DE10241287A1 - 9-Benzyliden-naphtho-[2,3b]-thiophen-4-one als neue Inhibitoren der Tubulin-Polymerisation - Google Patents

Abstract

Die erfindungsgemäßen 9-Benzyliden-naphtho-[2,3b]-thiophen-4-one der allgemeinen Formel DOLLAR F1 haben sich als sehr potente Hemmstoffe des Tumorzellwachstums und der Tubulinpolymerisation erwiesen. Sie sind daher zur Behandlung von Erkrankungen geeignet, die mit einer erhöhten zellulären Proliferation einhergehen. Die erfindungsgemäßen Tubulin-bindenden Substanzen können somit beispielsweise als wirkungsvolle anti-Krebs wirksame Verbindungen fungieren.

Description

• Die vorliegende Erfindung betrifft neuartige Hemmstoffe der Tubulinpolymerisation. Es handelt sich um 9-Benzyliden-naphtho-[2,3b]-thiophen-4-one und deren Derivate als anti-Tumor wirksame Verbindungen.
• Hintergrund der Erfindung
• Krebs stellt eine der größten Gesundheitsbedrohungen der Menschheit dar, und deshalb werden beträchtliche Anstrengungen hinsichtlich der Entwicklung neuer Chemotherapeutika für eine potentere und spezifischere anti-Krebs-Therapie unternommen. Die Zellen eines jeden Organismus befinden sich in einem exakt geregelten homöostatischen Gleichgewicht zwischen Wachstum (Proliferation), Differenzierung (zelluläre Spezialisierung) und programmiertem Zelltod (Apoptose). Das augenfälligste und medizinisch bedeutsamste Merkmal von Krebszellen ist deren unkontrollierte Vermehrung. Die zelluläre Proliferation ist ein Resultat der Zellteilung oder Mitose.
• Mikrotubuli besitzen eine herausragende Bedeutung für verschiedenste Funktionen der Zelle, darunter etwa für die Mitose, die Bewegung der Zelle, die Zellform sowie auch für den Transport von Organellen innerhalb der Zelle. Bei den Mikrotubuli handelt es sich um eine eigene Klasse von Zytoskelett-Bestandteilen. Die Bedeutung der Mikrotubuli für das zelluläre Leben und speziell für die Zellteilung und damit verbunden für die Induktion und das Fortschreiten der Apoptose machen sie zu einem der attraktivsten therapeutischen Targets für die Entwicklung neuer Verbindungen mit Bedeutung für die anti-Krebs-Chemotherapie. Tubulin zusammen mit seinen Isoformen bildet den Hauptbestandteil der Mikrotubuli und existiert seinerseits als Heterodimer der beiden globulären Polypeptiduntereinheiten α- und (β-Tubulin. Beide Peptide besitzen eine molekulare Masse zwischen 50–55 kDa. Unter physiologischen Bedingungen polymerisiert das Tubulin zu Mikrotubuli. Im Zuge des Einbaus des α/β-Dimers in den Mikrotubulus bindet das Heterodimer zwei Moleküle Guanosintriphosphat (GTP) und hydrolysiert eines davon zu GDP und anorganischem Phosphat. Elektronenmikroskopische Untersuchungen und Röntgenstrukturanalysen belegten den Aufbau des Mikrotubulus aus 13 parallelen, versetzt angeordneten Protofilamenten, die einen Hohlraum umschließen. Mikrotubuli werden ständig auf- und abgebaut, sie zeigen eine dynamische Instabilität. Für zahlreiche natürlich vorkommende antimitotisch wirksame Verbindungen konnte gezeigt werden, dass sie ihren Effekt durch eine Bindung an das Tubulin ausüben. Die sogenannten MAPs („mikrotubuli-assoziierte Proteine") oder andere in das Geschehen der Mitose involvierte Proteine spielen hier eine eher untergeordnete Rolle. Allgemein kennt man drei Hauptklassen antimitotisch wirksamer Verbindungen. Es handelt sich einmal um Mikrotubuli-stabilisierende Verbindungen, um Substanzen die an die Vinca-Alkaloid-Bindestelle binden sowie um Substanzen die an der Colchicin-Bindestelle angreifen. Erstere wirken durch Bindung und somit Blockade der Depolymerisation, die beiden zuletzt genannten Verbindungsklassen entfalten ihre Wirkung dagegen primär durch eine Hemmung der Tubulin-Polymerisation. Einige klinisch vielversprechende Substanzen mit dokumentierter zytotoxischer und anti-Tumor-Wirkung wirken durch eine Interaktion mit dem Prozess der Mikrotubuli-Assemblierung-Desassemblierung oder der Mikrotubulidynamik, was letztlich zu einer Blockade des Zellzyklus in der Mitosephase sowie zur Induktion von Apoptose führt.
• Unter den bedeutendsten anti-Mikrotubuli wirksamen Substanzen zur Krebstherapie befinden sich die Vinca-Alkaloide, so z.B. das Vinblastin und das Vincristin sowie die neueren Taxane wie das Paclitaxel (Taxol) und das Docetaxel (Taxotere), welche erfolgreich in die klinische Onkologie eingeführt wurden. Beim Colchicin handelt es sich um eine weitere wichtige, antimitotisch wirksame Substanz. Obwohl Colchicin auf Grund des sehr kleinen therapeutischen Fensters eine nur sehr eingeschränkte medizinische Anwendbarkeit besitzt, spielte die Substanz eine fundamentale Rolle bei der Aufklärung der Eigenschaften und Funktionen des Tubulins und der Mikrotubuli. Weiterhin üben die Naturstoffe Combretastatin A-4 and A-2^1,2, Curacin A³, Podophyllotoxin⁴, die Epothilone A and B⁵, das Dolastatin⁶, sowie einige synthetische Verbindungen wie das Indanocin⁷, das Phenstatin⁸, das Indolylglyoxylamid D-24851⁹ oder die 2-Styrylchinazolin-4(3H)-one¹⁰ ihre zytotoxischen Eigenschaften über eine Bindungsinteraktion mit dem Tubulin aus. Die spezifischen Interaktionen mit der Bindungsstelle sind in vielen Fällen nicht vollständig bekannt und für eine ganze Anzahl von Tubulin-bindenden Substanzen weitestgehend unbekannt.
• Gegenstand der Endung
• Die gegenwärtige Erfindung betrifft neue Inhibitoren der Tubulinpolymerisation mit Anthracenonstruktur sowie deren Analoga. Es wurde nun gefunden, dass bestimmte 9-Benzyliden-naphtho-[2,3b]-thiophen-4-one potente Inhibitoren der Tubulinpolymerisation sind und daher zur Behandlung von Erkrankungen geeignet sind, die mit einer erhöhten zellulären Proliferation einhergehen. Die erfindungsgemäßen Tubulin-bindenden Substanzen können somit beispielsweise als wirkungsvolle anti-Krebs wirksame Verbindungen fungieren.
• Kurze Beschreibung der Abbildungen
• Die folgenden Abbildungen sind Bestandteil der vorliegenden Patentschrift und dienen dem besseren Verständnis sowie der Spezifizierung der gegenwärtigen Erfindung.
• 1 zeigt das Reaktionsschema für die Synthese des Naphtho-[2,3b]-thiophen-4-ons.
• 2 zeigt ein representatives Reaktionsschema für die Synthese der erfindungsgemäßen 9-Benzyliden-naphtho-[2,3b]-thiophen-4-one.
• 2 zeigt den Effekt von Verbindung AZ 16 auf das Wachstum humaner chronisch myelogener K562 Zellen. Die Zellen wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen der zu prüfenden Verbindung über einen Zeitraum von 48 h behandelt und die Zellzahl durch Zählung mittels eines Hämozytometers (Neubauer-Kammer) bestimmt. Der 100% Wert entspricht einer Zellzahl von 1.20 × 10⁶ K562-Zellen pro ml. Die Ausgangszellzahl wird subtrahiert. Die Werte repräsentieren das Mittel ± SD (Standardabweichung) aus sechs Proben; Balken, SD.
• 4 zeigt die Assemblierung des Tubulins in Gegenwart von Verbindung AZ16 in PIPES-Puffer bei pH = 6.8 und 37 °C. Die Tubulinkonzentration beträgt 1.1 × 10^–5 M.
• Detailierte Beschreibung der Erfindung
• Gegenstand der Erfindung sind Benzyliden-Verbindungen der allgemeinen Formel I,

