PT2242479E - Filtração de proteínas por contrapressão - Google Patents

Description

1

DESCRIÇÃO "FILTRAÇÃO DE PROTEÍNAS POR CONTRAPRESSÃO" ANTECEDENTES Campo da Divulgação A descrição relaciona-se, de uma maneira genérica, a métodos de filtração para a purificação de proteínas. Mais particularmente, a descrição relaciona-se com a filtração estéril a baixo cisalhamento, e contrapressão de proteínas suscetíveis a danos por forças de cisalhamento (por exemplo, proteínas sensíveis ao cisalhamento, proteínas de cascata da coagulação sanguínea) , por exemplo, quando são transportadas num fluido.

Breve Descrição da Tecnologia Relacionada

Misturas de proteínas purificadas podem ser administradas a doentes para uma variedade de utilizações terapêuticas. Uma mistura de proteínas purificadas preparada para perfusão em doentes deve ser esterilizada antes da utilização. Um processo de esterilização adequado para algumas proteínas inclui filtração em membrana de uma mistura de proteínas purificadas. A membrana filtro pode ser dimensionada para reter (isto é, remover da mistura de proteínas) partículas, microrganismos, e alguns vírus, ao passo que as proteínas são capazes de passar através da membrana. Gésan et al. Journal of Membrane Science. 1993. 80. 131-145 referem-se ao sucesso de concentrados de proteína do soro do leite alta pureza devido à microfiltração com uma membrana Carbosep M14 (diâmetro de poro de 0,14 micrómetros). 2

Mietton-Peuchot et al. Journal of Membrane Science. 1997. 133. 73-82 divulga um processo de microfiltração de corrente transversal prejudicado pelo significativo problema de sugidade devido a um tamanho de poro que favorece a penetração dos solutos.

No entanto, algumas proteínas não são eficientemente recuperadas como proteínas purificadas, esterilizadas utilizando-se métodos convencionais tais como filtração em membrana. Este efeito é mais pronunciado quando se tenta filtrar proteínas que são sensíveis ao cisalhamento e/ou parte da cascata da coagulação sanguínea. Um exemplo de tal proteína é o fator von Willebrand (vWF), o qual circula no plasma complexado com fator VII e assiste na regulação da atividade biológica de coagulação sanguínea. Especificamente, as proteínas vWF são sensíveis a forças de cisalhamento induzidas pelo gradiente de velocidade de um meio fluido de transporte, em particular quando as proteínas vWF passam através ou próximo a uma membrana filtro (isto é, onde restrições ao escoamento e caminhos tortuosos de escoamento na vizinhança dos poros da membrana filtro resultam em gradientes de velocidade particularmente grandes). Assim, quando unidades de filtração são operadas a pressões suficientes para idealmente gerar taxas de fluxo de processo desejáveis, maiores taxas de fluxo (e o aumento das forças de cisalhamento induzidas que acompanham) tendem a reduzir o rendimento do processo, por exemplo, pelo dano ou destruição das proteínas, e/ou pela redução da taxa de filtração ao longo do tempo.

Em concordância, seria desejável desenvolver um método de filtrar uma mistura de vWF purificada de uma maneira que não danifique substancialmente as proteínas vWF, embora o tal método ainda permitisse um rendimento de processo 3 adequadamente alto (isto é, taxa de filtração) ao longo do tempo. Adicionalmente, seria desejável desenvolver um método de filtração geralmente aplicável a qualquer proteína, de tal modo que a proteína em geral possa ser filtrada (por exemplo, esterilizado por filtração) a uma taxa eficiente sem incorrer em dano substancial/perda da proteína.

SUMÁRIO 0 método descrito é útil para filtrar uma proteína numa mistura líquida tanto de uma maneira descontínua quanto contínua que não danifique substancialmente ou caso contrário limite a recuperação da proteína no filtrado da filtração. 0 método geralmente aplica uma contrapressão ao filtrado para reduzir e controlar de forma precisa o diferencial de pressão através de um filtro. 0 método descrito tem a vantagem de que taxas de fluxo de filtração relativamente altas podem ser alcançadas a diferenciais de pressão relativamente baixos, em contraste a altos diferenciais de pressão os quais na realidade reduzem o caudal de filtração de misturas líquidas de proteínas. Além disso, o método pode recuperar substancialmente toda a proteína que estiver inicialmente presente na mistura líquida.

Mais especificamente, a divulgação proporciona um método de filtração de uma mistura líquida de proteínas. De acordo com uma forma de realização, o método inclui o fornecimento de uma mistura líquida a uma primeira pressão Pi e a passagem da mistura líquida através de um filtro para formar um filtrado a uma segunda pressão P2, e a aplicação de uma contrapressão ao filtrado tal que um diferencial de pressão P1-P2 não seja de mais de cerca de 300 mbar. Em outra forma de realização, o método inclui as etapas de 4 fornecimento de uma mistura liquida a uma primeira pressão Pi, e a passagem da mistura liquida através de um filtro para formar um filtrado a uma segunda pressão P2, e a aplicação de uma contrapressão ao filtrado suficiente para produzir um caudal médio do filtrado de pelo menos cerca de 300 g/min.m2 de área superficial de filtro. A mistura liquida inclui um liquido transportador, uma proteína a uma primeira concentração Ci relativa ao líquido transportador, e um contaminante disperso. 0 filtrado inclui o líquido transportador e a proteína a uma segunda concentração C2 relativa ao líquido transportador. O filtro é dimensionado para remover pelo menos uma porção do contaminante disperso da mistura líquida.

