PT2054365E - Métodos para preparar penta-1,4-dien-3-onas e ciclo-hexanonas substituídas, e derivados com propriedades antitumorais e antiparasiticidas, compostos e usos dos mesmos - Google Patents

Métodos para preparar penta-1,4-dien-3-onas e ciclo-hexanonas substituídas, e derivados com propriedades antitumorais e antiparasiticidas, compostos e usos dos mesmos Download PDF

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Description

DESCRIÇÃO
"MÉTODOS PARA PREPARAR ΡΕΝΤΑ-1,4-DIEN-3-ONAS E CICLO-HEXANONAS SUBSTITUÍDAS, E DERIVADOS COM PROPRIEDADES ANTITUMORAIS E ANTIPARASITICIDAS, COMPOSTOS E USOS DOS MESMOS" A presente invenção refere-se aos métodos para preparar derivados de 1,5-bis (aril)penta-1,4-dien-3-ona, abrangendo desde os seus métodos sintéticos de preparação e purificação até suas aplicações biológicas in vivo como agentes e anti tumorais e aplicações in vitro, como agentes antiparasitários, entre outros. A presente invenção refere-se também a uma composição quimica que apresenta aplicabilidade farmacêutica, que inclui os compostos referidos, para tratar cancro e parasitoses.
Descrição da técnica anterior H. van der Gootetal. (Eur. J. Med. Chem. 32, 625-630, 1997) obtiveram 1,5-diaril-l,4-pentadien-3-onas e os seus análogos ciclicos com propriedades antioxidantes. Os compostos ciclicos foram sintetizados através da reação dos aldeidos substituídos com ciclo-hexanona e/ou ciclopenta-nona na presença de ácido clorídrico. M. Ártico et al, no artigo publicado em J. Med. Chem. (v. 41, 3948-3960, 1998), relataram a preparação de 2,6-bis(3,4-di-hidroxibenzilideno)ciclo-hexanonas, 3,5-bis(3,4-di-hidroxibenzilideno)piperidin-4-onas e 3,5-bis (3,4-di-hidroxibenziliden)tetra-hidropiran-4-onas com propriedades anti-HIV-1 em estudos realizados com células MT-4 .
Posteriormente, Buolomwini e Assefa, no seu artigo publicado em J. Med. Chem. (45, 852-841, 2002), revelaram a ação anti-HIV da 2,5-bis(3,4-di-hidroxiben-zilideno)ciclopentanona e da 3,5-bis (3,4-di-hidroxibenzi-lideno)tetra-hidrotiopiran-4-ona.
Em 2004 e 2005, Youssef et al. (Arch. Pharm. Med.
Chem. 337, 42-54, 2004; Arch. Pharm. Chem. Life Sei. 338, 181-189, 2005) desenvolveram a síntese de 2,5-bis(benzili-deno)ciclo-heptanonas substituídas e de 3,5-bis(benzili-deno)-N-alquil-4-piperidonas a partir da reação dos aldeídos substituídos correspondentes e ciclo-heptanona ou 4-pi-perididona em meio ácido, em que esses compostos apresentaram uma atividade antioxidante e anticancerigena qui-miopreventiva.
No ano de 2004, o artigo publicado na revista Bioorganic & Medicinal Chemistry (12, 3871-3883, 2005) inclui uma lista de produtos avaliados quanto às propriedades antitumorais antiangiogénicas derivadas de
2,6-bis((4-hidróxi-3-metoxifenil)-metilideno)-ciclo-hexano-na. 0 composto acetato de 3,5-bis (2 —fluorbenzilideno)-4-oxo-piperidina se destaca como o composto mais ativo.
Recentemente, um novo método para obter 1,5-bis(4-hidróxi-3-metoxifenil)penta-1,4-dien-3-ona e seus derivados, e suas propriedades antitumorais in vitro, por uma técnica de ultrassom (J. Quincoces et al. "New Method for the Preparation of 1,5-Bis(4-Hydroxy-3-methoxy-phe-nyl)penta-1,4-dien-3-one and Derivatives with antitumoral properties": PI 0207141-0; PCT: 28 de maio e 2005) foi publicado; WO 2004/047716 A2. Os derivados sintéticos de 1,5-bis(4-hidróxi-3-metoxifenil)penta-1,4-dien-3-ona com propriedades antitumorais são apresentados na figura a seguir:
HB5: pJ = Cf fj; Rl » H; R? » Η; K4 « H; 8? « Η; X » O
R* = CH, ; B? - HjCCO j R3 «H;; «S» Rs - Η · X « O HBfcR’- CHj ;R3 “ C% ; R««Bj Κ*»Η;Χ«Ο
HbS: St- CU,;S? “ CH2C»-C(CBj)j ; ft’ * S;; R4 “ H; Si » Η; X » ΰ
ΗΒΙΟ: 50 « CU, ; ίθ » Η; R3 » CSjCH^CÍCHsk ; fíl» H; » K; X “ O
KB12; Rl “ H; &J» H; 8? “ H; R4 » H; R5 - Η; X » O
ΗΒΊ3: K* « CH, ; Rs = H; R3 « Bt; 8? » H; R5 - Η.; X -»O
HB14: R» = £2¾ ; R? « CHjCH=C(CHj)j ·, R? = Sr; K* ® Eí; Rs»«; X » O
HB15t R* - H;. R? - H; R? “ ; R*» Cíí jCIK^CH^ j »5«S; X « O
Deve também considerar-se que, devido à presença de grupos hidroxilo fenólicos, tais compostos podem ser tratados como mono e dissais. Esses derivados referidos não foram descritos até agora na literatura, seja de modo sintético ou biológico. A sintese ou avaliação da propriedade biológica de alguns produtos, derivados de uma O-alquilação de análogos anteriores, não foi anteriormente relatada na literatura.
As 4-nitro-3,5-diarilciclo-hexanonas substituídas foram obtidas por Thayumanavan e colaboradores, em 2002, pelas reações de Diels-Alder aminocatalisadas entre cetonas α,β-insaturadas e nitrodienófilos (Tetrahedron Letters 43, 3817-3820, 2002). Através dessa abordagem, tais compostos são gerados com bons rendimentos (rendimentos de até 87%), porém com modesta enantiosseletividade. No entanto, a metodologia aplicada oferece a vantagem de não exigir o isolamento do intermediário 2-amino-l,3-butadieno, que é gerado in situ e, portanto, as 4-nitro-3,5-diarilciclo-hexanonas substituídas são preparadas numa única etapa.
Crawshaw e colaboradores (Tetrahedron Letters 38, 7115-7118, 1997) demonstraram que as 4-nitro-3,5-diarilci-clo-hexanonas podem ser obtidas pela reação das maleimidas e dos nitroestirenos numa fase sólida. Por meio dessa metodologia, os produtos são obtidos com rendimentos moderados (37 a 87%), mas com graus de pureza elevados (-90%).
Nas última décadas, Padmavathi e colaboradores (Indian Journal of Chemistry, 31B, 7, 407-410, 1992) estiveram ativamente à procura de adições de Michael para ligações duplas, para obter adutos cíclicos, entre os quais se encontram os derivados de 1, l-diciano-3-metil-6-aril-4- oxociclo-hexano. V. Padmavathi et al. relataram em seu artigo, publicado em Journal Heterocyclic Chem., 42, 797-802, 2005, a síntese de 1,l-diciano-3-metil-2-fenil-6-aril-4-oxociclo-hexanos através da adição de Michael de malono-nitrilo em 1,5-diarl-2-metil-l,4-pentadien-3-ona na presença de Triton B, usando esses compostos como intermediários no processo de obtenção de espiro-heterociclos.
Em 1998, Rowland et al. estudaram a estereo-química das posições C-l e C-2 para as ciclo-hexanonas substituídas com diarilo e demonstraram a capacidade de interconversão dos isómeros trans nos isómeros eis, sob condições alcalinas (Journal of Organic Chemistry, 63, 4359-4365, 1998).
As aplicações biológicas dos compostos acima descritos e de interesse para essa patente compreendem aplicações antitumorais e antiparasitárias.
Cancro ou neoplasia é o nome dado a um conjunto de mais de 100 doenças caracterizadas pelo crescimento descontrolado de células anormais que podem afetar quase qualquer tecido do corpo. Ele afeta mais de 11 milhões de pessoas todos os anos, e é responsável por 7 milhões de mortes por ano, que pode ser traduzido, do ponto de vista estatístico, como 12,5% de mortes no mundo (Organização Mundial de Saúde. Cancro. Disponível na Internet em: http://www.who.int/cancer/en, acessado em 22 de setembro de 2005).
Melanomas são neoplasias que surgem na pele; no entanto, elas também podem proceder de superfícies mucosas ou de outros sítios de migração das células da cristã neural, e podem ocorrer nos olhos (melanoma intraocular), meninges, trato gastrintestinal e linfonodos, entre outros lugares. 0 tumor prevalece em adultos e, em mais da metade dos casos, em locais de pele aparentemente normal e naqueles expostos à luz solar. Nos homens, o tumor é mais comum no tronco, cabeça ou pescoço. Nas mulheres, é mais comum que ele apareça no terço distai dos membros inferiores. Em pessoas de pele escura, o melanoma geralmente localiza-se na região subungueal, palmar ou plantar. Os sintomas mais comuns são coceira, mudança de textura da superfície, sangramento local e até mesmo dor. Os melanomas são tumores cutâneos graves. A progressão de um cancro maligno depende do sucesso de uma série de eventos. Esses eventos são o crescimento contínuo das células tumorais, a capacidade das mesmas em evitar a apoptose e superar os sinais inibidores do crescimento, além de desenvolver uma resposta e manter uma resposta angiogénica, para invadir os tecidos vizinhos e mover-se até órgãos distantes (metás- tase) . A invasão e a metástase são aspectos importantes da progressão tumoral. Ambos os processos parecem resultar de um equilíbrio local entre reguladores e efetores com a cooperação entre moléculas de adesão, elementos do citoes-queleto, proteases para degradar a matriz extracelular e moléculas reguladoras.
Entre os fármacos terapêuticos mais utilizados estão a doxorrubicina, o paclitaxel e o etoposideo. A tabela a seguir lista alguns valores para a posologia, 50% de dose letal e efeitos colaterais para alguns dos fármacos antitumorais mais utilizados.
Como é observado na tabela abaixo, esses fármacos apresentam uma série de desvantagens, tais como doses eficazes relativamente altas, baixo Índice terapêutico, além de efeitos colaterais frequentes e indesejáveis que prejudicam a condição do paciente ou que exigem internação hospitalar, diminuindo acentuadamente a qualidade de vida do paciente.
Quanto às doenças parasitárias, a leishmaniose, por exemplo, é uma condição patológica causada por uma in-fecção de protozoários do género Leishmania e é, até hoje, uma doença de grande importância social e economia, sendo provavelmente a segunda do ranking das parasitoses causadas por protozoários provavelmente a segunda em grau de importância, depois da malária. De acordo com os relatórios da Organização Mundial da Saúde do PNUD/Banco Mundial/OMS -
Special program for research and training in tropical diseases (disponível na internet, http://who.ch/programmes/tdr/workplan/leishman.htm. com acesso em 22 de setembro de 2005), em 1996, 88 países tinham sido afetados pela doença, com 12 milhões de pessoas infectadas e cerca 350 milhões em risco.
Os medicamentos mais utilizados para tratar essa doença são os medicamentos de antimônio pentavalente, tais como antimonato de N-metilglucamina e estibogliconato de sódio. Em geral, ambos os tipos de fármaco possuem um bom índice de cura para a leishmaniose cutânea e visceral; no entanto, pela via de administração parenteral, a resistência do parasita e a toxicidade do fármaco representam os principais problemas encontrados no tratamento com tais medicamentos (Rev. Soc. Bras. Med. Trap. 33(6), 535-543, 2000).
