MX2011002931A

MX2011002931A - Nuevo tratamiento de leucemia linfoblastica aguda pediatrica.

Info

Publication number: MX2011002931A
Application number: MX2011002931A
Authority: MX
Inventors: Gerhard Zugmaier
Original assignee: Micromet Ag
Priority date: 2008-11-07
Filing date: 2009-11-06
Publication date: 2011-04-11
Also published as: BRPI0921341A2; EP2918604B1; HK1215258A1; DK2918604T3; CY1116160T1; SG195549A1; HUE025452T2; ES2535257T3; HUE036922T2; DK3330293T3; DK2344539T3; EP2344539B1; EP2918604A1; JP2012508163A; RU2018144313A3; AU2009313039A1; SI2918604T1; NZ591312A; NO2918604T3; CN102209729A

Abstract

La presente invención se relaciona con un método para el tratamiento, mejora o eliminación de la leucemia linfoblástica aguda (ALL) pediátrica, el método comprende la administración de una composición farmacéutica que comprende un constructo de un anticuerpo biespecífico de una sola cadena CD19xCD3 a un paciente con ALL pediátrica en necesidad del mismo.

Description

NUEVO TRATAMIENTO DE LEUCEMIA LINFOBLASTICA AGUDA PEDIÁTRICA La presente invención se relaciona con un método para el tratamiento, · mejora o eliminación de la leucemia linfoblástica aguda (ALL) pediátrica, el método comprende la administración de una composición farmacéutica que comprende un constructo de un anticuerpo, biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 a un paciente con ALL pediátrica en necesidad del mismo.

Con el tratamiento actual de la ALL de la niñez, las proporciones de supervivencia libres de evento son de aproximadamente 75%. Por lo tanto, la recaída es todavía frecuente. Los problemas en el manejo de la recaída de la ALL son la resistencia de las células leucémicas y la tolerancia reducida de los pacientes a . una segunda ronda de tratamiento después de haber recibido ya la terapia intensiva de línea frontal, resultando en una proporción de remisión menor, así como en una incidencia mayor de la recaída posterior y en un desenlace total inferior.' La poliquimioterapia intensificada es por lo tanto, actualmente esencial para la inducción de una segunda remisión completa. Dependiendo de una variedad de factores de pronóstico, la remisión puede mantenerse con quimioterapia y con radiación craneal sola o con la intensificación del tratamiento por el transplante de las células germinales (Henze G, von Stackelberg A, Relapsed acute lymphoblastic leukemia. En: Childhood Leukemias, C-H Pui ed. Cambridge: Cambridge Uni ersity Press; 2006, p. 473-486) .

Aunque se ha hecho un progreso tremendo en el tratamiento de niños con leucemia linfoblástica aguda (ALL) (véase, por ejemplo, Moricke et al., Blood 111 (2008), p. 4477; Moghrabi et al., Blood 109 (2007), p. 896), la ALL con recaída es todavía la cuarta malignidad pediátrica más común (Gaynon, Cáncer 82 (1998), p. 1387) . Especialmente para pacientes con una recaída inicial de la médula ósea en el transcurso de tres años del diagnóstico, la terapia para estos pacientes es insatisfactoria y el transplante de las células germinales alogenéicas es el único procedimiento curativo conocido hasta ahora. La recaída quimiorresistente después del transplante de las células germinales hematopoyéticas (HSCT) está asociado con un pronóstico pobre, aunque las infusiones de linfocitos del donador, postransplante (DLI) puede inducir remisiones en unos cuantos pacientes, vía la inducción de un efecto de Injerto versus Leucemia (GvL) (Loren et al., BMT 41 (2008), p. 483) . Un segundo HSCT puede ser una opción y se han reportado algunos sobrevivientes a largo plazo. Sin embargo, el estado de enfermedad antes del HSCT es predictivo del desenlace postransplante y los pacientes con enfermedad morfológica o con niveles de MRD persistentes de >10~4 blastos leucémicos son conocidos por- tener un riesgo muy alto de recaída y un desenlace muy pobre (Bader et al., J Clin Oncol. 27 (2009), p. 377-84) . En vista de esto, el estado de la enfermedad antes, del segundo HSCT es de vital importancia y deben hacerse todos los esfuerzos para lograr otra remisión. A pesar del uso de agentes quimioterapéuticos introducidos recientemente para la leucemia resistente al tratamiento (Jeha, Semin Hematol . 46 (2009), 76-88), los pacientes con recaída después del HSCT, con frecuencia tienen una enfermedad quimiorresistente y estos pacientes son muy susceptibles a la toxicidad relacionada con la quimioterapia. Parra estos pacientes, se necesitan estrategias que no sean quimioterapéuticas y menos tóxicas, para inducir las remisiones en tales pacientes.

En vista de las desventajas mencionadas anteriormente de las terapias convencionales para la ALL pediátrica, existe todavía la necesidad de un régimen de tratamiento mejorado.

La presente invención se relaciona con un método para el tratamiento, mejora o eliminación de la leucemia linfoblástica aguda (ALL) pediátrica, el método comprende la administración de una composición farmacéutica que comprende un constructo de un anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 a un paciente con ALL pediátrica en necesidad del mismo. Este procedimiento inmunológico que utiliza los anticuerpos que se acoplan a los linfocitos T por primera vez, proporciona un tratamiento no quimioterapéutico y menos tóxico para la ALL pediátrica.

Recientemente, un estudio de fase I ha demostrado una actividad clínica significativa del anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 (blinatumomab) en la recaída del linfoma no de Hodgkin (NHL) de los linfocitos B CD19 positivos, en que se han observado regresiones impresionantes del tumor, parciales y completas (Bargou et al., Science 321 (2008): 974-7).

En un ensayo clínico adicional, todavía en curso, el tratamiento con el anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 mencionado, resultó en la eliminación de las células leucémicas quimiorresistentes en pacientes adultos positivos a la MRD, no transplantados, con ALL CD19+.

Se ha encontrado ahora de manera sorprendente en dos usos compasivos, que el anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 no sólo es adecuado para el tratamiento de la ALL en pacientes adultos, no transplantados, sino también de la ALL pediátrica (o de la niñez) con recaída, resistente al tratamiento con la terapia para ALL convencional, incluyendo la quimioterapia y el transplante de las células germinales hematopoyéticas alogenéicas (HSCT) .

Aquí, los inventores reportan el poderoso efecto antileucémico del anticuerpo biespecífico CDl9xCD3 en dos niños (en lo siguiente, nombrados paciente 1 y 2) con leucemia .linfoblástica aguda (ALL) de precursor B, que tuvieron una recaída quimiorresistente después del transplante de las células germinales hematopoyéticas alogenéicas (HSCT) de donadores coincidentes no relacionados y haploidénticos .

Antes del tratamiento con el anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3, el paciente 1 se había pretratado con HSCT alogenéico y con múltiples quimioterapias. Sin embargo, estas terapias convencionales de la ALL pediátrica fallaron, de manera que el paciente recaía de manera repetida, con la consecuencia de que tenía un pronóstico extremadamente pobre. En lo siguiente, el paciente con ALL pediátrica recibió 15 microgramos/m2/24 horas del anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 como una infusión continua durante cinco semanas. Durante el tratamiento con el anticuerpo, el paciente tuvo una expansión de los linfocitos T CD8+ derivados del donador, sin ningún signo de Enfermedad de Injerto versus Hospedero (GvHD) . Esta expansión de los linfocitos T estuvo asociada con una rápida eliminación de los blastos leucémicos del paciente y 10 días después del inicio del tratamiento con el anticuerpo, no se pudieron detectar blastos en la médula ósea del paciente más allá del nivel de detección de la enfermedad residual mínima (MRD) de 1 célula de 10000. El paciente permaneció negativo a la MRD durante el tratamiento con el anticuerpo . El paciente se sometió a un segundo transplante de las células germinales de su madre haploidéntica 2 semanas después del fin del tratamiento con el anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 y permaneció negativo a la MRD desde entonces (estado Noviembre del 2009) .

El paciente 2 de quince años de edad se diagnosticó con ALL del precursor B del cromosoma Philadelphia y CD19 positivo en Abril del 2001. Después de la quimioterapia, recibió un HSCT de un hermano con el HLA idéntico en Octubre del 2001. En el 2002, se diagnosticó una recaída de la médula ósea y se logró otra remisión con matinib y quimioterapia. Recibió entonces un segundo HSCT de un donador no relacionado con el HLA idéntico en Octubre del 2004. En Marzo del 2008, se diagnosticó una segunda recaída y se trató con quimioterapia de dosis baja y Dasatinib, debido a la resistencia al Imatinib. Después de la quimioterapia adicional con Clofarabina y Citosina/Arabinósido, logró una remisión molecular y recibió un tercer HSCT alogenéico de su padre haploidéntico con 3 de 6 de los alelos del HLA que no coincidían, con tratamiento postransplante con Dasatinib. Debido al sangrado gastrointestinal y a cardiomiopatía dilatante, el Dasatinib se interrumpió 5 meses después del transplante. En Abril del 2009, se diagnosticó una recaída combinada del sistema nervioso central (CNS) con 7xl09/L blastos en el CNS y 3% de blastos en la médula ósea. El paciente se trató entonces con Nilotinib, quimioterapia intratecal y radiación fraccionada del CNS con 18 Gy. Tres meses después de este tratamiento, la médula ósea del paciente permaneció positiva a la MRD a un nivel de 1.1 xlO"3 mientras que el CNS estuvo libre de blastos. El análisis del quimerismo de la sangre periférica reveló una hematopoyesis completa derivada del donador de su padre haploidéntico .

El paciente se trató entonces con -un solo agente, blinatumomab, a 15 µg/m2/día durante 4 semanas mediante infusión continua sin ningún efecto secundario. Una aspiración de médula ósea al final del tratamiento mostró una remisión completa con una MED indetectable en la médula ósea por debajo de <lxl0"4. Como el paciente 1, el paciente 2 no mostró ningún signo de GvHD durante o después del tratamiento con blinatumomab. Actualmente está bien y está asistiendo a la escuela.

Estos datos demuestran de manera impresionante que los anticuerpos biespecífieos que se acoplan a los linfocitos T pueden inducir un poderoso efecto de Injerto versus Leucemia (GvL) en la ausencia de GvHD en los pacientes pediátricos con recaídas y con ALL del precursor B resistente a la terapia después del HSCT alogenéico. En consecuencia, se prefiere en el tratamiento descrito en la presente de los pacientes pediátricos, que un constructo de un anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 induzca un efecto de injerto versus leucemia (GvL) . Además, el tratamiento es bien tolerado por los pacientes pediátricos. En vista de esto, los medios y métodos de esta invención proporcionan una opción de tratamiento sorprendentemente mejorada para la leucemia linfoblástica aguda (ALL) pediátrica, en particular, para casos en los cuales la ALL pediátrica es resistente al tratamiento con la terapia convencional para la ALL pediátrica, incluyendo la quimioterapia ylo el HSCT alogenéico. En consecuencia, y en una modalidad adicional de la presente invención, los constructos de una sola cadena biespecíficos que se acoplan a los linfocitos T (anti-CDl9xCD3) empleados en la presente, pueden emplearse también en pacientes pediátricos que se han sometido a un transplante de las células germinales hematopoyéticas (HSCT) (alogenéico). Como se ilustra en la presente, incluso los pacientes pediátricos que tienen una recaída de su ALL después del HSCT de un donador que coincide no relacionado o haploidéntico y/o los pacientes pediátricos que son resistentes al tratamiento con la quimioterapia, pueden tratarse de manera exitosa con los medios y métodos descritos en la presente. Los pacientes e emplificados como se documentaron en la presente, mostraron una respuesta antileucémica impresionante mediante la intervención farmacéutica descrita en la presente y se volvieron negativos a la MRD en la ausencia de algún signo de GvHD (enfermedad de injerto versus hospedero) . Aunque la supervivencia de los niños con ALL mejoró dramáticamente en las últimas décadas, la ALL con recaída es todavía la causa principal de falla del tratamiento. Para los pacientes en la 2a recaída, el HSCT alogenéico es el único procedimiento curativo hasta ahora. Una de la principal acción antileucémica del HSCT es la inducción de un efecto GvL. Desafortunadamente, la aparición del GvL está asociada con frecuencia a la GvHD, que es todavía una causa principal de morbidez y mortalidad después del HSCT. Por lo tanto, la inducción de GvL en la ausencia de GvHD es el tópico de una investigación intensiva. Un procedimiento para la inducción de un efecto GvL es las infusiones de linfocitos del donador (DLI) postransplante, que se utilizan de manera preferida para el tratamiento de la ALL con recaída después del HSCT. Aunque las DLI son muy efectivas en el tratamiento de la CML (Kolb, Blood 76 (1990), 2462), son menos efectivas en el tratamiento postransplante de la ALL con recaída (Loren, BMT 41 (2008) , 483) y con frecuencia conducen a la aparición de la GvHD.

• Los métodos y medios farmacéuticos y médicos de la presente invención proporcionan un procedimiento novedoso para la inducción de GvL sin GvHD. Este procedimiento es la activación ?? vivo de los linfocitos derivados del donador después del HSCT utilizando bajas dosis de los anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 que se acopla a los linfocitos T, que dirige los linfocitos T contra los blastos CD19+ de la ALL de los pacientes. Este anticuerpo ha mostrado una actividad antilinfoma y antileucémica ' impresionante en la situación autóloga, pero no se probó nunca en la ALL pediátrica con recaída después del HSCT. Los dos pacientes pediátricos descritos en los siguientes ejemplos tuvieron una recaída de su ALL después del HSCT de un donador que no coincide no relacionado o haploidéntico y eran resistentes al tratamiento con quimioterapia. Los pacientes mostraron una respuesta antileucémica impresionante después del inicio del tratamiento y se volvieron negativos a la MRD en la ausencia de algún signo de la GvHD. La acción inmunológica del anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 es independiente de la presentación del antígeno peptídico, y ésta el más probablemente la razón de que a pesar de la expansión extensa de linfocitos T derivados del donador in vivo, no se indujo la GvHD. Las dosis bajas del anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 fueron suficientes para eliminar los blastos de la ALL en los pacientes más allá de los niveles de detección de la MRD. Así, el modo de acción de acoplamiento de los linfocitos T de este anticuerpo es muy diferente a los anticuerpos convencionales, que requieren dosis mucho más altas y que no pueden acoplar los linfocitos T vía su parte Fe de la molécula del anticuerpo, debido a la falta de receptores Fe en los linfocitos T. Vía el anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3, los linfocitos T efectores altamente efectivos pueden volverse citotoxicos hacia los blastos de la ALL sin la inducción de una respuesta inmune alorreactiva que resulte en la GvHD. Los inventores decidieron realizar un segundo HSCT alogenéico de un donador haploidéntico en el paciente 1 después de que se volvió negativo a la MRD. Hasta la fecha (Noviembre del 2009), este paciente es todavía negativo a la MRD.

De la experiencia clínica inicial en estos dos pacientes con recaída quimiorresistente del postransplante de la ALL, se ha concluido que el anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 puede inducir remisiones completas impresionantes sin la GvHD. Por lo tanto, el tratamiento con el anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 en el entorno pretransplante para la reducción inmunológica de la carga leucémica y para el tratamiento de las recaídas postransplante, ofrece nuevas oportunidades terapéuticas para los pacientes pediátricos con ALL avanzada.