Em ainda outra forma de realização, o método é capaz de filtrar uma mistura de proteína aquosa, e inclui as etapas de fornecimento de uma mistura aquosa a uma primeira pressão Pi, a passagem da mistura aquosa através de um filtro de membrana porosa para formar um filtrado a uma segunda pressão P2, e a aplicação de uma contrapressão ao filtrado tal que um diferencial de pressão P1-P2 não seja de mais de cerca de 90 mbar. A mistura aquosa inclui água e vWF a uma primeira concentração Ci relativa à água. O filtrado inclui água e vWF a uma segunda concentração C2 relativa à água. O filtro de membrana porosa inclui poros dimensionados de cerca de 0,1 pm a cerca de 0,5 pm.

Em qualquer das formas de realização acima mencionadas, a proteína é preferencialmente uma proteína sensível ao cisalhamento e/ou uma proteína da cascata de coagulação sanguínea. Além disso, a proteína é preferencialmente recuperada no filtrado tal que uma proporção de recuperação C2/Ci seja de pelo menos cerca de 0,95, mais preferencialmente de pelo menos cerca de 0,99. Adicionalmente, o diferencial de pressão P1-P2 é 5 preferencialmente de não mais de cerca de 90 mbar e a primeira pressão Pi é preferencialmente de pelo menos cerca de 200 mbar manométricos. As formas de realização de preferência dos métodos acima incluem aquelas nas quais o liquido transportador é água, e/ou o contaminante disperso inclui microrganismos. A proteína pode incluir o Fator de von Willebrand, o Fator VIII, o Fator XIII, e misturas dos mesmos. O filtro preferencialmente inclui um filtro de membrana porosa que tem poros dimensionados de cerca de 0, 1 pm a cerca de 0,5 pm, mais preferencialmente dimensionados em cerca de 0,2 pm a cerca de 0,22 pm. Preferencialmente, o produto filtrado está substancialmente livre do contaminante disperso. A filtração de uma proteína sob a aplicação de uma contrapressão permite a recuperação da proteína em altas concentrações relativas, altas taxas de fluxo de filtrado relativas, e taxas de fluxo de filtrado substancialmente constantes que não são do contrário atingíveis na ausência de contrapressão. Isto está em contraste com a teoria geral de aplicação de filtros pelo menos com relação ao caudal de filtrado, o qual prevê que o caudal de filtrado aumenta com o crescente diferencial de pressão através do filtro (isto é, na ausência de contrapressão).

Outros aspectos e vantagens ficarão evidentes àqueles com habilidade comum na técnica a partir de uma análise da seguinte descrição detalhada, tomada em conjunto com o desenho. Embora as composições, filmes, e pacotes descritos aqui sejam suscetíveis a formas de realização de várias formas, a descrição a seguir inclui formas de realização específicas com o entendimento de que a descrição é 6 ilustrativa, e não se destina a limitar a invenção às formas de realização especificas descritas aqui.

BREVE DESCRIÇÃO DO DESENHO

Duas figuras de desenho estão anexadas a este documento para facilitar o entendimento da descrição. A Figura 1 é uma vista em corte transversal de um filtro de cartucho simétrico ao eixo para utilização na filtração de proteínas por contrapressão. A Figura 2 é uma comparação dos dados de taxa de filtração obtidos por meio da utilização de um método de filtração convencional e um método de filtração por contrapressão.

DESCRIÇÃO DETALHADA 0 método aqui descrito é geralmente aplicável à purificação por filtração de uma proteína numa mistura líquida de uma maneira que não danifique de forma substancial ou do contrário limite a recuperação da proteína durante a filtração. Para além da proteína, a mistura líquida também inclui um líquido transportador e um contaminante disperso. 0 líquido transportador é o meio de suspensão para a proteína e não é geralmente limitado. Um líquido transportador de preferência é a água. De modo similar, o contaminante disperso não é particularmente limitado e pode incluir qualquer material sólido disperso que seja um componente indesejável do filtrado de proteína purificada, final. No caso de uma operação de esterilização por filtração, o contaminante disperso geralmente inclui qualquer um de uma variedade de microrganismos (isto é, bactérias) que podem estar presentes na mistura líquida. 7 0 método divulgado é particularmente preferencialmente aplicado à filtração de proteínas que são sensíveis ao cisalhamento, parte da cascata da coagulação sanguínea humana, ou ambos (isto é, algumas proteínas adequadas, por exemplo, vWF, podem ser classificadas tanto como proteínas sensíveis ao cisalhamento como da cascata da coagulação sanguínea).

