PT2207786E - 2'-fluoro-2'-desoxitetra-hidrouridinas como inibidores de citidina desaminase - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

"2'—FLUORO—2'—DESOXITETRA—HIDROURIDINAS COMO INIBIDORES DE CITIDINA DESAMINASE"

Este pedido reivindica o beneficio do Pedido Provisório U.S. N° 60/980397, apresentado em 16 de Outubro de 2007, cujo conteúdo total é aqui incorporado por referência.

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona determinados compostos derivados de tetra-hidrouridina que são inibidores da enzima citidina desaminase, composições farmacêuticas compreendendo tais compostos, e métodos de produzir e utilizar tais compostos.

ANTECEDENTES DA TÉCNICA

As enzimas adenosina desaminase (ADA, EC 3.5.4.4) e citidina desaminase (CDA, EC 3.5.4.5) têm a função de desaminação de nucleósidos de aminopurina e de aminopirimidina naturais, respectivamente, em humanos e outros organismos. Estas poderão também converter fármacos activos baseados em nucleósidos em metabolitos inactivos. Por exemplo, o fármaco de nucleósido de purina, arabinosiladenina (fludarabina, ara-A) é deaminada pela ADA; o composto resultante, com o grupo amino parental substituído com hidroxilo, é inactivo como agente 1 antitumoral comparado com o composto parental. De um modo semelhante, o fármaco antileucémico arabinosilcitosina (citarabina, ara-C) é metabolicamente degradado pela CDA em arabinosiluracilo inactivo. A CDA é um componente da via de recuperação de pirimidina. Esta converte a citidina e a desoxicitidina em uridina e desoxiuridina, respectivamente, por desaminação hidrolitica (Arch. Biochem. Biophys. 1991, 290, 285-292; Methods Enzymol. 1978, 51, 401-407; Biochem. J. 1967, 104, 7P) . Também desamina vários análogos sintéticos de citosina que são fármacos clinicamente úteis, tal como a ara-C acima mencionada (Câncer Chemother. Pharmacol. 1998, 42, 373-378; Câncer Res. 1989, 49, 3015-3019; Antiviral Chem. Chemother. 1990, 1, 255-262). A conversão dos compostos de citosina em derivados de uridina confere habitualmente perda de actividade terapêutica ou adição de efeitos secundários. Foi também demonstrado que cancros que adquirem resistência a fármacos análogos de citosina muitas vezes sobre-expressam a CDA (Leuk Res. 1990, 14, 751-754). Células leucémicas expressando um elevado nivel de CDA podem manifestar resistência a antimetabolitos de citosina e assim limitar a actividade antineoplásica de tais terapêuticas (Biochem. Pharmacol. 1993, 45, 1857-1861). Os inibidores de CDA podem, por conseguinte, ser adjuvantes utéis na quimioterapia de combinação. A tetra-hidrouridina (THU) é conhecida como um inibidor da citidina desaminase desde há vários anos. 2

OH

OH

Tet ra-hidouridina (THU) Vários relatórios têm sugerido que a co-administração com THU aumenta a eficácia e actividade oral de fármacos baseados em citidina. Por exemplo, foi demonstrado que a THU melhora a actividade oral do agente anti-leucémico 5- azacitidina em ratinhos leucémicos L1210 (Câncer Chemotherapy Reports 1975, 59, 459-465). A combinação de THU e 5-azacitidina também tem sido estudada no modelo de anemia de células falciformes de babuíno (Am. J. Hematol 1985, 18, 283-288.) e em doentes humanos com anemia de células falciformes em combinação com 5-azacitidina administrada oralmente (Blood 1985, 66, 527-532).

5-azacitidina 5-aza-2'-desoxicitidina ara-C (decitabina)

Foi também demonstrado que a THU melhora a eficácia oral de ara-C em ratinhos leucémicos L1210 (Câncer Research 1970, 30, 3 2166; Câncer Invest 1987, 5, (4), 293-9) e em ratinhos portadores de tumores (Cancro Treat. Rep. 1977, 61, 1355-1364). A combinação de ara-C administrada intravenosamente com a THU administrada intravenosamente tem sido investigada em vários estudos clínicos em humanos (Câncer Treat. Rep. 1977, 61, 1347-1353; Câncer Treat. Rep. 1979, 63, 1245-1249; Câncer Res. 1988, 48, 1337-1342). Em particular, têm sido realizados estudos de combinação em doentes com leucemia mielóide aguda (LMA) e leucemia mielóide crónica (LMC) (Leukemia 1991, 5, 991-998; Câncer Chemother. Pharmacol. 1993, 31, 481-484). A 5-aza-2'-desoxicitidina (decitabina) é um agente antineoplásico para o tratamento da síndrome mielodisplásica (SMD), bem como com potencial utilidade para o tratamento de LMA e LMC. Tal como os outros fármacos baseados em citidina, a sua biodisponibilidade oral e eficácia são limitados por desactivação pela CDA. Foi mostrado que a THU melhora a potência de decitabina no modelo de doença de células falciformes em babuínos (Am. J. Hematol. 1985, 18, 283-288). Além disso, tem sido mostrado que outro conhecido inibidor da CDA, zebularina, aumenta a eficácia da decitabina em ratinhos com leucemia L1210 (Anticancer Drugs 2005, 16, 301-308). A gencitabina, outro fármaco antineoplásico baseado em citidina, foi também estudada em conjugação com inibidores de CDA (Biochem. Pharmacol. 1993, 45 , 1857-1861: ) . Foi demonstrado que a co-administração com THU altera a farmacocinética e biodisponibilidade da gencitabina em ratinhos (Abstr. 1556, 2007 AACR Annual Meeting, 14-18 de Abril de 2007, Los Angeles, CA; Clin. Câncer Res. 2008, 14, 3529-3535). 4 5-fluoro-2'-desoxicitidina (fluorocitidina, FdCyd) é um outro fármaco anti-canceroso baseado em citidina que é um inibidor da ADN metiltransferase. A modulação do seu metabolismo e farmacocinética por THU em ratinhos tem sido estudada (Clin Câncer Res., 2006, 12, 7483-7491; Câncer Chemother. Pharm. 2008, 62, 363-368).

Os resultados dos estudos acima mencionados sugerem que existe utilidade terapêutica na administração de inibidores de CDA juntamente com fármacos baseados em citidina, tais como ara-C, decitabina, 5-azacitidina e outros. No entanto, os inibidores de CDA iniciais, tail como THU sofrem de inconvenientes que incluem a instabilidade ácida (J. Med. Chem. 1986, 29, 2351) e fraca biodisponibilidade (J. Clin. Pharmacol. 1978, 18, 259).

Existe portanto, uma necessidade contínua de novos, mais potentes e terapeuticamente úteis, inibidores de CDA

BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona determinados compostos derivados de tetra-hidrouridina, composições farmacêuticas compreendendo tais compostos e métodos de produzir e utilizar tais compostos. Os compostos, composições e métodos da invenção podem proporcionar determinados benefícios. Por exemplo, os compostos e composições da invenção podem inibir a activiadade da enzima CDA e/ou melhorar a semi-vida, biodisponibilidade e/ou eficácia de fármacos que são substratos para CDA. De um modo adicional, os compostos, composições e métodos da invenção podem apresentar solubilidade aquosa, estabilidade química, níveis de 5 absorção de fármaco, níveis de toxicidade, estabilidade em armazenamento e reprodutibilidade melhorados no fabrico e formulação, e eficácia terapêutica.

Numa forma de realizaçao, a invenção proporciona um composto de fórmula I:

OH

OH ou um seu sal f armaceut icamente aceitável, em que o carbono assinalado com asterisco poderá apresentar uma configuação (R) ou (S) e, em que Ri e R2 são fluoro. Em algumas formas de realização, uma composição farmacêutica ou método de utilização divulgado poderá compreender um composto com uma configuração (R) uma configuração (S) ou uma mistura das configurações (R) e (S) .

Em formas de realização adicionais, o composto de fórmula I tem a esteroquimica de Ia ou Ib: 6

OH

OH

la lb

Em formas de realizaçao adicionais, o composto de fórmula I é o Composto 1 ou um seu sal farmaceuticamente aceitável:

OH

OH

Composto 1

Em formas de realização adicionais, o composto de fórmula I é seleccionado de um grupo consistindo nos Compostos la, lb e seus sais farmaceuticamente aceitáveis. OH OH | HN"S HN^S 0Λ4 U.U- O*" \ '"oh OH \ '"oh OH Composto la Composto lb 7

Uma vez que os compostos da invenção podem possuir, pelo menos, um centro quiral, estes podem existir na forma de enantiómeros, diastereómeros, misturas racémicas, misturas não-racémicas ou outros esterioisómeros. A presente invenção engloba todos esses isómeros possíveis, bem como isómeros geométricos e tautómeros.

Um outro aspecto da presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo: (i) uma quantidade eficaz de um composto da invenção, como aqui descrito, incluindo mas não limitado a cada forma de realização concreta; e (ii) um excipiente farmaceuticamente aceitavel.

Em formas de realização adicionais, a composição farmacêutica inclui ainda uma quantidade eficaz de, pelo menos, um agente terapêutico adicional, tais como um fármaco de substrato CDA ou agente quimioterapêutico. A "quantidade eficaz" do composto da invenção pode variar de 0,1% em peso a cerca de 100% em peso. Em algumas formas de realização, a quantidade eficaz do composto é 0,1 a 20% p/p. Noutras formas de realização, a quantidade eficaz é 1-10% p/p. Ainda outras formas de realização, a quantidade eficaz é 2-5% p/p.

As composições farmacêuticas da invenção podem ser formuladas para administração em forma líquida ou sólida, incluindo aquelas adaptadas para o seguinte: (1) administração oral, por exemplo, bebidos (por exemplo, soluções aquosas ou não 8 aquosas ou suspensões), comprimidos (por exemplo, os direccionados para absorção bucal, sublingual e sistémica), cápsulas, bolus, pó, grânulos, pastas para aplicação na língua, cápsulas de gelatina dura, cápsulas de gelatina mole, sprays bucais, trociscos, pastilhas, granulados, xaropes, suspensões, elixires, líquidos, emulsões e microemulsões; (2) administração parentérica, por exemplo, através de injecção subcutânea, intramuscular, intravenosa ou epidural como por exemplo, uma solução ou suspensão estéril; (3) aplicação tópica, por exemplo, como um creme, pomada, emplastro, almofada ou spray aplicado na pele; (4) via intravaginal ou via intrarrectal, por exemplo, como um pessário, creme ou espuma; (5) via sub-lingual; (6) via ocular; (7) via transdérmica; ou (8) via nasal. As composições farmacêuticas podem ser formuladas para libertação imediata, sustida ou controlada.

