KR20180028559A - 단백질의 역압 여과 - Google Patents

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Abstract

실질적으로 여과 여액 내의 단백질의 회수를 손상시키거나 달리 제한하지 않는 방식으로 액체 혼합물 내의 단백질을 여과하는 방법이 개시된다. 이 방법은 일반적으로 액체 혼합물 여액에 역압을 인가하여 필터 전후의 차압을 정확하게 감소 및 조절한 상태에서, 단백질을 함유하는 액체 혼합물(예: 수성 vWF 혼합물)을 필터에 통과시키는 것을 포함한다. 개시된 방법은, 실제로 단백질 액체 혼합물의 여과 유속을 감소시키는 높은 차압에서와 대조적으로, 비교적 낮은 차압에서 비교적 높은 여과 유속을 달성할 수 있다는 장점을 갖는다. 또한, 이 방법은 초기에 액체 혼합물 내에 존재하는 단백질을 실질적으로 모두 회수할 수 있다.

Description

단백질의 역압 여과{COUNTER-PRESSURE FILTRATION OF PROTEINS}
본원은 미국 임시 특허 출원 제61/017,418호(2007년 12월 28일 출원)에 대한 35 U.S.C.§119(e)의 이익을 청구하며, 그의 내용은 본원에 포함된다.
본 개시는 일반적으로 단백질의 정제를 위한 여과 방법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 개시는 예를 들어 유체 내에서 운반되는 경우에 전단력에 의한 손상을 받기 쉬운 단백질(예: 전단력 민감성 단백질, 혈액 응고 캐스케이드 단백질)의 저전단 역압 멸균 여과에 관한 것이다.
정제된 단백질 혼합물은 다양한 치료 용도로 환자에게 투여될 수 있다. 환자에게 주입하기 위해 제조된 정제된 단백질 혼합물은 사용 전에 멸균되어야 한다. 일부 단백질을 위한 적합한 멸균 공정은 정제된 단백질 혼합물의 막 여과를 포함한다. 필터 막은 미립자, 미생물, 및 일부 바이러스를 유지하면서(즉, 단백질 혼합물로부터 제거하면서) 단백질은 막을 통과할 수 있도록 하는 크기를 갖는다.
그러나 일부 단백질은 막 여과와 같은 통상의 방법을 사용해서는 정제된 멸균 단백질로서 효율적으로 회수되지 않는다. 이 효과는 전단력 민감성 및/또는 혈액 응고 캐스케이드의 일부인 단백질을 여과하고자 하는 경우에 가장 두드러진다. 그러한 단백질의 일례는 인자 VIII와 복합체화되어 혈장 내를 순환하며 생물학적 혈액 응고 활동의 조절을 돕는 폰 빌레브란트 인자(von Willebrand factor; vWF)이다. 구체적으로, vWF 단백질은 운반 유체 매질의 속도 구배에 의해 유도되는 전단력에 민감하며, 특히 vWF 단백질이 필터 막을 통과하거나 막의 근접부(즉, 필터 막 공극 인근에서 유동 억제 및 우회 유동 경로가 특히 큰 속도 구배를 유발하는 곳)를 지날 때 그러하다. 즉, 여과 장치가 바람직한 공정 유속을 이상적으로 발생시키는 충분한 압력 하에 작동되는 경우, 증가된 유속(및 수반되는 유도 전단력의 상승)은, 예를 들어 단백질의 손상 또는 파괴, 및/또는 시간에 따른 여과 속도의 저하에 의해, 공정 수율을 감소시키는 경향이 있다.
따라서, 정제된 vWF 혼합물을 vWF 단백질을 실질적으로 손상시키지 않는 방식으로 여과하면서도 시간이 지나도 적당히 높은 공정 처리량(즉, 여과 속도)을 허용하는 방법을 개발하는 것이 바람직할 것이다. 이에 더하여, 일반적인 단백질을 단백질의 실질적인 손상/손실의 발생 없이 효율적인 속도로 여과(예: 멸균 여과)할 수 있도록, 모든 단백질에 일반적으로 적용가능한 여과 방법을 개발하는 것이 바람직할 것이다.
개시된 방법은 실질적으로 여과 여액 내의 단백질의 회수를 손상시키거나 달리 제한하지 않는 배치(batch) 또는 연속 방식으로 액체 혼합물 내의 단백질을 여과하는데 유용하다. 이 방법은 일반적으로 여액에 역압을 인가하여, 필터 전후의 차압을 정확하게 감소 및 조절한다. 개시된 방법은, 실제로 단백질 액체 혼합물의 여과 유속을 감소시키는 높은 차압에서와 대조적으로, 비교적 낮은 차압에서 비교적 높은 여과 유속을 달성할 수 있다는 장점을 갖는다. 또한, 이 방법은 초기에 액체 혼합물 내에 존재하는 단백질을 실질적으로 모두 회수할 수 있다.
더 구체적으로, 본 개시는 액체 단백질 혼합물의 여과 방법을 제공한다. 한 실시양태에 따르면, 이 방법은 제1 압력 P1의 액체 혼합물을 제공하는 단계, 및 이 액체 혼합물을 필터에 통과시켜 제2 압력 P2의 여액을 형성하는 단계, 및 차압 P1-P2가 약 300 mbar 이하가 되도록 여액에 역압을 인가하는 단계를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 이 방법은 제1 압력 P1의 액체 혼합물을 제공하는 단계, 및 이 액체 혼합물을 필터에 통과시켜 제2 압력 P2의 여액을 형성하는 단계, 및 약 300 g/분·㎡(필터 표면적) 이상의 평균 여액 유속을 생성하기에 충분한 역압을 여액에 인가하는 단계를 포함한다. 액체 혼합물은 담체 액체, 담체 액체에 대해 제1 농도 C1의 단백질, 및 분산된 오염물을 포함한다. 여액은 담체 액체, 및 담체 액체에 대해 제2 농도 C2의 단백질을 포함한다. 필터는 액체 혼합물로부터 분산된 오염물의 적어도 일부를 제거하는 크기를 갖는다.