Outros fármacos, como a anfotericina B, pentami-dina, mefloquina e miltefosina também são utilizados na terapêutica para essas doenças parasitárias, apesar de com menor eficácia do que os medicamentos com antimónio, e o fato de serem empregues em casos de resistência do parasita ou intolerância do paciente (Trop. Dis. Hyg. 8, 319-342, 2002). A tabela que se segue lista alguns dos medicamentos usados para tratar a leishmaniose, sua posologia, efeitos colaterais e alguns comentários sobre suas limitações de uso.
Conforme mostrado na tabela acima, as várias limitações para usar os fármacos disponíveis para tratar a leishmaniose são relacionadas às suas toxicidades elevadas que fazem com que vários e graves efeitos colaterais e reações adversas, num amplo espectro de intensidade e gravidade levando, várias vezes, à descontinuação do tratamento. Outros fatores que dificultam ou tornam o uso dos fármacos clássicos impraticável são: inconveniência das vias de administração, sempre parenteral, que desestimula a aceitação do paciente ou requer uma inevitável hospita- lização; a natureza refratária de alguns casos ao tratamento; resistência aos fármacos desenvolvidos por algumas espécies ou isolados de parasitas; e o longo prazo necessário para o tratamento, frequentemente interrompido pelo paciente . 0 uso dos fármacos acima mencionados para tratar neoplasias humanas e animais e a doença parasitária, a determinação de regimes terapêuticos mais adequados para cada tipo de doença, a determinação do efeito sinérgico da associação entre dois ou mais desses compostos, a determinação do modo de ação dos compostos ativos, a toxicidade e os compostos parâmetros farmacológicos para as referidas familias de compostos que surgiram como mais como mais favoráveis do que esses fármacos atualmente utilizados na terapêutica, para as doenças acima mencionadas e para outras doenças correlacionadas, são descritos na presente invenção.
Descrição das figuras
Figura 1 - Avaliação do crescimento de melanoma de murino B16F10 (volume) após o tratamento com HB-1.
Figura 2 - Avaliação do crescimento de melanoma de murino B16F10 (área) após o tratamento com HB-1.
Figura 3 - Grupo controlo: Miglyol 810®. A - tumor dorsal pigmentado e nodular.
Figura 4 - Grupo controlo: Miglyol 810®. A - tumor dorsal pigmentado e nodular.
Figura 5 - grupo controlo: Miglyol 810®. A - tumor dorsal. Uma grande área de irrigação periférica é observada.
Figura 6 - Tumor dorsal no grupo tratado. Composto HB-1 em Miglyol 810®. A - Tumor dorsal para o composto HB-1. B - Necrose.
Figura 7 - Tumor dorsal no grupo tratado. Composto HB-1 em Miglyol 810®.
Figura 8 - Tumor dorsal no grupo tratado. Composto HB-1 em Miglyol 810®. A - tumor dorsal. Observa-se um exsudato peritumoral.
Figura 9 - Tumor dorsal no grupo tratado. Composto HB-1 em Miglyol 810®. Uma grande área de irrigação periférica é observada. A - Exsudato peritumoral. B - Sistema vascular + necrose.
Figura 10 - Análise das fases do ciclo celular do melanoma B16F10 tratado com 15 mg/Kg de HB-1.
Figura 11 - Ensaio de toxicidade (HB-1) em células de melanoma de murino B16F10.
Figura 12 - Efeito antiproliferativo citotóxico do composto HB-1 diluido em migliol 810 para as células de melanoma de murino B16F10.
Figura 13 - Efeito antiproliferativo citotóxico do composto HB-1 diluido em Miglyol 810 em macrófagos normais peritoneais.
Figura 14 - Avaliação do indice de caquexia para animais com melanoma B16F10 tumoral.
Figura 15 - Avaliação do composto HB-2, HB-1 + HB2 (associação) e Miglyol (controlo) em melanoma implantado B16F10 para ratinhos C57BL/6J.
Figura 16 - Avaliação do composto HB-2 e HB-1 + HB2 (associação) em melanoma implantado B16F10 para ratinhos C57BL/6J - Área.
Figura 17 - Efeito antiproliferativo citotóxico para o composto HB-1 diluido em Miglyol em células de melanoma B16F10.
Figura 18 - Avaliação pelo método MTT do efeito antipro- liferativo e citotóxico do composto HB-2 diluído em Miglyol 810® e controlo de Miglyol 810® em fibroblastos humanos de pele normal.
Figura 19 - Avaliação dos efeitos antiproliferativos e citotóxicos do composto monossódico em células de melanoma B16F10.
Figura 20 - Avaliação dos efeitos antiproliferativos e citotóxicos do composto dissódico em células de melanoma B16F10.
Figura 21 - Avaliação dos efeitos antiproliferativos e citotóxicos do composto DM-2 em linfócitos T.
Figura 22 - Toxicologia do composto monossódico administrado a ratinhos Balb-c por via endovenosa.
Figura 23 - Fotomicrografia do tumor de melanoma dorsal. A - Presença do tumor dorsal pigmentado nodular. C - Presença do tumor dorsal pigmentado nodular com ausência de infiltrado inflamatório leucocitico.
Figura 24 - Fotomicrografia do tumor de melanoma dorsal. B - Presença do tumor dorsal pigmentado nodular com grandes áreas de necrose. C - Presença do tumor dorsal pigmentado nodular com ausência leucócitos inflamatórios infiltrados.
Figura 25 - Fotomicrografia do tumor dorsal de melanoma implantado em ratinhos C57BL/6J após 14 dias de tratamento com o composto HB-1 diluído em Miglyol 810® administrado pela via intraperitoneal. A - Presença de leucócitos inflamatórios infiltrados intensos nas porções intra e peritumorais.
Figura 26 - Fotomicrografia do tumor dorsal de melanoma implantado em ratinhos C57BL/6J após 14 dias de tratamento com o composto HB-1 diluído em Miglyol 810® administrado pela via intraperitoneal. B - Massa de tumor modular infiltrado com extensas áreas de necrose.
Figura 27 - Fotomicrografia do tumor dorsal de melanoma implantado em ratinhos C57BL/6J após 14 dias de tratamento com o diluente Miglyol 810® administrado pela via intraperitoneal . A - Tumor dorsal pigmentado e nodular. B - Tumor dorsal vascularizado (*), pigmentado e nodular com grandes áreas de necrose.
Figura 28 - Fotomicrografia do tumor dorsal de melanoma implantado em ratinhos C57BL/6J após 14 dias de tratamento com o diluente Miglyol 810® administrado pela via in-traperitoneal. C - Tumor dorsal pigmentado nodular com ausência de leucócitos inflamatórios infiltrados intra e peritumorais. D - Tumor dorsal vascularizado (*), pigmentado e nodular com grandes áreas de necrose.
Figura 29 - Fotomicrografia do parênquima pulmonar de ratinhos C57BL/6J com tumor de melanoma dorsal do grupo tratado com o composto HB1 em Miglyol 810®.
Figura 30 - Fotomicrografia do parênquima pulmonar de ratinhos C57BL/6J com tumor de melanoma dorsal do grupo tratado com Miglyol 810®.
Figura 31 - Fotomicrografia de uma seção do parênquima hepático mostrando hepatócitos bem preservados com lóbulos bem definidos e padrão radial da trabécula.
Figura 32 - Fotomicrografia de um parênquima renal, demonstrando corpúsculos renais tipicos e bem preservados, túbulos enrolados distais e proximais também bem preservados, sem qualquer alteração estrutural.
Figura 33 - Efeito do composto HB1 sobras as formas promastigotas de Leishmania amazonensis cultivadas em meio de Warren.
Figura 34 - Efeito do composto HB1 sobre as formas promastigotas de Leishmania amazonensis cultivadas em meio RPMI.
Figura 35 - Viabilidade das formas promastigotas de
Leishmania (L) amazonensis tratada com HB-1, em meio RPMI.
Figura 36 - Efeito do composto HB1 sobre as formas promastigotas de Leishmania (L.C.L. isolada) incubada em meio de Warren, na presença de HB-1.
Figura 37 - Efeito do composto HB1 sobre as formas promastigotas de Leishmania (D.C.D. isolada) incubada em meio de Warren, na presença de HB-1.
Descrição detalhada da invenção
Parte 1: Síntese, Isolamento e Caracterização dos derivados . A presente invenção refere-se à preparação de 4-[5- (4-hidróxi-3-metoxifenil)-3-oxopenta-l, 4-dienil] -2-meto-xifenolatos e 3-oxopenta-l,4-dienilbis(2-metoxifenolatos) de 1,5-bis(4-hidróxi-3-metoxifenil)penta-1,4-dien-3-ona na
presença de alcóxido metálico numa razão molar igual a 1:1 e 1:2, respectivamente. Preferencialmente uma l,5-bis(4-hidróxi-3-metoxifenil)penta-1,4-dien-3-ona é colocada em contato com uma solução alcoólica do respectivo alcóxido, seguido por rotaevaporação do solvente até a constituição sólida. Os derivados de monossal e dissal podem ser obtidos devido à presença de dois grupos fenólicos nas estruturas e sua proporção é controlada pela razão molar dos reagentes. Uma vez obtidos, os fenolatos passam por uma peneira para obter um pó fino mais facilmente solubilizado em água e usado nos testes biológicos descritos posteriormente nesse documento. Outros derivados de monosssal e dissal da 1,5-bis(4-hidróxi-3-metoxifenil)penta-1,4-dien-3-ona com propriedades antiparasitas e antitumorais são mostrados na figura a seguir,
DMh X Ô; ’ 2 "Η; M ® Na; tW; X »<5(0%; Y í 2 * Η; M ; DM»; X - C(CN h j Y ® Η; Z* ΕΪ; M » tta; DM5: X “ CÍCOOCHj3CNY « Na; £ « Kj M « W; DMS: X * CXCOQCttjMSi; Y - 8; 2 » δ; M » Na; SMK X «<XCQO8$Ôí j Y ® W; Z « Η: M « Na; DM8; X w C(CGOB)CN; Y - H; 2 « M » »; DM5: X»0; Y« Na ; Z « UO-j; Xá; DM10; X « O; Y « H; Z»«M» Na; DMV51X «tXQQí; Y * Na; 2 * W M »Na; DM12: X " CCC»h; Y “ H; 2 ™ NO$ Μ * N»; DM13: X GÇCOGCHyCfí; Y “Na; Z « HO# M “ Na; DMH; X * CfOÔOCfi^CNr; Y - H; 2 * NÊfc M · Na. ; DM1S: X »0; ¥ wHa; 2 « ΉΗ&amp; M ; DMí fe X * O; ¥ » H; 2 »1¾ M “ Na;
onde X pode ser um átomo de oxigénio, um grupo malononitrilo ou mesmo um cianoacetato de alquilo; Y varia entre um hidrogénio ou um catião de sódio que estabiliza o composto como um ião fenóxido; Z inclui grupos nitro e amino, além de compostos não substituídos em tal posição (Z=H) e M representa um catião de sódio estabilizando o composto como um ião fenóxido. A presente invenção também se refere a um novo processo para preparar outra 1,5-bis(4-hidróxi-3-metoxife-nil)penta-1,4-dien-3-ona derivada com propriedades antipa- rasita e antitumoral.
Essas invenções podem ser ilustradas por meio dos exemplos de execução a seguir:
Exemplo 1: Preparação de 4-[5-(4-hidróxi-3-meto-xifenil)-3-oxopenta-l,4-dienil]-2-metoxifenolato de sódio (codificado como DM2).