El método de la presente invención proporciona las siguientes ventajas: 1. Como se demuestra en los siguientes ejemplos, la adminis ración del anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 puede utilizarse para la terapia de la leucemia linfoblástica aguda (ALL) pediátrica con recaída y/o resistente al tratamiento. No sólo el anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 puede reemplazar las terapias convencionales para la leucemia linfoblástica aguda (ALL) pediátrica (tal como la quimioterapia) en pacientes pediátricos no elegibles para el transplante de las células germinales alogenéicas. También puede utilizarse para convertir a los pacientes con ALL pediátrica elegibles para el transplante a un estado negativo a la MRD. Este aspecto de la invención es importante en que los pacientes negativos a la MRD tienen un riesgo menor de recaída después del transplante que los pacientes positivos a la MRD. En el mejor escenario del caso, la terapia para la ALL pediátrica con el anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 hace superfluos la quimioterapia y/o al HSCT. 2. Se sabe que los pacientes pediátricos con enfermedad morfológica o niveles de MRD persistentes de >10"4 blastos leucémicos, tienen un riesgo muy alto de recaída y un desenlace muy pobre (Bader et al., J Clin Oncol . 27 (2009), p. 377-84) . Los niños tratados con el anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 mostraron una respuesta antileucémica impresionante después del inicio del tratamiento y se volvieron negativos a la MRD durante el tratamiento, en la ausencia de algún signo de la GvHD. Los métodos y medios farmacéuticos de la invención, por lo tanto, proporcionan un . procedimiento terapéutico para el tratamiento, mejora o eliminación de la MRD en la ALL pediátrica, reduciendo por lo tanto, o incluso anulando el riesgo de una recaída para el paciente. El potencial curativo del HSCT alogenéico depende del nivel de la MRD ¦ antes del transplante. El tratamiento con el anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 puede utilizarse para convertir a los mencionados pacientes pediátricos con alto riesgo, a un estado negativo de la MRD. En consecuencia, la MRD en la ALL de la niñez resistente al tratamiento, puede tratarse por primera vez mediante el anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3. 3. Los métodos y medios farmacéuticos de la invención no sólo muestran un poderoso efecto antileucémico, si no que también son menos tóxicos y causan menos efectos adversos que la terapia convencional para la ALL pediátrica, incluyendo la quimioterapia y/o el HSCT alogenéico. Hasta ahora, no se han observado efectos secundarios a largo plazo después del tratamiento con el anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3. En contraste, . las terapias convencionales para la ALL pediátrica son muy agresivas y por lo tanto, están asociadas con riesgos para la salud considerables para los pacientes pediátricos. Además, se han reportado efectos tardíos después de la terapia convencional para la ALL en la niñez (véase, por ejemplo, Hudson MM, Late complications after leukemia therapy. En: Childhood Leukemias, C-H Pui ed. Cambridge: Cambridge University Press; 2006, p. 750-773; Schmoll, Hóffken, Possinger: Kompendium Internistische Onkologie, S. 2660 ff.; 4. Auflage, Springer Medizin Verlag Heidelberg; http : / /www. cáncer . gov/cancertopics/pdq/tratamiento/lateeffect s /HealthProfessional ) . De hecho, los tratamientos convencionales para la ALL pediátrica utilizan regímenes de tratamiento aún más agresivos que los procedimientos terapéuticos utilizados para la ALL de los adultos. Sin embargo, como es evidente de la proporción de recaídas de aproximadamente 25% en la ALL pediátrica, incluso estas terapias agresivas no son suficientes para curar finalmente a todos los pacientes. En vista de esto, es incluso más sorprendente que el tratamiento de los pacientes con ALL pediátricas resistentes al tratamiento y/o con recaída, con el anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3, sea capaz de volver a los pacientes a un estado negativo a la MRD, que ofrece nuevas oportunidades terapéuticas para tales pacientes con alto riesgo. Este es un resultado que no podría obtenerse con la terapia convencional para la ALL pediátrica, tal como la quimioterapia ylo el HSCT. 4. Por ejemplo, los pacientes pediátricos con ALL Ph+ (bcr/abl) portan un riesgo muy alto para una recaída entre todos los pacientes dentro de los subtipos de la ALL (véase a continuación) . Aunque el HSCT alogenéico se considera actualmente como el tratamiento de elección en la ALL Ph+ pediátrica, aproximadamente un tercio de los pacientes transplantados tienen una recaída. Además, como se expone con más detalle a continuación, los infantes (<12 meses) con ALL tienen un riesgo mayor para la falla del tratamiento convencional o estándar para la ALL, con el diagnóstico más pobre para aquéllos con rearreglos del gen MLL (t(4;ll)). Los resultados mostrados para el paciente 2 en los siguientes ejemplos, y los datos obtenidos en el ensayo clínico en curso mencionado anteriormente que trata a pacientes con ALL en los adultos (no transplantados) , sugieren que incluso la ALL Ph+ (bcr/abl) y la ALL con rearreglos del gen MLL pueden ser tratadas de manera exitosa con la administración del anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3. La administración del anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3, ofrece, por lo tanto, un .nuevo procedimiento terapéutico para la ALL Ph+ pediátrica o la ALL con translocaciones t(4;ll), especialmente para pacientes con ALL pediátrica con enfermedad residual mínima (MRD) . Esto se considera para la enfermedad residual mínima (MRD) definida, por ejemplo, por análisis con PCR o FACS. 5. Debido a su actividad citotóxica muy alta, sólo dosis bajas del anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 son suficientes para el tratamiento exitoso de la ALL pediátrica, lo que permite la eliminación de las células de leucemia incluso en la médula ósea. 6. Duración más corta del tratamiento con el anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 en comparación con la terapia convencional para la ALL pediátrica. La quimioterapia convencional para la ALL pediátrica toma usualmente 2 a 3 años, mientras que pudo observarse una respuesta muy rápida al anticuerpo biespecífico de una sola cadena CD19xCD3 en los pacientes pediátricos mostrados en los siguientes ejemplos. Además, la respuesta es de larga duración: el Paciente 1 ha permanecido negativo a la MRD más de 12 meses después del transplante; véase los siguientes ejemplos. 7. Los pacientes con ALL pediátrica con recaída con frecuencia tienen una enfermedad guimiorresistente y estos pacientes son muy susceptibles a la toxicidad relacionada con la quimioterapia. Para estos pacientes, el tratamiento con el anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 proporciona por primera vez, una estrategia no quimioterapéutica y menos tóxica para inducir las remisiones en tales pacientes. 8. Como se encontró en el ensayo clínico en curso 7 descrito anteriormente sobre la ALL en pacientes adultos, el tratamiento con el anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 resultó en la eliminación de las células leucémicas quimiorresistentes en pacientes adultos no transplantados positivos a la MRD con ALL CD19+. Aunque en estos pacientes los linfocitos T citotóxicos acoplados eran derivados del paciente no existen datos hasta ahora, del uso del anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 después del HSCT alogenéico en un entorno en donde los linfocitos T acoplados son derivados del donador. Aquí, los inventores reportan por primera vez, la inducción poderosa de un efecto GvL en la ausencia de la GvHD inducida por el anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 que acopla los linfocitos T derivados del donador en dos pacientes pediátricos con recaída quimiorresistente de la ALL CD19+ después del HSCT alogenéico.

En resumen, el tratamiento con el anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3, proporciona una terapia nueva y mejorada para la ALL pediátrica, particularmente para la ALL pediátrica resistente al tratamiento y/o con recaída.

En una modalidad preferida de los métodos y medios farmacéuticos de la invención, la leucemia linfoblástica aguda (ALL) pediátrica o de la niñez, es una ALL pediátrica del linaje B, de manera preferida, leucemia linfoblástica aguda ALL pediátrica del precursor B, de manera más preferida ALL pro-B, ALL pre-B o ALL común (cALL) pediátrica. Aún de manera más preferida, la ALL pediátrica del precursor B es ALL común (cALL) .

La vasta mayoría de los casos de ALL pediátrica o de la niñez (>85%) son del fenotipo de las células del precursor B (Schultz et al., Blood 109 (2007) : 926-935) . Puesto que el anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 descrito en la presente está dirigido contra el marcador CD19 asociado con los linfocitos B, el anticuerpo es particularmente adecuado como un agente terapéutico para la leucemia linfoblástica aguda pediátrica del linaje B, de manera más preferida para la ALL pediátrica del precursor B. La ALL pediátrica del precursor B puede subdividirse además, en ALL pro-B, ALL pre-B y ALL común (cALL) pediátrica (véase, por ejemplo, Behm F.G., Immunophenotyping . En: Childhood Leukemias, C-H Pui ed. Cambridge: Cambridge University Press; 2006, p. 150-209). La leucemia linfoblástica aguda (ALL) pediátrica, incluyendo la leucemia linfoblástica aguda pediátrica del precursor B y otros tipos de ALL pediátrica del linaje (linfocitos) B, y los tratamientos de la misma se revisan, por ejemplo, en Pui CH, Clin Adv Hematol Oncol . 4 (2006): 884-6; Pui CH, Evans WE, N Engl J Med 354 (2006): 166-178; Pui CH et al., Lancet 371 (2008): 1030-1043; Pui CH, Jeha S, Nat Rev Drug Discov 6 (2007): 149-165) . . La información adicional con respecto a la ALL pediátrica puede encontrarse también, por ejemplo, bajo http : / /www. cáncer . gov o http: //www.leukemia-lymphoma.org.

Desde un punto de vista histórico, el Grupo de Oncología Pediátrica (POG) y el Grupo del Cáncer Infantil (CCG) adoptaron un conjunto común de criterios de riesgo en una conferencia internacional apoyada por el Instituto Nacional del Cáncer (Smith M, et al., J Clin Oncol 14 (1996), 18-24), en 1993. El criterio del NCI se basó en factores que tenían una aceptación y reproducibilidad internacional : edad, conteos iniciales de las células sanguíneas blancas (WBC) , y la presencia de enfermedad extramedular en el diagnóstico. Para refinar adicionalmente la terapia, tanto el POG como el CCG también han utilizado factores de riesgo adicionales que han mostrado tener un impacto en los desenlaces del- paciente (por ejemplo, ploidia, cariotipo del blasto y respuesta morfológica inicial) . En el 2000, el CCG y el POG se unieron para formar el Grupo de Oncología Infantil (COG) . Esta fusión permitió el análisis de los datos de la respuesta clínica, biológica e inicial, predictivos de la supervivencia libre de eventos (EFS) en la leucemia linfoblástica aguda (ALL) para desarrollar un nuevo sistema' de clasificación y algoritmo de tratamiento. De 11779 niños (edad, 1 a 21.99 años) con la ALL del precursor B diagnosticada recientemente, reclutados por el CCG (Diciembre 'de 1988 a Agosto de 1995, n. = 4986) y el POG (Enero de 1986 a Noviembre de 1999, n = 6793), el estudio analizó de manera retrospectiva a 6238 pacientes (CCG, 1182; POG, 5056) con datos citogenéticos informativos (Schultz et al., Blood 109 (2007) : 926-935) . Cuatro grupos de riesgo se definieron como riesgo muy alto (VHR; EFS de 5 años, 45% o menos), riesgo menor (EFS de 5 años, al menos 85%), y riesgo estándar y alto (aquéllos que permanecieron en los grupos de riesgo respectivos del Instituto Nacional del Cáncer [NCI] ) . El criterio de VHR incluyó hipodiploidia extrema (menos de 44 cromosomas), t(9;22) y/o BCR/ABL, y falla de la inducción. Los pacientes con riesgo menor fueron el riesgo estándar del NCI con t(12;21) (TEL/AMLl ) o trisomías simultáneas de los cromosomas 4, 10 y 17. Incluso con las diferencias del tratamiento, hubo una alta concordancia entre los análisis del CCG y el POG. El esquema de clasificación de riesgo del COG se está utilizando para la división de la ALL del precursor B en grupos de riesgo menor (27%), estándar (32%), alto (37%) y muy alto (4%) , basándose en la edad, conteo de las células sanguíneas blancas (WBC) , citogenética, respuesta de la médula en el día 14, y la enfermedad residual mínima (MRD) al final de la inducción mediante citometría de flujo en los ensayos del COG.

Actualmente, la asignación del tratamiento basada en el riesgo se utiliza para la leucemia linfoblástica aguda (ALL) pediátrica o de la niñez. Este procedimiento permite a los niños que históricamente tienen un buen desenlace, a ser tratados con una terapia modesta y de evitar un tratamiento más intenso y tóxico, mientras que permite que los niños con históricamente, una probabilidad menor de supervivencia a largo plazo, reciban una terapia más intensiva que pueda incrementar su oportunidad de cura.' Se ha encontrado que los niños mayores y los adolescentes (=10 años) y los infantes (<12 meses) tienen un desenlace menos favorable que los niños de 1 a 9 años de edad en el diagnóstico, y los tratamientos más agresivos se emplean generalmente para estos pacientes (Nachman J, Br J Haematol 130 (2005): 166-73). El tratamiento con el anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3, proporciona ahora, una nueva terapia mejorada, menos tóxica para tales poblaciones de pacientes pediátricos, es decir, niños mayores y adolescentes (=10 años) e infantes (<12 meses), que tienen un desenlace menos favorable con la terapia convencional para la ALL, tal como quimioterapia y/o el HSCT.

El tratamiento exitoso de los niños con ALL requiere el control de la enfermedad sistémica (por ejemplo, médula, hígado y bazo, nodos linfáticos) , así como la prevención o tratamiento de la enfermedad extramedular , particularmente en el sistema nervioso central (CNS) . Únicamente 3% de los pacientes tienen una implicación detectable del CNS mediante el criterio convencional en el diagnóstico (=5 WBC/microlitro, con células de linfoblastos presentes) . A menos que la terapia específica esté dirigida hacia el CNS, sin embargo, 50% a 70% o más de los niños desarrollarán leucemia del CNS declarada. Por .lo tanto, se recomienda actualmente que todos los niños con ALL deban recibir quimioterapia sistémica en combinación junto con alguna forma de profilaxis del CNS. En la actualidad, la mayoría de los grupos trata a los pacientes con leucemia del CNS documentada (>5 WBC/µ? con blastos; CNS3), y aquéllos con el fenotipo de los linfocitos T y un alto conteo de las WBC en el diagnóstico, con terapia intratecal y radiación craneal posterior. En consecuencia, el tratamiento con el anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 se lleva a cabo de manera preferida en combinación con profilaxis del CNS, tal como terapia intratecal y/o radiación craneal .

El tratamiento convencional o estándar para los niños con ALL se divide en etapas: inducción, consolidación o intensificación de la remisión, y terapia de mantenimiento (o continuación) , con la terapia de protección del CNS proporcionada generalmente en cada etapa. Una fase de intensificación de la terapia después de la inducción de la remisión se utiliza para todos los pacientes. La intensidad de la terapia de inducción y la terapia postinducción se determina por los factores de pronóstico clínicos y biológicos utilizados para la asignación del tratamiento basada en el riesgo y algún tipo de valoración de la respuesta inicial. Esta valoración puede incluir el porcentaje de blastos de la. médula en el día 7 y/o el día 14, el conteo de blastos en la sangre periférica en el día 8, y las determinaciones de la enfermedad residual mínima en la médula ósea y/o la sangre periférica, durante o al final de la inducción (Pui CH, Evans WE, N Engl J Med 354 (2006) : 166-78) . La duración de la terapia para los niños con ALL varía entre 2 y 3 años. En contraste, pudo observarse una respuesta muy rápida al tratamiento con el anticuerpo biespecifico.de una sola cadena CDl9xCD3, en los pacientes pediátricos, como se muestra en los siguientes ejemplos. Además, el paciente 1 i negativo a la MRD hasta la fecha (Noviembre del 2009), indicando que puede lograrse una cura a largo plazo.

Los subgrupos de pacientes que tienen un pronóstico pobre con la terapia estándar o convencional actual pueden requerir un tratamiento diferente. Por ejemplo, los infantes con ALL tienen un riesgo más alto de falla del tratamiento, con el pronóstico más pobre para aquéllos con rearreglos del gen MLL (Rubnitz JE, et al.: Blood 84 (1994): 570-3; Biondi A, et al., Blood 96 (2000): 24-33; Pui CH, et al., Lancet 359 (2002): 1909-15; Silverman LB, et al.: Cáncer 80 (1997): 2285-95). Estos niños son tratados generalmente con regímenes diseñados de manera específica para infantes (Silverman, et al., (1997), loe. cit., Chessells JM, et al., J Haematol 117 (2002): 306-14; Reaman GH, et al., J Clin Oncol 17 (1999): 445-55; Pieters R, et al., Lancet 370 (2007) : 240-50) . Los regímenes actuales para los infantes emplean procedimientos de tratamiento intensificados y pueden ofrecer un control mejorado de la enfermedad, en comparación con los procedimientos previos menos intensos, pero el desenlace y la toxicidad a largo plazo se desconocen (Reaman (1999), loe. cit.; Pieters (2007), loe. cit.; Kosaka Y, et al., Blood 104 (2004): 3527-34; Hilden JM, et al., Blood 108 (2006) : 441-51) . Ciertos niños (mayores de 1 año) con ALL pueden tener menos de 50% de probabilidad de remisión a largo plazo con la terapia actual (por ejemplo, t[9;22] ALL positiva al cromosoma Philadelphia, pacientes hipodiploides y aquéllos con falla de la inducción inicial) . Para estos pacientes, el transplante de médula ósea alogenéica de un hermano con el antígeno del leucocito humano (HLA) que coincida, se considera durante la primera remisión (Snyder DS, et al., Leukemia 13 (1999): 2053-8; Aricó M, et al., N Engl J Med 342 (2000): 998-1006; Schrauder A, et al., J Clin Oncol 24 (2006): 5742-9). El transplante del donador del hermano con HLA que coincide, sin embargo, no ha probado ser de beneficio en los pacientes definidos como de alto riesgo únicamente por el conteo de las WBC, género y edad (Ribera JM, et al., J Clin Oncol 25 (2007): 16-24).