  

  worin die erfindungsgemäßen Verbindungen als Gemisch geometrischer Isomere (E/Z-Isomere) oder in Form eines der beiden denkbaren Isomere (E-Isomer oder Z-Isomer) vorliegen können und einen oder mehrere Substituenten (R1–R5) enthalten. Bevorzugte Verbindungen gemäß der Erfindung sind die in Tabelle I dargestellten sowie die in den Beispielen exemplarisch aufgeführten Verbindungen. Eine besonders bevorzugte Verbindung der allgemeinen Formel I ist diejenige mit R² = OCH₃, R³ = OH und R⁴ = OCH₃.
• Representativ für die erfindungsgemäßen Verbindungen stehen die im Folgenden aufgeführten:
  9-(3-Hydroxy-4-methoxy)-benzyliden-naphtho-[2,3b]-thiophen-4-on (AZ 1); 9-(4-Hydroxy-3-methoxy)-benzyliden-naphtho-[2,3b]-thiophen-4-on (AZ 9); 9-(3,4,5-Trimethoxy)-benzyliden-naphtho-[2,3b]-thiophen-4-on (AZ 10); 9-(3,5-Dimethoxy-4-hydroxy)-benzyliden-naphtho-[2,3b]-thiophen-4-on (AZ 16); 9-(2,4-Dimethoxy-3-hydroxy)-benzyliden-naphtho-[2,3b]-thiophen-4-on (AZ 17); 9-(4-Methoxy)-benzyliden-naphtho-[2,3b]-thiophen-4-on (AZ 18); 9-Benzyliden-naphtho-[2,3b]-thiophen-4-on (AZ 24); 9-(4-Nitro)-benzyliden-naphtho-[2,3b]-thiophen-4-on (AZ 27); 9-(3,5-Dichlor)-benzyliden-naphtho-[2,3b]-thiophen-4-on (AZ 29); 9-(3,4-Dimethoxy)-benzyliden-naphtho-[2,3b]-thiophen-4-on (AZ 30); 9-(3,4-Dihydroxy)-benzyliden-naphtho-[2,3b]-thiophen-4-on (AZ 31);
• Im Einklang mit der vorliegenden Erfindung kann die beschriebene Phenylalkyliden C-10 Einheit (Benzylidenstruktur) durch eine Struktur mit terminaler heterocyclischer Gruppe wie Thiophen, Pyrrol oder Imidazol ersetzt (modifiziert) werden.
• Antineoplastischer Effekt
• Die erfindungsgemäßen Verbindungen besitzen eine anti-Tubulin-Wirkung durch Hemmung der Tubulinassemblierung (Polymerisation). Die erfindungsgemäßen tubulinbindenden Verbindungen sind daher brauchbar als neue anti-Krebs wirksame Verbindungen.
• Salze
• Die Erfindung beinhaltet ebenfalls die pharmazeutisch verträglichen Säuren- und Basenadditionssalze der Verbindungen zur pharmazeutischen Anwendung. Die pharmazeutisch verträglichen Salze können Basenadditionssalze sein. Dazu zählen Salze der Verbindungen mit Metallen und Aminen, wie Alkali- oder Erdalkalimetallen oder organischen Aminen. Beispiele für brauchbare Metallkationen wären Natrium, Kalium, Magnesium, Calcium und dergleichen. Eingeschlossen sind auch Schwermetallsalze mit den Kationen Silber, Zink, Kobalt, und Cer. Beispiele für brauchbare Amine sind N,N'-Dibenzylethylendiamin, Chlorprocain, Cholin, Diethanolamin, Ethylendiamin, N-Methylglucamin, und Procain. Pharmazeutisch verträgliche Säureadditionssalze der Verbindungen werden diejenigen, die mit organischen und anorganischen Säuren gebildet werden. Beispiele geeigneter Säuren zur Salzbildung sind Salzsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Essigsäure, Zitronensäure, Oxalsäure, Malonsäure, Salicylsäure, Äpfelsäure, Gluconsäure, Fumarsäure, Bernsteinsäure, Ascorbinsäure, Maleinsäure, Methansulfonsäure, und dergleichen. Die Salze können durch Behandlung der freien basischen Form mit einer ausreichenden Menge der gewünschten Säure unter Bildung eines Monosalzes, Disalzes, etc. auf herkömmliche Art und Weise erhalten werden. Die freie basische Form kann durch Behandeln eines Salzes mit einer Base regeneriert werden. Es können z.B. verdünnte Lösungen der wässrigen Base verwendet werden. Verdünntes wässriges Natriumhydroxid, Kaliumcarbonat, Ammoniak und Natriumhydrogencarbonat sind für diesen Zweck brauchbar. Die freien basischen Formen unterscheiden sich von den Salzen in einigen physikalischen Eigenschaften wie z.B. der Löslichkeit in polaren Solventien, die Salze verhalten sich jedoch entsprechend den basischen Formen im Sinne der Erfindung.
• Depolymerisation von Tubulin
• Die erfindungsgemäßen Verbindungen binden an Tubulin. Durch Bindung der erfindungsgemäßen tubulinbindenden Substanzen kommt es zu einer Hemmung der Tubulinassemblierung (Polymerisation). Ein geeigneter Assay zur Feststellung der Tubulinwirksamkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen findet sich in den angegegeben Beispielen.
• Behandlung proliferativer Erkrankungen
• Die erfindungsgemäßen Verbindungen haben sich als potente Inhibitoren der Tubulinpolymerisation erwiesen. Sie sind daher auch geeignet zur Hemmung der Zellteilung und Proliferation von nicht-Krebszellen. Solche Krankheiten umfassen EBV-induzierte lymphoproliferative Erkrankungen und Lymphome, proliferative Sekundäreffekte im Zusammenhang mit Diabetes, einschließlich vaskulärer Proliferation und Retinopathie und Psoriasis; desweiteren benigne Tumore, einschließlich Angiome, Fibrome, Myome, Osteoporose, Mastozytose und myeloproliferative Erkrankungen.
• Anti-Tumor Wirkung
• Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind brauchbar zum Zwecke der Tumorbehandlung, um beispielsweise eine Hemmung der Tubulinassemblierung des Tumorzelltubulins zu erreichen, eine Hemmung des Tumorzellwachstums zu erzielen, Tumorzellen abzutöten, Apoptose zu induzieren und/oder die Lebensdauer eines Patienten zu verlängern.
• Die krebswirksamen, tubulinbindenden erfindungsgemäßen Verbindungen sind brauchbar zur Anwendung in Säugetieren. Säugetier bezeichnet im Sinne dieser Erfindung jede Klasse höherer Vertebraten, die ihre Jungen mit Milch, produziert in Milchdrüsen ernähren, einschließlich dem Menschen, Kaninchen und Affen.
• Die erfindungsgemäßen Inhibitoren der Tubulinpolymerisation sind geeignet zur Behandlung jeder Krankheit, bei der die Polymerisation von Tubulin von Bedeutung ist. Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind außerdem geeignet zur Behandlung von Krankheiten , welche durch parasitische Protozoen, wie Sporozoen (z.B. Plasmodium, Toxoplasma), Amöben (z.B. Acanthamoeba, Entamoeba), Flagellaten (z.B. Trypanosoma, Leishmania), Ciliaten (z.B. Balantidium) hervorgerufen werden und für die die Tubulinpolymerisation von Bedeutung für deren Bewegung ist. Die erfindungsgemäßen Inhibitoren der Tubulinpolymerisation sind insbesondere nützlich zur Behandlung der Chagas-Krankheit oder von Krankheiten, die durch Würmer hervorgerufen werden.
• Methoden zur Verabreichung der erfindungsgemäßen Verbindungen
