PT1991584E - Anticorpos dirigidos contra a il-22 humana e suas utilizações - Google Patents

Anticorpos dirigidos contra a il-22 humana e suas utilizações Download PDF

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Jing Li
Davinder S Gill
Lynette A Fouser
Viia Valge-Archer
David C Lowe
Caroline S Russell
Suzanne E Cohen
Albert B Thom
Ralph R Minter
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Description

1
DESCRIÇÃO
"ANTICORPOS DIRIGIDOS CONTRA A IL-22 HUMANA E SUAS UTILIZAÇÕES"
CAMPO TÉCNICO A presente invenção diz respeito a anticorpos, v.g., anticorpos humanos, e aos seus fragmentos de ligação ao antigénio, que se ligam à interleucina 22 (IL-22), em particular a IL-22 humana. Os anticorpos aqui descritos são úteis para o diagnostico, prevenção e/ou tratamento de patologias associadas à IL-22, v.g., patologias autoimunes, incluindo a artrite.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
Os antigénios desencadeiam as respostas imunitárias e activam as duas maiores populações de linfócitos: as células T e as células B. Depois de encontrarem o antigénio, as células T proliferam e diferenciam-se em células efectoras, ao passo que as células B proliferam e diferenciam-se em células do plasma segregadoras de anticorpos. As referidas células efectoras segregam e/ou respondem a citoquinas que são proteínas pequenas (< cerca de 30 kDa) segregadas pelos linfócitos e outros tipos de células.
A interleucina 22 (IL-22) é uma citoquina de classe II
que apresenta uma homologia sequencial com a IL-10. A sua expressão é regulada positivamente nas células T pela IL-9 ou ConA (Dumoutier L. et al. (2000) Proc Natl Acad Sei USA 2 97(18):10144-9). Outros estudos revelaram que a expressão do ARNm da IL-22 é induzida in vivo em resposta à LPS e que a IL-22 modula os parâmetros indicadores de uma resposta em fase aguda (Dumoutier L. et al. (2000); Pittman D. et al. (2001) Genes and Immunity 2:172) . Além disso, a IL-22 aumenta a expressão de péptidos antimicrobianos associados à defesa do hospedeiro, incluindo a defensina β, S100A7, S100A8 e S100A. Wolk et al. , Immunity, 21:241-54 (2004) ;
Boniface et al., J. Immunol. 174:3695-3702 (2005); Liang et al., J. Exp. Med., 203(10):2271-79 (2006). No seu conjunto, estas observações indicam que a IL-22 desempenha uma função na inflamação (Kotenko S.V. (2002) Cytokine & Growth Factor Reviews 13(3):223-40).
Admite-se que a IL-22 se liga a um complexo de receptores constituído por IL-22R e IL-10R2, dois membros da família de receptores das citoquinas de tipo II (CRF2) (Xie M.H. et al. (2000) J Biol Chem 275(40):31335-9;
Kotenko S.V. et al. (2001) J Biol Chem 276(4):2725-32). Ambas as cadeias dos receptores de IL-22 são expressas constitutivamente em diversos órgãos. As linhagens de células epiteliais derivadas destes órgãos respondem à IL-22 in vitro (Kotenko S.V. (2002) Cytokine & Growth Factor Reviews 13(3) :223-40) . A IL-22 induz a activação das vias de JAK/STAT3 e ERK, servindo também de intermediária de outras vias de MAPK (Dumoutier L. et al. (2000) supra; Xie
M.H. et al. (2000) supra; Dumoutier L. et al. (2000) J
Immunol 164 (4): 1814-9; Kotenko S.V. et al. (2001) J Biol
Chem 276 (4) :2725-32; Lejeune, D. et al. (2002) J Biol Chem 277 (37) :33676-82) . 3
Um anticorpo monoclonal anti-IL-22 de murganho melhora os sintomas de artrite num modelo de murganho ín vivo (WO 2005/000897).
Os membros de CRF2 são receptores para IFNa/β, ΙΙΓΝγ, factor de coagulação Vila, IL-10 e proteínas IL-19, IL-20, IL-22, IL-24, IL-26 congéneres de IL-10, e também para as citoquinas semelhantes a IFN, recentemente identificadas, IL-28 e IL-29 (Kotenko S.V. (2002) Cytokine & Growth Factor Reviews 13(3):223-40/ Kotenko, S.V. et al. (2000) Oncogene 19(21):2557-65/ Sheppard, P. et al. (2003) Nature Immunology 4(1):63-8/ Kotenko, S.V. et al. (2003) Nature Immunology 4(1):69-77). Para além destes receptores membranares, a família de CRF2 compreende também uma proteína solúvel, a proteína de ligação à IL-22 (IL-22BP), que é específica para a IL-22 e bloqueia a sua actividade (Dumoutier, L. et al. (2001) J Immunol 166(12):7090-5/ Kotenko, S.V. et al. (2001) J Immunol 166(12):7096-103/ Xu, W, et al. (2001) Proc Natl Acad Sei USA 98(17):9511-6/ Gruenberg, B.H. et al. (2001) Genes & Immunity 2(6):329-34/ Wei C-C et al. (2003) Genes &
Immunity 4:204-211) . Apesar de o complexo de receptores da IL-22 ser único para a IL-22, cada cadeia (isto é, IL-22R e IL-10R2) é partilhada com outros membros de CRF2 para definir receptores funcionais para outras citoquinas, incluindo as IL-20, IL-24 (IL-22R/IL-20R2), IL-28, IL-29 (IFN-ÀR1/IL-10R2) e IL-10 (IL-10R1/IL-10R2) (Dumoutier, L. et al. (2001) J. Immunol. 167(7):3545-9/ Wang, M. et al. (2002) J Biol Chem 277(9): 7341-7/ Parrish-Novak, J. et al. (2002) J Biol Chem 277 (49) :47517-23/ Kotenko, S.V. et al. (1997) EMBO J. 16(19):5894- 903/ Spencer, S.D. et al. (1998) J Exp Med 187(4):571-8). 4
As duas cadeias do receptor complexo de CRF2 são necessárias para a transdução do sinal. Uma cadeia do receptor complexo tem sido historicamente definida como sendo uma cadeia de ligação ao ligando (v.g., IFNyRI), com base na sua elevada afinidade com a citoquina. A outra cadeia (v.g., IFNyR2) tem sido caracterizada como sendo uma cadeia auxiliar ou acessória e manifesta uma afinidade mínima com a citoquina por si só (Kotenko, S.V. et al. (2000) Oncogene 19(21):2557-65). Para a IL-22, a subunidade IL-22R é a subunidade receptora de elevada afinidade com a IL-10R2, ligando-se subsequentemente ao complexo de IL-22/IL-22R (Li, J. et al. (2004) Int. Immunopharmacol. 4(5): 673-708; Logsdon, N. J. et al. (2002) J. Interferon
Cytokine Res 22(11):1099-1112).
DESCRIÇÃO ABREVIADA DA INVENÇÃO 0 presente pedido de patente de invenção proporciona, pelo menos em parte, agentes de ligação à IL-22, tais como anticorpos e seus fragmentos de ligação a antigénios que se ligam à interleucina 22 ("IL-22"), em particular a IL-22 humana, com elevadas afinidade e especificidade. Os anticorpos e os seus fragmentos de ligação aos antigénios mencionados na presente invenção são também aqui designados por "anticorpos anti-IL-22" e "seus fragmentos", respectivamente. De acordo com uma forma de realização, o anticorpo, ou um seu fragmento, reduz, inibe ou antagoniza a actividade de IL-22. Tais anticorpos podem ser utilizados para regular respostas imunitárias ou patologias associadas à IL-22, antagonizando a actividade de IL-22. De acordo com outras formas de realização, o anticorpo anti-IL-22 pode ser utilizado para 5 fins de diagnóstico, ou como anticorpo direcionado a um alvo para administrar um agente terapêutico ou citotóxico a uma célula em que tenha lugar a expressão de IL-22. Deste modo, os anticorpos anti-IL-22 da presente invenção são úteis para diagnosticar, tratar e/ou prevenir patologias associadas à IL-22, v.g., patologias autoimunes, v.g., artrite (incluindo artrite reumatóide, artrite reumatóide juvenil, osteoartrite, artrite psoriática, artrite associada ao lúpus ou espondilite anquilosante), escleroderma, eritematose do lúpus sistémico, VIH, síndroma de Sjogren, vasculite, esclerose múltipla, tiroidite autoimune, dermatite (incluindo a dermatite atópica e a dermatite eczematosa), miastenia grave, doença intestinal inflamatória (IBD), doença de Crohn, colite, diabetes mellitus (tipo I); estados inflamatórios, v.g., da pele (v.g., psoríase), do sistema cardiovascular (v.g., aterosclerose), do sistema nervoso (v.g., doença de Alzheimer), do fígado (v.g., hepatite), dos rins (v.g., nefrite) e do pâncreas (v.g., pancreatite); patologias cardiovasculares, v.g., patologias metabólicas do colesterol, lesões originadas por radicais livres de oxigénio, isquémia; patologias associadas à cicatrização de ferimentos; patologias respiratórias, v.g. asma e COPD (v.g., fibrose cística); estados inflamatórios agudos (v.g., endotoxemia, sépsis e septicémia, síndroma do choque tóxico e doenças infecciosas); rejeição de transplantes e alergias. De acordo com uma forma de realização, a patologia associada à IL-22 é uma patologia artrítica, v.g., uma patologia seleccionada entre artrite reumatóide, artrite reumatóide juvenil, osteoartrite, artrite psoriática ou espondilose anquilosante; uma patologia respiratória (v.g., asma, doença pulmonar obstrutiva crónica (COPD) ; ou um estado inflamatório, v.g., da pele (v.g., psoríase), do sistema 6 cardiovascular {v.g., aterosclerose) , do sistema nervoso {v.g., doença de Alzheimer), do fígado {v.g., hepatite), dos rins {v.g., nefrite), do pâncreas {v.g., pancreatite) e dos órgãos gastrintestinais, v.g., colite, doença de Crohn e IBD.
Assim sendo, de acordo com um dos seus aspectos, a invenção diz respeito a um anticorpo isolado que se liga à IL-22, em particular, a IL-22 humana. Em determinadas formas de realização, o anticorpo anti-IL-22 pode ter pelo menos uma das características seguintes: (1) é um anticorpo monoclonal ou com uma especificidade singular; (2) é um anticorpo humano; (3) é um anticorpo gerado in vitro; (4) é um anticorpo gerado in vivo {v.g., no sistema do murganho transgénico); (5) liga-se à IL-22 com uma constante de associação que é pelo menos igual a 1012 M_1; (6) liga-se à IL-22 com uma constante de associação que é pelo menos igual a 1011 M-1; (7) liga-se à IL-22 com uma constante de associação que é pelo menos igual a IO10 M_1; (8) liga-se à IL-22 com uma constante de dissociação igual a 500 nM ou inferior; (9) liga-se à IL-22 com uma constante de dissociação igual a 10 nM ou inferior; (10) liga-se à IL-22 com uma constante de dissociação igual a 150 pM ou inferior; (11) liga-se à IL-22 com uma constante de dissociação igual a 60 pM ou inferior; (12) inibe a ligação da IL-22 ao IL-22R ou a um complexo de receptores da IL-22R e da IL-10R2; (13) bloqueia a proliferação, mediada pela IL-22, das células BaF3 modificadas pelo receptor da IL-22, com um valor de CI50 igual a 150 pM ou inferior, segundo uma forma de realização, com um valor CI50 igual a 100 pM ou inferior de acordo com uma outra forma de realização e com um valor CI50 igual a 10 pM ou inferior de acordo com uma outra forma de realização; e (14) bloqueia a secrecção 7 de GROa, mediada por IL-22, a partir das células HT29, com um valor CI50 igual a 150 pM ou inferior de acordo com uma forma de realização e com um valor CI50 igual a 10 pM ou inferior de acordo com uma outra forma de realização. A proliferação de células BaF3, mediada por IL-22, e a secrecção de GROa, mediada por IL-22, a partir de células HT29, podem ser medidas conforme descrito nos exemplos.
Como formas de realização ilustrativas e não limitativas de anticorpos da invenção indica-se aqui os anticorpos "GIL16", "GIL60", "GIL68", "GIL92", "097D09", "062A09", "062G05", "087B03", "367D04", "368D04", "166B06", "166G05", "375G06", "376B10", "354A08", "355B06", "355E04" e "356A11." Estes anticorpos podem ser genomutacionados ou não genomutacionados. De acordo com uma outra forma de realização, 0 anticorpo é seleccionado entre 356A11, 354A08, 087B03 e 368D04. Os anticorpos podem ligar-se, especificamente, ao mesmo epitopo de IL-22 ou a um epitopo semelhante aqui descrito e/ou reivindicado ( v.g., um epitopo em sobreposição) a que se liguem GIL01, GIL16, GIL45, GIL60, GIL68, GIL92, 097D09, 062A09, 062G05, 087B03, 367D04, 368D04, 166B06, 166G05, 375G06, 376B10, 354A08, 355806, 355E04 ou 356A11. De acordo com outras formas de realização, os anticorpos ligam-se, especificamente, a um fragmento de uma IL-22, v.g., um fragmento que tenha pelo menos 10, 20, 50, 75, 100, 150 ou 200 aminoácidos contíguos à sequência de aminoácidos identificada por SEQ ID NO: 1, ou a uma sequência que seja pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais idêntica a qualquer sequência que tenha pelo menos 100 aminoácidos contíguos na sequência identificada por SEQ ID NO: 1. O anticorpo aqui descrito e/ou reivindicado pode inibir, de forma competitiva, a ligação de pelo menos um dos GIL01, GIL16, GIL45, GIL60, GIL68, GIL92, 097D09, 062A09, 062G05, 087B03, 367D04, 368D04, 166B06, 166G05, 375G06, 376B10, 354A08, 355B06, 355E04 ou 356A11 ao seu epitopo destinatário.
De acordo com uma forma de realização, o anticorpo da presente invenção compreende um domínio VH, um domínio VL/ ou uma sua combinação, do fragmento Fv de GIL16, GIL60, GIL68, GIL92, 097D09, 062A09, 062G05, 087B03, 367D04, 368D04, 166B06, 166G05, 375G06, 376B10, 354A08, 355B06, 355E04 ou 356A11. Por exemplo, o anticorpo compreende uma domínio VH e/ou VL que possui uma sequência de aminoácidos conforme explicitado nas SEQ ID NO: 23, 59, 77, 95, 113, 131, 149, 167, 185, 203, 221, 239, 257, 275, 491, 509, 527, 545, 563, 581, 599 ou 617, no caso do domínio VH, e conforme explicitado nas SEQ ID NO: 24, 60, 78, 96, 114, 132, 150, 168, 186, 204, 222, 240, 258, 276, 492, 510, 528, 546, 564, 582, 600 ou 618, no caso do domínio VL, ou uma sequência substancialmente idêntica às SEQ ID NO: 23, 24, 59, 60, 77, 78, 95 ou 96 . ( v. g. , uma sequência que sej a pelo menos cerca de 90%, 95%, 96%, 97% , 98%, 99% ou mais idêntica a essas, ou que seja diferente em não mais do que 1, 2, 5, 10 ou 15 aminoácidos, comparativamente com as SEQ ID NO: 23, 24, 59, 60, 77, 78, 95 ou 96.
De acordo com uma outra forma de realização, o anticorpo da presente invenção compreende um domínio VH, um domínio VL, ou uma sua combinação, do fragmento Fv do anticorpo seleccionado entre 356A11, 354A08, 087B03 e 368D04. De acordo com esta forma de realização, o anticorpo, ou o seu fragmento de ligação ao antigénio, compreende: um domínio VH que compreende a sequência de aminoácidos explicitada nas SEQ ID NO: 167 ou 491 e/ou um 9 domínio VL que compreende a sequência de aminoácidos explicitada nas SEQ ID NO: 168 ou 492 (087B03); um domínio VH que compreende a sequência de aminoácidos explicitada na SEQ ID NO: 545 e/ou um domínio VL que possui a sequência de aminoácidos explicitada na SEQ ID NO: 546 (354A08); um domínio VH que compreende a sequência de aminoácidos explicitada nas SEQ ID NO: 203 ou 617 e/ou um domínio VL que possui a sequência de aminoácidos explicitada nas SEQ ID NO: 204 ou 618 (368D04); ou um domínio VH que compreende a sequência de aminoácidos explicitada na SEQ ID NO: 599 e/ou um domínio VL que possui a sequência de aminoácidos explicitada na SEQ ID NO: 600 (356A11). O anticorpo aqui descrito e/ou reivindicado pode conter um domínio VH e/ou VL codificado por um ácido nucleico que possua uma sequência de nucleótidos como as explicitadas nos quadros 1 e 7 ( SEQ ID NO: 14, 32, 50, 68 CO 104, 122, 140, 158, 176, 194, 212, 230, 248, 2 66, 284, 302, 320, 338, 356, 374, 392, 410, 428, 446, 464, 482, 500, 518, 536, 554, 572, 590, 608 ou 62 < 5 no caso do domínio VH e SEQ ID NO: 15, 33, 51, 69, 87, 105 , 123, 141 , 159 , 177, 195, 213, 231, 249, 267, 285, 303, 321, 339, 357, 375, 393, 411, 429, 447, 465, 483, 501, 519, 537, 555, 573, 591, 609 ou 627 , no caso do domínio VL)r ou uma sequência substancialmente idêntica a estas (v.g.r uma sequência que seja pelo menos cerca de 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais idêntica a estas, ou que seja diferente em não mais do que 1, 2, 3, 6, 15, 30 ou 45 nucleótidos, comparativamente com as SEQ ID NO: 14, 15, 32, 33, 50, 51, 68 , 69, 00 CO 104, 105, 122, 123, 140, 141, 158, 159, 176, 177, 194, 195, 212, 213, 230, 231, 248, 249, 10 2 66, 267, 284, 285, 302, 303, 320, 321, 338, 339, 356, 357, 374, 375, 392, 393, 410, 411, 428, 429, 446, 447, 464, 465, 482, 483, 500, 501, 518, 519, 536, 537, 554, 555, 572, 573, 590, 591, 608, 609, 62 6 ou 627)
De acordo com outras formas de realização, o anticorpo compreende um domínio Fv que possui a sequência de aminoácidos explicitada nas SEQ ID NO: 151, 187, 205, 259, 277, 313, 331 ou 349. Em outras formas de realização, o anticorpo da presente invenção compreende um domínio Fv de um anticorpo seleccionado entre 356A11 (SEQ ID NO: 349) e 368D04 (SEQ ID NO: 205) . O anticorpo aqui descrito e/ou reivindicado por compreender uma domínio Fv codificado por um ácido nucleíco que possua uma sequência de nucleótidos explicitada nos quadros 1 e 7 (SEQ ID NO: 16, 34, 52, 70, 88, 106, 124, 142, 160, 178, 196, 214, 232, 250, 268, 286, 304, 322, 340, 358, 376, 394, 412, 430, 448, 466, 484, 502, 520, 538, 556, 574, 592, 610 ou 628), ou uma sequência substancialmente idêntica a estas (v.g., uma sequência que seja pelo menos cerca de 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais idêntica a estas, ou que seja diferente em não mais do que 1, 2, 3, 6, 15, 30, 45, 60, 90 ou 105 nucleótidos, comparativamente com as SEQ ID NO: 16, 34, 52, 70, 88, 106, 124, 142, 160, 178, 196, 214, 232, 250, 268, 286, 304, 322, 340, 358, 376, 394, 412, 430, 448, 466, 484, 502, 520 538, 556, 574, 592, 610 ou 628). 0 anti corpo aqui descrito e/ou reivindicado pode compreender pelo menos uma região determinante de complementaridade (CDR) destes domínios VH e VL. Por exemplo, o anticorpo pode compreender uma, duas ou três CDR do domínio VH, com uma sequência de aminoácidos seleccionada entre as sequências explicitadas ou incluídas nas sequências explicitadas nos quadros 1 e 7 (SEQ ID NO: 11 5, 7 , 8, 9, 10, 23, 25, 26, 27, 28 \—1 43, 44, 45 ', 46, 59 61, 62, 63, 64 , 77, 79, 80, 81, 82, 95, 97 , 98, 99, 100 113, 115, 116, 117, 118, 131, 133, 134, 135, 136, 149, 151 152, 153, 154, 167, 169, 170, 171, 172, 185, 187, 188, 189 190, 203, 205, 206, 207, 208, 221, 223, 224, 225, 226, 239 241, 242, 243, 244, 257, 259, 260, 261, 262, 275, 277, 278 279, 280, 293, 295, 296, 297, 298, 311, 313, 314, 315, 316 329, 331, 332, 333, 334, 347, 349, 350, 351, 352, 365, 367 368, 369, 370, 383, 385, 386, 387, 388, 401, 403, 404, 405 406, 419, 421, 422, 423, 424, 437, 439, 440, 441, 442, 455 457, 458, 459, 460, 473, 475, 476, 477, 478, 491, 493, 494 495, 496, 509, 511, 512, 513, 514, 527, 529, 530, 531, 532 545, 547, 548, 549, 550, 563, 565, 566, 567, 568, 581, 583 584, 585, 586, 599, 601, 602, 603, 604, 617, 619, 620, 621
ou 622), ou uma sequência substancialmente homóloga dessas (v.g., uma sequência que seja pelo menos cerca de 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais idêntica a essas) . O anticorpo aqui descrito e/ou reivindicado pode compreender uma, duas ou três CDR do domínio VH de um anticorpo seleccionado entre 356A11, 354A08, 087B03 e 368D04. O anticorpo, ou um seu fragmento de ligação ao antigénio, pode conter uma região variável de cadeia pesada que compreenda: a) SEQ ID NO: 170 ou 494; b) SEQ ID NO: 171 ou 4 95; e/ou c) SEQ ID NO: 172 ou 496 (087B03); a) SEQ ID NO: 296 ou 548; b) SEQ ID NO: 297 ou 54 9; e/ou c) SEQ ID NO: 298 ou 550 (354A08); a) SEQ ID NO: 206 ou 620; b) SEQ ID NO: 207 ou 621; e/ou c) SEQ ID NO: 208 ou 622 (368D04); ou a) SEQ ID NO: 350 ou 602; b) SEQ ID NO: 351 ou 603; e/ou c) SEQ ID NO: 352 ou 604 (356A11). 12 0 anticorpo pode compreender uma, duas ou três CDR do domínio VL que possua uma sequência de aminoácidos seleccionada entre as sequências aqui explicitadas ou incluídas nos quadros 1 e 7 (SEQ ID NO : 6, 7, 11 , 12, 13, 24, 25, 29 i, 30 , 31, 42, 43, 47, 48 , 49, 60, 61, 65 ), 66, 67, 00 Γ" 79, 83, 84, 85, , 96, 97, 101, 102, 103, 114, 115, 119, 120, 121, 132, 133, 137, 138, 139, 150, 151, 155, 156, 157, 168, 169, 173, 174, 175, 186, 187, 191, 192, 193, 204, 205, 209, 210, 211, 222, 223, 227, 228, 229, 240, 241, 245, 246, 247, 258, 259, 263, 264, 265, 276, 277, 281, 282, 283, 294, 295, 299, 300, 301, 312, 313, 317, 318, 319, 330, 331, 335, 336, 337, 348, 349, 353, 354, 355, 366, 367, 371, 372, 373, 384, 385, 389, 390, 391, 402, 403, 407, 408, 409, 420, 421, 425, 426, 427, 438, 439, 443, 444, 445, 456, 457, 461, 462, 463, 474, 475, 479, 480, 481, 492, 493, 497, 498, 499, 510, 511, 515, 516, 517, 528, 529, 533, 534, 535, 546, 547, 551, 552, 553, 564, 565, 569, 570, 571, 582, 583, 587, 588, 589, 600, 601, 605, 606, 607, 618, 619, 623, 624 ou 625 >) , ou uma sequência substancialmente idêntica a estas (v.g., uma sequência que se j a pelo menos cerca de 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais idêntica a essas ). o anticorpo aqui descrito e/ou reivindicado pode compreender uma, duas ou três CDR do domínio VL de um anticorpo seleccionado entre 356A11, 354A08, 087B03 e 368D04. 0 anticorpo, ou um seu fragmento de ligação ao antigénio, pode conter uma região variável de cadeia leve que compreenda: a) SEQ ID NO: 173 ou 497; b) SEQ ID NO: 174 ou 498; e/ou c) SEQ ID NO: 175 ou 499 (087B03); a) SEQ ID NO: 299 ou 551; b) SEQ ID NO: 300 ou 552; e/ou c) SEQ ID NO: 301 ou 553 (354A08); 13 a) SEQ ID NO: 209 ou 623; b) SEQ ID NO: 210 ou 624; e/ou c) SEQ ID NO: 211 ou 625 (368D04); ou a) SEQ ID NO: 353 ou 605; b) SEQ ID NO: 354 ou 606; e/ou c) SEQ ID NO: 355 ou 607 (356A11). O anticorpo aqui descrito e/ou reivindicado pode compreender um fragmento H3 do domínio VH de GIL01, GIL16, GIL45, GIL60, GIL68, GIL92, 097D09, 062A09, 062G05, 087B03, 367D04, 368D04, 166B06, 166G05, 375G06, 376B10, 354A08, 355B06, 355E04 ou 356A11, v.g., um fragmento H3 que possua uma sequência de aminoácidos explicitada nos quadros 1 e 7 (SEQ ID NO: 10 / 28, 46, 64, 82, 100, 118, 136, 154, 172, 190, 208, 226, 244, 262, 280, 298, 316, 334, 352, 370, 388, 406, 424, 442, 460, 478, 496, 514, , 532 , 550, 568, . 586, 604 ou 622), ou uma sequência que seja substancialmente idêntica a essas (v.g., uma sequência a que seja pelo menos cerca de 85%, 90 α o f 95 Q, O f 96%, 97%, 98%, 99% ou mais idêntica a essas). O anticorpo da presente invenção pode ser de comprimento completo (v.g., inclui pelo menos uma cadeia pesada completa e pelo menos uma cadeia leve completa) ou pode compreender apenas um fragmento de ligação ao antigénio (v.g., um fragmento Fab, F(ab')2, Fv, um fragmento Fv de cadeia singular, um fragmento Fd ou um fragmento dAb) . O anticorpo pode compreender uma região constante, ou uma sua parcela, seleccionada entre os genes das regiões constantes κ, A, oí, γ, δ, ε e μ. Por exemplo, é possível utilizar as regiões constantes de cadeia pesada dos diversos isotipos, incluindo: IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgAl, IgA2, IgD e IgE. A região constante de cadeia leve pode ser seleccionada entre as regiões κ ou λ. O anticorpo pode ser uma IgG ou também pode ser IgGlx ou IgGlY. 14 0 anticorpo anti-IL-22 aqui descrito pode ser transformado ou ligado a uma outra molécula funcional (tal como um outro péptido ou uma outra proteína (v.g., um fragmento Fab)). Por exemplo, um anticorpo da invenção pode ser funcionalmente ligado (v.g., por acoplamento químico, por fusão genética, por associação de tipo não covalente ou de qualquer outra forma) pelo menos a uma outra entidade molecular, tal como um outro anticorpo (v.g., um anticorpo biespecífico ou multiespecífico) , a uma toxina, a um radioisótopo, a uma gente citotóxico ou citostático, entre outros.
De acordo com um outro aspecto, a invenção diz respeito a uma composição farmacêutica que contenha pelo menos um anticorpo anti-IL-22 e um veículo farmaceuticamente aceitável. A composição farmacêutica pode compreender também uma combinação constituída pelo menos por um anticorpo anti-IL-22 e pelo menos um agente terapêutico (v.g., uma citoquina e inibidores do factor de crescimento, imunossupressores, agentes anti-inflamatórios, inibidores metabólicos, inibidores enzimáticos, agentes citotóxicos, agentes citostáticos ou suas combinações, conforme aqui descrito de forma mais minuciosa). Também são aqui descritas combinações do anticorpo anti-IL-22 e de um agente terapêutico. As composições e combinações da invenção podem ser utilizadas para regular estados inflamatórios associados à IL-22, v.g., modulando a sinalização da IL-22 através dos seus receptores localizados nas células epiteliais de diversos tecidos, incluindo, mas sem qualquer limitação, os do pâncreas, pele, pulmões, intestino, fígado, rins, glândulas salivares e endotélio vascular, para além de 15 células imunitárias localizadas em tecidos e potencialmente activadas.
Também se descreve aqui um processo para tratar um indivíduo com uma patologia associada à IL-22. 0 processo consiste em administrar a um indivíduo um anticorpo anti-IL-22 numa quantidade suficiente para inibir pelo menos uma actividade da IL-22 de células imunes, tratando-se assim a patologia associada à IL-22. 0 anticorpo anti-IL-22 pode ser administrado a um indivíduo por si só ou em combinação com outros agentes terapêuticos, conforme aqui descrito. 0 indivíduo pode ser um mamífero, v.g. um ser humano. Por exemplo, o processo pode ser utilizado para tratar um indivíduo com uma patologia associada à IL-22, tal como uma patologia autoimunitária, v.g., artrite (incluindo artrite reumatóide, artrite reumatóide juvenil, osteoartrite, artrite psoriática, artrite associada ao lúpus ou espondilite anquilosante), escleroderma, eritematose do lúpus sistémico, VIH, síndroma de Sjogren, vasculite, esclerose múltipla, tiroidite autoimune, dermatite (incluindo a dermatite atópica e a dermatite eczematosa), miastenia grave, doença intestinal inflamatória (IBD), doença de Crohn, colite, diabetes mellitus (tipo I); estados inflamatórios, v.g., da pele {v.g., psoríase), do sistema cardiovascular {v.g., aterosclerose), do sistema nervoso {v.g., doença de Alzheimer), do fígado {v.g., hepatite), dos rins {v.g., nefrite) e do pâncreas {v.g., pancreatite); patologias cardiovasculares, v.g., patologias metabólicas do colesterol, lesões provocadas pelo radical livre oxigénio, isquémia; patologias associadas à cicatrização de ferimentos; patologias respiratórias, v.g., asma e COPD {v.g., fibrose 16 cística); estados inflamatórios agudos (e.g., endotoxemia, sépsis e septicémia, síndroma do choque tóxico e doenças infecciosas); rejeição de transplantes e alergias. De acordo com uma forma de realização, a patologia associada à IL-22 é uma patologia artrítica, v.g., uma patologia seleccionada entre artrite reumatóide, artrite reumatóide juvenil, osteoartrite, artrite psoriática ou espondilose anquilosante; uma patologia respiratória (v.g., asma, doença pulmonar obstrutiva crónica (COPD); ou um estado inflamatório, v.g., da pele (v.g., psoríase), do sistema cardiovascular (v.g., aterosclerose), do sistema nervoso (v.g., doença de Alzheimer), do fígado (v.g., hepatite), dos rins (v.g., nefrite), do pâncreas (v.g., pancreatite) e dos órgãos gastrintestinais, v.g., colite, doença de Crohn e IBD.