Em algumas formas de realização, as composições farmacêuticas são formuladas para administração oral. Em formas de realização adicionais, as composições farmacêuticas são formuladas para administração oral na forma sólida.

Outra forma de realização da presente invenção refere-se a um método para inibir a citidina desaminase, compreendendo administração a um indivíduo como necessidade deste, de uma quantidade eficaz de um composto ou composição farmacêutica da invenção como aqui descrito, incluindo mas não limitada a cada forma de realização concreta.

Em algumas formas de realização, o indivíduo é um mamífero. Em formas de realização adicionais, o indivíduo é humano. 9

Outra forma de realização da presente invenção refere-se a utilização dos compostos da presente invenção num método para tratamento de cancro, compreendendo a administração a um indivíduo com necessidade deste: (i) uma quantidade eficaz de um composto ou composição farmacêutica da invenção como aqui descrito, incluindo mas não limitada a cada forma de realização concreta; e (ii) um fármaco de substrato CDA, incluindo mas não limitado a cada forma realização concreta descrita aqui.

Em algumas formas de realização, o indivíduo é um mamífero. Em formas de realização adicionais, o indivíduo é humano.

Em algumas formas de realização, o cancro é seleccionado de cancros hematológicos e cancros sólidos. Em formas de realização adicionais, o cancro hematológico é seleccionado de MDS e leucemia. Em formas de realização adicionais, o cancro sólido é seleccionado de cancro pancreático, cancro do ovário, cancro peritoneal, cancro do pulmão de não pequenas células e cancro da mama. Ainda noutras formas de realização, a leucemia é leucemia mieloide aguda (LMA) ou leucemia miéloide crónica (LMC).

Outra forma de realização da presente invenção refere-se um método para inibição da degradação de fármacos de substrato CDA por citidina desaminase, compreendendo a administração de uma quantidade eficaz de um composto ou composição farmacêutica da invenção como aqui descrito, incluindo mas não limitada a cada forma de realização concreta, a um indivíduo submetido a tratamento com o fármaco de substrato CDA. 0 fármaco de substrato CDA, incluindo mas não limitado a cada forma de realização concreta aqui descrita. 10

Em algumas formas de realizaçao, o indivíduo é um mamífero.

Em formas de realizaçao adicionais, o indivíduo é humano.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS FIG. 1 é um gráfico que mostra o efeito do Composto 1 na sobrevivência induzida por decitabina, no modelo L1210 de linfoma de ratinho. FIG. 2 é um gráfico que mostra o efeito do ( Composto la na sobrevivência induzida por decitabina no modelo L1210 de linfoma de ratinho. FIG. 3 é um gráfico que mostra o efeito do Composto 1 na sobrevivência induzida por Ara-C (200 mg/kg) no modelo L1210. FIG. 4 é um gráfico que mostra o efeito do Composto 1 na sobrevivência induzida por Ara-C (100 mg/kg) no modelo L1210. FIG. 5 é um gráfico que mostra o efeito do Composto 1 na sobrevivência induzida por Ara-C (50 mg/kg) no modelo L1210. FIG. 6 é um gráfico que mostra o efeito do Composto 1 na sobrevivência induzida por Ara-C (25 mg/kg) no modelo LI210 . 11 FIG. 7 é um gráfico que mostra o efeito do Composto 1 na redução do volume de tumor induzida por gencitabina no modelo de xenotransplante de cancro do ovário humano em ratinhos A2780. FIG. 8 é uma representação ORTEP da estrutura cristalina do Composto la. FIG. 9 é a estrutura RMN de 1H de THU em D2O. FIG. 10 é a estrutura RMN de de THU em D20, na presença de ácido trifluoroacético, a diferentes tempos. FIG. 11 é a estrutura RMN de ΤΗ do Composto la em D20. FIG. 12 é a estrutura RMN de ΤΗ do Composto la em D20, na presença de ácido trifluoroacético, a diferentes tempos.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona determinados compostos derivados de tetra-hidrouridina, composições farmacêuticas compreendendo tais compostos, e métodos para produzir e utilizar tais compostos. Os compostos, composições e métodos da invenção podem proporcionar determinados benefícios. Por exemplo, os compostos e composições da invenção pode inibir a actividade do enzima CDA e/ou melhorar a semi-vida, biodisponibilidade e/ou eficácia de fármacos que são subtrato para CDA. Além disso, os compostos, composições e métodos da invenção podem apresentar solubilidade aquosa, estabilidade química, níveis de absorção de fármaco, níveis de toxicidade, estabilidade em armazenamento e 12 reprodutibilidade melhorados no fabrico e formulação, e eficácia terapêutica.

Definições

Ao longo da descrição e reivindicações, aplicam-se as seguintes definições.