A partir de 1,5-bis(4-hidróxi-3-metoxifenil)penta-1 , 4-dien-3-ona na presença de alcóxido metálico numa razão molar de 1:1. Preferencialmente, a 1,5-bis(4-hidróxi-3-metoxifenil)penta-1,4-dien-3-ona é misturada com uma so-
lução alcoólica do respectivo alcóxido, seguido por rotae-vaporação do solvente até formar uma constituição sólida. 0 monossal pode ser obtido com alto rendimento. Uma vez obtido, o fenolato passa por uma peneira para obter um pó fino mais facilmente solubilizado em água aplicado aos testes biológicos descritos posteriormente nesse documento. 0 produto mostra uma cor vermelho escuro. Fórmula geral: CiçiHnOsNa. Peso molecular: 348.
Rendimento: 90%.
Resultado da caracterização estrutural: UV-VIS: Absorção máxima a 388 nm em água.
Através de acidificação com ácido clorídrico, o monossal é transformado na correspondente 1,5-bis(4-hidró-xi-3-metoxifenil)penta-1,4-dien-3-ona, que é extraída com éter etílico, clorofórmio ou acetato de etila. Os resultados da caracterização estrutural do composto isolado são como mostrados a seguir: 1,5-bis(4-hidróxi-3-metoxifenil)penta-1,4-dien-3-ona, também denominada HB-1.
Fórmula geral: Ci9H18O5. Peso molecular = 326.
Ponto de fusão = 140 °C.
Rendimento: 92%.
Resultados da Análise Elementar Quantitativa: Cálculo encontrado C 69,94% C 69,91% H 5,52% H 5,49%
Análises espectroscópicas. RMN 3H (CDC13): 7,7 (d, 2H, H-l', H-5'); 7,19 (m, H-2, H-5, H-6); 4,0 (s, 6H, MeO) ppm. RMN 13C- (CDC13) : 188 (C-3'); 148 (C-l', C-5'); 146 (C-3); 143 (C-4); 128 (C-2', C-4'); 122,9 (C-l); 116,5 (C—6); 110 (C-2, C-5); 56 (C do grupo metóxi) ppm. IR (filme) : em 3396 (banda de OH) ; 2962 (C sp2 H); 2841 (Csp3 H) ; 1587 (conjugado de C=O) cm-1. MS (70 VE) : 327 (M+ + H+) ; 28 (327,3 - 299, 3), que corresponde ao grupo CO 32 (M+ - 295), que corresponde ao grupo metóxi 15 (203-188), que corresponde ao grupo metila.
Exemplo 2: Preparação do 3-oxopenta-l,4-dienil-bis(2-metoxifenolato) dissódico codificado como DM1).
A partir de 1,5-bis(4-hidróxi-3-metoxifenil)penta-1 , 4-dien-3-ona na presença de alcóxido metálico numa razão molar de 1:2. Preferencialmente, a 1,5-bis(4-hidróxi-3-metoxifenil)penta-1,4-dien-3-ona é misturada com uma solução alcoólica do respectivo alcóxido, seguido por rota-evaporação do solvente até formar uma constituição sólida. 0 dissal pode ser obtido com rendimento elevado. Uma vez preparado, o fenolato passa por uma peneira para obter um pó fino mais facilmente solubilizado em água e aplicado aos testes biológicos descritos posteriormente nesse documento. 0 produto mostra uma cor vermelho escuro. Fórmula geral: Ci9Hi60sNa2. Peso molecular: 370.
Rendimento: 95%.
Resultados da caracterização estrutural: UV-VIS: Absorção máxima a 370 nm em água.
Através de acidificação com ácido clorídrico, o dissal correspondente é transformado na correspondente 1,5-bis(4-hidróxi-3-metoxifenil)penta-1,4-dien-3-ona, que é extraída por éter etilico, clorofórmio ou acetato de etilo. Os resultados da caracterização do composto são os mesmos discutidos acima.
Exemplo 3 (não de acordo com a presente invenção) : preparação da 3,5-bis-[3-metóxi-4-(3-metilbut-2-eni-lóxi)-fenil]-4-nitrociclo-hexanona (codificada como C-25).
Procedimento para a Preparação A
Previamente, preparar uma mistura contendo de 5 a 20 mL de dimetilformamida, 1,38 g (0,01 mol) de carbonato de potássio anidro e 0,01 mol (0,54 mL) de nitrometano, que deve ser aquecida sob refluxo a 20 a 70 °C, agitando durante 30 a 60 minutos. Após esse período de tempo, adicionar 0,001 mol (540 mg) do composto 1,5-bis[3-metóxi-4-(3-metil-but-2-enilóxi)-fenil]penta-1,4-dien-3-ona dissolvido numa quantidade apropriada de dimetilformamida e deixar aquecer sob agitação durante 5 a 15 horas. Após esse período, verter a mistura em água e gelo, acidificar, extrair com acetato de etilo, conforme necessário, e lavar a fase orgânica com água destilada. Secar com sulfato de sódio anidro e rotaevaporar o solvente, obtendo o produto da reação.
Procedimento para a Preparação B
Nesse procedimento de preparação, uma técnica de ultrassom é usada, consistindo na mistura de 0,001 mol (540 mg) de 1,5-bis[3-metóxi-4-(3-metilbut-2-enilóxi)-fenil]pen-ta-1,4-dien-3-ona com 5 a 20 mL de dimetilformamida e 0,01 mol (1,38 g) de carbonato de potássio anidro, 0,01 mol (0,54 mL) de nitrometano e reação durante um período de 3 a 10 horas a 30 a 70 °C. No final da reação, deve-se proceder conforme descrito no procedimento de preparação 1. O produto apresenta cor acastanhada. Fórmula geral: C30H37NO7. Peso molecular: 523.
Rendimento: 95%.
Resultados da Análise Quantitativa: Cálculo encontrado C 68,83% C 68,79% H 7,07% H 7,10% N 2,68% N 2,65%
Análise espectroscópica. RMN 3H (CDC13): Entre 6,9 e 6,6 (m, 3H, H-2, H-5, H-6); 5,5 (m, 2H, H-2'); 5,2 (t, 1H, H-4"); 4,59 (d, 4H, H-1'); 3,80 e 3,88 (s, 6H, 2 grupos MeO); entre 3,0 e 2,8 (m, 6H, H-6", H-2", H-3", H-5"); 1,78 (s, 6H, Me), 1,73 (s, 6H,
Me) ppm.. RMN 13C (CDC13) : 208,0 (CO) ; 149,0 (C-3) ; 148,0 (C-4); 138,0 (C-3'); 132,7 (C-l); 129,1 (C-6); 120,7 (C- 2'); 113,1 (C-2); 111,2 (C-5); 92,2 (C-4"); 66,8 (C-l'); 56,1 (MeO); 43,0 (C-2", C-6"); 42,0 (C-3", C-5"); 26,0 (C- 4' ) ; 19,3 (C- 4') ppm.
IR (filme): 2970 (Csp2 - H) ; 2933, 2916 (Csp3 - H); 1712 (C=O não conjugado), 1514 e 1381 (NO2) cm-1.
Exemplo 4 (não de acordo com a presente invenção) : preparação de 3,5-bis-(fur-2-il)-4-nitro-l-ciclo- hexanona. Síntese das γ-nitrocetonas substituídas pela adição de Michael de nitroalcanos em divinilcetonas
Procedimento para a Preparação A
Misturar uma solução pastosa do sal do nitroalcano de sódio, obtido pela adição de 40 mmol deste produto em 30 mmol (0,69 g) de solução de sódio em 5 a 20 mL de MeOH absoluto, a uma mistura de 20 mmol da divinil-cetona correspondente em 20 a 40 mL de MeOH absoluto. Agitar a mistura vigorosamente por um periodo de 4 a 8 horas, seguido por resfriamento externo com gelo e agitação vigorosamente lenta, acidificar com ácido acético glacial. Deixar a mistura em repouso a frio por um periodo de 5 a 12 horas até a cristalização do produto, que é filtrado e lavado com MeOH. As fases de água residual são extraídas com éter dietilico, lavadas com água e secas com sulfato de sódio anidro. 0 extrato etéreo é concentrado em um rotaevaporador e o óleo resultante cristaliza a partir de MeOH quente.
Procedimento para a Preparação B
Misturar 1 mmol de divinilcetona, 5 mmol de nitroalcano e 1,4 mmol (0,2 g) de carbonato de potássio anidro em 5 a 20 mL de EtOH. A mistura é submetida a refluxo durante 5 a 10 horas. Ao término da reação, adicionar 20 a 40 mL de água à mistura reagente e extrair com clorofórmio (3 x 10 mL). Os extratos de clorofórmio são lavados com uma quantidade suficiente de água destilada, secos com sulfato de sódio anidro e o solvente é rotaevaporado até a constituição do óleo. Esse óleo é tratado com EtOH quente e carvão vegetal ativado, produzindo sólidos que são separados por filtração sob pressão reduzida.
Procedimento para a Preparação C A reação é realizada de maneira semelhante à técnica A, para essa variante sintética; no entanto, usa irradiação de ultrassom entre 30 e 70 KHz como a fonte de energia, por um intervalo de 1 a 4 horas. Os produtos são isolados e purificados, conforme descrito no procedimento A. 3RS-(3a,4b,5b)1-3.5-di(fur-2-il)-4-nitro-l-ciclo-hexanona
Cristais brancos. Rendimento: Técnica A: 60%; Técnica B: 47%; Técnica C: 75%, Temperatura de Fusão. 92 °C, Fórmula Molecular: C14H13NO5 (M = 275,26)
EM: IE (70 VE) , [M]+ = 275 (12), 245 (11), 228 (76), 200 (53), 161 (40), 107 (100), 94 (41), 65 (30). IV: (KBr) 1720 cm'1 (CO) , 1550, 1372,5 cm"1 (NO2). RMN :H: (CDC13), 5 (ppm) : 7,34 (2H, m, H-5 Fur) , 6,29 (2H, dd, H-4 Fur), 6,14 (2H, d, H-3 Fur), 5,44 (1H, dd, J4-3a= 13,23 Hz, J4-5e= 6,6 Hz, H-4), 4,07 (1H, dd, J3a-4 = 13,2 Hz, J3-2 =6,6 Hz, H-3ax), 3,8 (1H, m, J5-6e = 3,9 Hz, J5-4 = 5,53 Hz, J5-6a = 9,3 Hz, H-5ec) , 3,05 (2H, m, H-2ax, H-6ax), 2,8 (2H, m, H-2ec, H-6ec),. RMN 13C: (CDC13), 8 (ppm): 204, 61 (CO) , 151,32, 150,48, 142,91, 142,75, 110,70, 110,55, 108,26, 108,12, (2 C-2, 2 C-5, 2 C-4, 2 C-3, C4H3O), 86,06 (C-4), 40,96, 40,89 (C-2, C-6), 37,30, 37,18 (C-3, C-5). 3RS-(3α,4β,5α)]-3.5-di(fur-2-il)-4-metil-4-nitro- 1-ciclo-hexanona
Rendimento de Escamas Brancas: Técnica A: 28%; Técnica C: 40%,
Temperatura de fusão. 130-131 °C; Fórmula
Molecular: Ci5H15NO5 (M = 289, 29).