Descreve-se aqui um processo para diminuir, inibir ou reduzir uma resposta, em fase aguda, num indivíduo. 0 processo consiste em administrar a esse indivíduo um agente de ligação à IL-22, v.g., um antagonista da IL-22, (v.g., um anticorpo anti-IL-22, ou um seu fragmento, conforme aqui descrito) , numa quantidade suficiente para diminuir, inibir ou reduzir a resposta, em fase aguda, no indivíduo. 0 indivíduo pode ser um mamífero, v.g., um ser humano que padeça de uma patologia associada à IL-22, incluindo, v.g., as patologias respiratórias, as patologias inflamatórias e as patologias autoimunes. 0 agente de ligação à IL-22 pode ser administrado localmente, v.g., por via tópica, subcutânea ou qualquer outro tipo de administração que não incida sobre a circulação geral. É possível utilizar um agente de ligação à IL-22 para alterar o tipo de resposta imune e/ou para aumentar a eficácia de uma formulação de vacina utilizada para 17 imunizar um indivíduo. Por exemplo, é possível administrar um anticorpo anti-IL-22 antes, durante e/ou após uma imunização para aumentar a eficácia da vacina. A formulação de vacina pode conter um ou vários antagonistas da IL-22 e um antigénio, isto é, um imunogénio, incluindo, por exemplo, antigénios virais, bacterianos ou tumorais. Em alternativa, o antagonista de IL-22 e o imunogénio são administrados separadamente, v.g., com um afastamento temporal entre eles de uma hora, três horas, um dia ou dois dias. A presença de IL-22 pode ser detectada numa amostra in vitro. As amostras podem ser amostras biológicas, tais como soro, plasma, tecidos e material de biópsias. 0 processo em guestão pode ser utilizado para diagnosticar uma patologia, tal como uma patologia associada à IL-22, conforme agui descrito. 0 processo compreende os passos seguintes: (1) fazer contactar a amostra, ou uma amostra de controlo, com um anticorpo anti-IL-22 e (2) detectar a formação de um complexo entre o anticorpo anti-IL-22 e a amostra, ou amostra de controlo, de tal modo gue uma alteração estatisticamente significativa na formação do complexo na amostra, relativamente à amostra de controlo, é um sinal indicador da presença de IL-22 na amostra.
Também se descreve agui um processo para detectar a presença de IL-22 in vivo (v.g., por imagiologia de um indivíduo in vivo). 0 processo pode ser utilizado para diagnosticar uma patologia, v.g., uma patologia associada à IL-22, conforme aqui descrito. 0 processo compreende os passos seguintes: (1) administrar um anticorpo anti-IL-22 a um indivíduo, ou a um indivíduo de controlo, em condições que permitam a ligação do anticorpo à IL-22 e (2) detectar 18 a formação de um complexo entre o anticorpo e a IL-22, em que uma alteração estatisticamente significativa na formação do complexo no indivíduo, relativamente a um controlo, v.g., um indivíduo de controlo, é um sinal indicador da presença de IL-22. 0 anticorpo pode ser marcado directa ou indirectamente com uma substância detectável para facilitar a detecção do anticorpo ligado ou não ligado. As substâncias detectáveis convenientes são diversas enzimas, grupos prostéticos, materiais fluorescentes, materiais luminescentes e materiais radioactivos.
Também se descreve aqui um processo para administrar ou encaminhar um agente, v.g., um agente terapêutico ou um agente citotóxico, para uma célula em que tenha lugar a expressão de IL-22 in vivo. 0 processo consiste em administrar um anticorpo anti-IL-22 a um indivíduo em condições que permitam a ligação do anticorpo à IL-22. 0 anticorpo pode ser acoplado a um segundo radical terapêutico, tal como uma toxina. A memória descritiva proporciona sequências de ácidos nucleicos dos domínios VH e VL de GIL16, GIL60, GIL68, GIL92, 097D09, 062A09, 062G05, 087B03, 367D04, 368D04, 166B06, 166G05, 375G06, 376B10, 354A08, 355B06, 355E04 e 356A11. Proporciona também sequências de ácidos nucleicos que compreendem pelo menos uma CDR de GIL16, GIL60, GIL68, GIL92, 097D09, 062A09, 062G05, 087B03, 367D04, 368D04, 166B06, 166G05, 375G06, 376B10, 354A08, 355806, 355E04 e 356A11. A memória descritiva proporciona também vectores e células hospedeiras que compreendem tais ácidos nucleicos. São aqui descritos processos para a produção de novos domínios VH e VL e de anticorpos funcionais que compreendem 19 a totalidade, ou uma parte, de tais domínios provenientes dos domínios VH ou VL de GIL01, GIL16, GIL45, GIL60, GIL68, GIL92, 097D09, 062A09, 062G05, 087B03, 367D04, 368D04, 166B06, 166G05, 375G06, 376B10, 354A08, 355B06, 355E04 ou 356A11. Há outros aspectos suplementares da memória descritiva que irão ser explicitados, em parte, no presente texto, e em parte que são óbvios a partir do texto, ou que podem ser apreendidos na prática da invenção. A invenção é explicitada e particularmente evidenciada nas reivindicações, não devendo a memória descritiva ser considerada como limitativa do âmbito das reivindicações. 0 texto minucioso subsequente compreende representações exemplificativas de diversas formas de realização da invenção, as quais não são restritivas da presente invenção, tal como reivindicada. As figuras anexas constituem uma parte da presente memória descritiva e conjuntamente com o texto servem para ilustrar formas de realização, sem contudo limitarem a invenção.
DESCRIÇÃO ABREVIADA DAS FIGURAS
Figura 1. Potência dos clones parentais de scFv anti-IL-22 no ensaio do complexo do receptor de IL-22: ensaio de competição DELFIA para o complexo de bio.IL-22 que se liga ao receptor IL-22.
Figura 2. Representação de clones de scFv qualificados no ensaio do complexo do receptor de IL-22: ensaio de competição DELFIA para o complexo de bio.IL-22 que se liga ao receptor de IL-22. (A) derivados de GIL 1. (B) derivados de GIL 16. (C) derivados de GIL 16, GIL 60 e GIL 68. (D) 20 derivados de GIL 60. (E) derivados de GIL 68. (F) derivados de GIL 68. (G) derivados de GIL 92.
Figura 3. Potência da IgG em ensaios baseados em células de GROa. As GIL-IgG optimizadas num ensaio com huIL-22 GROa. (A) IgG genomutacionada. (B) IgG não genomutacionada.
Figura 4. Reactividade cruzada de espécies de anticorpos de IL-22 pelo protocolo ELISA. As GIL-IgG optimizadas ligam-se especificamente à IL-22. (A) IgG genomutacionada. (B) IgG não genomutacionada.
Figura 5. Sequências de aminoácidos e de nucleótidos da IL-22 humana. A sequência de nucleótidos da IL-22 humana é a SEQ ID NO: 2 e compreende uma cauda poli (A) . A sequência de nucleótidos explicitada compreende uma grelha de leitura aberta e a sequência de aminoácidos da proteína IL-22 de comprimento completo, correspondente à sequência de nucleótidos referida antes, está explicitada na SEQ ID NO: 1. A sequência de aminoácidos da IL-22 madura corresponde, sensivelmente, aos aminoácidos 34-179 da SEQ ID NO: 1.
Figura 6. Sequências de aminoácidos e de nucleótidos da IL-22 do murganho.
Figura 7. Sequências de aminoácidos e de nucleótidos de GIL01, GIL16, GIL45, GIL60, GIL68, GIL92, 097D09, 062A09, 062G05, 087B03, 367D04, 368D04, 166B06, 166G05, 375G06, 376B10, 354A08, 355B06, 355E04 e 356A11 não genomutacionados, incluindo os domínios VH e VL, e das CDR (Hl, H2, H3, Ll, L2 e L3).
Figura 8. Sequências de aminoácidos e de nucleótidos de GIL01, GIL16, GIL45, GIL60, GIL68, GIL92, 062A09, 087B03, 166B06, 166G05, 354A08, 355B06, 355E04, 356A11 e 21 368D04 genomutacionados, incluindo os domínios VH e VL/ e das CDR (Hl, H2, H3, Ll, L2 e L3).
Figura 9. Sequências de aminoácidos e de nucleótidos dos scFv para G1L01, GIL16, GIL45, GIL60, GIL68, G1L92, 097D09, 062A09, 062G05, 087B03, 367D04, 368D04, 166B06, 166G05, 375G06, 376B10, 354A08, 355B06, 355E04 e 356A11 não genomutacionados, com as CDR sublinhadas (Hl, H2, H3, Ll, L2 e L3).
Figura 10. Sequências de aminoácidos e de nucleótidos dos scFv para GIL01, GIL16, GIL45, GIL60, GIL68, GIL92, 062A09, 087B03, 166B06, 166G05, 354A08, 355B06, 355E04, 356A11 e 368D04 genomutacionados, com as CDR sublinhadas (Hl, H2, H3, Ll, L2 e L3).
DESCRIÇÃO MINUCIOSA I. Definições
Para que a presente invenção possa ser compreendida mais facilmente, apresenta-se a definição de alguns termos. Outras definições irão aparecendo ao longo da descrição minuciosa. O termo "anticorpo" refere-se a uma imunoglobulina, ou a um seu fragmento, e diz respeito a qualquer polipeptido que compreenda um fragmento que se ligue a um antigénio, ou um domínio que se ligue a um antigénio. O termo abrange, mas sem qualquer limitação, os anticorpos policlonais, monoclonais, monoespecíficos, poliespecíficos, não específicos, humanizados, humanos, de cadeia singular, quiméricos, sintéticos, recombinantes, híbridos, mutacionados, enxertados e os gerados in vitro. A não ser que seja precedido pela palavra "intacto", 22 o termo "anticorpo" abrange os fragmentos de anticorpos, tais como Fab, f(ab')2, Fv, scFv, Fd, dAb e outros fragmentos de anticorpos que conservem a função de ligação ao antigénio. De uma forma tipica, tais fragmentos costumam compreender um domínio de ligação ao antigénio.
Os termos "domínio de ligação ao antigénio" e "fragmento de ligação ao antigénio" referem-se a uma parte de uma molécula do anticorpo que compreende os aminoácidos responsáveis pela ligação específica entre o anticorpo e o antigénio. A parte do antigénio que é especificamente reconhecida pelo anticorpo e a ele se liga é designada por "epítopo". Um domínio de ligação ao antigénio pode compreender uma região variável de cadeia leve do anticorpo (VL) e uma região variável de cadeia pesada do anticorpo (VH); no entanto, não tem de possuir ambas as regiões. Por exemplo, os fragmentos Fd têm duas regiões VH, e frequentemente conservam alguma função de ligação ao antigénio, das existentes no domínio intacto de ligação ao antigénio. Como exemplos de fragmentos de um anticorpo, de ligação ao antigénio, refere-se: (1) um fragmento Fab, um fragmento monovalente que possua os domínios VL, VH, CL e CH1; (2) um fragmento F(ab')2> um fragmento bivalente que possua dois fragmentos Fab ligados por uma ponte dissulfureto na região de charneira; (3) um fragmento Fd que possua os dois domínios VH e CH1; (4) um fragmento Fv que possua os domínios VL e VH de um braço singular de um anticorpo; (5) um fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), que possua um domínio VH; (6) uma região isolada determinante da complementaridade (CDR); e (7) um fragmento Fv de cadeia singular (scFv). Embora os dois domínios do fragmento Fv, VL e VH, sejam codificados por 23 genes separados, podem ser unidos, recorrendo a métodos recombinantes, por um ligador sintético que os habilite a ficarem constituídos sob a forma de uma cadeia proteínica singular, em que o par de regiões VL e VH forme moléculas monovalentes (conhecidas por Fv de cadeia singular (scFv); ver, v.g., Bird et al. (1988) Science 242:423-426; e Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:5879-5883) . Estes fragmentos de anticorpos são obtidos recorrendo a técnicas convencionais conhecidas pelos especialistas na matéria, sendo os fragmentos avaliados para se pesquisar a sua função, da mesma maneira que são avaliados os anticorpos intactos. 0 termo "quantidade eficaz" designa uma dose ou quantidade que seja suficiente para regular a actividade da IL-22 para melhorar os sintomas clínicos ou para se conseguir um resultado biológico desejado, v.g., uma menor actividade das células T e/ou das células B, a supressão da autoimunidade, a supressão da rejeição de transplantes, etc. . 0 termo "anticorpo humano" designa anticorpos que possuem regiões variáveis e constantes substancialmente correspondentes às sequências de imunoglobulinas de linhagens germinais mutacionadas humanas conhecidas na especialidade, incluindo, por exemplo, as descritas por Kabat et al. (ver Kabat, et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). Os anticorpos humanos da presente invenção podem compreender resíduos aminoácidos não codificados por sequências de imunoglobulinas de linhagens germinais humanas {v.g., mutações introduzidas por mutagénese 24 aleatória ou especifica do local ín vitro ou por mutação somática in vivo) , por exemplo, nas CDR, e em particular na CDR3. 0 anticorpo humano pode possuir pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou mais posições substituídas por um resíduo aminoácido que não seja codificado pela sequência da imunoglobulina das linhagens germinais humanas. A frase "inibir" ou "antagonizar" a actividade de IL-22, e dos seus cognados, refere-se a uma redução, inibição ou qualquer outro tipo de diminuição de uma actividade, pelo menos, da IL-22, devido à ligação a um anticorpo anti-IL-22, em que a redução é relativa à actividade de IL-22 na ausência do mesmo anticorpo. A actividade pode ser medida recorrendo a qualquer técnica conhecida na especialidade, incluindo, por exemplo, as descritas nos exemplos 7 e 9. A inibição ou o antagonismo não indicam, necessariamente, uma eliminação total da actividade biológica do polipeptido de IL-22. Uma redução de actividade pode ser de cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais. O termo "interleucina 22" ou "IL-22" designa uma citoquina de classe II (que pode ser de mamífero) capaz de se ligar a IL-22R e/ou a um complexo de receptores constituído por IL-22R e IL-10R2, a qual possui pelo menos uma das particularidades seguintes: (1) é uma sequência de aminoácidos de um polipeptido de IL-22 (forma de comprimento completo ou madura), ou a um seu fragmento, de um mamífero, que ocorre naturalmente, v.g., uma sequência de aminoácidos identificada por SEQ ID NO: 1 (humana) ou SEQ ID NO: 3 (murino) , ou um seu fragmento; (2) é uma sequência de aminoácidos substancialmente idêntica, v.g., pelo menos 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% idêntica a uma sequência de aminoácidos identificada por SEQ ID NO: 1, ou 25 os seus aminoácidos 34-179 (humana) ou SEQ ID NO: 3 (murino) , ou um seu fragmento; (3) é uma sequência de aminoácidos que é codificada por uma sequência nucleotidica de IL-22 de um mamífero, que ocorre naturalmente, ou um seu fragmento (v.g., SEQ ID NO: 2 ou nucleótidos 71 a 610 (humanos) ou SEQ ID NO: 4 (murinos), ou um seu fragmento); (4) é uma sequência de aminoácidos codificada por uma sequência nucleotidica que é substancialmente idêntica, v.g., pelo menos 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% a uma sequência nucleotidica identificada por SEQ ID NO: 2 ou seus nucleótidos 71 a 610 (humanos) ou SEQ ID NO: 4 (murinos), ou um seu fragmento; (5) uma sequência de aminoácidos codificada por uma sequência nucleotidica degenera numa sequência nucleotidica de IL-22, que ocorre naturalmente, ou num seu fragmento, v.g., a SEQ ID NO: 2 (humana) ou a SEQ ID NO: 4 (murino), ou um seu fragmento; ou (6) uma sequência nucleotidica que híbrida com uma das sequências nucleotídicas anteriormente referidas, em condições restringentes, v.g., condições fortemente restringentes. A IL-22 pode ligar-se ao IL-22R e/ou a um complexo de receptores constituído por IL-22R e IL-10R2, com origem num mamífero, v.g., um ser humano ou um murganho. A sequência nucleotidica e a sequência de aminoácidos prevista da IL-22 humana estão representadas, respectivamente, por SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 1. A sequência de aminoácidos da IL-22 humana madura corresponde aos aminoácidos 34-179 da SEQ ID NO: 1. A análise da IL-22 humana recombinante revela muitos domínios estruturais. (Nagem et ai. (2002) Structure, 10:1051-62; pedido de patente de invenção norte-americana n° US 2002/0187512 Al). 26 0 termo "actividade de IL-22" designa pelo menos um processo celular iniciado ou interrompido como resultado da ligação de IL-22 a um complexo de receptores constituído por IL-22R e IL-1 0R2 na célula. As actividades de IL-22 compreendem, sem qualquer limitação, pelo menos uma das seguintes: (1) ligação ao IL-22R ou a um complexo de receptores constituído por IL-22R e IL-10R2 (v.g., o IL-22R humano, com ou sem a IL-1 0R2 humana); (2) associação com as moléculas de transdução de sinal (v.g., JAK-1); (3) estimulação da fosforilação das proteínas STAT (v.g., STAT5, STAT3 ou uma sua combinação); (4) activação das proteínas STAT; e (5) modulação (v.g., aumento ou diminuição), proliferação, diferenciação, função celular efectora, actividade citolítica, secrecção de citoquinas, sobrevivência, ou suas combinações, de células epiteliais, fibroblastos ou células imunes. As células epiteliais compreendem, mas sem qualquer limitação, as células da pele, intestino, fígado e rins e também as células endoteliais. Os fibroblastos compreendem, mas sem qualquer limitação, os fibroblastos sinoviais. As células imunes podem ser as células T CD8+ e CD4 + , as células NK, as células B, macrófagos e megacariócitos. A actividade de IL-22 pode ser determinada in vitro, por exemplo, recorrendo ao ensaio de inibição do receptor de IL-22, conforme descrito nos exemplos 2 e 6, ao ensaio de secrecção de GROa descrito no exemplo 9 ou ao ensaio de proliferação de BAF3 descrito no exemplo 7. Também é possível determinar a actividade de IL-22 in vivo, por exemplo, registando e classificando a progressão de uma resposta ou patologia imunitária, conforme descrito no exemplo 13. 27
Tal como aqui utilizado, o termo "anticorpo gerado in vitro" designa um anticorpo em que a totalidade, ou uma parte da região variável (v.g., pelo menos uma CDR), é gerada numa selecção de células não imunes {v.g., num modelo de expressão de fagos in vitro, num modelo e microplacas proteinicas ou por meio de qualquer outro processo que permita testar as sequências elegíveis para se pesquisar a sua aptidão para se ligarem a um antigénio). Este termo exclui as sequências geradas por rearranjo genómico numa célula imune. 0 termo "isolado" designa uma molécula que está substancialmente separada do seu ambiente natural. Por exemplo, uma proteína isolada está substancialmente isenta de material celular ou de outras proteínas provenientes da fonte celular ou tecidual de onde proveio. 0 termo qualifica também preparações em que a proteína isolada é suficientemente pura para composições farmacêuticas; ou então é pelo menos 70-80% (p/p) pura; ou pelo menos 80-90% (p/p) pura; ou pelo menos 90-95% pura; ou pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% (p/p) pura. A frase "percentualmente idêntica", ou "identidade percentual", designa uma semelhança entre pelo menos duas sequências diferentes. É possível determinar a identidade percentual por meio de algoritmos convencionais de alinhamento, por exemplo, o protocolo 'Basic Local Alignment Tool' (BLAST) descrito por Altshul et al. ((1990) J. Mol. Biol., 215: 403-410); o algoritmo de Needleman et al. ((1970) J. Mol. Biol., 48: 444-453); ou o algoritmo de
Meyers et al. ((1988) Comput. Appl. Biosci., 4: 11-17). Como exemplo de um conjunto de parâmetros refere-se a matriz de classificação 'Blosum 62' com um ponderador de 28 lacunas de alinhamento igual a 12, um ponderador de prolongamento das lacunas de alinhamento igual a 4 e um ponderador de desvio da grelha de lacunas de alinhamento igual a 5. Também é possível determinar a identidade percentual entre duas sequências de aminoácidos ou de nucleótidos, utilizando o algoritmo de E. Meyers e W. Miller ((1989) CABIOS, 4:11-17), que foi incorporado no programa 'ALIGN' (versão 2.0), utilizando a tabela de resíduos ponderadores PAM120, um ponderador de comprimento das lacunas de alinhamento igual a 12 e um ponderador de lacunas igual a 4. A identidade percentual é calculada, normalmente, fazendo a comparação de sequências com um comprimento semelhante. O termo "repertório" designa pelo menos uma sequência nucleotídica obtida, total ou parcialmente, a partir de pelo menos uma sequência que codifique pelo menos uma imunoglobulina. As sequências podem ser geradas por rearranjo in vivo dos segmentos V, D e J das cadeias pesadas e dos segmentos V e J das cadeias leves. Em alternativa, as sequências podem ser geradas a partir de uma célula, em resposta àquilo que dá origem ao rearranjo, v.g., uma estimulação in vitro. Em alternativa, é possível obter uma parte ou a totalidade das sequências por junção de ADN, síntese nucleotídica, mutagénese e por outros processos; ver, v.g., a patente de invenção norte-americana n° 5 565 332. Um repertório pode conter apenas uma sequência ou pode conter um conjunto de sequências, incluindo aquelas que pertencem a uma colecção geneticamente diversa.
Os termos "ligação especifica" ou "liga-se especificamente" dizem respeito a duas moléculas que formam um complexo que é relativamente estável em condições 29 fisiológicas. A ligação especifica caracteriza-se por uma elevada afinidade e por uma capacidade entre diminuta e moderada, distinguindo-se de uma ligação não especifica que manifesta, normalmente, uma afinidade diminuta com uma capacidade entre moderada e elevada. De uma forma tipica, considera-se que a ligação é especifica, quando a constante de associação KA é superior a 106 M”1. Se necessário, é possível reduzir a ligação não específica sem afectar substancialmente a ligação específica, fazendo variar as condições de ligação. As condições adequadas de ligação, tais como a concentração de anticorpos, força iónica da solução, temperatura, tempo permitido para a ligação, concentração de um agente bloqueador (v.g., albumina do soro, caseína do leite), etc., podem ser optimizadas por um especialista na matéria, recorrendo a técnicas vulgares. As condições ilustrativas estão explicitadas no exemplo 3, mas há outras condições conhecidas pelos técnicos desta especialidade, que estão abrangidas no âmbito da presente invenção.
Tal como aqui utilizado, o termo "restringente" descreve as condições para hibridação e lavagem. As condições restringentes de hibridação são conhecidas pelos especialistas na matéria e podem ser encontradas na obra 'Current Protocols in Molecular Biology', John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Nesta obra estão descritos processos aquosos e não aquosos, podendo ser utilizados quaisquer deles. Um exemplo de condições restringentes de hibridação é o da hibridação feita em solução de citrato de sódio/cloreto de sódio 6X (SSC) a cerca de 45°C, seguindo-se pelo menos uma lavagem em SSC 0,2X, SDS a 0,1 % a 50°C. Um segundo exemplo de condições restringentes de hibridação 30 é a hibridação em SSC 6X a cerca de 45°C, seguindo-se pelo menos uma lavagem em SSC 0,2X, SDS a 0,1% a 55°C. Um outro exemplo de condições restringentes de hibridação é o da hibridação feita em SSC 6X a cerca de 45°C, seguindo-se pelo menos uma lavagem em SSC 0,2X, SDS a 0,1% a 60°C. Um outro exemplo de condições restringentes de hibridação é a hibridação feita em SSC 6X a cerca de 45°C, seguindo-se pelo menos uma lavagem em SSC 0,2X, SDS a 0,1% a 65°C. As condições fortemente restringentes compreendem a hibridação em fosfato de sódio 0,5M, SDS a 7% a 65°C, seguindo-se pelo menos uma lavagem em SSC 0,2X, SDS a 1 % a 65°C. A frase "substancialmente conforme explicitado", "substancialmente idêntico" ou "substancialmente homólogo" significa que a sequência relevante de aminoácidos ou de nucleótidos (v.g., os domínios CDR, VH ou VL) irá ser idêntica ou irá ter diferenças insubstanciais (através de substituições de aminoácidos conservados), comparativamente com as sequências explicitadas. As diferenças insubstanciais compreendem pequenas substituições de aminoácidos, tais como uma ou duas substituições numa sequência de aminoácidos de uma região especificada. No caso dos anticorpos, o anticorpo secundário pode ter a mesma especificidade e pode possuir pelo menos 50% da afinidade do primeiro anticorpo.
As sequências substancialmente idênticas, ou homólogas, (v.g., com uma identidade sequencial pelo menos igual a cerca de 85%) às sequências aqui descritas também fazem parte da presente invenção. De acordo com uma forma de realização, a identidade sequencial pode ser cerca de 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou superior. Em alternativa, existe uma identidade substancial ou homologia, quando os segmentos de ácidos nucleicos vão hibridar, em condições 31 selectivas de hibridação (v.g., condições de hibridação fortemente restringentes), com o complemento da cadeia. Os ácidos nucleicos podem estar presentes em células inteiras, num lisado celular ou numa forma parcialmente purificada ou substancialmente pura. 0 termo "agente terapêutico" designa uma substância que trata ou ajuda a tratar uma patologia médica. Os agentes terapêuticos podem compreender, mas sem qualquer limitação, as substâncias que modulem células imunes, ou respostas imunes, de uma maneira que complemente a actividade da IL-22 dos anticorpos anti-IL-22. São aqui descritos exemplos não limitativos e utilizações de agentes terapêuticos.
No contexto da presente memória descritiva, uma "quantidade terapeuticamente eficaz" de um anticorpo anti-IL-22 designa uma quantidade de um anticorpo que é eficaz, após a administração de uma dose singular ou múltipla a um indivíduo (tal como um paciente humano) para tratar, prevenir, curar, retardar, reduzir a gravidade e/ou melhorar pelo menos um sintoma de uma patologia ou de uma doença recorrente, ou para prolongar o período de vida do indivíduo para além daquilo que seria previsível na ausência de tal tratamento. 0 termo "tratamento" designa um procedimento terapêutico ou preventivo. 0 tratamento pode ser aplicado a um indivíduo que padeça de uma patologia médica ou que possa estar em risco de vir a padecer de tal patologia, com o intuito de se prevenir, curar, retardar, reduzir a gravidade e/ou melhorar um ou vários sintomas de uma patologia ou de uma doença recorrente, com a finalidade de 32 se prolongar o período de vida do indivíduo para além daquilo que seria previsível na ausência de tal tratamento. II. Anticorpos anti-IL-22 A presente invenção proporciona novos anticorpos anti-IL-22 que compreendem novos fragmentos de ligação aos antigénios.
Os especialistas na matéria conhecem inúmeros processos para se obter anticorpos, ou os seus fragmentos, de ligação aos antigénios. Por exemplo, é possível produzir anticorpos recorrendo a processos do ADN recombinante (patente de invenção norte-americana n° 4 816 567). Também é possível produzir anticorpos monoclonais para gerar hibridomas (ver, v.g., Kohler e Milstein (1975) Nature, 256: 495-499), em conformidade processos conhecidos. Os hibridomas produzidos desta maneira são depois pesquisados recorrendo a processos convencionais, tais como o ensaio imunoabsorvente ligado a enzimas (ELISA) e a análise por ressonância do plasmão da superfície (BIACORE™), para se identificar um ou vários hibridomas que produzam um anticorpo que se ligue especificamente com um antigénio especificado. É possível utilizar como imunogénio qualquer forma do antigénio especificado, v.g., um antigénio recombinante, formas que ocorram naturalmente, todas a variantes, ou seus fragmentos, e também as suas formas peptídicas antigénicas.
Um processo exemplificativo para a preparação de anticorpos consiste em pesquisar bibliotecas de expressão de proteínas, v.g., bibliotecas de expressão de fagos ou ribossomas. A metodologia dos fagos foi descrita, por 33 exemplo, por Ladner et al., na patente de invenção norte-americana n° 5 223 409; Smith (1985) Science 228:1315-1317; Clackson et al. (1991) Nature, 352: 624-628; Marks et al. (1991) J. Mol. Biol., 222: 581-597 WO 92/18619; WO 91/17271; WO 92/20791; WO 92/15679; WO 93/01288; WO 92/01047; WO 92/09690; e WO 90/02809.