Tal como utilizado na descrição e reivindicações, as formas singulares "a", "uma" e "o" incluem referências plurais a menos que o conteúdo claramente dite o contrário. Assim, por exemplo, a referência a uma composição farmacêutica compreendendo "um composto" pode englobar dois ou mais compostos. "Fármaco de substrato CDA" refere-se a um fármaco que pode ser desaminado pela CDA. Exemplos não limitativos de substrato CDA incluem análogos de citidina, tais como decitabina, 5-azacitidina, gencitabina, ara-C, troxacitabina, tezacitabina, 5'-fluoro-2'-desoxicitidina e citocloro. "Quantidade eficaz" refere-se a quantidade requerida para produzir um efeito desejado (e. g., melhorando a semi-vida, biodisponibilidade ou eficácia do fármaco de substrato CDA, tratamento de cancro num indivíduo, inibição de citidina desaminase num indivíduo, ou inibição da degradação de um fármaco de substrato CDA por citidina desaminase). "Semi-vida" refere-se ao período de tempo necessário para redução da concentração ou quantidade de um composto num indivíduo exactamente a metade de uma dada concentração ou quantidade. 13 "Farmaceuticamente aceitável" refere-se as propriedades e/ou substâncias que são aceitáveis para o doente de um ponto de vista farmacológico e/ou toxicológico e/ou para o químico de produtos farmacêuticos, de um ponto de vista físico e/ou químico quanto à composição, formulação, estabilidade, aceitação do doente, biodisponibilidade e compatibilidade com outros ingredientes. "Excipiente farmaceuticamente aceitável" pode significar qualquer substância, não em si, um agente terapêutico, utilizado como transportador, diluente, adjuvante, ligante, e/ou veiculo para distribuição de um agente terapêutico a um indivíduo, ou adicionado a uma composição farmacêutica para melhorar as suas propriedades de manuseamento ou armazenamento ou para permitir ou facilitar formação de um composto ou composição numa forma de dosagem única, para administração. Excipientes farmaceuticamente aceitáveis são bem conhecidos nas técnicas farmacêuticas e são descritos, por exemplo, em Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa (e. g., 20a Ed., 2000), e Handbook of Pharmaceutical Excipients, American Pharmaceutical Association, Washington, D.C., (e. g., Ia, 2a e 3a Eds., 1986, 1994 e 2000, respectivamente) . Como será conhecido pelos especialistas na técnica, os excipientes podem proporcionar uma variedade de funções e podem ser descritos como agentes molhantes, agentes tamponantes, agentes de suspensão, agentes lubrificantes, emulsificantes, desintegradores, absorventes, conservantes, tensioactivos, corantes, aromatizantes, e adoçantes. Exemplos de excipientes farmaceuticamente aceitáveis incluem sem limitação: (1) açúcares, tais como lactose, glucose e sacarose; (2) amidos, tais como amido de milho e amido de batata; (3) celulose e seus derivados, tais como 14 etilcelulose carboximetilcelulose de sódio, etilcelulose, acetato de celulose, hidroxipropilmetilcelulose e hidroxipropilcelulose; (4) tragacanto em pó; (5) malte; (6) gelatina; (7) talco; (8) excipientes, tais como manteiga de cacau e ceras supositórias; (9) óleos, tais como óleo de amendoim, óleo de algodão, óleo de cártamo, óleo de sésamo, azeite, óleo de milho e óleo de soja; (10) glicóis, tais como propilenoglicol; (11) polióis, tais como glicerina, sorbitol, manitol e polietilenoglicol; (12) ésteres, tais como oleato de etilo e laurato de etilo; (13) agár; (14) agentes tamponantes, tais como hidróxido de magnésio e hidróxido de aluminio; (15) ácido alginico; (16) água apirogénica; (17) solução salina isotónica; (18) solução de Ringer; (19) álcool etílico; (20) soluções de pH tamponado; (21) poliésteres, policarbonatos e/ou polianidridos; e (22) outras substâncias não-tóxicas compatíveis empregues em formulações farmacêuticas. "Sal farmaceuticamente aceitável" refere-se a um sal ácido ou básico de um composto da invenção, em que o sal possui a actividade farmacológica desejada e não é nem biologicamente nem de outro modo indesejável. O sal pode ser formado com ácidos que incluem sem limitação acetato, adipato, alginato, aspartato, benzoato, benzenossulfonato, bissulfato de butirato, citrato, canforato, canforossulfonato, ciclopentanopropionato, digluconato, dodecilsulfato, etanossulfonato, fumarato, gluco-heptanoato, glicero-fosfato, hemissulfato, heptanoato, hexanoato, hidrobromidrato de hidrocloridrato, hidroiodeto, 2-hidroxietano-sulfonato, lactato, maleato, metanossulfonato, 2-naftalenossulfonato, nicotinato, oxalato, tiocianato, tosilato e undecanoato. Exemplos de sais básicos incluem sem limitação sais de amónio, sais de metais alcalinos, tais como sais de sódio e potássio, sais de metais alcalino-terrosos, tais como sais de cálcio e magnésio, sais com bases orgânicas, tais como sais de 15 diciclo-hexilamina, N-metil-D-glucamina e sais com aminoácidos, tais como arginina e lisina. Em algumas formas de realização, os grupos básicos contendo azoto podem ser quaternizados com agentes incluindo halogenetos de alquilo inferiores, tais como cloretos de metilo, etilo, propilo e butilo, brometos e iodetos; sulfatos de dialquilo, tais como sulfatos de dimetilo, dietilo, dibutilo e diamilo; halogenetos de cadeia longa, tais como cloretos de decilo, laurilo, miristilo e estearil, brometos e iodetos; e halogenetos de aralquilo, tais como brometos de feniletilo. "Forma de dosagem unitária" refere-se a uma unidade fisicamente discreta adequada como dosagem unitária para indivíduos humanos ou outros animais. Cada forma de dosagem unitária pode conter uma quantidade pré-determinada de uma substânciia activa (e. g., composto ou composição da invenção, fármaco de substrato CDA e/ou outro agente terapêutico) calculado para produzir o efeito desejado. "Isómeros" refere-se a compostos tendo o mesmo número e tipo de átomos e, portanto, o mesmo peso molecular, mas diferindo no que respeita ao arranjo ou configuração dos átomos. "Estereoisómeros" refere-se a isómeros que diferem unicamente no arranjo dos atómos no espaço. "Diaestereoisómeros" refere-se a esterioisómeros que não são a imagem no espelho um do outro. "Enantiómeros" refere-se a esterioisómeros que são imagens no espelho não-sobreponiveis um do outro. Os enantiómeros incluem isómeros "enantiomericamente puros" que compreendem 16 substancialmente um único enantiómero, por exemplo, maior que ou igual a 90%, 92%, 95%, 98% ou 99%, ou igual a 100% de um único enantiómero. "Epimeros" refere-se a esterioisómeros de um composto que têm diferentes configurações, num único dos vários centros estereogénicos. "Racémico" refere-se a uma mistura contendo partes iguais de enantiómeros individuais. "Não racémicas" refere-se a uma mistura contendo partes desiguais de enantiómeros individuais. A mistura não racémica pode ser enriquecida na configuração R- ou S-, incluindo, sem limitação, misturas de 50/50, cerca de 60/40 e cerca de 70/30 enantiómero R- sobre S-, ou enantiómero S- sobre R-. "Opcional" ou "opcionalmente" significa que o evento ou circustância subsequentemente descrito pode ou não ocorrer, e que a descrição inclui casos em que o evento ou circustância ocorre e casos em que não ocorre. Por exemplo, um alquilo que é "opcionalmente substituído" engloba um alquilo que não é substituído e um alquilo que é substituído. "Indivíduo" refere-se a uma celúla ou tecido, in vitro ou in vivo, um animal ou um humano. Um indivíduo animal ou humano pode ser também referido como "doente." "Animal" refere-se a um organismo vivo que tem sensações e o poder do movimento voluntário e que requer para a sua existência oxigénio e alimentos orgânicos. 17 "Mamífero" refere-se a um animal vertebrado de sangue quente, com cabelo ou pêlo. Exemplos incluem sem limitação membros das espécies humana, equina, suina, bovina, murina, canina ou felina. "Tratamento" em referência a uma doença, distúrbio ou estado refere-se a: (i) inibição de uma doença, distúrbio ou estado, e. g., impedindo o seu desenvolvimento; e/ou (ii) alivio da doença, distúrbio ou estado, e. g., causando a regressão dos sintomas clínicos. "Prevenção" em referência a uma doença, distúrbio ou estado refere-se a prevenir uma doença, distúrbio ou estado, e. g., provocando o não desenvolvimento dos sintomas clínicos da doença, distúrbio ou estado. "Cancro" refere-se a um crescimento de células anormal que tendem a proliferar de uma forma não controlada e em alguns casos, a metastizar (espalhar). Tipos de cancro específicos, incluem sem limitação os cancros identificados na Publicação N° US 2006/0014949 e os seguintes: cardíaco: sarcoma (e. g., tais como angiosarcoma, fibrossarcoma, rabdomiossarcoma, liposarcoma e semelhantes), mixoma, rabdomioma, fibroma, lipoma e teratoma; pulmão: carcinoma broncogénico (e. g., tais como células escamosas, pequenas células indiferenciadas, grandes células indiferenciadas, adenocarcinoma e semelhantes), carcinoma alveolar (e. g., tal como bronquiolar), adenoma brônquico, sarcoma, linfoma, hamartoma condromatoso, mesotelioma; 18 gastrointestinal: esófago (e. g., tais como carcinoma de células escamosas, adenocarcinoma, leiomiossarcoma, linfoma e semelhantes), estômago (e. g., tais como carcinoma, linfoma, leiomiossarcoma e semelhantes), pâncreas (e. g., tais como adenocarcinoma ductal, insulinoma, glucagonoma, gastrinoma, tumores carcinóides, vipoma e semelhantes), intestino delgado (e. g., tais como adenocarcinoma, linfoma, tumores carcinóides, sarcoma de Karposi, leiomioma, hemangioma, lipoma, neurofibroma, fibroma e semelhantes), intestino grosso (e. g. , tais como adenocarcinoma, adenoma tubular, adenoma viloso, hamartoma, leiomioma e semelhantes); trato geniturinário: rins (e. g., tais como adenocarcinoma, nefroblastoma de tumor de Wilm, linfoma, leucemia e semelhantes), bexiga e uretra (e. g., tais como carcinoma de células escamosas, carcinoma de células transicionais, adenocarcinoma e semelhantes), próstasta (e. g., tais como adenocarcinoma, sarcoma), testículos (e. g., tais como seminoma, teratoma, carcinoma embrional, teratocarcinoma, coriocarcinoma, sarcoma, carcinoma de células insterticiais, fibroma, fibroadenoma, tumores adenomatóides, lipoma e semelhantes); fígado: hepatoma (e. g., carcinoma hepatocelular e semelhantes), colangiocarcinoma, hepatoblastoma, angiosarcoma, adenoma hepatoceleular, hemangioma; osso: sarcoma osteogénico (e semelhantes), fibrossarcoma, condrossarcoma, sarcoma de tais como sarcoma de células cordoma do tumor maligno de g., tais como osteosarcoma e histiocitoma fibroso maligno, Ewing, linfoma maligno (e. g., de retículo), mieloma múltiplo, células gigantes, osteocondroma 19 (e. g., tais como exostoses osteocartilaginosas), condroma benigno, condroblastoma, condromixofibroma, osteoma osteóide e tumores de células gigantes; sistema nervoso: crânio (e. g., tais como osteoma, hemangioma, granuloma, xantoma, osteíte deformante e semelhantes), meninges (e. g., tais como meningioma, meningiosarcoma, gliomatose e semelhantes), cérebro (e. g., tais como astrocitoma, meduloblastoma glioma, ependimoma, germinoma [pinealoma], glioblastoma multiforme, oligodendroglioma, schwannoma, retinoblastoma, tumores congénitos e semelhantes), espinal medula (e. g., tais como neurofibroma, meningioma, glioma, sarcoma e semelhantes); ginecológico: útero (e. g., tais como carcinoma do endométrio e semelhantes), colo uterino (e. g., tais como carcinoma do colo uterino, displasia cervical pré-tumoral e semelhantes) , ovários (e. g., tais como carcinoma do ovário [cistadenocarcinoma seroso, cistadenocarcinoma mucinoso, carcinoma não classificado], tumores das células granulosa-teca, tumores da células Sertoli-Leydig, disgerminoma, teratoma maligno e semelhantes), vulva (e. g., tais como carcinoma de células escamosas, carcinoma intra-epitelial, adenocarcinoma, fibrossarcoma, melanoma e semelhantes), vagina (e. g. , tais como carcinoma de células claras, carcinoma de células escamosas, sarcoma botrióide (rabdomiossarcoma embrionário), trompas de Falópio (carcinoma) e semelhantes); hematológico: sangue (e. g., tais como leucemia mielóide [aguda e crónica], leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crónica, doenças mieloproliferativas, mieloma 20 múltiplo, síndrome mielodisplásica e semelhante), doença de Hodgkin, linfoma não-Hodgkin; pele: melanoma maligno, carcinoma de células basais, carcinoma de células escamosas, sarcoma de Karposi, sinais displásticos nevi, lipoma, angioma, dermatofibroma, quelóides, psoriase e semelhantes; e glândulas supra-renais: neuroblastoma.

Compostos

Um aspecto da presente invenção refere-se um composto de fórmula I:

OH

X ou um seu sal farmaceuticamente aceitável , em que o carbono assinalado com um asterisco poderá apresentar uma configuação (R) ou (S) e em que Ri e R2 são fluoro. Em algumas formas de realização, uma composição farmacêutica ou método de utilização divulgados, podem compreender um composto com uma configuração (R) ou (S), ou uma mistura das configurações (R) e (S).

Em formas de realização adicionais, o composto de fórmula I apresenta a esteroquimica de Ia ou Ib: 21

Em formas de realizaçao adicionais, o composto de fórmula I é o composto 1 ou um seu sal farmaceuticamente aceitável:

OH

OH Composto 1

Em formas de realização adicionais, o composto de fórmula I é seleccionado do grupo consistindo de Compostos la, lb e seus sais farmaceuticamente aceitáveis. OH OH HN^ oVp f 'Oh (IH OH OH Composto 1 a Composto lb 22

Uma vez que os compostos da invenção podem possuir, pelo menos, um centro quiral, poderão existir na forma de enantiómeros, diastereómeros, misturas racémicas, misturas não-racémicas ou outros esterioisómeros. A presente invenção engloba todos os isómeros possíveis, bem como os isómeros geométricos e tautómeros.

Os estereoisómeros podem ser preparados ou isolados através de métodos conhecidos. Por exemplo, diaesterioisómeros podem ser separados através de métodos de separação física, tais como cristalização fracionada e técnicas cromatográficas, e os enantiómeros podem ser separados um do outro, através da cristalização selectiva dos sais diastereoméricos com ácidos e bases opticamente activos ou através de cromatografia quiral. Os esterioisómeros puros podem também ser preparados sinteticamente a partir de materiais de partida estereoquimicamente puros apropriados ou por utilização de reacções estereosselectivas.

Composições Farmacêuticas

Um outro aspecto da presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo: (i) uma quantidade eficaz de um composto da invenção tal como aqui descrito, incluindo mas não limitado a cada forma de realização concreta; e (ii) um excipiente farmaceuticamente aceitável.

Em formas de realização adicionais, a composição farmacêutica compreende ainda uma quantidade eficaz de, pelo 23 menos, um agente terapêutico adicicional, tais como um fármaco de substrato CDA ou agente guimioterapêutico. 0 fármaco de substrato CDA pode ser qualguer fármaco que pode ser desaminado pela CDA. Exemplos não limitativos de um substrato CDA incluem citosina e análogos de citidina, tais como decitabina, 5-azacitidina, gencitabina, ara-C, troxacitabina, tezacitabina, 5'-fluoro-2'-desoxicitidina, citocloro e os compostos divulgados na Publicação US N° 2006/0014949. Em algumas formas de realização, o fármaco de substrato CDA é decitabina. Em outras formas de realização, o fármaco de substrato CDA é 5-azacitidina. Ainda noutras formas de realização, fármaco de substrato CDA é gencitabina. Ainda noutras formas de realização, o fármaco de substrato CDA é ara-C.