As proteínas sensíveis ao cisalhamento que são adequadas para a purificação utilizando o método de filtração por contrapressão divulgado incluem aquelas que são suscetíveis a danos, destruição, perda de atividade, e/ou uma redução na taxa de filtração quando transportadas como uma suspensão num líquido transportador que é caracterizado por significantes forças de cisalhamento (isto é, gradientes de velocidade relativamente altos). De um modo geral, uma proteína sensível ao cisalhamento é uma proteína a qual exibe uma proporcionalidade inversa entre a taxa de filtração e o cisalhamento aplicado (ou pressão aplicada) acima de um cisalhamento crítico aplicado (ou pressão aplicada). 0 cisalhamento crítico aplicado (ou pressão aplicada) no qual uma transição entre uma relação diretamente proporcional para taxa de filtração e cisalhamento aplicado (ou pressão aplicada) e uma relação inversamente proporcional (isto é, uma transição que ocorre quando a taxa de filtração estiver num máximo) pode ser diferente para várias proteínas sensíveis ao cisalhamento. Por exemplo, o cisalhamento crítico aplicado pode ser pelo menos de cerca de 2000 s'1 (ou de pelo menos cerca de 4000 s_1) e não mais que cerca de 8000 s^1 (ou não mais que cerca de 12000 s”1) . No entanto, espera-se que o comportamento qualitativo para diferentes proteínas sensíveis a cisalhamento seja 8 similar. Uma proteína sensível a cisalhamento inclui vWF, embora o método divulgado não seja particularmente limitado a isso. Enquanto o vWF existe em plasma numa série de formas oligoméricas/poliméricas que têm pesos moleculares que vão desde cerca de 1.000 kDa (quilodalton) a cerca de 20.000 kDa baseado em dímeros de 520 kDa, o método divulgado não está necessariamente limitado a uma gama particular de peso molecular. O método divulgado também é geralmente aplicável na purificação de proteínas na cascata de coagulação sanguínea humana (isto é, fatores de coagulação). Por exemplo, os Fatores de coagulação II (peso molecular de cerca de 37 kDa), VII (cerca de 50 kDa), VIII:C (cerca de 260 kDa), IX (cerca de 55 kDa a cerca de 70 kDa) , X (cerca de 100 kDa) , XIII (cerca de 350 kDa), vWF (discutido acima), e combinações dos mesmos, alguns dos quais também são sensíveis ao cisalhamento, podem ser eficientemente filtrados e recuperados pela utilização de contrapressão.

Algumas proteínas purificadas particularmente preferidas incluem proteínas únicas tais como os Fatores XIII ou vWF e combinações de multi-proteínas tais como um complexo Fator VIII:C/vWF. Uma mistura de proteínas de preferência que não é particularmente sensível ao cisalhamento, mas a qual é ainda favoravelmente filtrada utilizando-se a contrapressão, é uma mistura FEIBA VH ("factor eight inhibitor bypassing activity (vapor heated)", disponível da Baxter, Deerfield, IL) que pode ser utilizada para controlar o sangramento espontâneo e/ou tratar doentes de hemofilia A/B. A mistura FEIBA VH inclui os Fatores II, IX e X (principalmente não ativados), o Fator VII (principalmente ativado), e o Fator VIII:C (cerca de 1 a 6 unidades/mL). A mistura FEIBA VH beneficia-se da utilização 9 da contrapressão pelo facto da mistura de proteína poder ser filtrada a taxas de filtração relativamente altas com pequena ou nenhuma perda na atividade da proteína quando a contrapressão é aplicada. A mistura líquida que contém a proteína e o contaminante disperso é então purificada pela passagem da mistura líquida através de um filtro. Os filtros adequados para utilização de acordo com o método divulgado não estão particularmente limitados e podem incluir filtros de superfície, por exemplo, filtros sem saída (isto é, no qual o fluido a ser filtrado aproxima-se perpendicularmente da superfície do filtro) e filtros de fluxo cruzado (isto é, no qual o fluido a ser filtrado viaja paralelamente à superfície do filtro). Ver, por exemplo, Kirk-Othmer

Encyclopedia of Chemical Technology, vol. 10, pág. 788-853 ("Filtration") (4th ed., 1993). Os filtros também não são particularmente limitados com relação ao seu tamanho de classificação (isto é, o tamanho acima do qual o material disperso é retido no filtro e o tamanho abaixo do qual o material disperso passa para o filtrado) . Uma vez que o tamanho de classificação de um filtro é selecionado para uma aplicação particular (isto é, material disperso a ser retido vs. material disperso a passar para o filtrado), o filtro deve ser operado levando-se em consideração a quantidade de cisalhamento gerada pelo líquido transportador que flui através do filtro em relação à sensibilidade ao cisalhamento da proteína em particular a ser filtrada.

Um meio de filtração de preferência é uma membrana porosa, a qual está geralmente disponível em vários tamanhos (isto é, área superficial do filtro; por exemplo, que varia de cerca de 0,001 m2 a cerca de 5 m2) e configurações (por 10 exemplo, discos de filtro, cartuchos de filtro). A membrana porosa pode ser formada de materiais tais como nitrato de celulose, acetato de celulose, polímeros vinílicos, poliamidas, fluorocarbonetos, e polietersulfonas. A membrana porosa inclui poros geralmente com um tamanho altamente uniforme que é selecionado dependendo do tamanho do contaminante disperso a ser removido da mistura liquida. Por exemplo, em operações de esterilização por filtração destinadas a remover microrganismos (embora seja permitido que a proteína passe através da membrana do filtro para o filtrado), os poros preferencialmente têm o tamanho numa gama de cerca de 0,1 pm a cerca de 0,5 pm, ou de cerca de 0,15 pm a cerca de 0,25 pm, por exemplo, de cerca de 0,2 pm a cerca de 0,22 pm. Filtros de membrana porosa adequados podem também incluir tanto um filtro de 0,2 pm/0,22 pm como um pré-filtro mais grosseiro (por exemplo, de cerca de 0,45 pm) para melhorar o rendimento e limitar a acumulação de torta na superfície de 0,2 pm/0,22 pm do filtro. Exemplos de filtros de membrana porosa comerciais adequados para esterilização por filtração de misturas líquidas com proteínas incluem uma membrana SARTOBRAN P 0,2 pm de acetato de celulose (incluindo tanto poros de filtração de 0,2 pm como uma membrana pré-filtro com poros de filtração de 0,45 pm; disponível da Sartorius AG, Gõttingen, Alemanha) e uma membrana SUPOR EKV 0,2 pm de polietersulfona (disponível da Pall Corporation, East Hills, NY) . A Figura 1 ilustra o escoamento da mistura líquida através de um aparelho de filtro 100, por exemplo, um filtro de cartucho que tem uma membrana porosa. Como ilustrado, a mistura líquida entra no aparelho de filtro 100 vedado por meio de uma entrada 110 para uma câmara de entrada 120. O fluido na câmara de entrada 120 é pressurizado, tendo uma 11 primeira pressão Pi que está geralmente acima da pressão ambiente (isto é, cerca de 1 bar absoluto) . A primeira pressão Pi na câmara de entrada 120 conduz o liquido transportador e a proteína na mistura líquida através de uma membrana porosa de filtro 130. 0 material que passa através da membrana do filtro 130 forma um filtrado que inclui tanto o líquido transportador como a proteína numa câmara de filtrado 140. 0 fluido na câmara de filtrado 140 é também pressurizado, tendo uma segunda pressão P2 que é menor que a primeira pressão Pi, mas a qual está geralmente acima da pressão ambiente. 0 filtrado purificado então sai do aparelho de filtro 100 por meio da saída 150. A taxa de fluxo através da saída 150 (e a segunda pressão P2) é regulada por meio de um regulador de contrapressão 160.