Puesto que la mielosupresión y la inmunosupresión generalizadas son una consecuencia anticipada de la leucemia y su tratamiento con quimioterapia, ' los pacientes deben verificarse estrechamente durante el tratamiento convencional de la ALL pediátrica. Deben estar disponibles inmediatamente las instalaciones adecuadas tanto para apoyo hematológico como para ' el tratamiento de complicaciones infecciosas y otras complicaciones durante todas las fases del tratamiento de la leucemia. Aproximadamente 1% de los pacientes muere durante la terapia de inducción y otro 1% a 3% muere durante la primera remisión de las complicaciones relacionadas con el tratamiento (Christensen MS, et al., Br J Haematol 131 (2005) : 50-8) .

El tratamiento con el anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 proporciona una terapia alterna y menos tóxica para la ALL pediátrica, particularmente para la ALL pediátrica resistente al tratamiento y/o con recaída. El tratamiento evita las desventajas de las terapias convencionales para la ALL de la niñez, tales como las fallas del tratamiento, la toxicidad y los efectos adversos a largo plazo. Es por lo tanto, una alternativa altamente eficiente pero menos tóxica y con menos riesgos para la salud que la quimioterapia y/o el HSCT alogenéico.

En consecuencia, en otra modalidad de los métodos y medios farmacéuticos de la invención, la leucemia linfoblástica aguda (ALL) es ALL resistente al tratamiento y/o con recaída.

La ALL pediátrica puede ser resistente al tratamiento con quimioterapia o al transplante de las células germinales hematopoyéticas alogenéicas (HSCT) o a la quimioterapia y al transplante de las células germinales hematopoyéticas alogenéicas (HSCT) . La ALL puede ser una ALL con recaída o ALL con recaída resistente al tratamiento con la terapia convencional para la ALL, incluyendo quimioterapia y/o transplante de las células germinales hematopoyéticas alogenéicas (HSCT) . Sin embargo, está dentro del ámbito de la invención, que la ALL sea una ALL diagnosticada recientemente. En este entorno, el tratamiento con el anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 puede utilizarse como una primera terapia (línea frontal) ya sea sola o en combinación con el. HSCT.

El término "ALL pediátrica resistente al tratamiento" como se utiliza en la presente, significa resistencia de la ALL pediátrica a la terapia convencional o estándar para la ALL pediátrica, tal como quimioterapia y/o el HSCT. Actualmente, la proporción de recaída en la ALL pediátrica es de aproximadamente 25%. Dicho de otra forma: La terapia convencional o estándar para la ALL pediátrica no es capaz de curar finalmente a todos los pacientes 7 pediátricos .

El término "ALL pediátrica con recaída" como se utiliza en la presente, denota el regreso de los signos y síntomas de la enfermedad ALL después de que un paciente pediátrico ha gozado de una remisión. Por ejemplo, después del tratamiento convencional para la ALL, utilizando quimioterapia y/o HSCT, un paciente con ALL pediátrica puede ir a remisión sin signos o síntomas de la ALL, permanece en remisión durante un par de años, pero entonces sufre una recaída y tiene que tratarse nuevamente para la ALL.

Los pacientes con ALL pediátrica con recaída con frecuencia tienen enfermedad quimiorresistente . Estos pacientes son muy susceptibles a la toxicidad relacionada con la quimioterapia, que puede evitarse con el tratamiento con el anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3.

El término "terapia estándar" o "terapia convencional" como se utiliza en la presente, se refiere a la terapia para la ALL pediátrica utilizando quimioterapia y/o HSCT. La leucemia linfoblástica aguda (ALL) pediátrica, incluyendo la leucemia linfoblástica aguda pediátrica del precursor B y otros tipos de ALL pediátrica del linaje (linfocitos) B, y los tratamientos de las mismas, se revisan por ejemplo, en Pui CH, Clin Adv Hematol Oncol . 4 (2006) : 884-6; Pui CH, Evans WE, N Engl J Med 354 (2006) : 166-178; Pui CH et al., Lancet 371 (2008) : 1030-1043; Pui CH, Jeha S, Nat Rev Drug Discov 6 ( 2007 ) : 149 -165 ) ; Henze G, von Stackelberg A, Relapsed acute lymphoblastic leukemia. En: Childhood Leukemias, C-H Pui ed. Cambridge: Cambridge University Press; 2006 , p. 473 -486 ) . La información adicional con respecto a la ALL pediátrica también puede encontrarse, por ejemplo, bajo http : / /www. cáncer . gov o http: //www. leukemia-lymphoma.org.

El término "anticuerpo biespecífico de una sola cadena" o "anticuerpo de una sola cadena biespecífico" o los términos relacionados, de acuerdo con la presente invención, significan constructos de anticuerpos que, resultan de la unión de al menos dos regiones variables del anticuerpo en una sola cadena polipeptídica desprovista de las porciones constantes y/o Fe presentes en las inmunoglobulinas completas. El anticuerpo biespecífico de una sola cadena, como se refiere en la presente, es funcional, es decir, citotóxicamente activo, como un monómero y por lo tanto, claramente distinguible de los diacuerpos o anticuerpos tandabs descritos en la técnica, que son funcionales sólo como dímeros o multímeros. Un "enlazante" como se utiliza en la presente, conecta los dominios V de la misma especificidad, mientras que un "separador" como se utiliza en la presente, conecta los dominios V de diferentes especificidades. Por ejemplo, un anticuerpo biespecífico de una sola cadena puede ser un constructo con un total de dos regiones variables del anticuerpo, por ejemplo, dos regiones VH, cada una capaz de unirse de manera específica a un antígeno separado, y conectadas una con la otra a través de un separador de un polipéptido sintético corto (usualmente, menos de 10 aminoácidos), de manera que las dos regiones variables del anticuerpo con su separador interpuesto existen como una sola cadena polipeptídica contigua. Otro ejemplo de un anticuerpo biespecífico de una sola cadena, puede ser una sola cadena polipeptídica con tres regiones variables del anticuerpo. Aquí, dos regiones variables del anticuerpo, por ejemplo, una VH y una VL, pueden constituir un scFv, en donde las dos regiones variables del anticuerpo están conectadas una con la otra vía un enlazante de polipéptido sintético, el último con frecuencia . se diseña genéticamente para ser mínimamente inmunogénico, mientras que permanece resistente al máximo a la proteólisis. Este scFv es capaz de unirse de manera específica a un antígeno particular, y está conectado a una región variable del anticuerpo adicional, por ejemplo, una región VH, capaz de unirse a un antígeno diferente a aquél unido por el scFv. Aún otro ejemplo de un anticuerpo biespecífico de una sola cadena puede ser una sola cadena polipeptídica con cuatro regiones variables del anticuerpo. Aquí, las primeras dos regiones variables del anticuerpo, por ejemplo, una región VH y una región VL, pueden formar un scFv capaz de unirse a un antígeno, mientras que la segunda región VH y la región VL pueden formar un segundo scFv capaz de unirse a otro antigeno. Dentro de una sola cadena polipeptídica contigua, las regiones variables individuales del anticuerpo de una especificidad pueden separarse de manera ventajosa por un enlazante de polipéptido sintético como se describió anteriormente, mientras que los scFv respectivos pueden separarse de manera ventajosa por un separador de polipéptido corto, como se describió anteriormente. Los ejemplos no limitantes de los anticuerpos de una sola cadena biespecífieos, asi como los métodos para producirlos, se muestran en WO 99/54440, WO 2004/106381, WO 2007/068354, Mack, J. Immunol . (1997), 158, 3965-70; Mack, PNAS, (1995), 92, 7021-5; Kufer, Cáncer Immunol. Immunother., (1997), 45, 193-7; Lóffler, Blood, (2000), 95, 6, 2098-103; Brühl, J. Immunol., (2001), 166, 2420-2426.

Como se utiliza en la presente, "CD3" denota un antigeno que se expresa en los linfocitos T, de manera preferida, linfocitos T humanos como parte del complejo receptor de los linfocitos T multimolecular, el CD3 consiste de cinco cadenas diferentes: CD3-epsilon, CD3-gamma, CD3-delta, CD3-eta y CD3 zeta. El agrupamiento de CD3 en los linfocitos T, por ejemplo, por los anticuerpos anti-CD3 conduce a una activación de los linfocitos T similar a la unión de un antigeno, pero independiente de la especificidad clonal del subconjunto de linfocitos T. Asi, el término "anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3", como se utiliza en la presente, se relaciona con un constructo específico de CD-3 capaz de unirse al complejo de CD3 humano expresado en los linfocitos T humanos, y capaz de inducir la eliminación/lisis de las células objetivo, en donde tales células objetivo portan/muestran un antígeno que está unido por la otra porción que no se une a CD3 del anticuerpo biespecífico de una sola cadena. La unión del complejo CD3 por los ligantes específicos de CD3 (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico de una sola cadena administrado de acuerdo con los medios y métodos f rmacéuticos de la invención) , conduce a la activación de los linfocitos T como se conoce en la técnica; véase, por ejemplo, la WO 99/54440 o la WO 2007/068354. En consecuencia, un constructo apropiado de los medios y métodos farmacéuticos de la invención, es capaz, de manera ventajosa, de eliminar/lisar las células objetivo in vivo y/o in vi tro. Las células objetivo correspondientes comprenden células que expresan un antígeno del tumor, tal como CD19, que se reconoce por la segunda especificidad (es decir, la porción que no se una a CD3 del anticuerpo biespecífico de una sola cadena) del constructo mencionado. De manera preferida, la segunda especificidad es para CD19 humano, que ya se ha descrito en la WO 99/54440, la WO 2004/106381 o la WO 2007/068354. De acuerdo con esta modalidad, cada porción específica del antígeno del anticuerpo biespecífico de una sola cadena, comprende una región VH del anticuerpo y una región VL del anticuerpo. Una variante ventajosa de este anticuerpo biespecífico de una sola cadena es del término N al término C: VL(CD19) -VH(CD19) -VH(CD3) -VL(CD3) .

Dentro del significado de la invención, el término "se une de manera específica" o términos relacionados, tales como "especificidad", se entiende que está caracterizado principalmente por dos parámetros: un parámetro cualitativo (el epitopo de unión, o en dónde se une un anticuerpo) y un parámetro cuantitativo (la afinidad de unión, o. qué tan fuerte se une este anticuerpo en donde lo hace) . Cuál epitopo se une por un anticuerpo, puede determinarse de manera ventajosa mediante, por ejemplo, metodología FACS, ELISA, trazado del mapa del péptido-epitopo marcado o espectroscopia de masas. La fuerza de unión del anticuerpo a un epitopo particular puede determinarse, de manera ventajosa, mediante, por ejemplo, metodologías Biacore y/o ELISA conocidas. Una combinación de tales técnicas permite el cálculo de la relación señal: ruido como una medida representativa de la especificidad de unión. En tal relación señal: ruido, la señal representa la fuerza de unión del anticuerpo al epitopo de interés, mientras que .el ruido representa la fuerza de unión del anticuerpo a otros epitopos no relacionados, que difieren del epitopo de interés. Una relación señal: ruido de, por ejemplo, al menos 50, pero de manera preferida, de aproximadamente 80 para un epitopo respectivo de interés como se determina, por ejemplo, mediante Biacore, ELISA o FACS, pueden tomarse como una indicación de que el anticuerpo evaluado se une al epitopo de interés de una manera específica, es decir, es un "ligante específico". El término "se une a/interacciona con", también puede relacionarse con un epitopo conformacional , un epitopo estructural o un epitopo discontinuo, que consiste de dos o incluso más regiones de las moléculas objetivo humanas o partes de las mismas. Un epitopo conformacional , se define por dos o más secuencias de aminoácidos discretas, separadas en la secuencia primaria, que se juntan en la superficie de la molécula cuando el polipéptido se pliega a la proteína nativa (Sela, (1969) Science 166, 1365 y Laver, (1990) Cell 61, 553-6). El término "epitopo discontinuo" significa epitopos no lineales que están montados de residuos de porciones distantes de la cadena polipeptídica . Estos residuos se juntan en la superficie de la molécula cuando la cadena polipeptídica se pliega en una estructura tridimensional para constituir un epitopo conformacional/estructural .

El término "tratamiento", como se utiliza en la presente, significa en el sentido más amplio, procedimientos o aplicaciones médicas que están pretendidos para aliviar la enfermedad. En el presente caso, la administración del anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 (preparado para la administración a un paciente con ALL pediátrica) , como se describe en la presente, es para el tratamiento, mejora o eliminación de la enfermedad ALL pediátrica .

El término "mejora", como se utiliza en la presente, es sinónimo de mejoría. Si la condición de un paciente con ALL pediátrica muestra una mejora, el paciente está claramente mejor, hay alguna mejoría en su condición clínica. Por ejemplo, puede haber una mejoría en la condición de la ALL del paciente, si puede lograrse una estabilización de la enfermedad ALL, es decir, la enfermedad ALL ya no es progresiva. En esta etapa de enfermedad, también se denomina enfermedad estable. La mejora también puede ser una mejoría del estado MRD del paciente con ALL pediátrica. Por ejemplo, antes del tratamiento con el anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3, 100 células de leucemia por 104 células de médula ósea pueden ser detectables en el paciente con ALL pediátrica. Debido al tratamiento con el anticuerpo biespecífico de una sola- cadena CDl9xCD3, el número de células de leucemia puede reducirse a 10 células de leucemia o incluso menos células de leucemia (por ejemplo, menos de una célula de leucemia) por 104 células de médula ósea, en este caso ejemplar.

El término "eliminación", como se utiliza en la presente, significa el retiro de las células leucémicas del cuerpo de un paciente con ALL pediátrica. Como se muestra en el siguiente ejemplo, la administración del anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3, es capaz de convertir la leucemia linfoblástica aguda (ALL) positiva a MRD a un estado negativo a la MRD, es decir, un estado en el cual ninguna MRD es detectable (<10~4, es decir, menos de 1 célula de leucemia por 104 células de médula ósea detectables) . En este caso, se alcanza una remisión molecular completa.

El término "administración", como se utiliza en la presente, significa la administración de una dosis terapéuticamente efectiva del anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 mencionado anteriormente (de manera preferida, el mostrado en la SEQ ID NO.l) a un individuo, es decir, un paciente pediátrico humano. Por "cantidad terapéuticamente efectiva", se quiere decir una dosis que produce los efectos para los cuales se administra, es decir, suficiente para destruir las células de la leucemia linfoblástica aguda. De manera preferida, la dosis administrada del anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3, conduce a la eliminación de todas las células de la leucemia linfoblástica aguda del cuerpo del paciente pediátrico, resultando en un estado de la ALL negativo a la MRD, como se define en la presenjte. La dosis exacta dependerá del propósito del tratamiento, y se determinará por alguien con experiencia en el campo, utilizando técnicas conocidas. El médico que atiende y los factores' clínicos, determinarán el régimen de dosificación. Como es bien conocido en el campo médico, las dosificaciones para cualquier paciente pediátrico dependen de muchos factores, incluyendo el tamaño del paciente pediátrico, el área de superficie corporal, la edad, peso corporal, el compuesto particular a ser administrado, el sexo, el tiempo y ruta de administración, el estado de salud general y otros fármacos que se administran de manera concurrente.

Una dosis típica puede estar, por ejemplo, en los intervalos expuestos en las modalidades de los métodos y medios de la invención, y los ejemplos anexos; sin embargo, las dosis por debajo o por encima de este intervalo ejemplar están previstas, considerando especialmente los factores mencionados anteriormente.