Para além da utilização das bibliotecas de expressão, é possível utilizar o antigénio especificado para imunizar um animal não humano, v.g., um roedor, v.g., um murganho, um criceto ou um rato. De acordo com uma forma de realização, o animal não humano possui pelo menos uma parte de um gene de imunoglobulina humana. Por exemplo, é possível manipular geneticamente estirpes de murganhos, deficientes em termos de produção de anticorpos de murganho, com fragmentos grandes dos loci da Ig humana. Recorrendo à tecnologia dos hibridomas, é possível produzir e seleccionar anticorpos monoclonais, específicos do antigénio, obtidos a partir dos genes com a especificidade desejada. Ver, v.g., XENOMOUSE™, Green et ai. (1994) Nature Genetics 7:13-21, US 2003-0070185, WO 96/34096, publicado a 31 de Outubro de 1986, e o pedido de patente de invenção PCT com o número PCT/US96/05928, depositado a 29 de Abril de 1996.
De acordo com uma outra forma de realização, obtém-se um anticorpo monoclonal a partir do animal não humano, sendo depois modificado, v.g., humanizado, desimunizado ou quimérico, sendo a sua produção feita recorrendo a técnicas do ADN recombinante conhecidas na especialidade. Foram já descritas diversas metodologias para a produção de anticorpos quiméricos. Ver, v.g., Morrison et al., Proc. Natl. Acad Sei. U.S.A. 81:6851, 1985; Takeda et ai., Nature 34 314:452, 1985, Cabilly et al., patente de invenção norte-americana n° 4 816 567/ Boss et ai., patente de invenção norte-americana n° 4 816 397; Tanaguchi et ai., publicação da patente de invenção europeia EP171496; publicação da patente de invenção europeia 0173494, patente de invenção do reino Unido GB 2177096B. Também é possível produzir anticorpos humanizados, por exemplo, utilizando murganhos transgénicos em que tenha lugar a expressão dos genes das cadeias pesada e leve humanas, mas que sejam incapazes de expressar os genes das cadeias pesada e leve da imunoglobulina endógena do murganho. Winter descreve um processo exemplificativo de enxerto de uma CDR, que pode servir para preparar anticorpos humanizados aqui descritos (patente de invenção norte-americana n° 5 225 539) . Todas as CDR de um anticorpo humano particular podem ser substituídas pelo menos com uma parcela de uma CDR não humana, ou então há apenas algumas CDR que podem ser substituídas pelas CDR não humanas. Apenas é necessário substituir o número das CDR necessárias para a ligação do anticorpo humanizado a um antigénio predeterminado.
Os anticorpos humanizados, ou os seus fragmentos, podem ser gerados substituindo as sequências do domínio variável Fv, que não estejam directamente implicadas na ligação do antigénio, por sequências equivalentes dos domínios variáveis Fv humanos. Os processos exemplificativos para gerar anticorpos humanizados, ou os seus fragmentos, foram já descritos por Morrison (1985) Science 229: 1202-1207; por Oi et ai. (1986) BioTechniques 4:214; e nos documentos US 5 585 089; US 5 693 761; US 5 693 762; US 5 859 205 e US 6 407 213. Tais processos consistem em isolar, manipular e expressar as sequências de ácidos nucleicos que codifiquem a 35 totalidade ou uma parte dos domínios variáveis Fv da imunoglobulina a partir pelo menos de uma cadeia pesada ou leve. Tais ácidos nucleicos podem ser obtidos a partir de um hibridoma que produza um anticorpo contra um alvo predeterminado, conforme descrito supra, e também a partir de outras fontes. 0 ADN recombinante que codifica a molécula de anticorpo humanizado pode ser depois clonado num vector de expressão conveniente.
Em determinadas formas de realização, faz-se a optimização de um anticorpo humanizado mediante a introdução de substituições conservadoras, por substituições da sequência de consenso, por substituições de linhagens germinais e/ou retromutações. Tais moléculas de imunoglobulinas alteradas podem ser preparadas recorrendo a qualquer uma de diversas técnicas conhecidas na especialidade (v.g., Teng et al., Proc. Natl. Acad Sei. U.S.A., 80: 7308-7312, 1983/ Kozbor et al., Immunology Today, 4: 7279, 1983; Olsson et al., Meth. Enzymol., 92: 3-16, 1982), podendo ainda ser produzidas em conformidade com os preceitos explicitados na publicação PCT com o n° WO 92/06193 ou no documento EP 0239400.
Também é possível modificar um anticorpo, ou um seu fragmento, por deleção específica de epítopos de células T humanas ou "desimunização", em conformidade com métodos descritos nos documentos WO 98/52976 e WO 00/34317. Dito de forma abreviada, é possível analisar os domínios variáveis das cadeias pesada e leve para pesquisar péptidos que se liguem à classe II do MHC; estes péptidos representam epítopos potenciais de células T (conforme definido nos documentos WO 98/52976 e WO 00/34317). Para a detecção de epítopos potenciais de células T, é possível recorrer a uma metodologia 36 de modelo informático, designada por "montagem peptidica sequencial", podendo ser pesquisada complementarmente uma base de dados relativa a péptidos de ligação à classe II do MHC humano, para procurar motivos presentes nas sequências de VH e VL, conforme descrito nos documentos WO 98/52976 e WO 00/34317. Estes motivos ligam-se a qualquer um dos 18 alotipos principais DR de classe II do MHC e por essa razão constituem epitopos potenciais de células T. Os epitopos potenciais detectados podem ser eliminados mediante a substituição de um pequeno número de resíduos aminoácidos nos domínios variáveis ou então, preferencialmente, por substituições singulares de aminoácidos. De uma forma típica, são feitas substituições conservadoras. Com frequência, mas não exclusivamente, é possível utilizar um aminoácido comum a uma posição em sequências de anticorpos de linhagens germinais humanas. As sequências de linhagens germinais humanas estão descritas, v.g., nas obras de Tomlinson, et al. (1992) J. Mol. Biol.
227:776-798; Cook, G. P. et al. (1995) Immunol. Today Vol. 16 (5): 237-242; Chothia, D. et al. (1992) J. Mol. Biol. 227:799-817; e Tomlinson et al. (1995) EMBO J. 14:4628-4638. O directório "V BASE" constitui um directório exaustivo de sequências da região variável da imunoglobulina humana (conforme compilado por Tomlinson, I.A. et al. "MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, UK"). Estas sequências podem ser utilizadas como uma fonte de sequências humanas, v.g., para regiões de sequências estruturais e para as CDR. Também podem ser utilizadas as regiões de sequências estruturais humanas de consenso, v.g., conforme descrito na patente de invenção norte-americana n° 6 300 064.
Em determinadas formas de realização, um anticorpo pode conter uma região Fc de imunoglobulina alterada ou 37 constante. Por exemplo, um anticorpo produzido em conformidade com os preceitos aqui descritos pode ligar-se mais fortemente ou com maior especificidade a moléculas efectoras, tais como os receptores de complemento e/ou de Fc, que conseguem controlar diversas funções imunes do anticorpo, tais como uma actividade de uma célula efectora, a lise, uma actividade mediada pelo complemento, a depuração de anticorpos e o período de semi-vida dos anticorpos. Os receptores de Fc típicos, que se ligam a uma região Fc de um anticorpo (v.g., um anticorpo de IgG) , compreendem, mas sem qualquer limitação, os receptores das subclasses FcyRI, FcyRII, FcyRIII e FcRn, incluindo as variantes alélicas e as formas unidas alternadamente destes receptores. Os receptores de Fc estão descritos nas obras de Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92, 1991; Capei et al., Immunomethods 4:25-34,1994; e de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41, 1995).
Para estudo de outras técnicas de produção de anticorpos, ler a obra 'Antibodies: A Laboratory Manual', eds. Harlow et al., Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. A presente invenção não fica necessariamente limitada a nenhuma fonte particular, a nenhum processo de produção ou a quaisquer outras características especiais de um anticorpo.
Os anticorpos, também conhecidos por imunoglobulinas, são tipicamente proteínas tetraméricas glicosiladas constituídas por duas cadeias leves (L) com um comprimento de cerca de 25 kDa cada uma e por duas cadeias pesadas (H) com cerca de 50 kDa cada uma. É possível encontrar nos anticorpos dois tipos de cadeias leves, designadas por λ e k. Consoante a sequência de aminoácidos do domínio constante das cadeias pesadas, assim 38 as imunoglobulinas podem ser classificadas segundo cinco classes principais: A, D, E, G e M, e várias destas classes ainda podem ser divididas em subclasses (isotipos), v.g.r IgGi, IgG2, IgG3, IgG4, IgAi e IgA2. Cada cadeia leve compreende um domínio variável (V) do terminal N (VL) e um domínio (C) constante (CL) . Cada cadeia pesada compreende um domínio V do terminal N (VH), três ou quatro domínios C (CH) e uma região de charneira. 0 domínio CH mais próximo de VH é designado por CHI. Os domínios VH e VL são constituídos por quatro regiões de sequências relativamente conservadas, designadas por regiões de sequências estruturais (FR1, FR2, FR3 e FR4), que formam uma armação de suporte para três regiões de sequências hipervariáveis (regiões determinantes da complementaridade, as CDR). As CDR contêm a maior parte dos resíduos responsáveis por interacções específicas do anticorpo com o antigénio. As CDR são as CDR1, CDR2 e CDR3. Assim sendo, os constituintes das CDR na cadeia pesada são designados por Hl, H2 e H3, ao passo que os constituintes das CDR na cadeia leve são designados por Ll, L2 e L3. A CDR3 é, tipicamente, a maior fonte de diversidade molecular no local de ligação do anticorpo. Por exemplo, a H3 pode ser bastante pequena, apresentando apenas dois resíduos aminoácidos, ou pode ter mais do que 26 aminoácidos. As estruturas das subunidades e as configurações tridimensionais das diferentes classes de imunoglobulinas são perfeitamente conhecidas na especialidade. Para um estudo sobre a estrutura de anticorpos, ler a obra 'Antibodies: A Laboratory Manual', Cold Spring Harbor Laboratory, eds. Harlow et al., 1988. Um especialista na matéria sabe como reconhecer que cada estrutura das subunidades, v.g., uma estrutura CH, VH, CL, 39 VL, CDR, FR, compreende fragmentos activos, v.g., a parcela das subunidades VH, VL ou CDR que se liga ao antigénio, isto é, o fragmento de ligação ao antigénio, ou então, v.g., a parcela da subunidade CH que se liga, v.g., a um receptor de Fc e/ou ao complemento e/ou os activa. De uma forma típica, as CDR são as CDR de Kabat, conforme descrito em "Sequences of Proteins of Immunological Interest", US Department of Health and Human Services (1991), eds. Kabat et al. . Uma outra forma de caracterizar o local de ligação do antigénio consiste em fazer a abordagem pelas formações anelares hipervariáveis, conforme descrito por Chothia. Ver, v.g., Chothia, D. et al. (1992) J. Mol. Biol. 227:799-817; e Tomlinson et al. (1995) EMBO J. 14:4628-4638. Ainda mais uma outra forma de caracterização consiste em recorrer à definição de AbM utilizada na aplicação informática de modelos de anticorpos 'Oxford Molecular's AbM'. Ver, em termos gerais, v.g., a obra "Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains. In: Antibody Engineering Lab Manual (Ed.: Duebel, S. e Kontermann, R., Springer-Verlag, Heidelberg). Em alternativa, é possível implementar as formas de realização descritas a propósito das CDR de Kabat, utilizando as relações semelhantes descritas a propósito das formações anelares hipervariáveis de Chothia ou das formações anelares definidas para AbM. 0 fragmento Fab (Fragment antigen-binding) é constituído por domínios VH-CH1 e VL-CL ligados de forma covalente por uma ponte dissulfureto entre as regiões constantes. Os fragmentos Fv são mais pequenos e são constituídos por domínios VH e VL ligados de forma não covalente. Para se superar a tendência de os domínios ligados de forma não covalente se dissociarem, é possível construir um fragmento Fv de cadeia singular (scFv) . 0 40 fragmento scFv contém um polipeptido flexível que liga (1) o terminal C de VH ao terminal N de VL ou (2) o terminal C de VL ao terminal N de VH. É possível utilizar como ligador um péptido 15-mero (Gly4Ser)3, mas há outros ligadores conhecidos na especialidade.
Após a montagem e as mutações somáticas, a sequência dos genes dos anticorpos é muitíssimo diversificada, estimando-se que estes genes diversificados codifiquem IO10 moléculas de anticorpos diferentes (Immunoglobulin Genes, 2nd ed., eds. Jonio et al., Academic Press, San Diego, CA, 1995).
Um anticorpo "biespecífico" ou "bifuncional" é um anticorpo híbrido artificial que possui dois pares de cadeias pesadas/leves e dois locais de ligação diferentes. Os anticorpos biespecíficos podem ser produzidos recorrendo a diversos processos, incluindo a fusão de hibridomas ou a ligação de fragmentos Fab'. Ver, v.g., Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990); Kostelny et al. , J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992). De acordo com uma forma de realização, um anticorpo biespecífico compreende um primeiro polipeptido do domínio de ligação, tal como um fragmento Fab', ligado através de uma região constante da imunoglobulina a um segundo polipeptido do domínio de ligação.
Small Modular ImmunoPharmaceuticals (SMIP™) constitui um exemplo de uma molécula variante que compreende um polipeptido do domínio de ligação. Os SMIP e as suas utilizações e aplicações estão descritos, v.g., nos pedidos de patentes de invenção norte-americanas publicadas com os n°s 2003/0118592, 2003/0133939, 2004/0058445, 2005/0136049. 200510175614, 2005/0180970, 2005/0186216, 2005/0202012, 41 2005/0202023, 2005/0202028, 2005/0202534 e 2005/0238646, e correspondentes membros da família de patentes de invenção congéneres.
Um SMIP™ é, tipicamente, uma proteína de fusão entre imunoglobulina-domínio de fusão, que compreende um polipeptido do domínio de ligação que é fundido ou de alguma outra forma unido a uma polipeptido da região da charneira da imunoglobulina ou que actua como charneira, que por sua vez é fundido ou de qualquer outra forma unido a uma região que compreende uma ou várias regiões constantes, naturais ou manipuladas, provenientes de uma cadeia pesada da imunoglobulina, diferente da região CHI, por exemplo, as regiões CH2 e CH3 de IgG e de IgA, ou as regiões CH3 e CH4 da
IgE (ver, v.g., U.S. 2005/0136049 de Ledbetter, J. et al.). A proteína de fusão de imunoglobulina-domínio de ligação pode conter ainda uma região que compreenda um polipeptido da região constante CH2 da cadeia pesada da imunoglobulina manipulada (ou da região CH3 no caso de uma construção obtida na totalidade ou parcialmente a partir de IgE) que é fundido ou de qualquer outra forma ligado ao polipeptido da região de charneira, e um polipeptido da região constante CH3 da cadeia pesada da imunoglobulina manipulada (ou da região CH4 no caso de uma construção obtida na totalidade ou parcialmente a partir de IgE) que é fundido ou de qualquer outra forma ligado ao polipeptido da região constante CH2 (ou CH3 no caso de uma construção obtida na totalidade ou parcialmente a partir de IgE) . De uma forma típica, tais proteínas de fusão de imunoglobulina-domínios de fusão são capazes de desenvolver pelo menos uma actividade imunológica seleccionada entre o conjunto constituído por citotoxicidade mediada por células, dependente dos anticorpos, fixação do 42 complemento e/ou ligação a um alvo destinatário, por exemplo, um antigénio destinatário, tal como a IL-22 humana.
As proteínas terapêuticas, isto é, uma proteína ou um péptido, que tenha um efeito biológico numa região do corpo onde actue ou numa região do corpo onde actue remotamente através de intermediários, também são úteis para a prática da presente invenção. Uma proteína terapêutica pode compreender miméticos peptídicos. Os miméticos são péptidos que contêm moléculas que imitam elementos de uma estrutura secundária proteínica. Ver, por exemplo, Johnson et al., "Peptide Turn Mimetics" in BIOTECHNOLOGY AND PHARMACY, Pezzuto et al., Eds., Chapman and Hall, New York (1993). Os fundamentos lógicos subjacentes à utilização de miméticos peptídicos assentam no facto de a estrutura peptídica das proteínas servir, essencialmente, para orientar as cadeias laterais dos aminoácidos de modo a facilitar as interacções moleculares, tal como sucede no caso de anticorpos e antigénios. Admite-se que o mimético peptídico permite interacções moleculares semelhantes às da molécula natural. Estes princípios podem ser utilizados para manipular moléculas da geração secundária que possuam inúmeras propriedades naturais dos péptidos relevantes aqui descritos, mas com características alteradas e potencialmente melhores.
Outras formas de realização de proteínas terapêuticas compreendem as proteínas de fusão. Estas moléculas possuem, geralmente, a totalidade ou uma parte substancial de um péptido relevante aqui referenciado, por exemplo, IL-22 ou um anticorpo anti-IL-22, ligada no terminal N ou no terminal C à totalidade ou a uma parte de um segundo polipeptido ou proteína. Por exemplo, as fusões podem utilizar as sequências líderes de outras espécies para 43 permitirem a expressão recombinante de uma proteína num hospedeiro heterólogo. Uma outra fusão útil compreende a adição de um domínio imunologicamente activo, tal como um epítopo de um anticorpo, para facilitar a purificação da proteína de fusão. A inclusão de um local de clivagem na junção de fusão ou próximo dela irá facilitar a remoção do polipeptido estranho após a purificação. Outras fusões úteis compreendem a ligação de domínios funcionais, tais como os locais activos provenientes de enzimas, domínios de glicosilação, sinais de encaminhamento celular ou regiões transmembranares. Como exemplos de proteínas ou péptidos que é possível incorporar numa proteína de fusão refere-se as proteínas citostáticas, as proteínas citocidas, os agentes pro-apoptose, agentes antiangiogénicos, hormonas, citoquinas, factores de crescimento, fármacos peptídicos, anticorpos, fragmentos Fab de anticorpos, antigénios, proteínas de receptores, enzimas, lectinas, proteínas do MHC, proteínas de adesão celular e proteínas de ligação. Os processos para gerar proteínas de fusão são perfeitamente conhecidos pelos especialistas na matéria. Tais proteínas podem ser produzidas, por exemplo, por fixação química, utilizando reagentes de reticulação bifuncionais, fazendo a síntese total e completa da proteína de fusão ou por fixação de uma sequência de ADN, que codifique o péptido relevante em causa, a uma sequência de ADN que codifique o segundo péptido ou proteína, seguindo-se a expressão da proteína de fusão intacta.
De acordo com uma forma de realização, o péptido relevante em causa, por exemplo, IL-22 ou um anticorpo anti-IL-22, é fundido com uma região constante da cadeia pesada da imunoglobulina, tal como um fragmento Fc, que contenha dois 44 domínios da região constante e uma região de charneira, mas ao qual lhe falte a região variável (ver as patentes de invenção norte-americanas n°s 6 018 026 e 5 750 375) . A região Fc pode ser uma região Fc que ocorra naturalmente, ou pode ser alterada para melhorar determinadas qualidades, tais como as qualidades terapêuticas, o período de circulação, a agregação reduzida, etc.. Os péptidos e as proteínas fundidos com uma região Fc exibem, tipicamente, um período de semi-vida maior in vivo do que os seus equivalentes não fundidos. Além disso, uma fusão com uma região Fc permite a dimerização/multimerização do polipeptido de fusão.
As moléculas de VHH (ou nanocorpos), conforme é sabido pelos especialistas na matéria, são domínios variáveis de cadeias pesadas, derivados de imunoglobulinas naturalmente desprovidas de cadeias leves, tais como as obtidas a partir de Camelídeos, conforme descrito no documento WO9404678. Uma molécula de VHH deste tipo pode ser obtida a partir de anticorpos criados contra espécies de Camelídeos, por exemplo, camelos, lamas, dromedários, alpacas e guanacos, sendo frequentemente designados por domínios variáveis camelizados ou de camelídeos. Ver, v.g., Muyldermans., J. Biotechnology (2001) 74(4): 277-302. Para além dos Camelídeos, há outras espécies que conseguem produzir anticorpos de cadeias pesadas naturalmente desprovidos de cadeias leves. As moléculas de VHH são cerca de 10 vezes mais pequenas do que as moléculas de IgG. São polipeptidos singulares e bastante estáveis, resistentes a condições extremas de pH e temperatura. Além do mais, são resistentes à acção de proteases, o que não é o caso dos anticorpos convencionais. Por outro lado, a expressão de VHH in vitro produz VHH correctamente dobradas e com um rendimento elevado. Além disso, os anticorpos gerados em 45
Camelídeos irão reconhecer epítopos diferentes que são reconhecidos por anticorpos gerados in vitro mediante a utilização de bibliotecas de anticorpos ou por imunização de mamíferos diferentes dos Camelídeos (ver o documento WO 9749805).
De acordo com um dos seus aspectos, a presente invenção diz respeito a anticorpos e a fragmentos de ligação de antigénios que se ligam a IL-22. A invenção proporciona novas CDR obtidas a partir de bibliotecas de genes de imunoglobulina humana. A estrutura para transportar uma CDR é, geralmente, uma cadeia pesada ou leve de um anticorpo, ou uma parte sua, em que a CDR se encontra localizada numa região de CDR que ocorra naturalmente. As estruturas e as localizações dos domínios variáveis podem ser determinadas conforme descrito por Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, No. 91-3242, National Institutes of Health Publications, Bethesda, MD (1991).
As sequências de ADN e de aminoácidos (AA) dos anticorpos anti-IL-22 aqui descritas e/ou reivindicadas, incluindo os seus fragmentos scFv, domínios VH e VL e as CDR, estão explicitada nas figuras 7-10 e enumeradas nos quadros 1 e 7. São identificados vinte anticorpos específicos não genomutacionados, designados por GIL01, GIL16, GIL45, GIL60, GIL68, GIL92, 097D09, 062A09, 062G05, 087B03, 367D04, 368D04, 166B06, 166G05, 375G06, 376B10, 354A08, 355B06, 355E04 e 356A11. As posições das CDR nos domínios VH e VL dos anticorpos não genomutacionados estão enumeradas no quadro 2. São identificados quinze anticorpos específicos genomutacionados, designados por GIL01, GIL16, GIL45, GIL60, 46 GIL68, GIL92, 062Α09, 087Β03, 166Β06, 166G05, 354Α08, 355Β06, 355Ε04, 356Α11 e 368D04.
Quadro IA: Sequências de aminoácidos e nucleótidos dos domínios VH e VL, Fv e CDR de anticorpos não genomutacionados
Região Tipo GIL01 SEQ ID GIL16 SEQ ID GIL45 SEQ ID GIL60 SEQ ID GIL68 SEQ ID GIL92 SEQ ID 097D09 SEQ ID 062A0 9 SEQ ID 062G025 SEQ ID 087B03 SEQ ID vH AA NO: 5 NO: 23 NO: 41 NO: 59 NO: 77 NO: 95 NO:113 NO:131 NO:149 NO:167 VL AA NO: 6 NO: 24 NO: 42 NO: 60 NO: 78 NO: 96 NO:114 NO:132 NO:150 NO:168 scFv AA NO: 7 NO: 25 NO: 43 NO: 61 NO: 79 NO: 97 NO:115 NO:133 NO:151 NO:169 Hl AA NO: 8 NO: 26 NO: 44 NO: 62 NO: 80 NO: 98 NO:116 NO:134 NO:152 NO:170 H2 AA NO: 9 NO: 27 NO: 45 NO: 63 NO: 81 NO: 99 NO:117 NO:135 NO:153 NO:171 H3 AA NO: 10 NO: 28 NO: 46 NO: 64 NO: 82 NO:100 NO:118 NO:136 NO:154 NO:172 LI AA NO: 11 NO: 29 NO: 47 NO: 65 NO: 83 NO:101 NO:119 NO:137 NO:155 NO:173 L2 AA NO: 12 NO: 30 NO: 48 NO: 66 NO: 84 NO:102 NO:120 NO:138 NO:156 NO:174 L3 AA NO: 13 NO: 31 NO: 49 NO: 67 NO: 85 NO:103 NO:121 NO:139 NO:157 NO:175 vH ADN NO: 14 NO: 32 NO: 50 NO: 68 NO: 86 NO:104 NO:122 NO:140 NO:158 NO:176 vL ADN NO: 15 NO: 33 NO: 51 NO: 69 NO: 87 NO:105 NO:123 NO:141 NO:159 NO:177 scFv ADN NO: 16 NO: 34 NO: 52 NO: 70 NO: 88 NO:106 NO:124 NO:142 NO:160 NO:178 Hl ADN NO: 17 NO: 35 NO: 53 NO: 71 NO: 89 NO:107 NO:125 NO:143 NO:161 NO:179 H2 ADN NO: 18 NO: 36 NO: 54 NO: 72 NO: 90 NO:108 NO:126 NO:144 NO:162 NO:180 H3 ADN NO: 19 NO: 37 NO: 55 NO: 73 NO: 91 NO:109 NO:127 NO:145 NO:163 NO:181 LI ADN NO: 20 NO: 38 NO: 56 NO: 74 NO: 92 NO:110 NO:128 NO:146 NO:164 NO:182 L2 ADN NO: 21 NO: 39 NO: 57 NO: 75 NO: 93 NO:111 NO:129 NO:147 NO:165 NO:183 L3 ADN NO: 22 NO: 40 NO: 58 NO: 76 NO: 94 NO:112 NO:130 NO:148 NO:166 NO:184
Quadro 1B: Sequências de aminoácidos e nucleótidos dos domínios VH e VL, Fv e CDR de anticorpos não genomutacionados
Região Tipo 367D04 SEQ ID 368D04 SEQ ID 166B06 SEQ ID 166G05 SEQ ID 375G06 SEQ ID 376B10 SEQ ID 354A08 SEQ ID 355B06 SEQ ID 355E04 SEQ ID 356A11 SEQ ID vH AA NO:185 NO:203 NO:221 NO:239 NO:257 NO:275 NO:293 NO:311 NO:329 NO:347 vL AA NO:186 NO:204 NO:222 NO:240 NO:258 NO:276 NO:294 NO:312 NO:330 NO:348 scFv AA NO:187 NO:205 NO:223 NO:241 NO:259 NO:277 NO:295 NO:313 NO:331 NO:349 Hl AA NO:188 NO:206 NO:224 NO:242 NO:260 NO:278 NO:296 NO:314 NO:332 NO:350 47
Região Tipo 367D04 368D04 166B06 166G05 375G06 376B10 354A08 355B06 355E04 356A11 SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID H2 AA NO:189 NO:207 NO:225 NO:243 NO: 2 61 NO:279 NO:297 NO:315 NO:333 NO:351 H3 AA NO:190 NO:208 NO:226 NO:244 NO:2 62 NO:280 NO:298 NO:316 NO:334 NO:352 LI AA NO:191 NO:209 NO:227 NO:245 NO: 2 63 NO:281 NO:299 NO:317 NO:335 NO:353 L2 AA NO:192 NO:210 NO:228 NO:246 NO:264 NO:282 NO:300 NO:318 NO:336 NO:354 L3 AA NO:193 NO:211 NO:229 NO:247 NO:265 NO:283 NO:301 NO:319 NO:337 NO:355 VH ADN NO:194 NO:212 NO:230 NO:248 NO:266 NO:284 NO:302 NO:320 NO:338 NO:356 vL ADN NO:195 NO:213 NO:231 NO:249 NO:267 NO:285 NO:303 NO:321 NO:339 NO:357 scFv ADN NO:196 NO:214 NO:232 NO:250 NO:268 NO:286 NO:304 NO:322 NO:340 NO:358 Hl ADN NO:197 NO:215 NO:233 NO:251 NO:269 NO:287 NO:305 NO:323 NO:341 NO:359 H2 ADN NO:198 NO:216 NO:234 NO:252 NO:270 NO:288 NO:306 NO:324 NO:342 NO:360 H3 ADN NO:199 NO:217 NO:235 NO:253 NO:271 NO:289 NO:307 NO:325 NO:343 NO:361 LI ADN NO:200 NO:218 NO:236 NO:254 NO:272 NO:290 NO:308 NO:326 NO:344 NO:362 L2 ADN NO:201 NO:219 NO:237 NO:255 NO:273 NO:291 NO:309 NO:327 NO:345 NO:363 L3 ADN NO:202 NO:220 NO:238 NO:256 NO:274 NO:292 NO:310 NO:328 NO:346 NO:364
Quadro 2: Posições das CDR nas sequências de aminoácidos dos domínios VH e VL de anticorpos não genomutacionados CDR GIL01 GIL16 GIL45 GIL60 GIL68 GIL92 097D09 062A09 062G05 087B03 Hl 31-35 31-35 31-35 31-35 31-35 31-35 31-35 31-35 31-35 31-35 H2 50-66 50-66 50-66 50-66 50-66 50-66 50-66 50-66 50-66 50-66 H3 99-108 99-108 99-108 99-110 99-108 99-110 99-108 99-108 99-108 99-110 LI 24-34 24-34 23-36 23-36 23-33 23-36 24-34 24-34 24-34 23-36 L2 50-56 50-56 52-58 52-58 49-55 52-58 50-56 50-56 50-56 52-58 L3 89-97 89-97 91-100 91-100 88-98 91-101 89-97 89-97 89-97 91-100 CDR 367D04 368D04 166B06 166G05 375G06 376B10 354A08 355B06 355E04 356A11 Hl 31-35 31-35 31-35 31-35 31-35 31-35 30-34 31-35 31-35 31-35 H2 50-66 50-66 50-66 50-66 50-66 50-66 49-65 50-66 50-66 50-66 H3 99-110 99-110 99-108 99-108 99-108 99-108 98-109 99-110 99-110 99-110 LI 23-36 23-36 23-33 23-33 23-33 23-33 23-36 23-36 23-36 22-35 L2 52-58 52-58 49-55 49-55 49-55 49-55 52-58 52-58 52-58 51-58 L3 91-100 91-100 88-98 88-98 88-98 88-98 91-101 91-101 91-101 90-100 48
Os anticorpos anti-IL-22 da presente invenção podem compreender, facultativamente, regiões constantes de anticorpos ou partes suas. Por exemplo, é possível acoplar um domínio VL pela extremidade do seu terminal C a um domínio constante de cadeia leve tal como Ck ou CX. De igual modo, é possível fixar um domínio VH/ ou uma parte sua, à totalidade, ou a uma parte, de uma cadeia pesada, tal como IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e a qualquer subclasse de isotipos. As regiões constantes são conhecidas na especialidade (ver, por exemplo, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, No. 91-3242, National Institutes of Health Publications, Bethesda, MD (1991)). Assim sendo, os anticorpos abrangidos no âmbito da presente invenção compreendem os domínios VH e VL, ou uma parte sua, combinados com regiões constantes conhecidas na especialidade.