Os poros da membrana de filtro 130 são dimensionados para remover pelo menos uma porção dos contaminantes dispersos contidos na mistura líquida, retendo os contaminante dispersos removidos no lado de entrada da membrana de filtro 130 (isto é, na câmara de entrada 120) . Preferencialmente, a membrana de filtro 130 é dimensionada para remover substancialmente todos os contaminantes dispersos inicialmente contidos na mistura líquida na entrada; desse modo, o filtrado está substancialmente livre (ou livre) dos contaminantes dispersos. Especificamente, o filtrado não deve conter os contaminantes dispersos numa quantidade que adversamente afetaria a utilização do filtrado e da mistura purificada de proteína como uma composição terapêutica. Por exemplo, quando os contaminantes dispersos incluem microrganismos, a membrana de filtro 130 deve ser capaz de remover pelo menos cerca de 107 unidades formadoras de colónia por cm2 de área de filtro. 12 A primeira pressão Pi da mistura liquida de entrada pode ser aplicada por qualquer fonte adequada, por exemplo, gravidade, um gás comprimido (por exemplo, ar comprimido), ou uma bomba (por exemplo, uma bomba de baixo cisalhamento). Preferencialmente, a primeira pressão Pi é de pelo menos cerca de 200 mbar manométrica, ou numa gama de cerca de 200 mbar manométrica a cerca de 1.000 mbar manométrica (isto é, cerca de 1 bar manométrica), por exemplo, de cerca de 300 mbar manométrica. A contrapressão (ou pressão contrária) também pode ser aplicada por qualquer fonte adequada, por exemplo, uma válvula convencional (ilustrada na Figura 1 como o regulador de contrapressão 160), para obter a segunda pressão P2 do filtrado de saida. Adicionalmente, a contrapressão pode também ser aplicada por uma restrição, obstrução, etc. ao fluxo ao longo do comprimento da passagem de saida 150. Como resultado da primeira e segunda pressões Pi e P2, a contrapressão aplicada gera um diferencial (positivo) de pressão P1-P2 para conduzir o liquido transportador e a proteína através do filtro e para dentro do filtrado. O diferencial de pressão é baixo, com diferenciais de pressão máximos adequados dependendo de uma variedade de fatores, por exemplo, a proteína em particular a ser filtrada e o filtro em particular a ser utilizado. Em particular, o diferencial de pressão é preferencialmente de não mais de cerca de 300 mbar, 200 mbar, 150 mbar, ou 120 mbar, mais preferencialmente de não mais de cerca de 90 mbar ou 50 mbar, até mais preferencialmente de não mais de cerca de 20 mbar ou 10 mbar, por exemplo, de não mais de 5 mbar ou não mais de cerca de 3 mbar.

Em tais diferenciais de pressão, a taxa de fluxo através do filtro é baixa o suficiente para gerar um ambiente de baixo cisalhamento que não danifica, destrói, ou reduz de forma 13 substancial a atividade da proteína. 0 ambiente de baixo cisalhamento também não limita substancialmente o rendimento do processo de filtração.

Especificamente, foi observado que uma baixa pressão diferencial pode ser utilizada para obter uma taxa tanto relativamente alta como substancialmente constante de filtração. Em particular, uma baixa pressão diferencial pode ser aplicada para obter uma taxa de fluxo de filtração média de pelo menos cerca de 300 g/min.m2, por exemplo, de cerca de 300 g/min.m2 a cerca de 1000 g/min.m2 ou cerca de 400 g/min.m2 a cerca de 800 g/min.m2, onde as unidades são massa de filtrado (isto é, gramas de líquido transportador e proteína combinados) obtidos por unidade de tempo (isto é, minutos) e normalizado por unidade de área superficial do filtro (isto é, m2) . A baixa pressão diferencial resultante da aplicação de contrapressão pode também gerar uma taxa de filtração substancialmente constante, em particular após a realização de um transiente de partida, desse modo melhorando a capacidade líquida do filtro. Em contraste à taxa de filtração observada a uma baixa pressão diferencial (e em contraste com a teoria geral de filtração, a qual descreve que a taxa de filtração é proporcional à pressão diferencial através do filtro), uma pressão diferencial mais alta (por exemplo, acima de cerca de 100 mbar) tende a diminuir a taxa de filtração. Desse modo, os métodos convencionais de filtração, os quais aplicam pressões diferenciais de pelo menos cerca de 100 mbar a cerca de pelo menos 300 mbar, são incapazes de atingir as taxas de fluxo de filtração médias observadas no método divulgado.