El término "infusión continua", se refiere a una infusión que se deja proceder de manera permanente durante un periodo de tiempo, es decir, sin interrupción. "Infusión continua", se refiere a una infusión administrada de manera permanente. En consecuencia, en el contexto de la invención, los términos "permanente" y "continuo" se utilizan como sinónimos. Dentro de los significados de la invención, por ejemplo, el término "administrado mediante infusión continua durante (al menos) 4 semanas" o lo similar, denotan una situación en la cual el anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 utilizado en los medios y métodos farmacéuticos de acuerdo con la invención, se administra de manera continua al cuerpo de un paciente pediátrico durante un periodo de (al menos) 4 semanas de una manera sostenida, constante, a través de toda la duración requerida en los medios y métodos farmacéuticos de la invención. Los esquemas de administración continua del anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3, se describen con más detalle en la WO 2007/068354. Una interrupción de la introducción del anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 se evita, es decir, no ocurre una transición de un estado en el cual este anticuerpo se está administrando al cuerpo del paciente pediátrico a un estado en el cual este anticuerpo ya no se administra más al cuerpo del paciente pediátrico, o no ocurre de manera significativa durante toda la administración requerida por los medios y métodos farmacéuticos de la invención, por otras razones que para reabastecer el suministro del anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 administrado, o intervenciones médicas que se vuelvan necesarias y lo similar. Aunque tal reabastecimiento necesario conduce a una interrupción temporal de la introducción del anticuerpo administrado, tal administración se entiende todavía como que es "no interrumpida" o "permanente" en el sentido de los medios y métodos farmacéuticos de acuerdo con la invención. En la mayoría de los casos, tal reabastecimiento será generalmente de una duración tan corta, que el tiempo durante el cual el anticuerpo no se introduce al cuerpo del paciente pediátrico, será muy pequeño cuando se compara con el tiempo planeado para el régimen de administración total de acuerdo con los medios y métodos farmacéuticos de acuerdo con la invención. De acuerdo con la invención, un ciclo de tratamiento puede entenderse como una infusión continua del anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 al paciente con ALL durante un periodo de (al menos) 4 semanas, seguido por un intervalo libre de tratamiento de 2 semanas. El término "al menos" como se utiliza en la presente, significa que la infusión continua también puede llevarse a cabo durante un periodo de tiempo mayor de 4 semanas, por ejemplo, durante 5, 6, 7 u 8 semanas o incluso más, seguido por un intervalo libre de tratamiento de 2 semanas. Puede ser el caso que, tras el estacionamiento de la MRD del paciente pediátrico tratado después de una administración continua de (al menos) 4 semanas (o un ciclo de tratamiento) , pudiera lograrse una respuesta mínima o parcial pero no una negatividad a la MRD.

Bajo tales circunstancias, la administración continua puede extenderse por uno, dos, tres, cuatro, cinco o incluso hasta diez ciclos de tratamiento adicionales, con el fin de alcanzar un mejor resultado terapéutico, por ejemplo, una respuesta hematológica completa, o incluso molecular completa. De manera preferida, la respuesta molecular completa es la negatividad a la MRD (como se define aquí posteriormente) , que disminuye el riesgo de recurrencia de la enfermedad ALL. Por ejemplo, se ha encontrado que la negatividad a la MRD o los bajos niveles de MRD en los pacientes con ALL pediátrica antes del HSCT alogenéico, reduce el riesgo de una recaída (Bader P, et al., J Clin Oncol 27 (2009) : 377-384) . Como se muestra en los siguientes ejemplos, la negatividad a la MRD puede lograrse mediante el tratamiento de los pacientes con ALL pediátrica con el anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3.

Por lo tanto, en una modalidad de los métodos y medios farmacéuticos de la invención, el uno o más ciclos de tratamiento, en los cuales el anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 se administra de manera continua al paciente con ALL pediátrica, es /son seguidos por el HSCT alogenéico. Dicho de otra forma: En esta modalidad preferida, el método de la invención es previo al transplante de las células germinales alogenéicas (HSCT) , con el fin de convertir la ALL positiva a la MRD en un estado negativo a la MRD. De esta manera, el riesgo de una recaída se disminuye de manera significativa.

En otra modalidad del método de la invención, el método es después del transplante de las células germinales hematopoyéticas alogenéicas (HSCT) .

El procedimiento de transplante puede seguirse por uno o más ciclos de tratamiento con el anticuerpo biespecífico de una sola .cadena CDl9xCD3. Esta modalidad es importante en los casos de ALL pediátrica con recaída, en donde los pacientes han recibido quimioterapia y HSCT. Debido a la falla de estas terapias convencionales, la enfermedad puede recaer y curarse ahora mediante la administración del anticuerpo. Además, el tratamiento con el anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 puede utilizarse como una terapia de consolidación después del HSCT con el fin de evitar otra recaída de la enfermedad de la ALL.

Los siguientes ejemplos también proporcionan datos del uso del anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 después del HSCT alogenéico, en donde los linfocitos T acoplados se derivan del donador. Pudo observarse una inducción poderosa del efecto del Injerto versus leucemia (GvL) en la ausencia de la Enfermedad de Injerto versus el Hospedero (GvHD) inducida por el tratamiento con el anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 en dos pacientes con recaída quimiorresistente de la ALL CD19+ después del HSCT herriatopoyético alogenéico. Por lo tanto, en otra modalidad preferida de los métodos y medios farmacéuticos de la invención, el paciente con ALL pediátrica puede tratarse con el anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 después de que ella/él, ha recibido un HSCT alogenéico.

En el escenario del mejor caso, se considera que el tratamiento de los pacientes con ALL pediátrica con el anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3, es capaz de reemplazar la terapia para la ALL pediátrica convencional, tal como quimioterapia y/o transplante de las células germinales hematopoyéticas alogenéicas (HSCT) .

Como se muestra en los siguientes ejemplos, el tratamiento del paciente con leucemia linfoblástica aguda (ALL) pediátrica con el anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3, es capaz de eliminar las células de la leucemia linfoblástica aguda del cuerpo de los pacientes por debajo de un límite de detección. De manera preferida, el objetivo, terapéutico principal de la administración del anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3,' ya sea solo o en combinación con el HSCT alogenéico, a un paciente con ALL pediátrica, es la conversión de un estado positivo a la MRD a un estado negativo a la MRD, que resulta en la supervivencia libre de leucemia, como se define en la presenté a continuación. Como se demuestra en la presente, los pacientes con ALL pediátrica positivos a la MRD se volvieron negativos a la MRD después del primer ciclo de tratamiento, en el cual el anticuerpo, biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 se ha administrado de manera continua durante cinco semanas (paciente 1) o cuatro semanas (paciente 2) . En el paciente 1, el ciclo de tratamiento es seguido por un HSCT haploide. Hasta Noviembre del 2009, este paciente permanecía en una remisión completa negativa a la MRD, es decir, libre de tumor.

La administración no interrumpida continua del anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 de la manera de los medios y métodos farmacéuticos de acuerdo con la invención durante periodos de tiempo más largos, permite que la activación ventajosa de los linfocitos T mencionada en los ejemplos, ejerza su efecto durante un tiempo suficiente para eliminar de manera ventajosa todas las células de la leucemia linfoblástica aguda del cuerpo. Puesto que la velocidad del anticuerpo biespecífico de una sola cadena administrado de manera interrumpida se mantiene baja, la aplicación del agente terapéutico puede continuarse más tiempo sin el riesgo de efectos secundarios dañinos para el paciente.

El anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3, como se utiliza en la presente, se prepara de manera ventajosa en la forma de una composición farmacéutica para la administración a un paciente pediátrico humano diagnosticado con leucemia linfoblástica aguda (ALL) . La ALL puede ser una ALL diagnosticada recientemente, una ALL resistente al tratamiento con quimioterapia y/o al transplante de las células germinales hematopoyéticas alogenéicas (HSCT) , una ALL con recaída o una ALL con recaída resistente al tratamiento con quimioterapia y/o transplante de las células germinales hematopoyéticas alogenéicas (HSCT) .

En una modalidad preferida de los métodos y medios farmacéuticos de la invención, la leucemia linfoblástica aguda (ALL) pediátrica, es la leucemia linfoblástica aguda pediátrica (ALL) del linaje B, de manera preferida, una leucemia linfoblástica aguda pediátrica del precursor B. La vasta mayoría de casos de ALL pediátrica ( >85% ) , son del fenotipo de las células del precursor B. Se han propuestos varias clasificaciones de la ALL del linaje B (véase, por ejemplo, Schultz et al., Blood 109 ( 2007 ) : 926 - 935 ) . Con el fin de modular la intensidad de la terapia con relación a un riesgo de recaída del paciente, los pacientes con ALL del precursor B se estratifican actualmente en grupos de riesgo "bajo", "estándar", "alto" o "muy alto", utilizando parámetros de laboratorio y clínicos: edad del paciente, sexo, conteo de células sanguíneas blancas (WBC) en la presentación de la enfermedad, y la presencia o ausencia de anormalidades citogenéticas específicas. Las anormalidades genéticas que recurren frecuentemente, que ayudan a definir estos grupos de riesgo incluyen, por ejemplo: t (12; 21) [TEL-AML1] ; t (1 ; 19 ; ) [E2A-PBX] ; t (4 ; 11 ) [AF4-MLL] ; t ( 9 ; 22 ) [BCR-ABL] ; hiperdiploidia (o trisomía de los cromosomas 4, 10 y 17), e hipodiploidia; véase, por ejemplo, Sc ultz et al.; Bader et al., loe. cit. Utilizando los datos de varios estudios, se ha desarrollado e implementado un sistema de clasificación como COG AALL03B1 (Clasificación de la Leucemia Linfoblástica Aguda) (Raetz et al., Personalized Med. 2 (2005), 349-361; Schultz et al., Blood 109 (2007): 926-935) . Puesto que el anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 descrito en la presente está dirigido contra el marcador CD19 asociado con los linfocitos B, el anticuerpo es particularmente adecuado como un agente terapéutico para la leucemia linfoblástica aguda pediátrica del linaje B, de manera preferida, para la ALL pediátrica del precursor B. Las ALL pediátricas del precursor B pueden subdividirse además en ALL pro-B, ALL pre-B y ALL común (cALL) pediátricas. Como se muestra en los siguientes ejemplos, el tratamiento de acuerdo con los métodos de la invención del paciente 1 de siete años de edad con ALL común resistente a cualquier tratamiento, y por lo tanto, propenso a ser fatal, no solo resultó en una remisión hematológica completa sino en una remisión molecular completa. Dicho de otra forma: no pudo detectarse más la enfermedad residual mínima en este paciente después del tratamiento con el anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3. Particularmente preferida, la leucemia linfoblástica aguda (ALL) pediátrica es una ALL del precursor B, de manera más preferida, cALL. De manera importante, el anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 es capaz de destruir no sólo las células de ALL que tienen TCR o rearreglos de inmunoglobulina, sino todas las células ALL con varias otras anormalidades citogenéticas : Por ejemplo, se ha encontrado en el paciente 2 descrito en los siguientes, ejemplos, así como en pacientes con ALL en adultos, que el anticuerpo es capaz de tratar la ALL caracterizada por rearreglos de inmunoglobulina o TCR, translocaciones t(4;ll) o transcriptos de fusión bcr/abl (Ph+) . Particularmente, la ALL Ph+ y la ALL con translocaciones t(4;ll) se han reportado como extremadamente difíciles de tratar mediante la terapia convencional para la ALL, pero pudieron tratarse de manera exitosa con el anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3. Los datos mencionados indican que el anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 es capaz de tratar varias formas de ALL, incluyendo, por ejemplo, ALL caracterizada por t ( 12 ; 21 ) [TEL-AMLl ] ; t ( 1 ; 19 ; ) [E2A-PBX] ; t (4 ; 11 ) [AF4- LL] ; t (9 ; 22 ) [BCR-ABL] ; hiperdiploidia (o trisomía de los cromosomas 4, 10 y 17), hipodiploidia, así como rearreglos de inmunoglobulina o TCR; véase también la Tabla 1.

El diagnóstico de la ALL pediátrica se basa en características morfológicas, citoquímicas e inmunológicas de las células, incluyendo la morfología del linfoblasto en los frotis de médula ósea teñidos con Wright-Giemsa, tinción positiva para la desoxinucleótido transferasa terminal (TdT) , tinción negativa para la mieloperoxidasa, y expresión de la superficie celular de 2 o más antígenos de la diferenciación linfoide de los precursores de los linfocitos B. La inmunofenotipificación se describe, por ejemplo, por Behm F.G. (Immunophenotyping. En: Childhood Leukemias , C-H Pui ed. Cambridge: Cambridge University Press; 2006, p. 150-209), y puede realizarse, por ejemplo, mediante inmunofluorescencia indirecta, inmunohistoquimica y/o citometría de flujo.

El término "paciente" como se utiliza en la presente, se refiere a un paciente humano. El término "ALL pediátrica"' o "paciente con ALL pediátrica" como se refiere en la presente, denota a niños de un mes a 18 años. La edad indicada se entiende como la edad del niño en el diagnóstico de la enfermedad de la ALL. Los niños pueden subagruparse de manera más específica en infantes (1 a 12 meses de edad) , niños más jóvenes de 1 a 9 años de edad, y niños mayores y adolescentes (>10 a 18 años de edad) . Como se utiliza en la presente, el intervalo de tiempo que se define como "X a Y" se iguala con un intervalo de tiempo que se define como "entre X y Y". Ambos intervalos de tiempo, incluyen de 7 manera específica el límite superior y también el límite inferior. Esto significa que, por ejemplo, un intervalo de tiempo "de un mes a 18 años" incluye "un mes" y "18 años". De manera preferida, el paciente a ser tratado de acuerdo con la presente invención, es de casi 18 años de edad (incluyendo pacientes de 18 años de edad) .

Como se muestra en los siguientes ejemplos, el paciente 1 tenía siete años de edad cuando se trató con el anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3, con la ALL diagnosticada a los dos años de edad. El paciente 1 teñía quince años de edad cuando se trató con el anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3, con la ALL diagnosticada en el 2001., Las definiciones anteriores se aplican mutatis mutandis al término "leucemia linfoblástica aguda (ALL) pediátrica", "ALL de la niñez", o lo similar. Por ejemplo, la ALL pediátrica o de la niñez se entiende ' como la ALL diagnosticada en un paciente pediátrico de entre 1 mes (incluyendo 1 mes) y 18 años (incluyendo 18 años) de edad.

Aunque el anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 como se utiliza en la presente, puede administrarse per se, la administración en un portador farmacéuticamente aceptable se prefiere. Los ejemplos de portadores farmacéuticos adecuados son bien conocidos en la técnica, e incluyen soluciones salinas amortiguadas con fosfato, agua, liposomas, varios tipos de . agentes humectantes, soluciones estériles, etc. Las composiciones que comprenden tales portadores pueden formularse mediante métodos convencionales bien conocidos. Estas composiciones farmacéuticas pueden administrarse al paciente pediátrico en una dosis . adecuada. El régimen de dosificación se determinará por el médico que atiende y los factores clínicos. Como es bien conocido en el campo médico, las dosificaciones para cualquier paciente pediátrico dependen de muchos factores, incluyendo el tamaño del paciente, el área-de la superficie corporal, la edad, peso corporal, el compuesto particular a ser administrado, el sexo, tiempo y ruta de administración, salud general, y otros fármacos que son administrados de manera concurrente. Las preparaciones para la administración parenteral incluyen soluciones acuosas o no acuosas estériles o suspensiones. Los ejemplos de solventes no acuosos son propilenglicol , polietilenglicol y esteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Los portadores acuosos incluyen agua, soluciones o suspensiones acuosas, incluyendo solución salina y medio amortiguado. Los vehículos parenterales incluyen solución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, o solución de Ringer lactada. Los vehículos intravenosos incluyen reabastecedores de fluidos y nutrientes, reabastecedores de electrolitos (tales como aquéllos basados en dextrosa de Ringer) , y lo similar. Los conservadores y otros aditivos también pueden estar presentes, tales como, por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y gases inertes y lo similar. Además, la composición puede comprender portadores proteináceos , tales como, por ejemplo, seroalbúmina o inmunoglobulina, de manera preferida, de origen humano. Se considera que la composición puede comprender, además del anticuerpo biespecífico de una sola cadena, proteináceo, agentes biológicamente activos adicionales, dependiendo del uso pretendido de la composición farmacéutica. Tales agentes pueden ser agentes que actúan como citostáticos , agentes que evitan la hiperuricemia, agentes que inhiben las reacciones inmunes (por ejemplo, corticosteroides , FK506), fármacos que actúan en el sistema circulatorio y/o agentes tales como moléculas o citocinas coestimuladoras de los linfocitos T conocidas en la técnica. Por ejemplo, el tratamiento con el anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3, puede llevarse a cabo en combinación con quimioterapia intratecal tal como profilaxis del CNS, corticoides y/o alopurinol .