또 다른 실시양태에서, 상기 방법은 수성 단백질 혼합물을 여과할 수 있으며, 제1 압력 P1의 수성 혼합물을 제공하는 단계, 수성 혼합물을 다공성 막 필터에 통과시켜 제2 압력 P2의 여액을 형성하는 단계, 및 차압 P1-P2가 약 90 mbar 이하가 되도록 여액에 역압을 인가하는 단계를 포함한다. 수성 혼합물은 물, 및 물에 대해 제1 농도 C1의 vWF를 포함한다. 여액은 물, 및 물에 대해 제2 농도 C2의 vWF를 포함한다. 다공성 막 필터는 약 0.1 ㎛ 내지 약 0.5 ㎛의 크기를 갖는 공극을 포함한다.
상기 중 임의의 실시양태에서, 단백질은 바람직하게는 전단력 민감성 단백질 및/또는 혈액 응고 캐스케이드 단백질이다. 또한, 단백질은 바람직하게는 회수율 C2/C1이 약 0.95 이상, 더욱 바람직하게는 약 0.99 이상이 되도록 여액 내에 회수된다. 또한, 차압 P1-P2는 바람직하게는 약 90 mbar 이하이고, 제1 압력 P1은 바람직하게는 약 200 mbar 게이지 이상이다. 상기 방법들의 바람직한 실시양태는, 담체 액체가 물이고/거나 분산된 오염물이 미생물을 포함하는 것을 포함한다. 단백질은 폰 빌레브란트 인자, 인자 VIII, 인자 XIII, 및 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. 필터는 약 0.1 ㎛ 내지 약 0.5 ㎛의 크기를 갖는, 더욱 바람직하게는 약 0.2 ㎛ 또는 약 0.22 ㎛의 크기를 갖는 공극을 갖는 다공성 막 필터를 포함한다. 바람직하게는, 생성된 여액은 분산된 오염물이 실질적으로 없다.
역압을 인가한 상태에서의 단백질 여과는, 역압 부재시에는 달성될 수 없는, 높은 상대 농도, 높은 상대 여액 유속, 및 실질적으로 일정한 여액 유속에서의 단백질 회수를 허용한다. 이는 적어도 여액 유속과 관련하여, 여액 유속은 필터 전후의 차압을 증가시킴에 따라 증가한다(즉, 역압의 부재시에)는 필터 이론의 일반적인 적용과 대조된다.
추가의 양태 및 이점은, 도면과 함께 하기 상세한 설명의 검토로부터 당업자에게 자명할 것이다. 본원에 기재된 조성물, 필름, 및 패킷은 다양한 형태의 실시양태가 가능하며, 이하 설명은, 그러한 개시가 예시적이며 본 발명을 본원에 기재된 특정 실시양태로 한정하고자 함은 아니라는 전제하에, 특정 실시양태를 포함한다.
본 개시의 이해를 돕기 위해 2개의 도면을 본원에 첨부한다.
도 1은 단백질의 역압 여과에 사용하기 위한 축대칭(axisymmetric) 카트리지 필터의 단면도이다.
도 2는 통상의 여과 방법 및 역압 여과 방법을 사용하여 얻어진 여과 속도 데이터의 비교이다.
본원에 기재된 방법은 일반적으로 여과 동안 단백질의 회수를 실질적으로 손상시키거나 달리 제한하지 않는 방식으로 액체 혼합물 내의 단백질을 여과 정제하는 데에 적용가능하다. 단백질에 더하여, 액체 혼합물은 또한 담체 액체 및 분산된 오염물을 포함한다. 담체 액체는 단백질의 현탁 매질이며, 일반적으로 제한되지 않는다. 바람직한 담체 액체는 물이다. 유사하게, 분산된 오염물은 특별히 제한되지 않으며, 최종 정제된 단백질 여액의 바람직하지 않은 성분인 임의의 분산된 고체 물질을 포함할 수 있다. 멸균 여과 공정의 경우, 분산된 오염물은 일반적으로 액체 혼합물 내에 존재할 수 있는 다양한 미생물(즉, 박테리아) 중 임의의 것을 포함한다.
개시된 방법은 전단력 민감성이거나, 인간 혈액 응고 캐스케이드의 일부분이거나, 또는 둘 다인(즉, 일부 적합한 단백질, 예를 들어 vWF는 전단력 민감성이면서 혈액 응고 캐스케이드 단백질인 것으로서 분류될 수 있음) 단백질의 여과에 특히 바람직하게 적용된다.
개시된 역압 여과 방법을 사용한 정제에 적합한 전단력 민감성 단백질로는, 현저한 전단력(즉, 비교적 큰 속도 구배)을 특징으로 하는 담체 액체 내의 현탁액으로서 운반될 경우, 손상, 파괴, 활성 손실, 및/또는 여과 속도 저하를 받기 쉬운 것들을 들 수 있다. 일반적으로, 전단력 민감성 단백질은 여과 속도와 임계 인가 전단력(또는 인가 압력) 초과로 인가된 전단력(또는 인가 압력) 사이에 역비례 관계를 나타내는 단백질이다. 여과 속도와 인가된 전단력(또는 인가된 압력)의 정비례 관계가 역비례 관계로 전환(즉, 여과 속도가 최대일 때에 일어나는 전환)되는 지점인 임계 인가 전단력(또는 인가 압력)은 다양한 전단력 민감성 단백질에 따라 상이할 수 있다. 예를 들어, 임계 인가 전단력은 약 2000 s-1 이상(또는 약 4000 s-1 이상) 및 약 8000 s-1 이하(또는 약 12000 s-1 이하)일 수 있다. 그러나 상이한 전단력 민감성 단백질의 정성적 거동은 유사할 것으로 예상된다. 전단력 민감성 단백질로는 vWF를 들 수 있으나, 개시된 방법은 그것으로 특별히 한정되는 것은 아니다. vWF는 520-kDa 이합체에 기초하여 약 1,000 kDa(킬로달톤) 내지 약 20,000 kDa 범위의 분자량을 갖는 일련의 올리고머/중합체 형태로 혈장 내에 존재하지만, 개시된 방법은 특정 분자량 범위로 한정할 필요는 없다.