Além disso, foi observado que uma baixa pressão diferencial pode ser utilizada para obter uma alta recuperação da 14 proteína. Especificamente, substancialmente toda a proteína que está inicialmente presente na mistura líquida é preferencialmente recuperada no filtrado. Por exemplo, quando uma primeira concentração Ci representa a concentração da proteína em relação ao líquido transportador na mistura líquida inicial, e uma segunda concentração C2 representa a concentração da proteína em relação ao líquido transportador no filtrado final, então uma proporção de recuperação C2/C1 do método de filtração descrito é preferencialmente pelo menos de cerca de 0,95, e mais preferencialmente pelo menos de cerca de 0,99. 0 método de filtração por contrapressão divulgado é útil quando aplicado a proteínas porque o método fornece controle preciso da taxa de fluxo de filtração. Fontes de pressão que são utilizadas para conduzir a mistura líquida através do filtro geralmente fornecem uma pressão excessiva que resulta em altas taxas de cisalhamento, as quais, por sua vez, levam ao entupimento do filtro e dano da proteína. É geralmente difícil, senão impossível, regular uma única fonte de pressão em relação à pressão ambiente tal que a pressão diferencial resultante é baixa o suficiente e suficientemente constante para resultar numa taxa de fluxo média através do filtro que seja suficientemente baixa para evitar dano da proteína e substancialmente constante. Pela aplicação de contrapressão no lado do filtrado do fluido de processo, no entanto, uma fonte de pressão relativamente alta (isto é, a primeira pressão Pi) pode ser contrabalançada com precisão (isto é, com a segunda pressão P2) para obter um diferencial de pressão baixo e substancialmente constante (isto é, P2-P2) ·

Exemplos 15

Os seguintes exemplos são proporcionados para ilustração e não são destinados a limitar o âmbito da invenção.

Exemplos 1-8

Uma mistura liquida aquosa da proteína sensível ao cisalhamento, da cascata da coagulação sanguínea vWF foi esterilizada por filtração para determinar o efeito da pressão (e contrapressão) e outras variáveis do processo (por exemplo, tamanho e tipo de filtro) na eficácia da filtração, por exemplo, com base na atividade recuperada de vWF no filtrado, a taxa de fluxo média do filtrado, e a capacidade de aumentar a escala do processo.

Uma mistura líquida de vWF recombinante ("rVWF:Rco") que tem uma atividade de 125 IU/mL e concentração de 1159 pg/mL (ensaio do ácido bicinconínico ("BCA")) foi preparada para utilização em cada um dos seguintes Exemplos 1-8. Sais de baixo peso molecular foram adicionados para ajustar o pH e a osmolaridade da mistura para valores de 7,3 e cerca de 400 mOsmol/L (miliosmol/Litro), respectivamente. Elo facto dos Exemplos 1-8 serem destinados a isolar os efeitos dinâmicos do fluido (por exemplo, o cisalhamento) na proteína na vizinhança de um filtro, nenhum outro contaminante ou material disperso (por exemplo, bactérias, outros microrganismos, ou outras proteínas) foi adicionado à mistura. Os componentes da mistura líquida aquosa estão resumidos na Tabela 1. 16

Tabela 1 - Composição da Mistura Liquida para os Exemplos 1-8

Componente de Mistura Concentração rVWF:Rco 125 IU/mL Proteína (BCA) 1159 pg/mL Di-hidrato de Citrato de Sódio 4,53 g/L Glicina 1,16 g/L Trealose 10,26 g/L Manitol 20,52 g/L

Polissorbato 80 (diluição 1,03 g/L 10:1 da carga) Água para Injeção (WFI) Restante A mistura líquida aquosa foi então testada da seguinte maneira. Um volume de teste de pelo menos cerca de 500 mL da mistura foi adicionado a um vaso resistente à pressão de aço inoxidável. A saída do vaso foi conectada à entrada de um filtro estéril (esterilizado a vapor) com uma primeira secção de tubulação de silicone. Um segunda secção de tubulação de silicone com um comprimento de cerca de 10 cm foi anexada à saída do alojamento do filtro estéril. O efluente filtrado do filtro estéril foi coletado numa proveta posicionada sobre uma balança para monitorizar a taxa de filtração. A balança estava em inerface com um computador para registar a intervalos determinados a quantidade total de filtrado colhido como uma função do tempo.

