido por PCR ou por FACS. 0 valor da classificação em termos de quantificação da doença residual mínima na ALL das crianças foi descrito por exemplo em Bader et al. (J. Clin. Oncol. 27 (2009) : 377-384) ou em Eckert et al. (Lancet 358 (2001): 1239-41). O estado para MRD pode ser medido em análise por PCR ou por FACS, na medida em que as anormalidades citogenéticas individuais mencionadas neste documento, e/ou as transposições de genes de imunoglobulina ou de receptores de células T (TCR), sejam quantitativamente detectados. Por exemplo, uma análise por PCR consegue detectar transcritos de fusão tais como bcr/abl ou translocações t(4;ll)bem como transposições clonais individuais de imunoglobulinas (IgH) e/ou genes de receptores de células T (TCR).

Tal como se demonstra nos exemplos que se seguem, após o tratamento com o anticorpo biespecifico de cadeia singela CD19xCD3 descrito neste documento, conseguiam eliminar-se todas as células da leucemia linfoblástica aguda dos corpos dos doentes com ALL pediátrica, conseguindo portanto atingir-se uma remissão molecular completa (isto é, um estado negativo para MRD).

As anormalidades cromossómicas recorrentes nas células malignas dos doentes pediátricos e adultos que sofrem de leucemia linfoblástica aguda são os sinais universais desta doença (Harrison e Foroni, Rev. Clin. Exp. Hematol. 6 (2002), 91-113). As aberrações particulares que sejam frequentemente indicativas de lesões moleculares subjacentes são consistentes e podem assistir ou mesmo estabelecer o diagnóstico e determinar a terapia óptima. Na ALL das crianças, foram identificados muitos subgrupos citogenét icos bons e de alto risco, que são normalmente utilizados para estratificar os doentes recomendando terapias especificas (Pui e Evans, N. Engl. J. Med. 354 (2006) , 166-178) . Na ALL de adultos, o papel da citogenética na gestão dos doentes tem largamente sido centrado na presença do cromossoma Filadélfia (Ph) que habitualmente provém de t(9;22)(q34;qll.2) e origina a fusão BCR-ABL (Faderl et al., Blood 91 (1998), 3995-4019). Embora a incidência global de ALL Ph+ ALL nos adultos seja de cerca de 25 %, ela correlaciona-se com a idade e aumenta até mais do que 50 % nos doentes com idades superiores a 55 anos (Appelbaum, Livro de educação de 2005 da American Society of Clinical Oncology. Alexandria: ASCO, 2005: 528-532) . Outras translocações citogenéticas associadas a anormalidades moleculares genéticas especificas na leucemia linfoblástica aguda (ALL) estão listadas na Tabela 1 e também foram descritas em Schultz et al. ou em Bader et al., loc. cit.

A citogenética tem sido cada vez mais reconhecida como um instrumento importante na previsão do resultado da ALL (Moormann et al., Blood 109 (2007), 3189-97).

Os prognósticos para alguns subtipos citogenéticos são piores do que para outros. Nestes se incluem por exemplo: (i) Uma translocação entre os cromossomas 9 e 22, o cromossoma Filadélfia (Ph+), ocorre em cerca de 20 % dos casos de ALL nos adultos e 5 % nos pediátricos. (ii) Uma translocação entre os cromossomas 4 e 11 ocorre em cerca de 4 % dos casos de ALL e é mais comum nos recém-nascidos com menos de meses.

As transposições dos genes de imunoglobulina ou as transposições dos receptores de células T (TCR) e o seu papel na ALL foram descritas na técnica (veja-se por exemplo Szczepahski et al. , Leukemia 12 (1998), 1081-1088).

Noutra concretização preferida dos métodos farmacêuticos da invenção, o referido doente com ALL pediátrica é positivo para MRD mas em remissão hematológica completa. O termo "remissão" ou "remissão hematológica completa", tal como se utiliza neste documento, deve ser entendido como não existindo nenhuns sinais da doença ALL depois de um tratamento padrão, por exemplo depois de uma quimioterapia e/ou de uma transplantação. Isto significa que a medula óssea contém menos do que 5 % de células blasto, tal como determinadas por microscopia luminosa, que as contagens das células sanguíneas estão dentro dos limites normais, e que não existem quaisquer sinais ou sintomas da doença ALL. No entanto, pode acontecer que nem todas as células leucémicas hajam sido eliminadas do corpo. Um doente destes, embora classificado como estando em remissão ou em remissão hematológica completa, ainda é positivo para MRD. Estas células de tumor remanescentes podem originar uma recaída da leucemia. Os métodos farmacêuticos da invenção podem ser utilizados para matar estas células de tumor remanescentes para evitar uma recaída da leucemia devida às células leucémicas ocultas que permaneçam no corpo após a terapia primária. Deste modo, os meios e métodos farmacêuticos ajudam a evitar recaídas da doença em todos os doentes com ALL pediátrica.

Em contraste, uma "remissão molecular completa" significa que não há nenhuns vestígios de células leucémicas nas biópsias de medula óssea, mesmo quando são utilizados testes muito sensíveis tais como análises por PCR ou por FACS. Por outras palavras: Quando não é detectável nenhuma MRD (<1CT4, isto é, menos do que uma célula de leucemia por 104 células de medula óssea), atingiu-se uma remissão molecular completa.

Noutra concretização preferida dos métodos farmacêuticos da invenção, a administração da referida composição farmacêutica transforma uma leucemia linfoblástica aguda (ALL) pediátrica positiva para MRD a um estado negativo para MRD.

Noutra concretização preferida dos métodos farmacêuticos da invenção, mede-se a MRD pela detecção quantitativa de pelo menos uma das anormalidades citogenéticas ou transposições, seleccionadas de entre o conjunto constituído por: t(12;21) [TEL-AML1] ; t(1;19;)[E2A-PBX]; t (4;11) [AF4-MLL]; t (9;22) [BCR-ABL]; hiperdiploidia ou trissomias simultâneas nos cromossomas 4, 10, e 17; hipodiploidia (isto é, menos do que 44 cromossomas); transposições dos genes de imunoglobulina; e transposições nos genes de receptores de células T.

Mede-se a MRD com a detecção quantitativa de pelo menos uma de entre: (i) as anormalidades citogenéticas individuais mencionadas neste documento, tais como t (12;21) (TEL-AML1]; t (1;19;) [E2A-PBX]; t (4;11) [AF4-MLL]; t(9;22)[BCR-ABL]; hiperdiploidia (ou trissomias simultâneas nos cromossomas 4, 10, e 17), hipodiploidia (isto é, menos do que 44 cromossomas), ou (ii) as transposições dos genes de imunoglobulina ou em receptores de células T (TCR); veja-se também a Tabela 1. A referida detecção quantitativa das anormalidades citogenéticas mencionadas ou transposições é preferivelmente levada a cabo utilizando, por exemplo, análise por PCR ou por FACS. 0 método da invenção proporciona uma via terapêutica para o tratamento, melhoria ou eliminação da MRD, diminuindo ou mesmo abolindo deste modo o risco de recaída para o doente com ALL pediátrica. É de sublinhar que não se encontrava disponível até à data nenhu tratamento curativo da MRD nos doentes com ALL pediátrica.

Noutra concretização preferida dos métodos farmacêuticos da invenção, o referido doente pediátrico com uma MRD denota um sinal de ter uma anormalidade citogenética acima do limite de detecção e/ou pelo menos um marcador por transposição, com uma sensibilidade >10~4. Preferivelmente, detecta-se a MRD por análise utilizando PCR e/ou FACS.

As anormalidades citogenéticas individuais mencionadas neste documento incluem por exemplo t (12;21) [TEL-AML1] ; t (1;19;) [E2A-PBX] ; t (4;11) [AF4-MLL] ; t(9;22) [BCR-ABL]; hiperdiploidia (ou trissomia dos cromossomas 4, 10, e 17), hipodiploidia. As transposições incluem, por exemplo, transposições dos genes de imunoglobulina ou dos receptores de células T (TCR) ; veja-se também a Tabela 1. A MRD representada por células de ALL portadoras das referidas anormalidades citogenéticas e/ou transposições pode ser detectada por uma análise de PCR ou de FACS.