Exemplos de um agente quimioterapêutico incluem, sem limitação: agentes alquilantes (e. g., que podem incluir doxorubicina, ciclofosfamida, estramustina, carmustina, mitomicina, bleomicina e semelhantes); antimetabolitos (e. g., que podem incluir 5-Fluoro-Uracilo, capecitabina, gencitabina, nelarabina, fludarabina, metotrexato e semelhantes); agentes de platina (e. g., que podem incluir cisplatina, oxaliplatina, carboplatina e semelhante); inibidores de topoisomerase (e. g., que podem incluir topotecano, irinotecano, etoposida e semelhantes); agentes de tubulina (e. g., que podem incluir paclitaxel, docetaxel, vinorelbina, vinblastina, vincristina, outros taxanos, epotilonas e semelhantes); inibidores de sinalização (e. g., inibidores de cinase, anticorpos, inibidores de farnesiltransferase e semelhantes); e

Outros agentes quimioterapêuticos (e. g, tamoxifeno, agentes anti-mitoticos tais como inibidores de tipo polo-cinase ou inibidores de aurora cinase e semelhantes). A "quantidade eficaz" do composto da invenção pode variar desde 0,1% em peso a cerca de 100% em peso. Em algumas formas de realização, a quantidade eficaz do composto é 0,1 a 20% p/p. Noutras formas de realização, a quantidade eficaz é 1-10% p/p. Ainda em outras formas de realização, a quantidade eficaz é 2-5% p/p.

As composições farmacêuticas da invenção podem ser formuladas para administração em forma liquida ou sólida, incluindo aquelas adaptadas para o seguinte: (1) administração oral, por exemplo, bebidos (por exemplo, soluções aquosas ou não aquosas ou suspensões), comprimidos (por exemplo, aqueles direccionados para absorção bucal, sublingual e sistémica), cápsulas, bolus, pós, grânulos, pastas para aplicação na lingua, cápsulas de gelatina dura, cápsulas de gelatina mole, sprays bucais, trociscos, pastilhas, granulados, xaropes, suspensões, elixires, líquidos, emulsões e microemulsões; (2) administração parentérica, por exemplo, por injecção subcutânea, intramuscular, intravenosa ou epidural como por exemplo, uma 25 solução ou suspensão estéril; (3) aplicação tópica, por exemplo, como creme, pomada, emplastro, almofada ou spray aplicado na pele; (4) via vaginal ou via rectal, por exemplo, como um pessário, creme ou espuma; (5) via sublingual; (6) via ocular; (7) via transdérmica; ou (8) via nasal. As composições farmacêuticas podem ser formuladas para libertação imediata, sustida ou controlada.

Em algumas formas de realização, as composições farmacêuticas são formuladas para administração oral. Em formas de realização adicionais, as composições farmacêuticas são formuladas para administração oral na forma sólida.

As composições farmacêuticas da invenção podem ser preparadas utilizando materiais e técnicas conhecidas, que podem incluir mas não estão limitados à mistura e/ou envolvimento do composto da invenção com o excipiente farmaceuticamente aceitável e agente8s) terapêutico(s) opcional(is). Métodos

Um outro aspecto da presente invenção refere-se a um método para inibição da citidina desaminase, compreendendo a administração a um indivíduo com essa necessidade de quantidade eficaz de um composto ou composição farmacêutica da invenção tal como aqui descrito, incluindo mas não limitada a cada forma de realização concreta.

Em algumas formas de realização, o indivíduo é um mamífero. Em formas de realização adicionais, o indivíduo é humano. 26

Outro aspecto da presente invenção refere-se à utilização dos compostos da presente invenção num método para tratamento de cancro, compreendendo a administração a um indivíduo com essa necessidade: (i) uma quantidade eficaz de um composto ou composição farmacêutica da invenção como aqui descrito, incluindo, mas não limitada a cada forma de realização concreta; e (ii) um fármaco de substrato CDA, mas não limitada a cada forma de realização concreta, aqui descritas.

Em algumas formas de realização, o indivíduo é um mamífero. Em formas de realização adicionais, o indivíduo é um humano.

Em algumas formas de realização, o cancro é seleccionado de cancros hematológicos e cancros sólidos. Em formas de realização adicionais, o cancro hematológico é seleccionado de MDS e leucemia. Em formas de realização adicionais, o cancro sólido é seleccionado de cancro pancreático, cancro do ovário, cancro peritoneal, cancro do pulmão de não pequenas células, e cancro da mama. Ainda em outras formas de realização, a leucemia é leucemia mieloide aguda (LMA) ou leucemia mieloide crónica (LMC).

Um outro aspecto da presente invenção refere-se a um método para inibição da degradação de um fármaco de substrato CDA por citidina desaminase, compreendendo a administração de uma quantidade eficaz de um composto ou composição farmacêutica da invenção como aqui descrito, incluindo mas não limitada a cada forma de realização concreta, a um indivíduo submetido a tratamento com o fármaco de substrato CDA. 0 fármaco de 27 substrato CDA, incluindo, mas não limitada a cada forma de realização concreta, aqui descritas.

Em algumas formas de realização, o indivíduo é um mamífero. Em formas de realização adicionais, o indivíduo é humano. A administração do composto ou composição da invenção pode ser via qualquer método aceite conhecido de um especialista na técnica, por exemplo, via oral, via parentérica, por spray de inalação, via tópica, via rectal, via nasal, via bucal, via vaginal, via intraocular, via intrapulmonar ou via reservatório implantado. 0 termo "via parentérica" inclui sem limitação via subcutânea, via intravenosa, via intramuscular, via intraperitoneal, via intratecal, via intraventricular, via intrastenal, via intracraniana, por injecção intra-óssea e por técnicas de infusão.

Qualquer regime de administração bem conhecido dos especialistas na técnica para regular a temporização e sequência de administração do fármaco pode ser utilizado e repetido conforme necessário para efectuar o tratamento nos métodos da invenção. Por exemplo, o composto ou composição da invenção podem ser administrados 1, 2, 3 ou 4 vezes diariamente, por uma dose única, doses múltiplas discretas ou infusão continua. 0 composto ou composição da invenção pode ser administrado antes, substancialmente ao mesmo tempo, ou após a administração do fármaco de substrato CDA. 0 regime de administração pode incluir pré-tratamento e/ou co-administração de, pelo menos, um agente terapêutico adicional. Em tal caso, o composto ou composição da invenção, o fármaco de substrato CDA e, pelo 28 menos, um agente terapêutico adicional podem ser administrados simultaneamente, separadamente ou sequencialmente.

Exemplos de regimes de administração incluem, sem limitação: administração de cada composto, composição, fármaco de substrato CDA e/ou agente terapêutico, numa forma sequencial, e co-administração de cada composto, composição, fármaco de substrato CDA e/ou agente terapêutico numa forma substancialmente simultânea (e. g., como numa forma de dosagem única) ou em múltiplas formas de dosagem unitárias separadas para cada composto, composição, fármaco de substrato CDA e/ ou agente terapêutico.

Será entendido pelos especialistas na técnica que a "quantidade eficaz" ou "nível de dose" dependa de vários factores, tais como o modo de administração particular, regime de administração, composto e composição seleccionados, e da doença particular e doente a ser tratado. Por exemplo, o nível de dose adequado pode variar dependendo da actividade, taxa de excreção e possível toxicidade do composto específico ou composição empregue, a idade, peso corporal, estado de saúde geral, género e dieta do doente a ser tratado; a frequência de administração; o(s) outro (s) agente(s) terapêutico(s) a ser(em) co-administrado(s) e o tipo e gravidade da doença. A presente invenção contempla níveis de dose da ordem de cerca de 0,001 a cerca de 10000 mg/kg/d. Em algumas formas de realização, o nível de dose é de cerca de 0,1 a cerca de 29 1000 mg/kg/d. Noutras formas de realização, o nível de dose é de cerca de 1 a cerca de 100 mg/kg/d. Ainda em outras formas de realização, o nível de dose é de cerca de 1 a cerca de 50 mg/kg/d. Ainda em outras formas de realização, o nível de dose é de cerca de 1 a cerca de 25 mg/kg/d. Os níveis de dosagem adequados, o modo de administração e o regime de administração podem ser determinados pelos especialistas na técnica utilizando técnicas conhecidas.

Será evidente para os especialistas na técnica que formas de realização específicas da presente invenção podem ser dirigidas para um, alguns ou todos os aspectos acima indicados, bem como outros aspectos, e podem englobar uma, algumas ou todas as formas de realização acima e abaixo indicadas, bem como outras formas de realização.

Excepto nos exemplos de trabalho, ou quando indicado em contrário, todos os números que expressam quantidades de ingredientes, condições de reacção e, assim por diante, utilizadas na descrição e reivindicações devem ser entendidas como sendo modificadas pelo termo "cerca de". Por conseguinte, a menos que indicado em contrário, tais números são aproximações que podem variar dependendo das propriedades desejadas que se procurou obter pela presente invenção. No mínimo, e não como uma tentativa de limitar a aplicação da doutrina de equivalentes ao âmbito das reivindicações, cada parâmetro numérico deve ser interpretado em função do número de dígitos significativos e técnicas de arredondamento comuns.

Enquanto as gamas numéricas e parâmetros que estabelecem o âmbito alargado da invenção são aproximações, os valores numéricos estabelecidos nos exemplos de trabalho são relatados 30 tão precisamente quanto possível. Qualquer valor numérico, no entanto, contém inerentemente determinados erros, necessariamente resultantes do desvio padrão encontrado nas respectivas medições de testes.