De manera preferida, el anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 como se define en la presente, está formulado en un amortiguador, un estabilizante y un agente tensoactivo. El amortiguador puede ser un amortiguador de fosfato, citrato, succinato o acetato. El estabilizador puede ser un aminoácido ylo un azúcar. Los agentes tensoactivos pueden ser detergentes, PEG, o lo similar. De manera más preferida, el anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 como se define en la presente, se formula en citrato, lisina, trehalosa y Tween 80. Como un diluyente para la composición farmacéutica de la invención, la solución salina isotónica y el Tween 80 se prefieren.

De manera preferida, en los métodos y medios farmacéuticos de la invención, la composición farmacéutica se va a preparar para la administración a un paciente pediátrico humano diagnosticado con leucemia linfoblástica aguda (ALL) .

El éxito de la terapia con el anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 puede verificarse mediante métodos estándar establecidos para las entidades de enfermedad respectivas : Para la terapia para la ALL de los linfocitos B, también pueden utilizarse la Clasificación de las Células Activadas con Fluorescencia (FACS) , aspiración de la médula ósea y varios parámetros clínicos y químicos específicos de la leucemia y otros métodos estándar establecidos conocidos en la técnica. Los métodos y medios para la determinación del estado de l enfermedad residual mínima (MRD) se describen en la presente.

La actividad citotóxica del anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3, puede detectarse mediante métodos conocidos en la técnica y métodos como se ilustran, por ejemplo, en la WO 99/54440, la WO 2004/106381, la O 2007/068354.

En una modalidad preferida de los métodos y medios farmacéuticos de la invención, la ALL del precursor B del paciente pediátrico tiene recaída y/o es resistente al tratamiento. Con el tratamiento actual para la ALL de la niñez, las proporciones de supervivencia libres de eventos son de aproximadamente 75%. Por lo tanto, 25% de los pacientes recaen a pesar del tratamiento tóxico y riesgoso para la salud. Los problemas en el manejo de la recaída de la ALL son la resistencia de las células leucémicas y la tolerancia reducida de los pacientes pediátricos a una segunda ronda de tratamiento después de haber recibido ya una terapia intensiva de línea frontal, resultando en una proporción de remisión menor, así como en una incidencia mayor de recaída posterior y un desenlace total inferior. Por lo tanto, la poliquimioterapia intensificada es es'encial para la inducción de una segunda remisión completa (Henze G, von Stackelberg A, Relapsed acute lymphoblastic leukemia. En: Childhood 'Leukemias, C-H Pui ed. Cambridge: Cambridge University Press; 2006, p. 473-486) . El término "resistente a la quimioterapia y/o al transplante de las células germinales alogenéicas" , como se utiliza en la presente, significa que los pacientes con ALL pediátrica . son resistentes a estas terapias, y por lo tanto, recaen después del tratamiento convencional para la ALL. También se considera que los pacientes pediátricos que recayeron después del tratamiento con el anticuerpo biespecifico de una sola cadena CDl9xCD3, reciban uno o más ciclos de tratamiento adicionales con el anticuerpo, con el fin de volver a los niños tratados negativos a la MRD. Tales pacientes pueden, por ejemplo, recibir un segundo HSCT alogenéico.

Como se muestra en los siguientes ejemplos, los métodos y medios farmacéuticos de la invención son particularmente adecuados para el tratamiento de pacientes pediátricos resistentes a las terapias convencionales para la ALL. Aunque los pacientes pediátricos mostrados han sido bastante pretratados con quimioterapia y transplante de las células germinales alogenéicas, los pacientes recayeron varias veces. Por lo tanto, los pacientes tenían un pronóstico extremadamente pobre. Sin embargo, después del tratamiento con el anticuerpo biespecifico de una sola cadena CDl9xCD3, los pacientes fueron negativos a la MRD, es decir, mostraron una remisión molecular completa. Dicho de otra forma: El tratamiento eliminó las células de la leucemia linfoblástica aguda del cuerpo de los pacientes pediátricos por debajo del límite de detección. De manera más importante, la médula ósea de los pacientes pediátricos se había limpiado de las células leucémicas.

En una modalidad preferida de los métodos y medios farmacéuticos" de la invención, la leucemia linfoblástica aguda (ALL) de los pacientes pediátricos es resistente a la quimioterapia y/o al HSCT alogenéico con respecto a la MRD. Dicho de otra forma: la MRD en los pacientes con ALL pediátrica es resistente a la quimioterapia y/o al HSCT alogenéico .

Se considera que los medios y métodos farmacéuticos de la invención son adecuados también para el tratamiento de la ALL pediátrica diagnosticada recientemente, en que proporciona una alternativa a los regímenes de tratamiento convencionales para la ALL pediátrica, tales como quimioterapia y/o el HSCT alogenéico.

En una modalidad preferida adicional, la leucemia linfoblástica aguda (ALL) recae en el transcurso de tres años del diagnóstico, de manera preferida, en el transcurso de dos años del diagnóstico, aún de manera más preferida en el transcurso de un año del diagnóstico. De manera preferida, la recaída es una recaída de la médula ósea.

El término "quimioterapia", como se utiliza en la presente, denota quimioterapia utilizada para el tratamiento de la leucemia linfoblástica aguda (ALL) pediátrica. La quimioterapia es el tratamiento inicial de elección para la ALL pediátrica (véase, por ejemplo, Pui CH, Jeha S, Nat Rev Drug Discov 6 ( 2007 ) : 149-165 ; Schmiegelow K, Gustaffson G.

Acute lymphoblastic leukemia. En: Cáncer in Children: Clinical Management. Voute PA, Barret A, Stevens MCG, Caron H (eds) . Londres, RU, Oxford University Press, 2005, p. 138-170; Schmoll, Hóffken, Possinger, loe. cit.) . La mayoría de los pacientes con ALL pediátrica terminan recibiendo una combinación de diferentes tratamientos.. En el tratamiento de la ALL pediátrica, no hay opciones quirúrgicas, debido a la distribución en todo el cuerpo de las células malignas. En general, la quimioterapia citotóxica para la ALL pediátrica combina múltiples fármacos antileucémicos en varias combinaciones. La quimioterapia para la ALL pediátrica consiste de tres fases: inducción de la remisión, intensificación y terapia de mantenimiento. La quimioterapia también está indicada para proteger el sistema nervioso central de la leucemia. El objeto de la inducción de la remisión es destruir rápidamente la mayoría de las células del tumor y llevar al paciente pediátrico a una remisión hematologica completa. Esto se define como la presencia de menos de 5% blastos leucémicos en la médula ósea (determinado mediante microscopía con luz) . Por ejemplo, la Clofarabina, Ciclofosfamida, VP16, Amsacrina, Prednisona, Melfalano o Citarabina, solos o en combinación, se utilizan para inducir la remisión. La intensificación utiliza dosis altas de una quimioterapia con múltiples fármacos intravenosos para reducir además la carga del tumor. Los protocolos de intensificación típicos utilizan vincristina, ciclofosfamida, citarabina, daunorrubicina, tioguanina o mercaptopurina dados como bloques en diferentes combinaciones. Puesto que las células del ALL algunas veces penetran el Sistema Nervioso Central (CNS) , la mayoría de los protocolos incluye el suministro de quimioterapia en el fluido del CNS, conocido comúnmente como quimioterapia intratecal . Algunos centros del tumor suministran el fármaco a través de un depósito de Ommaya (un dispositivo colocado quirúrgicamente bajo el cuero cabelludo y utilizado para suministrar fármacos al fluido del CNS y para extraer el fluido del CNS para varias pruebas) . Otros centros realizan múltiples punciones lumbares conforme se necesite para pruebas y suministro de tratamiento. El metotrexato o citarabina intratecales se utilizan actualmente para este propósito. El objeto de la terapia de mantenimiento es destruir cualquier célula residual que no haya sido destruida por la inducción de la remisión, y los regímenes de intensificación. Aunque tales células son pocas, pueden causar una recaída si no se erradican. Para este propósito, mercaptopurina oral diaria,- metotrexato oral una vez a la semana, un curso de 5 días una vez al mes de vincristina intravenosa (sic) . El largo de la terapia de mantenimiento es de 3 años para los niños, 2 años para las niñas y adultos. La recaída del sistema nervioso se trata con la administración intratecal de hidrocortisona, metotrexato y citarabina. Puesto que los regímenes de quimioterapia pueden ser intensos y prolongados (con frecuencia aproximadamente 2 años en el caso de los protocolos GMALL UKALL, HyperCVAD o CALGB; aproximadamente 3 años para los hombres en los protocolos COG) , muchos pacientes tienen un catéter intravenoso insertado en una vena grande (denominado un catéter venoso central o una línea de Hickman) , o un Portacath (una abertura con forma de cono con una punta de silicona que se implanta de manera quirúrgica debajo de la piel, usualmente cerca de la clavícula) . Sin embargo, la quimioterapia sigue siendo un procedimiento altamente tóxico, en particular para pacientes pediátricos.

Los pacientes pueden experimentar una recaída de la ALL después de la terapia inicial y/o volverse resistentes a la quimioterapia después del tratamiento. Los pacientes con ALL pediátrica que son resistentes a la quimioterapia, tienen un pronóstico marcadamente pobre. En particular, el pronóstico de los pacientes pediátricos con ALL Ph+ o ALL con translocaciones t(4;ll) tratados únicamente con quimioterapia es pobre. Puesto que el método de la invención es capaz de volver a los pacientes con ALL pediátrica negativos a la MRD, es particularmente útil para el tratamiento de pacientes con ALL resistente a la quimioterapia y/o al HSCT alogenéico. En vista de esto, el término "resistente a la quimioterapia y/o al HSCT alogenéico", como se utiliza en la presente, denota resistencia de las células de la leucemia linfoblástica aguda a la quimioterapia y/o al HSCT alogenéico.

El término "transplante de las células germinales hematopoyéticas alogenéicas (HSCT)", como se utiliza en la presente, significa el transplante de las células germinales hematopoyéticas alogenéicas (HSCT) o el transplante de médula ósea que es un procedimiento médico en el campo de la hematología y la oncología, que involucra el transplante de las células germinales hematopoyéticas (HSC) . Es realizado con más frecuencia para pacientes con enfermedades de la sangre o la médula ósea, o ciertos tipos de cáncer, tales como la ALL . La mayoría de los pacientes de los HSCT son pacientes con leucemia (por ejemplo, ALL) que se beneficiarían del tratamiento con dosis alta de quimioterapia o irradiación corporal . El HSCT alogenéico en niños con ALL se describe, por ejemplo, en Schrauder A, et al. (Bone Marrow Transplantation 41 (2008) : Sup 12 S71-74) . Sin embargo, el trahsplante de las células germinales alogenéicas sigue siendo un procedimiento riesgoso, en particular para pacientes pediátricos.

El término "elegible para el transplante de las células germinales hematopoyéticas alogenéicas (HSCT)", como se utiliza en la presente, significa . que el transplante de las células germinales alogenéicas es la terapia requerida para un paciente con ALL pediátrica. En los casos en donde el paciente con ALL pediátrica es elegible para el transplante de las células germinales alogenéicas, pueden considerarse los siguientes dos escenarios. Primero, en una modalidad de los métodos y medios farmacéuticos de la invención, la administración del anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 (solo o de manera preferida como una composición farmacéutica) , puede utilizarse para reemplazar el transplante de las células germinales alogenéicas utilizado como una terapia convencional para los pacientes con ALL pediátrica elegibles para el transplante. De manera que el método de la invención puede evitar los riesgos para la salud para los pacientes con ALL pediátrica, asociados con el HSCT alogenéico. Además, aproximadamente 30% de los pacientes con ALL pediátrica transplantados recaen usualmente después del transplante. De manera que el método de la invención, puede utilizarse para tratar a estos pacientes. En una modalidad alterna, la infusión continua del anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 al paciente con ALL pediátrica, puede seguirse por un transplante de las células germinales alogenéicas. En esta modalidad, la administración de una composición farmacéutica que comprende el constructo del anticuerpo, biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3, puede utilizarse para convertir pacientes con ALL pediátrica elegibles para el transplante a un .estado negativo a la MRD antes de que reciban el transplante. De esta manera, el método de la invención puede utilizarse con el fin de eliminar la MRD, que conduce a un riesgo menor de recaída que el tratamiento del transplante de pacientes positivos a la MRD. Los siguientes ejemplos presentan un paciente pediátrico (paciente 1), que se convirtió primero a un estado negativo a la MRD tras el tratamiento con el anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3, seguido por un transplante alogenéico. Hasta ahora (Noviembre del 2009), este paciente pediátrico es todavía negativo a la MRD.

El término "no elegible para el transplante de las células germinales hematopoyéticas alogenéicas (HSCT)", como se utiliza en la presente, significa aquellos pacientes pediátricos para quienes el transplante de las células germinales alogenéicas no es el tratamiento para la ALL de elección, por ejemplo, debido a razones médicas. Podría pasar que no esté disponible un donador apropiado para el transplante de las células germinales alogenéicas.

En consecuencia, en una modalidad, la leucemia linfoblástica aguda (ALL) es resistente al tratamiento con quimioterapia y/o al HSCT alogenéico en pacientes pediátricos no elegibles o ya no elegibles para el HSCT alogenéico. Por ejemplo, un paciente pediátrico puede estar en tal condición clínica mala que. no pueda llevarse a cabo un transplante de las células germinales alogenéicas por razones médicas.

El paciente 1 mostrado en los siguientes ejemplos no había sido elegible para el transplante de las células germinales alogenéicas antes del tratamiento con el anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3, debido a su pobre estado de salud. En tal caso, el tratamiento con el anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3, proporciona un nuevo procedimiento terapéutico para la ALL pediátrica .

Hasta ahora, la ALL significa la sentencia de muerte para los pacientes pediátricos resistentes a la quimioterapia o no elegibles para el HSCT alogenéico. El método de la invención por primera vez, proporciona una terapia para esta población de pacientes pediátrico, en que elimina la enfermedad residual mínima (MRD) , que de otra manera causaría una recaída y que mataría finalmente a los pacientes.

Está dentro del alcance de los métodos y medios farmacéuticos de la invención, que el constructo de un anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 se administre a pacientes con ALL pediátrica que han recibido quimioterapia,, sola o en combinación con el transplante de las células germinales alogenéicas, y que hayan recaído posteriormente.

En otra modalidad preferida, el método de la invención es para el tratamiento, mejora o eliminación de la enfermedad residual mínima (MRD) en un paciente pediátrico con leucemia linfoblástica aguda (ALL) .

El término "enfermedad residual mínima (MRD)", como se define en la presente, denota un término utilizado después del tratamiento, por ejemplo, con agentes quimioterapéuticos cuando las células leucémicas no pueden encontrarse en la médula ósea utilizando pruebas estándar, tales como métodos microscópicos. En su lugar, tienen que utilizarse pruebas más sensibles, tales como citometría de flujo (métodos basados en FACS) o reacción en cadena de la polimerasa (PCR) , con el fin de encontrar evidencia de que las células de la leucemia permanecen en la médula ósea del paciente con ALL pediátrica. De manera más específica, la presencia de células de leucemia por debajo del límite de detección citológico (5% de células leucémicas) , se define como la enfermedad residual mínima (MRD) . Si ninguna MRD es detectable (<10~4, es decir, menos de 1 célula de leucemia por 104 células de . médula ósea detectable) , una remisión molecular completa se alcanza (negatividad a la MRD o estado negativo a la MRD). Un "estado positivo a la MRD" , como se define en la presente, significa una señal medida mediante PCR o FACS por encima del límite de detección o un umbral cuantitativo. Un "estado negativo a la MRD" como se define en la presente, significa por debajo del límite de detección y/o por debajo de un .umbral cuantitativo medido mediante PCR o FACS. El valor del, pronóstico de la cuantificación de la enfermedad residual mínima en la ALL de la niñez, se ha descrito, por ejemplo, en Bader et al. (J. Clin. Oncol . 27 (2009): 377-384) o en Eckert et al. (Lancet 358 (2001): 1239-41). El estado de la MRD puede medirse mediante análisis con PCR o FACS, en que las anormalidades citogenéticas individuales mencionadas en la presente, y/o los rearreglos de los genes de inmunoglobulina. o los rearreglos del receptor de los linfocitos T (TCR) se detectan de manera cuantitativa. Por ejemplo, el análisis con PCR puede detectar los transcriptos de fusión tales como bcr/abl o translocaciones t(4;ll), así como rearreglos clónales individuales de las inmunoglobulinas (IgH) y/o los genes del receptor de los linfocitos T (TCR) .