Determinadas formas de realização compreendem um domínio VH, um domínio VL, ou uma sua combinação, do fragmento Fv proveniente de GIL16, GIL60, GIL68, GIL92, 097D09, 062A09, 062G05, 087B03, 367D04, 368D04, 166B06, 166G05, 375G06, 376B10, 354A08, 355B06, 355E04 ou 356A11.
Uma outra forma de realização compreende um domínio VH, um domínio VL, ou uma sua combinação, do fragmento Fv de um anticorpo seleccionado entre 356A11, 354A08, 087B03 e 368D04. Os anticorpos aqui descritos e/ou reivindicados podem compreender uma, duas, três, quatro, cinco ou seis regiões determinantes da complementaridade (CDR) dos domínios VH e VL. Os anticorpos aqui descritos e/ou reivindicados podem ter sequências de CDR abrangidas no conjunto de SEQ ID NO: 5-13, 23-31, 41-49, 59-67, 77-85, 95-103, 113-121, 131-139, 149-157, 167-175, 185-193, 203- 211, 221-229, 239-247, 257-265, 275-283, 293-301, 311-319, 49 329-337, 347-355, 365-373, 383-391, 401-409, 419-427, 437-445, 455-463, 473-481, 491-499, 509-517, 527-535, 545-553, 563-571, 581-589, 599-607 ou 617-625. Por exemplo, um anticorpo pode compreender um fragmento H3 do domínio VH de anticorpos GIL01, GIL16, GIL45, GIL60, GIL68, GIL92, 097D09, 062A09, 062G05, 087B03, 367D04, 368D04, 166B06, 166G05, 375G06, 376B10, 354A08, 355B06, 355E04 ou 356A11 genomutacionados ou não genomutacionados ou de um anticorpo seleccionado entre 356A11, 354A08, 087B03 e 368D04.
Em determinadas formas de realização, os domínios VH e/ou VL podem ser genomutacionados, isto é, as regiões das sequências estruturais (FR) destes domínios são mutacionadas, recorrendo a técnicas convencionais da biologia molecular, para corresponderem aos produzidos pelas células E linhagens germinais. Noutras formas de realização, as sequências de FR continuam a ser distintas das sequências de consenso das linhagens germinais. Os anticorpos genomutacionados aqui descritos e/ou reivindicados estão indicados no quadro 7.
De acordo com uma forma de realização, a invenção proporciona sequências de aminoácidos e de ácidos nucleicos para os anticorpos GIL60, GIL68, GIL92, 087B03, 368D04, 166B06, 166G05, 354A08, 355B06, 355E04 ou 356A11 genomutacionados. As sequências de aminoácidos e de nucleótidos para o domínio VH dos anticorpos GIL01, GIL16, GIL45, GIL60, GIL68, GIL92, 062A09, 087B03, 166B06, 166G05, 354A08, 355B06, 355E04, 356A11 e 368D04 genomutacionados estão indicadas no quadro 7 e na figura 8. As sequências de aminoácidos e de nucleótidos para o domínio VL dos anticorpos GIL01, GIL16, GIL45, GIL60, GIL68, GIL92, 062A09, 087B03, 166B06, 166G05, 354A08, 355B06, 355E04, 50 356Α11 e 368D04 genomutacionados também estão ilustradas no quadro 7 e na figura 8.
De acordo com uma forma de realização, recorre-se à mutagénese para se obter um anticorpo mais semelhante a uma ou várias sequências de linhagens germinais. Isto pode ser desejável quando são introduzidas mutações na região estrutural de um anticorpo, mediante mutagénese somática ou através de PCR com propensão para erros. As sequências das linhagens germinais para os domínios VH e VL podem ser identificadas executando alinhamentos dês sequências de aminoácidos e de ácidos nucleicos na presença das sequências da base de dados 'VBASE' (MRC Center for Protein Engineering, UK) . A 'VBASE' é um directório exaustivo de sequências da região variável de linhagens germinais humanas, compiladas a partir de mais de um milhar de sequências publicadas, incluindo as que constam das bancos actuais de dados públicos de Genbank e EMBL. Em algumas formas de realização, as regiões FR dos scFv são mutacionadas em conformidade com as correspondências mais rigorosas da base de dados VBASE e as parcelas das CDR são mantidas intactas.
Os anticorpos aqui descritos e/ou reivindicados podem reagir especif icamente com um epítopo que seja o mesmo epítopo reconhecido por GIL01, GIL16, GIL45, GIL60, GIL68, GIL92, 097D09, 062A09, 062G05, 087B03, 367D04, 368D04, 166B06, 166G05, 375G06, 376B10, 354A08, 355B06, 355E04 ou 356A11, de tal modo que inibem competitivamente a ligação de GIL01, GIL16, GIL45, GIL60, GIL68, GIL92, 097D09, 062A09, 062G05, 087B03, 367D04, 368D04, 166B06, 166G05, 375G06, 376B10, 354A08, 355B06, 355E04 ou 356A11 à IL-22 humana. Tais anticorpos podem ser determinados em ensaios 51 de ligação competitivos. 0 anticorpo, ou o seu fragmento de ligação ao antigénio, pode ligar-se a um epitopo de IL-22 que seja reconhecido por 368D04, de tal modo que o anticorpo inibe de forma competitiva a ligação de 368D04 à IL-22 humana. Em alternativa, o anticorpo, ou o seu fragmento de ligação ao antigénio, pode ligar-se a um epitopo de IL-22 que é reconhecido por 356A11, de tal modo que o anticorpo inibe de forma competitiva a ligação de 356A11 à IL-22 humana. Assim sendo, o anticorpo, ou o seu fragmento de ligação ao antigénio, pode ligar-se a um epitopo de IL-22 que seja reconhecido por 354A08, de tal modo que o anticorpo inibe, de forma competitiva, a ligação de 354A08 à IL-22 humana. Em alternativa, o anticorpo, ou o seu fragmento de ligação ao antigénio, pode ligar-se a um epitopo de IL-22 que seja reconhecido por 087B03, de tal modo que o anticorpo inibe, de forma competitiva, a ligação de 087B03 à IL-22 humana. A constante de associação (KA) destes anticorpos para a IL-22 humana pode ser pelo menos igual a 106 M_1 ou pelo menos igual a 109 M_1. De acordo com uma forma de realização, a constante de associação destes anticorpos para a IL-22 humana é pelo menos igual a IO10 M-1, pelo menos igual a 1011 M_1 ou pelo menos igual a ΙΟ12 Μ-1. A afinidade de ligação pode ser determinada utilizando técnicas conhecidas na especialidade, tais como o protocolo ELISA, a tecnologia dos biodetectores, tais como a análise de interacção bioespecifica, ou outras técnicas, incluindo as explicitadas na presente memória descritiva.
Está previsto que os anticorpos aqui descritos e/ou reivindicados podem ligar-se a outras proteínas tais como, por exemplo, as proteínas recombinantes que compreendam a totalidade ou uma parte da IL-22. 52
Um vulgar especialista na matéria sabe que os anticorpos aqui descritos e/ou reivindicados podem ser utilizados para detectar, medir e/ou inibir proteínas que sejam, de alguma forma, diferentes da IL-22. Por exemplo, estas proteínas podem ser homólogas da IL-22. Antevê-se que os anticorpos anti-IL-22 se liguem a proteínas que compreendam uma sequência que seja pelo menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, ou mais, idêntica a qualquer sequência que tenha pelo menos 100, 80, 60, 40 ou 20 aminoácidos contíguos na sequência identificada por SEQ ID NO: 1.
Para além das análises de homologia de sequências, também é possível efectuar a cartografia de epítopos (ver, v.g., Epitope Mapping Protocols, ed. Morris, Humana Press, 1996) e as análises de estruturas secundárias e terciárias para a identificação de estruturas 3D específicas, assumidas pelos anticorpos agora descritos e seus complexos com antigénios. Tais processos compreendem, mas sem que isso constitua qualquer limitação, a cristalografia por meio de raio X (Engstom (1974) Biochem. Exp. Biol., 11:7-13) e os modelos informáticos de representações virtuais dos anticorpos da presente invenção (Fletterick et ai. (1986) Computer Graphics and Molecular Modeling, em Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).
Descreve-se aqui um processo para obter anticorpos anti-IL-22, o qual consiste em criar anticorpos com sequências alteradas de VH e/ou VL do quadro 1. Tais anticorpos podem ser obtidos por um especialista na matéria, recorrendo a técnicas conhecidas na especialidade. Por exemplo, é possível introduzir substituições, deleções ou adições de aminoácidos nas regiões FR e/ou CDR. As 53 modificações nas regiões FR são concebidas, normalmente, para melhorarem a estabilidade e imunogenicidade do anticorpo, ao passo que as alterações nas regiões CDR são concebidas, tipicamente, para aumentarem a afinidade do anticorpo para o seu antigénio. As alterações que aumentam a afinidade podem ser testadas alterando a sequência das CDR e medindo a afinidade do anticorpo para o seu alvo destinatário (ver Antibody Engineering, 2nd ed., Oxford University Press, ed. Borrebaeck, 1995).
Os anticorpos podem ter sequências de CDR que sejam insubstancialmente diferentes das que estão incluídas ou contidas nas sequências do conjunto SEQ ID NO: 5-13, 23-31, 41-49, 59-67, 77-85, 95-103, 113-121, 131-139, 149-157, 167-175, 185-193, 203-211, 221-229, 239-247, 257-265, 275-283, 293-301, 311-319, 329-337, 347-355, 365-373, 383-391, 401-409, 419-427, 437-445, 455-463, 473-481, 491-499, 509-517, 527-535, 545-553, 563-571, 581-589, 599-607 ou 617-625. De uma forma típica, isto implica a substituição de um aminoácido por um outro aminoácido que tenha características de carga eléctrica, hidrofóbicas ou estereoquímicas semelhantes. Também é possível fazer substituições mais drásticas nas regiões FR, ao contrário das regiões CDR, desde que não afectem adversamente {v.g.f reduzam a afinidade em mais de 50%, comparativamente com o anticorpo não substituído) as propriedades de ligação do anticorpo. Também é possível fazer substituições para genomutacionar o anticorpo ou para estabilizar o local de ligação do antigénio.
As modificações conservadoras irão produzir moléculas que possuem características funcionais e químicas semelhantes às da molécula a partir da qual são feitas as modificações. Pelo contrário, é possível efectuar modificações substanciais 54 nas características funcionais e/ou químicas das moléculas, realizando substituições na sequência de aminoácidos que sejam significativamente diferentes pelos seus efeitos em termos de manutenção (1) da estrutura da formação principal molecular na zona da substituição, por exemplo, segundo uma conformação em folha ou helicoidal, (2) da carga eléctrica ou hidrofobicidade da molécula no local destinatário ou (3) do tamanho da molécula.
Por exemplo, uma "substituição conservadora de aminoácidos" pode implicar uma substituição de um resíduo aminoácido natural por um resíduo não natural, de tal modo que haja um efeito diminuto ou nulo sobre a polaridade ou a carga eléctrica do resíduo aminoácido nessa posição. (Ver, por exemplo, MacLennan et al., 1998, Acta Physiol. Scand. Suppl. 643:55-67; Sasaki et al., 1998, Adv. Biophys. 35:1-24).
As substituições pretendidas de aminoácidos (sejam elas conservadoras ou não conservadoras) podem ser determinadas pelos especialistas na matéria no momento em que tais substituições são pretendidas. Por exemplo, as substituições de aminoácidos podem servir para identificar resíduos importantes na sequência da molécula, ou para aumentar ou diminuir a afinidade das moléculas aqui descritas. Como exemplos de substituições de aminoácidos refere-se, mas sem que isso constitua qualquer limitação, as indicadas no quadro 3.
Quadro 3. Substituições de aminoácidos
Residuos originais Substituições exempli ficativas Substituições mais conservadoras Ala (A) Vai, Leu, Ile Vai Arg (R) Lys, Gin, Asn Lys 55
Resíduos originais Substituições exemplificativas Substituições mais conservadoras Asn (N) Gin Gin Asp (D) Glu Glu Cys (C) Ser, Ala Ser Gin (Q) Asn Asn Gly (G) Pro, Ala Ala His (H) Asn, Gin, Lys, Arg Arg He (I) Leu, Vai, Met, Ala, Phe, Norleucina Leu Leu (L) Norleucina, Ile, Vai, Met, Ala, Phe Ile Lys (K) Arg, ácido 1,4-diaminobutírico, Gin, Asn Arg Met (M) Leu, Phe, Ile Leu Phe (F) Leu, Vai, Ile, Ala, Tyr Leu Pro (P) Ala Gly Ser (S) Thr, Ala, Cys Thr The (T) Ser Ser Trp (W) Tyr, Phe Tyr Tyr (Y) Trp, Phe, Thr, Ser Phe Vai (V) Ile, Met, Leu, Phe, Ala, Norleucina Leu
Em determinadas formas de realização, as substituições conservadoras de aminoácidos também podem abranger resíduos aminoácidos que ocorram de forma não natural, os quais são incorporados, tipicamente, por síntese química de péptidos, em vez da síntese em sistemas biológicos.
De acordo com uma forma de realização, o processo para se obter um domínio VH variante consiste em adicionar, 56 suprimir ou substituir pelo menos um aminoácido nos domínios VH explicitados, ou combinando os domínios VH explicitados pelo menos com um domínio VL e testando o domínio de VH variante para se pesquisar a ligação da IL-22 ou a modulação da actividade de IL-22.
Um processo análogo para se obter um domínio VL variante consiste em acrescentar, suprimir ou substituir pelo menos um aminoácido nos domínios VL explicitados, ou combinando os domínios VL explicitados pelo menos com um domínio VH e testando o domínio VL variante para se pesquisar a ligação de IL-22 ou a modulação da actividade de IL-22.
De acordo com um outro dos seus aspectos, a presente invenção proporciona um processo para a preparação de anticorpos, ou de fragmentos de ligação ao antigénio, que se ligam especificamente à IL-22. 0 processo compreende os passos seguintes: (a) arranjar um repertório inicial de ácidos nucleicos que codifiquem um domínio VH ao qual lhe falte pelo menos uma CDR ou que contenha pelo menos uma CDR que irá ser substituída; (b) inserir ou substituir na região da CDR do repertório inicial pelo menos um ácido nucleico dador que codifique uma sequência de aminoácidos do conjunto substancialmente aqui explicitado para uma CDR de VH, para assim se obter um repertório resultante; (c) realizar a expressão dos ácidos nucleicos do repertório resultante; (d) seleccionar um fragmento de ligação ao antigénio específico, que se ligue à IL-22; e 57 (e) recuperar o fragmento de ligação ao antigénio especifico ou o ácido nucleico que o codifica.
De acordo com um processo análogo, combina-se pelo menos uma CDR de VL da invenção com um repertório de ácidos nucleicos que codifiquem um domínio VL ao que lhe falte pelo menos uma CDR ou que contenha pelo menos uma CDR que irá ser substituída. A CDR de VH ou de VL, eventualmente única, pode ser uma CDR1, uma CDR2, uma CDR3 ou uma sua combinação, incluindo as combinações das CDR de VH e de VL, tais como as explicitadas nos quadros 1 ou 7, incluindo as do conjunto constituído por SEQ ID NO: 8, 9, 10 / 11/ 12 13, 26, 27 , 28, 29, 30, 31, 4 4, 45 , 46, 47, 48, 4Í ), 62, 63 64, 65, 6( 5, 67 , 80, 81, 82, 00 LO oo 4, 85, r 98, - 99, 100, 101 102, 103, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 134, 135, 136, 137 138, 139, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 170, 171, 172, 173 174, 175, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 206, 207, 208, 209 210, 211, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 242, 243, 244, 245 246, 247, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 278, 279, 280, 281 282, 283, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 314, 315, 316, 317 318, 319, 332, 333, 334, 335, 338, 337, 350, 351, 352, 353 354, 355, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 386, 387, 388, 389 390, 391, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 422, 423, 424, 425 426, 427, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 458, 459, 460, 461 462, 463, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 494 . 495, 496, 497 498, 499, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 530, 531, 532, 533 534, 535, 548, 549, 550, 551, 552, 553, 566, 567, 568, 569 570, 571, 584, 585, 586, 587, 588, 589, 602, 603, 604, 605 606, 607, 620, 621, 622, 623, 624 ou 625 ) . 0 domínio variável pode conter uma CDR3 que irá ser substituída ou pode faltar-lhe uma região que codifique a CDR3, e o ácido nucleico dador, eventualmente único, 58 codifica um aminoácido essencialmente do conjunto definido por SEQ IE i NO: 10, 13, 28 , 31, 46, 49, 64, 67 , 82 , 85, 100 103, 118, 121, 136, 139, 154, 157, 172, 175, 190, 193, 208 211, 226, 229, 244, 247, 262, 265, 280, 283, 298, 301, 316 319, 334, 337, 352, 355, 370, 373, 388, 391, 406, 409, 424 427, 442, 445, 460, 463, 478, 481, 496, 499, 514, 517, 532 535, 550, 553, 568, 571, 586, 589, 604, 607, 622 ou 625 . 0 domínio variável pode conter uma CDR1 que irá ser substituída, ou pode faltar-lhe uma região que codifique a CDR1, e o ácido nucleico dador, eventualmente único, codifica uma sequência de aminoácidos essencialmente do conj unto definido por SEQ ID NO: 8, 11, 26, 29, 44 i, 47, 62, 65, O co 83, 98, 101, 116, 119, 134, 137, 152, 155, 170, 173, 188, 191, 206, 209, 224, 227, 242, 245, 260, 263, 278, 281, 296, 299, 314, 317, 332, 335, 350, 353, 368, 371, 386, 389, 404, 407, 422, 425, 440, 443, 458, 461, 476, 479, 494, 497, 512, 515, 530, 533, 548, 551, 566, 569, 584, 587, 602, 605, 620 ou 623. 0 domínio variável pode compreender uma CDR2 que irá ser substituída, ou pode faltar-lhe uma região codificadora de CDR2, e o ácido nucleico dador, eventualmente único, codifica uma sequência de aminoácidos essencialmente do conjunto definido por SEQ ID NO: 9, 12, 27, 30, 45, 48, 63, 66, 81, 84, 99 ', 102, 117, 120, 135, 138, 153, 156, 171, 174, 189, 192, 207, 210, 225 , 228 , 243, 246, 261, 264, 279, 282, 297, 300, 315, 318, 333 , 336 , 351, 354, 369, 372, 387, 390, 405, 408, 423, 426, 441 , 444 , 459, 462, 477, 480, 495, 498, 513, 516, 531, 534, 549 , 552 , 567, 570, 585, 588, 603, 606, 621 ou 624 e O domínio variável pode compreender uma CDR3 que irá ser substituída, ou pode faltar-lhe uma região codificadora 59 de CDR3, e pode compreender ainda uma CDRl que irá ser substituída, ou pode faltar-lhe uma região codificadora de CDRl, em que o ácido nucleico dador, eventualmente único, codifica uma sequência de aminoácidos essencialmente do conjunto explicitado nos quadros 1 ou 7. 0 domínio variável pode compreender uma CDR3 que irá ser substituída, ou pode faltar-lhe uma região codificadora de CDR3, e pode compreender ainda uma CDR2 que irá ser substituída ou, ou pode faltar-lhe uma região codificadora de CDR2, em que o ácido nucleico dador, eventualmente único, codifica uma sequência de aminoácidos essencialmente do conjunto explicitado nos quadros 1 ou 7. 0 domínio variável pode compreender uma CDR3 que irá ser substituída, ou pode faltar-lhe uma região codificadora de CDR3, e pode compreender ainda uma CDRl e uma CDR2 que irão ser substituídas, ou pode faltar-lhe uma região codificadora de uma CDRl e de uma CDR2, em que o ácido nucleico dador, eventualmente único, codifica uma sequência de aminoácidos essencialmente do conjunto explicitado nos quadros 1 ou 7.
Utilizando a metodologia do ADN recombinante, é possível introduzir uma sequência de CDR, aqui explicitada, num repertório de domínios VH ou VL aos quais lhes faltem as correspondentes CDR (Marks et al. (BioTechnology (1992) 10: 779-783). Por exemplo, é possível utilizar um iniciador adjacente à extremidade 5' do domínio variável e um iniciador para a terceira FR, para gerar um repertório de sequências de domínios variáveis a que falte a CDR3. Este repertório pode ser combinado com uma CDR3 de um anticorpo aqui descrito. Utilizando técnicas análogas, é possível misturar partes de uma sequência de uma CDR, aqui 60 explicitada, com partes de sequências de CDR de outros anticorpos para se obter um repertório de fragmentos de ligação do antigénio que se ligam à IL-22. Qualquer dos repertórios pode ser expresso num sistema hospedeiro, tal como um sistema de expressão de fagos (descrito no documento WO 92/01047 e na correspondente patente de invenção norte-americana n° 5 969 108), podendo assim ser seleccionados fragmentos adequados de ligação ao antigénio, que se ligam à IL-22.
Numa outra alternativa, é utilizada a mutagénese aleatória de sequências de domínios VH ou VL, aqui explicitadas, para gerar domínios VH ou VL variantes que continuam a ser capazes de se ligarem à IL-22. Há uma técnica, em que se recorre à PCR com propensão para erros, descrita por Gram et al. (Proc. Nat. Acad. Sei. U.S.A. (1992) 89: 3576-3580).
Um outro processo utiliza a mutagénese directa das sequências de domínios VH ou VL aqui descritas. Tais técnicas foram descritas por Barbas et al. (Proc. Nat. Acad. Sei. U.S.A. (1994) 91: 3809-3813) e Schier et al. (J. Mol. Biol. (1996) 263: 551-567).
Uma parcela de um domínio variável irá compreender pelo menos uma região CDR essencialmente conforme aqui explicitado e, facultativamente, regiões de sequências estruturais mediadoras dos domínios VH ou VL, conforme aqui explicitado. A parcela pode conter a metade do terminal C de FR1 e/ou a metade do terminal N de FR4. Outros resíduos da extremidade do terminal N ou da extremidade do terminal C do domínio variável podem não ser os mesmos resíduos existentes em anticorpos que ocorram naturalmente. Por exemplo, a construção de anticorpos por meio de técnicas do ADN 61 recombinante introduz, frequentemente, resíduos do terminal N ou do terminal C provenientes da utilização de ligadores. Alguns ligadores podem ser utilizados para unir domínios variáveis a outros domínios variáveis, (v.g., diacorpos), domínios constantes ou identificadores proteínicos.
Embora as formas de realização ilustradas nos exemplos compreendam um par de domínios VH e VL "condizentes", um especialista na matéria sabe que noutras formas de realização podem ser utilizados fragmentos de ligação ao antigénio que contenham apenas uma CDR singular de qualquer dos domínios VL ou VH. É possível utilizar qualquer um dos domínios específicos de cadeia singular de ligação ao antigénio para se fazer a pesquisa de domínios complementares capazes de formarem um fragmento específico de dois domínios de ligação ao antigénio, capaz de se ligar, por exemplo, à IL-22. Esta pesquisa pode ser efectuada por processos de análise pela metodologia dos fagos, utilizando o chamado método combinatório de dupla hierarquia descrito no documento WO 92/01047. De acordo com este método, utiliza-se uma colónia individual, contendo um clone, quer de cadeia H quer de cadeia L, para infectar uma biblioteca completa de clones que codifiquem a outra cadeia (L ou H) e selecciona-se o domínio resultante de ligação ao antigénio, de cadeia dupla, em conformidade com as técnicas metodológicas dos fagos, conforme descrito.
Em algumas formas de realização alternativas, os anticorpos anti-IL-22 podem ser ligados a uma proteína (v.g., albumina) por processos recombinantes ou de interligação química. Os anticorpos descritos também podem ser ligados a diversos polímeros não proteínicos (v.g., polietileno-glicol, polipropileno-glicol ou polioxialquilenos), em conformidade com 62 os preceitos descritos nas patentes de invenção norte-americanas n°s 4 640 835; 4 496 689; 4 301 144; 4 670 417; 4 791 192; ou 4 179 337. Os anticorpos podem ser modificados quimicamente por conjugação covalente com um polímero, por exemplo, para aumentar o seu período de semi-vida na circulação sanguínea. Como exemplos de polímeros e de processos de acoplamento refere-se os descritos nas patentes de invenção norte-americanas n°s 4 766 106; 4 179 337; 4 495 285; e 4 609 546.
Os anticorpos descritos podem ser modificados para alterar a sua glicosilação, isto é, é possível suprimir ou acrescentar ao anticorpo pelo menos um radical hidrato de carbono. A deleção ou adição de locais de glicosilação pode ser efectuada modificando a sequência de aminoácidos para suprimir ou criar locais de consenso de glicosilação, os quais são perfeitamente conhecidos na especialidade. Um outro processo para acrescentar radicais hidrato de carbono é o acoplamento químico ou enzimático de glicósidos a resíduos aminoácidos do anticorpo (ver o documento WO 87/05330 e Aplin et ai. (1981) CRC Crit. Rev. Biochem., 22: 259-306). A remoção de um radical hidrato de carbono também pode ser efectuada pelas vias química ou enzimática (ver Hakimuddin et ai. (1987) Arch. Biochem. Biophys., 259: 52; Edge et ai. (1981) Anal. Biochem., 118: 131; Thotakura et ai. (1987) Meth. Enzymol., 138: 350).
Os processos para alterar uma região constante de um anticorpo são conhecidos na especialidade. Os anticorpos com uma função alterada (v.g., afinidade alterada para um ligando efector, tal como FcR numa célula do componente Cl do complemento) podem ser produzidos substituindo pelo menos um resíduo aminoácido, na parte constante do 63 anticorpo, por um resíduo diferente (ver, v.g., os documentos EP 388 151 Al, US 5 624 821 e US 5 648 260) . Poderíamos descrever tipos semelhantes de alterações que, se fossem aplicadas a anticorpos de murinos ou de outras espécies, iriam reduzir ou eliminar funções semelhantes
Por exemplo, é possível alterar a afinidade de uma região Fc de um anticorpo [v.g., uma IgG, tal como uma IgG humana) para o FcR [v.g., FcyRI) ou Clq. A afinidade pode ser alterada substituindo pelo menos um resíduo especificado pelo menos por um outro resíduo que tenha uma funcionalidade adequada na sua cadeia lateral, ou introduzindo um grupo funcional com carga eléctrica, tal como glutamato ou aspartato, ou talvez um resíduo aromático não polar, tal como fenilalanina, tirosina, triptofano ou alanina (ver, v.g., o documento US 5 624 821).
Por exemplo, a substituição do resíduo 297 (asparagina) por alanina na região constante da IgG inibe, significativamente, a mobilização de células efectoras, ao mesmo tempo que apenas reduz ligeiramente (cerca de três vezes mais fraca) a afinidade para Clq (ver, v.g., o documento US 5 624 821) . A numeração dos resíduos na cadeia pesada é a do manual da EU (ver Kabat et al., 1991 supra). Esta alteração destrói o local de glicosilação e admite-se que seja necessária a presença de hidratos de carbono para ligação ao receptor de Fc. Admite-se que qualquer outra substituição neste local, que destrua o local de glicosilação, provoque uma diminuição semelhante na actividade lítica. Sabe-se também que há outras substituições de aminoácidos, v.g., que modificam qualquer um dos resíduos 318 (Glu), 320 (Lys) e 322 (Lys), por permuta com Ala, que suprimem a ligação de Clq à região Fc de anticorpos de IgG (ver, v.g., o documento US 5 624 821). 64 É possível produzir anticorpos modificados que tenham uma interacção reduzida com um receptor de Fc. Por exemplo, foi já demonstrado que na IqG3 humana, que se liqa ao receptor FcyRI humano, a troca de Leu 235 por Glu destrói a sua interacção com o receptor. Também podem ser utilizadas mutações em locais adjacentes ou próximos, na reqião de ligação da charneira de um anticorpo (v.g., substituindo os resíduos 234, 236 ou 237 por Ala) para afectar a afinidade do anticorpo com o receptor FcyRI. A numeração dos resíduos na cadeia pesada baseia-se no manual da EU (ver Kabat et al., 1991 supra). Há outros processos para alterar a actividade lítica de um anticorpo, por exemplo, alterando pelo menos um aminoácido na região do terminal N do domínio CH2, descritos no documento WO 94/29351 por Morgan et al. e no documento US 5 624 821.