Por exemplo, o termo "sinal de bcr/abl acima do limite de detecção", tal como se utiliza neste documento, significa que uma análise por PCR ou por FACS leva a um sinal de bcr/abl detectável. De forma semelhante, um sinal de uma translocação t(4;ll) significa que a referida translocação pode ser detectada por PCR ou por FACS. Isto aplica-se mutatis mutandis às outras anormalidades citogenéticas ou às transposições que se mencionam neste documento. 0 termo "com uma sensibilidade >1CT4" no contexto com as transposições, significa que pelo menos uma célula leucémica, ou mais, (com uma transposição TCR ou de imunoglobulina mencionada) por 104 células de medula óssea, consegue ser detectada pelos métodos mencionados.

Noutra concretização preferida dos métodos farmacêuticos da invenção, o período de tempo até à recaída molecular (detectável pelos ensaios descritos acima) é mais longo do que 6 meses, preferivelmente mais do que 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 meses, ou ainda mais preferivelmente de 2, 3, 4, 5 ou mais anos. O termo "recaída molecular", tal como se utiliza neste documento, significa que o referido doente pediátrico apresenta um sinal de uma anormalidade citogenética acima do limite de detecção e/ou pelo menos um marcador por transposição, com uma sensibilidade >10 4, por PCR e/ou por FACS, tal como exposto acima.

Noutra concretização preferida dos métodos farmacêuticos da invenção, as regiões variáveis correspondentes da cadeia pesada (VH) e as regiões variáveis correspondentes da cadeia leve (VL) na construção do referido anticorpo biespecifico de cadeia singela CD19xCD3 estão dispostas, desde o terminal N e até ao terminal C, pela ordem VL (CD19)-VH(CD19)-VH(CD3)-VL(CD3) .

Mostram-se as regiões variáveis correspondentes da cadeia pesada (VH) e as regiões variáveis correspondentes da cadeia leve (VL) dos domínios de ligação a CD3 e a CD19 do anticorpo biespecifico de cadeia singela CD19xCD3 respectivamente nas SEQ ID Nos. 3 a 10. As regiões CDR correspondentes das regiões VH e VL respectivas do mencionado anticorpo biespecifico de cadeia singela CD19xCD3 estão ilustradas pelas SEQ ID Nos. 11 a 22.

Noutra concretização preferida dos métodos farmacêuticos da invenção, a construção do referido anticorpo biespecifico de cadeia singela CD19xCD3 inclui uma sequência de aminoácidos tal como consta da SEQ ID NO. 1, ou uma sequência de aminoácidos que seja pelo menos 90 %, preferivelmente pelo menos 95 % idêntica à SEQ ID NO. 1. A invenção descreve uma molécula de anticorpo biespecifico de cadeia singela CD19xCD3 que inclui uma sequência de aminoácidos tal como consta da SEQ ID NO. 1, bem como uma sequência de aminoácidos que seja idêntica em pelo menos 90 % ou preferivelmente em 95 %, e de preferência pelo menos 96, 97, 98, ou 99 %, à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO. 1. A invenção também descreve a sequência de ácidos nucleicos correspondente tal como na SEQ ID NO. 2, em como uma sequência de ácido nucleico idêntica em pelo menos 90 %, preferivelmente 95 % idêntica, e de preferência pelo menos 96, 97, 98, ou 99 % idêntica à sequência de ácido nucleico representada pela SEQ ID NO. 2. Deve entender-se que a identidade das sequências é determinada ao longo da totalidade da sequência de nucleótidos ou de aminoácidos. Para além disto, deve entender-se que uma molécula de anticorpo biespecifico de cadeia singela que inclua uma sequência de aminoácidos que seja pelo menos 90 % ou preferivelmente 95 % idêntica, e de preferência 96, 97, 98, ou 99 % idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO. 1 contém todas as sequências de CDR ilustradas nas SEQ ID Nos. 11 a 22. Para os alinhamentos das sequências, por exemplo, podem utilizar-se os programas Gap ou BestFit (Needleman e Wunsch J. Mol. Biol. 48 (1970), 443-453; Smith e Waterman, Adv. Appl. Math 2 (1981), 482-489), contidos no pacote de programas GCG (Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, EUA 53711 (1991). É um método de rotina para os especialistas da técnica determinar e identificar uma sequência, de nucleótidos ou de aminoácidos, que tenha por exemplo 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade de sequência com as sequências, de nucleótido ou de aminoácidos, do anticorpo biespecífico de cadeia singela CD19xCD3 descrito neste documento. Por exemplo, e de acordo com a hipótese Wobble de Crick, a base em 5' do anti-códon não tem as mesmas limitações estereoquímicas que as outras duas bases, e pode portanto apresentar um emparelhamento de bases diferente daquilo que é o padrão. Por outras palavras: a terceira posição do tripleto de um códon pode variar, de tal modo que dois tripletos que diferem nesta terceira posição podem codificar para o mesmo resíduo de aminoácido. Esta hipótese é bem conhecida dos especialistas da técnica (veja-se por exemplo http://en.wikipedia.org/wiki/Wobble_Hypothesis; Crick, J. Mol. Biol. 19 (1966): 548-55). Além disto é um procedimento de rotina para os especialistas da técnica determinar a actividade citotóxica de uma tal sequência de nucleótidos ou de aminoácidos com uma identidade de, por exemplo, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 %, com a sequência de nucleótidos ou de aminoácidos do anticorpo biespecífico de cadeia singela CD19xCD3 descrito neste documento. A actividade citotóxica do anticorpo biespecífico de cadeia singela CD19xCD3 ou de uma construção de anticorpo que tenha por exemplo uma identidade de sequência de aminoácidos de 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % com a sequência de aminoácidos do anticorpo biespecífico CD19xCD3 pode ser determinada por métodos tais como os ilustrados, por exemplo, nos WO 99/54.440, W0 2004/106.381, ou WO 2007/068.354.

Noutra concretização preferida dos métodos farmacêuticos da invenção, a composição farmacêutica contendo uma construção de um anticorpo biespecifico de cadeia singela CD19xCD3 destina-se a ser administrada por infusão continua durante pelo menos quatro semanas seguindo-se um intervalo de 2 semanas sem qualquer tratamento. Deve entender-se um ciclo de tratamento como uma infusão continua do anticorpo referido durante pelo menos quatro semanas, seguido por um intervalo de 2 semanas sem qualquer tratamento. Este intervalo pode por sua vez ser seguido por um ou mais ciclos de tratamento ou por uma HSCT alogénica. Preferivelmente, a referida administração por infusão continua do anticorpo biespecifico de cadeia singela CD19xCD3 (isto é, um ciclo de tratamento) deve ser repetida pelo menos duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou até dez vezes, depois de se ter determinado um estado negativo para MRD, para consolidação.

Numa concretização dos métodos farmacêuticos da invenção, o método é utilizado antes da transplantação de células estaminais alogénicas para transformar o estado de positivo para MRD da ALL no estado negativo para MRD.

Noutra concretização dos métodos farmacêuticos da invenção, emprega-se o métodos depois de uma HSCT alogénica, por exemplo, nos casos que que a ALL pediátrica recaiu após uma terapia convencional de ALL recorrendo a quimioterapia e/ou a uma transplantação de células estaminais alogénicas.

Noutra concretização preferida dos métodos farmacêuticos da invenção, administra-se a construção do anticorpo biespecifico de cadeia singela CD19xCD3 a uma dose diária de entre 10 pg e 100 pg por metro quadrado da área superficial do corpo do paciente.

Tal como se utiliza neste documento, uma gama de doses definida como "X a Y" significa uma gama de doses definida como "entre X e Y" . Esta gama inclui o limite superior e também o limite inferior. Isto significa, por exemplo, que uma dose diária de 10 pg a 100 pg por metro quadrado da área superficial do corpo inclui "10 pg" e "100 pg" .