Nos exemplos 1-7, foi utilizado um filtro SARTOBRAN P 0,2 pm de membrana de acetato de celulose (incluindo um pré-filtro de 0,45 pm) . No Exemplo 8, foi utilizado um filtro SUPOR EKV 0,2 pm de membrana de polietersulfona. Os Exemplos 1-3 utilizaram filtros de membrana em disco, ao passo que os Exemplos 4-8 utilizaram filtros de membrana em cartucho. A área superficial de filtro de cada filtro está apresentada na Tabela 2. 17

Para cada um dos Exemplos 1-8, o volume de teste da mistura líquida aquosa foi filtrado a uma pressão constante. No Exemplo 1, a mistura líquida aquosa que entra no filtro estéril teve uma pressão aplicada de cerca de 100 mbar manométrica (isto é, cerca de 1,1 bar absoluto), com base na altura da coluna de fluido que alimenta o filtro estéril do vaso de aço inoxidável. Nos Exemplos 2-8, foi utilizado ar comprimido limpo para fornecer a pressão da mistura líquida aquosa que entra no filtro estéril, cuja pressão variou de 150 mbar a 300 mbar, como indicado na Tabela 2. Nos Exemplos 1-4, a filtração por contrapressão não foi realizada (isto é, o tubo de saída do filtro estéril estava aberto à atmosfera enquanto o filtrado fluía para a proveta coletora); assim, o diferencial de pressão que conduz a filtração foi essencialmente a pressão da mistura líquida aquosa a entrar no filtro estéril. Para os Exemplos 5-8, a contrapressão foi aplicada ao filtrado pela anexação e aperto de uma braçadeira ao tubo de saída do filtro estéril. 0 diferencial de pressão para os Exemplos 5-8 (indicado na Tabela 2) foi estimado com base na taxa de fluxo de filtração média medida durante a filtração e as características da taxa de fluxo de queda de pressão conhecidas dos filtros comerciais utilizados.

De uma maneira geral, em cada exemplo, a mistura foi filtrada imediatamente após o volume teste da mistura líquida aquosa ser preparado. No entanto, no Exemplo 5, a mistura foi filtrada após um atraso de oito horas para examinar qualquer efeito potencial de armazenamento do método divulgado. A Tabela 2 resume os parâmetros de teste para cada um dos Exemplos 1-8. 18

Tabela 2 - Parâmetros do Teste de Filtração para os Exemplos 1-8

Exarplo 1 2 3 4 5 6 7 8 Filtro Configuração Disco Disco Disco Cart. Cart. Cart. Cart. Cart. da Marforana Área Superficial (m2) Tamanho de 0,0017 0,0017 0,0017 0,015 0,015 0,015 0,03 0,022 0,45/0,2 0,45/0,2 0,45/0,2 0,45/0,2 0,45/0,2 0,45/0,2 0,45/0,2 0,2 Poro (pm) Pressão Contrapressão Não Não Não Não Sim Sim Sim Sim Pj Aplicada (irfoar mancmétrica) 100 200 300 150 300 300 300 300 Diferencial Pf-P2 100 200 300 150 2,6 3,2 3,5 3,8 Os resultados dos testes de filtração estão resumidos na Tabela 3. Na Tabela 3, a "quantidade de filtrado" representa a massa de filtrado (isto é, incluindo a água e qualquer vWF recuperado) obtida durante o teste individual. Para os Exemplos 1- 0 1 teste de filtração foi realizado até que o filtro ficasse entupido e quantidades substanciais de filtrado não pudessem mais ser obtidas. Para os Exemplos 5-8, o teste de filtração foi realizado até que várias centenas de gramas de filtrado fossem obtidas, e o teste foi terminado enquanto o filtro estava desentupido e ainda capaz de outra filtração. A entrada "capacidade do filtro" na Tabela 3 representa a quantidade de filtrado normalizada por área unitária de superfície de filtro. 0 ">" para os Exemplos 5-8 indica que a capacidade do filtro é uma estimativa mais baixa ou a capacidade real, na medida em que o filtro não ficou entupido durante o teste. A entrada de "taxa de fluxo média" na Tabela 3 representa a quantidade de filtrado calculada ao longo do curso do teste e normalizada por área unitária de superfície de filtro. 19

Tabela 3 - Resultados das Filtrações para OS Exemplos 1-8 Exerrplo 1 2 3 4 5 6 7 8 Quantidade de 27 5,4 5,1 75 390 720 1080 550 Filtrado (g) Capacidade do Filtro (kg/m2) 16 3,2 3,0 5,0 >26 >48 >36 >25 Taxa de Fluxo 290 148 72 53 330 410 450 760 Média (g/min.m2)

Da Tabela 3, é evidente que a filtração por contrapressão de proteínas aumenta de forma significativa a capacidade de filtração e a taxa de fluxo. As pressões uniformes moderadamente baixas aplicadas que variam desde 100 mbar a 300 mbar para o vWF e os filtros utilizados (onde os cartuchos de filtro utilizados podem resistir a pressões máximas que vão desde cerca de 2 bar a cerca de 5,5 bar), os Exemplos 1- 4 indicam que a capacidade do filtro é baixa e rapidamente decresce com o aumento da pressão. Em contraste, quando uma contrapressão é aplicada ao filtrado para reduzir o diferencial de pressão, os

Exemplos 5-8 exibem capacidades de filtração e taxas de fluxo substancialmente maiores. Este comportamento observado é inesperado, na medida em que os filtros são geralmente caracterizados por uma proporcionalidade direta entre a taxa de fluxo de filtração e diferencial de pressão: Q Ap A /.Jt Eq. ( D Na Equação (1), Q é a taxa de fluxo de filtração (volume ou massa por unidade de tempo), A é a área superficial do filtro, Δρ é o diferencial de pressão através do filtro, μ é a viscosidade do fluido a ser filtrado, e R é uma resistência empírica do meio de filtro. A similaridade entre os resultados dos Exemplos 20 5-8 indica ainda que os benefícios da filtração por contrapressão podem ser obtidos pela utilização de meios de filtro e/ou tamanhos de filtros variáveis.