Os anticorpos da presente invenção podem ser identificados com um marcador de identificação detectável ou funcional. Estes marcadores de identificação podem ser seleccionados entre marcadores radioisótopos (v.g., 131I ou 99Tc), marcadores enzimáticos (v.g., peroxidase de Ãrmoracia rusticana ou fosfatase alcalina) e outros radicais químicos (v.g., biotina). A invenção também diz respeito a um anticorpo isolado que se liga à IL-22, em particular à IL-22 humana. Em determinadas formas de realização, o anticorpo anti-IL-22 pode apresentar pelo menos uma das seguintes características: (1) é um anticorpo monoclonal ou um anticorpo com uma especificidade singular; (2) é um anticorpo humano; (3) é um anticorpo gerado in vitro; (4) é um anticorpo gerado in vivo (v.g., no sistema do murganho transgénico); (5) liga-se à IL-22 com uma 65 constante de associação pelo menos igual a 1012 M-1; (6) liga-se à IL-22 com uma constante de associação pelo menos igual a 1011 M-1; (7) liga-se à IL-22 com uma constante de associação pelo menos igual a 1010 M-1; (8) liga-se à IL-22 com uma constante de dissociação igual a 500 nM ou inferior; (9) liga-se à IL-22 com uma constante de dissociação igual a 10 nM ou inferior; (10) liga-se à IL-22 com uma constante de dissociação igual a 150 pM ou inferior; (11) liga-se à IL-22 com uma constante de dissociação igual a 60 pM ou inferior; (12) inibe a ligação da IL-22 ao IL-22R ou a um complexo de receptores constituído por IL-22R e IL-10R2; (13) bloqueia a proliferação, mediada por IL-22, das células BaF3 artificialmente manipuladas do receptor de IL-22, com um valor CI50 igual a 150 pM ou inferior, de acordo com uma forma de realização, com um valor CI50 igual a 100 pM ou inferior, segundo uma outra forma de realização, e com um valor CI50 igual a 10 pM ou inferior, de acordo com uma outra forma de realização; e (14) bloqueia a secrecção de GROa, mediada por IL-22, a partir de HT29, com um valor CI50 igual a 150 pM ou inferior, numa forma de realização, e com um valor CI50 igual a 10 pM ou inferior, numa outra forma de realização.
Um especialista na matéria sabe que nem todas as modificações descritas supra são exaustivas, havendo muitas outras modificações que são evidentes para os especialistas, à luz dos preceitos da presente memória descritiva. III. Ácidos nucleicos e sistemas de clonagem e expressão A presente invenção proporciona ácidos nucleicos isolados que codificam os anticorpos aqui explicitados. Os ácidos nucleicos podem ser ADN ou ARN e podem ser de origem 66 sintética (total ou parcialmente) ou recombinante (total ou parcialmente). Uma referência a uma sequência de nucleótidos, conforme aqui se explicita, diz respeito a uma molécula de ADN com a sequência especificada e diz respeito a uma molécula de ARN com a sequência especificada em que se substitui T por U. A invenção proporciona também ácidos nucleicos que compreendem uma sequência codificadora de uma, duas ou três CDR, um domínio VH, um domínio VL ou suas combinações, conforme aqui descrito, ou uma sequência que lhes seja substancialmente idêntica (v.g., uma sequência pelo menos 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais, idêntica à daqueles, ou que seja capaz de hibridar, em condições restringentes, com as sequências explicitadas) .
De acordo com uma forma de realização, os ácidos nucleicos isolados possuem sequências de nucleótidos que codificam as regiões variáveis da cadeia pesada e de cadeia leve de um anticorpo anti-IL-22 que possua pelo menos uma CDR seleccionada entre as sequências de aminoácidos identificadas por SEQ ID NO: 8-13, 26-31, 44-49, 62-67, 80-85, 98-103, 116-121, 134-139, 152-157, 170-175, 188-193, 206-211, 224-229, 242-247, 260-265, 278-283, 296-301, 314-319, 332-337, 350-355, 368-373, 386-391, 404-409, 422-427, 440-445, 458-463, 476-481, 494-499, 512-517, 530-535, 548-553, 566-571, 584-589, 602-607 ou 620-625; ou uma sequência que codifique uma CDR que seja diferente, por um ou dois aminoácidos, das sequências aqui descritas. O ácido nucleico pode codificar apenas a região variável da cadeia leve ou da cadeia pesada ou pode codificar também uma região constante de uma cadeia leve ou pesada de um anticorpo, a qual está funcionalmente ligada à 67 região variável correspondente. De acordo com uma forma de realização, a região variável da cadeia leve está ligada a uma região constante seleccionada entre uma região constante κ ou λ. A região constante da cadeia leve também pode ser de tipo κ ou λ humana. De acordo com uma outra forma de realização, a região variável da cadeia pesada está ligada a uma região constante da cadeia pesada de um isotipo de anticorpo seleccionado entre IgG (v.g., IgGl, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgAl, IgA2. IgD e IgE. A região constante da cadeia pesada pode ser um isotipo de IgG (v.g., uma IgGl).
As sequências de ácidos nucleicos da presente invenção, muitas vezes na sequência natural (de ADNc ou ADN genómico ou suas misturas), excepto para os locais de restrição modificados e semelhantes, podem ser mutacionadas de acordo com técnicas convencionais para proporcionar sequências génicas. No caso das sequências codificadoras, estas mutações podem afectar a sequência de aminoácidos, conforme desejado. Em particular, estão contempladas sequências de nucleótidos substancialmente idênticas às sequências naturais V, D, J, constantes, comutadoras e de outro tipo, aqui descritas, ou delas derivadas (em que o termo "derivada" significa que a sequência é idêntica a uma outra sequência ou modificada a partir desta).
De acordo com uma forma de realização, o ácido nucleico difere (v.g., difere por substituição, inserção ou deleção), do ácido nucleico das sequências explicitadas (v.g., conforme se segue: pelo menos 1 mas menos do que 10, 20, 30 ou 40 nucleótidos; pelo menos 1 mas menos do que 1%, 5%, 10% ou 20% dos nucleótidos no ácido nucleico em questão). Se necessário, para esta análise, as sequências 68 devem ser alinhadas segundo uma homologia máxima. As sequências com "protuberâncias", provenientes de deleções ou inserções ou incompatibilidades, são consideradas diferenças. A diferença pode ocorrer em um ou vários nucleótidos que codifiquem um ou vários resíduos não essenciais, ou então a diferença pode ser uma ou várias substituições conservadoras. A presente invenção proporciona também construções de ácidos nucleicos sob a forma de vectores de expressão, os quais compreendem pelo menos um ácido nucleico, conforme aqui descrito. A invenção proporciona também uma célula hospedeira que compreende pelo menos uma construção de ácido nucleico, conforme aqui descrito. A invenção proporciona também processos para a preparação de proteínas codificadas a partir de sequências de ácidos nucleicos, do tipo aqui descrito. 0 processo consiste em criar em cultura células hospedeiras em condições convenientes, de tal modo que nelas tenha lugar a expressão da proteína a partir dos ácidos nucleicos. A seguir à expressão e à produção, o domínio VH ou VL, ou um membro de ligação específica, pode ser isolado e/ou purificado, recorrendo a qualquer técnica adequada, sendo depois utilizados convenientemente. 0 processo pode incluir também os passos de fusão de um ácido nucleico, que codifique um scFv, com ácidos nucleicos que codifiquem uma parcela de Fc de um anticorpo e que expressem numa célula o ácido nucleico resultante da fusão. 0 processo também pode compreender um passo de genomutação.
Os fragmentos de ligação ao antigénio, os domínios VH e/ou VL e as moléculas e vectores de ácidos nucleicos podem ser isolados e/ou purificados a partir do seu ambiente 69 natural, obtendo-se formas homogéneas ou substancialmente puras ou então, no caso dos ácidos nucleicos, isentos ou praticamente isentos de ácidos nucleicos ou genes com uma origem diferente da sequência que codifica um polipeptido com a função pretendida.
Os sistemas para clonagem e expressão de polipeptidos em diversas células hospedeiras são conhecidos na especialidade. As células convenientes para a produção de anticorpos foram descritas, por exemplo, por Fernandez et al. (1999) Gene
Expression Systems, Academic Press, eds.. Dito de forma abreviada, as células hospedeiras convenientes podem ser células de mamíferos, células de insectos, células vegetais, células de leveduras ou células procarióticas, v.g., células de E. coli. As células de mamíferos disponíveis na especialidade para a expressão de polipeptidos heterólogos podem ser as linhagens de células linfocíticas {v.g., NSO) , células HEK293, células de ovário do criceto chinês (CHO), células COS, células HeLa, células do rim do criceto bebé, células de oócitos e células provenientes de um animal transgénico, v.g., células epiteliais mamárias. De acordo com uma forma de realização, os anticorpos GIL16, GIL60, GIL68, GIL92, 097D09, 062A09, 062G05, 087B03, 367D04, 368D04, 166B06, 166G05, 375G06, 376B10, 354A08, 355B06, 355E04 e 356A11 são expressos em células HEK293 ou de CHO. De acordo com uma outra forma de realização, há um conjunto de anticorpos seleccionados entre 365A11, 354A08, 087B03 e 368D04 que são expressos em células HEK293 ou de CHO. De acordo com outras formas de realização, os ácidos nucleicos que codificam os anticorpos da invenção são colocados sob o controlo de um promotor específico de tecidos {v.g., um promotor específico mamário) e os anticorpos são produzidos 70 em animais transgénicos. Por exemplo, os anticorpos são segregados para dentro do leite do animal transgénico, por exemplo, uma vaca, uma porca, uma égua, uma ovelha, uma cabra ou uma roedora transgénica.
Os vectores convenientes podem ser seleccionados ou construídos de modo a conterem sequências reguladoras apropriadas, incluindo sequências promotoras, sequências terminadoras, sequências de poliadenilação, sequências intensificadoras, genes marcadores e outras sequências. Os vectores também podem conter uma estrutura principal plasmídica ou virai. Para o estudo de pormenores, ver a obra de Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Há inúmeras técnicas consagradas que são utilizadas com vectores, incluindo a manipulação, preparação, mutagénese, sequenciação e transfecção de ADN, as quais se encontram descritas na obra 'Current Protocols in Molecular Biology', Segunda Edição, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons (1992).
Descreve-se aqui um processo para introduzir o ácido nucleico numa célula hospedeira. No caso das células eucarióticas, as técnicas de transfecção convenientes podem ser as técnicas de transfecção com fosfato de cálcio, DEAE-dextrano, electroporação, transfecção mediada por lipossomas e transdução, utilizando retrovírus ou outros vírus, v.g., vírus de vacínia ou baculovírus. No caso das células bacterianas, as técnicas adequadas podem consistir na transformação com cloreto de cálcio, electroporação e transfecção, utilizando um bacteriófago. Após a introdução de ADN, pode seguir-se um método de selecção (v.g., 71 resistência aos fármacos) para seleccionar as células que contenham o ácido nucleico. IV. Utilização de anticorpos anti-IL-22
Os anticorpos anti-IL-22, que actuam como antagonistas contra a IL-22 podem ser utilizados para regular pelo menos uma resposta imune mediada pela IL-22, por exemplo, actuando sobre as células epiteliais em tecidos sólidos e, indirectamente, modulando as respostas imunes a jusante, por exemplo, bloqueando a expansão de subconjuntos de células T, incluindo, por exemplo, as células TH17T. Os anticorpos da invenção podem ser utilizados num processo para regular uma resposta imune, consistindo o processo em fazer contactar a IL-22 com o anticorpo da invenção, regulando assim a resposta imune. A resposta imune pode ser uma proliferação celular, uma actividade citolitica, uma secreção de citoquinas ou uma secrecção de quimioquinas.
Assim sendo, os anticorpos da invenção podem ser utilizados para inibir, directa ou indirectamente, a actividade (v.g., a proliferação, diferenciação e/ou a sobrevivência) de uma célula imune ou hematopoiética (v.g., uma célula de linhagem mielóide, linfóide ou eritróide, ou as suas células precursoras) e consequentemente podem ser utilizados para tratar diversas patologias do sistema imunitário e patologias hiperproliferativas. Como exemplos não limitativos de patologias do sistema imunitário que é possível tratar, refere-se, mas sem que isso constitua qualquer limitação, as patologias autoimunes, v.g., artrite (incluindo artrite reumatóide, artrite reumatóide juvenil, osteoartrite, artrite psoriática, artrite associada ao lúpus ou espondilite 72 anquilosante) , escleroderma, eritematose do lúpus sistémico, VIH, síndroma de Sjogren, vasculite, esclerose múltipla, tiroidite autoimune, dermatite (incluindo a dermatite atópica e a dermatite eczematosa), miastenia grave, doença intestinal inflamatória (IBD), doença de Crohn, colite, diabetes mellitus (tipo I); estados inflamatórios, v.g., da pele (v.g.r psoríase), do sistema cardiovascular (v.g., aterosclerose), do sistema nervoso (v.g., doença de Alzheimer), do fígado (v.g., hepatite), dos rins (v.g., nefrite) e do pâncreas (v.g., pancreatite); patologias cardiovasculares, v.g., patologias metabólicas do colesterol, lesões originadas por radicais livres de oxigénio, isquémia; patologias associadas à cicatrização de ferimentos; patologias respiratórias, v.g. asma e COPD (v.g., fibrose cística); estados inflamatórios agudos (v.g., endotoxemia, sépsis e septicémia, síndroma do choque tóxico e doenças infecciosas); rejeição de transplantes e alergias. De acordo com uma forma de realização, a patologia associada à IL-22 é uma patologia artrítica, v.g., uma patologia seleccionada entre artrite reumatóide, artrite reumatóide juvenil, osteoartrite, artrite psoriática ou espondilose anquilosante; uma patologia respiratória (v.g., asma, doença pulmonar obstrutiva crónica (COPD); ou um estado inflamatório, v.g., da pele (v.g., psoríase), do sistema cardiovascular (v.g., aterosclerose), do sistema nervoso (v.g., doença de Alzheimer), do fígado (v.g., hepatite), dos rins (v.g., nefrite), do pâncreas (v.g., pancreatite) e dos órgãos gastrintestinais, v.g., colite, doença de Crohn e IBD; estados inflamatórios agudos, v.g., endotoxemia, sépsis e septicémia, síndroma do choque tóxico e doenças infecciosas; colapso múltiplo de órgãos; doença respiratória (ARD); amiloidose; nefropatias, tais como a glomerulosclerose, 73 neuropatia membranosa, arteriosclerose renal glomerulonefrite, doenças fibroproliferativas do rim e também outras disfunções renais e tumores renais. Devido aos efeitos da IL-22 sobre os epitélios, os anticorpos anti-IL-22 podem ser utilizados para tratar cancros epiteliais, v.g., carcinomas, melanomas e outros. Para um estudo dos fundamentos lógicos respeitantes à inibição da IL-22, nestes e noutros estados patológicos, ler o documento WO 03/083062 (paginas 58-75). A esclerose múltipla é uma doença do sistema nervoso central que se caracteriza por inflamação e perda das bainhas de mielina - o material gordo que isola os nervos e que é necessário para um funcionamento correcto dos nervos. A inflamação que resulta de uma resposta imune que seja dependente da IL-22 pode ser tratada com os anticorpos e composições da presente invenção. No modelo experimental de murganho com encefalite autoimune (EAE) para a esclerose múltipla (Tuohy et ai. (J. Immunol. (1988) 141: 1126-1130), Sobel et al. (J. Immunol. (1984) 132: 2393-2401) e Traugott (Cell Immunol. (1989) 119: 114-129), o tratamento dos animais com injecções de GIL01, GIL16, GIL45, GIL60, GIL68, GIL92, 097D09, 062A09, 062G05, 087B03, 367D04, 368D04, 166B06, 166G05, 375G06, 376B10, 354A08, 355B06, 355E04 ou 356A11 antes (e continuamente) da indução de EAE pode retardar imenso o inicio da doença. Isto pode servir como modelo para confirmar a utilização dos anticorpos da invenção. Os anticorpos da presente invenção também podem ser igualmente utilizados para tratar a esclerose múltipla em seres humanos. A artrite é uma doença que se caracteriza por inflamação nas articulações. A artrite reumatóide (AR) é a forma mais frequente de artrite, estando associada à inflamação do 74
tecido conjuntivo e da membrana sinovial que é uma membrana que reveste as articulações. A membrana sinovial inflamada infiltra-se, frequentemente, na articulação e danifica a cartilagem e os ossos da articulação. As proteínas IL-22 e IL-22R e/ou os seus transcritos estão associados às duas doenças nos seres humanos. Em biopsias sinoviais de AR, a proteína IL-22 é detectada em fibroblastos sinoviais vimentina+ e em alguns macrófagos CD68+, ao passo que a proteína IL-22R é detectada em fibroblastos sinoviais. 0 tratamento de fibroblastos sinoviais com IL-22 induz a produção da proteína 1 monocítica quimioatractiva, MCP-1, e também a actividade metabólica geral (Ikeuchi, H., et al. (2005) Arthritis Rheum. 52:1037-46). Os inibidores de IL-22 melhoram os sintomas da artrite reumatóide (WO 2005/000897 A2; patente de invenção norte-americana n° 6 939 545) . O aumento da secrecção de citoquinas e de quimioquinas inflamatórias e sobretudo a intensificação da doença resultante de respostas imunes que são dependentes da IL-22 podem ser tratados com os anticorpos da presente invenção. De igual modo, os anticorpos e composições da presente invenção podem ser utilizados para tratar a AR ou outras doenças artríticas em seres humanos. A rejeição de transplantes é um fenómeno imunológico em que os tecidos de um dador são especif icamente "atacados" pelas células imunes do hospedeiro. As principais células "atacantes" são as células T, sabendo-se que os receptores das células T reconhecem as moléculas do MHC do dador como sendo "exógenas". Este reconhecimento activa as células T que vão proliferar e segregar diversas citoquinas e proteínas citolíticas que irão destruir, em última instância, o transplante. Os modelos de MLR e de 75 transplantação estão descritos nas obras 'Current Protocols in Immunology', segunda edição, Coligan et ai. eds., John Wiley & Sons, 1994; Kasaian et ai. (Immunity (2002) 16: 559-569); Fulmer et ai. (Am. J. Anat. (1963) 113: 273-285) e Lenschow et ai. (science (1992) 257: 789-792). Os anticorpos e as composições da presente invenção podem ser utilizados para reduzir o MLR e para tratar a rejeição de transplantes e doenças congéneres (v.g., doença do hospedeiro perante o enxerto) em seres humanos, que sejam dependentes de IL-22.
Os anticorpos da presente invenção também podem ser utilizados para tratar patologias hiperproliferativas associadas a uma actividade aberrante de células responsivas à IL-22 e de células responsivas à IL-22R/IL-10R2, mediante a administração desses anticorpos numa quantidade suficiente para inibir ou reduzir a hiperproliferação de células responsivas a IL-22 e/ou a IL-22R e/ou IL-10R2 num indivíduo, servindo ainda estes anticorpos para tratar ou prevenir a patologia. A expressão de IL-22 e de IL-22R é constitutiva nas células epiteliais em diversos tecidos, incluindo, mas sem qualquer limitação, os do pâncreas, pulmões, pele, intestino, fígado, rim (Kotenko, S.V. et ai. (2001) J. Biol. Chem. 276:2725-32; Xie, M.H. et ai. (2000) J. Biol. Chem. 275:31335-9; Wolk, K. et ai. (2004) Immunity 21:241-54). Além disso, o complexo de receptores de IL-22 também é expresso sobre a superfície de fibroblastos provenientes da articulação com patologia e de intestino normal (Ikeuchi, H. et ai. (2005) Arthritis Rheum. 52:1037-46; Andoh, A. et ai., (2005) Gastroenterology 129:969-84). Os derivados neoplásicos destes tipos de células podem ser hiperresponsivos à IL-22, modulando a aptidão destas células 76 para sobreviverem no organismo. Deste modo, os anticorpos contra a IL-22 também podem ser utilizados para inibir a progressão de tais neoplasmas, v.g., carcinomas das células escamosas, carcinomas das células basais, papilomas e carcinomas das células de transição, adenomas, adenocarcinomas, linite plástica, insulinomas, glucagonomas, gastrinomas, vipomas, colangiocarcinomas, carcinoma hepatocelular, carcinoma citico adenoide, tumor carcinóide do apêndice, prolactinoma, oncocitoma, adenoma das células de Hurthle, carcinoma das células renais, tumor de Grawitz, adenomas endócrinos múltiplos, adenoma endometrióide, neoplasmas de formações anexas e acessórias da pele, neoplasmas mucoepidermóides, neoplasmas císticos, mucinosos e serosos, cistadenoma, pseudomixoma do peritoneu, neoplasmas ductal, lobular e medular, neoplasmas das células acinares, neoplasmas epiteliais complexos, tumor de Warthin, timoma, neoplasmas gonadais especializados, tumores cordestromais dos órgãos sexuais, tecoma, tumor das células granulosas, arrenoblastoma, tumor das células de Sertoli-Leydig, paraganglioma, feocromocitoma, tumor do glomus, nevos melanocíticos, melanoma maligno, melanoma, melanoma nodular, nevos displásicos, lentigo maligno, melanoma de disseminação superficial ou melanoma lentiginoso acral. Embora o receptor de IL-22 não seja detectado em células imunes naturais ex vivo ou activadas, a desregulação do receptor pode fazer com que tais células neoplásicas derivadas respondam à IL-22 e consequentemente possa haver inibição por acção de um anticorpo contra a IL-22.
Também se descreve aqui um processo para diminuir, inibir ou reduzir uma resposta em fase aguda num indivíduo. 0 processo consiste em administrar ao indivíduo um 77 anticorpo anti-IL-22 ou um seu fragmento, conforme aqui descrito, numa quantidade suficiente para diminuir, inibir ou reduzir a resposta em fase aguda no indivíduo. 0 indivíduo pode ser um mamífero, v.g.r um ser humano que padeça de uma patologia associada à IL-22, conforme aqui descrito, incluindo, v.g., patologias respiratórias, patologias inflamatórias e patologias autoimunes. 0 agente de ligação à IL-22 pode ser administrado localmente, v.g., pelas vias tópica, subcutânea ou por outra via de administração que não seja a circulação geral.
Presume-se que a IL-22 exerça os seus efeitos inflamatórios localmente, v.g., por actuar {v.g., actuação directa) como agente modulador ou regulador da inflamação tecidual, e não pelos seus efeitos sistémicos directos. Assim sendo, a inibição da actividade da IL-22, utilizando, v.g., um anticorpo anti-IL-22 da presente invenção, pode proporcionar um agente anti-inflamatório específico de tecidos mais eficaz (v.g., menos tóxico) do que os agentes sistémicos utilizados em modalidades anti-inflamatórias. Além disso, a inibição local da IL-22, utilizando, v.g., um anticorpo anti-IL-22, ou um seu fragmento aqui descrito pode constituir uma metodologia elegível considerada útil para combinação com as modalidades anti-inflamatórias sistémicas. V. Terapia combinada
De acordo com uma forma de realização, administra-se uma composição farmacêutica, constituída pelo menos por um anticorpo anti-IL-22 e pelo menos um agente terapêutico, numa terapia combinada. A terapia útil para tratar estados 78 patológicos ou patologias, tais como as patologias imunes e inflamatórias. 0 termo "combinado" no contexto da presente invenção significa que a composição de anticorpos e o agente terapêutico são administrados praticamente ao mesmo tempo, quer simultânea quer sequencialmente. De acordo com uma forma de realização, no caso de a administração ser sequencial, no inicio da administração do segundo composto, o primeiro dos dois compostos é ainda detectável em concentrações eficazes no local de tratamento. De acordo com uma outra forma de realização, se a administração for feita sequencialmente, no inicio da administração do segundo composto, o primeiro dos dois compostos não é detectável em concentrações eficazes no local de tratamento.
Por exemplo, a terapia combinada pode compreender pelo menos um anticorpo anti-IL-22 co-formulado e/ou co-administrado pelo menos com um agente terapêutico suplementar. Os agentes suplementares podem ser pelo menos um inibidor de citoquinas, um inibidor de factores de crescimento, um imunossupressor, um agente anti-inflamatório, um inibidor metabólico, um inibidor de enzimas, um agente citotóxico e um agente citostático, conforme adiante descrito de forma mais minuciosa. De acordo com uma forma de realização, o agente suplementar é um agente convencional para o tratamento da artrite, incluindo, mas sem qualquer limitação, os agentes anti-inflamatórios não esteroidais (NSAID); corticosteróides, incluindo prednisolona, prednisona, cortisona e triamcinolona; e fármacos anti-reumáticos modificadores da doença (DMARD), tais como metotrexato, hidroxicloroquina (Plaquenil) e sulfasalazina, leflunomida (Arava) , inibidores do factor da necrose tumoral, incluindo etanercept (Enbrel), infliximab 79 (Remicade) (com ou sem metotrexato) e adalimumab (Humira) , anticorpo anti-CD20 (e.g., Rituxan), receptores solúveis da interleucina 1, tal como anakinra (Kineret), ouro, minociclina (Minocin), penicilamina e agentes citotóxicos, incluindo azatioprina, ciclofosfamida e ciclosporina. Em tais terapias combinadas é possível utilizar, de forma vantajosa, doses menores dos agentes terapêuticos administrados, assim se evitando as possíveis toxicidades ou complicações associadas às diversas monoterapias. Além do mais, os agentes terapêuticos suplementares aqui explicitados actuam em vias que são complementares ou que diferem da via de actuação de IL-22/IL-22R/IL-10R2 e por esse motivo antevê-se que reforcem e/ou determinem um efeito sinérgico conjuntamente com os efeitos dos anticorpos anti-IL-22.
Os agentes terapêuticos utilizados em combinação com os anticorpos anti-IL-22 podem ser os agentes que interfiram em fases diferentes da resposta autoimune e da resposta inflamatória subsequente. De acordo com uma forma de realização, é possível fazer uma co-formulação que contenha pelo menos um anticorpo anti-IL-22, aqui descrito, e/ou fazer a sua co-administração, pelo menos com um antagonista de citoquinas e/ou de factores de crescimento. Os antagonistas podem compreender os receptores solúveis, inibidores peptídicos, moléculas pequenas, fusões de ligandos, anticorpos e seus fragmentos de ligação (que se ligam às citoquinas ou aos factores de crescimento ou aos seus receptores ou a outras moléculas da superfície celular) e "citoquinas anti-inflamatórias" e seus agonistas.
Como exemplos não limitativos de agentes que é possível utilizar em combinação com os anticorpos anti-IL-22 aqui descritos refere-se, mas sem que isso constitua 80 qualquer limitação, os antagonistas de uma, pelo menos, interleucina (v.g., IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-12 (ou uma das suas subunidades p35 ou p40), IL-13, IL-15, IL-16, IL-17A-F (incluindo os seus heterodímeros, por exemplo, o heterodimero IL-17A/IL-17F), IL-18, IL-19, IL-20, IL-21 e IL-23 (ou uma das suas subunidades pl9 ou p40) ) ; de uma, pelo menos, citoquina (v.g., TNFa, LT, EMAP-II e GM-CSF); e de um, pelo menos, factor de crescimento (v.g., FGF e PDGF) . Os agentes também podem compreender, mas sem que isso constitua qualquer limitação, os antagonistas de um, pelo menos, receptor de uma interleucina, de uma citoquina e de um factor de crescimento. Os anticorpos anti-IL-22 também podem ser combinados com inibidores (v.g., anticorpos ou seus fragmentos de ligação) para moléculas da superfície celular, tais como CD2, CD3, CD4, CD8, CD20 (v.g. Rituxan), CD25, CD28, CDR30, GD40, CD45, CD69, CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD90 ou seus ligandos (v.g., CD154 (gp39, CD40L)), ou LFA-l/ICAM-1 e VLA-4/VCAM-1 (Yusuf-Makagiansar et al. (2002) Med Res Rev 22(2):146-67)). Em determinadas formas de realização, os antagonistas que podem ser utilizados em combinação com os anticorpos anti-IL-22 aqui descritos podem ser os antagonistas de IL-1, IL-12 (ou uma das suas subunidades p35 ou p40) , TNFa, IL-15, IL-17A-F (incluindo os seus heterodímeros, por exemplo, o heterodimero IL-17A/IL-17F), IL-18, IL-19, IL-20, IL-21 e IL-23 (ou uma das suas subunidades pl9 ou p40) e os seus receptores.
Como exemplos desses agentes refere-se os antagonistas de IL-12 (tais como os anticorpos que se ligam à IL-12 (ver, v.g., o documento WO 00/56772) ou de uma das suas subunidades p35 ou p40); os inibidores do receptor de IL-12 81 (tais como os anticorpos para o receptor de IL-12); e o receptor solúvel de IL-12 e seus fragmentos. Como exemplos de antagonistas de IL-15 refere-se os anticorpos contra a IL-15 ou contra o seu receptor, os fragmentos solúveis do receptor de IL-15 e as proteínas de ligação a IL-15. Como exemplos de antagonistas de IL-18 refere-se os anticorpos contra a IL-18, os fragmentos solúveis do receptor de IL-18 e as proteínas de ligação a IL-18 (IL-18BP, Mallet et al. (2001) Circ. Res. 28). Como exemplos de antagonistas de IL-1 refere-se os inibidores da enzima conversora da interleucina 1 (ICE) (tais como Vx740), os antagonistas de IL-1 (v.g., IL-1 RA (ANIKINRA, AMGEN)), sIL-1 RII (immunex) e os anticorpos anti-receptor de IL-1.
De acordo com uma forma de realização, a terapia combinada compreende pelo menos um anticorpo anti-IL-22 co-formulado e/ou co-administrado com um antagonista, tal como um anticorpo, ou um seu fragmento de ligação ao antigénio, ou um receptor solúvel, de um, pelo menos, heterodímero de IL-17A, IL-17F, IL-17A/IL-17F ou de IL-23 (ou de uma das suas subunidades pl9 ou p40).