Numa concretização ainda mais preferida dos métodos farmacêuticos da invenção, administração a construção do anticorpo biespecifico de cadeia singela CD19xCD3 a uma dose diária de 15 pg, 30 pg, 60 pg ou 90 pg por metro quadrado da área superficial do corpo. É ainda mais preferido administrar-se o anticorpo referido a uma dose diária de entre 15 e 30 pg por metro quadrado da área superficial do corpo do doente, de preferência a uma dose diária de 15 ou de 30 pg por metro quadrado da área superficial do corpo do doente. A área superficial média do corpo de um doente pediátrico é calculada neste documento e no contexto do método ou utilização consoante a invenção, como sendo de entre cerca de 0,2 e 2,2 m2. Para este cálculo vejam-se por exemplo as fórmulas proporcionadas em http://www.cato .eu/koerperoberflaeche-kinder.html

Noutra concretização dos métodos farmacêuticos da invenção, a leucemia linfoblástica aguda (ALL) pediátrica acabou de ser diagnosticada, é ALL refractária ou uma sua recaída e pediátrica, ou é uma recaída de ALL refractária. Uma ALL pediátrica que acabou de ser diagnosticada, tal como se utiliza neste documento, significa que a doença ALL foi diagnosticada pela primeira vez ao doente pediátrico.

Noutra concretização dos métodos farmacêuticos da invenção, o método referido destina-se a um doente em elevado risco de recaída consoante a classificação COGAALL03B1 da leucemia linfoblástica aguda.

De uma forma vantajosa, a composição farmacêutica que contém o anticorpo biespecífico de cadeia singela CD19xCD3 tal como decreto neste documento contém também, opcionalmente, (a) um ou mais tampões reaccionais, soluções de armazenagem e/ou agentes adicionais ou materiais necessários para o método ou utilização descritos. Além disto, as componentes referidas podem ser individualmente empacotadas em frascos ou garrafas, ou em estarem em combinação em contentores ou em unidades com diversos contentores .

Para se avaliar a segurança e a tolerabilidade do anticorpo biespecífico de cadeia singela CD19xCD3 tal como descrito neste documento, administra-se o composto por uma infusão contínua de longo termo.

Verificou-se que os efeitos beneficiais e inesperados dos métodos farmacêuticos da invenção podem ser obtidos administrando o anticorpo biespecífico de cadeia singela CD19xCD3 a uma dose diária de entre 10 micrograma e 100 micrograma por metro quadrado de área superficial do corpo. Pode manter-se a dose constante ao longo do período de administração. No entanto, também está adentro do âmbito desta concretização que no ou nos dias iniciais do período de infusão, se pode administrar uma dose menor do anticorpo biespecífico de cadeia singela CD19xCD3 ("dose inicial") antes da que consta nos métodos farmacêuticos descritos neste documento, enquanto durante o período remanescente se aplica uma dose maior ("dose de manutenção"). Esta maneira de proceder pode ajudar à adaptação do corpo do doente ao tratamento com o anticorpo e/ou a evitar efeitos colaterais indesejáveis. Por exemplo, 5 micrograma de anticorpo biespecífico com cadeia singela por metro quadrado de área superficial do corpo podem ser administrados a título de dose inicial no ou nos primeiros dias (por exemplo no primeiro dia, ou no primeiro e no segundo dias, ou nos três primeiros dias, etc. até ao sétimo dia) do período de infusão, seguindo-se a administração de 15 micrograma por metro quadrado de área superficial do corpo a título de dose diárias durante o período remanescente. Ou podem administrar-se 5 micrograma do anticorpo biespecifico de cadeia singela por metro quadrado de área superficial do corpo a titulo de dose inicial no ou nos primeiros dias do período da infusão, seguindo-se a administração de 30 ou de 45 micrograma por metro quadrado de área superficial do corpo a título de dose diárias durante o período remanescente. Também se encara administrarem-se 5 micrograma do anticorpo biespecifico de cadeia singela CD19xCD3 por metro quadrado de área superficial do corpo durante o ou os primeiros dias do período da infusão, seguindo-se a administração de 15 micrograma do anticorpo biespecifico de cadeia singela CD19xCD3 por metro quadrado de área superficial do corpo durante os dias seguintes do período de infusão, administrando-se em seguida 30 ou 45 micrograma por metro quadrado de área superficial do corpo a título de dose diária (de manutenção) durante o restante do período de infusão, para um total de pelo menos 4 semanas. Podem administrar-se as duas doses iniciais não apenas durante um dia, mas também durante 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 dias ou ainda durante mais tempo. Calcula-se a este efeito a área superficial média do corpo de um doente no contexto dos métodos farmacêuticos consoante a invenção como sendo de entre 0,2 e 2,2 m2. A administração ininterrupta do anticorpo biespecifico de cadeia singela CD19xCD3 pode ser endovenosa, parenteral, subcutânea, transdérmica, intraperitoneal, intramuscular ou pulmonar. O modo de administração endovenosa será o método escolhido na maior parte dos casos para a administração ininterrupta do anticorpo biespecifico de cadeia singela CD19xCD3 e, quando for caso disso, para a co-administração de um agente farmacêutico que integre um regime de co-terapia. Deste modo, é especialmente preferida a administração endovenosa. Neste caso, pode seleccionar-se vantajosamente um dispositivo de medição adequado tal como uma bomba de infusão de terapias múltiplas, por exemplo uma bomba do modelo 6060 fabricada pela Baxter. Qualquer que seja o dispositivo de medição que se seleccione, ele deve ser de uma concepção e construção tais que se minimize ou, ainda melhor, que se evite uma interrupção da administração do agente terapêutico aquando de uma permuta de cartuchos e/ou de pilhas ou células de energia, ou do seu recarregamento. Isto pode ser conseguido, por exemplo seleccionando um dispositivo com um reservatório secundário da solução do anticorpo biespecifico de cadeia singela CD19xCD3, para além do cartucho que se vai substituir, de tal modo que se assegure uma infusão continua a partir deste reservatório secundário e ao doente pediátrico, mesmo enquanto se remova o cartucho vazio ou quase vazio, e se substitua por um novo.

Um modo de administração endovenosa e, quando tal for o caso, de co-administração como parte de um regime de co-terapia, envolve a implantação de uma bomba no corpo do doente pediátrico para quantificar a administração referida. Estas bombas de medição são conhecidas dos indivíduos especializados na técnica, por exemplo o modelo 6060 fabricado pela Baxter tal como se mencionou acima. A título de exemplo não limitativo, pode acontecer que a administração ininterrupta, isto é contínua, seja levada a cabo por um pequeno sistema de uma bomba que pode ser aposta ou implantada no doente pediátrico, para medir o influxo do agente terapêutico para dentro do corpo do doente. Estes sistemas de bomba são em geral conhecidos na técnica, e baseiam-se em geral na permuta periódica de cargas que contêm o agente terapêutico que se pretende infundir. Quando se permuta o reservatório de um tal sistema de bomba, pode ocorrer uma interrupção temporária do caudal que de outra forma é ininterrupto, do agente terapêutico para dentro do corpo do doente pediátrico. Num tal caso, a fase de administração anterior à substituição da carga e a fase de administração logo a seguir à substituição da carga seriam ainda consideradas, no âmbito dos métodos farmacêuticos da invenção, como constituindo uma componente da "administração ininterrupta" do referido agente terapêutico. O mesmo se aplicaria para administrações muito duradouras, nas quais a carga teria que ser substituída mais do que uma vez, ou no caso em que as pilhas ou baterias que actuam a bomba necessitem de substituição, levando a uma paragem temporária do caudal de solução terapêutica para dentro do corpo do doente.

Também devem ser tomadas medidas apropriadas para minimizar o perigo de infecção no ponto em que perfura para se administrar o medicamento ao corpo do doente, uma vez que estas feridas de longa duração são especialmente atreitas a infecções. Isto também se aplica a uma administração intramuscular recorrendo a um sistema de administração semelhantes. A administração continua pode ser transdérmica via um pacho aposto sobre a pele e substituído a intervalos. Um especialista da técnica está consciente de sistemas com pachos para a entrega de fármacos que são adequados para este propósito. Deve anotar-se que a administração transdérmica é particularmente utilizável para uma administração ininterrupta, uma vez que a substituição de um primeiro pacho exaurido pode ser feita vantajosamente aquando da colocação de um novo pacho, por exemplo sobre a superfície da pele imediatamente adjacente à do primeiro pacho exaurido e imediatamente antes da remoção deste primeiro pacho exaurido. Os problemas de interrupção do fluxo ou de falha de corrente não se pões portanto.