개시된 방법은 또한 일반적으로 인간 혈액 응고 캐스케이드 내의 단백질(즉, 응고 인자)의 정제에 적용가능하다. 예를 들어, 응고 인자 II (약 37 kDa 분자량), VII (약 50 kDa), VIII:C (약 260 kDa), IX (약 55 kDa 내지 약 70 kDa), X (약 100 kDa), XIII (약 350 kDa), vWF (상기 논의되었음), 및 이들의 조합(이들 중 일부는 또한 전단력 민감성임)은 역압을 이용하여 효율적으로 여과 및 회수될 수 있다.
일부 특히 바람직한 정제된 단백질로는 인자 XIII 또는 vWF와 같은 단일 단백질 및 인자 VIII:C/vWF 복합체와 같은 다단백질 조합을 들 수 있다. 특별히 전단력 민감성은 아니지만 여전히 역압을 이용하여 유리하게 여과되는 바람직한 단백질 혼합물은, 자연출혈의 억제 및/또는 A형/B형 혈우병 환자의 치료에 사용될 수 있는 FEIBA VH 혼합물("factor eight inhibitor bypassing activity (vapor heated)"; 미국 일리노이주 디어필드의 백스터(Baxter)로부터 입수가능함)이다. FEIBA VH 혼합물은 인자 II, IX, 및 X (주로 비활성화), 인자 VII (주로 활성화), 및 인자 VIII:C (약 1 내지 6 단위/㎖)를 포함한다. FEIBA VH 혼합물은 역압을 인가할 경우 단백질 활성의 손실이 거의 또는 전혀 없이 비교적 높은 여과 속도로 여과될 수 있다는 점에서 역압의 사용으로부터 이익을 얻는다.
이어서, 단백질 및 분산된 오염물을 함유하는 액체 혼합물을 필터에 통과시켜 정제한다. 개시된 방법에 따라 사용하기 적합한 필터는 특별히 제한되지 않으며, 표면형 필터, 예컨대 데드-엔드(dead-end) 필터(즉, 여기에서는 여과되는 유체가 필터 표면에 수직으로 접근함) 및 횡류 필터(즉, 여기에서는 여과되는 유체가 필터 표면에 평행하게 이동함)을 들 수 있다 (예컨대 문헌[Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, vol. 10, pp. 788-853("Filtration")(4th ed., 1993)] 참조). 필터는 또한 그의 분급 크기(즉, 분산된 물질이 이 크기보다 클 경우 필터상에 유지되며, 분산된 물질이 이 크기보다 작을 경우 통과하여 여액으로 들어감)에 대해 특별한 제한이 없다. 특정 적용(즉, 유지될 분산 물질 대 여액 내로 통과시킬 분산 물질)을 위한 필터 분급 크기가 선택되면, 필터를 통해 흐르는 담체 액체에 의해 발생하는 전단력의 양을 여과되는 특정 단백질의 전단력 민감성에 대해 고려하여 필터를 작동시킨다.
바람직한 필터 매질은 다공성 막이며, 이것은 일반적으로 다양한 크기(즉, 필터 표면적; 예를 들어 약 0.001 ㎡ 내지 약 5 ㎡의 범위임) 및 형태(예: 필터 디스크, 필터 카트리지)로 입수가능하다. 다공성 막은 셀룰로오스 니트레이트, 셀룰로오스 아세테이트, 비닐 중합체, 폴리아미드, 플루오로카본, 및 폴리에테르술폰과 같은 물질로부터 형성될 수 있다. 다공성 막은, 일반적으로 액체 혼합물로부터 제거하고자 하는 분산된 오염물의 크기에 따라 선택되는 고도로 균일한 크기를 갖는 공극을 포함한다. 예를 들어, (단백질은 필터 막을 통해 여액으로 통과시키면서) 미생물을 제거하고자 하는 멸균 여과 공정에서, 공극은 바람직하게는 약 0.1 ㎛ 내지 약 0.5 ㎛, 또는 약 0.15 ㎛ 내지 약 0.25 ㎛의 범위, 예를 들어 약 0.2 ㎛ 또는 약 0.22 ㎛의 크기를 갖는다. 적합한 다공성 막 필터는 또한, 0.2 ㎛/0.22 ㎛ 필터 및 보다 성긴(예: 약 0.45 ㎛) 예비필터를 둘 다 포함하여, 처리량을 향상시키고 0.2 ㎛/0.22 ㎛ 필터 표면에서 케이크 축적을 제한할 수 있다. 단백질을 갖는 액체 혼합물의 멸균 여과를 위한 적합한 시판 다공성 막 필터의 예로는, SARTOBRAN P 0.2 ㎛ 셀룰로오스 아세테이트 막(0.2 ㎛ 여과 공극 및 0.45 ㎛ 여과 공극을 갖는 예비필터 막을 둘 다 포함함; 독일 괴팅겐의 자르토리우스 아게(Sartorius AG)에서 입수가능함) 및 SUPOR EKV 0.2 ㎛ 폴리에테르술폰 막(미국 뉴욕주 이스트 힐즈의 폴 코포레이션(Pall Corporation)에서 입수가능함)을 들 수 있다.
도 1은 필터 장치 (100), 예를 들어 다공성 막을 갖는 카트리지 필터를 통한 액체 혼합물의 유동을 도시한다. 도시된 바와 같이, 액체 혼합물은 밀봉된 필터 장치 (100)에 유입구 (110)을 통해 유입 챔버 (120)으로 들어간다. 유입 챔버 (120) 내의 유체는 가압되어, 일반적으로 상압(즉, 약 1 bar 절대)보다 높은 제1 압력 P1을 갖는다. 유입 챔버 (120) 내의 제1 압력 P1은 액체 혼합물 내의 담체 액체 및 단백질을 다공성 필터 막 (130)을 통해 밀어낸다. 필터 막 (130)을 통과한 물질은 여액 챔버 (140) 내에 담체 액체 및 단백질을 모두 포함하는 여액을 형성한다. 여액 챔버 (140) 내의 유체도 역시 가압되어, 제1 압력 P1보다 낮지만 일반적으로 상기 상압보다는 높은 제2 압력 P2를 갖는다. 이어서, 정제된 여액은 배출구 (150)을 통해 필터 장치 (100)에서 빠져나온다. 배출구 (150) (및 제2 압력 P2)을 통과하는 유속은 역압 조절기 (160)을 통해 조절된다.