Como exemplos de antagonistas de TNF refere-se os anticorpos contra os TNF (v.g., TNFa humano), tais como D2E7 (anticorpo anti-TNFa humano, documento U.S. 6 258 562, Humira™, BASF); CDP-571/CDP-870/BAY-10-3356 (anticorpos humanizados anti-TNFa, Celltech/Pharmacia); cA2 (anticorpo quimérico anti-TNFa, Remicade™, Centocor); e os fragmentos de anticorpos anti-TNF (v.g., CPD870). Outros exemplos são os fragmentos do receptor solúvel dos TNF (v.g., p55 ou p75 humanos) e os derivados, tais como p55 kdTNFR-IgG (proteína de fusão de IgG-receptor de TNF de 55 kD, Lenercept™) e 75 kdTNFR-IgG (proteína de fusão de IgG-receptor de TNF de 75 82 kD, Enbrel™, lmmunex, ver, v.g., Arthritis & Rheumatism (1994) Vol. 37, S295; J. Invest. Med. (1996) Vol. 44, 235A) . Outros exemplos são os antagonistas de enzimas {v.g., os inibidores da enzima conversora de TNFa (TACE) tais como o derivado o ácido α-sulfonil-hidroxâmico (WO 01/55112) ou o inibidor de N-hidroxiformamida (GW 3333, -005, ou -022)) e TNF-bp/s-TNFR (proteínas solúveis de ligação do TNF, ver, v.g., Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (suplemento), S284; e Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. (1995) Vol. 268, pp. 37-42) . Os antagonistas de TNF podem ser os fragmentos do receptor solúvel de TNF (v.g., p55 ou p75 humanos) e os seus derivados tais como 75 kdTNFR-IgG; e os inibidores da enzima conversora de TNFa (TACE).
De acordo com outras formas de realização, os anticorpos anti-IL-22 aqui descritos podem ser administrados em combinação pelo menos com uma das seguintes substâncias: antagonistas de IL-13, tais como receptores solúveis de IL-13 e/ou os anticorpos anti-IL-13; e os antagonistas de IL-2, tais como as proteínas de fusão com IL-2 (v.g., DAB 486-IL-2 e/ou DAB 389-IL-2, Seragen, ver, v.g., Arthritis & Rheumatism (1993) Vol. 36, 1223) e os anticorpos anti-IL-2R (v.g., anti-Tac (anticorpo humanizado, Protein Design Labs, ver, Câncer Res. 1990 Mar 1; 50 (5) : 1495-502) ) . Uma outra combinação compreende os anticorpos anti-IL-22 combinados com inibidores anti-CD4 não depletivos, tais como IDEC-CE9.1/SB 210396 (anticorpo anti-CD4, IDEC/SmithKline). Ainda uma outra combinação compreende anticorpos anti-IL-22 conjuntamente com antagonistas (tais como anticorpos, receptores solúveis ou ligandos antagonísticos) de moléculas co-estimuladoras, tais como CD8 0 (B7.1) e CD8 6 (B7.2); ICOSL, ICOS, CD2 8 e CTLA4 (v.g., CTLA4-Ig); o ligando da glicoproteina selectina P 83 (PSGL); e as citoquinas anti-inflamatórias e seus agonistas (v.g., anticorpos). As citoquinas anti-inflamatórias podem ser IL-4 (DNAX/Schering); IL-10 (SCH 52000, 1L-10 recombinante, DNAX/Schering); IL-13; e TNF.
Em outras formas de realização, o anticorpo anti-IL-22, eventualmente único, pode ser co-formulado e/ou co-administrado pelo menos com um fármaco anti-inflamatório, um imunossupressor, um inibidor metabólico e um inibidor enzimático. Como exemplos não limitativos de fármacos ou inibidores que é possível utilizar em combinação com os antagonistas de IL-22 aqui descritos, refere-se, mas sem qualquer limitação, pelo menos um seleccionado entre: fármacos anti-inflamatórios não esteroidais (NSAID) (tais como o ibuprofeno, Tenidap (ver, v.g., Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (suplemento), S280)), Naproxen (ver, v.g., Neuro Report (1996) Vol. 7, pp. 1209-1213), Meloxicam, Piroxicam, Diclofenac e Indometacina)/ Sulfasalazina (ver, v.g., Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (suplemento), S281); corticosteróides (tais como prednisolona); fármacos anti-inflamatórios supressores das citoquinas (CSAID); e um inibidor da biosíntese de nucleótidos (tais como um inibidor da biosíntese da purina (v.g., antagonistas de folato, tais como o metotrexato) e um inibidor da biosíntese da pirimidina (v.g., um inibidor de di-hidroorotato-desidrogenase (DHODH), tal como a leflunomida (ver, v.g., Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (suplemento), S131; Inflammation Research (1996) Vol. 45, pp. 103-107)). Os agentes terapêuticos para utilização em combinação com os antagonistas de IL-22/IL-22R ou IL-22/IL-10R2 podem ser os inibidores de NSAID, 84 CSAID, DHODH (tais como leflunomida) e os antagonistas de folato (tais como metotrexato).
Como exemplos de outros inibidores refere-se pelo menos um seleccionado entre: corticosteróides (orais, inaláveis e injectáveis localmente); imunossupressores (tais como ciclosporinas e tacrolimus (FK-506)); um inibidor de mTOR (tais como sirolimus (rapamicina) ou um derivado de rapamicina (v.g., o derivado do éster de rapamicina, tal como CCI-779 (Elit. L. (2002) Current
Opinion Investig. Drugs 3(8):1249-53/ Huang, S. et al. (2002) Current Opinion Investig. Drugs 3(2):295-304)))/ um agente que interfira com a sinalização das citoquinas pró-inflamatórias, tal como TNFa e IL-1 (v.g., IRAK, NIK, IKK, p38 ou um inibidor da cinase MAP) ; um inibidor de COX2 (v.g., celecoxib e suas variantes (MK-966), ver, v.g., Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, NO.9 (suplemento), S81); um inibidor das fosfodiesterases (tal como R973401, ver, v.g., Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (suplemento), S282)); um inibidor das fosfolipases (v.g., um inibidor da fosfolipase 2 citossólica (cPLA2), tal como um análogo de trifluorometil-cetona (U.S. 6 350 892))/ um inibidor do factor de crescimento das células endoteliais vasculares (VEGF); um inibidor do receptor de VEGF; e um inibidor da angiogénese. Os agentes terapêuticos para utilização em combinação com os anticorpos anti-IL-22 podem ser agentes imunossupressores (tais como ciclosporina e tacrolimus (FK-506)); e inibidores de mTOR (tais como sirolimus (rapamicina) ou derivados de rapamicina (v.g., os derivados ésteres de rapamicina (tais como CCI-779)); os inibidores de COX2 (tais como celecoxib e suas variantes); e os inibidores de fosfolipases (tais como os inibidores da 85 fosfolipase 2 citossólica (cPLA2) {v.g., análogos de trifluorometil-cetona)) .
Como exemplos de agentes terapêuticos que é possível co-administrar e/ou co-formular, pelo menos com um anticorpo anti-IL-22, refere-se, mas sem qualquer limitação, pelo menos um agente seleccionado entre: antagonistas de TNF (tais como os anticorpos anti-TNF); os fragmentos solúveis dos receptores de TNF (v.g., p55 e p75 humanos) e seus derivados (tais como p55 kdTNFR-IgG (proteína de fusão de IgG-receptor de TNF de 55 kD, Lenercept™) e 75 kdTNFR-IgG (proteína de fusão de IgG-receptor de TNF de 75 kD, Enbrel™)); antagonistas da enzima de TNF (tais como os inibidores de TACE); antagonistas de IL-12 (ou uma das suas subunidades p35 ou p40), IL-15, IL-17A-F (incluindo os seus heterodímeros, por exemplo o heterodímero IL-17A/IL-17F), IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22 e IL-23 (ou uma das suas subunidades pl9 ou p40); agentes depletivos das células T e das células B (tais como os anticorpos anti-CD4 ou anti-CD22); inibidores de moléculas pequenas (tais como metotrexato e leflunomida); sirolimus (rapamicina) e seus análogos (tais como CCI-779); inibidores de C0X2 e de cPLA2; inibidores de p38, TPL-2, Mk-2 e NFkB; RAGE e RAGE solúvel; inibidores das selectina P e de PSGL-1 (tais como os anticorpos contra as moléculas pequenas e os inibidores de moléculas pequenas); e os agonistas do receptor β dos estrogénios (ERB) e os antagonistas de ERBNFkb. Os agentes terapêuticos que é possível co-administrar e/ou co-formular, pelo menos com um anticorpo anti-IL-22, podem ser pelo menos um dos seguintes: um fragmento solúvel de um receptor de TNF (v.g., p55 ou p75 humanos), tal como 75 kdTNFRIgG (proteína de fusão de IgG-receptor de TNF de 75 kD, Enbrel™) ; metotrexato; 86 leflunomida; e sirolimus (rapamicina) e seus análogos (tais como CCI-779).
Os anticorpos anti-IL-22 aqui descritos podem ser utilizados em combinação com outros agentes terapêuticos para tratar patologias imunes específicas, conforme adiante se descreve de forma mais minuciosa.
Como exemplos não limitativos de agentes para tratar patologias artríticas (v.g., artrite reumatóide, artrite inflamatória, artrite reumatóide juvenil, osteoartrite e artrite psoriática), com os quais é possível combinar um anticorpo anti-IL-22, refere-se pelo menos um dos seguintes: antagonistas de TNF (tais como os anticorpos anti-TNF); fragmentos solúveis de receptores de TNF (v.g., p55 e p75 humanos) e seus derivados (tais como p55 kdTNFR-IgG (proteína de fusão de IgG-receptor de TNF de 55 kD, Lenercept™) e 75 kdTNFR-lgG (proteína de fusão de IgG-receptor de TNF de 75 kD, Enbrel™) ) ; antagonistas da enzima de TNF (tais como os inibidores de TACE) ; antagonistas de IL-12 (ou uma das suas subunidades p35 ou p40), de IL-15, de IL-17A-F (incluindo os seus heterodímeros, por exemplo, o heterodímero IL-17A/IL- 17F), de IL-18, 11-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23 (ou uma das suas subunidades pl9 ou p40) e de IL-24; agentes depletivos das células T e das células B (tais como os anticorpos anti-CD4, anti-CD20 ou anti-CD22); inibidores de moléculas pequenas (tais como metotrexato e leflunomida); sirolimus (rapamicina) e seus análogos (v.g., CCI-779); inibidores de
Cox-2 e de cPLA2; inibidores de NSAID; p38, TPL-2, Mk-2 e NFkB; RAGE ou RAGE solúvel; inibidores das selectina P ou de PSGL-1 (tais como os inibidores de moléculas pequenas e os anticorpos contra tais moléculas); agonistas do receptor β dos estrogénios (ERB) e os antagonistas de ERB-NFkB. Os 87 agentes terapêuticos que é possível co-administrar e/ou co-formular, pelo menos com um antagonista de IL-22/IL-22R/IL-10R2, podem ser pelo menos um dos seguintes: um fragmento solúvel de um receptor de TNF (v.g., p55 ou p75 humanos), tal como 75 kdTNFR-IgG (proteína de fusão de IgG-receptor de TNF de 75 kD, Enbrel™); metotrexato; leflunomida; e sirolimus (rapamicina) ou um seu análogo (tais como CCI-779).
Como exemplos não limitativos de agentes para tratar a esclerose múltipla, com os quais é possível combinar um anticorpo anti-IL-22, refere-se um interferão β, por exemplo, IFNp-la e IFNp-lb), copaxona, corticosteróides, inibidores de IL-1, inibidores de TNF, anticorpos contra o ligando CD40, anticorpos contra o CD80 e antagonistas de IL-12, incluindo os anticorpos que se ligam à IL-12 (ou a uma das suas subunidades p35 ou p40).
Como exemplos não limitativos de agentes para tratar a doença intestinal inflamatória ou a doença de Crohn, com os quais é possível combinar um anticorpo anti-IL-22, refere-se os seleccionados entre budenosida; factor de crescimento epidermal; corticosteróides; ciclosporinas; sulfasalazina; aminossalicilatos; 6-mercaptopurina; azatioprina; metronidazol; inibidores das lipoxigenases; mesalamina; olsalazina; balsalazida; antioxidantes; inibidores de tromboxano; antagonistas do receptor de IL-1; anticorpos monoclonais anti-IL-1; anticorpos monoclonais anti-IL-6; factores de crescimento; inibidores das elastase; compostos de piridinil-imidazol; os antagonistas de TNF aqui descritos; IL-4, IL-10, IL-13 e/ou ΤΰΕβ ou os seus agonistas (v.g., os anticorpos agonistas); IL-11; profármacos de prednisolona conjugados com glucuronida ou com dextrano, dexametasona ou budesonide; oligodesoxinucleótidos de fosforotioato anti-sentido e ICAM-1 88 (ISIS 2302/ Isis Pharmaceuticals, Inc.)/ receptor 1 solúvel do complemento (ΤΡΙΟ; T Cell Sciences, Inc.); mesalazina de libertação lenta; metotrexato; antagonistas do factor de activação das plaquetas (PAF); ciprofloxacina; e lignocaina.
Em outras formas de realização, é possível utilizar um anticorpo anti-IL-22 em combinação pelo menos com um anticorpo dirigido contra outros alvos destinatários implicados em respostas imunes reguladoras, v.g., rejeição de transplantes ou da doença do hospedeiro perante o enxerto. Como exemplos não limitativos de agentes para tratar respostas imunes, com os quais é possível combinar um antagonista de IL-22/IL-22R/IL10R2 da presente invenção, refere-se os seguintes: anticorpos contra as moléculas da superfície celular, incluindo, mas sem qualquer limitação, os anticorpos contra CD25 (receptor α de IL-2), CDlla (LFA-1) , CD54 (ICAM-1), CD4, CD45, CD28/CTLA4, CD80 (B7-1), CD8 6 (B7-2) ou suas combinações. De acordo com uma outra forma de realização, utiliza-se um anticorpo anti-IL-22 em combinação pelo menos com um agente imunossupressor geral, tal como a ciclosporina A ou FK506.
Também são aqui descritos os estojos para transportar as substâncias para a administração combinada de anticorpos anti-IL-22, conjuntamente com outros agentes terapêuticos. O estojo pode conter pelo menos um anticorpo anti-IL-22, formulado num veículo farmacêutico, e pelo menos um agente terapêutico, formulado convenientemente em uma ou várias preparações farmacêuticas separadas. VI. Utilizações para Diagnóstico
Os anticorpos também podem ser utilizados para detectar a presença de IL-22 em amostras biológicas. 89
Fazendo a correlação da presença ou da concentração destas proteínas com um estado clínico, um especialista na matéria consegue diagnosticar o estado clínico associado. Por exemplo, a IL-22 induz alterações associadas às que são provocadas pelas citoquinas inflamatórias (tais como IL-1 e TNFa), sabendo-se que os inibidores de IL-22 melhoram os sintomas da artrite reumatóide (WO 2005/000897 A2). Os estados patológicos ilustrativos que podem ser diagnosticados pelos anticorpos da presente invenção são a esclerose múltipla, a artrite reumatóide, a psoríase, a doença intestinal inflamatória, a pancreatite e a rejeição de transplantes.
Os processos de detecção à base de anticorpos são perfeitamente conhecidos na especialidade e compreendem os seleccionados entre os protocolos ELISA, radioimunoensaios, imunoabsorções, absorções de Western, citometria de fluxo, imunofluorescência, imunoprecipitação e outras técnicas congéneres. Os anticorpos podem ser apresentados num estojo que sirva, pelo menos, para a prática de um destes procedimentos para a detecção de IL-22. O estojo pode conter outros componentes, indicações de acondicionamento, instruções de utilização ou outro material que ajude a detectar a proteína e a utilizar o estojo.
Os anticorpos podem ser modificados com marcadores detectáveis, incluindo grupos de ligandos (v.g., biotina), fluoróforos e cromóforos, radioisótopos, reagentes densos em electrões ou enzimas. As enzimas são detectadas pela sua actividade. Por exemplo, a peroxidase de Armoracia rusticana (HRP) é detectada pela sua aptidão para converter a tetrametilbenzidina (TMB) num pigmento azul, quantificável com um espectrofotómetro. Outros agentes de 90 ligação convenientes são a biotina e a avidina, IgG e proteína A e outros pares de tipo receptor-ligando conhecidos na especialidade.
Os anticorpos também podem ser funcionalmente ligados (v.g., por acoplamento químico, fusão genética, associação não covalente ou de qualquer outra forma) pelo menos a uma outra entidade molecular, tal como um outro anticorpo (v.g., um anticorpo biespecífico ou multiespecífico) , a toxinas, radioisótopos, agentes citotóxicos ou citostáticos, entre outros. Há outras permutações e possibilidades que são evidentes para os especialistas na matéria. VII. Composições farmacêuticas e processo de administração
Determinadas formas de realização da presente invenção dizem respeito a composições que incorporam os anticorpos aqui descritos. As composições podem ser adequadas para fins farmacêuticos e para administração a pacientes. As composições compreendem um anticorpo da presente invenção e um excipiente farmacêutico. Tal como aqui utilizado, o termo "excipiente farmacêutico" designa solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes bacterianos e antifúngicos, agentes isotónicos e retardadores da absorção, etc., os quais são compatíveis com a administração farmacêutica. A utilização destes agentes para mistura com substâncias farmaceuticamente activas é perfeitamente conhecida na especialidade. As composições também podem conter outros compostos activos que desempenhem funções terapêuticas melhores, complementares ou reforçadas. As composições farmacêuticas também podem estar incluídas num reservatório, 91 embalagem ou aplicador, conjuntamente com instruções para administração.
Uma composição farmacêutica da presente invenção é formulada de modo a ser compatível com a via de administração pretendida. Os processos para a realização da administração são conhecidos pelos especialistas na matéria. As composições farmacêuticas podem ser administradas pelas vias tópica ou oral, ou devem poder ser transmissíveis através das membranas das mucosas. Como exemplos de administração de uma composição farmacêutica refere-se a administração por ingestão ou por inalação. A administração também pode ser intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intracavidades, subcutânea, cutânea ou transdérmica.
As soluções ou suspensões utilizadas para aplicação intradérmica ou subcutânea contêm, tipicamente, pelo menos um dos componentes seguintes: um diluente estéril, tal como a água, uma solução salina, óleos estáveis, polietileno-glicol, glicerina, propileno-glicol ou outro solvente sintético; agentes antibacterianos, tais como o álcool benzílico ou metil-parabeno; antioxidantes, tais como o ácido ascórbico ou bissulfito de sódio; agentes quelantes, tais como o ácido etilenodiaminatetraacético (EDTA); tampões, tais como os tampões acetato, citrato ou fosfato; e agentes reguladores da tonicidade, tais como o cloreto de sódio e a dextrose. 0 valor do pH pode ser ajustado com ácidos ou bases. Tais preparações podem estar contidas em ampolas, seringas descartáveis ou frascos de doses múltiplas.
As soluções ou suspensões utilizadas para administração intravenosa contêm um veículo, tal como um soluto salino fisiológico, água bacteriostática, Cremophor EL™ (BASF, 92
Parsippany, NJ), etanol ou poliol. Em todos os casos, a composição deve ser estéril e fluida para facilidade de manuseamento com uma seringa. A fluidez conveniente pode ser conseguida, frequentemente, recorrendo a lecitina ou a agentes tensioactivos. A composição também deve ser estável nas condições de fabrico e de armazenagem. É possível prevenir a existência de microrganismos, recorrendo a agentes antibacterianos e antifúngicos, v.g., parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal, etc.. Em muitos casos, é possível incorporar nas composições agentes isotónicos (açúcar), polialcoóis (manitol e sorbitol) ou cloreto de sódio. É possível conseguir uma absorção prolongada da composição, acrescentando um agente que retarde a absorção, v.g., monostearato de alumínio e gelatina.
As composições orais contêm um diluente inerte ou um veículo edível. As composições podem ficar contidas em gelatina ou podem ser comprimidas em pastilhas. Para efeitos de administração oral, os anticorpos podem ser incorporados com excipientes e colocados em comprimidos, trociscos ou cápsulas. Podem ser incorporados na composição materiais adjuvantes ou agentes de aglutinação farmaceuticamente compatíveis. Os comprimidos, trociscos e cápsulas podem conter (1) um agente aglutinante, tal como a celulose microcristalina, goma de alcatira ou gelatina; (2) um excipiente, tal como amido ou lactose; (3) um agente desintegrador, tal como o ácido algínico, Primogel ou amido de milho; (4) um agente lubrificante, tal como o estearato de magnésio; (5) um agente deslizante, tal como o dióxido de silício coloidal; ou (6) um agente edulcorante ou um agente aromatizante. 93 A composição também pode ser administrada pelas vias transmucosal ou transdérmica. Por exemplo, os anticorpos que compreendem uma parcela de Fc são capazes de atravessar as membranas mucosas do intestino, da boca ou dos pulmões (através dos receptores de Fc). A administração transmucosal pode ser efectuada mediante o recurso a pastilhas em forma de losangos, micronizadores nasais, inaladores ou supositórios. A administração transdérmica também pode ser efectuada mediante a utilização de uma composição que contenha unguentos, pomadas, geles ou cremes conhecidos na especialidade. Para a administração transmucosal ou transdérmica são utilizados agentes de penetração adequados para atravessamento da barreira que se pretende atravessar. Para a administração por inalação, os anticorpos são administrados numa forma micronizada em aerossol, emanada por um reservatório ou aplicador pressurizado que contém um agente propulsor (v.g., um líquido ou um gás) ou um nebulizador
Em determinadas formas de realização, os anticorpos da presente invenção são preparados com veículos que servem para proteger os anticorpos contra uma rápida eliminação para fora do corpo. São utilizados, frequentemente, polímeros biodegradáveis (v.g., acetato de etileno vinílico, polianidridos, poliácidos glicólicos, colagénio, poliortoésteres, ácido poliláctico). Os processos para a preparação de tais formulações são perfeitamente conhecidos pelos especialistas na matéria. Também é possível utilizar suspensões lipossómicas enquanto veículos farmaceuticamente aceitáveis. Os lipossomas, podem ser preparados em conformidade com métodos consagrados, conhecidos na especialidade (patente de invenção norte-americana n° 4 522 811). 94
Os anticorpos e as composições de anticorpos da presente invenção são administrados em quantidades terapeuticamente eficazes, conforme descrito. As quantidades terapeuticamente eficazes podem variar consoante a idade, o estado, o sexo e a gravidade da patologia médica do indivíduo em causa. A dosagem adequada pode ser determinada por um médico, com base em indicações clínicas. Os anticorpos ou composições podem ser administrados sob a forma de uma dose bolus para maximizar a concentração de anticorpos na circulação, para um intervalo de duração máximo. Também é possível recorrer à infusão contínua após a administração da dose bolus.
Tal como aqui utilizado, o termo "indivíduo" pretende designar os seres humanos e animais não humanos. Os indivíduos podem ser pacientes humanos que padeçam de uma patologia caracterizada por células em que tenha lugar a expressão de IL-22, v.g., células cancerosas ou células imunes. 0 termo "animais não humanos", utilizado na presente invenção, designa todos os vertebrados, tais como primatas não humanos, ovelhas, canídeos, bovinos, galináceos, anfíbios, repteis, etc..
Os exemplos de intervalos de dosagem que é possível administrar a um indivíduo podem ser os seguintes: 1 pg/kg a 20 mg/kg, 1 pg/kg a 10 mg/kg, 1 pg/kg a 1 mg/kg, 10 pg/kg a 1 mg/kg, 10 pg/kg a 100 pg/kg, 100 pg/kg a 1 mg/kg, 250 pg/kg a 2 mg/kg, 250 pg/kg a 1 mg/kg, 500 pg/kg a 2 mg/kg, 500 pg/kg a 1 mg/kg, 1 mg/kg a 2 mg/kg, 1 mg/kg a 5 mg/kg, 5 mg/kg a 10 mg/kg, 10 mg/kg a 20 mg/kg, 15 mg/kg a 20 mg/kg, 10 mg/kg a 25 mg/kg, 15 mg/kg a 25 mg/kg, 20 mg/kg a 25 mg/kg e 20 mg/kg a 30 mg/kg (ou superiores). Estas doses podem ser administradas diária, semanal, quinzenal, 95 mensalmente ou com menor frequência, por exemplo, semestralmente, consoante a dosagem, o processo de administração, a patologia ou sintomas que se pretenda tratar e consoante as características de cada indivíduo. As doses também podem ser administradas por infusão contínua (por exemplo, por meio de uma bomba) . A dose administrada também pode depender da via de administração. Por exemplo, a administração cutânea pode implicar um regime de dosagem mais elevado do que a administração intravenosa.
Em determinadas circunstâncias pode ser vantajoso formular as composições em formas unitárias de dosagem, por razões de facilidade de administração e de uniformidade da dosagem. A forma unitária de dosagem, tal como aqui utilizada, diz respeito a unidades fisicamente discretas adequadas para o paciente. Cada unidade de dosagem contém uma quantidade predeterminada de anticorpos, calculada para produzir um efeito terapêutico em associação com o veículo. A unidade de dosagem depende das características dos anticorpos e do efeito terapêutico particular que se pretenda alcançar. É possível determinar a toxicidade e a eficácia terapêutica da composição, recorrendo a procedimentos farmacêuticos convencionais em culturas de células ou com animais experimentais, v.g., determinando o valor DL50 (a dose letal para 50% da população) e o valor DE50 (a dose terapeuticamente eficaz em 50% da população). A razão entre as doses correspondentes aos efeitos tóxicos e terapêuticos recebe a designação de índice terapêutico e pode ser expressa pela relação DL50/DE50. Os anticorpos para os quais os índices terapêuticos sejam grandes podem ser menos tóxicos e/ou mais eficazes sob o ponto de vista terapêutico. 96
Os dados obtidos a partir de experiências com culturas de células e a partir de estudos com animais podem ser utilizados para formular intervalos de dosagem para os seres humanos. A dosagem destes compostos pode estar situada no intervalo das concentrações de anticorpos na circulação sanguínea, abrangendo valores DE50 com fraca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar neste intervalo, consoante a forma da composição de dosagem utilizada e a via de administração. Para qualquer anticorpo utilizado na presente invenção, a dose terapeuticamente eficaz pode ser estimada inicialmente recorrendo a experiências com culturas de células. A dose pode ser formulada em modelos com animais para se obter uma concentração no plasma em circulação que abranja o valor CI50 (isto é, a concentração de anticorpos que permite conseguir uma inibição dos sintomas para metade do valor máximo). Os efeitos de qualquer dosagem particular podem ser monitorizados por meio de um bioensaio conveniente. Como exemplos de bioensaois convenientes refere-se os ensaios de replicação de ADN, os ensaios à base de transcrição, os ensaios de ligação de IL-22/IL-22R, os ensaios de ligação de IL-22/IL-10R2, os ensaios com IL-22/IL-22R/IL-10R2 e outros ensaios imunológicos.
EXEMPLOS
Exemplo 1: selecção dos scFv anti-IL-22
Selecção de GIL01 e GIL68 originais
Os GIL01 e GIL68 foram isolados a partir de bibliotecas de scFv por selecção solúvel em presença de IL- 97 22. As selecções solúveis foram realizadas utilizando IL-22 biotinilada com uma proteína identificada com His/FLAG no terminal N (bio. IL-22 H/F) . A bio. IL-22 H/F foi utilizada inicialmente com uma concentração de 100 nM. Utilizou-se uma biblioteca de fagomideos scFv, que é uma versão expandida de uma biblioteca de l,38xl010 já descrita (Vaughan et al., 1996), para seleccionar anticorpos específicos para a IL-22. Os fagos scFv purificados (1012 unidades de transdução (ut)) foram bloqueados durante 30 minutos em 100 pL de MPBS a 3% (3% de leite em pó em PBS) e depois acrescentou-se bio.IL-22 H/F e manteve-se tudo a incubar à temperatura ambiente durante 1 hora. Acrescentou-se o fago/antigénio a 50 pL de esférulas magnéticas de estreptavidina 'Dynal M280' que haviam sido bloqueadas durante 1 hora a 37 °C em 1 mL de MPBS a 3% e depois manteve-se tudo a incubar durante mais 15 minutos à temperatura ambiente. Efectuou-se a captura das esférulas utilizando uma peça magnética, tendo sido lavadas 4 vezes em 1 mL de MPBS a 3%/Tween 20 a 0,1% (v/v) , seguindo-se três lavagens em PBS. Após a última lavagem, as esférulas foram recolocadas em suspensão em 100 pL de PBS e foram utilizadas para infectar 5 mL de células TG-1 de E. coli em crescimento em fase exponencial. As células e os fagos sobre as esférulas ficaram a incubar durante 1 hora a 37°C (30 minutos em estado estacionário, 30 minutos com agitação a 250 rpm) e depois foram espalhadas sobre placas 2TYAG. As placas ficaram a incubar a 30°C, de um dia para o outro, tendo as colónias sido visualizadas no dia seguinte. Efectuou-se a raspagem das colónias para fora das placas e para dentro de 10 mL de caldo 2TY e acrescentou-se glicerol a 15% para armazenagem a -70°C. 98
As culturas disponíveis no glicerol, provenientes da primeira selecção criteriosa, foram superinfectadas com fagos auxiliares e recuperadas para se obter partículas de fagos em que tem lugar a expressão de anticorpos de scFv para a segunda fase de selecção. A segunda e a terceira fases do processo de selecção solúvel foram efectuadas conforme descrito supra, fazendo cair a concentração de bio.IL-22 H/F para 50 nM.
Isolamento de GIL16, GIL45, GIL60 e GIL92 originais
Os GIL16, GIL45, GIL60 e GIL92 foram isolados a partir de bibliotecas de scFv, por meio de uma combinação de selecção criteriosa de uma proteína de fusão IL-22 e selecção solúvel em presença de bio.IL-22 H/F. As cavidades de uma placa de microtitulação foram recobertas com proteína de fusão de IL-22 humana na concentração de 10 pg/mL (PBS da Dulbecco, pH 7,4) e manteve-se tudo a incubar de um dia para o outro a 4°C. Efectuou-se a lavagem das cavidades em PBS e bloqueou-se durante 2 horas a 37°C em MPBS a 3%. Às cavidades bloqueadas acrescentou-se os fagos purificados (1012 ut) em 100 pL de MPBS a 3% e manteve-se tudo a incubar à temperatura ambiente durante 1 hora. Efectuou-se a lavagem das cavidades 10 vezes com PBST (PBS contendo Tween 20 a 0,1% v/v) e depois 10 vezes com PBS. Efectuou-se a eluição das partículas dos fagos ligados, utilizando para tal 100 pL de solução de tripsina (tripsina na concentração de 0,5 pg/mL em Tris 50 mM a pH 8, CaCl2 1 mM) , durante 30 minutos a 37°C. Os fagos resultantes da eluição foram utilizados para infectar 10 mL de células TG1 de E. coli em crescimento em fase exponencial. As células 99 infectadas ficaram a desenvolver-se em caldo 2TY durante 1 hora a 37°C, conforme indicado supra, e depois foram feitas com elas riscas sobre placas 2TYAG e ficou tudo a incubar de um dia para o outro a 30°C. As colónias resultantes foram raspadas para fora das placas e os fagos foram recuperados conforme se disse antes. Efectuou-se uma segunda fase de selecção solúvel, conforme descrito antes, utilizando bio.IL-22 H/F 100 nM.