Como se demuestra en los siguientes ejemplos, tras el tratamiento con el anticuerpo biespecífico de, una sola cadena CDl9xCD3 descrito en la presente, todas las células de la leucemia linfoblástica aguda pudieron eliminarse del cuerpo de los pacientes con ALL pediátrica, de manera que pudo lograrse la remisión molecular completa (es decir, un estado negativo a la MRD) .

Las anormalidades cromosomales recurrentes en las células malignas de pacientes pediátricos y de adultos con leucemia linfoblástica aguda, son las marcas de la enfermedad (Harrison y Foroni , Rev. Clin. Exp. Hematol . 6 (2002), 91-113). Las aberraciones específicas que son indicativas frecuentemente de lesiones moleculares subyacentes consistentes, pueden ayudar o incluso establecer el diagnóstico y determinar la terapia óptima. En la ALL de la niñez, numerosos subgrupos citogenéticos con un riesgo bueno y alto se han identificado, que se utilizan de manera regular para estratificar a los pacientes para las terapias particular (Pui y Evans,. N. Engl . J. Med. 354 (2006), 166-178) . En la ALL en adultos, el papel de la citogenética en el manejo de pacientes se ha centrado en gran medida en la presencia del cromosoma Philadelphia (Ph) , que surge usualmente de t (9 ; 22 ) (q34 ,-qll .2 ) , y resulta en la fusión BCR-ABL (Faderl et al., Blood 91 (1998), 3995-4019). Aunque la incidencia total de ALL Ph+ en adultos es de aproximadamente 25%, se correlaciona con la edad y se eleva más del 50% entre los pacientes mayores de 55 años (Appelbaum, American Society of Clinical Oncology 2005 education book. Alexandria: ASCO, 2005: 528-532). Otras translocaciones citogenéticas asociadas con las anormalidades genéticas moleculares específicas en la leucemia linfoblástica aguda (ALL) , se muestran en la Tabla 1 y también se describen en Schultz et al. o Bader et al., loe. cit.

Tabla 1: La citogenética, se ha reconocido de manera creciente como un predictor importante del desenlace en la ALL (Moormann et al., Blood 109 (2007), 3189-97).

Algunos subtipos citogenéticos tienen un pronóstico peor que otros. Estos incluyen, por ejemplo: (i) Una translocación entre los cromosomas 9 y 22, el cromosoma Philadelphia (Ph+) , ocurre en aproximadamente 20% de los adultos y en 5% de los casos pediátricos de la ALL. (ii) Una translación entre los cromosomas 4 y 11 que ocurre en aproximadamente 4% de los casos y es más común en infantes de menos de 12 meses .

Los rearreglos de los genes de inmunoglobulina o los rearreglos del receptor de los linfocitos T (TCR) y su papel en la ALL, se han descrito en la técnica (véase, por ejemplo, Szczepanski et al., Leukemia 12 (1998), 1081-1088).

En otra modalidad preferida de los métodos y medios farmacéuticos de la invención, el paciente con ALL pediátrica es positivo a la MRD en la remisión hematologica completa.

El término "remisión" o "remisión hematologica completa", como se utiliza en la presente, se entiende como que no tiene evidencia de enfermedad de la ALL después del tratamiento estándar, por ejemplo, después de la quimioterapia y/o el transplante. Esto significa que la médula ósea contiene menos de 5% de células de blastos determinado mediante microscopía de luz, los conteos de las células sanguíneas están dentro de límites normales, y no hay signos o síntomas de la enfermedad de la ALL. Sin embargo, puede ocurrir que no todas las células de leucemia pudieran eliminarse del cuerpo. Tal paciente, aunque clasificado como que está en remisión o en remisión hematologica completa, todavía es MRD positivo. Estas células del tumor restantes pueden dar lugar a leucemia recurrente . Los medios y métodos farmacéuticos de la invención pueden utilizarse para destruir estas células del tumor restantes, con el fin de evitar la recurrencia de la leucemia que se origina de las células de leucemia ocultas que permanecen en el cuerpo después de la terapia primaria. De esta manera, los medios y métodos farmacéuticos ayudan a evitar la recaída de la enfermedad en pacientes con ALL pediátrica.

En contraste, una "remisión molecular completa", significa que no hay evidencia de células de leucemia en las biopsias de la médula ósea, incluso cuando se utilizan pruebas muy sensibles tales como análisis con PCR o FACS . Dicho de otra forma: Si no se detecta ninguna MRD (<10~4, es decir, menos de una célula de leucemia por 104 células de médula ósea) , se alcanza una remisión molecular completa.

En otra modalidad preferida de los métodos y medios farmacéuticos de la invención, la administración de la composición farmacéutica convierte a la leucemia linfoblástica aguda (ALL) pediátrica positiva a la MRD a un estado negativo a la MRD.

En otra modalidad preferida de los métodos y medios farmacéuticos de la invención, la MRD se mide con detección cuantitativa de al menos una de las anormalidades o rearreglos citogenéticos seleccionados del grupo que consiste de: t (12,-21) [TEL-AML1] ; t (1;19; ) [E2A-PBX] ; t (4; 11) [AF4-MLL] ; t (9,-22) [BCR-ABL] ; hiperdiploidia o trisomías simultáneas de los cromosomas 4, 10 y 17; hipodiploidia (es decir, menos de 44 cromosomas) ; rearreglos de los genes de la inmunoglobulina; y rearreglos del receptor de los linfocitos T (TCR) . La MRD se mide con detección cuantitativa de al menos uno de: (i) las anormalidades citogenéticas individuales mencionadas en la presente, tales como t ( 12 ; 21 ) [TEL-AMLl ] ; t (1; 19 ; ) [E2A-PBX] ; t (4 ; 11 ) [AF4-MLL] ; t (9 ; 22 ) [BCR-ABL] ; hiperdiploidia (o trisomías simultáneas de los cromosomas 4, 10 y 17), hipodiploidia (es decir, menos de 44 cromosomas), o (ii) los rearreglos de los genes de la inmunoglobulina o los rearreglos del receptor de los linfocitos T (TCR); véase también la Tabla 1. La detección cuantitativa de las anormalidades o rearreglos citogenéticos mencionados se lleva a cabo de manera preferida utilizando, por ejemplo, análisis con PCR o FACS.

El método de la invención proporciona un procedimiento terapéutico para el tratamiento, mejora o eliminación de la MRD, reduciendo por lo tanto, o anulando incluso el riesgo de¦ recaída para el paciente con ALL pediátrica. De manera notable, el tratamiento curativo de la MRD en los pacientes con ALL pediátrica no había estado disponible hasta ahora.

En otra modalidad preferida de los métodos y medios farmacéuticos de la invención, el paciente pediátrico que tiene MRD muestra una señal para una anormalidad citogenética por encima del límite de detección y/o al menos un marcador mediante el rearreglo con una sensibilidad de =10"4. De manera preferida, la MRD se detecta mediante análisis de PCR y/o FACS .

Las anormalidades citogenéticas individuales mencionadas en la presente incluyen, por ejemplo, t (12,-21) [TEL-AML1] ; t ( 1 ; 19 ; ) [E2A-PBX] ; t (4 ; 11 ) [AF4-MLL] ; t (9 ; 22 ) [BCR-ABL] ; hiperdiploidia (o trisomía de los cromosomas 4, 10 y 17), hipodiploidia . Los rearreglos incluyen, por ejemplo, rearreglos de los genes de inmunoglobulina o rearreglos del receptor de los linfocitos T (TCR); véase también la Tabla 1. La MRD . representada por las células de ALL que portan las anormalidades y/o rearreglos citogenéticos puede detectarse mediante análisis con PCR o FACS .

Por ejemplo, el término "por encima de la señal bcr/abl por encima del, límite de detección" como se utiliza en la presente, significa que el análisis con PCR o FACS conduce a una señal bcr/abl detectable. De manera similar, una señal de la translocación t(4;ll) significa que la translocación puede detectarse mediante PCR o FACS. Esto se aplica mutatis mutandis a las otras anormalidades o rearreglos citogenéticos mencionados en la presente. El término "con una- sensibilidad de >10"4" en el contexto de los rearreglos, significa que al menos una célula de leucemia o más de una célula de leucemia (con el TCR o el rearreglo de la inmunoglobulina mencionado) por 104 células de médula ósea puede detectarse con los métodos mencionados .

En otra modalidad preferida de los métodos y medios farmacéuticos de la invención, el tiempo para la recaída molecular (detectable mediante los ensayos descritos anteriormente) es más de 6 meses, de manera preferida, más de 7, 8, 9, 10, 11 ó 12 meses, o aún de manera más preferida durante 2, 3, 4, 5 o más años.

El término "recaída molecular" como se utiliza en la presente, significa que el paciente pediátrico muestra una señal para una anormalidad citogenética por. encima del límite de detección y/o al menos un marcador mediante el rearreglo con una sensibilidad de =10"4, mediante PCR y/o FACS, como se expuso anteriormente.

En otra modalidad preferida de los métodos y medios farmacéuticos de la invención, las regiones de las regiones variables de cadena pesada (VH) correspondientes, y las regiones variables de cadena ligera (VL) correspondientes en el constructo de un anticuerpo biespecífico de , una sola cadena CDl9xCD3 se arreglan, del término N al término C, en el orden, VL (CD19 ) -VH (CD19 ) -VH (CD3 ) -VL (CD3 ) .

Las regiones de las regiones variables de cadena pesada (VH) correspondientes y las regiones variables de cadena ligera (VL) correspondientes de los dominios que se unen a CD3 y CD19 del anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 se muestran en la SEQ ID NOs . 3 a 10, respectivamente. Las regiones CDR correspondientes de las regiones VH y VL respectivas del anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 mencionado, se muestran en las SEQ ID NOs . 11 a 22.

En otra modalidad preferida de los métodos y medios farmacéuticos de la invención, el constructo de un anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO. 1, o una secuencia de aminoácidos al menos 90%,, de manera preferida, al menos 95% idéntica a la SEQ ID NO. 1.

La invención -describe una molécula del anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en la SEQ ID NO. 1, así como una secuencia de aminoácidos al menos 90% o de manera preferida 95% idéntica, de manera más preferida, al menos 96, 97, 98 ó 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 1. La invención describe también una secuencia de ácidos nucleicos correspondiente, como se describe en la SEQ ID NO. 2, así como una secuencia de ácidos nucleicos al menos 90%, de manera preferida 95% idéntica, de manera más preferida al menos 96, 97, 98 ó 99% idéntica a la secuencia de ácidos nucleicos mostrada en la SEQ ID NO. 2. Se entenderá que la identidad de la secuencia se determina sobre toda la secuencia nucleotídica o de aminoácidos.

Además, se entenderá que una molécula de un anticuerpo biespecífico de una sola cadena que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90% o de manera preferida 95% idéntica, de manera más preferida al menos 96, 97, 98 ó 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 1, contiene todas las secuencias CDR mostradas en las SEQ ID NOs . 11 a 22. Para las alineaciones de la secuencia, por ejemplo, pueden utilizarse los programas Gap o BestFit (Needleman y Wunsch J. Mol. Biol . 48 (1970), 443-453; Smith y Waterman, Adv. Appl . Math 2 (1981), 482-489), que está contenida en el paquete del programa GCG (Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, EUA 53711 (1991) . Es un método de rutina para aquellos con experiencia en la técnica, determinar e identificar una secuencia nucleotídica o de aminoácidos que tenga, por ejemplo, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de la secuencia con las secuencias nucleotídicas o de aminoácidos del anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 descrito en la presente. Por ejemplo, de acuerdo con la hipótesis de Wobble (bamboleo) de Crick, la base 5' en el anti-codón no está tan confinada espacialmente como las otras dos base, y podría, por lo tanto, tener un apareamiento de las bases no estándar. Dicho en otras palabras: la tercera posición en un triplet del codón puede variar de manera que los tripletes que difieren en esta tercera posición pueden codificar el mismo residuo de aminoácido. La hipótesis es bien conocida para las personas con experiencia en la técnica (véase, por ejemplo, http : / /en .wikipedia . org/wiki/Wobble_Hypothesis ; Crick, J Mol Biol 19 (1966): 548-55). Además, es un procedimiento de rutina para aquellos con experiencia en la técnica, determinar la actividad citotoxica de tal secuencia de aminoácidos, que tiene, por ejemplo, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de la secuencia con la secuencia nucleotídica o de aminoácidos del anticuerpo biespecífico de una sola cadena . CDl9xCD3 descrito en la presente. La actividad citotoxica del anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 o un constructo de anticuerpo que tiene, por ejemplo, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de la secuencia con las secuencias de aminoácidos del anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3, puede determinarse mediante los métodos ilustrados por ejemplo, en WO 99/54440, WO 2004/106381 o WO 2007/068354.

En otra modalidad preferida de los métodos y medios farmacéuticos de la invención, la composición farmacéutica que comprende un constructo de un anticuerpo biespecífico de una sola cadena CD19xCD3 se va a administrar mediante una infusión continua durante al menos cuatro semanas, seguido por un intervalo libre de tratamiento de 2 semanas. Un ciclo de tratamiento se entiende como una infusión continua del anticuerpo durante al menos cuatro semanas, seguido por un intervalo libre de tratamiento de 2 semanas. Este intervalo puede a su vez, ser seguido por uno o más ciclos de tratamiento o por un HSCT alogenéico. De manera preferida, la administración mediante la infusión continua del anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 (es decir, un ciclo de tratamiento.) se va a repetir al menos dos, tres veces, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o incluso hasta diez veces, después de la determinación de un estado negativo a la MRD, para la consolidación.

En una modalidad de los métodos y medios farmacéuticos de la invención, el método es antes del transplante de las células germinales alogenéicas para convertir la ALL positiva a la MRD a un estado negativo a la MRD.

En otra modalidad de los métodos y medios farmacéuticos de la invención, el método es después del HSCT alogenéico, por ejemplo, en casos en. donde la ALL pediátrica con recaída después de la terapia convencional para la ALL, utilizando quimioterapia y/o transplante de las células germinales alogenéicas .

En otra modalidad preferida de los métodos y medios farmacéuticos de la invención, el constructo de un anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 se va a administrar en una dosis diaria de 10 ig a 100 ig por metro cuadrado del área de la superficie corporal del paciente.

Como se utiliza en la presente, un intervalo de dosis que se define como "X a Y" se iguala con un intervalo de dosis que se define como "entre X y Y" . El intervalo incluye el límite superior y también el límite inferior. Esto significa, por ejemplo, una dosis diaria de 10 pg a 100 ug por metro cuadrado del área de la superficie corporal del paciente e incluye "10 ug" y "100 ug" .

En una modalidad aún más preferida de los métodos y medios farmacéuticos de la invención, el constructo de un anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 se va a administrar en una dosis diaria de 15 \ig , 30 ig , 60 ]ig o 90 ug por metro cuadrado del área de la superficie corporal del paciente. Aún más preferido, el anticuerpo se va a administrar en una dosis diaria de 15 a 30 xg por metro cuadrado del área de la superficie corporal del paciente, de manera más preferida, en una dosis diaria de 15 ó 30 \g por metro cuadrado del área de la superficie corporal del paciente.