EM: IE (70 VE) , [M]+ = 289 (2.5), 242 (80), 227 (50), 199 (30), 121 (100), 94 (80), 81 (75), 65 (48), 39(63) . IV: (KBr) 1728 cm'1 (CO) , 1552, 1352 cm_1(N02). RMN :H: (DMSO-d6) , 8 (ppm) : 7,6 (2H, m, J5-4 = 1,8 Hz, H-5 Fur), 6,4 (2H, dd, J4-3 = 3,2 Hz, J4-5 = 1,87
Hz, H-4 Fur), 6,2 (2H, d, H-3 Fur), 4,35 (2H, c, J3-2e = 4,5 Hz, J3-2a = 14,17 Hz, H-3, H-5), 3,02 (2H, dd, J2a-3 = 14,1 Hz, J2a-2e = 16,4 Hz, H-2ax, H-6ax) , 2,6 (2H, m, J2e-3 = 4,58 Hz, H-2ec, H-6ec), 1,4 (3H, s, Me). RMN 13C: (DMSO-d6), 8 (ppm): 203, 73 (CO) , 150,83, 143,10, 110,42, 108,27 (2 C-2, 2 C-5, 2 C-4, 2 C-3, C4H3O), 94,21 (C-4), 42,75 (C-3, C-5), 40,62 (C-2, C-6), 11,86
(Me) . 3RS-(3a,4b,5a)1-3,5-difenil-4-metil-4-nitro-l-ci- clo-hexanona
Agulhas brancas. Rendimento: Técnica C: 85% (Literatura 40%) .
Temperatura de fusão. 187-188 °C (Literatura 188 °C) Fórmula Molecular: C19H19NO3 (M = 309, 36).
EM: IE (70 VE) , [M]+ = 309 (1.5), [M+l]+ = 310 (1), 280 (2), 260 (65), 247 (8), 219 (8), 205 (12), 175 (17), 159 (38), 131 (100), 104 (77), 91 (73), 77 (23). IV: (KBr) 1725 cm'1 (CO) , 1538,1341 cm"1 (NO2). RMN :H: (CDC13), 8 (ppm) : 7,30 - 7,26 (6H, m, C6H5), 7,20 - 7,05 (4H, m, C6H5), 4,43 (1H, dd, H-5), 3,65 (1H, ddd, H-3) , 2,95 (2H, dd, H-2ax, H-6ax) , 2,7 (2H, dd, H-2ec, H-ec), 1,4 (3H, s, Me). RMN 13C: (CDC13), 8 (ppm): 208,56 (CO) , 137, 68, 136, 29 (2 C-l, C6H5), 129, 10, 128, 92, 128,81, 128, 65,
128,56, 128,44, 128,35, 128,20, 128,11 (10CH, C6H5), 93,89, (C-4), 48,55, 46,45 (C-3, C-5), 42,16, 41,80 (C-2, C-6), 21,44 (Me).
Exemplo 5 (não de acordo com a presente invenção) : preparação de 2,6-di-(arilalquiliden)-3,5-di-(fur-2-il)-4-metil-4-nitro-l-ciclo-hexanonas
Uma (1) mmol da ciclo-hexanona A correspondente reage com 4 mmol do aldeído em 5 mL de MeOH absoluto e, sob agitação e condições mais lentas, a mistura de 4 mmol de metanolato de sódio é gotejada em 10 mL de MeOH absoluto. A agitação é mantida por um período de 12 horas. O precipitado sólido é filtrado e os produtos são isolados por coluna cromatográfica e recristalizados. 3RS-(3a,4B,5a)1-2,6-di[1-(fur-2-il)metiliden]3,5- di(fur-2-il)-4-metil-4-nitro-l-ciclo-hexanona
EM: IE (70 VE), [M]+ = 445 (3), 399 (29), 398(80), 383 (24), 315 (18), 171 (18), 143 (23), 128 (70), 115 (100), 81 (52), 55 (45), 39 (55). IV: (KBr) 1664 cm"1 (CO) , 1604 (C = C) , 1536, 1344 cm"1 (NO2) . RMN :H: (DMSO-d6) , 5 (ppm) : 7,87 (2H, d, J5-4 = 1,5 Hz, 2 H-5 Fur em R1) , 7,71 (2H, s, H-7, H-8), 7,40 (2H, d, J5-4 =1,4 Hz, 2 H-5 Fur em R), 6,88 (2H, d, J4-3 =3,4
Hz, 2 H-3 Fur em R1) , 6,64 (2H, m, 2 H-4 Fur em R1) , 6,14 (2H, m, J4-3 = 3,25 Hz, 2 H-4 Fur em R), 5,86 (2H, d, 2 H-3
Fur em R), 5,60 (2H, s, H-3, H-5), 2,0 (3H, s, Me). RMN 13C: (CDC13), 5 (ppm): 183, 68 (CO) , 150,45, 149,37 (2 C-2, C4H3O), 147,27, 142,06 (2 C-5, C4H3O), 127,27 (C-2, C-6), 126,50 (2 CH olef,).119,63, 113,11 (2 C- 3, C4H3O), 110,57, 109,80 (2 C-4, C4H3O), 92,87 (C-4), 48,55, 43,27 (C-3, C-5), 25,22 (Me). 3RS- (3α,4β,5α) ] -3,5-difenil-2, 6-di- [1- (fur-2-il)metiliden-4-metil-4-nitro-1-ciclo-hexanona
Cristais amarelos. Rf: 0,34 (n-heptano/acetato de etila 3:1), Rendimento: 60%, temperatura de fusão. 216 -218 °C (DMF - água) Fórmula Molecular: C29H23NO5 (M = 465,51)
ΕΜ: ΙΕ (70 VE), [M]+ = 465,1 (100), 419 (37), 418 (41), 403 (13), 335 (14), 208 (11), 194 (12), 165 (39), 153 (26), 105 (22) , 81 (14) , 77 (13) . IV: (KBr) 1665, 8 cm"1 (CO) , 1600 (C = C) , 1540, 1351 cm"1 (NO2) . RMN :H: (CDC13), 8 (ppm): 7,91 (1H, s, H-7), 7,8 (1H, s, H-8), 7,58 - 7,47 (2H, d, H-5 Fur), 7,4 - 7,26 (10 H, m, C6H5) , 6,7 - 6,6 (2H, d, H-3 Fur), 6,5 - 6,4 (2H, dd, H-4 Fur), 5,6 (1H, s, H-3), 5,13 (1H, s, H-5), 1,67 (3H, s,
Me) . RMN 13C: (CDC13), 8 (ppm): 189,19 (CO) , 151,33, 151,17, 146,10, 145,82 (2 C-2, 2 C-5, C4H30), 139,49, 137,82 (2 C-l, C6H5), 132,84, 130,37 (C-2,C-6), 130,18, 129,60, 128,77, 128,26, 127,76 (10 CH, C6H5), 127,04,126,48 (2 CH olef.93,99 (C-4), 53,67, 48,33 (C-3, C-5), 25,21 (Me) . 3RS-(3α,4 β,5α)]-2,6-di[1-(5-bromofur-2-il)metili-den]-3,5-difenil-4-metil-4-nitro-l-ciclo-hexanona
Sólido amarelo. Rf: 0,3 (n-heptano/acetato de etilo 3:1) Rendimento: 65%.
Temperatura de fusão. 226-227 °C (MeOH - água) Fórmula Molecular: C29H2iBr2NOs (M = 543,39)
IV: (KBr) 1668,3 cm-1 (CO) , 1611,4 (C = C) , 1542, 1361 cm-1 (NO2) . RMN :H: (CDC13), 6 (ppm): 7,6 (1H, s, H-8), 7,52 (1H, s, H-7), 7,25 - 7,1 (10 H, m, C6H5), 6,42 (2H, m, H-3
Fur), 6,19 (2H, m, H-4 Fur) , 5,26 (1H, s, H-3), 4,78 (1H, s, H-5), 1,5 (3H, s, Me). RMN 13C: (CDC13), 8 (ppm) 187,12 (CO) , 151,59, 151,54, 137,38, 136,04, 131,36, 130,04, 129,22, 128,81 (2 C-2, C4H3O, 2 C-l, C6H5, 2 C-5, C4H3O, C-2, C-6), 127,40, 127,35, 126,86, 125,53, 125,73, 125,57, 123,98, 123,78 (10 CH, C6H5, 2 CH olef.92,03 (C-4), 51,75, 47,99 (C-2, C-5), 23,54 (Me).
Exemplo 6 (não de acordo com a presente invenção) : preparação de 2-(3,5-diaril-4-nitrociclo-hexili- den)malononitrilo
Dez (10) mmol de 4-nitrociclo-hexanona correspondente C reage com 20 mmol de malononitrilo, 12,9 mmol (1 g) de acetato de amónio e 1 mL de ácido acético glacial em 60 mL de tolueno seco. A mistura é colocada sob refluxo durante 3 a 10 horas com o auxílio de Dean-Stark. Após esse período, a reação é resfriada com solução aquosa de carbonato de sódio (10%) e, em seguida, com água destilada. A fração orgânica é seca com sulfato de sódio anidro e com-centrada por rotaevaporação a vácuo, até a constituição do óleo, que se cristaliza a partir de metanol quente. 3RS-(3α,4β,5β)1-[3,5-di(fur-2-il)-4-nitrociclo-hexiliden]malononitrila
Cristais verde claros.
Rendimento: 80%.
Temperatura de fusão. 141 a 142 °C (MeOH) Fórmula Molecular: C17H13N3O4 (M = 323,30)
ΕΜ: ΙΕ, (70 VE) , [M]+ = 323 (7), 293 (28), 276 (100), 247 (26), 209 (96), 173 (15), 115 (14), 94 (19), 83 (65) . IV: (KBr) 2232 cm'1 (2 CN) , 1600, 1500 (C=C) , 1548, 1356 cm'1 (NO2) . RMN :H: (CDC13), 5 (ppm): 7,40 (2H, dd, H-5 Fur), 6,38 (2H, m, H-4 Fur), 6,28 (1H, d, H-3 Fur), 6,20 (1H, d, H-3' Fur), 5,35 (1H, dd, J4,3 = 12,8 Hz, J4,5 = 5,8 Hz, H- 4), 4,0 (1H, dd, J3-2 = 11,1 Hz, J3-2e = 6,3 Hz, H-3ax), 3,8 (1H, m, J5-6 = 3,1 Hz, H-5ec) , 3,44 (2H, m, H-2ax, H- ax), 3,16 (2H, m, H-2e, H-6e). RMN 13C: (CDC13), 5 (ppm): 175,71 (C=C) , 150,09, 149,34, 143,4, 143,01, 110,94, 110,72, 108,74, 108,44 (2 C-2, 2 C-5, 2 C-3, 2 C-4, C4H3O) , 111,12 (2 CN) , 86, 66 ( = C(CN)2), 85,93 (C-4), 37,17, 37,11 (C-3, C-5), 34,17, 33,96 (C-2, C-6). 3RS-(3α,4β,5β)]-[3,5-di(fur-2-Il)-4-meti1-4-nitrociclo-hexiliden]malononitrila
Cristais cinza claros.
Rendimento: 85%,
Temperatura de fusão. 192 °C (MeOH) Fórmula Molecular: C18H15N3O4 M = 337,33) .
EM: IE (70 VE), [M-47]+= 290 (20), [M -46]+ = 291 (60), 275 (100), 222 (20), 147 (18), 128 (20), 115 (27), 95 (52), 81 (98), 65 (41), 53 (54), 39 (88). IV: (KBr) 2240 cm'1 (2 CN) , 1608, 1504 (C = C) , 1548, 1352 cm'1 (NO2) . RMN :H: (CDC13), 5 (ppm) : 7,62 (2H, d, H-5 Fur) , 6,44 (2H, dd, H-4 Fur), 6,32 (2H, d, H-3 Fur), 4,18 (2H, dd, J3-e = 5,0 Hz, J3-a= 14,4 Hz, H-3ax, H-5ax), 3,28 (2H, m, Ja-3 = 14,2 Hz, H-2ax, H-6ax), 3,10 (2H, m, Je-3 = 5,1
Hz, H-2ec, H-6ec), 1,3 (3H, s, Me). RMN 13C-NMR: (CDC13), 5 (ppm): 177,35 (C = C) , 150,17, 143,32, 110,49, 108,59 (2 C-2, 2 C-5, 2 C-4, 2 C-3, C4H3O) , 111,73 (2 CN), 93,91 (C-4), 84,01 (= C(CN)2), 43,12 (C-3, C-5), 33,38 (C-2, C-6), 11,93 (Me).