• Die erfindungsgemäßen Verbindungen können entweder als einzelne therapeutische Wirkstoffe oder als Mischung mit anderen therapeutischen Wirkstoffen verabreicht werden. Im allgemeinen werden sie in Form pharmazeutischer Mittel verabreicht, das heißt als Mischungen der Wirkstoffe mit geeigneten Trägern oder Verdünnungsmitteln. Die Verbindungen oder Mittel können oral, parenteral (z.B. intravenös, intraperitoneal), durch Inhalation oder topisch (einschließlich dermal, transdermal, buccal, und sublingual) verabreicht werden.
• Die Art des pharmazeutischen Mittels und des pharmazeutischen Trägers bzw. Verdünnungsmittels hängt von der gewünschten Verabreichungsart ab. Orale Mittel können beispielsweise als Tabletten oder Kapseln, auch in retardierter Form, vorliegen und können übliche Exzipienzien enthalten wie Bindemittel (z.B. Sirup, Akazia, Gelatine, Sorbit, Tragant oder Polyvinylpyrrolidon), Füllstoffe (z.B. Lactose, Saccharose, Maisstärke, Calciumphosl hat, Sorbit oder Glycin), Gleitmittel (z.B. Magnesiumstearat, Talcum, Polyethylenglykol oder Siliciumdioxid), desintegrierende Mittel (z.B. Stärke) oder Netzmittel (z.B. Natrium aurylsulfat). Orale flüssige Präparate können in Form wässriger oder öliger Suspensionen, Lösungen, Emulsionen, Sirupen, Elixieren oder Sprays usw. vorliegen oder können als Trokenpulver zur Rekonstitution mit Wasser oder einem anderen geeigneten Träger vorliegen. Derartige flüssige Präparate können übliche Additive, beispielsweise Suspendiermittel, Geschmacksstoffe, Verdünnungsmittel oder Emulgatoren enthalten. Für die parenterale Verabreichung kann man Lösungen oder Suspensionen mit üblichen pharmazeutischen Trägern einsetzen. Für die Verabreichung durch Inhalation können die Verbindungen in wässriger oder teilweise wässriger Lösung vorliegen, die in Form eines Aerosols angewendet werden kann. Mittel für die topische Anwendung können z.B. als pharmazeutisch verträgliche Puder, Lotionen, Salben, Cremes, Gele oder als therapeutische Systeme vorigegen, die therapeutisch wirksame Mengen der erfindungsgemäßen Verbindungen enthalten. Die erforderliche Dosierung ist abhängig von der Form des angewendeten pharmazeutischen Mittels, von der Art der Anwendung, der Schwere der Symptome und dem speziellen Subjekt (Mensch oder Tier), das behandelt wird. Die Behandlung wird üblicherweise mit einer Dosis begonnen, die unterhalb der optimalen Dosis liegt. Danach wird die Dosis erhöht, bis der für die angegebene Bedingungen optimale Effekt erzielt wird. in Allgemeinen werden die erfindungsgemäßen Verbindungen am besten in Konzentrationen verabreicht, mit welchen sich effektive Wirkungen erzielen lassen, ohne dass schädliche oder nachteilige Wirkungen auftreten. Sie können in einer Einzeldosis oder in mehreren Dosen verabreicht werden.
• Die Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen lässt sich anhand verschiedener Testsysteme bestimmen. Nähere Angaben erfolgen in den angegebene Beispielen.
• Methoden zur Darstellung der erfndungsgemäßen Verbindungen
• Die Synthese der erfindungsgemäßen Verbindungen kann wie untenstehend in Beispiel 1 beschrieben erfolgen.
• Beispiele
• Die nachfolgenden Beispiele dienen der Erläuterung der Endung ohne sie zu beschränken sowie dem besseren Verständnis der Erfindung.
• Der Grundkörper des Naphtho-[2,3b]-thiophen-4-ons ist in der Literatur mehrfach beschrieben. ^11,12,13,14 9-Benzyliden-naphtho-[2,3b]-thiophen-4-one sind bislang in der Literatur nicht dokumentiert.
• Zahlreiche Beiträge zu den vom 9(10H)-Anthracenon abgeleiteten Benzylidenen finden sich dagegen in der Literatur. ^{15,16,17,18,19,20,21,22,23} Für das N-[4-[(10-Oxo-9(10H)-anthracenyliden)-methyl]phenyl]-acetamid konnte kürzlich eine Unterdrückung der HER-2/neu-induzierten zellulären Transformation gezeigt werden²⁴. Müller et al. beschreiben die Synthese und die biologischen Aktivitäten von 1,8-Dihydroxy-9(10H)-anthracenonen mit Acyl-. Alkyl-. oder Benzylidensubstitutionsmuster in der 10-Position des antipsoriatrisch wirksamen Dithranols²⁵.
• Beispiel 1
• Synthese der Hemmstoffe der Tubulinpolymerisation
• Chemische Methoden
• Die Schmelzpunkte wurden mittels eines Kofler Schmelzpunktbestimmungsapparates ermittelt und sind nicht korrigiert. Spektren wurden wie folgt erhalten:
  ¹H NMR Spektren wurden mit einem Varian Gemini 200 (50.3 MHz) Spektrometer. unter Verwendung von Tetramethylsilan als internem Standard. aufgenommen. Fouriertransformierte IR-Spektren wurden mit einem Bio-Rad Laboratorien Typ FTS 135 Spectrometer aufgenommen und mittels WIN-IR Foundation Software analysiert. Verbrennungsanalysen wurden im mikroanalytischen Labor der Universität Münster unter Verwendung eines Heraeus CHN-O-Rapid analyser 240 durchgeführt. Alle Werte befinden sich innerhalb ± 0.4% der berechneten Zusammensetzung. Massenspektren (EI) wurden im EI Modus mittels eines MAT 44S Finnigan Massenspektrometers aufgenommen. Alle organischen Lösungsmittel wurden vor dem Gebrauch sorgfältig getrocknet bzw. gereinigt. Aromatische Aldehyde waren überwiegend kommerziell erhältlich. Analytische Dünnschichtchromatographie wurde auf mit Kieselgel bezogenen Aluminiumplattten (Merck Kieselgel 60 F₂₅₄. E. Merck. Darmstadt) durchgeführt. Säulenchromatographie mit Kieselgel wurde unter Verwendung von Kieselgel der Firma Merck (70–230 mesh) durchgeführt.
• Zur Synthese des Naphtho-[2,3b]-thiophen-4-ons bedienten wir uns literaturbekannter Methoden, die wir für unsere Zwecke leicht modifizierten. ^11,12, Es ist bekannt. dass das 9(10H)-Anthracenon (Anthron) mit Aldehyden Kondensationsreaktionen eingeht. ^22,26 In Analogie konnten die substituierten 9-Benzyliden-naphtho-[2,3b]-thiophen-4-one konnten durch eine aldolartige Umsetzung von Naphtho-[2,3b]-thiophen-4-on mit entsprechend substituierten Benzaldehyden unter basischen Bedingungen in Gegenwart von Pyridin/Piperidin erhalten werden (Methode A. Schema 1). ²² In einer effizienteren Variante wurde die Kondensationsreaktion unter sauren Bedingungen durch Einleiten von Chlorwasserstoffgas durchgeführt (Methode B). ²⁷ Im Allgemeinen liefert diese Vorgehensweise die besseren Ausbeuten. Die hier beschriebenen strukturellen Variationen betreffen in erster Linie den Benzylidenteil der Moleküle sowie die Umwandlung einiger Methoxyverbindungen in die freien phenolischen Derivate. Die als Ausgangsverbindungen verwendeten Benzaldehyde waren kommerziell erhältlich. Zur Herstellung des Derivates AZ31 wurden die Ethergruppen der Verbindung AZ30 mittels Bortribromid in Dichlormethan gespalten.
• Synthese von Derivaten des 9-Benzyliden-naphtho-[2,3b]-thiophen-4-ons
• Synthese von o-(2-Thienoyl)-benzoesäure¹²