El área de la superficie corporal promedio de un paciente pediátrico, se calcula por lo tanto, en el contexto del método o uso de acuerdo con la invención, para que esté en un intervalo de aproximadamente 0.2 a 2.2 m2. Para el cálculo, véase, por ejemplo, las fórmulas proporcionadas por http : / /www . cato . eu/koerperoberflaeche-kinder . html otra modalidad de los métodos y medios farmacéuticos de la invención, la leucemia linfoblástica aguda (ALL) pediátrica es diagnosticada recientemente, es ALL pediátrica resistente al tratamiento o con recaída, o ALL resistente al tratamiento o con recaída. La ALL pediátrica diagnosticada recientemente, como se utiliza en la presente, significa que la enfermedad de la ALL se ha diagnosticado en el paciente pediátricos por primera vez .

En . otra modalidad de los métodos y medios farmacéuticos de la invención, el método es para un paciente con alto riesgo de recaída, de acuerdo con la clasificación COGAALL03B1 de la leucemia linfoblástica aguda.

De manera ventajosa, la composición farmacéutica que comprende el anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 como se describe en la presente, comprende además, opcionalmente (a) amortiguadores de la reacción, soluciones de almacenamiento y/o reactivos o materiales restantes requeridos para el método o uso expuesto. Además, los componentes pueden empacarse de manera individual en viales o botellas o en combinación con recipientes o unidades con múltiples recipientes.

Con el fin de valuar la seguridad y tolerabilidad del anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 como se describe en la presente, el compuesto se va a administrar mediante una infusión continua a largo plazo.

Se ha encontrado que los efectos benéficos e inesperados de los medios y métodos farmacéuticos de la invención pueden obtenerse administrando el anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 en una dosis diaria de 10 microgramos a 100 microgramos por metro cuadrado del área de la superficie corporal. La dosis diaria puede mantenerse constante durante el periodo de administración. Sin embargo, también está dentro del ámbito de esta modalidad, que para los días iniciales del periodo de infusión, se administre una dosis menor del anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 ("dosis inicial") antes de los métodos farmacéuticos descritos en la presente, mientras que para el periodo de infusión restante, se aplique una dosis mayor ("dosis de mantenimiento"). Esta medida puede ayudar a adaptar el cuerpo del paciente al tratamiento con el anticuerpo y/o para evitar los efectos secundarios indeseados. Por ejemplo, 5 microgramos del anticuerpo biespecífico de una sola cadena por metro cuadrado del área de la superficie corporal pueden administrarse como una dosis inicial en los primeros días (por ejemplo, primer día o primer y segundo días, o primer, segundo y tercer días, etc., hasta el séptimo día) del periodo de infusión, seguido por la administración de 15 microgramos por metro cuadrado de superficie corporal como la dosis diaria para el periodo restante. O 5 microgramos del anticuerpo biespecífico de una sola cadena por metro cuadrado del área de la superficie corporal pueden administrarse como la dosis inicial en los primeros días del periodo de infusión, seguido por la administración de 30 ó 45 microgramos por metro cuadrado de superficie corporal como la dosis diaria durante el periodo restante. También se considera que 5 microgramos del anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 por metro cuadrado del área de la superficie corporal puedan administrarse en los primeros días del periodo de infusión, seguido por la administración de 15 microgramos del anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 por metro cuadrado del área de la superficie corporal para los siguientes días del periodo de infusión, seguido por la administración de 30 ó 45 microgramos por metro cuadrado de superficie corporal como la dosis diaria (mantenimiento) para el periodo de administración restante de un total de al menos 4 semanas. Las dos dosis iniciales pueden administrarse no sólo durante un día, sino también durante 2, 3, 4, 5, 6 ó 7 días o incluso más. El área de la superficie corporal promedio de un paciente, se calcula en la presente en el contexto de los métodos y medios farmacéuticos de acuerdo con la invención, para que esté en un intervalo de 0.2 a 2.2 m2.

La administración no interrumpida del anticuerpo biespecífico de , una sola cadena CDl9xCD3 puede ser intravenosa, parenteral, subcutánea, transdérmica, intraperitoneal , intramuscular o pulmonar. El modo de administración intravenoso será, en la mayoría de los casos, el modo de elección para administrar de manera no interrumpida el anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 y, como se sea el caso, para la coadministración de un agente farmacéutico como parte de un régimen de coterapia. Por lo tanto, la administración intravenosa es especialmente preferida. En este caso, puede elegirse de manera ventajosa, un dispositivo de dosificación adecuado tal como una bomba para infusión de terapias múltiples modelo 6060, fabricado por Baxter. Cualquiera que sea el dispositivo de dosificación elegido, debe ser de tal diseño y construcción que reduzca al mínimo, o mejor, que excluya una interrupción de la administración del agente terapéutico en el caso de intercambio del cartucho y/o reemplazo o recarga de la celda energética. Esto puede lograrse, por ejemplo, eligiendo un dispositivo con un depósito secundario de la solución del anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 separado del cartucho a ser intercambiado, de manera que la infusión continua de este depósito secundario en el paciente pediátrico, pueda continuar, incluso mientras el cartucho vacío o casi vacío se retira y reemplaza con uno nuevo.

Un modo de administración intravenosa, y dado el caso, de coadministración como parte de un régimen de coterapia, involucra el implante de una bomba en el cuerpo del paciente pediátrico para dosificar tal administración. 7 Alguien con experiencia ordinaria en la técnica está consciente de tales bombas de dosificación, por ejemplo, el modelo 6060 fabricado por Baxter, como se expuso anteriormente .

Como un ejemplo no limitante, puede ser que la administración no interrumpida, es decir, continua, se realice por un sistema de bomba pequeña usado por, o implantado en el paciente pediátrico para dosificar el flujo de agente terapéutico en el cuerpo del paciente. Tales sistemas de bomba se conocen generalmente en la técnica, y se basan comúnmente en un intercambio periódico de cartuchos que contienen el agente terapéutico a ser infundido. Cuando se intercambia el cartucho en tales sistemas de bomba, puede seguir -una interrupción temporal del flujo del agente terapéutico no interrumpido de otra manera en el cuerpo del paciente pediátrico. En tal caso, la fase de administración antes del reemplazo del cartucho y la fase de administración después del reemplazo del cartucho, se considerarían todavía dentro del significado de los medios y métodos farmacéuticos de la invención, para constituir juntas la "administración no interrumpida" de tal agente terapéutico. Lo mismo se aplicaría para las administraciones muy largas en las cuales el cartucho requeriría reemplazo más de una vez, o en el caso de que las celdas energéticas que accionan la bomba requirieran reemplazo, conduciendo a una desviación temporal del flujo de la solución terapéutica en el cuerpo del paciente.

También deben tomarse medidas apropiadas para reducir al mínimo el peligro de infección en el sitio de punción de la adminis ración en el cuerpo del paciente, puesto que las heridas a largo plazo son especialmente propensas a infección. Lo anterior también se aplica para la administración intramuscular vía un sistema de suministro similar.

La administración continua puede ser transdérmica, por medio de un parche usado en la piel y reemplazado a intervalos. Alguien con experiencia en la técnica está consciente de los sistemas de parche para el suministro del fármaco, adecuados para este propósito. Deberá notarse que la administración transdérmica es especialmente adecuada para la administración no interrumpida, puesto que el intercambio de un primer parche gastado puede lograrse de manera ventajosa con el reemplazo de un nuevo segundo parche, por ejemplo, en la superficie de la piel inmediatamente adyacente al primer parche gastado e inmediatamente antes de la eliminación del primer parche gastado. No surgen problemas de interrupción del flujo o de la falla de la celda energética .

Además, la invención se relaciona con un constructo de un anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 para el tratamiento, mejora o eliminación de la leucemia linfoblástica aguda (ALL) pediátrica, en donde el anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 se va a preparar para la administración a un paciente pediátrico.

La invención se relaciona además con el uso de un constructo de un anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3, para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento, mejora o eliminación de la leucemia linfoblástica aguda (ALL) pediátrica. Por lo tanto, la presente invención también se relaciona con un constructo de un anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3, como se define eri la presente, para el tratamiento, mejora o eliminación de . la leucemia linfoblástica aguda (ALL) pediátrica. Las modalidades descritas en la presente, en el contexto de los medios y métodos farmacéuticos se aplican aquí mutatis mutandis para la preparación de la composición farmacéutica correspondiente, que comprende los constructos anti-CD19xCD3 de los constructos de una sola, cadena, para la administración a un paciente pediátrico, en particular en el tratamiento, mejora o eliminación de la leucemia linfoblástica aguda (ALL) pediátrica.

De manera preferida, la leucemia linfoblástica aguda (ALL) pediátrica es leucemia linfoblástica aguda pediátrica del linaje B (ALL) , de manera preferida, leucemia linfoblástica aguda ALL pediátrica del precursor B, de manera más preferida, ALL pro-B, ALL pre-B o ALL común (cALL) pediátricas. De manera aún más preferida, la ALL es cALL.

En una¦ modalidad preferida de los usos médicos mencionados, la ALL del precursor B es con recaída y/o resistente al tratamiento convencional para la ALL, tal como quimioterapia y/o el HSCT.

De manera preferida, la leucemia linfoblástica aguda (ALL) recae en el transcurso de aproximadamente tres años del diagnóstico.

En otra modalidad preferida de los usos médicos' mencionados, el constructo de un anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 es para el tratamiento, mejora o eliminación de la enfermedad residual mínima (MRD) en un paciente pediátrico con leucemia linfoblástica aguda (ALL) . De manera preferida, el paciente pediátrico es positivo a la MRD en la remisión hematologica completa.

En una modalidad préferida adicional de los usos médicos mencionados, la administración del anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 convierte la leucemia linfoblástica¦ aguda (ALL) pediátrica positiva a la MRD a un estado negativo a la MRD.

De manera preferida, la MRD se mide con la detección cuantitativa de las anormalidades o rearreglos citogenéticos individuales, como se define en la presente, utilizando análisis de PCR y/o FACS.

Aún de manera más preferida, los pacientes con ALL pediátrica muestran una señal para una anormalidad citogenética por encima del límite de detección y/o al menos un marcador, mediante el rearreglo con una sensibilidad de =10"4.

En otra modalidad preferida de los usos médicos mencionados, el tiempo, para la recaída molecular detectable por los métodos de detección indicados es de más de 6 meses.

En otra modalidad preferida de los usos médicos mencionados, las regiones de las regiones variables de cadena pesada (VH) correspondientes y las regiones variables de cadena ligera (VL) correspondientes en él constructo de un anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 se arreglan del término N al término C, en el orden, VL(CD19)-VH(CD19) -VH(CD3) -VL(CD3) .

De manera preferida, el constructo de un anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO. 1, o una secuencia de aminoácidos al menos 90%, de manera preferida 95% idéntica a la SEQ ID NO. 1.

En una modalidad preferida adicional de los usos médicos mencionados, un ciclo de tratamiento es una infusión continua durante al menos cuatro semanas, seguido por un intervalo libre de tratamiento de 2 semanas.

De manera preferida, la administración se va a repetir al menos dos, tres, cuatro, cinco; seis, siete, ocho, nueve o diez veces, después de la determinación de un estado negativo a la MRD.

En otra modalidad, la administración es antes del transplante de las células germinales alogenéicas para convertir la ALL positiva a la MRD en un estado negativo a la MRD.

En una modalidad alterna, la administración es después del transplante de las células germinales alogenéicas.

En otra modalidad preferida de los usos médicos mencionados, el constructo de un anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 se va a administrar en una dosis diaria de 10 ug a 100 ug por metro cuadrado del área de la superficie corporal del paciente.

De manera preferida, el constructo de un anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 se va a administrar en una dosis diaria de 15 µg a 30 \ig por metro cuadrado del área de la superficie corporal del paciente.

En otra modalidad de los usos médicos mencionados, la administración del constructo de un anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 reemplaza el transplante de las células germinales alogenéicas en pacientes pediátricos elegibles para el transplante de las células germinales alogenéicas.

Las modalidades, definiciones y explicaciones proporcionadas con respecto a los métodos y medios farmacéuticos de la invención se aplican mutatis mutandis a los usos médicos del constructo de un anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 descrito en la presente.

Las Figuras muestran: Figura 1 : modo de acción del anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 (bscab CDl9xCD3). El anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 (SEQ ID NO. 1) redirige los linfocitos T citotóxicos CD3 positivos para eliminar las células de la leucemia linfoblástica aguda humana que portan el antígeno CD19.

Figura 2 : Falla de la terapia convencional para la ALL en un paciente de 7 años de edad con ALL común. Un año después del HSCT, el paciente pediátrico experimentó una segunda recaída de la médula ósea y recibió quimioterapia posterior incluyendo 1 ciclo de Clofarabina/Ciclofosfamida/VPl6 , 2 ciclos de Amsacrina, VP16, pr'ednisona y 1 ciclo de Melfalano/Citarabina . A pesar de esta quimioterapia agresiva, el paciente tuvo enfermedad morfológica persistente durante el tratamiento, como se demuestra por los altos niveles de la RD. El eje y izquierdo indica el % de FACS-MRD, el eje y derecho indica PCR-MRD (de 10° a <10"4) , el, eje x indica los días desde el primer HSCT; véase el Ejemplo 4.

Figura 3 : Tratamiento exitoso del paciente pediátrico mediante la administración del anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 (bscab CDl9xCD3; SEQ ID NO. 1), como se demuestra por la MRD antes, durante y después del tratamiento con el anticuerpo. Después de la falla de la terapia convencional para la ALL, el paciente se trató con una infusión continua de 15 ug/m2 del anticuerpo biespecifico de una sola cadena CDl9xCD3 (SEQ ID NO. 1) durante 5 semanas. Tras el tratamiento con el anticuerpo, pudo alcanzarse la negatividad de la MRD. En 10/2008, es decir, 2 semanas después del final del tratamiento con el anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 (día 0 en las Figuras 3 a 5) , se sometió a un segundo HSCT de su madre haploidéntica utilizando un régimen preparativo- que no es mieloablativo de Clofarabina, Tiotepa y melfalano (Lang) indicado por la barra de acondicionamiento. El eje y izquierdo indica el % de FACS-MRD, el eje y derecho indica PCR-MRD (de 10° a <10~4) , el eje x indica los días desde el primer HSCT, el día M0" indica el día del segundo HSCT (después del tratamiento con el anticuerpo) ; véase el Ejemplo 4.

Figura 4 : Desarrolló temporal de los conteos de blastos antes y después del tratamiento con el anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 (bscab CDl9xCD3; SEQ ID NO. 1) . Un análisis de la médula ósea en el día 10 del tratamiento con el anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 reveló una eliminación completa de los blastos de la médula ósea (MRD < 10~4) por el anticuerpo. Otro análisis BM al final del tratamiento con anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 en el día 35, confirmó la ausencia completa de blastos leucémicos de la médula ósea (MRD <10"4) . El eje y izquierdo indica el conteo de blastos mediante citometría de flujo en %, el eje y derecho indica el conteo de blastos mediante microscopía en %, el eje x indica los días desde el HSCT, con los días negativos indicando los días desde el primer HSCT, el día " 0" indica el día del segundo HSCT (después del tratamiento con el anticuerpo) y los días positivos indican los días después del segundo HSCT.

Figura 5: Disminución de los niveles de la MRD tras el tratamiento con el anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 (bscab CDl9xCD3; SEQ, ID NO. 1) . Tras el tratamiento con el anticuerpo, pudo alcanzarse la negatividad de la MRD. Para el 6/2009, el paciente permanece en remisión molecular completa negativa a la MRD. El eje y izquierdo indica el % de FACS-MRD, el eje y derecho indica PCR-MRD (de 10° a <10"4) , el eje x indica los días desde el HSCT, con los días negativos indicando los días desde el primer HSCT y w0" indicando el día del segundo HSCT y los días positivos indicando los días desde el segundo HSCT.