Além disto, a invenção diz respeito a uma construção do anticorpo biespecífico de cadeia singela CD19xCD3 para utilização num método de tratamento, melhoria ou eliminação da leucemia linfoblástica aguda (ALL) pediátrica, em que o referido anticorpo biespecífico de cadeia singela CD19xCD3 será preparado para administração a um doente pediátrico. A invenção também diz respeito à utilização de uma construção do anticorpo biespecifico de cadeia singela CD19xCD3 para a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento, melhoria ou eliminação da leucemia linfoblástica aguda (ALL) pediátrica. Portanto, a invenção presente também diz respeito a uma construção do anticorpo biespecifico de cadeia singela CD19xCD3 tal como se define neste documento, para o tratamento, melhoria ou eliminação da leucemia linfoblástica aguda (ALL) pediátrica. As concretizações descritas neste documento no contexto dos métodos farmacêuticos aplicam-se mutatis mutandis para a preparação da correspondente composição farmacêutica incluindo as construções de cadeia singela anti CD19xCD3 para administração a um doente pediátrico, em especial no tratamento, melhoria ou eliminação da leucemia linfoblástica aguda (ALL) pediátrica.

Preferivelmente, a referida leucemia linfoblástica aguda (ALL) pediátrica é uma leucemia linfoblástica aguda (ALL) pediátrica de linhagem B, preferivelmente uma leucemia linfoblástica aguda (ALL) pediátrica de precursor B, mais preferivelmente pró-B ALL pediátrica, pré-B ALL pediátrica ou ALL comum pediátrica (cALL). No caso mais preferido de todos, a ALL é cALL.

Numa concretização preferida das utilizações medicinais mencionadas, a referida ALL de precursor B é uma recaída de ALL e/ou uma ALL refractária ao tratamento convencional para a ALL, tal como a quimioterapia e/ou a HSCT.

Preferivelmente, a referida leucemia linfoblástica aguda (ALL) recai adentro dos três primeiros anos após o seu diagnóstico.

Noutra concretização preferida das utilizações medicinais mencionadas, a construção do anticorpo biespecifico de cadeia singela CD19xCD3 destina-se ao tratamento, melhoria ou eliminação da doença residual minima (MRD) num doente pediátrico com leucemia linfoblástica aguda (ALL). Preferivelmente, o doente pediátrico referido é positivo para MRD numa remissão hematológica completa.

Numa concretização preferida adicional das utilizações medicinais mencionadas, a administração do referido anticorpo biespecifico de cadeia singela CD19xCD3 transforma a leucemia linfoblástica aguda (ALL) pediátrica de um estado positivo para MRD a um estado negativo para MRD.

Preferivelmente, mede-se a MRD por detecção quantitativa das anormalidades citogenéticas individuais ou de transposições, tais como se definiram neste documento, utilizando uma análise por PCR e/ou por FACS. E um modo ainda mais preferido, o doente com ALL pediátrica denota um sinal de uma anormalidade citogenética acima do limite de detecção e/ou pelo menos um marcador por transposição, com uma sensibilidade >10~4.

Noutra concretização preferida das utilizações medicinais mencionadas, o período de tempo até à recaída molecular detectável pelos métodos de detecção indicados é mais longo do que 6 meses.

Noutra concretização preferida das utilizações medicinais mencionadas, as regiões variáveis correspondentes da cadeia pesada (VH) e as regiões variáveis correspondentes da cadeia leve (VL) na referida construção do anticorpo biespecífico de cadeia singela CD19xCD3 estão dispostas, a partir do terminal N e até ao terminal C, pela ordem VL (CD19)-VH (CD19)-VH(CD3)-VL(CD3) . Preferivelmente, a construção do referido anticorpo biespecífico de cadeia singela CD19xCD3 inclui uma sequência de aminoácidos tal como descrita na SEQ ID NO. 1, ou uma sequência de aminoácidos que seja pelo menos 90 %, preferivelmente 95 %, idêntica à SEQ ID NO. 1.

Noutra concretização preferida das utilizações medicinais mencionadas, um ciclo de tratamento é uma infusão contínua durante pelo menos quatro semanas, seguida por um intervalo de 2 semanas isento de tratamento.

Preferivelmente, a referida administração será repetida duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez vezes, depois de se ter determinado um estado negativo para MRD.

Noutra concretização, a administração é feita antes de uma transplantação com células estaminais alogénicas para transformar uma ALL num estado positivo para MRD, num estado negativo para MRD.

Numa concretização alternativa, a administração ocorre após uma transplantação com células estaminais alogénicas.

Noutra concretização preferida das utilizações medicinais preferidas, a construção do anticorpo biespecifico de cadeia singela CD19xCD3 será administrada a uma dose diária de entre 10 pg e 100 pg por metro quadrado de área superficial do corpo do doente.

Preferivelmente, administra-se a construção do anticorpo biespecifico de cadeia singela CD19xCD3 a uma dose diária de 15 pg a 30 pg por metro quadrado de área superficial do corpo do doente.

Noutra concretização das utilizações medicinais preferidas, a administração da construção do anticorpo biespecifico de cadeia singela CD19xCD3 substitui a transplantação com células estaminais alogénicas nos doentes pediátricos elegíveis para transplantação com células estaminais alogénicas.

As concretizações, definições e as explicações proporcionadas a propósito dos métodos farmacêuticos da invenção aplicam-se mutatis mutandis às utilizações medicinais da construção do anticorpo biespecifico de cadeia singela CD19xCD3 descritas neste documento.

As Figuras mostram:

Figura 1: Modo de actuação do anticorpo biespecifico de cadeia singela CD19xCD3 (CD19xCD3 bscab). 0 anticorpo biespecifico de cadeia singela CD19xCD3 (SEQ ID NO. 1) re-direcciona células citotóxicas positivas para CD3 para eliminarem células de leucemia linfoblástica aguda portadoras do antigénio CD19 .

Figura 2: Falhanço da terapia convencional de ALL num doente com 7 anos de idade sofrendo de ALL comum. Um ano depois da HSCT, o doente pediátrico sofreu uma segunda recaída a nível da medula óssea e recebeu quimioterapia subsequente incluindo 1 ciclo de Clofarabina/Ciclofosfamida/VPl6, 2 ciclos de Amsacrina, VP16, prednisona e 1 ciclo de Melfalan/Citarabina. Apesar desta quimioterapia agressiva, o doente apresentava uma doença morfológica persistente ao longo de todo o tratamento, tal como demonstrada pelos elevados níveis de MRD. 0 eixo do yy esquerdo indica os valores de MRD em % determinados por FACS, o eixo dos yy direito indica os valores de MRD em % determinados por PCR (de 10° a <1CT4) , o eixo dos xx indica os dias a partir da primeira HSCT; veja-se o Exemplo 4.

Figura 3: Tratamento bem-sucedido do doente pediátrico por administração do anticorpo biespecífico de cadeia singela CD19xCD3 (CD19xCD3 bscab; SEQ ID NO. 1), tal como demonstrado por MRD antes, durante e depois do tratamento com o anticorpo referido. Depois do falhanço da terapia convencional para ALL, tratou-se o doente com uma infusão contínua de 15 pg/m2 de anticorpo biespecífico de cadeia singela CD19xCD3 (SEQ ID NO. 1) durante 5 semanas. Aquando do tratamento com o anticorpo, conseguiu atingir-se um estado negativo para MRD. Em Outubro de 2008, isto é 2 semanas depois de terminado o tratamento com o anticorpo biespecífico de cadeia singela CD19xCD3 (dia 0 nas Figuras 3 a 5) , aplicou-se ao doente uma segunda HSCT a partir da sua mãe haploidêntica, utilizando um regime de preparação não mieloablativo constituído por Clofarabina, Tiotepa e melfalan (Lang) indicado pela barra de acondicionamento. O eixo dos yy esquerdo indica os valores de MRD em % determinados por FACS, o eixo dos yy direito indica os valores de MRD em % determinados por PCR (de 10° a <1CT4) , o eixo dos xx indica os dias a partir da primeira HSCT; o dia "0" indica o dia da segunda HSCT (após o tratamento com anticorpo); veja-se o Exemplo 4.