  
• Phtalsäureanhydrid (29.6 g, 0.2 mol) wird in 300 ml Dichlormethan suspendiert und diese Mischung langsam zu einer Suspension von wasserfreiem Aluminiumchlorid (58.7 g, 0.44 mol) in 150 ml Dichlormethan gegeben. Die Mischung wird bei einer Temperatur von unter 30 °C für die Dauer von 30 min gerührt. Anschließend wird Thiophen (16.8 g, 0.2 mol, 15.76 ml) unter Rühren über einen Zeitraum von 2 h zugetropft.
• Dann wird die Reaktion durch Zugabe einer Mischung von 13 ml HCl 37% und 1 L Wasser abgestoppt und das Gemisch für die Dauer von 1 h gerührt.
• Die wässrige Phase wird mit Dichlormethan (2 × 150 ml) extrahiert und die vereinigten organischen Phasen werden mit 1N NaOH (3 × 200 ml) geschüttelt. Durch vorsichtige und langsame Zugabe von 60 ml HCl 37% (bei zu schneller Zugabe der Säure entsteht ein gummiartiges Produkt, dass die weitere Handhabung erschwert) fällt die o-(2-Thienoyl)-benzoesäure als weißer Niederschlag aus.
• Man saugt ab und kristallisiert aus Methano/Wasser (1:1) oder aus verd. Essigsäure (50%) um. Die Kristalle werden abgesaugt und getrocknet.
  Schmp.: 145–146 °C
• Synthese von o-(2-Thienyl)-benzoesäure¹¹

  
• Eine Mischung aus o-(2-Thienyl)-benzoesäure (12 g), 350 ml Ammoniaklösung 25%, 1.8 g CuSO₄·5 H₂O sowie 42 g Zinkstaub wird für die Dauer von 24 Stunden unter Rückfluss zum Sieden erhitzt. In diesem Zeitraum werden 3 × ca. 20 ml Ammoniak 25% ergänzt.
• Die Mischung wird heiß filtriert und die noch warme Lösung langsam mit HCl 37% unter Rühren versetzt. Die o-(2-Thienyl)-benzoesäure fällt in Form weißer Kristalle aus. Die Substanz wird in Toluol getrocknet (Dean Stark), die Lösung wird anschließend eingeengt, das Produkt abgesaugt und im Ölpumpenvakuum von Lösungsmittelresten befreit.
  Schmp.: 102–105 °C
• Synthese von Naphtho-[2,3b]-thiophen-4-on