Parte 2: Atividade Antitumoral e Ensaios Pré- clínicos Pertinentes A presente invenção refere-se também à atividade antitumoral in vivo para os derivados acima mencionados, bem como para os seus precursores 1,5-bis(4-hidróxi-3-meto-xifenil)penta-l,4-dien-3-ona.
Também se refere à atividade antitumoral in vivo de uma associação preparada a partir de 1,5-bis(4-hidróxi-3-metoxifenil)penta-1,4-dien-3-ona (HB-1) e 4-[5-(4-acetó-xi-3-metoxifenil)-3-oxopenta-l,4-dienil]-2-metoxifenilace-tato (HB-2) numa razão molar apropriada e em um solvente adequado.
Os compostos aqui presentes demonstraram significativa atividade antiproliferativa, compreendendo ações ci-tostáticas e citotóxicas em testes realizados in vivo, além de terem demonstrado ser quase atóxicos, a última caracte-rística sendo bastante vantajosa.
As atividades observadas são ilustradas através dos seguintes exemplos:
Exemplo 7: Análise da capacidade inibitória (volume e área tumoral para o composto HB-1 em tumores de melanoma implantados em ratinhos C57BL/6J, tratados pela via intraperitoneal (1,15 pg/Kg). As figuras 1 e 2 ilustram essa análise.
Após o dia 4 do implante das células tumorais (2xl05 células tumorais/mL) , os animais foram divididos em dois grupos: o grupo teste, tratado com composto HB-1 diluído em Miglyol 810® e o grupo controlo, que recebeu apenas o diluente (Miglyol 810®) no mesmo volume que o grupo teste. Os animais foram tratados diariamente por via intraperitoneal. Ao mesmo tempo, as medições do peso do animal e do tamanho do tumor (duas medidas - comprimento x largura) foram realizados e o aspecto do tumor foi registrado por fotografias.
Após o dia 14, os animais foram sacrificados por deslocamento cervical, os tumores foram removidos e a necropsia foi realizada para remover todos os órgãos internos e lesões macroscópicas para análise histopato-lógica.
Os parâmetros tumorais foram obtidos pelo cálculo da área média (A) e volume (V) do tumor, através das seguintes fórmulas A = nR2 e V = 4nR3, onde (R = raio médio do tumor).
Nossos resultados demonstraram alta significância para reduzir os parâmetros tumorais (volume e área), após o tratamento com o composto HB-1 diluído em Miglyol 810®. Durante o tratamento, observamos que os animais que receberam o composto HB-1 diluído em Miglyol 810® não demonstraram, em qualquer momento, o crescimento exponencial do tumor dorsal, que ocorreu no grupo controlo que recebeu apenas Miglyol 810®. A porcentagem de tratamento inibitório para o melanoma B16F10 foi maior que 98%, mostrando claramente sua eficácia para reduzir e inibir a proliferação tumoral.
Exemplo 8: Aspecto Macroscópico
Grupo Controlo - Aspecto Macroscópico do Melanoma de Tumor Dorsal O tumor dorsal pigmentado de aspecto nodular no grupo controlo, ocupando % do volume do corpo do animal, é mostrado nas figuras 3 e 4. A figura 5 mostra, para o mesmo grupo, o aspecto macroscópico após a necropsia do tumor. Nessa figura, podemos observar o sistema de irrigação periférico (angiogénese) do tumor dorsal (melanona).
Grupo Trataro - Aspecto Macroscópico do Melanoma de Tumor Dorsal. O tumor dorsal pigmentado resultantes do grupo tratado é mostrado nas figuras 6 e 7. Podemos observar um pequeno tumor dorsal pigmentado, ausência de nódulos ou ulcerações. As áreas de necrose podem ser observadas como falta de crescimento tumoral. 0 aspecto macroscópico do sistema vascular e do exsudato peritumoral do tumor dorsal (melanoma) no grupo tratado são mostrados nas figuras 8 e 9. Uma redução do sistema de irrigação do tumor e do desenvolvimento de infiltrado celular e/ou seroso ao redor do tumor podem ser observada.
Determinação das fases do ciclo celular por citometria de fluxo dos tumores dorsais de melanoma tratados durante 14 dias com o composto HB-1 por via intraperitoneal.
As análises do ciclo celular do melanoma B16F10 tratado com 15 mg/Kg de HB-1 são mostradas na figura 10. Aliquotas das suspensões de células tumorais (106 célu-las/mL) para o grupo controlo que recebeu o veiculo Miglyol 810® e dos animais tratados com o composto HB-1 durante 14 dias por via intraperitoneal foram imediatamente congelados em citrato (2 mM) , sacarose (25 mM) e tampão dimetilsulfó-xido (DMSO) 0,05%, mantidas em nitrogénio liquido até o momento de uso. Após a amostra descongelar em banho de gelo, as células foram incubadas com 375 pL de tripsina 0,03 g/L (Sigma) durante 10 minutos, em temperatura ambien- te, e neutralizadas com inibidor de tripsina 0,5 g/L (Sigma), ribonuclease A 0,1 g/L (Sigma) e espermina 1,2 g/L (Sigma). As amostras foram analisadas por um citômetro de fluxo (Becton-Dickson) e a porcentagem de células foi avaliada para as diferentes fases do ciclo celular, nível de apoptose (Sub-Gl) e o teor de DNA em células quiescentes na fase S (G0/G1) e células em pré-mitose (G2/M).
Nossos resultados (Figura 11) demonstraram que o composto HB-1 diluído em Miglyol 810® reduz significativamente a população de células tumorais na fase G0/G1 do ciclo celular. Esse resultado demonstra que o composto HB-1 é capaz de impedir a multiplicação de células tumorais, com as mesmas qualidades que os fármacos quimioterápicos de rotina usados para o tratamento de neoplasia maligna humana, tais como doxorrubicina, metotrexato de sódio ou fármacos de última geração derivados do paclitaxel e do etoposídeo.
Análise dos Efeitos Citotóxicos e Antiprolife-rativos do Composto HB-1 e do Miglyol 810© como Controlo pelo método colorimétrico MTT em Células de Melanoma BI6F10.
Os efeitos citotóxicos e antiproliferativos das linhagens celulares e células normais foram realizados em diferentes concentrações do composto HB-1 diluído em Miglyol 810® e, como controlo, o diluente para todas as diluições realizadas e também quimioterapias comerciais foi usado (Paclitaxel, Etoposídeo). A metodologia colorimétrica para a via respiratória das mitocôndrias MTT (brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)2,5-difeniltetrazólio) foi usada, como descrito por MOSMANN (1983). Esse método baseia-se na redução de MTT ao formazano por células vivas. Após crescimento e confluência in vitro de células normais e tumorais, diferentes concentrações do composto HB-1 diluído em Miglyol 810® e do diluente-controlo (Miglyol 810®) foram adicionadas sobre as células aderidas, incubadas durante 24 horas. Após o referido período, 10 pL de MTT (5 mg/mL) foram adicionados e incubados durante 3 horas no fogão com CO2 a 5% a 37 °C. Após esse período, o conteúdo das placas de cultura foi centrifugado durante 2 minutos a 1800 rpm, a 4 °C, o sobrenadante foi removido e 100 pL de dimetilsul-fóxido (DMSO) foram adicionados para dissolver os cristais de formazano anteriormente constituídos e precipitados. As absorvâncias foram obtidas por um leitor de ELISA em comprimento de onda de 540 nm (TiterTek Multiskan) , com os resultados obtidos mostrados na figura 12.
Avaliação da IC50 para as células de melanoma B16F10 obtidas a partir da equação linear. IC50 = 7,0 pg/mL do composto HB-1 diluído em
Miglyol 810®.
Efeito citotóxico do composto HB-1 nos macrófagos normais peritoneais avaliados pelo método MTT.
Macrófagos peritoneais foram obtidos de ratinhos Balb-C normais através do seguinte procedimento: as cavidades abdominais dos animais foram abertas sob condições estéreis sob fluxo laminar e expostas. Um volume de 2 mL de solução salina, contendo 5000 U de heparina gelada (Liquemine-Roche), foi injetado na cavidade, seguido por uma massagem e coleta do liquido de irrigação de lavagem peritoneal, centrifugado a 2000 rpm por 10 minutos a 4 °C. A suspensão foi ressuspensa com meio de cultura RPMI-1640, suplementado com 10% de soro bovino fetal, com o número de contagem de células ajustado para 106/mL numa câmara de Neubauer. As aliquotas dos macrófagos foram cultivadas em placas de fundo plano de 96 poços, incubadas com e sem o composto HB-1 diluido em Miglyol 810®. Após 24 horas, as placas foram submetidas à avaliação do efeito citotóxico e antiproliferativo pelo método colorimétrico de MTT. Os resultados obtidos são mostrados na figura 13. IC50 = 16,89 pg/mL para o composto HB-1 diluido em Miglyol 810®.
Avaliação dos efeitos tóxicos avaliação pelo indice de caquexia (perda de peso corporal total) para o tratamento in vivo, durante 14 dias, por via intraperi-toneal para animais com melanomas dorsais e tratados com HB-2 e compostos conjugados (HB-1 + HB-2).
Animais do grupo controlo com um tumor dorsal de melanoma receberam, pela mesma via, um volume igual de diluente (100 pL de Miglyol 810®).
Antes de receber HB-2 e o conjugado HB-1 + HB2, os animais foram pesados diariamente e, aparentemente, não demonstraram modificações macroscópicas (perda de cabelo-alopecia) ou comportamental (mobilidade, irritabilidade ou euforia). Nossos resultados (figura 14) mostraram que os animais tratados com o composto HB-2 diluido em Miglyol 810® e o grupo controlo apresentaram comportamento semelhante à perda de peso, que era esperada para os animais com tumores. Por outro lado, os grupos de animais que receberam o conjugado (HB2 + HB1) não apresentaram modificações de perda de peso significativas durante o tratamento, e nenhuma perda de peso foi observada em comparação com os grupos de HB-2 e controlo. Nossos resultados mostraram que o conjugado, apesar de não ser eficiente para controlar o volume ou a área do tumor, apresenta baixa toxicidade in vi vo.
Análise dos parâmetros antitumorais in vivo (volume) para tratar o melanoma B16F10 com o composto HB-2 e o conjugado (HB-1 + HB-2). A análise do parâmetro antitumoral in vivo (volume) para tratar o melanoma B16F10 com o composto HB2-2 e (HB-1 + HB-2) é mostrada na figura 15.
Análise dos parâmetros antitumorais in vivo (área a volume) para tratar o melanoma B16F10 com o composto HB-2 e o conjugado (HB-1 + HB-2).
Após o implante de células tumorais, os animais foram tratados com o composto HB-2 diluído em Miglyol 810® e com o conjugado (HB2 + HB1), enquanto que o grupo com-trolo recebeu o mesmo volume de diluente e pela mesma via de administração (intraperitoneal - 100 pL) . Diariamente, os animais receberam os compostos (100 pL) e o grupo controlo recebeu Miglyol 810®, os animais foram pesados e os tumores foram medidos (comprimento x largura) e fotografados. Após o dia 14, os animais foram sacrificados por deslocamento cervical, os tumores foram removidos para realizar a necropsia e os órgãos internos e as lesões macroscópicas foram removidos para análise histopatológica.
Os parâmetros tumorais foram obtidos pelo cálculo da área média (A) e volume (V) do tumor, através das seguintes fórmulas A = nR2 e V = 4nR3' Os resultados são mostrados na figura 16.
Em relação aos efeitos antitumorais do tratamento de melanoma dorsal B16F10, os compostos HB-2 e a associação (HB-2 + HB-1) demonstraram sem importantes agentes antipro-liferativos, reduzindo significativamente a carga tumoral em 60% para o composto HB-2 e 80% para a associação (HB-1 + HB-2), respectivamente, para a área e o volume do tumor.