La invención es ilustrada además mediante los siguientes ejemplos: Ejemplos: 1. Anticuerpo de una sola cadena biespecífico CDl9xCD3 La generación, expresión y actividad citotoxica del anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 se ha descrito en la WO 99/54440. Las secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos correspondientes del anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 se muestran en las SEQ ID NOs. 1 y 2, respectivamente. Las regiones VH y VL del dominio de unión de CD3 del anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 se muestran en las SEQ ID NO. 7 a 10, respectivamente, mientras que las regiones VH y VL del dominio de unión a CD19 del anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 se muestran en las SEQ ID NOs 3 a 6, respectivamente. 2. Análisis fenotípicos de los linfocitos y análisis del quimerismo Para los análisis fenotípicos de los linfocitos y el análisis del quimerismo, las muestras de sangre del paciente se recolectaron antes, durante y después del tratamiento con el anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 utilizando tubos de recolección que contiene EDTA. El número absoluto de linfocitos en las muestras de sangre fue determinado a través del análisis de sangre diferencial en un Advia. Los linfocitos se tiñeron utilizando anticuerpos marcados con fluorescencia dirigidos contra CD3 , CD4, CD8, CD19 y CD56 (todos obtenidos de Becton-Dickinson, Heidelberg, Alemania) . El análisis de las células marcadas y la recolección de datos se realizaron con un FACSCalibur (Becton-Dickinson) . 3. Detección de la MRD Para la detección de la MRD, se utilizó un ensayo basado en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Bader et al., loe. cit.) o análisis FACS. Brevemente, el ADN .se aisló mediante el Equipo para Sangre y Tejido DNeasy (Qiagen GmbH, Hilden, Alemania) . Los rearreglos de la inmunoglobulina y del gen del receptor de los linfocitos T como los objetivos basados en PCR han mostrado recientemente ser marcadores estables para verificar la MRD en la leucemia linfoblástica aguda después del transplante de las células germinales (Kreyenberg, Leukemia, 2009) . 4. Reportes del caso 4.1 Reporte del caso paciente 1 Este paciente de 7 años de edad se diagnosticó con ALL común CD10+ de alto riesgo (positiva a CD19, CD34; reducida CD45; rearreglos del TCR; negativa para el CNS) en el 2004. Después del tratamiento, experimentó una recaída de la médula ósea en Junio del 2006 y se trató de acuerdo con el estudio ALL-REZ BFM en el grupo S3. Después de dos ciclos de quimioterapia, el paciente tuvo enfermedad persistente y logró una remisión completa después de 3 cursos de clofarabina. En el 2007, recibió un HSCT alogenéico de un donador no relacionado con 9 de 10 alelos HLA que coincidían, después del acondicionamiento con irradiación total del cuerpo y Etopósido. Un. año después del HSCT, experimentó otra recaída de la médula ósea y recibió quimioterapia posterior incluyendo un ciclo de Clofarabina/Ciclofosfamida/VPl6 (Nobuko) , 2 ciclos de Amsacrina, VP16, prednisona (Hamburgo) y 1 ciclo de Melfalano/Citarabina; véase la Figura. 2. A pesar de esta quimioterapia agresiva, el paciente tuvo enfermedad morfológica persistente durante el tratamiento, como es evidente de los altos niveles de la MRD en la Figura 2. Fue tratado entonces bajo un uso compasivo con una infusión continua de 15 ig/m2 del anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 (blinatumomab; SEQ ID NO. 1) durante 5 semanas; véase la Figura 3. El análisis en serie de las poblaciones de linfocitos antes (día 0) y durante el tratamiento con el anticuerpo mencionado mostró una expansión impresionante de los linfocitos T CD8+, mientras que se notó ningún cambio en los linfocitos T CD4+ t las células NK • CD56+. Tras el tratamiento con el anticuerpo, pudo lograrse la negatividad a la MRD . El análisis del quimerismo concomitante mostró un quimerismo 100% del donador. Como se muestra en la Figura 4, los análisis de médula ósea en el día 10 del tratamiento con el anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3, reveló una completa eliminación de los blastos de la médula ósea (MRD < 10"4) . Otro análisis de la BM al final del tratamiento con el anticuerpo biespecífico - de una . sola cadena CDl9xCD3 mostró nuevamente una ausencia completa de blastos leucémicos de la médula ósea (MRD <1Ó"4) . Los análisis en serie de la MRD antes, durante y después del tratamiento con el anticuerpo se describen en la Figura 5. Antes del tratamiento con el anticuerpo, el paciente pediátrico tenía un pronóstico muy pobre y no era elegible al HSCT debido a su mala condición clínica. Tras el tratamiento con el anticuerpo, pudo lograrse la negatividad a la MRD. Además de signos discretos transitorios de ataxia, no se observaron efectos secundarios mayores y no se observaron signos de GvHD, a pesar de la impresionante expansión de los linfocitos T CD8+ derivados del donador. En 10/2008, 2 semanas después del final del tratamiento con el anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 (es decir, día 0 en las Figuras 3 a -5), se sometió a un segundo HSCT de su madre haploidéntica utilizando un régimen preparativo no mieloablativo que consiste de Clofarabina, Tiotepa y melfalano (Lang) . Para el 11/2009, el paciente había permanecido en una remisión completa negativo a la MRD. 4.2 Reporte del caso Paciente 2 Este paciente de quince años de edad se diagnosticó con ALL del precursor B con el cromosoma Philadelphia y CD19 positivo en Abril del 2001. Después de la quimioterapia, recibió un HSCT de un hermano con HLA idéntico en Octubre del 2001, después del acondicionamiento con TBI de 12 Gy y etopósido. En el 2002, se diagnosticó una recaída de la médula ósea y se logró otra remisión con matinib y quimioterapia. Recibió entonces un segundo HSCT de un donador no relacionado con el HLA idéntico en Octubre del 2004. En Marzo del 2008, se diagnosticó una segunda recaída y se trató con quimioterapia de dosis baja y Dasatinib debido a la resistencia al Imatinib. Después de la quimioterapia adicional con Clofarabina y Citosina/Arabinósido, logró una remisión molecular y recibió un tercer HSCT alogenéico de su padre con 3 de 6 alelos HLA que no coincidían, con tratamiento postransplante con Dasatinib. Debido al sangrado gastrointestinal y a cardiomiopatía dilatante, el Dasatinib se interrumpió 5 meses después del transplante. En Abril del 2009, se diagnosticó una recaída combinada del sistema nervioso central (CNS) con 7xl09/L blastos en el CNS y 3% de blastos en la médula ósea. El paciente se trató entonces con Nilotinib, quimioterapia intratecal y radiación fraccionada del CNS con 18 Gy. Tres meses después de este tratamiento, la médula ósea del paciente, permaneció positiva a la MRD a nivel de 1.1 xlO"3 mientras el CNS estuvo libre de blastos. El análisis del quimerismo de la sangre periférica reveló una hematopoyesis completa derivada del donador de su padre haploidéntico .

El paciente se trató entonces bajo un uso compasivo con un solo agente, blinatumomab a 15 ug/m2/día durante 4 semanas mediante infusión continua sin ningún efecto secundario. Una aspiración de la médula ósea al final del tratamiento mostró una remisión completa con MRD indetectable en la médula ósea por debajo de <lxl0"4. Como el paciente 1, el paciente 2 no mostró ningún signo de GvHD durante después del tratamiento con blinatumomab. Dos semanas después del final del tratamiento con blinatumomab, el paciente experimentó una reacción hemolítica transitoria desencadenada por una infección. El paciente 2 está actualmente sin recaía cuatro semanas después del tratamiento. Está bien y está asistiendo a la escuela. 4.3 Resumen Los fármacos hasta ahora disponibles para el tratamiento de la ALL son de baja especificidad y afectan una variedad de otras células, resultando en efectos secundarios 9 severos tales como inmunosupresión, aplasia de la médula ósea, mucositis, neuropatía, cardiotoxicidad y alopecia. Por lo tanto, se necesitan urgentemente procedimientos mejor dirigidos con menos efectos secundarios. Además, en algunos pacientes, las clonas de ALL desarrollan resistencia completa a la quimioterapia convencional, en particular aquellas clonas que surgen post-HSCT, de manera que son deseables fármacos con un modo de acción distinto. La eficacia de la citotoxicidad dependiente del anticuerpo vía los receptores Fe de las células N y los granulocitos , , en combinación con quimioterapia, podría demostrarse en la ALL pediátrica utilizando el anticuerpo monoclonal quimérico rituximab. Actualmente,, el blinatumomab es el único anticuerpo en ensayos clínicos que permite el acoplamiento de los linfocitos T citotóxicos para seleccionar a CD19 en los linfomas no de Hodgkin y las leucemias linfáticas de los linfocitos B. Los linfocitos T son considerados por tener un potencial citotóxico mayor que aquellas células inmunes acopladas mediante anticuerpos monoclonales convencionales .

Se supone que el efecto GvL alogenéico es una de las principales razones de la eficacia antileucémica del HSCT. Desafortunadamente, la aparición del GvL está asociada con frecuencia con la GvHD, que es todavía una causa principal de morbilidad y mortalidad después del HSCT alogenéico. Por lo tanto, la inducción de GvL en la ausencia de la GvHD es un tópico de investigación extenso. Un procedimiento para la inducción del efecto GvL es la infusión de linfocitos donadores (DLI) . Mientras que la DLI es muy efectiva en el tratamiento de la CML, es menos efectiva en el tratamiento postransplante de la ÁLL con recaída y con frecuencia conduce a la aparición de GvHD crónica con un daño significativo de la calidad de vida para los niños afectados.

Un posible procedimiento para inducir el GvL sin GvHD es la activación in-vivo de los linfocitos T derivados del donador después del HSCT, utilizando dosis bajas del anticuerpo que acopla los linfocitos T blinatumomab, que puede dirigir los linfocitos T contra los blastos CD19 positivos de la ALL de los pacientes. Este anticuerpo ha mostrado una actividad antilinfoma y antileucémica impresionante en la situación autóloga, pero nunca se había probado en la ALL con recaída después del HSCT o en niños . En la situación autóloga, las remisiones moleculares se han inducido en 13 de 16 pacientes adultos evaluables con ALL positiva a la MRD. Ambos pacientes pediátricos descritos anteriormente, mostraron una respuesta antileucémica impresionante después del inicio del tratamiento. En ambos casos, la MRD cayó por debajo del nivel de detección sin ningún signo de GvHD, a pesar de la extensa expansión de los linfocitos T derivados del donador. Esto podría deberse al hecho de que la acción del blinatumomab es independiente de la presentación del antígeno peptídico. regular y puede no implicar el acoplamiento del repertorio de los linfocitos T sin exposición previa.

Los niveles de dosis de blinatumomab tan bajos como 15 ig/m2 por día, fueron suficientes para inducir la expansión de los linfocitos T derivados del donador y eliminar los blastos de la ALL por debajo del nivel de detección de la MRD. Esto resalta que el acoplamiento de los linfocitos T es muy diferente del modo de acción de los anticuerpos monoclonales convencionales, que requieren dosis mucho mayores y no pueden acoplar los linfocitos T citotoxicos debido a su falta de receptores Fe.

El Blinatumomab fue bien tolerado en ambos pacientes causando sólo fatiga, ataxia leve y temblor de CTCAE grado 1-2. En el paciente 2, no se observaron efectos secundarios a pesar de los pretratamientos intensos . La infusión i.v. continua durante varias semanas fue bien aceptada por ambos pacientes pediátricos.

De esta primera experiencia clínica en la ALL pediátrica, los inventores concluyen que el blinatumomab es bien tolerado y puede inducir rápidamente las remisiones hematológicas completas y negativas a la MRD en niños con enfermedad resistente al tratamiento con terapia, después de múltiples recaídas de la ALL del precursor B CD19 positivo post-HSCT alogenéico. Vale la pena notar que ninguno de los 7 pacientes mostró ningún signo de GvHD a pesar de la expansión de los linfocitos T derivados del donador, incluso después del transplante haploidéntico que no coincidía.

Estos primeros resultados indican que el tratamiento de los pacientes con leucemia linfoblástica aguda (ALL) pediátrica con el anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 es capaz de eliminar completamente las células de la leucemia linfoblástica aguda del cuerpo de los pacientes pediátricos. De manera importante, este tratamiento resultó no sólo en la remisión hematológica completa, si no en la remisión molecular completa en que la leucemia linfoblástica aguda (ALL) positiva a la enfermedad residual, mínima (MRDj se ha convertido a un estado negativo a la MRD. El tratamiento fue bien tolerado. A la luz de esto, la administración del anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 descrito en la presente proporciona una opción de tratamiento mejorada para la leucemia linfoblástica aguda (ALL) pediátrica, en particular para la ALL resistente al tratamiento con quimioterapia y/o HSCT alogenéico y/o ALL con recaída.

Los resultados pueden resumirse brevemente como sigue: • Dos pacientes pediátricos se han tratado en una base de uso compasivo.

· Negatividad a la MRD en curso en dichos pacientes .

• Sin eventos adversos (AE) principales observados .

• Todos los AE fueron transitorios, no fue necesaria una interrupción del tratamiento .

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para el tratamiento, mejora o eliminación de la leucemia linfoblástica aguda (ALL) pediátrica, el método comprende la administración de una composición farmacéutica que comprende un constructo de un anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 a un paciente con ALL pediátrica en necesidad del mismo.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la leucemia linfoblástica aguda (ALL) pediátrica es leucemia linfoblástica aguda pediátrica del linaje B (ALL) , de manera preferida, leucemia linfoblástica aguda ALL pediátrica del precursor B, de manera más preferida, ALL pro-B, ALL pre-B o ALL común (cALL) pediátricas.

3. El método de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque la leucemia linfoblástica aguda (ALL) es ALL resistente al tratamiento y/o con recaída.

- 4. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la leucemia linfoblástica aguda (ALL) es ALL con recaída, de manera preferida, la recaída de la ALL es en el transcurso de tres años del diagnóstico.

5. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el método es para el tratamiento, mejora o eliminación de la enfermedad residual mínima (MRD) en un paciente con ALL pediátrica.

6. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque- el paciente con ALL pediátrica es positiva a la MRD en la remisión hematologica completa.

7. El método de conformidad con la reivindicación 5 ó 6, caracterizado porque el método convierte la ALL ¦positiva a la MRD a un estado negativo a la MRD.

8. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en donde la MRD se mide con la detección cuantitativa de al menos uno de las anormalidades o rearreglos citogenéticos seleccionados del grupo que consiste de: t (12; 21) [TEL-AMLl ] ; t (1;19; ) [E2A-PBX] ; t (4; 11) [AF4-MLL] ; t (9; 22) [BCR-ABL] ; hiperdiploidia o trisomías de los cromosomas 4, 10 y 17; hipodiploidia; rearreglos de los genes de inmunoglobulina; . y receptor de los linfocitos T (TCR) rearreglos.

9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el paciente con ALL pediátrica muestra una señal para las anormalidades citogenéticas por encima del límite de detección y/o al menos un marcador mediante el rearreglo con una sensibilidad de =10~4.

10. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque las regiones de las regiones variables de cadena pesada (VH) correspondientes y las regiones variables de cadena ligera (VL) correspondientes en el constructo de un anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 se rearreglan, del término N al término C en el orden, VL (CD19 ) -VH (CD19 ) -VH(CD3) -VL(CD3) .

11. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el constructo de un anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO. 1, o una secuencia de aminoácidos al menos 90%, de manera preferida, 95% idéntica a la . SEQ ID NO. 1.

12. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque la composición farmacéutica que comprende un constructo de un anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 se va a administrar mediante una infusión continua durante al menos cuatro semanas, seguido por un intervalo libre de tratamiento de 2 semanas .

13. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la administración se va a repetir al menos dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve de diez veces, después de la determinación de un estado negativo a la MRD.

14. El método de conformidad con la reivindicación 12 ó 13, caracterizado porque el método es antes del transplante de las células germinales alogenéicas (HSCT) para convertir la ALL positiva a la MRD a un estado negativo a la MRD.

15. El método de conformidad con la reivindicación 12 ó 13, caracterizado porque el método es después del transplante de las células germinales hematopoyéticas alogenéicas (HSCT) .

16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque un constructo de un anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 induce un efecto de injerto versus leucemia (GvL) .

17. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque el constructo de un anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 se va a administrar en una dosis diaria de 10 yg a 100 \ig por metro cuadrado del área de la superficie corporal del paciente.

18. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el constructo de un anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 se va a administrar en una dosis diaria de 15 ]ig a 30 ]ig por metro cuadrado del área de la superficie corporal del paciente.

19. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, caracterizado porque el método es para un paciente con ALL pediátrica con alto riesgo de recaída, de acuerdo con la clasificación COGAALL03B1 de la leucemia linfoblástica aguda.

20. El método de conformidad con la reivindicación 1 ó 2,. caracterizado porque el paciente no es elegible para el transplante de las células germinales alogenéicas.

21. Un constructo de un anticuerpo biespecífico de una sola cadena CDl9xCD3 para el tratamiento, mejora o eliminación de la leucemia linfoblástica aguda (ALL) pediátrica.