Os dados de filtração dependentes do tempo (isto é, o filtrado coletado como uma função do tempo) para os Exemplos 4 e 6 estão apresentados na Figura 2. Da Figura 2, é evidente que o diferencial de pressão mais alto para o Exemplo 4 resulta numa taxa de filtração relativamente alta ao longo dos primeiros 10-15 minutos do teste de filtração. Contudo, o diferencial de pressão mais alto no Exemplo 4 também resulta num entupimento mais rápido do filtro. Em contraste, o uso da contrapressão no Exemplo 6 abaixa o diferencial de pressão e a taxa inicial de filtração. Especificamente, após o período transitório inicial de cerca de 10 minutos a cerca de 15 minutos, o baixo diferencial de pressão cria um ambiente de filtração de baixo cisalhamento que impede o filtro de ficar entupido pelo vWF, desse modo aumentando a capacidade do filtro e a taxa de fluxo de filtração ao longo da vida do filtro, e ainda resultando numa taxa de fluxo de filtração que é substancialmente constante.

Como resumido na Tabela 4, o filtrado de cada um dos Exemplos 1-3 e 5 pode também ser analisado para medir o nível de vWF recombinante no filtrado para determinar se o processo de filtração afetou de forma adversa a concentração do vWF recombinante presente na mistura líquida aquosa inicial. Na ausência de contrapressão, os Exemplos 1-3 indicam que diferenciais de pressão uniformes moderadamente baixos podem danificar ou destruir proteínas durante a filtração, com até cerca de metade do vWF recombinante sendo perdido durante a filtração a 21 diferenciais de pressão de 200 mbar e 300 mbar. Essa perda na filtração é evitada pelo uso de contrapressão, como mostrado no Exemplo 5, onde nenhuma redução mensurável na concentração de rVWFrRco ocorreu e apenas ocorreu um decréscimo de 4% no conteúdo de proteína medido (BCA). Desse modo, substancialmente toda a proteína que está inicialmente presente na mistura líquida aquosa pode ser recuperada no filtrado.

Tabela 4 - Recuperação de vWF no Filtrado

Exatplo Carga 1 2 3 5 Rvwf:Rco (IU/mL) 125 n/a 69 69 126 Proteína (BCA.) (pg/mL) 1159 1054 724 715 1113

Exemplos 9-20

Soluções aquosas contendo o Fator VIII foram testadas em filtros SARTOBRAN®, com um pré-filtro SARTOCLEAN, para determinar o efeito da contrapressão na eficácia da filtração, por exemplo, com base na área superficial de filtro necessária. Nos Exemplos 9-13, a filtração por contrapressão não foi realizada; a pressão inicial aplicada foi de 100 mbar a 500 mbar. Nos Exemplos 14-16, o diferencial de pressão foi de 200 mbar, e nos Exemplos 17-20, o diferencial de pressão foi reduzido para menos de 150 mbar. A área superficial de cada filtro foi de 1,2 m . A Tabela 5 contém a atividade do Fator VIII antes e depois da filtração e rendimento para cada experimento. 22

Tabela 5 - Recuperação de FVIII no Filtrado

Exemplo: 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Filtração sem saida Filtração por contrapressão Volume inicial (ml) 695 670 710 623 698 702 684 727 717 650 707 704 Volume de filtrado (mL) 685 667 696 617 687 696 667 719’ 708 640 701 698 Número de filtros 10 10 15 5 15 7 10 8 5 5 6 5 Área filtrante total (m2) 12 12 18 6 18 8,4 12 9,6 6 6 7,2 6 Atividade antes da filtração (IU/mL) 11, 5 11, 8 14, 5 8, 04 8, 41 13, 7 7,99 12,2 10 9, 46 9, 74 8, 95 Atividade após filtração (IU/mL) 11,-> 12, 1 12, 7 9, 94 10,6 13, 3 8,63 11,1 13, 8 13 13, 5 12,2 Rendimento da Atividade (%) 96 102 86 122 124 96 105 90 136 135 137 135 Capacidade do filtro (kg/ m2) 57,9 55, 8 39, 4 103, 8 38, 8 83, 6 57 75, 7 119,5 108, 3 98,2 117, 3 Rendimento de Atividade Médio 106 119

Os dados precedentes demonstram que bem menos área de filtro é necessária quando a filtração por contrapressão é utilizada para a mesma quantidade de substância ativa. A filtração por contrapressão estabiliza a filtração, e quando a pressão diferencial é otimizada, o rendimento de atividade médio é melhorado.

Exemplos 21-25

Soluções contendo o Fator XIII foram testadas num filtro PALL® POSIDYNE® N66 de nylon para determinar o efeito da contrapressão na eficácia da filtração, por exemplo, com base na atividade recuperada e concentração de proteína do Fator XIII no filtrado. A área de filtro foi de 0,82 m2. Nos Exemplos 21-23, a filtração por contrapressão não foi realizada; a pressão aplicada para estes exemplos foi de 23 600 mbar. Nos Exemplos 24-26, o diferencial de pressão foi de cerca de 100 mbar. A Tabela 6 contém a concentração e atividade da proteína antes e depois da filtração e rendimento para cada experimento.