필터 막 (130)의 공극은 액체 혼합물 내에 함유된 분산된 오염물의 적어도 일부를 제거하고, 제거된 분산된 오염물을 필터 막 (130)의 유입구측(즉, 유입 챔버 (120) 내)에 유지하도록 하는 크기를 갖는다. 바람직하게는, 필터 막 (130)은 유입 액체 혼합물에 초기에 함유된 분산된 오염물을 실질적으로 모두 제거하도록 하는, 따라서 여액에 분산된 오염물이 실질적으로 없도록 (또는 없도록) 하는 크기를 갖는다. 구체적으로, 여액은 여과되고 정제된 단백질 혼합물을 치료 조성물로서 사용하는데 부정적 영향을 미칠 수 있는 양으로 분산된 오염물을 함유하지 않아야 한다. 예를 들어, 분산된 오염물이 미생물을 포함할 경우, 필터 막 (130)은 필터 면적 ㎠당 약 107 이상의 집락 형성 단위를 제거할 수 있어야 한다.
유입 액체 혼합물의 제1 압력 P1은 임의의 적합한 압력원, 예를 들어, 중력, 압축 기체(예, 압축 공기), 또는 펌프(예, 저전단력 펌프)에 의해 인가될 수 있다. 바람직하게는, 제1 압력 P1은 약 200 mbar 게이지 이상, 또는 약 200 mbar 게이지 내지 약 1,000 mbar 게이지(즉, 약 1 bar 게이지), 예를 들어 약 300 mbar 게이지이다. 역압(또는 배압)도 역시 임의의 적합한 소스, 예를 들어 통상적인 밸브(도 1에는 역압 조절기 (160)으로 도시됨)에 의해 인가되어 배출 여액의 제2 압력 P2를 얻을 수 있다. 또한, 역압은 배출구 (150) 경로의 길이를 따른 유동 억제, 차단 등에 의해 인가될 수도 있다. 제1 압력 P1 및 제2 압력 P2의 결과로서, 인가된 역압은 (양의) 차압 P1-P2를 발생시켜, 담체 액체 및 단백질을 필터를 통해 여액으로 밀어낸다. 차압은 낮으며, 적합한 최대 차압은 다양한 요인, 예를 들어 여과되는 특정 단백질 및 사용되는 특정 필터에 따라 달라진다. 특히, 차압은 바람직하게는 약 300 mbar, 200 mbar, 150 mbar, 또는 120 mbar 이하, 더욱 바람직하게는 약 90 mbar 또는 50 mbar 이하, 더욱더 바람직하게는 약 20 mbar 또는 10 mbar 이하, 예를 들어 약 5 mbar 이하 또는 약 3 mbar 이하이다.
이러한 차압에서, 필터를 통한 유속은 단백질의 활성을 실질적으로 손상시키거나, 파괴하거나, 또는 저하시키지 않는 저전단력 환경을 발생시킬 정도로 충분히 낮다. 저전단력 환경은 또한 여과 공정의 수율을 실질적으로 제한하지 않는다.
특히, 낮은 차압을 사용하여 비교적 높으면서도 실질적으로 일정한 여과 속도를 얻을 수 있음이 관찰되었다. 구체적으로, 낮은 차압을 인가하여 약 300 g/분·㎡ 이상, 예를 들어 약 300 g/분·㎡ 내지 약 1000 g/분·㎡ 또는 약 400 g/분·㎡ 내지 약 800 g/분·㎡의 평균 여과 유속을 얻을 수 있으며, 여기에서 단위는, 단위 시간(즉, 분)에 대해 얻어지고 필터의 단위 표면적(즉, ㎡)으로 표준화된 여액의 질량(즉, 담체 액체 및 단백질을 합한 그램)이다. 역압의 인가에 의해 얻어진 낮은 차압은 또한, 특히 시동 과도 기간(start-up transient) 종료 후에, 실질적으로 일정한 여과 속도를 발생시켜, 필터의 순 용량을 향상시킬 수 있다. 낮은 차압에서 관찰된 여과 속도와 대조적으로 (또한 여과 속도는 필터 전후의 차압에 비례함을 암시하는 일반적 여과 이론과 대조적으로), 더욱 높은 차압(예: 약 100 mbar 초과)은 여과 속도를 저하시키는 경향이 있다. 따라서, 약 100 mbar 이상 내지 약 300 mbar 이상의 차압을 인가하는 통상적인 여과 방법으로는 개시된 방법에서 관찰되는 평균 여과 유속을 달성할 수 없다.
또한, 낮은 차압을 사용하여 높은 단백질 회수율을 얻을 수 있음이 관찰되었다. 특히, 액체 혼합물 내에 초기에 존재하는 실질적으로 모든 단백질이 바람직하게 여액에서 회수된다. 예를 들어, 제1 농도 C1이 초기 액체 혼합물 내의 담체 액체에 대한 단백질의 농도를 나타내고 제2 농도 C2가 최종 여액 내에서의 담체 액체에 대한 단백질의 농도를 나타낸다고 할 때, 개시된 여과 방법의 회수율 C2/C1은 바람직하게는 약 0.95 이상, 더욱 바람직하게는 약 0.99 이상이다.
개시된 역압 여과 방법은 여과 유속의 정확한 조절을 제공하므로 단백질에 적용할 경우 유용하다. 액체 혼합물을 필터를 통해 밀어내기 위해 사용되는 압력원은 일반적으로 높은 전단 속도를 유발하는 과도한 압력을 공급하며, 이것은 다시 필터 막힘 및 단백질 손상으로 이어진다. 필터를 통과하는 평균 유속이 단백질 손상을 피할 정도로 충분히 낮고 실질적으로 일정하게 되도록, 충분히 낮으면서도 충분히 일정한 차압이 생성되도록 단일 압력원을 상압에 대해 조절하는 것은, 불가능하지는 않으나, 일반적으로 어렵다. 그러나 공정 유체의 여액 측에 역압을 인가함으로써, 비교적 높은 압력원(즉, 제1 압력 P1)에 대해 정확하게 균형을 잡아(즉, 제2 압력 P2로), 낮고 실질적으로 일정한 차압(즉, P1-P2)을 얻을 수 있다.