Exemplo 2: o scFv bloqueia a ligação da IL-22 ao IL-22R
Foram efectuados ensaios de inibição com os anticorpos originais GIL01, GIL16, GIL45, GIL60, GIL68 e GIL92 para identificar anticorpos que bloqueiem ou alterem a ligação da IL-22 ao IL-22R e/ou ao complexo de receptores de IL-22. Efectuou-se a pesquisa de extractos periplásmicos contendo os scFv impuros para se pesquisar a sua aptidão para inibirem a ligação de bio.IL-22 H/F a uma proteína receptora de IL-22 humana (hIL-22R). As colónias resultantes das selecções foram aplicados por meio de uma ponta fina em placas de 96 cavidades contendo 100 pL de 2TYAG. A produção de scFv foi induzida por adição de IPTG 1 mM a culturas em crescimento em fase exponencial e por incubação de um dia para o outro a 30°C. Os extractos periplásmicos foram preparados (Griffiths et al., 1993) em MOPS 50 mM a pH 7,4 / EDTA 0,5 mM / sorbitol 0,5 M.
As placas de microtitulação foram recobertas com um anticorpo da proteína receptora de IL-22, na concentração de 1,25 pg/mL (em PBS), durante 1,5 horas à temperatura ambiente. As placas foram depois lavadas três vezes em PBS e bloqueadas durante 1 hora à temperatura ambiente com PBS 100 contendo 2% de leite em pó (MPBS a 2%) . Após mais 3 lavagens, acrescentou-se a cada cavidade 50 pL de meio condicionado com 25% de células, contendo uma proteína receptora de IL-22, e manteve-se tudo a incubar de um dia para o outro a 4°C. No dia seguinte acrescentou-se às placas lavadas 25 pL de amostra e 25 pL de bio. IL-22 H/F (54 ng/mL em PBS/BSA a 0,5% /Tween a 0,05%) e manteve-se tudo a incubar durante 1,5 horas à temperatura ambiente. Após 3 lavagens em PBST detectou-se a ligação de bio.IL-22 H/F com Európio-Estreptavidina e detectou-se o TRF com o estojo de reagentes DELFIA® e com o leitor de placas Victor 2™ (Perkin Elmer).
Os clones que manifestaram inibição da ligação de IL-22 foram novamente testados, enquanto scFv purificados. Foram praticados tanto o ensaio de ligação de IL-22/IL-22R (descrito supra) como o ensaio com o complexo de IL-22 / receptor de IL-22 (descrito infra). Efectuou-se a titulação das concentrações de scFv, com a finalidade de se determinar as potências do clone, conforme medido por experimentação dos valores CI50. Estes foram determinados utilizando a aplicação informática 'GraphPad Prism' e o ajustamento da curva pela equação logística de quatro parâmetros. Os resultados obtidos com as amostras, a partir do ensaio com o complexo de receptor de IL-22, estão ilustrados na figura 1.
Exemplo 3: verificação da ligação da IL-22 pelo protocolo ELISA com fagos
Para se determinara a especificidade dos scFv para a IL-22, realizou-se um protocolo ELISA com fagos, utilizando 101 a proteína de fusão de IL-22, a IL-22 H/F, e uma proteína sem qualquer conotação. Com colónias individuais de E. coli que continham os faqomídeos efectuou-se a inoculação de placas de 96 cavidades que continham 100 pL de meio 2TYAG por cavidade. Acrescentou-se o faqo auxiliar M13K07, até se obter uma multiplicidade de infecção (mdi) igual a 10 a uma cultura em crescimento em fase exponencial e manteve-se as placas a incubar durante mais 1 hora a 37°C. Efectuou-se a centrifugação das placas numa centrífuga de bancada de laboratório a 2000 rpm durante 10 minutos. Removeu-se o sobrenadante e com os agregados celulares preparou-se nova suspensão em 100 pL de meio 2TYAK e manteve-se tudo a incubar a 30°C de um dia para o outro, com agitação. No dia seguinte, efectuou-se a centrifugação das placas a 2000 rpm durante 10 minutos e transferiu-se de cada cavidade 100 pL de sobrenadante, contendo os fagos, para uma nova placa de 96 cavidades. As amostras de fagos foram bloqueadas em MPBS com uma concentração final de 3% durante 1 hora à temperatura ambiente.
As placas de microtitulação foram recobertas com a proteína de fusão de IL-22, a IL-22 H/F, na concentração de 1 pg/mL, ou com uma proteína sem qualquer conotação, na mesma concentração, e ficou tudo a incubar de um dia para o outro a 4°C. Depois de efectuado o revestimento, efectuou-se a remoção de soluções para fora das cavidades e realizou-se o bloqueio das placas durante 1 horta à temperatura ambiente em MPBS a 3%. Efectuou-se o enxaguamento das placas com PBS e depois acrescentou-se a cada cavidade 50 pL de fagos previamente bloqueados. Manteve-se as placas a incubar à temperatura ambiente durante 1 hora, tendo sido lavadas depois 3 vezes com PBST, seguindo-se 3 substituições de PBS. 102 A cada cavidade acrescentou-se 50 pL de uma diluição a 1:5000 de conjugado de anti-M13-HRP (Pharmacia), tendo as placas ficado a incubar à temperatura ambiente durante 1 hora. Efectuou-se a lavagem das placas 3 vezes com PBST e depois 3 vezes com PBS. Acrescentou-se a cada cavidade 50 pL de substrato de TMB e manteve-se tudo a incubar até aparecer uma cor. Interrompeu-se a reacção por adição de 25 pL de H2SO4 0,5 M e mediu-se a absorvência a 450 nm. Estas experiências confirmaram a ligação especifica dos clones de scFv à IL-22.
Exemplo 4: conversão de scFv em IgG
As regiões V das cadeias pesada e leve dos clones de scFv foram amplificadas com iniciadores específicos dos clones. Os produtos da PCR foram digeridos com enzimas de restrição adequadas e subclonados em vectores que continham o domínio constante da cadeia pesada da IgG4 humana (no caso dos domínios VH) ou em vectores que continham os domínios constantes das cadeias λ ou κ humanas, conforme apropriado (para os domínios VL) . Efectuou-se a determinação das
linhagens germinais humanas mais próximas dos segmentos de VH e VL e utilizou-se esta informação para indicar quais dos domínios constantes das cadeias leves κ ou À haviam sido utilizados (quadro 4) . Verificou-se a inserção correcta dos domínios da região V nos plasmídeos, fazendo a sequenciação do ADN plasmídico proveniente das colónias individuais de E. coli. Os plasmídeos foram preparados a partir de culturas de E. coli, por meio de técnicas convencionais, e as construções de cadeias pesadas e leves foram co-transfectadas em células HEK 293 EBNA, recorrendo a técnicas convencionais. A IgG 103 segregada foi purificada, utilizando proteína A em sepharose (Pharmacia) e tendo sido substituído o tampão por PBS.
Quadro 4. Linhagens germinais de VH e VL de clones neutralizadores da IL-22
Clones Linhagem germinal de VH Linhagem germinal de VL GIL01 3-11 (DP35) Vkl:L12 GIL16 1-18 (DP14) Vkl:L12 GIL45 3-33 (DP50) VL2:2a2 (DPL11) GIL60 3-20 (DP32) VL2:2a2 (DPL11) GIL68 1-2 (DP8) VL3:3h GIL92 1-2 (DP8) VL1:1e (DPL8)
Verificou-se a potência da IgG purificada, no ensaio bioquímico de inibição do complexo de receptores de IL-22, conforme descrito infra. Efectuou-se a titulação das concentrações de IgG com a finalidade de se obter os valores de potência. Os dados respeitantes à potência das amostras estão ilustrados no quadro 5.
Quadro 5: Potência de scFv de IL-22 e da IgG no ensaio de inibição do complexo de receptores de IL-22
Clones Potência de scFv (nM) Potência da IgG (nM) GIL01 104 13 GIL16 49 10 GIL60 43 15 GIL68 7 2 GIL92 16 impossível de obter GIL45 358 180 104
Exemplo 5: optimização dos anticorpos para a IL-22
Foram criadas grandes bibliotecas de expressão de ribossomas, os quais foram pesquisados para procurar os scFv que reconheceram especificamente a IL-22 humana recombinante, essencialmente conforme descrito por Hanes et ai. (2000). Inicialmente, os cinco clones originais (GIL01, GIL16, GIL60, GIL68 e GIL92) foram convertidos em formato de expressão de ribossomas e depois este molde foi utilizado para a criação da biblioteca. Ao nível do ADN, acrescentou-se o promotor T7 na extremidade 5' para uma transcrição eficiente em ARNm. AO nível do ARNm, a construção continha um local procariótico de ligação de ribossomas (sequência de Shine-Dalgarno) e as hélices duplas de 5' e 3' para a estabilidade do ARNm. Na extremidade 3 T da cadeia simples foi removido o códão de terminação e foi acrescentada uma parcela de glll para actuar como um espaçador, permitindo o desdobramento do scFv a partir do túnel ribossómico (Hanes et al. 2000).
Foram criadas bibliotecas de expressão de ribossomas a partir dos clones originais, por mutagénese das regiões determinantes da complementaridade de cadeia singular (CDR) , praticando a PCR com polimerase de ADN de Taq sem actividade correctora. Foram realizadas selecções, com base na afinidade, em que se manteve a biblioteca a incubar com bio.IL-22 H/F, seguindo-se a utilização de esférulas paramagnéticas recobertas com estreptavidina (Dynal M280). Os complexos terciários (ARNm-ribossoma-scFv) foram recuperados por separação magnética, tendo sido deitados fora os complexos desligados. Os ARNm que codificam os scFv ligados foram depois recuperados por RT-PCR, conforme descrito (Hanes et ai., 2000), e repetiu-se o processo de 105 selecção com concentrações decrescentes (100 nM - 10 pM ao longo de 5 procedimentos) de bio.IL-22 H/F.
Introduziu-se a PCR com propensão para erro (Error Prone PCR) para aumentar ainda mais o tamanho da bbiblioteca. A taxa de erro que foi utilizada criou, em média, 7,2 mutações por cada 1000 pb, após um procedimento de PCR convencional com base no processo de Cadwell e Joyce (1992) . Os procedimentos iniciais de PCR com propensão para o erro decorreram entre a primeira e a segunda operações de selecção.
As bibliotecas recombinatórias de Vh/Vl para cada clone original foram preparados a partir daquilo que resultou da expressão de ribossomas das CDR de VH e VL, após a segunda ou após a quarta operações de selecção. A parcela de VH daquilo que resultou da selecção da CDR de VH para uma linhagem particular foi especificamente amplificado por PCR, utilizando iniciadores específicos dos clones. A parcela de VL daquilo que resultou da selecção da CDR de VL para a mesma linhagem foi amplificada separadamente. Estes dois produtos de PCR foram recombinados por meio de um procedimento de PCR com sobreposição. Isto criou uma biblioteca completa de produtos de scFv, contendo a totalidade dos componentes necessários para outras operações de selecção de bibliotecas de expressão de ribossomas.
Para alguns clones foram também utilizadas bibliotecas de expressão de fagos. As bibliotecas de fagos foram criados por mutagénese das CDR de cadeia singular, recorrendo a procedimentos de PCR com iniciadores adequados, tendo a selecção sido feita conforme descrito supra. Os produtos destes procedimentos foram também combinados com os produtos 106 de selecção de bibliotecas de expressão de ribossomas, para assim serem criadas bibliotecas de recombinação de VH/VL. Os produtos resultantes da selecção de VH obtidos na quarta operação de expressão de ribossomas, conjuntamente com os produtos resultantes da terceira operação de expressão de fagos, foram recombinados com os produtos de selecção de VL provenientes da mesma linhagem. Isto foi conseguido utilizando iniciadores específicos dos clones e PCR com sobreposição para a produção de bibliotecas recombinatórias de VH/VL. As selecções com bio.IL-22 H/F solúvel prosseguiram em formato de expressão de ribossomas, conforme descrito supra. As regiões de scFv dos produtos da selecção foram clonadas direccionalmente em pCANTAB6 para a produção de scFv para se efectuar uma separação bioquímica com elevada produtividade geral.
Exemplo 6: identificação de clones optimizados
Foram realizados dois ensaios experimentais para a separação dos produtos de selecção com elevada produtividade geral. Foram separados os produtos obtidos a partir dos clones GIL01, GIL1E e GIL68, num ensaio de fluorescência de resolução temporal (HTRF®, Cis Biointernational), ao passo que os produtos obtidos a partir de GIL60 e GIL92 foram separados num ensaio DELFIA® (Perkin Elmer).
Ensaio de competição do epitopo HTRF®
Procedeu-se à preparação dos sobrenadantes de culturas que continham scFv, provenientes dos clones obtidos a partir de GIL01, GIL16 e GIL68, conforme descrito supra, 107 para se pesquisar a inibição de ligação de bio.IL-22 H/F a GIL68 num ensaio experimental com HTRF. A IgG de GIL68, marcada com criptato (estojo de marcação da Cis Biointernational) foi diluída 400 vezes em tampão de ensaio (PBS/KF 0,4M /BSA a 0,05% /Tween a 0,05%), seguindo-se a adição de Streptavidin XL665 7,5 nM (Xlent, Cis Biointernational). Misturou-se esta solução com a amostra impura de scFv (diluída 125 vezes) e com bio.IL-22 H/F em placas negras 'Optiplate' de 384 cavidades da
Packard (Perkin Elmer). Manteve-se as placas a incubar durante 1 hora à temperatura ambiente, tendo sido lidas depois com um leitor de placas Victor 2™ (Perkin Elmer). Utilizou-se o coeficiente de emissão igual a 665 nM/620 nM para calcular a percentagem de ligação específica em cada cavidade.
Ensaio de fluorescência de resolução temporal DELFIA®
Efectuou-se a pesquisa de clones provenientes de GIL60 e GIL92 para se investigar a inibição da ligação de bio.IL-22 H/F a um complexo e receptores de IL-22.
As placas de microtitulação foram recobertas com um anticorpo do complexo de receptores de IL-22 (1 pg/mL em PBS) e manteve-se tudo a incubar durante 1,5 horas à temperatura ambiente. Efectuou-se a lavagem das placas 3 vezes em PBST, tendo sido bloqueadas durante 1 hora à temperatura ambiente com MPBS a 2%. Após mais 3 lavagens, acrescentou-se meio condicionado e diluído para células, contendo um complexo de receptores de IL-22, e manteve-se tudo a incubar de um dia para o outro a 4°C. Os sobrenadantes de scFv impuros foram preparados conforme 108 descrito supra. No dia seguinte, acrescentou-se às placas lavadas 25 pL de amostra de scFv diluída e 25 pL de bio.IL-22 H/F (6 ng/mL) e manteve-se tudo a incubar durante 1,5 horas à temperatura ambiente. Efectuou-se a lavagem das placas 3 vezes em PBST e depois detectou-se a ligação de bio.IL-22 H/F ao complexo de receptores de IL-22 com Európio-Estreptavidina e com o estojo de reagentes DELFIA® (PerkinElmer). Mediu-se a fluorescência de resolução temporal, utilizando um leitor de placas 'Victor 2™' (Perkin Elmer).
Os scFv purificados, provenientes dos clones positivos, identificados na sequência da análise de pesquisa, foram testados no ensaio de competição do complexo dos receptores de IL-22 com o estojo DELFIA®, conforme descrito supra. Utilizou-se uma titulação das concentrações de scFv para se determinar a potência dos clones, conforme medido pelos valores de CI50 no ensaio. Os resultados obtidos com as amostras estão ilustrados na figura 2. Os 14 clones optimizados receberam as designações de 097D09, 062A09, 062G05, 087B03, 367D04, 368D04, 166B06, 166G05, 375G06, 376B10, 354A08, 355806, 355E04 e 356A11.
Exemplo 7: ordenamento dos clones optimizados no ensaio de proliferação com BAF3-IL-22
Foram efectuados ensaios de proliferação para se avaliar a aptidão dos anticorpos para bloquearem a proliferação de células BaF3, mediada por IL-22. As células BaF3, em que tem lugar a expressão de hIL22R/hIL10R2, foram geradas por co-transfecção de células BaF3 com hIL22R-GFP e hIL10R2-YFP. As células BaF3, em que tem lugar a expressão 109 de hIL22R e hIL10R2 (células do receptor de IL-22-BaF3), foram classificadas e recolhidas por FACS.
As células do receptor de IL-22-BaF3 foram mantidas, de forma rotineira, em meio RPMI 1640 contendo FBS a 10% e IL-3 de murinos na concentração de 1 ng/mL. Imediatamente antes da preparação da experiência, efectuou-se a lavagem das células 4 vezes em meio de ensaio (RPMI 1640 com 10% FBS, penicilina na concentração de 100 U/mL e estreptomicina na concentração de 100 pg/mL) e com elas preparou-se nova suspensão em meio de ensaio e manteve-se tudo a incubar a 37°C em atmosfera contendo 5% de CO2 durante 6-8 horas. Para a preparação das placas de ensaio, acrescentou-se 100 pL de células (lxl05/mL no meio de ensaio) às 60 cavidades centrais de uma placa de cultura de tecidos de 96 cavidades de fundo plano (Costar) . As amostras experimentais de scFv ou de IgG foram preparadas diluindo a amostra do lote geral em meio de ensaio, seguindo-se a filtração através de um filtro de 0,22 pM. Foram preparadas diluições sequenciais, feitas 5 vezes, das amostras numa placa de diluição separada. As cavidades que continham as células foram tratadas com 50 pL de amostra, seguindo-se a adição de 50 pL de IL-22 humana (40 ng/mL em meio de ensaio) e depois ficou tudo a incubar durante 40 horas a 37°C sob uma atmosfera contendo 5% de CO2. As cavidades de controlo continham apenas meio e células, quer por si sós quer na presença de IL-22 humana, na concentração de 10 ng/mL.
Detectou-se a proliferação celular por adição de 20 pL de corante azul de Alamar (Serotec) às cavidades, seguindo-se a incubação durante 5 horas ± 30 minutos a 37°C em atmosfera contendo 5% de CO2. Efectuou-se a agitação das placas por meio de pancadas suaves para se garantir um sinal uniforme em todas 110 as cavidades, antes de se medir a fluorescência (excitação a 560 nm, emissão a 590 nm) . Fez-se uma estimativa dos valores CE50 e CI50, recorrendo ao ajustamento da curva logística de quatro parâmetros (aplicação informática Graphpad Prism 2), tendo tais valores sido utilizados para ordenar os anticorpos. Os dados sobre potência das amostras, respeitantes aos valores optimizados de scFv e de IgG, estão agrupados no quadro 6.
Quadro 6. Valores CI50 dos clones de scFv e de IgG no ensaio de proliferação de BaF3-IL-22
Clone Original CI50 de scFv (pM) CI50 de IgG (pM) 097D09 GIL01 2981246 197142 062A09 GIL16 267 83137 062G05 GIL16 182 112130 087B03 GIL60 212 105117 367D04 GIL60 160149 12616 368D04 GIL60 186166 127110 16 6B06 GIL68 460 71123 166G05 GIL68 204 97123 375G06 GIL68 118198 10011 376B10 GIL68 104147 11916 354A08 GIL92 219183 79115* 355806 GIL92 18313 92114* 355E04 GIL92 192147 100114* 356A11 GIL92 124121 5315* * Foram testados clones derivados de GIL92, enquanto IgG genomutacionadas
Exemplo 8: Produção de genomutaçÕes 111
Para os 6 clones originais foram utilizados os dados respeitantes a sequências para identificação da sequência da linhagem germinal mais próxima para as cadeias pesada e leve de cada clone. As mutações adequadas foram produzidas recorrendo a técnicas convencionais de mutagénese dirigida ao local, utilizando-se para tal os iniciadores mutagénicos convenientes. A mutação das sequências foi confirmada por análise das sequências. As sequências respeitantes aos clones genomutacionados e aos seus domínios de scFv e VH e VL estão agrupadas no quadro 7. Os scFv purificados, provenientes de clones originais genomutacionados foram testados no ensaio de competição pela ligação entre a IL-22 biotinilizada e o complexo de receptores de IL-22, conforme descrito antes, com a finalidade de se determinar a potência do clone, conforme medida pelos valores CI50 no ensaio. Os resultados estão agrupados no quadro 8.
Quadro 7A. Sequências de aminoácidos e de nucleótidos dos domínios VH e VL, FV e CDR de anticorpos genomutacionados (GIL01, GIL16, GIL45, GIL60, GIL68, GIL92, 062A09 e 087B03)
Região Tipo 6IL01 SEQ ID GIL16 SEQ ID GIL45 SEQ ID GIL60 SEQ ID GIL68 SEQ ID GIL92 SEQ ID 062A09 SEQ ID 087B03 SEQ ID VH AA NO:365 NO:383 NO:401 NO:419 NO:437 NO:455 NO:473 NO:491 Vl AA NO:366 NO:384 NO:402 NO:420 NO:438 NO:456 NO:474 NO:492 scFv AA NO:367 NO:385 NO:403 NO:421 NO:439 NO:457 NO:475 NO:493 Hl AA NO:368 NO:386 NO:404 NO:422 NO:440 NO:458 NO:476 NO:494 H2 AA NO:369 NO:387 NO:405 NO:423 NO:441 NO:459 NO:477 NO:495 H3 AA NO:370 NO:388 NO:406 NO:424 NO:442 NO:460 NO:478 NO:496 LI AA NO:371 NO:389 NO:407 NO:425 NO:443 NO:461 NO:479 NO:497 L2 AA NO:372 NO:390 NO:408 NO:426 NO:444 NO:462 NO:480 NO:498 L3 AA NO:373 NO:391 NO:409 NO:427 NO:445 NO:463 NO:481 NO:499 vH ADN NO:374 NO:392 NO:410 NO:428 NO:446 NO:464 NO:482 NO:500 VL ADN NO:375 NO:393 NO:411 NO:429 NO:447 NO:465 NO:483 NO:501 112
Região Tipo 6IL01 GIL16 GIL45 GIL60 GIL68 GIL92 062A09 087B03 SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID scFv ADN NO:376 NO:394 NO:412 NO:430 NO:448 NO:466 NO:484 NO:502 Hl ADN NO:377 NO:395 NO:413 NO:431 NO:449 NO:467 NO:485 NO:503 H2 ADN NO:378 NO:396 NO:414 NO:432 NO:450 NO:468 NO:486 NO:504 H3 ADN NO:379 NO:397 NO:415 NO:433 NO:451 NO:469 NO:487 NO:505 LI NO:380 NO:398 NO:416 NO:434 NO:452 NO:470 NO:488 NO:506 L2 ADN NO:381 NO:399 NO:417 NO:435 NO:453 NO:471 NO:489 NO:507 L3 ADN NO:382 NO:400 NO:418 NO:436 NO:454 NO:472 NO:490 NO:508
Quadro 7B. Sequências de aminoácidos e de nucleótidos dos domínios VH e VL, FV e CDRs de anticorpos genomutacionados (166B06, 166G05, 354A08, 355806, 355E04, 356A11 e 368D04)
Região Tipo 166B06 SEQ ID 166G05 SEQ ID 35408 355B06 SEQ ID 355E04 SEQ ID 356Ά11 SEQ ID 368D04 SEQ ID VH AA NO:5 0 9 NO:527 NO:5 4 5 NO:563 NO:581 NO:599 NO:617 Vl AA NO:510 NO:528 NO:5 4 6 NO:564 NO:582 NO:600 NO:618 scFv AA NO:511 NO:529 NO:547 NO:565 NO:583 NO:601 NO:619 Hl AA NO:512 NO:530 NO:548 NO:566 NO:584 NO:602 NO:620 H2 AA NO:513 NO:531 NO:549 NO:567 NO:585 NO:603 NO:621 H3 AA NO:514 NO:532 NO:550 NO:568 NO:586 NO:604 NO:622 LI AA NO:515 NO:533 NO:551 NO:569 NO:587 NO:605 NO:623 L2 AA NO:516 NO:534 NO:552 NO:570 NO:588 NO:606 NO:624 L3 AA NO:517 NO:535 NO:553 NO:571 NO:589 NO:607 NO:625 VH ADN NO:518 NO:536 NO:554 NO:572 NO:290 NO:608 NO:626 Vl ADN NO:519 NO:537 NO:555 NO:573 NO:591 NO:609 NO:627 scFv ADN NO:520 NO:538 NO:556 NO:574 NO:592 NO:610 NO:628 Hl ADN NO:521 NO:539 NO:557 NO:575 NO:593 NO:611 NO:629 H2 ADN NO:522 NO:540 NO:558 NO:576 NO:594 NO:612 NO:630 H3 ADN NO:523 NO:541 NO:559 NO:577 NO:595 NO:613 NO:631 LI NO:524 NO:542 NO:560 NO:578 NO:596 NO:614 NO:632 L2 ADN NO:525 NO:543 NO:561 NO:579 NO:597 NO:615 NO:633 L3 ADN NO:526 NO:544 NO:562 NO:580 NO:598 NO:616 NO:634 113
Quadro 8. Sequências de ScFv dos clones originais não genomutacionados e genomutacionados no ensaio de competição pelo receptor de IL-22 scFv do clone original Valor CI50 (nM) no ensaio de competição com IL-22 Original Totalmente genomutacionado GIL01 124150 143145 GIL16 4411 3811 GIL60 51116 8213 GIL68 911 1411 GIL92 1812 40111
Houve 9 dos anticorpos optimizados que foram genomutacionados conforme descrito supra. Houve 8 das IgG mutacionadas que foram testadas no ensaio de proliferação de BaF3-IL-22, conforme descrito supra. Os valores CI50 dos anticorpos, obtidos numa experiência representativa, estão agrupados no quadro 9.
As sequências dos anticorpos foram depois enviadas para a instituição 'GENEART North America' (28 Kirk Bradden Rd. East, Toronto, ON, Canada M8Y2E6), onde foram sintetizadas para expressão optimizada em células de CHO, utilizando o algoritmo de optimização pertencente à instituição GENEART.
Quadro 9: Potências de IgG de clones optimizados e genomutacionados no ensaio de proliferação de BaF3-IL-22R
Clone Original CI50 (pM) de IgG não genomutacionada CI50 de IgG genomutacionada 087B03 GIL60 7216 118119 114
Clone Original CI5o (pM) de IgG não genomutacionada CI50 de IgG genomutacionada 16 6B0 6 GIL68 10 9±16 163132 166G05 GIL68 3661226* 109131 356A11 GIL92 ND 5315 355B06 GIL92 ND 92114 355E04 GIL92 ND 100114 354A08 GIL92 ND 79115 062A09 GIL16 10 8±2 3 Impossível de se obter * precipitado contic 0 na amostra; ND = não determinado
Exemplo 9: O anticorpo inibe a secreção de GROa induzida por IL-22, a partir de células HT29
Foram realizados ensaios com GROa para se avaliar a aptidão do anticorpo para bloquear a secrecção de GROa induzida por IL-22 a partir de células HT29. Fez-se uma inoculação de células HT29 numa placa de 96 cavidades de fundo redondo para cultura de tecidos (Corning Inc. Cat. #3595) em meio DMEM (DMEM + 10% de FBS + penicilina na concentração de 100 unidades/mL e estreptomicina + glutamina 2 mM) , à razão de 5 x 104/cavidade. Misturou-se IL-22, à razão de 10 ng/mL, com o anticorpo sequencialmente diluído em meio DMEM e manteve-se tudo a incubar durante 30 minutos a 37°C. Decorridas 24 horas após a preparação destes inóculos, removeu-se o meio para fora das células HT29 e acrescentou-se às células uma mistura prévia de IL-22 e de anticorpos, na placa de 96 cavidades.
Ao fim de 48 horas de incubação a 37 °C em atmosfera contendo 5% de C02, recolheu-se o meio e testou-se o GROa 115 segregado, recorrendo ao estojo de imunoensaio de GROa humano (R&D Systems, Cat. DGROO), em conformidade com as instruções do fabricante. Os resultados estão ilustrados na figura 3.
Exemplo 10: O anticorpo liga-se a diferentes espécies de IL-22 e inibe-as
Determinou-se a reactividade cruzada entre espécies de anticorpos optimizados, genomutacionados e não genomutacionados, do modo seguinte: foram utilizadas placas próprias para o protocolo ELISA (Costar, Cat. #3590) que foram recobertas, de um dia para o outro, com IL-22 de rato, de murganho ou de seres humanos ou com IL-22 de seres humanos em tampão de PBS na concentração de 1 pg/mL. As placas foram depois lavadas com tampão de PBST (Tween 20 a 0,05% em PBS) 3 vezes e a seguir foram bloqueadas com uma solução de BSA a 1% (Sigma A8918) / PBST durante 1 hora à temperatura ambiente. Acrescentou-se os anticorpos à razão de 1 pg/mL e manteve-se tudo a incubar durante 1 hora a 25°C. As placas foram depois lavadas e a seguir ficou tudo a incubar durante 1 hora a 25°C. As placas foram lavadas e depois acrescentou-se anticorpos anti-IgG humana conjugada na cabra com HRP (Southern Biotech Association, Cat. #2040-05). As placas ficaram a incubar durante 1 hora à temperatura de 25°C, tendo sido então feita uma lavagem com PBST e uma revelação com TMB (KPL, Cat. #50-7 6-04) . Interrompeu-se a reacção com H2SO4 a 0,18 M. Fez-se uma leitura das placas para os valores de DO a 450 nm. Os resultados estão ilustrados na figura 4.