  
• In 200 ml trockenem Benzol wird o-(2-Thienyl)-benzoesäure (6.54 g. 30 mmol) suspendiert. Durch die Apparatur wird 30 min. Stickstoff geleitet und das Gemisch auf 2°C abgekühlt. Bei dieser Temperatur wird Phosphorpentachlorid (6.24 g, 30 mmol) unter Rühren innerhalb von 20 min zugegeben. Die Mischung wird 20 min bei Raumtemperatur gerührt und dann unter Rückfluss erwärmt bis die HCl-Produktion nahezu beendet ist (ca. 50 min).
• Die gelbbraune Lösung wird 5 min. bei Raumtemperatur unter Rühren belassen, dann auf 4 °C abgekühlt und eine Lösung von Zinntetrachlorid (4.0 ml, 8.9 g, 34 mmol) in 50 ml trockenem Benzol tropfenweise innerhalb einer Stunde zugegeben. Es entsteht dabei ein grüngelbes Präzipitat. Man rührt eine weitere Stunde bei Raumtemperatur, gießt auf ein Gemisch aus 200 ml 2M HCl und 200 ml Eis. gibt 150 ml Dichlormethan zu und rührt dann für die Dauer von 45 min. Nach Abtrennung der organischen Phase wird die wässrige Phase mit weiteren 150 ml Dichlormethan extrahiert. Die organischen Phasen werden vereinigt, mit Wasser (3 × 150 ml) sowie mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung (4 × 250 ml) gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Die organische Phase wird im Vakuum eingengt, der Rückstand in wenigen ml Dichlormethan gelöst und sc (SiO₂; CH₂Cl₂) gereinigt. Das grüngelbe Rohprodukt kristallisiert beim Einengen der Fraktionen aus und wird ohne weitere Aufreinigung verwendet.
  Reinigung: SiO₂; CH₂Cl₂
  Ausbeute: grüngelbes Pulver ( mg, %)
  Schmp.: 126–130 °C
• Synthese von 9-Benzyliden-naphtho-[2,3b)-thiophen-4-on-Derivaten
• Allgemeine Vorschrift zur Herstellung der 9-Benzyliden-naphtho-[2,3b]-thiophen-4-one
• Methode A. Naphtho-[2,3b]-thiophen-4-on (1 g, 5 mmol) und der substituierte Benzaldehyd (5 mmol) werden unter Stickstoff in 30 ml Pyridin und 5 ml Piperidin suspendiert und unter Rückfluss (bei Bismethoxy-hydroxy-substituierten Benzaldehyden 4 Stunden) erhitzt bis die Umsetzung vollständig ist (DC Kontrolle). Man gießt anschließend auf ein Gemisch aus 300 ml Wasser und 50 ml 6M HCl und lässt weitere 20 min. rühren. Die wässrige Phase wird mit Dichlormethan extrahiert. 2 × mit Wasser gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Die organische Phase wird im Vakuum zur Trockene eingengt, in wenigen ml Dichlormethan aufgenommen und sc gereinigt (SiO₂; CH₂Cl₂). Das Produkt kristallisiert beim Einengen der Reinfraktionen nach Zugabe von wenig Hexan und Stehenlassen im Eisbad aus.
• Methode B. ²⁷ Naphtho-[2.3b]-thiophen-4-on (1 g. 5 mmol) und der substituierte Benzaldehyd (5 mmol) werden bei Raumtemperatur in 25 ml absoluten Ethanol gelöst. Die Suspension wird dann mit HCl-Gas gesättigt (5 min). Das Gemisch färbt sich dunkel und wird für die Dauer von 1h unter Rückfluss zum Sieden erhitzt (DC-Kontrolle). Danach lässt man auf Raumtemperatur abkühlen. gießt auf Wasser (300 ml) und extrahiert mit CH₂Cl₂ oder mit Ethylacetat (Verbindungen mit freier phenolischer OH-Gruppe). Nach Trocknen über Natriumsulfat wird das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. der Rückstand in wenigen ml CH₂Cl₂ gelöst und sc gereinigt (SiO₂; CH₂Cl₂). Das Produkt kristallisiert beim Einengen der Reinfraktionen nach Zugabe von wenig Hexan und Stehenlassen im Eisbad aus.
• Methode C. Die jeweilige Verbindung (0.58 mmol) wird in CH₂Cl₂ (10 ml) gelöst. die Lösung dann auf –78 °C abgekühlt. Eine 1-molare Lösung von Bortribromid in Dichlormethan (5 ml. 5 mmol) wird tropfenweise unter Rühren zugegeben. Man rührt anschließend 24 h. wobei sich das Gemisch auf Raumtemperatur erwärmt. Man beendet die Umsetzung durch Eingießen in Wasser (300 ml) und extrahiert die Produkte mit Etylacetat. Die organischen Phasen werden über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel anschließend im Wasserstrahlvakuum entfernt. Der Rückstand wird säulenchromatographisch unter Verwendung von Ethylacetat als Eluens gereinigt.
• 9-(3-Hydroxy-4-methoxy)-benzyliden-naphtho-[2,3b]-thiophen-4-on (AZ 1)

  
• Herstellung nach Methode A
  Reinigung: SiO₂; CH₂Cl₂
  Ausbeute: oranges Pulver (226 mg, 14 %)
  Schmp.: 181–183 °C
  C₂₀H₁₄O₃S (334.38)
  FT-IR: 3427 cm^–1 (OH); 2845 cm^–1 (OCH₃); 1626 cm^–1 (C=O); 1596 cm^–1, 1575 cm^–1; 1561 cm^–1 (Ar).
  ¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 8.43–8.40 (m, 1H, H-5), 8.12–8.10 (m, 1H, H-8), 7.99 (s, 1H, H-10), 7.67–7.56 (m, 2H, H-6,7), 7.61 (d, J = 5.27 Hz, 1H, H-2), 7.10 (d, J = 5.28 Hz, 1H, H-3), 6.98–6.96 (m, 3H, H-2',5',6'), 5.73 (s, 1H, OH), 3.99 (s, 3H, OCH₃).
  Isomerenanteil: 8% E-Isomer
  MS: m/z 334 (100, M^+.).
  *** keine Verbesserung trotz wiederholter Bestimmung
• 9-(4-Hydroxy-3-methoxy)-benzyliden-naphtho-[2,3b]-thiophen-4-on (AZ 9)

  
• Herstellung nach Methode A
  Reinigung: SiO₂; CH₂Cl₂
  Ausbeute: oranges. kristallines Pulver (199.4 mg, 16 %)
  Schmp.: 175–178 °C
  C₂₀H₁₄O₃S (334.38) Ber. C 71.84 H 4.22
  Gef. C 71.51 H 3.86
  FT-IR: 3276 cm^–1 (OH); 2833 cm^–1 (OCH₃); 1629 cm^–1 (C=O); 1593 cm^–1, 1512 cm^–1 (Ar).
  ¹H-NMR (400MHz, CDCl₃): δ 8.43–8.41 (m, 1H, H-5), 8.13–8.11 (m, 1H, H-8), 8.03 (s, 1H, H-10), 7.69–7.55 (m, 2H, H-6,7), 7.62 (d, J = 5.47 Hz, 1H, H-2), 7.11 (d, J = 5.27 Hz, 1H, H-3), 7.07–6.91 (m, 3H, H-2',5',6'), 5.82 (s, 1H, OH), 3.90 (s, 3H, OCH₃).
  Isomerenanteil: 19 % E-Isomer
  MS: m/z 334 (100%. M^+.).
• 9-(3,4,5-Trimethoxy)-benzyliden-naphtho-[2,3b]-thiophen-4-on (AZ 10)

  
• Herstellung nach Methode A
  Ausbeute: gelbes, kristallines Pulver (207.5 mg, 15 %)
  Schmp.: 196–199 °C
  C₂₂H₁₈O₄S (378.44) Ber. C 69.82 H 4.79
  Gef. C 69.13 H 4.43
  FT-IR: 2814 cm^–1 (OCH₃), 1642 cm^–1 (C=O), 1599, 1577 cm^–1 (Ar).
  ¹H-NMR (400 MHz. CDCl₃): δ 8.43–8.41 (m, 1H, H-5), 8.13–8.11 (m, 1H, H-8), 8.02 (s, 1H, H-10), 7.70–7.56 (m, 2H, H-6,7), 7.63 (d, J = 5.28 Hz, 1H, H-2), 7.14 (d, J = 5.27 Hz, 1H, H-3), 6.64 (s, 2H, H-2',6'), 3.96 (s. 3H, OCH₃), 3.87 (s. 6H, OCH₃).
  Isomerenanteil: 14% E-Isomer
  MS: m/z 378 (100%, M^+.)
  *** keine Verbesserung trotz wiederholter Bestimmung
• 9-(3,5-Dimethoxy-4-hydroxy)-benzyliden-naphtho-[2,3b]-thiophen-4-on (AZ 16)