실시예
하기 실시예는 예시를 위해 제공되며, 본 발명의 범위를 제한하고자 함은 아니다.
실시예 1 내지 8
전단력 민감성 혈액 응고 캐스케이드 단백질 vWF의 수성 액체 혼합물을 멸균 여과하여 압력(및 역압) 및 다른 공정 변수(예: 필터 크기 및 유형)이 여과 효능에 미치는 효과를, 예를 들어 여액 내의 vWF의 회수 활성, 여액의 평균 유속, 및 공정 대규모화 능력에 기초하여 측정하였다.
125 IU/㎖의 활성 및 1159 ㎍/㎖의 농도(비신코닌산 ("BCA") 분석)를 가지는 재조합 vWF("rVWF:Rco")의 수성 액체 혼합물을 제조하여 하기 실시예 1 내지 8의 각각에 사용하였다. 저분자량 염을 첨가하여 혼합물의 pH 및 오스몰 농도(osmolarity)를 각각 7.3 및 약 400 mOsmol/ℓ(밀리오스몰/리터)의 값으로 조정하였다. 실시예 1 내지 8은 필터 근방에서 단백질에 대한 유체 동역학 효과(예: 전단력)를 분리하고자 한 것이므로, 다른 분산된 오염물 또는 물질(예: 박테리아, 다른 미생물, 또는 다른 단백질)은 혼합물에 첨가하지 않았다. 수성 액체 혼합물의 성분을 표 1에 요약하였다.
실시예 1 내지 8을 위한 액체 혼합물
혼합물 성분 농도
rVWF:Rco 125 IU/㎖
단백질(BCA) 1159 ㎍/㎖
시트르산나트륨 이수화물 4.53 g/ℓ
글리신 1.16 g/ℓ
트레할로스 10.26 g/ℓ
만니톨 20.52 g/ℓ
폴리소르베이트 80 (10:1 원액 희석) 1.03 g/ℓ
주사용수(WFI) 잔량
이어서, 수성 액체 혼합물을 하기 방식으로 시험하였다. 혼합물의 시험 부피 약 500 ㎖ 이상을 내압 스테인리스강 용기에 넣었다. 용기의 배출구를 실리콘 관의 제1 구획에 의해 (스팀-멸균된) 멸균 필터의 유입구에 연결하였다. 약 10 cm의 길이를 갖는 실리콘 관의 제2 구획을 멸균 필터 하우징의 배출구에 부착하였다. 멸균 필터로부터의 여액 유출액을 저울 위에 놓은 비이커에 수집하여 여과 속도를 모니터링하였다. 저울을 컴퓨터에 접속하여 설정된 간격으로 시간의 함수로서 수집되는 여액의 총량을 기록하였다.
실시예 1 내지 7에서는, SARTOBRAN P 0.2 ㎛ 셀룰로오스 아세테이트 막 필터 (0.45 ㎛ 예비필터 포함)를 사용하였다. 실시예 8에서는, SUPOR EKV 0.2 ㎛ 폴리에테르술폰 막 필터를 사용하였다. 실시예 1 내지 3은 디스크 막 필터를 사용하였으며, 실시예 4 내지 8은 카트리지 막 필터를 사용하였다. 각각의 필터의 필터 표면적을 표 2에 기재하였다.
실시예 1 내지 8의 각각에서, 수성 액체 혼합물의 시험 부피를 일정 압력에서 여과하였다. 실시예 1에서, 멸균 필터에 유입되는 수성 액체 혼합물의 인가 압력은, 스테인리스강 용기로부터 멸균 필터로 공급되는 유체 컬럼의 높이에 기초하여, 약 100 mbar 게이지(즉, 약 1.1 bar 절대)였다. 실시예 2 내지 8에서, 청정 압축 공기를 사용하여, 멸균 필터에 유입되는 수성 액체 혼합물의 압력을 제공하였으며, 이 압력은 표 2에 나타낸 바와 같이 150 mbar 내지 300 mbar 범위였다. 실시예 1 내지 4에서는 역압 여과를 수행하지 않았으며(즉, 여액이 수집 비커 내로 비워질 때 멸균 필터의 배출관을 대기에 개방하였음); 따라서 여과를 추동하는 차압은 본질적으로 멸균 필터에 유입되는 수성 액체 혼합물의 압력이었다. 실시예 5 내지 8에서는 멸균 필터의 배출관에 클램프를 부착하여 조임으로써 여액에 역압을 인가하였다. 실시예 5 내지 8에서의 차압(표 2에 나타냄)은 여과 동안 측정된 평균 여액 유속 및 사용된 시판 필터의 공지된 압력 강하-유속 특성에 기초하여 평가하였다.
일반적으로, 각각의 실시예에서, 혼합물은 수성 액체 혼합물 시험 부피가 제조된 직후에 여과하였다. 그러나 실시예 5에서는, 개시된 방법에 대한 저장의 임의의 잠재적인 효과를 조사하기 위해, 8시간 지연 후에 여과하였다.
표 2에 실시예 1 내지 8의 각각에 대한 시험 파라미터를 요약하였다.