Análise dos Efeitos Citotóxicos e Antiprolife-rativos do Composto HB-2 diluído com Miglyol 810® e controlo de Miglyol 810® pelo método colorimétrico MTT nas células de melanona B16F10. IC50 = 90,28 pg/mL do composto HB-2 diluído em
Miglyol 810®. O tratamento in vitro do melanoma B16F10 com o composto HB-2 diluído em Miglyol 810® apresentou, conforme mostrado na figura 17, baixo efeito citotóxico em relação aos outros compostos, uma IC50 de cerca de 90,3 pg/mL obtida pela equação linear. Esse composto apresentou baixa toxicidade in vitro; no entanto, quando conjugado com o composto HB-1, ele demonstrou eficácia terapêutica antitu-moral in vivo com uma redução de 80% da área e volume do tumor.
Análise dos Efeitos Citotóxicos pelo método MTT e Efeitos Antiproliferativos para o composto HB-2 diluído em Miglyol 810® e controlo de Miglyol 810® em Fibroblastos
Humanos de Pele Normal.
Fragmentos de pele foram assepticamente coletados durante procedimentos cirúrgicos para a remoção de tecido em cirurgias estéticas e foram imediatamente transferidos para frascos estéreis de 50 mL contendo meio de cultura HAM F-12 (Gibco) suplementado com 20% de soro bovino fetal. Os fragmentos foram cortados e limpos, e os fragmentos menores foram cultivados em placas de Petri em meio de cultura de Ham-F12 suplementado com 10% de soro bovino fetal, e mantidos numa estufa umidifiçada a 37 °C e CO2 a 5%.
Ao atingir a subconfluência, as células foram tripsinizadas durante 5 minutos, inativadas com soro bovino fetal a 10%, centrifugadas durante 10 minutos a 2000 rpm a 4 °C, transferidas para placas de fundo plano de 96 poços e cultivadas durante 24 horas numa estufa de CO2 a 5%. Os fibroblastos foram tratados durante 24 horas, com diferentes concentrações do composto HB-2 diluído em Miglyol 810®, e o grupo controlo recebeu os mesmos volumes de Miglyol apenas; os efeitos citotóxicos e antiproliferativos foram avaliados pelo método colorimétrico do MTT.
Conforme mostrado na figura 18, nenhum efeito citotóxico foi observado em fibroblastos humanos normais após o tratamento com o composto HB-2 diluído em Miglyol 810®.
Análise dos Efeitos Citotóxicos pelo Método de MTT e dos Efeitos Antiproliferativos do Composto HB-1
Monossódico e do Controlo em Melanoma de Murino B16F10. IC50 = 1,9 pg/mL do composto DM-2.
Nossos resultados (figura 19) demonstraram que a composição do fármaco monossódico do composto HB-1 aumentou significativamente a resposta citotóxica em células de melanoma B16F10, exibindo CIso% = 1,9 pg/mL. A sua eficácia in vitro tem um aumento de 7,0 vezes em termos dos efeitos citotóxicos.
Análise dos Efeitos Citotóxicos pelo Método de MTT e dos Efeitos Antiproliferativos do Composto DM-1 e do
Controlo em Células de Melanoma de Murino B16F10. IC50 = 7,95 pg/mL do composto DM-1.
Nossos resultados (figura 20) demonstraram que a composição do fármaco para o composto DM-1 aumentou significativamente a resposta citotóxica em células de melanoma B16F10, exibindo CIso% = 7,95 pg/mL. In vitro, a eficácia em relação ao composto DM-2 monossódico é igual a cerca de 6,0 vezes menor.
Portanto, o derivado monossódico é melhor que o derivado dissódico. IC50 = 7,95 pg/mL do composto DM-1.
Avaliação do composto DM-2 nos linfócitos T.
Exemplo 9: Preparação dos linfócitos T
Grupos compostos por 5 ratinhos C57BL/6J de 2 meses de idade foram sacrificados por deslocamento cervical e a cadeia de linfonodos dos mesmos das regiões axilar, poplitea e mesentérica foi removida sob condições estéreis.
Os linfonodos foram mantidos em meio de cultura RPMI-1640 suplementado com 10% de soro bovino fetal inativado a 56 °C na presença de antibióticos, e o desdobramento foi realizado com o auxilio de um bisturi. A suspensão de células resultante foi filtrada através de membrana de diálise de 30 pm e centrifugada durante 10 minutos a 1800 rpm a 4 °C. O pelete celular foi ressuspenso em 5 mL de meio RPMI completo e, depois disso, incubado em placas de Petri contendo 10 mL de soro bovino fetal durante 1 hora em estufa, a 37 °C e CO2 a 5%. Após esse periodo, as células não aderidas, os linfócitos T, foram coletados e transferidos para tubos cónicos de 50 mL, centrifugadas e ressuspensas em meio RPMI-1640 completo. A concentração de células foi ajustada na câmara de Mallassez até uma concentração de 5 x 105 células/mL e a viabilidade celular foi determinada pelo método de exclusão com azul triptano.
As atividades citotóxicas e proliferativas foram determinadas numa placa de 96 poços e comparadas com a atividade mitogénica da fito-hemaglutinina (PHA) e avaliadas pelo método colorimétrico do MTT. Os valores obtidos foram expressos em porcentagem.
Os dados de cada experimento foram estatisticamente analisados pelo teste de variância ANOVA, com signi-ficância p<0,05.
Nossos resultados (figura 21) demonstraram que o tratamento de linfócitos com diferentes concentrações do composto DM-2 não induziram nenhuma atividade proliferativa dessas células em comparação com aquelas da fito-hemaglu-tinina (PHA) em concentrações ideais de 2,5 e 5,0 pg, como controlo positivo. Esses resultados mostraram que o compôs-to não apresenta nenhuma atividade tóxica sobre as células normais, e não é capaz de induzir uma atividade prolifera-tiva como uma resposta imunológica específica, que seria responsável por reações adversas, como a produção de imuno-complexos, reações alérgicas e de hipersensibilidade, ou autoimunes.
Toxicologia aguda e subcrônica do DM-2 em ratinhos Balb-c pela via endovenosa. LD50 = 14 mg/Kg/animal ~ 700 mg/peso corporal.
Os ratinhos Balb-c foram pesados e alojados no biotério, subdivididos em grupos de 5 animais por gaiola e, após duas semanas, receberam o composto DM-2 em diferentes concentrações por via endovenosa. O composto foi administrado em um volume de 0,2 mL, usando uma microsseringa, para todas as concentrações, através do plexo venoso retro-orbital. Após a administração, não observou-se nenhuma alteração comportamental, como diminuição da motilidade, exaustão, frequência de respiração prejudicada ou choque endovolêmico.
Após 24 horas, a mortalidade e a perda de peso corporal total dos animais tratados, foram observadas a fim de determinar a dose máxima tolerável (MTD); este grupo de animais foi observado durante 60 dias.
Nossos resultados (figura 22) demonstraram que a dose de 14 mg/Kg corresponde à 50% da dose letal (DL50) , bem como também foi, pela mesma via de administração, a dose máxima tolerável. Após a necropsia, no dia 30, nenhuma alteração macroscópica e histopatológica significativa foi observada para os órgãos internos.
Após a análise dos dados, para a atividade anti-tumoral e toxicidade in vivo anteriormente descritas, um breve comparativo pode ser estabelecido entre a ação das penta-1,4-dien-3-onas e seus derivados, e os fármacos atualmente utilizados na terapêutica, como a doxorrubicina, taxol e etoposídeo. A tabela a seguir lista essas comparações .
* Diferentes unidades dos outros, como os dados, foram obtidas por modelos experimentais pré-clinicos ao invés do cálculo de dose padrão obtido em seres humanos, tal como apresentado pelos fármacos da terapêutica. 0 composto DM-1 apresenta um valor de LD50 inferior em comparação com aqueles exibidos pelo taxol (1,75 vez menor) e doxorrubicina (35 vezes menores).
Durante os testes pré-clínicos, DM-1 não apresentou qualquer efeito sugestivo de toxicidade respiratória e cardíaca aguda, o que representa uma grande vantagem para explorar a série de compostos como potenciais fármacos antitumorais com menos efeitos colaterais antitumorais.
Deve-se ressaltar que os compostos mencionados também podem ser utilizados como tratamento e profilaxia para doenças neoplásicas causadas por cancro de pulmão, carcinoma de mama e vários cancros de mama resistentes a fármacos, cancro de pele não melanoma, leucemia linfoide, leucemia mieloide aguda e crónica, eritroleucemia, mielo-displasias, cancro de cólon, ovário, colo do útero, renal, pancreático, de próstata, sarcomas de tecido mole, hépato-carcinomas, osteossarcomas, cancro do sistema nervoso central, neuroblastomas, astrocitomas e cancro do aparelho orofaríngeo, da tireoide, gástrico e do aparelho reprodutor masculino.
Exemplo 10: Descrição Histológica
Os animais são sacrificados por deslocamento cervical e os fragmentos dos órgãos foram coletados nas áreas próximas da região tumoral, armazenados em frascos contendo formaldeído 10% e fixados para serem submetidos ao processamento histológico de rotina (PARDI, PC; SIMÕES, MJ, BINIVIGNAT, G.O - Uitrastructural study of the remodeling of the stroma of persistent-estrous rats - Rev. Chil. Cienc. Méd. Biol 3(2):61-65,1993).
Linhagens de células B16F10 de melanoma são implantadas em 5xl04 células por animal, a dose ideal para obter os resultados esperados e já citados para esse tipo escolhido de animal.
Todos os animais são tratados após o Dia 14 do implante de tumor e, em consequência, a sequência de necropsias inicia no Dia 15.
Para visualizar os resultados da administração de HB-1, os animais são alocados nos seguintes grupos:
Grupo controlo, os animais são identificados de 1 a 6, tratados com Miglyol 810® e mantidos sob regime de alimentação e água ad libitum;
Grupo HB-1, tratado com HB-1, diluido em Miglyol 810®, mantido sob regime de alimentação e água ad libitum.
Em ambos os casos, a dose administrada padrão é igual a 1,15 pg/Kg, via intraperitoneal, como a rota de administração eliciada.
Os animais são sacrificados por deslocamento cervical e a necropsia é realizada com o material imediatamente coletado e transferido para frascos contendo formal-deido 10% e, após um periodo de 1 a 2 dias, submetido a uma técnica histológica de rotina de acordo com o Hystology Technique Manual (Manual De Técnicas Para Histologia Normal E Patológica: Castro De Tolosa, Rodrigues, Behmer E Freitas Neto, Editora Manole 2003).
Essa técnica consiste na desidratação dos pedaços com concentrações crescentes de álcool, seguido por diafa-nização por xilol, impregnação com parafilme liquido a 57°C em estufa e, por fim, os blocos são embebidos em parafina em temperatura ambiente. O corte do bloco é realizado por um micrótomo LEICA semiautomático, com 7 pm de espessura máxima.
Após o corte, o material é mantido em banho-maria para ser transferido para placas finas de vidro previamente revestidas com albumina, para fixação do material.
Após o procedimento de fixação à placa fina, o método de coloração com hematoxilina/eosina Hystology Technique Manual (Manual (Manual De Técnicas Para Histologia -Normal E Patológica: Castro De Tolosa, Rodrigues, Behmer E Freitas Neto, Editora Manole 2003) é aplicado, pois o mesmo apresenta bons resultados para avaliação morfológica, principalmente aos componentes em cada bloco. A coloração é realizada da seguinte forma: - secagem da placa fina em estufa a 57 °C durante cerca de 20 minutos; - diafanização por corte em dois banhos de xilol; hidratação pela diminuição da quantidade de álcool (100%, 96%, 70%, 50%); lavagem em água destilada durante 30 minutos; - coloração com hematoxilina durante 30 segundos, seguido pela lavagem em água da torneira corrente para remover o excesso de corante; coloração com eosina durante 1 minuto; - desidratação com uma crescente quantidade de álcool (96%, 100%); - diafanização em xilol (dois banhos).