  
• Herstellung nach Methode
  Ausbeute: oranges Pulver (347.4 mg, 29 %)
  Schmp.: 192–195 °C / 205–206 °C
  C₂₁H₁₆O₄S (364.41) Ber. C 69.22 H 4.43 Gef. C 69.12 H 4.15
  FT-IR: 3334 cm^–1 (OH), 2837 cm^–1 (OCH₃), 1635 cm^–1 (C=O), 1594, 1511 cm^–1 (Ar).
  ¹H-NMR (400 MHz. CDCl₃): δ 8.43–8.41 (m, 1H, H-5), 8.12–8.10 (m, 1H, H-8), δ 8.02 (s, 1H, H-10), 7.68–7.55 (m, 2H, H-6,7), 7.62 (d, J = 5.47 Hz, 1H, H-2), 7.67 (t, J = ...Hz, 1H, H-6), 7.11 (d, J = 5.47 Hz, 1H, H-3), 6.66 (s, 2H, H-2',6'), 5.74 (s, 1H, OH), 3.90 (s, 3H, OCH₃).
  Isomerenanteil: 18 % E-Isomer
  MS: m/z 364 (100%. M^+.)
• 9-(2,4-Dimethoxy-3-hydroxy)-benzyliden-naphtho-[2,3b]-thiophen-4-on (AZ 17)

  
• Herstellung nach Methode A
  Ausbeute: zitronengelbes, kristallines Pulver (292.2 mg, 16 %)
  Schmp.: 210–212 °C / 224–226 °C
  C₂₁H₁₆O₄S (364.41) Ber. C 69.22 H 4.43
  Gef. C 68.83 H 4.13
  FT-IR: 3349 cm^–1 (OH), 2829 cm^–1 (OCH₃), 1636 cm^–1 (C=O), 1591, 1510 cm^–1 (Ar), δ 8.4, 8.41 (m. 1H).
  ¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 8.44–8.41 (m, 1H, H-5), 8.17–8.15 (m, 1H, H-8), 7.96 (s, 1H, H-10), 7.70–7.55 (m, 2H, H-6,7), 7.63 (d, J = 5.27 Hz, 1H, H-2), 7.11 (d, J = 5.47 Hz, 1H, H-3), 6.91–6.74 (m, 2H, H-5',6'), 5.70 (s, 1H, OH), 3.99 (s, 3H, OH₃), 3.81 (s, 3H, OCH₃).
  
  Isomerenanteil: 8 % E-Isomer
  MS: m/z 364 (100%. M^+.).
• 9-(4-Methoxy)-benzyliden-naphtho-[2,3b]-thiophen-4-on (AZ 18)

  
• Herstellung nach Methode A
  Ausbeute: gelbes, kristallines Pulver (82.6 mg, 7 %)
  Schmp.: 110–112 °C / 119–125 °C
  C-H₁₄O₂S (318.38) Ber. C 75.45 H 4.43
  Gef. C 75.19 H 4.09
  FT-IR: 2833 cm^–1 (OCH₃), 1638 cm^–1 (C=O), 1598, 1510, 1459 cm^–1 (Ar).
  ¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 8.43–8.41 (m, 1H, H-5), 8.14–8.12 (m, 1H, H-8), 8.04 (s, 1H, H-10), 7.69–7.54 (m, 2H, H-6,7), 7.62 (d, J = 5.28 Hz, 1H, H-2), 7.36–7.02 (m, 4H, H-2',3',5',6'), 7.09 (d, J = 5.28 Hz, 1H, H-3), 3.90 (s, 3H, OCH₃).
  Isomerenanteil: 14 % E-Isomer
  MS: m/z 318 (100%, M^+.).
• 9-Benzyliden-naphtho-[2,3b]-thiophen-4-on (AZ 24)

  
• Herstellung nach Methode A
  Ausbeute: hellgelbe Nadeln (160.4 mg, 15 %)
  Schmp.: 135–137 °C
  C₁₉H₁₂OS (288.36) Ber. C 79.14 H 4.19
  Gef. C 78.82 H 4.00
  FT-IR: 1641 cm^–1 (C=O), 1598, 1559, 1510 cm^–1 (Ar).
  ¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 8.44–8.41 (m, 1H, H-5), 8.15–8.13 (m, 1H, H-8), 8.08 (s, 1H, H-10), 7.68–7.57 (m, 2H, H-6,7), 7.61 (d, J = 5.28 Hz, 1H, H-2), 7.51–7.26 (m, 5H, H-2',3',4',5',6'), 7.09 (d, J = 5.28 Hz, 1H, H-3).
  Isomerenanteil: 12 % E-Isomer
  MS: m/z (100 %, M^+.).
• 9-(4-Nitro)-benzyliden-naphtho-[2,3b]-thiophen-4-on (AZ 27)

  
• Herstellung nach Methode A
  Ausbeute: gelbes kristallines Pulver (125.2 mg, 8 %)
  Schmp.: 200–204 °C
  C_{1 9}H₁₁O₃S (333.36) Ber. C 68.46 H 3.33 N 4.2
  Gef. C 67.91 H 2.98 N 4.06
  FT-IR: 1650 cm^–1 (C=O), 1598, 1559, 1510 cm^–1 (Ar), 1344 cm^–1 (NO₂).
  ¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 8.43–8.41 (m, 1H, H-5), 8.38–8.35 (m, 2H, H-3',5'), 8.13-8.11 (m, 1H, H-8), 7.95 (s, 1H, H-10), 7.73–7.59 (m, 4H, H-6,7,2',6'), 7.63 (d, J = 5.27 Hz 1H, H-2), 7.15 (d, J = 5.28 Hz, 1H, H-3).
  Isomerenanteil: 22 % E-Isomer
  MS: m/z (100%, M^+.).
• 9-(3,5-Dichlor)-benzyliden-naphtho-[2,3b]-thiophen-4-on (AZ 29)

  
• Herstellung nach Methode B
  Ausbeute: gelbes kristallines Pulver (720.1 mg, 50.4 %)
  Schmp.: 219–221 °C
  C₁₉H₁₀Cl₂OS (357.25) Ber. C 63.88 H 2.82
  Gef. C 63.69 H 2.65
  FT-IR: 1639 cm^–1 (C=O); 1596, 1557 cm^–1 (Ar); 1100 cm^–1 (Cl).
  ¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 8.42–8.40 (m, 1H, H-5), 8.09–8.06 (m, 1H, H-8), 7.83 (s, 1H, H-10), 7.71–7.57 (m, 2H, H-6, 7), 7.64 (d, J = 5,47 Hz, 1H, H-2), 7.46–7.3 (m, 3H, H-2',4', 6'), 7.2 (d, J = 5,27 Hz, 1H, H-3).
  Isomerenanteil: 11 % E-Isomer
  MS: m/z (100, M^+.).
• 9-(3,4-Dimethoxy)-benzyliden-naphtho-[2,3b]-thiophen-4-on (AZ 30)