Figura 4: Desenvolvimento ao longo do tempo das contagens de blastos antes e depois do tratamento com o anticorpo biespecífico de cadeia singela CD19xCD3 (CD19xCD3 bscab; SEQ ID NO. 1). Uma análise da medula óssea no dia 10 do tratamento com o anticorpo biespecífico de cadeia singela CD19xCD3 revelou uma eliminação completa dos blastos da medula óssea (MRD < 1CT 4) pelo anticorpo. Outra análise de BM no final do tratamento com o anticorpo biespecífico de cadeia singela CD19xCD3 no dia 35 confirmou a completa ausência de blastos leucémicos na medula óssea (MRD <1CT4). O eixo dos yy esquerdo indica as contagens de blastos por citometria de fluxo, em %, o eixo dos yy direito indica a contagem de blastos por microscopia, em %, o eixo dos xx indica dias a partir da HSCT, indicando os dias negativos os dias em relação à primeira HSCT, indicando o dia "0" o dia da segunda HSCT (depois do tratamento com o anticorpo) e indicando os dias positivos os dias depois da segunda HSCT.

Figura 5: Diminuição dos valores de MRD por tratamento com o anticorpo biespecifico de cadeia singela CD19xCD3 (CD19xCD3 bscab; SEQ ID NO. 1) . Por tratamento com o anticorpo, conseguia atingir-se um estado negativo para MRD. A partir de Junho de 2009, o doente continua em estado negativo para MRD em remissão molecular completa. O eixo dos yy esquerdo indica a % de MRD por FACS, o eixo dos yy direito indica a MRD por PCR (de 10° a <10~4) , o eixo dos xx indica dias a partir da HSCT, indicando os dias negativos os dias a partir da primeira HSCT e indicando "0" o dia da segunda HSCT e os dias positivos indicando os dias após a segunda HSCT. A invenção é complementarmente ilustrada pelos seguintes exemplos:

Exemplos: 1. Anticorpo biespecifico de cadeia singela CDl9xCD3 A geração, expressão e a actividade citotóxica do anticorpo biespecifico de cadeia singela CD19xCD3 foi descrita no WO 99/54.440. Mostram-se as correspondentes sequências de aminoácidos e de ácidos nucleicos para o

anticorpo biespecífico de cadeia singela CD19xCD3 respectivamente nas SEQ ID Nos. 1 e 2. As regiões VH e VL do domínio de ligação a CD3 do anticorpo biespecífico de cadeia singela CD19xCD3 estão descritas respectivamente nas SEQ ID Nos. 7 a 10, enquanto as regiões VH e VL do domínio de ligação a CD19 do anticorpo biespecífico de cadeia singela CD19xCD3 estão descritas respectivamente nas SEQ ID Nos 3 a 6. 2. Análise fenotipica dos linfócitos e análise de quimerismo

Para a análise fenotipica dos linfócitos e para a análise do quimerismo, obtiveram-se amostras do sangue do doente antes, durante e depois do tratamento com o anticorpo biespecífico de cadeia singela CD19xCD3, em tubos de recolha de amostras contendo EDTA. Determinaram-se os números absolutos de linfócitos nas amostras de sangue por análise diferencial do sangue numa Advia. Contrastaram-se os linfócitos utilizando anticorpos marcados por fluorescência, dirigidos contra CD3, CD4, CD8, CD19 e CD56 (todos eles obtidos junto da Becton-Dickinson, Heidelberga, Alemanha). Levaram-se a cabo as análises das células marcadas e a recolha de dados num FACSCalibur (Becton-Dickinson) .

3. Detecção da MRD

Para a detecção da MRD, utilizou-se quer um ensaio baseado na reacção da polimerase em cadeia (PCR) (Bader et al. , loc. cit.), quer uma análise por FACS. Em suma, isolou-se o ADN com um estojo DNeasy (Blood&Tissue Kit) (Qiagen GmbH, Hilden, Alemanha). As transposições de genes de imunoglobulina e de receptores de células T como alvos baseados em PCR foram recentemente demonstradas como sendo marcadores estáveis para monitorizar a MRD na leucemia linfoblástica aguda após transplantação de células estaminais (Kreyenberg, Leukemia, 2009) . 4. Relatórios dos casos 4.1 Relatório do caso para o Doente 1 A este doente com 7 anos de idade foi diagnosticada uma ALL comum CD10+ com alto risco (positiva para CD19-, CD34; diminuída para CD45; transposição de TCR; negativa para o SNC) em 2004. Depois do tratamento, sofreu uma recaída na medula óssea em Junho de 2006 e foi tratado de acordo com o estudo ALL-REZ BFM no seu ramo S3. Depois de dois ciclos de quimioterapia, o doente apresentava doença persistente e conseguia uma remissão completa após 3 tratamentos com clofarabina. Em 2007, foi-lhe feita uma HSCT alogénica a partir de um doador não relacionado com 9 de 10 alelos HLA emparelhados, após um acondicionamento por irradiação do corpo inteiro, e com Etoposido. Um ano depois da HSCT, sofreu uma nova recaída na medula óssea e foi-lhe administrada quimioterapia subsequente incluindo 1 ciclo de

Clofarabina/Ciclofosfamida/VPl6 (Nobuko), 2 ciclos de Amsacrina, VP16, prednisona (Hamburgo) e 1 ciclo de Melfalan/Citarabina; veja-se a Figura 2. Apesar desta quimioterapia agressiva, o doente apresentava doença morfológica persistente ao longo da totalidade do tratamento, tal como era evidente dos valores elevados de MRD na Figura 2. Foi então tratado por utilização de compaixão, com uma infusão continua de 15 pg/m2 do anticorpo biespecifico de cadeia singela CD19xCD3 (blinatumomab; SEQ ID NO. 1) durante 5 semanas; veja-se a Figura 3. Uma análise em série das populações de linfócitos antes (dia 0) e durante o tratamento com o anticorpo mencionado denotou uma expansão impressionante dos linfócitos T CD8+, não se tendo notado nenhuma alteração nas células T CD4+ e das células NK CD56+. Com o tratamento usando o anticorpo conseguiu atingir-se um estado negativo para MRD. Uma análise concomitante do quimerismo revelou um quimerismo 100 % do doador. Tal como se mostra na Figura 4, uma análise da medula óssea no 102 dia do tratamento com o anticorpo biespecifico de cadeia singela CD19xCD3 revelou uma eliminação completa dos blastos da medula óssea (MRD < 1CT4). Outra análise da medula óssea no final do tratamento com o anticorpo biespecifico de cadeia singela CD19xCD3 denotou mais uma vez uma ausência completa de blastos leucémicos na medula óssea (MRD <1CU4). Representa-se a série de análises da MRD antes, durante e depois do tratamento com o anticorpo referido na Figura 5. Antes do tratamento com o anticorpo, o doente pediátrico tinha um prognóstico muito desfavorável e não era elegivel para uma HSCT devido ao seu mau estado clínico. Por tratamento com o anticorpo, conseguiu-se atingir um estado negativo para MRD. Para além de sinais passageiros e discretos de ataxia, não foram observados quaisquer efeitos colaterais importantes, e não se viram nenhuns sinais de GvHD apesar da expansão impressionante dos linfócitos T CD8+ derivados do doador. Em Outubro de 2008, 2 semanas depois do fim do tratamento com o anticorpo biespecífico de cadeia singela CD19xCD3 (isto é, no dia 0 das Figuras 3 a 5) , foi-lhe feita uma nova HSCT a partir da sua mãe haploidênt ica, utilizando um regime preparatório não mieloablativo constituído por Clofarabina, Tiotepa e melfalan (Lang). Em Novembro de 2009, o doente manteve a sua remissão completa estando negativo para MRD. 4.2 Relatório do caso do Doente 2

Foi diagnosticada a este doente com quinze anos de idade uma ALL de precursor B com cromossoma Filadélfia e positiva para CD19 B-precursor em Abril de 2001. Depois da quimioterapia, ele recebeu uma HSCT de um irmão idêntico em HLA em Outubro de 2001, depois de um acondicionamento com irradiação de corpo inteiro de 12 Gy e etoposido. Em 2002, foi diagnosticada uma recaída na medula óssea e conseguiu-se nova remissão com matinib e quimioterapia. Recebeu então uma segunda HSCT de um doador não relacionado idêntico em HLA em Outubro de 2004. Em Março de 2008, foi diagnosticada uma segunda recaída e foi tratado com quimioterapia de pequena dose e Dasatinib devido a resistência a Imatinib.