Tabela 6 - Recuperação de FXIII no Filtrado

Exemplo 21 22 23 24 25 26 Exemplo Filtração sem Filtração por saída contrapressão Atividade antes da filtração (IU/mL) 217,9 188 161, 7 158 187,2 118,8 Atividade depois da filtração (IU/mL) 194,6 179, 8 180,2 189,4 184,8 115,2 Rendimento de Atividade (%) 89 96 111 120 99 97 Rendimento de Atividade Médio 99 105 Proteína antes da filtração (pg/mL) 4,65 5,57 6,28 5,9 5, 66 3, 66 Proteína depois da filtração (pg/mL) 3,59 4,48 5, 04 5, 03 5,25 3, 73 Rendimento de Proteína (%) 77 80 80 85 93 102 Rendimento de Proteína Médio 79 93 Como apresentado na Tabela 6, o rendimento da atividade e o rendimento da proteína são substancialmente melhorados com a utilização de contrapressão durante a filtração.

Lisboa, 9 de Novembro de 2011

Claims (20)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Método de filtração de uma mistura liquida de proteína, caracterizado pelo fato do método compreender: proporcionar uma mistura líquida a uma primeira pressão (Pi) , a mistura líquida compreendendo um líquido transportador, uma proteína a uma primeira concentração (Ci) em relação ao líquido transportador, e um contaminante disperso; passar a mistura líquida através de um filtro para formar um filtrado a uma segunda pressão (P2) , o filtrado compreendendo um líquido transportador e a proteína numa segunda concentração (C2) em relação ao líquido transportador, em que o filtro é dimensionado para remover pelo menos uma porção do contaminante disperso da mistura líquida; e, aplicar uma contrapressão ao filtrado para assegurar que um diferencial de pressão entre a primeira e a segunda pressões (P1-P2) não seja de mais de cerca de 300 mbar.

2. Método de filtração de uma mistura líquida de proteína, caracterizado pelo fato do método compreender: proporcionar uma mistura líquida a uma primeira pressão (Pi) , a mistura líquida compreendendo um líquido transportador, uma proteína a uma primeira concentração (Ci) em relação ao líquido transportador, e um contaminante disperso; passar a mistura líquida através de um filtro para formar um filtrado a uma segunda pressão (P2) , o filtrado compreendendo um líquido transportador e a proteína numa segunda concentração (C2) em relação ao líquido transportador, em que o filtro é dimensionado 2 para remover pelo menos uma porção do contaminante disperso da mistura liquida; e, aplicar uma contrapressão ao filtrado suficiente para produzir uma taxa de fluxo de filtrado média de pelo menos 300 g/min.m2 de área superficial de filtro.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato da contrapressão ser suficiente para produzir uma taxa de fluxo de filtrado média de pelo menos cerca de 300 g/min.m2 de área superficial de filtro.

4. Método de filtração de uma mistura de proteína de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato do método compreender uma proteína sensível ao cisalhamento.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato da proteína compreender uma proteína da cascata de coagulação sanguínea.

6. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato do diferencial de pressão não se de mais de cerca de 90 mbar.

7. Método de acordo com qualquer reivindicação anterior, caracterizado pelo fato de pelo menos 95% da proteína presente na mistura líquida serem recuperados no filtrado.

8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de pelo menos cerca 99% da proteína presente na mistura líquida serem recuperados no filtrado.

9. Método de acordo com qualquer reivindicação anterior, caracterizado pelo fato da primeira pressão (Pi) er de pelo menos cerca de 200 mbar manométrica. 3

10. Método de acordo com qualquer reivindicação anterior, caracterizado pelo fato do liquido transportador compreender a áqua.

11. Método de acordo com qualquer reivindicação anterior, caracterizado pelo fato da proteína ser selecionada do grupo que consiste no fator von Willebrand (vWF) , Fator VIII, Fator XIII, e misturas dos mesmos.

12. Método de acordo com qualquer reivindicação anterior, caracterizado pelo fato de que o contaminante disperso compreende um microrganismo.

13. Método de acordo com qualquer reivindicação anterior, caracterizado pelo fato do filtrado estar substancialmente livre de contaminante disperso.

14. Método de acordo com qualquer reivindicação anterior, caracterizado pelo fato do filtro compreender uma membrana porosa, a membrana porosa compreendendo poros dimensionados de cerca de 0,1 p a cerca de 0,5 pm.

15. Método de acordo com qualquer reivindicação anterior, caracterizado pelo fato dos poros serem dimensionados de cerca de 0,2 pm a cerca de 0,22 pm.

16. Método de filtração de uma mistura líquida de proteína, caracterizado pelo fato do método compreender: fornecer uma mistura líquida a uma primeira pressão (Pi) , a mistura líquida compreendendo água e o fator von Willebrand (vWF), a uma primeira concentração (Cl) em relação à água; 4 passar a mistura líquida através de um filtro de membrana porosa par formar um filtrado a uma segunda pressão (p2), o filtrado compreendendo a água e o vWF a uma segunda concentração (2) em relação à água, em que o filtro de membrana porosa compreende poros dimensionados de 0,1 pm a 0,5 pm; e, aplicar uma contrapressão ao filtrado para assegurar que um diferencial de pressão entre a primeira e a segunda pressões (PI - P2) não é mais de 90 rnbar.

17. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de pelo menos cerca 95% do vWF presente na mistura líquida serem recuperados no filtrado.

18. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de pelo menos cerca 99% do vWF presente na mistura líquida serem recuperados no filtrado.

19. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato dos poros serem dimensionados a 0, 2 pm ou 0,22 pm.

20. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato da mistura aquosa compreender adicionalmente uma população de microrganismos, pelo menos uma porção de cuja população ser removida da mistura aquosa pelo filtro de membrana porosa. Lisboa, 9 de Novembro de 2011