Após da coloração, as placas fins são montadas e, em seguida, analisadas por um microscópio ZEISS com uma câmera digital da marca AXIOCAM - MRC3, e as imagens resultantes foram processadas por um software AXIOVISON REL 4.2 (Cari Zeiss Inc.), registradas por um computador.
As observações histológicas e os resultados são ilustrados como a seguir:
Resultado A: Grupo Controlo - Administração de Mialvol 810®.
As figuras 23 e 24 mostram os fragmentos do tecido tumoral do grupo controlo: tumor dorsal implantado em ratinhos C57BL/6J tratados com diluente Miglyol 810® administrado por via intraperitoneal e sacrificados no Dia 14 do tratamento.
Pelas micrografias correspondendo às figuras 23 e 24, podemos observar a presença do tumor dorsal pigmentado nodular (A) , com grande área de necrose (B) e ausência de infiltrado inflamatório leucocítico (C).
Resultado B: Grupo HB-1 - diluído em Mialvol 810®. A análise histopatológica dos tumores dorsais dos animais com melanoma tratados com HB-1 diluído em Miglyol 810® é mostrada nas figuras 25 e 26.
Pode-se observar a presença de intenso infiltrado inflamatório leucocítico nas porções intra e peritumoral (A) ; a massa tumoral nodular infiltrada e com extensas áreas de necrose (B). A presença de um infiltrado de leucócitos nas porções peri e intratumoral demonstra que o tratamento no dia 14 com o composto HB-1 é capaz de induzir uma resposta imunológica específica, gerada pela interação entre o composto e as células tumorais ou, indiretamente, pelas interações com outros tipos celulares. Esse infiltrado inflamatório presente no tumor do melanoma tratado com o composto HB-1 não foi encontrado no grupo controlo, que recebeu o veículo (Miglyol 810®) do composto, nas mesmas condições experimentais e através da mesma via de administração. Por outro lado, esses resultados corroboram a eficácia antitumoral do composto HB-1 para inibir o crescimento e a disseminação de células tumorais; nenhuma lesão metastática foi encontrada no grupo de animais tratados, em comparação com o grupo controlo, no qual várias lesões ou nódulos tumorais foram encontrados no pulmão e nos gânglios linfáticos.
Resultado C: Grupo controlo - diluído em Mialvol 810®. A análise histopatológica dos tumores dorsais dos animais com melanoma tratado com Miglyol 810® é mostrada nas figuras 27 e 28.
Tumor dorsal nodular pigmentado (A) , vasculari-zado (*) e com grandes áreas de necrose (B e D) e ausência de infiltrado inflamatório leucocítico intra e peritumoral (C) .
Resultado D: Metástase do Parênquima Luna A análise histopatológica da metástase do parênquima pulmonar é mostrada nas figuras 29 e 30.
Nenhuma alteração de espessura ou de ruptura do epitélio bronquiolar, alterações de congestão ou deposição de fibrina e substâncias pigmentadas, bem como a presença de infiltração inflamatória nos animais tratados com o composto HB-1 foi observada (figura 29), em comparação com o grupo controlo (figura 30) . A presença dos nódulos ou massas metastáticas não foi observada (figura 29) . Por outro lado, os animais do grupo controlo demonstraram várias lesões metastáticas próximas da cápsula do pulmão contendo células tumorais no pigmento de melanina, sem a presença de um infiltrado inflamatório (A) .
Resultado E: Análise de histopatologia dos órgãos internos
Os resultados de histopatologia dos órgãos internos, como o fígado e rins, são mostrados nas figuras 31 e 32, respectivamente. Os resultados mostram parênquimas normais preservados, sem sequelas ou processos inflamatórios consideráveis. Na figura 31, podemos observar hepatócitos bem preservados, com lóbulos e trabéculas bem definidos em um padrão radial. Pode-se também observar que a veia central está bem preservada com sinusoides típicos. Na figura 32, corpúsculos do rim bem preservados típicos evidentes, túbulos enrolados distais e proximais também bem preservados, não apresentando qualquer alteração estrutural, são mostrados.
Os órgãos internos dos animais com melanoma dorsal e tratados com diluente Miglyol 810® estavam normais em todos os cortes, sem processos inflamatórios ou infiltrados, ou qualquer outro tipo de alteração que poderia ser correlacionada com efeitos tóxicos ou deposição do diluente nas áreas adjacentes ou massa tumoral.
Parte 3: Atividade antiparasita A presente invenção refere-se também à ação antiparasita para os derivados acima mencionados listados nas figuras da parte 1 desse item.
Os compostos aqui apresentados foram avaliados quanto aos seus efeitos in vitro sobre a proliferação e/ou viabilidade de formas promastigotas de diferentes isolados de Leishmania spp que causam a leishmaniose tegumentar americana e sobre a proliferação e/ou a viabilidade das formas tipo amastigotas de Leishmania amazonensis.
Os ensaios para medir a inibição da proliferação são executados pela incubação de diferentes concentrações dos compostos, que varia de 100,00 a 3.12 pg/mL e número de parasitas entre 1,0 x 106 a 2,0 x 106 por mililitro do meio de cultura, para alcançar volumes totais entre 2 e 20 mL de cultura, conforme necessário para o experimento. Os compostos são solubilizados com dimetilsulfóxido (DMSO) para produzir uma solução estoque, da qual amostras com diferentes concentrações são obtidas, pela adição do meio de cultura em um volume suficiente, conforme necessário, para atingir a primeira concentração desejada, com as outras concentrações sendo obtidas por diluição em série dessa primeira, com uma razão 2. As culturas são incubadas a 22°C ou a 34°C, respectivamente para os promastigotos e amastigotos.
Como um controlo positivo para a avaliação de viabilidade do parasita, apenas o meio de cultura e o parasita, sem qualquer outra adição, foram usados. Como comtrolo de toxicidade para o solvente presente na composição do composto, as formas de parasita foram incubadas com DMSO diluído em meio de cultura.
Para quantificar os promastigotos, câmaras de Neubauer são usadas e as culturas são quantificadas a cada 24 horas durante todo o período de incubação, programado para cada experimento. As amostras são preparadas a partir de uma diluição inicial de 20 pL de cultura em 180 pL da solução salina formulada (PBS + formaldeído 2%) para obter uma diluição 1/10. Sempre que necessário, diluições em série podem ser realizadas a partir da primeira diluição. Para todos os experimentos, as formas do parasita devem ser incubadas com várias concentrações de HB-1, seus respectivos controlos com DMSO (deve-se ter em mente que a solução estoque de HB-1 inicial foi preparada com DMSO, e que a sua toxicidade em relação às formas de parasita devem ser avaliadas) e a cultura normal, sem qualquer componente adicionado ao meio. As contagens são realizadas como duplicatas, por duas pessoas diferentes, e o resultado final é expresso como a média aritmética das duas contagens. 0 mesmo procedimento é utilizado para quantificar as formas amastigotas.
Os compostos apresentaram bons perfis inibitórios para a proliferação de promastigotos, desde as primeiras 24 horas de cultura e em meio de cultura diferente.
Os compostos foram também muito promissores face à capacidade proliferativa inibitória dos semelhantes a amastigotos, com essas formas sendo extremamente sensíveis para os compostos. Nas primeiras 48 horas de incubação, 100% dos parasitas se transformou em formas não viáveis por todas as concentrações analisadas dos compostos e, já nas primeiras 24 horas, as concentrações de 10 pg/mL e 20 pg/mL inibiram a atividade celular de 100% dos amastigotos.
Esse resultado é extremamente relevante, uma vez que essa forma intracelular é o alvo estabelecido para os agentes antiparasitários no tratamento das infecções humanas.
Ensaios de viabilidade e/ou de proliferação de células das formas promastigota e amastigota também são realizados pelo método do MTT (brometo de difeniltetrazólio 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]2,5-brometo) , conforme descrito por Moreira, et ai. (Moreira, Μ. E. C., Del Portillo, H. A., Milder, R. V., Balanço, J. M. F. e Barcinski, Μ. A. Heat shock induction of apoptosis in promastigotes of the unicellular organism Leishmania (Leishmania) amazonensis, J. Cell Physiol. 167,305-313,1996), modificado.
Após a incubação das formas parasitárias com os compostos, como descrito acima, por periodos predeterminados de tempo para cada experimento (24, 48, 72 horas, etc.),uma aliquota de 1,0 mL da suspensão celular é recolhida de cada tubo de cultura ou frasco e transferida para tubos de microcentrifuga, onde eles são centrifugados a 14.000 rpm durante 3 minutos, o meio de cultura é aspirado e descarregado. É adicionado às células sedimentadas 200 pL de PBS. Depois disso, o volume em PBS das suspensões celulares é dividido em dois poços (cada um de duplicatas de 100 pL) de uma placa de cultura de 96 poços. A cada duplicata, 20 pL de MTT (solução estoque 5 mg/mL, 1,0 mg/mL de concentração final) são adicionados. Após lh ou lh 30min, a uma temperatura de 22°C (promastigotos) ou a 34°C (amastigotos), 100 pL de SDS 10% são adicionados a cada bem para interromper a reação, para lisar as células e para dissolver os cristais de formazano, resultando numa solução azul homogénea apropriada para medir a absorvância através de um espectrofotômetro para microplacas de cultura (modelo 3550 BIORAD, Richmond, CA) , a 595 nm como comprimento de onda de teste e 690 nm como o comprimento de onda de referência .
Os valores de densidade óptica (D.O.) correspondem à redução enzimática do MTT pelas células metabólicas ativas. Consequentemente, a D.O. é diretamente proporcional ao número de células viáveis da suspensão celular. O aumento progressivo da D.O. indica a proliferação celular. Os resultados são expressos como a média aritmética das duplicatas de densidade óptica.
Os brancos da reação são obtidos pela incubação do meio específico empregado em cada ensaio, além do MTT, e diferentes concentrações de HB-1. A cor amarelo-acastanhado do HB-1 exerce certa interferência sobre o ensaio colorimé- trico em diferentes magnitudes, de acordo com o meio e com a concentração de HB-1. Em geral, a D.O. do branco variou entre os ensaios de 0,002 a 0,020.
As atividades e os resultados observados são ilustrados a seguir:
Exemplo 11: Efeito do composto HB-1 sobre a proliferação da forma promastigota de Leishmania (L) amazonensis em meio de cultura de Warren.
As formas promastigotas da Leishmania (L) amazonensis (isolado LV79, 8a passagem para o meio de cultura, dia 7 de cultura, fase estacionária) são incubadas numa proporção de 106 promastigotos/mL no meio de Warren, com 3,0 mL de volume final, na presença de diferentes com-centrações de HB-1 e dos respectivos controlos em volume equivalente de DMSO e meio de cultura, como controlo positivo para a proliferação e a viabilidade. O efeito do HB-1 sobre os promastigotos de Leishmania amazonensis cultivados em meio de Warren é mostrado na seguinte tabela e na figura 33. VE: representa o controlo individual de cada concentração de HB-1 obtida por incubação do parasita em um meio contendo o volume de DMSO equivalente àquele utilizado para obter concentrações finais diferentes de HB-1, respec- tivamente.
Como pode ser observado na tabela a seguir e na figura 33, todas as concentrações de HB-1 (de 100 pg/mL a 3,12 pg/mL) inibem a proliferação dos promastigotos, em proporções diferentes, desde as primeiras 24 horas de cultura. As concentrações de 25 pg/mL, 50 pg/mL e 100 pg/mL inibem, respectivamente, 81%; 95,8% e 100% da proliferação do parasita após 72 horas de incubação, e atingem 100% de inibição em 120 horas de cultura.