Depois de quimioterapia adicional com Clofarabina e Citosina/Arabinosido, conseguiu uma remissão molecular e recebeu uma terceira HSCT alogénica do seu pai haploidêntico com desemparelhamento de HLA em 3 de 6 alelos e um tratamento apos o transplante com Dasatinib. Devido a hemorragia gastrointestinal e a cardiomiopática dilatativa, interrompeu-se o tratamento com Dasatinib 5 meses depois da transplantação. Em Abril de 2009, foi diagnosticada uma recaída combinada no sistema nervoso central (SNC) com 7x109/L blastos no SNC e 3 % de blastos na medula óssea. Tratou-se então o doente com Nilotinib, quimioterapia intratecal e irradiação fraccionada do SNC com 18 Gy. Três meses depois deste tratamento, a medula óssea do doente continuava positiva para MRD a um nível de 1,1 xlCT3 enquanto o SNC estava isento de blastos. Uma análise do quimerismo do sangue periférico revelou uma hematopoiese completamente derivada do doador proveniente do seu pai haploidêntico.

Tratou-se então o doente sob utilização de compaixão com o agente único blinatumomab a 15 pg/m2/dia durante 4 semanas por infusão contínua, sem nenhuns efeitos colaterais. Uma aspiração da medula óssea no final do tratamento mostrou uma remissão completa sem MRD detectável na medula, <lxlCh4. Tal como o doente 1, o doente 2 não denotou quaisquer sinais de GvHD durante nem depois do tratamento com blinatumomab. Duas semanas depois do fim do tratamento com blinatumomab, o doente sofreu uma reacção hemolítica passageira despoletada por uma infecção. O doente 2 está neste momento sem recaída, quatro semanas depois do tratamento. Ele está bom e tem ido à escola. 4.3 Resumo

Os fármacos disponíveis até à data para o tratamento da ALL têm uma pequena especificidade e afectam diversas outras células, originando efeitos colaterais severos tais como uma imunossupressão, aplasia da medula óssea, mucosite, neuropatia, cardiotoxicidade, e alopecia. São portanto urgentemente necessárias novas vias alvejantes com menores efeitos colaterais. Além disto, em alguns doentes, desenvolvem-se clones de ALL com uma resistência completa à quimioterapia convencional, em especial os clones que aparecem depois da HSCT, de tal modo que são desejáveis fármacos que tenham um modo de actuação distinto. A eficácia da toxicidade dependente do anticorpo através dos receptores Fc das células NK e de granulócitos, em combinação com a quimioterapia, era passível de ser demonstrada para a ALL pediátrica utilizando o anticorpo quimérico monoclonal rituximab. Correntemente, o blinatumomab é o único anticorpo em ensaios clínicos que permite a mobilização de células T citotóxicas que alvejem CD19 em linfomas de células B sem ser de Hodgkin e em leucemias linfáticas. Considera-se que as células T possuem uma citotoxicidade potencial maior do que as células imunológicas que são mobilizadas pelos anticorpos monoclonais convencionais.

Supõe-se que o efeito GvL alogénico é uma das principais razões de ser da eficácia anti-leucémica da HSCT. Infelizmente, a ocorrência de GvL está muitas vezes associada à da GvHD, que é ainda uma das principais causas de morbidez e de mortalidade após uma HSCT alogénica. Portanto, a indução da GvL na ausência de GvHD é um tópico de investigação intensiva. Uma via para a indução de um efeito GvL é a infusão de linfócitos de um doador (DLI) . Embora a DLI seja muito eficaz no tratamento de CML, ela é menos eficaz no tratamento após o transplante de recaídas de ALL e leva amiúde à ocorrência de GvHD crónica com um prejuízo significativo para a qualidade de vida das crianças afectadas.

Uma via possível para se induzir GvL sem GvHD é a activação in vivo de linfócitos T derivados de um doador depois da HSCT, utilizando pequenas doses do anticorpo mobilizador de células T blinatumomab, que consegue dirigir os linfócitos T contra os blastos de ALL positivos para CD19 do doente. Este anticorpo mostrou uma actividade anti-linfoma e anti-leucémica impressionante na situação autóloga, mas nunca foi testado em recaídas de ALL depois da HSCT nem em crianças. Na situação autóloga, forma induzidas remissões moleculares em 13 de 16 doentes adultos avaliáveis com ALL positiva para MRD. Ambos os doentes pediátricos descritos acima mostraram uma resposta anti-leucémica impressionante depois do início do tratamento. Em ambos os casos, a MRD desceu para menos do que o teor detectável sem quaisquer sinais de GvHD, apesar de uma expansão brutal de células T derivadas do doador. Isto poderá ser devido ao facto de que a acção do blinatumomab é independente da apresentação regular de antigénio de péptido, e pode não envolver a mobilização do reportório de células T néscias.

Teores de dose do blinatumomab tão pequenos como 15 pg/m2 ao dia, são suficientes para induzir uma expansão dos linfócitos T derivados do doador e para eliminar os blastos de ALL até teores inferiores aos detectados na MRD. Isto sublinha que a mobilização das células Té muito diferente do modo de acção dos anticorpos monoclonais convencionais, de que são necessárias doses muito maiores e que não mobilizam células T citotóxicas devido a não terem receptores Fc. 0 blinatumomab foi bem tolerado em ambos os doentes provocando apenas fadiga, uma ataxia ligeira e um tremor do grau 1-2 da CTCAE. No doente 2, não se viram nenhuns efeitos colaterais apesar dos tratamentos prévios intensivos a que havia sido sujeito. A infusão contínua endovenosa durante diversas semanas foi bem aceite por ambos os doentes pediátricos.

Desta primeira experiência clínica com a ALL pediátrica, os inventores concluem que o blinatumomab é bem tolerado e pode induzir rapidamente remissões hematológicas completas e negativas para MRD em crianças com doença refractária em relação à terapia, após múltiplas recaídas da ALL com precursor B positiva para CD19após uma HSCT alogénica. É digno de nota que nenhum dos doentes mostrava nenhuns sinais de GvHD apesar de uma expansão dos linfócitos T provenientes do doador, mesmo no caso de uma transplantação proveniente de um haploidêntico com desemparelhamentos.

Estes primeiros resultados indicam que o tratamento de doentes com a leucemia linfoblástica aguda (ALL) pediátrica pelo anticorpo biespecifico de cadeia singela CD19xCD3 é capaz de eliminar por completo as células de leucemia linfoblástica aguda dos corpos dos doentes pediátricos. De um modo importante, este tratamento resultou não apenas numa remissão hematológica completa mas também numa remissão molecular completa, na medida em que se transformou uma leucemia linfoblástica aguda (ALL) positiva doença residual minima (MRD) até um estado negativo para MRD. 0 tratamento foi bem tolerado. Nestas condições, a administração do anticorpo biespecifico de cadeia singela CD19xCD3 descrito neste documento proporciona uma opção de tratamento melhor para a leucemia linfoblástica aguda (ALL) pediátrica, em especial para uma ALL refractária à quimioterapia e/ou a uma HSCT alogénica, e/ou uma recaida de ALL.