EXEMPLOS

Os exemplos seguintes são ilustrativos da presente invenção e não se destinam a ser suas limitações. Síntese dos Compostos 0 composto da invenção pode ser preparado como aqui descrito e/ou pela aplicação ou adaptação de métodos conhecidos. Será entendido pelos especialistas na técnica que um ou mais dos reagentes, etapas e/ou condições descritas nos esquemas reaccionais possam exigir o ajustamento para acomodar outros grupos substituintes em R2 e R2. 31

Exemplo 1:

Esquema 1. Sintese de derivados de difluorotetra— hidrouridina (Compostos la e lb)

r«? H0 Hô F 24

Nh2 1) H^Rh/Alumina (24h) \ (slH 3 eq NaBH4 2) Hj/Rh/Alumina (72h) Q ΜθΟΗ 61% rvV° Hô 0 °C—>rt, 4h 25

26(17%) 1b (31%) 1a (29%) 2'2'-DiFluoro-Di-Hidro-Uridina (DFDHU, 25). Gencitabina 24 (3,0 g, 11,4 mmol) é dissolvida em H2O (50 mL). Ródio em alumina (900 mg) é adicionado à solução e a mistura é hidrogenada de um dia para o outro, a 40 psi. No dia seguinte, a mistura é filtrada, a água é removida in vacuo e o sólido pegajoso resultante é novamente dissolvido em H20. Ródio em alumina é adicionado à solução (900 mg) e o material é hidrogenado, de um dia para o outro, a 40 psi. 0 ródio é filtrado e o filtrado resultante é concentrado para obter uma mistura bruta de difluorodi-hidrouridina (5, DFDHU) e -10% de difluorotetra-hidrouridina la e lb (DFTHU) . A mistura bruta é purificada em HPLC de fase reversa (fase reversa Cis a 5% CH3CN/H2O) para obter 32 1,84 g (61%, 14,5 minutos) de DFDHU 25 e 175 mg (17%, la, 9,5 minutos e lb, 13,9 minutos) dos epimeros de DFTHU. A configuração absoluta de C-4 para o composto la é determinada por difração de Raios-X de cristal único e é consistente com precedentes na literatura na estrutura cristalina da citidina desaminase complexada com um único epimero de tetra-hidrouridina. RMN de ΤΗ de 5: 6,00 (dd, 1H), 4,20 (q, 1H), 3,92-3,72 (m, 3H), 3,64 (m, 1H), 3,43 (m, 1H), 2,68 (t, 2H). 2'2'-DiFluoro-Tetra-hidrouridina (DFTHU, la e lb) . DFDHU 25 (1,2 g, 4,9 mmol) é dissolvido em 30 mL de MeOH e arrefecido a 0 °C. Boro-hidreto de sódio (540 mg, 14,6 mmol) é adicionado em porções à solução e a reacção é lentamente aquecida até à temperatura ambiente. Após 4 horas de agitação à temperatura ambiente (t.a.), o MeOH é removido in vacuo e o resíduo é dissolvido em 15 mL de H20. A solução é neutralizada com 2,0 N HC1 até pH 7. A solução é então purificada via prep HPLC (fase reversa Cig a 5% CH3CN/H2O) . Os sais aparecem aos 5,2 minutos. Um pico é evidente aos 7,5 minutos (12%). Um epimero do DFTHU la aparece aos 9,5 minutos (350, 29%). O outro epimero lb aparece aos 14,3 minutos (370 mg, 31%). O produto desoxigenado 26 elui aos 17 minutos (200 mg, 17%). la RMN de ΤΗ (D20, 9,5 minutos) : 6, 03 (dd, 1H) , 5, 04 (bs 1H) , 4,20 (q, 1H) , 3,90-3,71 (m, 3H) , 3,53 (dt, 1H) , 3,30 (dt 1H) , 1,92-1,75 (m, 2H) . Anal . Calcd. para C 9H14N205F 2 (0, 15 H20) c, 39,90; H, 5 ,32; N, 10,34. Encontrados: C, 39,87; H, 5,41; N O \—1 26 . lb RMN de ΧΗ (D20, 14,3 minutos) : 5, 97 (dd, 1H) , 5, 03 (bt 1H) , 4,16 (q, 1H) , 3,91-3,68 (m, 3H) , 3,41 (dt, 1H) , 3,20 (dt 1H), 1,95-1, 80 (m, 2H) . Anal Calcd. Para C9H14N2O5F2 (0,60 H20) : C, 33 38,74; H, 5,49; N, 10, 04. Encontrados: C, 38,55 ; H, 5, 36; N, 9,87. 26 RMN de ΤΗ (D20) δ 5,99 (dd, J = 15 Hz, 6 Hz, 1H) , 4,17 (m, 1H) , 3,89 (m, 1H) , 3,75 (m, 2H), 3,42 (m, 1H), 3, 21 (t, J = 6 Hz, 2H), 3,18 (m, 1H) , 1,86 (m, 2H) .

Exemplo 2:

Actividade enzimática CDA A capacidade dos compostos da invenção para inibir a actividade enzimática da CDA pode ser demonstrada utilizando o método de ensaio seguinte. 0 procedimento para determinar a actividade enzimática de CDA é baseado em metodologias publicadas (por exemplo, Cacciamani, T. et al. , Arch. Biochem. Biophys. 1991, 290, 285-92; Cohen R. et al., J. Biol. Chem., 1971, 246, 7566-8;

Vincenzetti S. et al. , Protein Expr. Purif. 1996, 8, 247-53) . 0 ensaio segue a alteração da absorvância a 286 nm da desaminação da citidina, catalisada pela CDA, para formar uridina. A reacção é realizada num tampão de fosfato de potássio (pH 7,4, 20 mM, contendo 1 mM DTT) num volume total de 200 pL em formato de placa de 96 poços. A mistura de reacção final contém citidina (50 μΜ) e CDA recombinante purificada humana. A enzima purificada é diluída de modo a provocar uma variação de absorvância de aproximadamente 2 mili-unidades de absorvância/minuto. As medidas de linha de base de variação de absorvância ao longo do tempo são feitas antes da adição de CDA para assegurar uma não variação de absorvância na ausência de CDA. Após a adição de CDA, a variação de absorvância é monitorizada durante 20-30 minutos. Quando estão presentes 34

potenciais inibidores, são testadas oito concentrações de cada na gama 0,1 nM - 1 mM, de forma a obter valores de IC50. O declive da variação de absorvância ao longo do tempo para as amostras que contêm citidina e CDA, mas sem inibidores (totais) é normalizado para 100%. A actividade enzimática de CDA deixada na presença de um composto expresso como percentagem de actividade total é subtraída de 100% a fim de obter a percentagem de inibição a diferentes concentrações de composto.

Utilizando o ensaio acima descrito, a potência inibidora dos Compostos 1 é avaliada. Os valores IC50 dos compostos são definidos na Tabela 1. "la" e "lb" denotam esterioisómeros individuais; "1" denota uma mistura epimérica.

Tabela 1. Potência Inibidora dos Compostos em Estudo

Composto IC50 (nM) la 400 ± 60 lb 5000 ± 1000 1 400 ± 60

Melhoria da Eficácia de Fármacos de Substrato CDA A capacidade dos compostos da invenção para melhorar a eficácia de fármacos de substrato CDA pode ser demonstrada no modelo L1210 de linfoma em ratinho. 35

Exemplo 3:

Efeito do inibidor CDA, Composto 1, na sobrevivência induzida por decitabina (0,1 mg/kg), nos métodos do modelo L1210 de sobrevivência. 30 ratinhos CD2F1 fêmea com 6-7 semanas, são separados aleatoriamente em 6 grupos:

Grupo N2 1 L1210 i.v e Veículo + Veículo p.o. x 2, durante 4 dias 2 L1210 i.v. e Veículo + Composto 1 10 mg/kg p.o. x 2, durante 4 dias 3 L1210 i.v. e Veículo +0,1 mg/kg decitabina p.o. x 2, durante 4 dias 4 L1210 i.v. e Composto 1 1 mg/kg + 0,1 mg/kg decitabina p.o. x 2, durante 4 dias 5 L1210 i.v. e Composto 1 lOmg/kg + 0,1 mg/kg decitabina p.o. x 2, durante 4 dias 6 L1210 i.v. e Veículo + 0,1 mg/kg decitabina i.p. x 2, durante 4 dias

Injecção Intravenosa (i.v) L1210: Antes da experiência, as células L1210 são passadas, pelo menos, 3 vezes em ratinhos fêmea CD2F1. Os ratinhos são injectados intraperitonealmente (i.p.) com células asciticas L1210, uma semana antes do sacrifício, utilizando CO2. Cada ratinho é colocado de costas, a superfície da barriga é limpa com toalhetes com álcool e é feita uma pequena incisão na sua cavidade peritoneal. 2 mL de 2,1% 36 albumina de soro bovino (BSA) gelada, em solução salina são injectados na cavidade. 0 fluido é retirado da cavidade, transferido com uma seringa 18 G de 3 cc para um tubo estéril limpo e mantido em gelo. 0 fluido é diluído 1:10 em 2,1% BSA em solução salina e é adicionada uma gota de zap-O-globin a 2 mL de células asciticas diluídas. As células asciticas diluídas (diluídas novamente 1:10) são contadas num hematocitómero e o número de células/mL é calculado. Um stock de células asciticas em solução BSA é diluída a lxlO4 células/0,1 mL. Os ratinhos são injectados com 0,1 mL de solução celular com uma agulha 27 G. Preparação da Solução de Dose: Quando apropriado, os ratinhos são doseados com um veículo ou Composto 1 p.o 30 minutos antes da decitabina. O composto 1 é preparado a 1 mg/mL em tampão de fosfato salino (PBS) e então diluido a 0,1 mg/mL em PBS para a dose menor. A decitabina é preparada com um stock 1 mg/mL em PBS e diluída adequadamente para obter uma solução de dosagem de 0,01 e 0,02 mg/mL.

Esquema de Dosagem: A decitabina é preparada em fresco duas vezes ao dia. Todas as soluções de dose são armazenadas em gelo durante a dosagem. Os ratinhos são doseados i.p. ou oralmente (p.o.) duas vezes ao dia (intervalo de 8 horas) durante 4 dias consecutivos. O esquema de dosagem final e as doses totais de decitabina e Composto 1 são delineados na Tabela 2. 37

Tabela 2. Esquema de Dosagem

Grupo N° Fármaco Dose deDecitabina (via administrada) Dose de Decitabina acumulada Dose deComposto 1 Dose de Composto 1 acumulada 1 Veiculo Veiculo 0 mg/kg Veiculo 0 mg/kg 2 Composto 1 Veiculo 0 mg/kg 10 mg/kg 80 mg/kg 3 Decitabina 0,1 mg/kg p. o. 0,8 mg/kg Veículo 0 mg/kg 4 Decitabina/ Composto 1 0,1 mg/kg p. o. 0,8 mg/kg 1 mg/kg 40 mg/kg 5 Decitabina/ Composto 1 0,1 mg/kg p. o. 0,8 mg/kg 10 mg/kg 80 mg/kg 6 Decitabina 0,1 mg/kg i.p. 0,8 mg/kg Veículo 0 mg/kg

Sobrevivência e Autópsia: Os ratinhos são observados para sobrevivência e pesados diariamente (Segunda a Sexta) durante a duração do estudo (30 dias). Os ratinhos mortos são autopsiados e observados para detectar a presença de tumores nos orgãos. As mortes por tumor são determinadas por pesos de figado superiores a 1,6 g e pesos de baços superiores a 150 mg, como por Covey et ai., Eur. J. Câncer Oncol. 1985.