실시예 1 내지 8에 대한 여과 시험 파라미터
실시예: 1 2 3 4 5 6 7 8
필터
막 형태 디스크 디스크 디스크 카트리지 카트리지 카트리지 카트리지 카트리지
표면적
(㎡)		 0.0017 0.0017 0.0017 0.015 0.015 0.015 0.03 0.022
공극 크기(㎛) 0.45/0.2 0.45/0.2 0.45/0.2 0.45/0.2 0.45/0.2 0.45/0.2 0.45/0.2 0.2
압력
역압 없음 없음 없음 없음 있음 있음 있음 있음
인가된 P1
(mbar 게이지)		 100 200 300 150 300 300 300 300
차압 P1-P2
(mbar)		 100 200 300 150 2.6 3.2 3.5 3.8
여과 시험의 결과를 표 3에 요약하였다. 표 3에서, "여액량"은 개별 시험 동안에 얻어진 여액(즉, 물 및 임의의 회수된 vWF 포함)의 질량을 나타낸다. 실시예 1 내지 4의 경우, 여과 시험은 필터가 막히게 되어 더 이상 여액의 실질적인 양을 수득할 수 없을 때까지 수행하였다. 실시예 5 내지 8의 경우, 여과 시험은 수백 그램의 여액을 얻어질 때까지 수행하였으며, 필터가 막히지 않고 여전히 추가 여과가 가능한 상태에서 시험을 종료하였다. 표 3에서 "필터 용량" 값은 필터 표면의 단위 면적에 대해 표준화된 여액량을 나타낸다. 실시예 5 내지 8의 경우 ">"은 필터 용량이, 필터가 시험 동안 막히게 되지 않은 것을 고려하면, 실제 용량에 비해 낮은 추정치임을 나타낸다. 표 3의 "평균 유속" 값은 시험의 과정에 걸쳐서 평균을 내고 필터 표면의 단위 면적에 대해 표준화한 여액량을 나타낸다.
실시예 1 내지 8에 대한 여과 결과
실시예: 1 2 3 4 5 6 7 8
여액량 (g) 27 5.4 5.1 75 390 720 1080 550
필터 용량 (kg/㎡) 16 3.2 3.0 5.0 >26 >48 >36 >25
평균 유속 (g/분·㎡) 290 148 72 53 330 410 450 760
표 3으로부터, 단백질의 역압 여과에 의해 여과 용량 및 유속이 현저히 증가되었음이 명백하다. vWF의 경우 심지어 100 mbar 내지 300 mbar의 범위의 온화하게 낮은 인가 압력 및 사용된 필터(사용된 필터 카트리지는 약 2 bar 내지 약 5.5 bar 범위의 최대 압력을 견딜 수 있음)에서도, 실시예 1 내지 4는 필터 용량이 낮고 압력 증가에 따라 급격히 감소함을 나타낸다. 대조적으로, 여액에 역압을 인가하여 차압을 감소시킨 경우, 실시예 5 내지 8은 현저히 더 큰 여과 용량 및 유속을 나타낸다. 필터는 일반적으로 여과 유속과 차압 사이에 하기 정비례 관계를 특징으로 함을 고려해 보면, 상기 관찰된 거동은 의외이다.
Figure pat00001
수학식 1에서, Q는 여과 유속(단위 시간당 부피 또는 질량)이고, A는 필터 표면적이고, Δp는 필터 전후의 차압이고, μ는 여과되는 유체의 점도이고, R은 필터 매질의 실험 저항이다. 실시예 5 내지 8의 결과들 간의 유사성은 또한 역압 여과의 유익이 다양한 필터 매질 및/또는 필터 크기를 사용하여 얻어질 수 있음을 나타낸다.
실시예 4 및 6의 시간-의존적 여과 데이터(즉, 시간의 함수로서 수집된 여액)를 도 2에 나타내었다. 도 2로부터, 실시예 4의 더 높은 차압은 여과 시험의 최초 10 내지 15분에 걸쳐 비교적 높은 여과 속도를 유발함이 명백하다. 그러나 실시예 4에서의 더 높은 차압은 또한 필터의 더욱 신속한 막힘을 유발한다. 대조적으로, 실시예 6에서의 역압의 사용은 차압 및 초기 여과 속도를 감소시킨다. 특히, 약 10분 내지 약 15분의 초기 과도 기간 후에, 낮은 차압에 의해, 필터가 vWF에 의해 막히게 되는 것을 방지함으로써 필터 수명 동안 필터 용량 및 여과 유속을 증가시키고, 또한 실질적으로 일정한 여과 유속을 생성하는 저전단 여과 환경이 생성된다.
표 4에 요약된 바와 같이, 실시예 1 내지 3, 및 5의 각각의 여액을 또한 분석하여, 여액 내의 재조합 vWF의 수준을 측정하고 여과 공정이 초기 수성 액체 혼합물 내에 존재하는 재조합 vWF의 농도에 부정적으로 영향을 미쳤는지를 판정하였다. 역압의 부재 하에, 실시예 1 내지 3은 심지어 온화하게 낮은 차압도 여과 동안 단백질을 손상 또는 파괴할 수 있으며, 200 mbar 내지 300 mbar의 차압에서의 여과 동안 재조합 vWF의 약 절반까지 손실되었음을 나타내었다. 이러한 여과 손실은, rVWF:Rco 농도의 측정가능한 감소가 발생하지 않았고 단지 측정된 단백질(BCA) 함량의 4％ 감소가 발생한 실시예 5에 나타난 바와 같이, 역압의 사용에 의해 피할 수 있다. 따라서, 초기에 수성 액체 혼합물 내에 존재하는 실질적으로 모든 단백질을 여액에 회수할 수 있다.
여액 내 vWF의 회수
실시예: 원액 1 2 3 5
rVWF:Rco (IU/㎖) 125 n/a 69 69 126
단백질(BCA)(㎍/㎖) 1159 1054 724 715 1113
실시예 9 내지 20
인자 VIII를 함유하는 수성 용액을 SARTOCLEAN 예비필터가 있는 SARTOBRAN® 필터상에서 시험하여 역압이 여과 효능에 미치는 효과를 예를 들어 필요한 필터 표면적에 기초하여 측정하였다. 실시예 9 내지 13에서는 역압 여과를 수행하지 않았으며, 초기 인가 압력은 100 mbar 내지 500 mbar였다. 실시예 14 내지 16에서는 차압이 200 mbar였으며, 실시예 17 내지 20에서는 차압을 150 mbar 미만으로 감소시켰다. 각각의 필터의 표면적은 1.2 ㎡였다. 표 5는 각각의 실험에 대한 여과 전 및 후의 인자 VIII 활성 및 수율을 나타낸다.