Podem resumir-se estes resultados em poucas linhas, tal como se segue: • Foram tratados dois doentes pediátricos, com base em compaixão. • Estado actual negativo para MRD nos doentes referidos. • Ausência de manifestação de efeitos adversos importantes (AE). • Todos os AE foram passageiros, sem ser necessário interromper o tratamento.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

<110> Micromet AG <120> Novo tratamento da leucemia linfoblástica aguda pediátrica <130> R2201 PCT S3 <150> 61/112.323 <151> 2008-11-07 <150> 61/221.269 <151> 2009-06-29 <150> 61/183.291 <151> 2009-06-02 <160> 22 <170> Patente na versão 3.3

<210> 1 <211> 498 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <221> fonte <223> /nota="Descrição da sequência artificial: Anticorpo biespecifico de cadeia singela CD19xCD3" <4 0 0> 1

Asp lie Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 15 10 15

Gin Arg Ala Thr He Ser Cys Lys Ala Ser Gin Ser Val Asp Tyr Asp 20 25 30

Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gin Gin lie Pro Gly Gin Pro Pro 35 40 45

Lys Leu Leu lie Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser Gly lie Pro Pro 50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn He His 65 70 75 80

Pro Val Glu Lys Val Asp Ala Ala Thr Tyr His Cys Gin Gin Ser Thr 85 90 95

Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu He Lys Gly 100 105 110

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gin Val 115 120 125

Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser Ser Val 130 135 140

Lys lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr Trp Met 145 150 155 160

Asn Trp Val Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp lie Gly Gin 165 170 175 lie Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys Gly 180 185 190

Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gin 195 200 205

Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg 210 215 220

Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp 225 230 235 240

Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp 245 250 255 lie Lys Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser 260 265 270

Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe,Thr Arg Tyr Thr 275 280 285

Met His Trp Val Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp lie Gly 290 295 300

Tyr lie Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gin Lys Phe Lys 305 310 315 320

Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met 325 330 335

Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 340 345 350

Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 355 360 365

Thr Leu Thr Val Ser Ser Val Glu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly 370 375 380

Ser Gly Gly Ser Gly Gly. Val Asp Asp lie Gin Leu Thr Gin Ser Pro 385 390 395 400

Ala lie Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg 405 410 415

Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Ser Gly 420 425 430

Thr Ser Pro Lys Arg Trp lie Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly 435 440 445

Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu 450 455 460

Thr He Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin 465 470 475 480

Gin Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu 485 490 495

Leu Lys

<210> 2 <211> 1.494 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <221> fonte <223> /nota="Descrição de sequência artificial: Anticorpo biespecífico de cadeia singela CD19xCD3" <400> 2 gatatccagc tgacccagtc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 60 atctcctgca aggccagcca aagtgttgat tatgatggtg atagttattt gaactggtac 120 caacagattc caggacagcc acccaaactc cteatctatg atgcatccaa tctagtttct 180 gggatcccac ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240 cctgtggaga aggtggatgc tgcaacctat cactgtcagc aaagtactga ggatccgtgg 300 acgttcggtg gagggaccaa gctcgagatc aaaggtggtg gtggttctgg cggcggcggc 360 tccggtggtg gtggttctca ggtgcagctg cagcagtctg gggctgagct ggtgaggcct 420 gggtcctcag tgaagatttc ctgcaaggct tctggctatg cattcagtag ctactggatg 480 aactgggtga agcagaggcc tggacagggt cttgagtgga ttggacagat ttggcctgga 540 gatggtgata ctaactacaa tggaaagttc aagggtaaag ccactctgac tgcagacgaa 600 tcctccagca cagcctacat gcaactcagc agcctagcat ctgaggactc tgcggtctat 660 ttctgtgcaa gacgggagac tacgacggta ggccgttatt actatgctat ggactactgg 720 ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctcc ggaggtggtg gatccgatat caaactgcag 780 cagtcagggg ctgaactggc aagacctggg gcctcagtga agatgtcctg caagacttct 840 ggctacacct ttactaggta cacgatgcac tgggtaaaac agaggcctgg acagggtctg 900 gaatggattg gatacattaa tcctagccgt ggttatacta attacaatca gaagttcaag 960 gacaaggcca cattgactac agacaaatcc tccagcacag cctacatgca actgagcagc 1020 ctgacatctg aggactctgc agtctattac tgtgcaagat attatgatga tcattactgc 1080 cttgactact ggggccaagg caccactctc acagtctcct cagtcgaagg tggaagtgga 1140 ggttctggtg gaagtggagg ttcaggtgga gtcgacgaca ttcagotgac ccagtctcca 1200 gcaatcatgt crgcatctcc aggggagaag gtcaccatga cctgcagagc cagttcaagt 1260 gtaagttaca tgaactggta ccagcagaag tcaggcacct cccccaaaag atggatttat 1320 gacacatcca aagtggcttc 'tggagtccct tatcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc 1380 tcatactctc tcacaatcag cagcatggag gctgaagatg ctgccactta ttactgccaa 1440 cagtggagta gtaacccgct cacgttcggt gctgggacca agctggagct gaaa 1494

<210> 3 <211> 124 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <221> fonte

<223> /nota="Descrição de sequência artificial: VH anti CD19" <400> 3

Trp Met Asn Trp Vai Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45

Gly Gin lie Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Gin Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Vai Tyr Phe Cys 85 90 95

Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr Vai Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp 100 105 110

Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser 115 120

<210> 4 <211> 372 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <221> fonte

<223> /nota="Descrição de sequência artificial: VH anti CD19" <400> 4 caggtgcagc tgcagcagtc tggggctgag ctggtgaggc ctgggtcctc agtgaagatt 60 tcctgcaagg cttctggcta tgcattcagt agctactgga tgaactgggt gaagcagagg 120 cctggacagg gtcttgagtg gattggacag atttggcctg gagatggtga tactaactac 180 aatggaaagt tcaagggtaa agccactctg actgcagacg aatcctccag cacagcctac 240 atgcaactca gcagcctagc atctgaggac tctgcggtct atttctgtgc aagacgggag 300 actacgacgg taggccgtta ttactatgct atggactact ggggccaagg gaccacggtc 360 accgtctcct cc 372

<210> 5 <211> 111 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <221> fonte

<223> /nota="Descrição de sequência artificial: VL anti CD19" <400> 5

Asp lie Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 15 10 15

Gin Arg Ala Thr lie Ser Cys Lys Ala Ser Gin Ser Val Asp Tyr Asp 20 25 30

Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gin Gin lie Pro Gly Gin Pro Pro 35 40 45

Lys Leu Leu lie Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser Gly lie Pro Pro 50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn lie His 65 70 75 80

Pro Val Glu Lys Val Asp Ala Ala Thr Tyr His Cys Gin Gin Ser Thr 85 90 95

Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 110

<210> 6 <211> 333 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <221> fonte

<223> /nota="Descrição de sequência artificial: VL anti CD19" <400> 6 gatatccagc tgacccagtc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 60 atctcctgca aggccagcca aagtgttgat tatgatggtg atagttattt gaactggtac 120 caacagattc caggacagcc acccaaactc ctcatctatg atgcatccaa tctagtttct 180 gggatcccac ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240 cctgtggaga aggtggatgc tgcaacctat cactgtcagc aaagtactga ggatccgtgg 300 acgttcggtg gagggaccaa gctcgagatc aaa 333 <213> Sequência Artificial <22 0>

<210> 7 <211> 119 <212> PRT <221> fonte <223> VH anti CD3 <400> 7

Asp lie Lys Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr-Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30

Thr Met His Trp Val Lys Gin Arg Pro Gly Gin'Gly Leu Glu Trp lie 35 40 45

Gly Tyr lie Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gin Lys Phe 50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Tyr Tyr' Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110

Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115

<210> 8 <211> 357 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <221> fonte

<223> /nota="Descrição de sequência artificial: VH anti CD3" <400> 8 gatatcaaac tgcagcagtc aggggctgaa ctggcaagac ctggggcctc agtgaagatg 60 tcctgcaaga cttctggcta cacctttact aggtacacga tgcactgggt aaaacagagg 120 cctggacagg gtctggaatg gattggatac attaatccta gccgtggtta tactaattac 180 aatcagaagt tcaaggacaa ggccacattg actacagaca aatcctccag cacagcctac 240 atgoaactga gcàgcctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc aagatattat 300 gatgatcatt actgccttga ctactggggc caaggcacca ctctcacagt ctcctca 357

<210> 9 <211> 106 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <221> fonte

<223> /nota="Descrição de sequência artificial: VL anti CD3" <400> 9

Asp lie Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ala lie Met Ser Ala Ser Pro Gly 15 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30

Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp lie Tyr 35 40 45

Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr lie Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr 85 90 95

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105

<210> 10 <211> 318 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <22 0> <221> fonte <4 0 0> 10 gacattcagc tgacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60 atgacctgca gagccagttc aagtgtaagt tacatgaact ggtaccagca gaagtcaggc 120 acctccccca aaagatggat ttatgacaca tccaaagtgg cttctggagt cccttatcgc 180 ttcagtggca gtgggtctgg gacctcatac tctctcacaa tcagcagcat ggaggctgaa 240 gatgctgcca cttattactg ccaacagtgg agtagtaacc cgctcacgtt cggtgctggg 300 accaagctgg agctgaaa 318 <213> sequência artificial <22 0>