Os ratinhos doseados com decitabina ou decitabina e Composto 1 vivem mais que os ratinhos doseados com veiculo de controlo ou apenas Composto 1 (FIG. 1 e Tabela 3; p<0,05) . Uma tendência para uma resposta de dose é observada com o Composto 1 combinado com decitabina. 38 A decitabina (0,1 mg/kg) p.o. é menos eficaz que decitabina 0,1 mg/kg i.p., mas não significativamente diferente (Tabela 3; FIG. 1, p=0, 052) .

Co-administração do Composto 1 10 mg/kg com decitabina 0,1 mg/kg p.o. aumenta significativamente a sobrevivência comparada com decitabina 0,1 mg/kg p.o. isolada (p=0.0031) e decitabina 0,1 mg/kg i.p. (p=0,016; Tabela 3, FIG. 1). Co-administração do composto 1, 1 mg/kg com decitabina 0,1 mg/kg p.o. aumenta significativamente a sobrevivência comparado com decitabina 0,1 mg/kg p.o. isolada (p=0,0031), mas não comparado com decitabina 0,1 mg/kg i.p. (p=0,13; Tabela 3, FIG. 1). A Tabela 3 lista a sobrevivência média de cada grupo de tratamento e a percentagem ILS (aumento da esperança de vida) comparado com o grupo de veiculo. Todos os grupos tratados vivem significativamente mais que os controlos de veiculo e os grupos de inibidor de CDA isolado (p<0,05). A Tabela 3 lista os pesos dos figados e baços de ratinhos na autópsia. Todos os ratinhos excepto o ratinho de decitabina 0,1 mg/kg i.p. morreram devido a "carga tumoral", como indicado pelos pesos de figado maiores que 1 g e os pesos dos baços superiores a 80 mg (Covey et ai., supra). Os pesos dos figados e baços de 3 ratinhos de controlo são de 0,97±0,08 g e 0,08±0,02 g. Observações grosseiras são anotadas relativamente a aparência global das cavidades peritoneal e torácica. 39

Tabela 3. Efeito de Decitabina e Composto 1 na Sobrevivência e Pesos de Figados e Baços no Modelo de Sobrevivência IV L1210

Grupo N° Células L1210 Sobrevivência média (dias) ± DP * % de ILS (Aumento Esperança vida) Peso médio figado (g) ± DP Peso médio baço (g) í DP 1 lxl O4 7,40±0,55 n/a 1,8110,13 0,3110,05 2 lxl O4 7,40±0,55 0,00 1,99±0,22 0,39+0,07 3 lxl O4 10,6±0,56 43,24 2,05±0,17 0,33+0,06 4 lxl O4 12,8±0,45 72,97 2,03±0,08 0,29±0,03 5 lxl O4 14,2±0,45 91,89 2,0210,27 0,29±0,07 % de ILS = Sobrevivência média da experiência (dias)-Sobrevivência nédia do controlo (dias) X 100

Sobrevivência nédia do controlo (dias) FIG. 1 é um gráfico que mostra o efeito do Composto 1 na sobrevivência induzida por decitabina (DAC) no modelo L1210de linfoma de ratinho.

Exemplo 4:

Efeito do inibidor de CDA, Composto la, na sobrevivência induzida por decitabina (0,1 mg/kg), no modelo L1210 de sobrevivência O composto la é avaliado no modelo L1210, seguindo o protocolo do Exemplo 3. Os ratinhos doseados com decitabina 40 ("DAC") e DAC e composto la, vivem mais tempo do que aqueles que receberam o veículo de controlo e inibidor CDA isolado (FIG. 2, p <0,05) . Em combinação com CAD, o Composto la 10 mg/kg é mais eficaz em prolongar a sobrevivência do que as doses mais baixas.

Exemplo 5:

Efeito de inibidor de CDA, Composto I, na sobrevivência induzida por citarabina (ara-C) no modelo de sobrevivência L1210 50 ratinhos CD2F1 fêmea com 6-7 semanas, são separados aleatoriamente em 10 grupos. (N = 5 ratinhos/grupo):

Grupo N2 1 L1210 i.v. e Veí. + Veí. (PBS) p.o. x 2, durante 4 dias 2 L1210 i.v. e Veí. + Ara-C 200 mg/kg p.o. x 2, durante 4 dias 3 L1210 i.v. e Veí. + Ara-C 100 mg/kg p.o. x 2, durante 4 dias 4 L1210 i.v. e Veí. + Ara-C 50 mg/kg p.o. x 2, durante 4 dias 5 L1210 i.v. e Veí. + Ara-C 25 mg/kg p.o x 2, durante 4 dias 6 L1210 i.v. e Composto 1, 10 mg/kg + Ara-C 200mg/kg x 2, durante 4 dias 41 (continuação)

Grupo N2 7 L1210 i.v. e Composto 1, 10 mg/kg + Ara-C lOOmg/kg x 2, durante 4 dias 8 L1210 i.v. e Composto 1, 10 mg/kg + Ara-C 50 mg/kg x 2, durante 4 dias 9 L1210 i.v. e Composto 1, 10 mg/kg + Ara-C 25mg/kg x 2, durante 4 dias 10 L1210 i.v. e Composto 1, 10 mg/kg + Veí. p.o. x 2, durante 4 dias

Injecção IV L1210: os ratinhos CD2F1 fêmea são injectados i.p. com células asciticas L1210, uma semana antes do sacrifício (C02). As células L1210 são passadas, pelo menos, 3 vezes in vivo antes da experiência. 0 ratinho é colocado de costas, a superfície da barriga é limpa com toalhetes com álcool e é feita uma pequena incisão na cavidade peritoneal. 2 mL de 2,1% BSA gelado em solução salina são injectados na cavidade e então o fluido é retirado e transferido com uma seringa 18 G 3 cc para um tubo estéril limpo, e mantido em gelo. 0 fluido é diluido 1:10 com 2,1% BSA em solução salina e uma gota de zap-O-globin é adicionada a 2 mL de células asciticas diluídas. As células asciticas diluídas (diluídas novamente 1:10) são contadas num hematocitómero e o número de células/mL é calculado. O stock de células asciticas em solução BSA é diluído a lxlO4 células/0,1 mL. Os ratinhos são injectados com 0,1 mL de solução de células com uma seringa 27 G. O total de injecções i.v. demora cerca de 50 minutos. 42

Preparação da Solução de Dose: Quando apropriado, os ratinhos são doseados com veiculo ou Composto 1 p.o. 30 minutos antes de Ara-C. O Composto 1 é preparado a 1 mg/mL em PBS e Ara-C é preparado num stock de 20 mg/mL em PBS e então adequadamente diluidas para doses mais baixas.

Esquema de Dosagem: O composto 1 é preparado no inicio do estudo e armazenado a 4 °C. Ara-C é preparado em fresco duas vezes ao dia. Todas as soluções são armazenadas em gelo, durante a dosagem. Os ratinhos são doseados oralmente duas vezes ao dia (intervalo de 8 horas) durante 4 dias consecutivos. 0 esquema final de dosagem e dose total de Ara-C e Composto 1 são delineados na Tabela 4.

Tabela 4. Esquema Dosagem

Grupo N° Fármaco Dose Ara-C (via adm.) Dose cumulativa de Ara-C Dose de Composto 1 Dose cumulativa de Composto 1 1 Veí. Veí. 0 mg/kg Veí. 0 mg/kg 2 Composto 1 Veí . 0 mg/kg 10 mg/kg 40 mg/kg 3 Ara-C 200mg/kg 800 mg/kg Veí. 0 mg/kg 4 Ara-C 100 mg/kg p.o. 400 mg/kg Veí. 0 mg/kg 5 Ara-C 50 mg/kg p.o. 200 mg/kg Veí. 0 mg/kg 43 (continuação)

Grupo N° Fármaco Dose Ara-C (via adm.) Dose cumulativa de Ara-C Dose de Composto 1 Dose cumulativa de Composto 1 6 Ara-C 25 mg/kg p.o. 100 mg/kg Vei. 0 mg/kg 7 Ara-C 200 mg/kg p.o. 800 mg/kg 10 mg/kg 40 mg/kg 8 Ara-C lOOmg/kg p.o. 400 mg/kg 10 mg/kg 40 mg/kg 9 Ara-C 50 mg/kg p.o. 200 mg/kg 10 mg/kg 40 mg/kg 10 Ara-C 25 mg/kg p.o. 100 mg/kg 10 mg/kg 40 mg/kg

Sobrevivência e Autópsia: Os ratinhos são observados para sobrevivência e pesados diariamente (Seg-Sex) durante a duração do estudo (45 dias). Os ratinhos mortos são autopsiados e observados para detectar a presença de tumores nos orgãos. As mortes por tumor são determinadas por pesos de figado superiores a 1,6 g e pesos de baços superiores a 150 mg, como por Covey et a 1. , supra .

Os ratinhos doseados com apenas Ara-C (50 mg/kg, 100 mg/kg e 200 mg/kg) e Ara-C e Composto 1 vivem mais que os ratinhos tratados com veiculo de controlo e inibidor de CDA isolado (FIGS 4-7; p<0,05) . O composto 1 por si não tem efeito na sobrevivência comparado com controlos de veiculo (FIG. 4).

Ara-C 25 mg/kg, isolado, não tem efeito na extensão de sobrevivência comparado com ratinhos tratados com veiculo e 44

Composto 1, 10 mg/kg. Ara-C 50, 100 e 200 mg/kg melhora significativamente a sobrevivência (dias), de uma forma dependente da dose comparado com ratinhos no grupo de controlo. Co-administração de Composto 1, 10 mg/kg com Ara-C p.o. aumenta significativamente a sobrevivência comparado com o tempo de sobrevivência de ratinhos tratados com a mesma dose de Ara-C, isolado (FIGS 4-7).

Exemplo 6:

Efeito do Composto 1 na redução do volume de tumor induzida por gencitabina no modelo de xenotransplante de cancro do ovário humano, em ratinho A2780 A eficácia oral da gencitabina é testada em combinação com o Composto 1 no xenotransplante de cancro do ovário humano A2780. Ratinhos NCr nu/nu fêmea com 5-6 semanas são implantados subcutaneamente com 30 a 60 mg de fragmentos de tumor. No dia 11 quando os tumores são de aproximadamente 200 mm3, o tratamento inicia-se como descrito na Tabela 5.