Estes anticorpos também foram avaliados no ensaio com células GROa e no ensaio de proliferação de BaF3-IL-22. 116
Conforme ilustrado nos quadros 10(a) e 10(b), os anticorpos bloquearam a actividade da IL-22 humana, do macaco, do rato e do murganho, que sinaliza através de um receptor da IL-22 humana. Os anticorpos 356A11 e 368D04 também demonstraram reactividade cruzada entre espécies contra a IL-22 de murino, de rato e de macaco, tendo sido para tal feita uma análise de interacção bioespecifica em tempo real (BIA), conforme adiante se descreve de forma mais minuciosa no Exemplo 11.
Quadro 10(a). Os anticorpos contra a IL-22 são muitíssimo poderosos para bloquearem outras espécies de IL-22, conforme ilustrado no sistema de ensaio baseado nas células GROa. Os valores indicados são os valores CI50 em pM.
Dl da IL-22 IL-22 do IL-22 do IL-22 do proteína humana murino rato macaco 356A11 123,64 143,76 210,91 89, 57 368D04 154,07 156,25 281,12 184,10 controlo 1 353,18 468,34 1161,57 343,19 controlo 2 1955,80 3399,79 10697,17 1459,27 Quadro 10 (b). Os anticorpos contra a IL-22 são muitíssimo poderosos para bloquearem outras espécies de IL-22, conforme ilustrado no sistema de ensaio baseado nas células BaF3. Os valores indicados são os valores CI50 em pM.
Dl da IL-22 IL-22 do IL-22 do IL-22 do proteína humana murino rato macaco 356A11 3, 57 2,53 10, 69 2,58 368D04 3, 63 1,47 12,07 3, 87 controlo 1 6, 40 5~ 6 27,37 7,18 117
Dl da IL-22 IL-22 do IL-22 do IL-22 do proteína humana murino rato macaco controlo 2 204,98 1033,26 2500,00 134,27
Exemplo 11: comparação da cinética de ligação entre anticorpos monoclonais do rato anti-IL-22 e anticorpos monoclonais humanos anti-IL-22
Efectuou-se uma avaliação da cinética de ligação dos anticorpos monoclonais humanos anti-IL-22 (356A11 e 368D04) e dos anticorpos monoclonais do rato anti-IL-22 (P3/3 (Ab-02) e P3/2 (Ab-04), descritos nos documentos WO 2005/000897 e WO 02/068476), utilizados contra a IL-22 humana, por meio de uma análise de interacção bioespecifica em tempo real (BIA), recorrendo à tecnologia de ressonância do plasmão de superfície.
Para a preparação da superfície biodetectora para os anticorpos monoclonais do rato, imobilizou-se a proteína A/G (Pierce #21186, Rockford, IL) sobre uma microplaca de carboximetil-dextrano de qualidade própria para investigação (CM5), utilizando o acoplamento com amina. A superfície foi activada com EDC/NHS. A proteína A/G foi injectada com uma concentração de 50 pg/mL em tampão de acetato de sódio (pH
4.0) . A imobilização foi feita utilizando ferramentas Wizard para um valor de 3000 (UR) para a proteína A/G. Os outros grupos activados foram bloqueados com etanolamina 1,0 M (pH 8.0) . A primeira célula de fluxo serviu como superfície de referência para corrigir o índice de refracção do lote, os efeitos da matriz e a ligação não específica. A segunda, a terceiro e a quarta células de fluxo foram revestidas com a molécula capturadora. Os anticorpos monoclonais de rato, Ab-02 e Ab-04, que se ligam à proteína A/G, foram capturados 118 sobre a superfície da proteína A/G, mediante a injecção de 30 pL de uma solução com a concentração de 1 pg/ml. A diferença líquida entre a linha de referência e o ponto que fica aproximadamente a 90 segundos depois de completa a injecção de Ab-02 ou Ab-04 serviu para representar a quantidade de 1i gando 1i gado.
Para a preparação da superfície biodetectora dos anticorpos monoclonais humanos, efectuou-se a imobilização de anticorpo monoclonal humano (356A11 ou 368D04) ou de anticorpo de controlo PD-1 (#17) sobre uma microplaca de carboximetil-dextrano de qualidade própria para pesquisa (CM5), praticando a técnica convencional de acoplamento com amina. A superfície foi activada com EDC/NHS. Os anticorpos capturadores foram injectados com uma concentração de 1
pg/mL em solução de tampão acetato (pH 5,5). Os outros grupos activados foram bloqueados com etanolamina 1,0 M (pH 8,0) . A primeira célula de fluxo serviu de superfície de referência para correcção do índice de refracção do lote, dos efeitos da matriz e da ligação não específica. A segunda, a terceiro e a quarta células de fluxo foram revestidas com a molécula capturadora.
No caso dos anticorpos Ab-02 e Ab-04, foram injectadas soluções de IL-22 humana com as concentrações de 300, 100, 50, 25, 12,5, 6, 4, 3,2, 1, 6 e 0 nM em triplicado, com um caudal de 30 pL por minuto durante 3 minutos e depois registou-se, sob a forma de sensogramas, o material ligado em função do tempo. Monitorizou-se a fase de dissociação em tampão de HBS/EP durante 10 minutos com o mesmo caudal, seguindo-se uma injecção de 5 pL de TFA a 0,1% e uma injecção de 5 pL de glicina a pH 1,5 para regenerar uma superfície capturadora totalmente activa. 119
No caso dos anticorpos 356A11 e 368D04, foram injectadas soluções de IL-22 humana com as concentrações de 400, 200, 100, 50, 25, 12, 5, 6,25 e 0 nM em triplicado, com um caudal de 100 pL por minuto (caudal elevado para se evitar a ligação não especifica) durante 3 minutos e registou-se, sob a forma de sensogramas, a quantidade de material ligado em função do tempo. Monitorizou-se a fase de dissociação em tampão de HBS/EP durante 60 minutos com o mesmo caudal, seguindo-se duas injecções de 5 pL de glicina a pH 1,5 para se regenerar uma superfície capturadora totalmente activa.
Todas as experiências cinéticas foram feitas a 22,5°C em tampão de HBS/EP. Os efeitos das soluções tampão e neutras foram subtraídos a cada sensograma, utilizando-se para tal uma referenciação dupla. Nas experiências de controlo a primeira injecção continha solução tampão.
Os dados cinéticos foram analisados utilizando a aplicação informática 'BIAevaluation' 3.0.2 aplicada a um modelo 1:1. As constantes de velocidade aparente de dissociação (Kd) e de associação (Ka) foram calculadas a partir das regiões convenientes dos sensogramas, recorrendo a uma análise global. As constantes de afinidade da interacção entre o anticorpo e o analito foram calculadas a partir das constantes de velocidade cinética, de acordo com a expressão seguinte: KD = Kd / Ka, em que KD é a constante de dissociação e KA = Ka/Kd, em que KA é a constante de associação. Os dados de ligação respeitantes a Ab-02 e Ab-04 estão agrupados nos quadros 11A e 11B. Os dados de ligação respeitantes a 356A11 e 368D04 estão agrupados no quadro 12. 120
Quadro 11A. Parâmetros cinéticos para a interacção entre a IL-22 humana e os anticorpos Ab-02 e Ab-04 anti-IL-22
Ab-02 ka (ÍTV1) Ab-02 kd (s'1) Ab-04 ka (WV1) Ab-04 kd (s_1) Proteína A/G 2,78 E+05 1,45 E-03 5,15 E+06 1,23 E-03
Quadro 11B. Dados cinéticos de anticorpos monoclonais de rato para a IL-22 humana
Anticorpo Ka (1/Ms) Kd (1/s) KA (1/M) KD (M) Chi 2 Ab-02 2,78 1,45 1, 92 5, 22 0, 49 E+05 E-03 E+08 E-08 Ab-04 5, 15 1,23 4,22 2,38 0, 53 E+05 E-03 E+08 E-09
Quadro 12. Dados cinéticos dos anticorpos monoclonais humanos para a IL-22 humana
Anticorpo Ka (1/Ms) Kd (1/s) KA (1/M) KD (M) Chi 2 356A11 7,91 4,27 1, 85 5, 40 0, 223 E+4 E-06 E+10 E-ll 368D04 1,89 2,50 7,56 1,32 0, 298 E+05 E-05 E+09 E-10
Estes resultados comprovam que os anticorpos anti-IL-22 monoclonais humanos da presente invenção têm uma afinidade significativamente maior para a IL-22 humana do que os anticorpos monoclonais Ab-02 e Ab-04 de rato anti-IL-22, descritos nos documentos WO 2005/000897 e WO 02/068476, onde se afirma que têm aptidão para neutralizarem a IL-22 humana. Dito de forma concreta, a constante de dissociação para o anticorpo 356A11 (KD = 5,40 x 10-11 M ou 0,054 nM) para a IL-22 humana é cerca de 1000 vezes e mais do que 40 vezes superior 121 às constantes de dissociação do Ab-02 (KD = 5,22 x 1CT8 M ou 52 nM) e Ab-04 (KD = 2,38 x 10~9 M ou 2,38 nM) , respectivamente. De igual modo, o anticorpo 368D04 (KD = 1,32 x IO-10 M ou 0,132 nM) apresenta uma afinidade cerca de 400 vezes e 18 vezes maior para a IL-22 humana do que os Ab-02 e Ab-04, respectivamente. Os perfis de ligação dos anticorpos 356A11 e 36804 para a IL-22 de macacos, murinos e ratos foram semelhantes aos observados com a IL-22 humana (dados não apresentados)
As especificidades e ligação dos anticorpos 356A11 e 368D04 também foram avaliadas utilizando o protocolo BIA. Nenhum dos anticorpos manifestou reactividade cruzada com IL-10 humana, IL-19 humana, IL-20 humana, IL-24 humana, IL-28A humana, IL-29 humana, IFN-a2c humano ou IFN-ω humano (dados não apresentados).
Exemplo 12: modelo para o tratamento de artrite A artrite é uma doença caracterizada por inflamação nas articulações. A artrite reumatóide (AR) é a forma mais frequente de artrite, implicando a inflamação de tecido conjuntivo e da membrana sinovial, uma membrana que reveste a articulação. A membrana sinovial inflamada infiltra-se, frequentemente, na articulação e danifica a cartilagem e os ossos da articulação. Tanto a proteína IL-22 como a proteína IL-22R e/ou os seus transcritos estão associados a essa doença nos seres humanos. Em biópsias sinoviais de AR, a proteína IL-22 é detectada em fibroblastos sinoviais vimentina+ e em alguns macrófagos CD68+, ao passo que a proteína IL-22R é detectada em fibroblastos sinoviais. O tratamento dos fibroblastos sinoviais com IL-22 induz a 122 produção da proteína 1 quimioatractiva monocítica, MCP-1, e também a produção de actividade metabólica geral (Ikeuchi, H. et al. (2005) Arthritis Rheum. 52:1037-46). A IL-22 é utilizada para estudar o seu efeito sobre células da membrana sinovial, que é a membrana que reveste as articulações. Os sinoviócitos humanos semelhantes a fibroblastos (HFLS) (Cell Applications (San Diego, CA) ) são isolados a partir de tecidos sinoviais de pacientes com artrite reumatóide sujeitos a cirurgia das articulações. Os HFLS são criados em cultura com IL-22 humana durante 48 horas e os sobrenadantes são removidos e testados para pesquisa de quimioquinas e de citoquinas pelo protocolo ELISA. A IL-22 faz aumentar a secrecção, nos HFLS, de quimioquinas MCP-1, eotaxina e IP-10 e das citoquinas TNFa, IL-6 e IL-8. Estas quimioquinas e citoquinas são conhecidas na especialidade e sabe-se que favorecem a inflamação através de diversas actividades e que grandes concentrações suas nas articulações, provocadas pela IL-22, exacerbam a inflamação e a AR. A IL-22 é utilizada para regular a progressão clínica de CIA (artrite induzida pelo colagénio) . A CIA é o modelo convencional, com murganhos e ratos, para se estudar a artrite reumatóide; ver, v.g., Holmdahl et al., (2002) Ageing Res. Rev., 1:135. No dia 0, os murganhos são injectados com 100 pg de colagénio de tipo II em adjuvante de Freund completo e ao 21° dia os murganhos são novamente estimulados com 100 pg de colagénio de tipo II em adjuvante de Freund incompleto. Após 21° dia, os murganhos também são injectados diariamente com 1 pg de IL-22, sendo os murganhos examinados diariamente para pesquisa da patologia. Os sinais clínicos são registados do modo seguinte: 0 = ausência de inchaço, 1 = um inchaço com 1 a 123 2 dígitos ou tornozelo inchado, 2 = inchaço superior a 2 dígitos ou inchaço ligeiro das patas, 3 = inchaço intenso das patas e 4 = anquilose das patas. Os murganhos injectados com PBS após as injecções de colagénio desenvolveram a doença progressivamente. Os murganhos que foram injectados com IL-22 após as injecções de colagénio desenvolveram progressivamente uma patologia mais grave. Uma vez que o tratamento com a IL-22 exacerba especificamente a CIA, antevê-se que o tratamento com anticorpos anti-IL-22, por exemplo, com os anticorpos 087B03, 368D04, 354A08 ou 356A11 genomutacionados suprima ou retarde a CIA. Assim, uma vez que este modelo permite antever a eficácia do tratamento para a AR, antevê-se que o tratamento com anticorpos anti-IL-22, incluindo os anticorpos 087B03, 368D04, 354A08 ou 356A11 genomutacionados ou não genomutacionados, suprima ou retarde a AR em seres humanos.
Exemplo 13: tratamento de pacientes
Os pacientes com patologia autoimune, patologia respiratória, estado inflamatório da pele, do sistema cardiovascular, sistema nervoso, rins, fígado e pâncreas ou os pacientes de transplantes estão entre os tipos de pacientes que é possível tratar com os anticorpos da invenção. Apresenta-se seguidamente exemplos de regimes de tratamento e de efeitos previsíveis dos anticorpos de acordo com a presente invenção, incluindo os anticorpos 087B03, 368D04, 354A08 e 356A11. Também é possível utilizar dosagens e frequências de administração diferentes das indicadas no quadro 13. Os especialistas na matéria podem ajustar os regimes de tratamento, conforme necessário, com base na via de administração ou com base em outras 124 variáveis conhecidas, tais como a idade, a massa corporal, o estado patológico, o sexo, a gravidade do estado clinico, etc. do paciente que se pretende tratar.
Quadro 13. Regimes de tratamento
Patologia Tratado com Intervalo de dosagem Frequência Efeito esperado esclerose múltipla 087B03, 368D04, 356A11 ou 354A08 250 pg/kg a 2 mg/kg semanal, quinzenal ou mensalmente melhoria ou estabilização do estado patológico artrite reumatóide 087B03, 368D04, 356A11 ou 354A08 250 pg/kg a 2 mg/kg semanal, quinzenal ou mensalmente melhoria ou estabilização do estado patológico psoriase 087B03, 3 68 DO 4, 356A11 ou 354A08 250 pg/kg a 2 mg/kg semanal, quinzenal ou mensalmente melhoria ou estabilização do estado patológico IBD 087B03, 368D04, 356A11 ou 354A08 250 pg/kg a 2 mg/kg semanal, quinzenal ou mensalmente melhoria ou estabilização do estado patológico doença de Alzheimer 087B03, 368D04, 356A11 ou 354A08 250 pg/kg a 2 mg/kg semanal, quinzenal ou mensalmente melhoria ou estabilização do estado patológico 125
Compreende-se melhor o presente texto à luz dos preceitos explicitados nas obras aqui citadas. As formas de realização explicitadas na memória descritiva constituem uma ilustração das formas de realização da invenção e não devem ser consideradas como limitativas do âmbito da invenção. Um especialista na matéria depreende facilmente que há muitas outras formas de realização que estão abrangidas pela invenção.
Salvo quando especificado de outro modo, subentende-se que todos os números que expressam quantidades de ingredientes, condições de reacção, etc., utilizados na memória descritiva, incluindo as reivindicações, podem ser objecto de modificação, em todos os casos, quando associados aos termos "cerca de" ou "aproximadamente". Assim sendo, salvo quando especificado de outro modo, os parâmetros numéricos são aproximações e podem variar consoante as propriedades desejadas que venham a ser obtidas na presente invenção. Em última instância, e sem qualquer intuito de limitar a aplicação da doutrina de equivalentes ao âmbito das reivindicações, cada parâmetro numérico deve ser considerado em termos de número de dígitos significativos e tendo em conta os arredondamentos vulgares.
Salvo quando especificado de outro modo, subentende-se que o termo "pelo menos", precedendo um conjunto de elementos, diz respeito a cada elemento desse conjunto. 126
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
<110> WYETH CAMBRIDGE ANTIBODY TECHNOLOGY LIMITED
SUAS
<12 0> ANTICORPOS DIRIGIDOS CONTRA A IL-22 HUMANA UTILIZAÇÕES <130> 8702.0204-00304 <140> <141> <150> 60/774,596 <151> 2006-02-21 <160> 634 <170> Patentln versão 3.3 <210> 1 <211> 178 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 1 127
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<210> 2 <211> 1191 <212> ADN <213> Homo sapiens 128 <400> 2 gaassçggce aaag&ggcçç acaggfctçfcç çtçscççagS eaeíj&gtagç tçgagttaga SO atfcgscfcgea atggcegcce tgcagaaatç tgtgagotet fcfccettátfegg ggacfififcggss 12 S caccagctgc CtSCKtCíiCt tggecctcfcfc ggta<s®ggg» ggsgssgcfcg çgeecafccsg ise ®gge£5ga;«a. agtssa-scí.fe císsgeagseís! eattaftffifcee* awswg«*.«ffti.fc 34« <í»t:getggec &&g«sggefc& gççtggçsga e&&caae&e:& gsegt fcogte tc&tsgggga 3 CG easggagtss-a gtatg&gtga gsg$ígçts& cts&tgaaeíi:: s.ggtgetgaa 3:60 «ttcswscpte gs.agsag&g© tg|.te««í:.i33 aftçsgaeâgg feseéageete atstgcaggs 43« ggKgg&gpQCQ tfeSfi&ggfeíS. ggftvc«gcaa caggfitaag» aijístfcgfcHS&tií* £ tga.&ggfc.§a 4 CG tgaectgeat afccsagagga atg«9c®Ãaa getgsaggsG &g£t£ggsga MO ássáaagca». ctggisgaac!: ggaetLfcge&g fe&tafcgíetcf egagaaatgc (S«ô seagagc.a&s gccgaaaaas gsar.aacsaa csscctttec ssgsSaga&s, sso açgçeççaaa gffifHCS&ttt tta.aeesssa8i gga&gacggg aagoçaasefc 730 c-eatcafcgat eaaatgaaee wfc;gsg:fcfeag fetaeaaAgga .aáscaa fc-íjce 7*0 aetetfegte c s&ss@aeea.g aíaggtagasfc S&«£.asg«sfe agsfeattfcate: tgaSÍíiaeafet m® tcsíttgtsse tggegtt.cta. s-scacs-gasa seast^Eatr, tcfctaaatíta Ètgtettttt 3Í50 c;c«ts*á*âs gatcacttte e&stereiíCtsi gggg&asaaa ccestãaatã gsfcse&tgtt S*Õ tccafcaafcca gtacttCata eseesfe^aafeg· Sâfettsíiííàíí ç»fcfc®,£aágã «tgcattfetai ISSO fcfct&t»fcca.& e,.£tsse.saafcsi tatagassea teattegasa ttgfita«e.çg 1060 agtgtaaffs fcaatâttgsé atfetatgaca atastsatag âgcfcafcaacs SigSifctattíig 1140 accfceeafca» acasfcfcggafc atcctaaaàa aaáaasaíiaia aaftgoggocg £ USl
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REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO A presente listagem de referências citadas pela requerente é apresentada meramente por razões de conveniência para o leitor. Não faz parte da patente de invenção europeia. Embora se tenha tomado todo o cuidado durante a compilação das referências, não é possível excluir a existência de erros ou omissões, pelos quais o IEP não assume nenhuma responsabilidade.
Patentes de invenção citadas na descrição wo 2005000897 A [0004] [0230] us 20020187512 AI [0059] us 5565332 A [0064] us 4816567 A [0073] [0076] us 5223409 A, Ladner [0074] wo 9218619 A [0074] wo 9117271 A [0074] wo 9220791 A [0074] wo 9215679 A [0074] wo 9301288 A [0074] wo 9201047 A [0074] [0120] [0124] wo 9209690 A [0074] wo 9002809 A [0074] us 20030070185 A [0075] wo 9634096 A [0075] us 9605928 W [0075] us 4816397 A, Boss [0076] EP 171496 A [0076] EP 0173494 A [0076] GB 2177096 B [0076] us 5225539 A [0076] 424 US 5585089 A [0077] US 5693761 A [0077] US 5693762 A [0077] US 5859205 A [0077] US 6407213 B [0077] wo 9206193 A [0078] EP 0239400 A [0078] wo 9852976 A [0079] wo 0034317 A [0079] US 6300064 B [0079] • US 20030118592 A [0087] • US 20030133939 A [0087] • US 20040058445 A [0087] • US 20050136049 A [0087] [0088] • US 200510175614 A [0087] • US 20050180970 A [0087] • US 20050186216 A [0087] • US 20050202012 A [0087] • US 20050202023 A [0087] • US 20050202028 A [0087] • US 20050202534 A [0087] • US 20050238646 A [0087] US 6018026 A [0091] US 5750375 A [0091] wo 9404678 A [0092] wo 9749805 A [0092] US 5969108 A [0120] US 4640835 A [0125] US 4496689 A [0125] US 4301144 A [0125] US 4670417 A [0125] 425 us 4791192 A [0125] us 4179337 A [0125] us 4766106 A [0125] us 4495285 A [0125] us 4 60954 6 A [0125] wo 8705330 A [0126] EP 388151 Al [0127] us 5624821 A [0127] [0128] [0129] us 5648260 A [0127] wo 9429351 A, Morgan [0131] wo 03083062 A [0149] wo 2005000897 A2 [0151] [0173] us 6939545 B [0151] wo 0056772 A [0160] us 6258562 B [0162] wo 0155112 A [0162] us 6350892 B [0165] us 4522811 A [0183] wo 02068476 A [0230] us 60774596 B [0239] [0131]
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Lisboa, 09.02.2012

Claims (14)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Anticorpo isolado, ou um seu fragmento de ligação ao antigénio, que se liga especificamente à IL-22, em que o anticorpo, ou o seu fragmento de ligação ao antigénio, compreende: (a) um domínio VH que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos explicitada na SEQ ID NO: 23 e um domínio VL que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos explicitada na SEQ ID NO:2 4; (b) um domínio VH que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos explicitada na SEQ ID NO: 59 e um domínio VL que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos explicitada na SEQ ID NO:60; (c) um domínio VH que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos explicitada na SEQ ID NO: 77 e um domínio VL que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos explicitada na SEQ ID NO:7 8; ou (d) um domínio VH que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos explicitada na SEQ ID NO: 95 e um domínio VL que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos explicitada na SEQ ID NO:9 6; 2 e em que (i) a constante de associação do anticorpo para a IL-22 humana é pelo menos IO1 2 3 4 5 6 7 8 M-1, conforme medido por análise de interacção bioespecifica em tempo real, utilizando a tecnologia da ressonância do plasmão de superfície, (ii) o anticorpo bloqueia a proliferação de células BaF3 mediada pela IL-22 com um valor de CI50 igual a 150 pM ou inferior e em que as células BaF3 compreendem um receptor de IL-22 humana; ou (iii) o anticorpo bloqueia a secreção de GROa, mediada por IL-22, a partir das células HT29, com um valor de CI50 igual a 150 pM ou inferior.
2. Anticorpo da reivindicação 1(a), em que: a) o domínio VH compreende a sequência de aminoácidos explicitada na SEQ ID NO:131 e o domínio VL compreende a sequência de aminoácidos explicitada na SEQ ID NO:132; ou b) o domínio VH compreende a sequência de aminoácidos explicitada na SEQ ID NO:149 e o domínio VL compreende a sequência de aminoácidos explicitada na SEQ ID NO:150. 1 Anticorpo da reivindicação 1(b), em que: 2 a) o domínio VH compreende a sequência de aminoácidos 3 explicitada na SEQ ID NO:617 e o domínio VL compreende a 4 sequência de aminoácidos explicitada na SEQ ID NO:618; 5 b) o domínio VH compreende a sequência de aminoácidos 6 explicitada na SEQ ID NO:491 e o domínio VL compreende a sequência de aminoácidos explicitada na SEQ ID NO:492; 7 c) o domínio VH compreende a sequência de aminoácidos 8 explicitada na SEQ ID NO:167 e o domínio VL compreende a sequência de aminoácidos explicitada na SEQ ID NO:168; 3 d) o domínio VH compreende a sequência de aminoácidos explicitada na SEQ ID NO:185 e o domínio VL compreende a sequência de aminoácidos explicitada na SEQ ID NO:186; ou e) o domínio VH compreende a sequência de aminoácidos explicitada na SEQ ID NO:203 e o domínio VL compreende a sequência de aminoácidos explicitada na SEQ ID NO:204.
4. Anticorpo da reivindicação 1(c) , em que: a) o domínio VH compreende a sequência de aminoácidos explicitada na SEQ ID NO:527 e o domínio VL compreende a sequência de aminoácidos explicitada na SEQ ID NO:528; b) o domínio VH compreende a sequência de aminoácidos explicitada na SEQ ID NO:221 e o domínio VL compreende a sequência de aminoácidos explicitada na SEQ ID NO:222 c) o domínio VH compreende a sequência de aminoácidos explicitada na SEQ ID NO:239 e o domínio VL compreende a sequência de aminoácidos explicitada na SEQ ID NO:240; d) o domínio VH compreende a sequência de aminoácidos explicitada na SEQ ID NO:257 e o domínio VL compreende a sequência de aminoácidos explicitada na SEQ ID NO:258; ou e) o domínio VH compreende a sequência de aminoácidos explicitada na SEQ ID NO:275 e o domínio VL compreende a sequência de aminoácidos explicitada na SEQ ID NO:276.
5. Anticorpo da reivindicação 1(D), em que: a) o domínio VH compreende a sequência de aminoácidos explicitada na SEQ ID NO:599 e o domínio VL compreende a sequência de aminoácidos explicitada na SEQ ID NO:600; b) o domínio VH compreende a sequência de aminoácidos explicitada na SEQ ID NO:581 e o domínio VL compreende a sequência de aminoácidos explicitada na SEQ ID NO:582; 4 c) o domínio VH compreende a sequência de aminoácidos explicitada na SEQ ID NO:563 e o domínio VL compreende a sequência de aminoácidos explicitada na SEQ ID NO:564; ou d) o domínio VH compreende a sequência de aminoácidos explicitada na SEQ ID NO:545 e o domínio VL compreende a sequência de aminoácidos explicitada na SEQ ID NO:546.
6. Anticorpo da reivindicação 3, em que o domínio VH compreende a sequência de aminoácidos explicitada na SEQ ID NO:617 e o domínio VL compreende a sequência de aminoácidos explicitada na SEQ ID NO:618.
7. Anticorpo da reivindicação 5, em que o domínio VH compreende a sequência de aminoácidos explicitada na SEQ ID NO:599 e o domínio VL compreende a sequência de aminoácidos explicitada na SEQ ID NO:600.
8. Anticorpo isolado, ou um seu fragmento de ligação ao antigénio, que se liga especif icamente à IL-22, em que o anticorpo, ou um seu fragmento de ligação ao antigénio, compreende (i) um domínio VH que compreende a sequência de aminoácidos explicitada na SEQ ID NO:113 e um domínio VL que compreende a sequência de aminoácidos explicitada na SEQ ID NO:114; (ii) um domínio VH que compreende a sequência de aminoácidos explicitada na SEQ ID NO:509 e um domínio VL que compreende a sequência de aminoácidos explicitada na SEQ ID NO:510; ou (iii) um domínio de Fv que compreende as sequências de aminoácidos explicitadas em SEQ ID NO:151, SEQ ID NO:187, SEQ ID NO:205, SEQ ID NO:259, SEQ ID NO:277, SEQ ID NO:313, SEQ ID NO:331 ou SEQ ID NO:349. 5
9. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, em que: (a) o anticorpo se liga especificamente à sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica a qualquer sequência contendo pelo menos 100 aminoácidos contíguos na sequência explicitada em SEQ ID NO:l; (b) o anticorpo inibe a ligação de IL-22 ao IL-22R ou a um complexo de receptores constituído por IL-22R e IL-10R2; (c) o anticorpo é humano; ou (d) o anticorpo é IgGI ou IgG4.
10. Composição farmacêutica que contém o anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9. 11. Ácido nucleico isolado que codifica um anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9.
12. Vector de expressão que compreende o ácido nucleico da reivindicação 11.
13. Célula hospedeira transformada com o vector da reivindicação 12.
14. Célula hospedeira da reivindicação 13, em que a célula hospedeira é uma célula bacteriana, de mamífero, de levedura, vegetal ou de insectos.
15. Processo para a produção de um anticorpo que se liga à IL-22, o qual consiste em criar em cultura a célula hospedeira da reivindicação 14 em condições que permitam a 6 expressão do anticorpo, isolando-se depois o anticorpo a partir da cultura de células.
16. Estojo de diagnóstico que compreende o anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9. Lisboa, 09.02.2012
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