<210> 11 <211> 15 <212> PRT <221> fonte <223> /nota="Descrição de sequência artificial: anti- CD19 LI" <4 0 0> 11

Lys Ala Ser Gin Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Leu Asn 1 5 . 10 15

<210> 12 <211> 7 <212> PRT <213> sequência artificial <22 0> <221> fonte <223> /nota="Descrição de sequência artificial: anti- CD19 L2" <4 0 0> 12

Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser 1 5 <210> 13 <213> sequência artificial <22 0> <211> 9

<212> PRT <221> fonte <223> /nota="Descrição de sequência artificial: anti- CD19 L3" <4 0 0> 13

Gin Gin Ser Thr Glu Asp Pro Trp Thr 1 5

<210> 14 <211> 5 <212> PRT <213> sequência artificial <22 0> <221> fonte <223> /nota="Descrição de sequência artificial: anti- CD19 HI" <4 0 0> 14

Ser Tyr Trp Met Asn 1 5 <210> 15 <211> 17 <213> sequência artificial <22 0>

<212> PRT <221> fonte <223> /nota="Descrição de sequência artificial: anti- CD19 H2" <4 0 0> 15

Gin lie Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 16 <211> 15 <212> PRT <213> sequência artificial <22 0> <221> fonte <223> /nota="Descrição de sequência artificial: anti- CD19 H3" <4 0 0> 16

Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr 15 10 15 <210> 17 <211> 5

<212> PRT <213> sequência artificial <22 0> <221> fonte <223> /nota="Descrição de sequência artificial: anti- CD3 HI" <4 0 0> 17

Arg Tyr Thr Met His 1 5

<210> 18 <211> 17 <212> PRT <213> sequência artificial <22 0> <221> fonte <223> /nota="Descrição de sequência artificial: anti- CD3 H2" <4 0 0> 18

Tyr lie Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gin Lys Phe Lys 15 10 15

Asp <210> 19 <211> 10

<212> PRT <213> sequência artificial <22 0> <221> fonte <223> /nota="Descrição de sequência artificial: anti- CD 3 H3" <4 0 0> 19

Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr 1 5 10

<210> 20 <211> 10 <212> PRT <213> sequência artificial <22 0> <221> fonte <223> /nota="Descrição de sequência artificial: anti- CD3 LI" <400> 20

Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn 15 10 <210> 21 <211> 7 <213> sequência artificial <22 0>

<212> PRT <221> fonte <223> /nota="Descrição de sequência artificial: anti- CD3 L2" <400> 21

Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser 1 5

<210> 22 <211> 9 <212> PRT <213> sequência artificial <22 0> <221> fonte <223> /nota="Descrição de sequência artificial: anti- CD 3 L3" <400> 22

Gin Gin Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr 1 5

Lisboa, 18 de Março de 2015.

Claims (19)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Uma construção de um anticorpo biespecífico de cadeia singela CD19xCD3 para utilização num método para o tratamento, a melhoria ou a eliminação de uma leucemia linfoblástica aguda (ALL) pediátrica, num doente com ALL pediátrica.
2. 2. A construção para a utilização da reivindicação 1, em gue a referida leucemia linfoblástica aguda (ALL) pediátrica seja uma leucemia linfoblástica aguda (ALL) pediátrica de linhagem B, preferivelmente uma leucemia linfoblástica aguda (ALL) de precursor B, mais preferivelmente uma ALL pró-B pediátrica, uma ALL pré-B pediátrica ou uma ALL comum (cALL).
3. 3. A construção para a utilização da reivindicação 1 ou da 2, em gue a leucemia linf oblást ica aguda (ALL) referida seja ALL refractária e/ou uma recaída de ALL.
4. 4. A construção para a utilização de gualguer uma das reivindicações 1 a 3, em gue o método se destine ao tratamento, melhoria ou eliminação da doença residual mínima (MRD) num doente com ALL pediátrica.
5. 5. A construção para a utilização da reivindicação 4, em gue o referido doente com ALL pediátrica seja positivo para MRD numa remissão hematológica completa.
6. 6. A construção para a utilização da reivindicação 4 ou da 5, em que a MRD seja medida por detecção quantitativa de pelo menos uma das anormalidades citogenéticas ou das transposições seleccionadas de entre o conjunto constituído por: t (12;21) [TEL-AML1] ; t (1;19;) [E2A-PBX]; t (4;11) [AF4-MLL] ; t(9;22)[BCR-ABL]; hiperdiploidia ou trissomias dos cromossomas 4, 10, e 17; hipodiploidia; transposições nos genes de imunoglobulina; e transposições nos genes dos receptores de células T (TCR).
7. 7. A construção para a utilização de qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que as regiões variáveis correspondentes da cadeia (VH) e as regiões variáveis correspondentes da cadeia leve (VL) na construção do referido anticorpo biespecífico de cadeia singela CD19xCD3 estejam dispostas, do terminal N para o terminal C, pela ordem VL(CD19)-VH(CD19)-VH(CD3)-VL (CD3) .
8. 8. A construção para a utilização da reivindicação 7, em que a construção do referido anticorpo biespecifico de cadeia singela CD19xCD3 inclua uma sequência de aminoácidos tal como a descrita na SEQ ID NO. 1, ou uma sequência de aminoácidos que seja pelo menos 90 %, preferivelmente 95 %, idêntica à SEQ ID NO. 1.
9. 9. A construção para a utilização de qualquer uma das reivindicações 1 a 8, em que composição farmacêutica que inclua a construção do anticorpo biespecifico de cadeia singela CD19xCD3 se destine a ser administrada por infusão continua durante pelo menos quatro semanas, seguidas por um intervalo de 2 semanas isento de tratamento.
10. 10. A construção para a utilização da reivindicação 9, em que a administração referida se destine a ser repetida pelo menos duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez vezes, depois de se haver determinado um estado negativo para MRD.
11. 11. A construção para a utilização da reivindicação 9 ou da 10, em que o método seja aplicado antes de uma transplantação de células estaminais alogénicas (HSCT) , para transformar uma ALL positiva para MRD, num estado negativo para MRD.
12. 12. A construção para a utilização da reivindicação 9 ou da 10, em que o método seja aplicado depois de uma transplantação de células estaminais alogénicas (HSCT).
13. 13. A construção para a utilização da reivindicação 12, em que a construção do anticorpo biespecifico de cadeia singela CD19xCD3 induza um efeito de enxerto contra a leucemia (GvL).
14. 14. A construção para a utilização de qualquer uma das reivindicações 1 a 13, em que a construção do anticorpo biespecifico de cadeia singela CD19xCD3 seja administrada a uma dose diária de 10 pg a 100 pg por metro quadrado de área superficial do corpo do doente.
15. 15. A construção para a utilização de qualquer uma das reivindicações 1 a 13, em que a construção do anticorpo biespecifico de cadeia singela CD19xCD3 seja administrada a uma dose diária de 15 pg a 30 pg por metro quadrado de área superficial do corpo do doente.
16. 16. A construção para a utilização de qualquer uma das reivindicações 1 a 13, em que a construção do anticorpo biespecifico de cadeia singela CD19xCD3 seja administrada a uma dose diária de 15 pg, 30 pg, 60 pg, ou 90 pg por metro quadrado de área superficial do corpo do doente.
17. 17. A construção para a utilização de qualquer uma das reivindicações 1 a 13, em que a construção do anticorpo biespecífico de cadeia singela CD19xCD3 seja administrada a uma dose de 5 pg no ou nos primeiros dias, seguindo-se uma administração de 15 pg durante os dias seguintes, e seguindo-se uma administração de 30 ou 45 pg, por metro quadrado de área superficial do corpo do doente, como dose diária durante o período remanescente, de um total de 4 semanas.
18. 18. A construção para a utilização da reivindicação 17, em que as duas doses iniciais sejam administradas durante 2, 3, 4, 5, 6, ou 7 dias, ou mesmo durante mais tempo.
19. 19. A construção para a utilização da reivindicação 1 ou 2, em que o doente referido seja não elegível para uma transplantação de células estaminais alogénicas. Lisboa, 18 de Março de 2015.