Tabela 5. Esquema de Dosagem

Grupos Tratamento Calendarização Gencitabina Calendarização Composto 1 1 Veículo (solução salina) PO; q3dx4 2 Composto 1 PO 10 mg/kg q3dx4 3 Gencitabina PO 10 mg/kg; 45 (continuação)

Grupos Tratamento Calendarização Gencitabina Calendarização Composto 1 q3dx4 4 Gencitabina/Composto 1* PO 10 mg/kg; q3dx4 PO 10 mg/kg q3dx4 5 Gencitabina PO 30 mg/kg; q3dx4 6 Gencitabina/Composto 1* PO 30 mg/kg; q3dx4 PO 10 mg/kg q3dx4 • Composto 1 é doseado aproximadamente 30 min antes da Gencitabina 0 volume detumor é seguido ao longo da experiência. 0 volume de tumor é medido três vezes por semana. A carga tumoral (mg=mm3) é calculada a partir de medidas de paquímetro pela fórmula para o volume de um prolato elipsóide (CxL2) /2 onde C e L são os respectivos comprimento ortogonal e medidas de largura (mm) .

Os objectivos primários utilizados para avaliar a eficácia com modelo A2780 são a completa e parcial regressão do tumor, atraso do crescimento do tumor e o número de sobreviventes sem tumor no final do estudo. Uma resposta completa (RC) é definida como uma diminuição do tamanho de tumor até um tamanho indetectável (<50mm3) . Uma resposta parcial (RP) é definida como uma diminuição >50% na massa do tumor, partindo do tamanho do tumor inicial. Um tumor que atinja uma RC ou RP durante o estudo, mas inicia novamente o crescimento é igualmente considerado RC ou RP. Sobrevivência sem tumor (SST) no fim do 46 estudo seria a existência de tumor não detectáveis (<50 mm3) no término do estudo (dia 74). Atraso no crescimento do tumor (ACT) é definido nesta experiência como o número médio de dias para o grupo de tratamento comparado com o grupo de controlo para atingir 750 mm3. A administração oral de gencitabina 10 mg/kg PO q3dx4 não é muito eficaz neste modelo com um atraso de crescimento de tumor de 6,1 dias (estatisticamente não significativo), sem RCs, RPs ou sobreviventes sem tumor no término da experiência no dia 74. Quando a Gencitabina 10 mg/kg é doseada em combinação com o Composto 1, um significativo atraso no crescimento tumoral é observado comparado com esta dose de gencitabina isolada (19,2 dias; p<0,05 comparado com Gen. isolada) com 75% dos tumores exibindo RC, mas não existindo SST no final da experiência. Na FIG. 8 (volume de Tumor vs tempo (dias) após inicio do tratamento, é evidente que o Composto 1 isolado não tem efeito no crescimento do tumor, enquanto o tratamento de combinação com composto 1 e gencitabina é mais eficaz que a gencitabina isolada. A administração oral de gencitabina 30 mg/kg PO q3dx4 (MTD) é eficaz na obtenção de um atraso estatisticamente significativo do crescimento tumoral de 22 dias com 63% RCs mas sem SST. A combinação de quimioterapia com gencitabina (30 mg/kg PO) e Composto 1 obteve um atraso estatisticamente significativo do crescimento tumoral > 57 dias e 100% RC e 50% incidência de SST no dia 74, término da experiência.

Tabela 6. Efeito do tratamento de Combinação de Gencitabina e Composto 1 no atraso de Crescimento Tumoral, no modelo A2780, de cancro do ovário

Tratamento ACT Valor P Controlo não tratado NA 10 mg/kg Composto 1 0,4 dias 10 mg/kg Gencitabina 6,1 dias 10 mg/kg Gencitabina 19,2 <0,05 comparado com 10 mg/kg + Composto 1 dias Gem isolada 30 mg/kg Gencitabina 22 dias <0,05 comparado com controlo não tratado 30 mg/kg Gencitabina + > 57 <0,05 comparado com 30 mg/kg Composto 1 dias Gem isolado

Exemplo 7:

Caracterização de estado sólido do Composto la

Recolha de dados

Um cristal prismático incolor do Composto la (F2O5N2C9H14) com as dimensões aproximadas de 0,48 x 0,43 x 0,32 mm é montado numa ansa. Todas as medições são efectudadas num detector de área de placa de imagem Rigaku RAXIS SPIDER com radiação Cu-Ka, de grafite monocromada. 48 A indexação é realizada a partir de 5 oscilações que são expostas por 60 segundos. A distância cristal-detector é 127,40 mm.

As constantes de célula e uma matriz de orientação para recolha de dados correspondem a uma célula trigonal primitiva (classe Laue: -3 mL) com dimensões:

a = 9,78961(18) A

c = 20,4588(7) A V = 1698,02(7) A3

Para Z = 6 e F.W. = 268,22, a densidade calculada é 1,574 g/cm3. Baseada nas ausências sistemáticas de: 0001: 1 ± 3 n e a bem sucedida solução e afinação da estrutura, o grupo espacial é determinado como: P3i21 (N° 152)

Os dados são recolhidos a uma temperatura de -123 ± 1 °C para um valor máximo 2Θ de 136,4°. Um total de 111 imagens de oscilação é recolhido. Um varrimento de dados é efectuado utilizando varrimentos ω desde 20,0 a 200,0° em passos de 5,0°, em χ=0,0° e φ = 180,0°. Um segundo varrimento é realizado desde 20,0 a 200,0° em passos de 5,0°, em x=54,0°e φ = 180,0°. Um terceiro varrimento é realizado desde 20,0 a 185,0° em passos de 5,0°, em χ=54,0° e φ = 90,0°, e um varrimento final é efectuado utilizando varrimentos ω desde 20,0 a 50,0° em passos de 5,0°, em χ=0,0° e φ = 0,0°. A taxa de exposição é 12,0 [s./°] . A 49 distância cristal-detector é 127,40 mm. A leitura é realizada no modo de pixel de 0,100 mm.

Redução do Dados

Das 11772 reflexões recolhidas, 2052 são únicas (R±nt = 0,038); Reflexões equivalentes são agrupadas.

O coeficiente de absorção linear, μ, para radiação Cu-Kcx é 13,035 cm-1. Uma correcção empírica da absorção é aplicada o que resulta em factores de transmissão variando desde 0,540 a 0,659. Os dados são corrigidos para efeitos de polarização e Lorentz. Uma correcção para extinção secundária (Larson, A.C., Crystallographic Computing 1970, 291-294; equação 22, com V substituído pelo volume da célula) é aplicada (coeficiente = 0,005900).

Solução Estrutural e Refinamento A estrutura é resolvida por métodos directos (SIR92: Larson, A.C., J. Appl. Cryst., 1994, 27, 435) e expandida utilizando técnicas de Fourier (DIRDIF99: Beurskens, P.T. et al., The DIRD-99 Program System. Technical Report of the Crystallography Laboratory, 1999, University of Nijinegen, The Paises Baixos). Os átomos de não-hidrogénio são refinados anisotropicamente. Alguns átomos de hidrogénio são refinados isotropicamente e os restantes são refinados utilizando o modelo riding. O ciclo final de refinamento dos mínimos quadrados da matriz completa (pesos mínimos quadrados = Ew (FQ2-FC2)2) em F2 é baseada em 2052 reflexões observadas e 181 parâmetros variáveis 50 e converge (maior desvio de parâmetro é <0,01 vezes o seu DPE) com factores de acordo ponderados e não ponderados de: RI = Σ ||Fo| - |Fc|| / Σ |Fol = 0.0303 wR2 = [ Σ ( w (Fo2 - Fc2)2 y Σ w(Fo2)2]l/2 = 0.0733 O desvio padrão de uma observação de peso unitário (desvio padrão = [Ew(F02-Fc2)2/(N0-Nv) ]1/2, Nc = número de observações,

Nv = número de variáveis) é 1,10. São utilizados os pesos unitários. Os picos máximo e mínimo no mapa de Fourier de diferenças finais correspondem a 0,22 e -0,22 e”/Â3, respectivamente. A estrutura absoluta é deduzida baseada no parâmetro de Flack, 0,0(1), refinada utilizando 839 pares de Friedel (Flack, H. D., Acta Cryst. 1983, A39, 876-881.

Factores de dispersão de átomos neutros são retirados de Cromer, D. T. et al., International Tables for X-ray Crystallography 1974, IV, Tabela 2.2 A. Efeitos de dispersão anómalos são incluídos em Fcalc (Ibers, J. A. et al., Acta Crystallogr. 1964, 17, 781); Os valores para Af' e Af" são os de

Creagh, D. C. et al., International Tables for Crystalloghraphy 1992, C, Tabela 4.2.6.8, 219-222. Os valores para os coeficientes de atenuação de massa são os de Creagh, D. C. et ai.., International Tables for Crystalloghraphy 1992, C, Tabela 4.2.4.3, 200-206. Todos os cálculos são realizados utilizando o pacote de software cristalográfico CrystalStructure 3.8, excepto para o refinamento, que é realizado utilizando SHELXL-9 7. 51

Detalhes Experimentais A. Dados do Cristal Fórmula Empírica

Peso da fórmula

Cor do cristal, tendência

Dimensões do cristal

Sistema Cristalino

Tipo de malha

Imagens de indexação

Posição do detector

Dimensão de Pixel

Parâmetros da malha

Grupo Espacial Valor Z

Dcalc F 000 μ(CuKa) F 2O5N2C9H14 268,22 incolor, prisma 0,48 X 0,43 X 0,32 mm trigonal Primitiva 5 oscilações @ 60,0 segundos 127,40 mm 0,100 mm a = 9,78961(18! 0 ) A c = 20,4588(7) 0 A V = 1698,02(7) 0 G A3 P3i21 (N° 152) 6 1,574 g/ cm3 840,00 13,035 cirT1 52 B. Medições de Intensidade

Difractómetro Rigaku RAXIS-SPIDER Radiação Cuba (λ = 1,54187 À) grafite monocromada Abertura do detector 460 mm x 256 mm Imagens dos Dados 111 exposições Gama de Oscilação ω (χ=0,0, φ= 18 0 ,0) 20,0 - 200,0° Gama de Oscilação ω (χ=54,0, φ= 18 0 ,0) 20,0 - 200,0° Gama de Oscilação ω (χ=54,0, φ= 9 0,0) 20,0 - 185,0° Gama de Oscilação ω Ο Ο II -θ- ο ο II X 20,0 - 50,0° Taxa de Exposição 12,0 s./° Posição do detector 12,40 mm Dimensão de Pixel 0,100 mm 2 0j4ax 136,4° N°. de Reflexões medidas Total: 11772 Único: 2052 (Rint = 0,038) Pares de Friedel: 839 Correcções Polarização de Lorentz Absorção (trans. factores: 0,540 -0,659) Extinção Secundária (coeficiente: 5,90000e-003) 53 C. Solução Estrutural e Refinamento

Solução Estrutural Refinamento

Função Minimizada Pesos mínimos quadrados

Limite 2 0Max

Dispersão anómala N° de Observações(Todas reflexões) N° de Variáveis

Razão Reflexão/Parâmetro

Residuais: Ri (I>2.00o(I))

Residuais: R (Todas reflexões)

Residuais: wR2 (Todas as reflexões)

Fiabilidade do indicador de ajuste

Parâmetro de Flack (pares de Friedel = 839)

Desvio máximo/Erro no Ciclo Final Pico Máximo no Mapa Final Dif. Pico Mínimo no Mapa Final Dif Métodos Directos (SIR92) Mínimos quadrados da matriz completa em F2

Tw (Fo2 - Fc2)2 w = 1/ [ o2 (Fo2) + (0,0317 · P)2 + 0,6904 · P] onde P = (Max(Fo2,0) + 2Fc2)/3 136,40

Todos os átomos não-hidrogénio 2052 181 11,34 0,0303 0,0329 0. 0733 1, 099 0,0(1) <0,001 0,22 e-/Â3 -0,22 e-/Â3 54

Um gráfico ORTEP (Michael N. Burnett e Carroll K. Johnson, ORTEP-III: Oak Ridge Thermal Ellipsoid Plot Program for crystal structure Illustrations, Oak Ridge National Laboratory Report ORNL-6895, 1996) da estrutura determinada do Composto la é apresentada na FIG. 9.