  
• Herstellung nach Methode B
  Ausbeute: gelbes, kristallines Pulver (649.6 mg, 37 %)
  Schmp.: 190–192 °C
  C₂₁H₁₆O₃S (348.41) Ber. C 72.39 H 4.63
  Gef. C H
  FT-IR: 2829 cm^–1 (OCH₃); 1642 cm^–1 (C=O), 1596, 1559, 1510 cm^–1 (Ar).
  ¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 8.43–8.41 (m, 1H, H-5), 8.14–8.12 (m, 1H, H-8), 8.04 (s, 1H, H-10), 7.69–7.55 (m, 2H, H-6, 7), 7.62 (d, J = 5.13 Hz, 1 H, H-2), 7.10 (d, J = 5.47 Hz, 1 H, H-3), 7.0–6.92 (m, 3H, H-2',5',6'), 3.98 (s, 3H, OCH₃), 3.89 (s, 3H, OCH₃).
  Isomerenanteil: 15 % E-Isomer
  MS: m/z (100, M^+.).
• 9-(3,4-Dihydroxy)-benzyliden-naphtho-[2,3b]-thiophen-4-on (AZ 31)

  
• Herstellung nach Methode C
  Ausbeute: orangebraunes Pulver (105.9 mg, 33 %)
  Schmp.: °C
  C_{1 9}H₁₂O₃S (320.36) Ber. C 71.23 H 3.78
  Gef. C H
  FT-IR: 3273 cm^–1 (OH); 1627 cm^–1 (C=O); 1592 cm^–1. 1559, 1512 cm^–1 (Ar).
  ¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 8.35–8.33 (m, 1H, H-5), δ 8.04–8.02 (m, 1H, H-8), δ 7.90 (s, 1H, H-10), δ 7.61–7.44 (m, 2H, H-6,7), δ 7.54 (d, J = 5.27 Hz, 1H, H-2), δ 7.02 (d, J = 5.27 Hz, 1H, H-3), δ 6.95–6.79 (m, 3H, H-2',5',6'), δ ? (s, 1H, OH).
  Isomerenanteil: 19 % E-Isomer
  MS: m/z (100. M^+.).
• 9-(4-Hydroxy)-benzyliden-naphtho-[2,3b]-thiophen-4-on

  
• Methode C
  Ausbeute: orange, glänzende Kristalle ( mg, %)
  Schmp.: °C
  C₁₉H₁₂O₃S (304.36) Ber. C 74.98 H 3.97
  Gef. C H
  FT-IR: 3155 cm^–1 (OH), 1625 cm^–1 (C=O), 1559 cm^–1, 1580, 1511 cm^–1 (Ar).
  ¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 8.36–8.34 (m, 1H, H-5), δ 8.06–8.04 (m, 1H, H-8), δ 7.95 (s, 1H, H-10), δ 7.62–7.47(m, 2H, H-6, 7), δ 7.55 (d, J = 5.28 Hz, 1H, H-2), δ 7.23–7.20 (m, 3H, H-3',5'), δ 7.03 (d, J = 5.47 Hz, 1H, H-3), δ 6.92–6.89 (m, 3H, H-2', 6'), δ ? (s, 1H, OH).
  Isomerenanteil: 19 % E-Isomer
  MS: m/z (100%. M^+.).
• Beispiel 2
• Prüfung auf wachstumshemmende Eigenschaften an K562-Zellen
• Wir prüften die neu synthetisierten Verbindungen auf wachstumshemmende Eigenschaften an der in Suspension wachsenden K562 Leukämie Zell-Linie. ²⁸ Der IC₅₀-Wert (definiert als die effektive Konzentration, die für eine 50%ige Hemmung des Zellwachstums benötigt wird) von 9-(3,5-Dimethoxy-4-hydroxy)-benzyliden-naphtho-[2,3b]-thiophen-4-on AZ16 beträgt in diesem Assay 0.007 μg/ml (Tabelle 1 u. 3).
• Humane chronisch myelogene K562 Leukämie-Zellen wurden von Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zelllulturen bezogen und in RPMI 1640 Medium (Zusätze: 10% Rinderserum (FBS), 10 ml PenStrep) bei 37 °C und 5% CO₂ kultiviert.
• Die K562-Zellen wurden in einer Zelldichte von 2 × 10⁵ Zellen/ml in Platten zu je 48 Vertiefungen (Costar, Cambridge, MA) ausgesäät. Unbehandelte Kontrollen wurden dabei als 100% betrachtet. Die zu prüfenden Verbindungen wurden in DMSO/Methanol im Verhältnis 1:1 gelöst. den Kontrollen wurde lediglich das Lösungsmittel zugesetzt. In jede Vertiefung wurden jeweils 5 μL der gelösten Verbindung pipettiert. das Gesamtvolumen im Endbehältnis betrug somit 500 μl. Die Zellzahl wurde mittels einer Neubauerkammer nach Inkubation mit den zu prüfenden Verbindungen über einen Zeitraum von 48 h ermittelt.
• Eine Übersicht über die synthetisierten 9-Benzyliden-naphtho-[2,3b]-thiophen-4-one sowie über deren wachstumshemmende Eigenschaften (IC₅₀-Werte) gibt Tabelle 1.
• Die beobachteten antiproliferativen Effekte hängen vom Substitutionsmuster ab. 9-(3,5-Dimethoxy-4-hydroxy)-benzyliden-naphtho-[2,3b]-thiophen-4-on AZ16 zeigte stark wachstumshemmende Eigenschaften (IC₅₀ (K562): 0.07 μM). Der IC₅₀-Wert liegt hier im Bereich des antiproliferativ gut wirksamen Anthracyclins Adriamycin. Ebenfalls sehr aktiv waren die Verbindungen AZ9 und AZ17 mit IC₅₀ Werten im Bereich von 0.1 μM.
• Insgesamt wird die ausgeprägte antiproliferative Aktivität dadurch dokumentiert, das die IC_50- Werte aller geprüften Substanzen im submikromolaren Bereich liegen.
• Tabelle 1. Wachstumshemmende Aktivität der 9-Benzyliden-Naphtho-[2,3b]-thiophen-4-one gegenüber dem Wachstum von K562 Zellen und Hemmung der Tubulinpolymerisation in vitro

  
• 
• Tabelle 2 Chemische Daten der 9-Benzyliden-Naphtho-[2,3b]-thiophen-4-one

  
• Tabelle 3.