여액 내의 FVIII의 회수
실시예: 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
데드 엔드 여과 역압 여과
출발 부피(㎖) 695 670 710 623 698 702 684 727 717 650 707 704
여액 부피(㎖) 685 667 696 617 687 696 667 719 708 640 701 698
필터 수 10 10 15 5 15 7 10 8 5 5 6 5
총 필터 면적(㎡) 12 12 18 6 18 8.4 12 9.6 6 6 7.2 6
여과 전 활성 (IU/㎖) 11.5 11.8 14.5 8.04 8.41 13.7 7.99 12.2 10 9.46 9.74 8.95
여과 후 활성 (IU/㎖) 11.2 12.1 12.7 9.94 10.6 13.3 8.63 11.1 13.8 13 13.5 12.2
활성 수율(％) 96 102 86 122 124 96 105 90 136 135 137 135
필터 용량(kg/㎡) 57.9 55.8 39.4 103.8 38.8 83.6 57 75.7 119.5 108.3 98.2 117.3
평균 활성 수율 106 119
상기 데이터는 동량의 활성 물질에 대해 역압 여과를 사용할 경우 훨씬 더 작은 필터 면적이 필요함을 입증한다. 역압 여과는 여과를 안정화시키고, 차압을 최적화할 경우, 평균 활성 수율을 향상시킨다.
실시예 21 내지 25
인자 XIII를 함유하는 용액을 PALL® POSIDYNE® N66 나일론 필터상에서 시험하여, 역압이 여과 효능에 미치는 효과를 예를 들어 회수된 활성 및 여액 내의 인자 XIII의 단백질 농도에 기초하여 측정하였다. 필터 면적은 0.82 ㎡였다. 실시예 21 내지 23에서는 역압 여과를 수행하지 않았으며, 이들 실시예에서의 인가 압력은 600 mbar였다. 실시예 24 내지 26에서는 차압이 약 100 mbar였다. 표 6은 각각의 실험에 대한 여과 전 및 후의 단백질 농도 및 활성 및 수율을 나타낸다.
여액 내의 FXIII의 회수
실시예: 21 22 23 24 25 26
데드 엔드 여과 역압 여과
여과 전 활성(IU/㎖) 217.9 188 161.7 158 187.2 118.8
여과 후 활성(IU/㎖) 194.6 179.8 180.2 189.4 184.8 115.2
활성 수율(％) 89 96 111 120 99 97
평균 활성 수율 99 105
여과 전 단백질(㎍/㎖) 4.65 5.57 6.28 5.9 5.66 3.66
여과 후 단백질(㎍/㎖) 3.59 4.48 5.04 5.03 5.25 3.73
단백질 수율(％) 77 80 80 85 93 102
평균 단백질 수율 79 93
표 6에 나타낸 바와 같이, 활성 수율 및 단백질 수율은 여과 동안 역압의 사용에 의해 상당히 향상되었다.
상기 설명은 단지 이해의 명확함을 위해 주어진 것이고, 그로부터 불필요한 제한은 없음을 이해하여야 하며, 본 발명의 범위 이내에서의 변경은 당업자에게 자명할 수 있다.
명세서 전반에서, 조성물이 성분 또는 물질을 포함하는 것으로서 기재된 경우, 그러한 조성물은 달리 기재되지 않은 이상, 언급된 성분 또는 물질의 임의의 조합으로 본질적으로 이루어지거나, 그것으로 이루어질 수 있음이 고려된다.
본원에 개시된 방법의 및 그의 개별 단계의 실시는 수동으로 및/또는 전자 장치를 이용하여 수행할 수 있다. 특정 실시양태를 참조하여 방법을 설명하였으나, 당업자는 그 방법과 관련된 작업을 수행하는 다른 방식을 사용할 수 있음을 쉽게 알 것이다. 예를 들어, 다양한 단계들의 순서는, 달리 기재되지 않은 이상, 방법의 범위 또는 정신으로부터 벗어남 없이 변경될 수 있다. 또한, 개별 단계들의 일부는 조합되거나, 생략되거나, 또는 추가의 단계로 더 분할될 수 있다.

Claims (43)

  1. 액체 단백질 혼합물의 여과 방법이며,
    담체 액체, 담체 액체에 대해 제1 농도(C1)의 단백질, 및 분산된 오염물을 포함하는 제1 압력(P1)의 액체 혼합물을 제공하는 단계;
    액체 혼합물을 데드-엔드(dead-end) 필터에 통과시켜, 제2 압력(P2)의 여액을 형성하는 단계로서, 여액은 담체 액체, 및 담체 액체에 대해 제2 농도(C2)의 단백질을 포함하고, 필터는 분산된 오염물의 일부 이상을 액체 혼합물로부터 제거하는 크기를 갖는 단계; 및
    여액에 역압을 인가하여, 제1 압력과 제2 압력 사이의 차압(P1-P2)이 0 mbar 초과 300mbar 이하가 되도록 보장하고/거나 300 g/분·㎡의 필터 표면적 이상의 평균 유동을 생성하는 단계를 포함하고,
    필터가 0.1 ㎛ 내지 0.5 ㎛ 크기의 공극을 포함하는 다공성 막을 포함하고,
    액체 혼합물에 존재하는 단백질의 약 85% 이상이 여액 내에 회수되는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 단백질이 전단력 민감성 단백질 또는 혈액 응고 단백질을 포함하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 단백질이 폰 빌레브란트 인자(von Willebrand factor; vWF), 인자 VIII, 인자 XIII, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 액체 혼합물 내에 존재하는 단백질의 95％ 이상이 여액 내에 회수되는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 액체 혼합물 내에 존재하는 단백질의 99％ 이상이 여액 내에 회수되는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 담체 액체가 물을 포함하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 분산된 오염물이 미생물을 포함하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 여액에 분산된 오염물이 실질적으로 없는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 차압이 90 mbar 이하인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 차압이 50 mbar 이하인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 제2 압력(P2)은 제1 압력(P1)보다 낮고, 상압보다 높은 방법.