Exemplo 8:

Aumento da estabilidade ácida do Composto la comparado com

THU

As estabilidades do Composto la e tetra-hidrouridina (THU) em solução ácida são avaliadas por espectroscopia de RMN de 1H.

THU tfa/d2o

TH-piranose

Composto la TFA/D20

Tetra-hidrouridina (THU, 5 mg) é dissolvida em D2O (0,75 mL) . O espectro de RMN de ΤΗ (D20, 300 MHz, 27° C) é apresentado na FIG. 10. A esta mesma amostra é adicionada uma gota de TFA deuterado seguido por um espectro de RMN de ΤΗ 55 imediato (FIG. 10). Mesmo a este ponto de tempo inicial, o pico a 5,4 ppm (-10% conversão por integração) é indicativo da expansão do anel para a TH-piranose. Ao longo de várias horas, os espectros (D20, 300 MHz, 21° C) são registados como apresentado na FIG. 11. Após 4 horas, a TH-piranose é mais prevalente indicando cerca de 60% de conversão. Às 72 horas, a conversão está quase inteiramente completa (>80%). Alterações assinaláveis na região de 4,0-4,5 são também indicativas da decomposição de THU e da formação de TH-piranose.

Composto la (5 mg) é dissolvido em D20 (0,75 mL). O espectro de RMN de ΤΗ (D20, 300 MHz, 27° C) é apresentado na FIG. 12. A esta mesma amostra é adicionada uma gota de TFA deuterado seguido por um espectro de RMN de imediato (FIG. 12) . Após o ponto de tempo inicial, a única alteração assinalável é a epimerização do aminal que é demonstrado pelos picos extra a 5,92 e 5,93. Após 4 horas e 72 horas (FIG. 13), não existem mais alterações assinaláveis nos espectros (D20, 300 MHz, 27° C) .

Estes resultados indicam que não ocorre formação de piranose com o Composto la nestas condições.

Enquanto a presente invenção tem sido descrita com referência às suas formas de realização especificas, deverá ser entendido pelos especialistas na técnica que várias alterações podem ser efectudadas e equivalentes podem ser substituídos sem desvio do âmbito da invenção. Além disso, várias modificações podem ser efectuadas para adaptação a uma situação particular, material, composição de matéria, processo, passo ou passos de processo, para o âmbito da presente invenção. Todas estas modificações destinam-se a estar dentro do âmbito das reivindicações aqui anexas.

Lisboa, 18 de Maio de 2012 56

Claims (21)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Composto de fórmula I ou um seu sal f armaceuticamente aceitável: OH

   I em que o carbono assinalado com um asterisco poderá ter configuração (R) ou (S); e em que Ri e R2 são fluoro. que o composto é ou um seu sal Composto da reivindicação 1, em representado pelo Composto la farmaceuticamente aceitável: OH

   Composto da reivindicação 1, representado pelo Composto la: em que composto 1

   OH Composto la. Composição farmacêutica para inibição da actividade da enzima CDA, consistindo essencialmente num composto de fórmula I ou um seu sal farmacuticamente aceitável: OH

   OH I em que o carbono assinalado com um asterisco poderá apresentar configuração (R) ou (S); e em que Ri and R2 são fluoro; e um excipiente farmaceuticamente aceitável. Composição farmacêutica da reinvidicação 4, em que o composto é representado pelo Composto la ou um seu sal farmaceuticamente aceitável: OH

   Composto 1 a o
2. 6. Composição farmacêutica da reivindicação 4, em que composto é representado pelo Composto la: OH

   Composto la.
3. 7. Composição compreendendo: sal (i) composto de Fórmula I ou um seu farmaceuticamente aceitável: 3 OH

   I em que o carbono assinalado com um asterico poderá apresentar uma configuração (R) ou (S); e em que Ri e R2 são fluoro; e (ii) um fármaco de substrato CDA seleccionado do grupo consistindo em 5-azacitidina, gencitabina, ara-C, tezacitabina, 5-fluoro-2'-desoxicitidina e citocloro.
4. 8. Composição compreendendo: (i) Composto de fórmula I ou um seu sal farmaceuticamente aceitável: OH

   4 I em que o carbono assinalado com um asterico poderá apresentar uma configuração (R) ou (S); e em que Ri e R2 são fluoro; e (ii) um fármaco de substrato CDA; em que o fármaco de substrato CDA não é decitabina.
5. 9. Composição compreendendo: (i) Composto de fórmula I ou um seu sal farmaceuticamente aceitável: OH

   I em que o carbono assinalado com um asterico poderá apresentar uma configuração (R) ou (S);e em que Ri e R2 são fluoro; e (ii) um fármaco de substrato CDA; em que o fármaco de substrato CDA é decitabina.
6. 10. Composição de qualquer uma das reivindicações 7 ou 8, em que o fármaco de substrato CDA é gencitabina, ara-C ou 5-azacitidina. 5
7. 11. Composição de qualquer uma das reivindicações 7-10, em que o composto é representado pelo Composto la ou um seu sal farmaceuticamente aceitável: 12. OH

   σ "F \ OH OH Composto la. Composição de qualquer uma das reivindicações 7-10, em que o composto é representado pelo Composto la: OH

   Composto la.
8. 13. Composição farmacêutica compreendendo o composto de qualquer uma das reivindicações 1-3 ou a composição de qualquer uma das reivindicações 7-12; e um excipiente a farmaceuticamente aceitável.
9. 14. Composto de Fórmula I ou um seu sal f armaceuticamente aceitável: 6 OH

   I em que o carbono assinalado com um asterico poderá apresentar uma configuração (R) ou (S); e em que Ri e R2 são fluoro para aplicação num método para tratamento de cancro, compreendendo: (i) administração a um mamífero com necessidade deste, de um composto de fórmula I, e (ii) administração a um mamífero com a necessidade deste, de um fármaco de substrato CDA seleccionado do grupo consistindo em 5-azacitidina, gencitabina, ara-C, tezacitabina, 5-fluoro-2'-desoxicitidina, e citocloro.
10. 15. Composto de Fórmula I ou um seu sal f armaceut icamente aceitável: 7 OH I em que o carbono assinalado com um asterisco poderá apresentar uma configuração (R) ou (S); e em que Ri e R2 são fluoro, para utilização num método para tratamento de cancro, compreendendo: (i) administração a um mamífero com necessidade deste, de um composto de fórmula I, e (ii) administração a um mamífero com necessida deste, de um fármaco de substrato CDA; em que o fármaco de substrato CDA não é decitabina. 16 .

    Composto de fórmula I ou um seu sal f armaceut icamente aceitável: 8 OH

    I em que o carbono assinalado com um asterico poderá apresentar uma configuração (R) ou (S); e em que Ri e R2 fluoro, para utilização num método para tratamento de cancro, compreendendo: (i) administração a um mamífero com necessidade deste, de um composto de fórmula I, e (ii) administração a um mamífero com necessida deste, de um fármaco de substrato CDA; em que o fármaco de substrato CDA é decitabina.
11. 17. Composto de qualquer uma das reivindicações 14-16, em que o fármaco de substrato CDA é gencitabina, ara-C ou 5-azacitidina.
12. 18. Composto de qualquer uma das reivindicações 14-17 para utilização num método para tratamento de cancro, em que o cancro é seleccionado do grupo consistindo em cancros hematológicos e cancros sólidos. 9
13. 19. Composto da reinvidicação 18 para utilização num método para tratamento de cancro, em que o cancro é um cancro hematológico seleccionado do grupo consistindo em sindrome mielodisplásica e leucemia.
14. 20. Composto da reinvidicação 19 para utilização num método para tratamento de cancro, em que o cancro hematológico é leucemia mielóide aguda ou leucemia mielóide crónica.
15. 21. Composto da reinvidicação 18 para utilização num método para tratamento de cancro, em que o cancro é um cancro sólido seleccionado do grupo consistindo em cancro pancreático, cancro do ovário, cancro peritoneal, cancro do pulmão de não pequenas células, cancro da mama metastizado, cancro da bexiga, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células de transição, adenocarcinoma, cancro ginecológico, carcinoma da trompa de falópio, cancro do figado, carcinoma hepatocelular, cancro do pulmão, carcinoma do colo uterino, cancro do tracto genito-urinário, e cancro gastrointestinal.
16. 22. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 14-21 para utilização num método para tratamento de cancro, em que o composto é representado pelo Composto la ou um seu sal farmaceuticamente aceitável: 10 OH

    0‘ 'OH \ OH Composto la.
17. 23. Composto de acordo com qualquer uma reivindicações 14-21 para utilização num método para tratamento de cancro, em que o composto é representado pelo Composto la: OH

    Composto la.
18. 24. Composto de qualquer uma das reivindicações 14-23 para utilização num método para tratamento de cancro, em que o composto é administrado substancialmente ao mesmo tempo com o fármaco de substrato CDA, antes do fármaco de substrato CDA ou após o fármaco de substrato CDA.
19. 25. Composto de qualquer uma das reivindicações 14-24 para utilização num método para tratamento de cancro, em que o composto e o fármaco de substrato CDA são administrados numa única forma de dosagem unitária. 11
20. 26. Composto de qualquer uma das reivindicações 14-24 para utilização num método para tratamento de cancro, em que o composto e o fármaco de substrato CDA são administrados em múltiplas formas de dosagem unitária separadas.
21. 27. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3 ou composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 4-6 ou 13 ou composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 7-12, para utilização como um medicamento. Lisboa, 18 de Maio de 2012 12