  
• Beispiel 3
• Mikrotubuliassemblierung-Turbidimetrischer Assay
• Prinzip der Methode
• Bei physiologischer Temperatur und in Gegenwart von Kofaktoren (GTP und Mg²⁺-Ionen) assembliert das Mikrotubuliprotein (MTP) in vitro unter Mikrotubulibildung. Dieser Prozess ist umkehrbar. Antagonisten der Assemblierung, wie z.B. Ca²⁺-Ionen oder auch niedrige Temperaturen (für Mikrotubuli aus Säugerhirn Temperaturen < 10 °C) bedingen eine Disassemblierung. Promotoren dagegen bedingen eine Stabilisierung. Die Kinetiken und "steady state"-Bedingungen der MT-Bildung sowie der MT-Disintegration können durch zeit- und temperaturabhängige turbidimetrische Messungen bei 350 nm verfolgt werden.
• Isolierung von MTP und Hemmung der MT Assemblierung
• Mikrotubuliprotein wurde aus Schweinehirn durch Zyklen temperaturabhängiger Desassemblierung/Reassemblierung nach einer von Shelanski et al. etablierten Methode gewonnen.²⁹ Zur Steigerung der Ausbeute wurden die Schritte der Reassemblierung in Gegenwart von Glycerol durchgeführt. Eine zufriedenstellende Reinheit des Mikrotubuliproteins war nach zwei Zyklen von Disassemblierung/Reassemblierung gewährleistet.
• Mikrotubuli zur Bestimmung antimikrotubulärer Effektoraktivitäten wurden durch in vitro Assemblierung von Mikrotubuliprotein erhalten. Die Mikrotubulikonzentration in den Assemblierungsstudien betrug 1 mg/ml (bestimmt nach dem Lowry Verfahren unter Verwendung von bovinem Serumalbumin). Die Mikrotubuli assemblierten in einem Puffer der Zusammensetzung 20 mM PIPES (1,4-Piperazinediethansulfonsäure, pK_a 6.8), 80 mM NaCl, 0.5 mM MgCl₂, 1 mM EGTA (Ethyleneglykol-bis-(2-aminoethylen)-tetraessigsäure) nach Zugabe von 0.25 mM GTP (Guanosin-5'-triphosphat) und Erwärmung der Proben auf 37 °C. Der Gleichgewichtszustand, erkennbar an der nicht weiter zunehmenden Menge an polymerisiertem Tubulin, wurde in den Turbiditätsmessungen nach einer Inkubationsdauer von 20 min erreicht.
• Turbidimetrische Messung
• Die turbidimetrischen Messungen wurden spektralphotometrisch bei einer Wellenlänge von 360 nm durchgeführt. Die Temperatur in der Assemblierungs-/Desassemblierungs Küvette wurde mittels einer Kryostat/Thermostat-Kombination reguliert. Die zu prüfenden Verbindungen wurden zu einer kalten MTP-Lösung (MTP Konzentration 1 mg/ml, Temperatur 2 bis 4 °C) in PIPES Puffer (zur Zusammensetzung siehe oben) bei pH = 6.8 gegeben. Unmittelbar mit Beginn der Messung wurde die Temperatur auf 37 °C erhöht. Nach einer kurzen "gap-Phase" kommt es zur Assemblierung des MTP zu MT. Die Lösung trübt sich und erreicht nach ca. 20 min einen Gleichgewichtszustand. Um die Trübung von unspezifischen Proteinpräzipitaten zu unterscheiden, wird die Lösung auf 2 °C gekühlt und für 5 min bei dieser Temperatur gehalten, was eine MT Disassemblierung bedingt. Die MTP Lösung wird erneut transparent. Bindet oder interferiert die zu prüfende Verbindung mit Tubulin, so nimmt der "steady state"-Zustand für Inhibitoren der Assemblierung ab bzw. zu für MT stabilisierende Substanzen. Der IC₅₀ Wert gibt diejenige Konzentration an, die eine 50%ige Abweichung vom "steady-state" Zustand bedingt.
• In der Tabelle 1 sind die IC₅₀ Werte der Polymerisationshemmung von Schweinehirntubulin angegeben. Als Referenzsubstanzen sind Colchicin, Nocodazol, Podophyllotoxin und Vinblastinsulfat mit einbezogen. Hinsichtlich der Hemmung der Tubulinpolymerisation in vitro liegen die Verbindungen AZ1, AZ9, AZ16 und AZ17 im submikromolaren Bereich und sind damit ähnlich aktiv wie die Referenzsubstanzen oder übertreffen diese sogar in ihrer Aktivität. Verbindung AZ16 als Verbindung mit den ausgeprägtesten wachstumshemenden Eigenschaften gegenüber K562-Leukämie-Zellen erwies sich als die potenteste Verbindung im turbidimetrischen Assay (IC₅₀ ITP = 0.38 μM, Tabelle 1).
• Die gefundenen Daten belegen, dass die erfindungsgemässen 9-Benzyliden-naphtho-[2.3b]-thiophen-4-one potente zytotoxische Wirkstoffe darstellen, die die Tubulinpolymerisation unterbinden. Hervorzuheben ist außerdem die im Vergleich zu den Vinca-Alkaloiden vergleichsweise einfache Zugänglichkeit der Verbindungen.
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Claims (9)

1. Ein 9-Benzyliden-naphtho-[2,3b]-thiophen-4-one der allgemeinen Formel I,

   

   wobei dieses als Gemisch geometrischer Isomere (E/Z-Isomere) oder in Form eines der beiden denkbaren Isomere (E- oder Z-Isomer) vorliegen kann und worin die Substituenten R1 –R5 unabhängig voneinander für die folgenden Substituenten stehen können: für Wasserstoff, für Alkoxy (C1-C6), für Alkyl (C1-C6), für Aryloxy, für COOH, für SO₃H, für SO₃M⁺ (wobei es sich bei M+ um ein Kation handelt), für eine Estergruppe, für eine Thioestergruppe, für CN, für einen Acylrest, für eine Aryloxygruppe, für Phenylmethoxy, Nitro, Hydroxy, Amino, Imino, Mercapto, Halogen, für eine Phosphatesterstruktur (-OP(O)(O-M⁺)2) oder ein Phosphoramidat (-NP(O)(O-M⁺)₂), wobei M für ein Kation steht, oder (-NP(O)(OR)₂), wobei es sich bei R um einen Alkylrest mit bis zu 8 Kohlenstoffatomen handelt (die beiden Reste R können identisch oder unterschiedlich sein, es kann sich um Benzyl- oder Arylreste handeln).
2. Eine Verbindung gemäß Patentanspruch 1 mit der Struktur:

   
3. Eine Verbindung gemäß Patentanspruch 1 mit der Struktur:

   
4. Eine Verbindung gemäß Patentanspruch 1 mit der Struktur

   
5. Eine Verbindung gemäß Patentanspruch 1 mit der Struktur

   
6. Eine Verbindung gemäß Patentanspruch 1 mit der Struktur

   
7. Eine Verbindung gemäß Patentanspruch 1 mit der Struktur

   
8. Eine therapeutische Zusammensetzung mit einer pharmazeutisch wirksamen Menge einer der Verbindungen entsprechend Patentanspruch 1 sowie einen pharmazeutisch effektiven Träger.
9. Eine pharmazeutische Zubereitung entsprechend Patentanspruch 8, worin es sich bei der pharmazeutisch wirksamen Verbindung um die Verbindung

   

   handelt.