Portanto, nesse período, 100% dos parasitas são mortos. Consequentemente, verificamos que, na condição experimental acima relatada, as concentrações efetivas de HB-1 para produzir 100% de inibição da proliferação de promastigotos (= 100% de mortalidade) estão relacionadas com o tempo de incubação. Portanto, 100% de mortalidade é alcançado em 120 horas, em 96 horas ou em 72 horas de cultura, quando as concentrações de HB-1 tem, respectiva-mente, concentrações de 25 pg/mL, 50 pg/mL ou 100 pg/mL. Concentrações de 12,5 pg/mL a 3,12 pg/mL mostraram ser subletais, porque a inibição da proliferação está presente até 72 horas do cultivo.
Exemplo 12: Efeito do composto HB-1 em promastigotos de Leishmania (L) amazonensis em meio de cultura RPMI.
As formas promastigotas de Leishmania (L) amazonensis (isolado LV79, Ia passagem em meio de cultura, dia 7 de cultura, fase estacionária) são incubadas a uma proporção de 106 promastigotos/mL de meio RPMI, com volume final de 3,0 mL na presença de diferentes concentrações de HB-1 e dos respectivos controlos em DMSO. O efeito do composto HB-1 sobre a proliferação dos promastigotos de Leishmania (L) amazonensis em meio RPMI foi demonstrado na tabela a seguir e na figura 34.
VE: representa o controlo individual de cada com-centração de HB-1 obtida por incubação do parasita em um meio contendo o volume de DMSO equivalente àquele utilizado para obter concentrações finais diferentes de HB-1, respec- tivamente.
Podemos observar que o composto HB-1 é capaz de inibir a proliferação de promastigotos de Leishmania em todas as concentrações utilizadas (de 100 pg/mL a 3,12 pg/mL), quando o meio de cultura utilizado é o RPMI. O efeito inibidor é particularmente evidente nestas condições experimentais. Conforme é mostrado pela tabela anterior e pela figura 34, desde as primeiras 24 horas de cultura, há um importante efeito inibidor do HB-1, com todas as concentrações testadas e, em 48 horas de cultura, podemos observar 100% do efeito inibidor (= 100% de mortalidade) com concentrações de 100 pg/mL a 12,5 pg/mL.
Exemplo 13 Determinação de viabilidade para a forma promastigota de Leishmania (L) amazonensis tratada com HB-1, em meio de cultura RPMI.
Nesse ensaio, a viabilidade da forma de promastigota de Leishmania é avaliada pelo método de MTT, quando incubada em meio RPMI, na presença de HB-1 ou de seus respectivos controlos em DMSO. Também é possível verificar se o efeito do HB-1 poderia ser detectado na fase estacionária da curva de crescimento.
Para as incubações, os promastigotos do isolado LV79 na Ia passagem e no dia 7 de cultura são utilizados, de 1,0 x 106/mL como inoculo inicial. O volume reacional final é de 3,0 mL. Os resultados da determinação de viabilidade para as formas promastigotas de Leishmania (L) amazonensis tratadas com HB-1 em meio RPMI são mostrados na tabela a seguir e na figura 35.
VE: representa o controlo individual de cada concentração de HB-1 obtida por incubação do parasita em um meio contendo o volume de DMSO equivalente àquele utilizado para obter concentrações finais diferentes de HB-1, respectivamente.
Os resultados apresentados na tabela anterior e na figura 35 mostram que, desde as primeiras 24 horas de incubação, todas as concentrações de HB-1 entre 6,25 pg/mL e 100 pg/mL comprometem, irreversivelmente, a viabilidade celular, porque não há evidências de recuperação nos últimos tempos de incubação.
Através da observação da atividade mitocondrial, a medida pelo MTT em 144 horas de incubação, da comparação entre o controlo reacional (sem HB-1) e as outras reações, nós poderíamos demonstrar claramente que o HB-1 age tornando as células não viáveis, tanto na fase exponencial quanto na fase estacionária da curva de crescimento.
Essas análises confirmam os resultados obtidos através da quantificação da câmara de Neubauer. Nós podemos observar que a HB-1, nas concentrações acima de 12,5 pg/mL, tem um efeito de morte de leishmânia evidente, na medida em que as células não se recuperam ao longo da curva de crescimento. A concentração de 6,25 pg/mL revela um efeito leishmaniótico; no entanto, é incapaz de tornar 100% das formas promastigotas não viáveis. O efeito do HB-1 sobre a atividade mitocondrial pode ser observado tanto na fase exponencial quanto na fase estacionária do crescimento do parasita.
Exemplo 14: Avaliação do efeito do HB-1 nos isolados de Leishmania que causam a leishmaniose cutânea localizada (L.C.L.) e a leishmaniose cutânea difusa (D.C.L.) pelo método de MTT.
Esse experimento é desenvolvido no meio de Warren usando um inoculo inicial de 2,0 x 106/mL do meio para os isolados. As culturas estavam no 7° dia de passagem e no
crescimento da fase exponencial final (6° dia de incubação) . Os resultados da determinação de viabilidade para os promastigotos de Leishmania (isolado de L.C.L.), incubados em meio de Warren e na presença de HB-1, são mostrados na tabela a seguir e na figura 36. 0 volume final da cultura é 5 mL e as reações do MTT são processadas em lhe 30 minutos de incubação, começando com 1,0 mL de cultura.
VE: controlo individual de cada concentração de HB-1 obtida por incubação do parasita em um meio contendo uma quantidade equivalente de DMSO.
Conforme mostrado pela tabela anterior e pela figura 36, o isolado de L.C.L. é extremamente suscetível à ação do HB-1. O efeito desse composto nas células é claramente dose-dependente, de modo que a concentração de 5 pg/mL causa apenas uma inibição parcial da proliferação, a concentração de 10 pg/mL tem um efeito leishmaniótico e a concentração de 20 pg/mL mata as leishmânias.
Na tabela a seguir e na figura 37, são mostrados os resultados da determinação de viabilidade para os
promastigotos de Leishmania (isolado de D.C.L.) incubados em meio de Warren, na presença de HB-1.
ΙΤΕΜΡΟ DE INCUBAÇÃO (horas) VE: representa o controlo individual de cada concentração de HB-1 obtida por incubação do parasita em um meio contendo o volume de DMSO equivalente àquele utilizado para obter concentrações diferentes.
Em relação ao D.C.L. isolado, os resultados são semelhantes (tabela anterior e figura 37), mostrando um efeito claro do HB-1 na viabilidade do promastigoto. No entanto, nesse caso, os parasitas parecem ser mais sensíveis ao composto, porque a partir de 10 pg/mL, podemos observar o efeito de morte de leishmaniose, enquanto que para o L.C.L., o efeito do composto com esta dose foi apenas leishmaniostático.
Exemplo 15: Avaliação do efeito de HB-1 sobre as formas tipo amastigotas de Leishmania (L) amazonensis.
Considerando que as formas de amastigoto são aquelas que se multiplicam dentro de um hospedeiro vertebrado e, consequentemente, que são responsáveis pela doença, é indispensável avaliar a viabilidade dessas formas quando incubadas com HB-1.
Essa avaliação é realizada como descrito ante-riormente e aplicando as formas amastigotas obtidas a partir de uma cultura axénica. Os resultados são mostrados na tabela a seguir:
VE: representa o controlo individual de cada concentração de HB-1 obtida por incubação do parasita em um meio contendo o volume de DMSO equivalente àquele utilizado para obter concentrações finais diferentes de HB-1, respec- tivamente.
Conforme mostrado pela tabela anterior, as formas amastigotas mostraram ser extremamente sensíveis ao HB-1. Nas primeiras 48 horas, 100% dos parasitas se tornam não viáveis por todas as concentrações de HB-1 analisadas e, já nas primeiras 24 horas, as concentrações de 10 pg/mL e 20 pg/mL inibem a atividade celular de 100% dos amastigotos.
Deve-se enfatizar que os compostos mencionados também podem ser utilizados para tratar parasitoses humanas e/ou animais causadas por protozoários de tecido, sangue, ou intestinais, ou protozoários dos gêneros Leishmahia, Plasmodium, Trypanosoma, Toxoplasma, Giardia, Entamoeba e outros parasitas helminticos como Taenia, Schistosoma, Ancylostoma, Necator, Ascaris, Enterobius e Wuchereria, em suas diferentes manifestações clinicas.
Lisboa, 23 de Dezembro de 2014

Claims (10)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Processo para preparar monofenolatos e dife- nolatos de estrutura II:
    caraterizado por colocar em contato um composto de estrutura I na presença de um alcóxido metálico ROM numa razão molar entre 1:1 e 1:2 e um álcool ROH como solvente, em que: X pode ser um átomo de oxigénio, um grupo malonitrila ou um grupo cianoacetato de alquila; Y pode ser um átomo de hidrogénio ou um cátion de sódio estabilizante, sob a forma de um ion fenóxido; Z representa grupos nitro e amina e compostos não substituídos em tal posição (Z=H); e M representa um catião de sódio que estabiliza o composto sob a forma de um ião fenóxido.
  2. 2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a 1,5-bis (4-hidróxi-3-metoxifenil)penta-1,4-dien-3-ona ser misturada com uma solução etanólica de etóxido de sódio seguido por rotaevaporação do solvente até a formação de um sólido.
  3. 3. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado por os sais monossó-dicos e/ou dissódicos resultantes passarem por uma peneira para obter um pó fino que pode ser solubilizado sem dificuldade em água e utilizado nos testes biológicos reivindicados abaixo.
  4. 4. Composto caracterizado por ser 4—[5—(4— hidróxi-3-metoxifenil)-3-oxopenta-l,4-dienil]-2-metoxife-nolato ou 3-oxopenta-l,4-dienilbis(2-metoxifenolato sódi-co) .
  5. 5. Composição farmacêutica, caracterizada por compreender uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto, conforme definido na reivindicação 4, e um veiculo farmaceuticamente aceitável.
  6. 6. Compostos, conforme definido na reivindicação 4, caracterizados por serem usados no tratamento de cancros e doenças parasitárias em seres humanos e animais.
  7. 7. Compostos, de acordo com a reivindicação 6, caracterizados por serem para uso no tratamento e profilaxia de doenças como o cancro de pulmão, cancro de mama e cancro de mama resistente a múltiplos medicamentos, cancro de pele não melanoma e melanomas, leucemias linfoides, leucemias mieloides agudas e crónicas, eritroleucemia, mielo-displasia, cancros do cólon, ovário, colo do útero, rins, baço, próstata, sistema nervoso central, orofaringe, ti-róide, estômago e aparelho reprodutor masculino, sarcomas de tecido mole, hepatocarcinomas, osteossarcomas, neuro-blastomas e astrocitomas.
  8. 8. Compostos, de acordo com a reivindicação 6, caracterizados por as doenças parasitárias humanas e/ou animais serem causadas por protozoários de tecido, sangue ou intestino selecionados do grupo consistindo nos gêneros Leishmania, Plasmodium, Trypanosoma, Toxoplasma, Giardia, ou Entamoeba, e helmintos selecionados do grupo consistindo nos gêneros Taenia, Schisto-soma, Ancylostoma, Necator, Ascaris, Enterobius ou Wuchereria.
  9. 9. Compostos, de acordo com a reivindicação 8, caracterizados por o protozoário ser Leishmania (L) amazo- nensis.
  10. 10. Compostos, de acordo com a reivindicação 4, caracterizados por serem usados como imunoestimuladores no tratamento de patologias imunossupressoras, imunodeficien-tes e degenerativas em seres humanos e em animais. Lisboa, 23 de Dezembro de 2014
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