  12. 제1항에 있어서, 제1 압력(P1)은 상압보다 높고 약 1 bar보다 낮으며, 제2 압력(P2)은 제1 압력(P1)보다 낮은 방법.
  13. 제1항에 있어서, 제1 압력(P1)이 약 200 mbar 게이지 이상인 방법.
  14. 제1항에 있어서, 공극이 0.2 ㎛ 또는 0.22 ㎛의 크기를 갖는 것인 방법.
  15. 액체 단백질 혼합물의 여과 방법이며,
    담체 액체, 담체 액체에 대해 제1 농도(C1)의 단백질, 및 분산된 오염물을 포함하는 제1 압력(P1)의 액체 혼합물을 제공하는 단계;
    분산된 오염물의 일부 이상을 액체 혼합물로부터 제거하는 크기를 갖는 필터에 액체 혼합물을 통과시켜, 담체 액체, 및 담체 액체에 대해 제2 농도(C2)의 단백질을 포함하는 제2 압력(P2)의 여액을 형성하는 단계; 및
    여액에 역압을 인가하여, 제1 압력과 제2 압력 사이의 차압(P1-P2)이 0 mbar 초과 300 mbar 이하가 되도록 보장하고/거나 300 g/분·㎡의 필터 표면적 이상의 평균 유동을 생성하는 단계를 포함하고,
    단백질이 혈액 응고 캐스케이드 단백질을 포함하고,
    액체 혼합물에 존재하는 혈액 응고 캐스케이드 단백질의 약 85% 이상이 여액 내에 회수되는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 액체 혼합물에 존재하는 활성의 혈액 응고 캐스케이드 단백질의 약 90% 이상이 여액 내에 회수되는 방법.
  17. 제15항에 있어서, 혈액 응고 캐스케이드 단백질이 폰 빌레브란트 인자(vWF), 인자 VIII, 인자 XIII, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  18. 제15항에 있어서, 액체 혼합물에 존재하는 혈액 응고 캐스케이드 단백질의 95% 이상이 여액 내에 회수되는 방법.
  19. 제15항에 있어서, 액체 혼합물에 존재하는 혈액 응고 캐스케이드 단백질의 99% 이상이 여액 내에 회수되는 방법.
  20. 제15항에 있어서, 담체 액체가 물을 포함하는 방법.
  21. 제15항에 있어서, 분산된 오염물이 미생물을 포함하는 방법.
  22. 제15항에 있어서, 여액에 분산된 오염물이 실질적으로 없는 방법.
  23. 제15항에 있어서, 역압은 300 g/분·㎡ 내지 1000 g/분·㎡의 필터 표면적의 평균 여액 유속을 생성하기에 충분한 방법.
  24. 제15항에 있어서, 차압이 150 mbar 이하인 방법.
  25. 제24항에 있어서, 차압이 90 mbar 이하인 방법.
  26. 제15항에 있어서, 역압의 인가가 저전단력 환경을 제공하는 방법.
  27. 제15항에 있어서, 제2 압력(P2)은 제1 압력(P1)보다 낮고, 상압보다 높은 방법.
  28. 제15항에 있어서, 제1 압력(P1)은 상압보다 높고 약 1 bar보다 낮으며, 제2 압력(P2)은 제1 압력(P1)보다 낮은 방법.
  29. 제15항에 있어서, 제1 압력(P1)이 약 200 mbar 내지 약 1000 mbar 게이지인 방법.
  30. 제15항에 있어서, 필터가 0.1 ㎛ 내지 0.5 ㎛ 크기의 공극을 포함하는 다공성 막을 포함하는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 공극이 0.2 ㎛ 또는 0.22 ㎛의 크기를 갖는 것인 방법.
  32. 제30항에 있어서, 액체 혼합물이 미생물 집단을 더 포함하며, 미생물 집단의 일부 이상이 다공성 막 필터에 의해 액체 혼합물로부터 제거되는 방법.
  33. 수성 단백질 혼합물의 여과 방법이며,
    물, 물에 대해 제1 농도(C1)의 단백질, 및 분산된 오염물을 포함하는 제1압력(P1)의 수성 혼합물을 제공하는 단계;
    분산된 오염물의 일부 이상을 수성 혼합물로부터 제거하는 크기를 갖는 공극을 포함하는 다공성 막 필터에 수성 혼합물을 통과시켜, 물, 및 물에 대해 제2 농도(C2)의 단백질을 포함하는 제2 압력(P2)의 여액을 형성하는 단계; 및
    여액에 역압을 인가하여, 제1 압력과 제2 압력 사이의 차압(P1-P2)이 0 mbar 초과 300 mbar 이하가 되도록 보장하는 단계를 포함하고,
    단백질이 혈액 응고 캐스케이드 단백질을 포함하고,
    수성 혼합물에 존재하는 혈액 응고 캐스케이드 단백질의 약 85% 이상이 여액 내에 회수되는 방법.
  34. 제33항에 있어서, 공극이 0.1 ㎛ 내지 0.5 ㎛의 크기를 갖는 것인 방법.
  35. 제34항에 있어서, 공극이 0.2 ㎛ 또는 0.22 ㎛의 크기를 갖는 것인 방법.
  36. 제33항에 있어서, 제1 압력(P1)이 약 200 mbar 내지 약 1000 mbar 게이지인 방법.
  37. 제33항에 있어서, 역압은 300 g/분·㎡ 내지 1000 g/분·㎡의 필터 표면적의 평균 여액 유속을 생성하기에 충분한 방법.
  38. 제33항에 있어서, 분산된 오염물이 미생물을 포함하는 방법.
  39. 제33항에 있어서, 여액에 분산된 오염물이 실질적으로 없는 방법.
  40. 제33항에 있어서, 수성 혼합물에 존재하는 활성의 혈액 응고 캐스케이드 단백질의 약 95% 이상이 여액 내에 회수되는 방법.
  41. 제33항에 있어서, 차압이 150 mbar 이하인 방법.
  42. 제41항에 있어서, 차압이 90 mbar 이하인 방법.
  43. 제33항에 있어서, 혈액 응고 캐스케이드 단백질이 폰 빌레브란트 인자(vWF), 인자 VIII, 인자 XIII, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
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