ES2354693T3

ES2354693T3 - Anticuerpos contra interleucina-22 y usos para ellos.

Info

Publication number: ES2354693T3
Application number: ES04756337T
Authority: ES
Inventors: Jing Li; Xiang-Yang Tan; Kathleen N. Tomkinson; Debra D. Pittman; Geertruida M. Veldan; Lynette Fouser
Original assignee: Genetics Institute LLC
Current assignee: Genetics Institute LLC
Priority date: 2003-06-23
Filing date: 2004-06-22
Publication date: 2011-03-17
Anticipated expiration: 2024-06-22
Also published as: NO20060189L; DE602004030341D1; EP1644415B1; CR8211A; BRPI0411784A; WO2005000897A2; MXPA05013881A; JP2008044966A; ATE490275T1; CN1839157A; JP2007537132A; WO2005000897A3; CA2530386A1; ECSP066297A; EP1644415A2; KR20060022289A; ZA200600608B; IL172646A0; RU2006101702A; AU2004252169A1

Abstract

Un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se unen específicamente a interleucina-2 (IL-2) e inhiben competitivamente la unión de un segundo anticuerpo a dicha IL-2, siendo dicho segundo anticuerpo un anticuerpo monoclonal producido por un hibridoma elegido entre PTA-254 y PTA-255.

Description

CAMPO DE LA INVENCIÓN

Esta invención se refiere a anticuerpos y a fragmentos de unión a antígenos de los mismos que unen interleucina–22 (IL–22), en particular, IL–22 humana, y sus usos en regular actividades asociadas con IL–22. Los anticuerpos descritos en el presente documento son útiles en diagnosticar, evitar, y/o tratar trastornos asociados a IL–22, por 5 ejemplo, trastornos autoinmunes (por ejemplo, artritis).

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La interleucina–22 (IL–22) es una citocina de clase II que muestra homología de secuencia con IL–10. Su expresión está regulada por incremento en linfocitos T por IL–9 o por ConA (Dumoutier L. y col. (2000) Proc Natl Acad Sci EE.UU. 97 (18): 10144–9). Estudios adicionales han mostrado que la expresión de ARNm de IL–22 ARNm se induce 10 en vivo en respuesta a administración de LPS y que IL–22 modula parámetros indicadores de una respuesta de fase aguda (Dumoutier L. y col. (2000) supra; Pittman D. y col. (2001) Genes and 15 Immunity 2: 172). Tomadas conjuntamente, estas observaciones sugieren que IL–22 juega un papel en inflamación (Kotenko S.V. (2002) Cytokine & Growth Factor Reviews 13 (3): 223–40).

Se cree que IL–22 se une a un complejo receptor constituido por IL–22R e IL–10R2, dos miembros de la familia de 15 receptores de citocinas de tipo II (CRF2) (Xie M.H. y col. (2000) J Biol Chem 275(40): 31335–9; Kotenko S.V. y col. (2001) J Biol Chem 276 (4): 2725–32). Ambas cadenas del receptor de IL–22 se expresan constitutivamente en un número de órganos. Las líneas celulares epiteliales derivadas de estos órganos son responsables de IL–22 in vitro (Kotenko S.V. (2002) Cytokine & Growth Factor Reviews 13 (3): 223–40). IL–22 induce activación de las rutas de JAK/STAT3 y de ERK, así como intermedios de otras rutas de MAPK (Dumoutier L., y col. (2000) supra; Pittman D. y 20 col. (2000) supra; Pittman D. y col. (2000) J Biol Chem 164(4): 1814–9; Kotenko S.V. y col. (2001) J Biol Chem 276 (4): 2725–32; Kotenko S.V. y col. (2002) J Biol Chem 277(37): 33676–82).

Los miembros de CRF2 son receptores para IFNα/β, IFNγ, factor de coagulación VIla, IL–10 y las proteínas relacionadas con IL–10 IL–19, IL–20, IL–22, IL–24, así como las citocinas similares a IFN identificadas recientemente, IL–28 e IL–29 (Kotenko S.V. (2002) Cytokine & Growth Factor Reviews 13 (3): 223–40; Kotenko, S.V. y col. (2000) 25 Oncogence 19 (21): 2557–65; Sheppard, P. y col. (2003) J Biol Chem 4 (1): 63–8; Kotenko S.V. y col. (2003) Nature Immunology 4 (1): 69–77). Además de estos receptores de membrana, la familia CRF2 incluye también una proteína soluble, proteína de unión a IL–22 (IL–22BP), que es específica para IL–22 y bloquea su actividad (Dumoutier, L. y col. (2001) J Biol Chem 166 (12): 7090–5; Kotenko S.V. y col. (2001) J Biol Chem 166 (12): 7096–103; Kotenko S.V. y col. (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98 (17): 9511–6; Gruenberg, B.H. y col. (2001) Genes & Immunity 2 (6):329–34; 30 Wei C–C y col. (2003) Genes & Immunity 4: 204–211). Aunque el complejo receptor de IL–22 es único para IL–22, sin embargo, cada cadena (es decir, IL–22R y IL–10R2) está compartida por otros miembros de CRF2 definiendo receptores funcionales para IL–20, IL–24 (IL–22R/IL–20R2), IL28, IL29 (IFN–λR1/IL–10R2) y IL–10 (IL–10R1/IL–10R2) (Dumoutier, L. y col. (2001) J. Immunol. 167 (7): 3545–9; Wang, M. y col. (2002) J Biol Chem 277 (9): 7341–7; Parrish–Novak, J. y col. (2002) J Biol Chem 277 (49): 47517–23; Kotenko S.V. y col. (1997) EMBO J. 16 (19): 5894–35 903; Spencer, S.D. y col. (1998) J Exp Med 187 (4): 571–8).

Ambas cadenas del receptor compuesto de CRF2 son necesarias para transducción de señales. Una cadena del receptor compuesto se ha definido históricamente como una cadena de unión a ligando (por ejemplo, IFNγR1) en base a su alta afinidad por la citocina. La otra cadena (por ejemplo, IFNγR2) se ha caracterizado como una cadena ayudante o accesoria y muestra afinidad mínima por la citocina sola (Kotenko, S.V. y col. (2000) Oncogene 19 (21): 40 2557–65). Resultados más recientes sugieren que ambas cadenas receptoras pueden contribuir a la afinidad de unión, al menos por IL–10 e IL–22 (Xie M.H. y col. (2000) J Biol Chem 275 (40): 31335–9; Kotenko S.V. y col. (2001) J Biol Chem 276 (4): 2725–32; Kotenko S.V. y col. (2002) J Interferon Cytokine Res 22 (11): 1099–112).

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente solicitud proporciona, al menos en parte, agentes de unión a IL22 tales como anticuerpos y fragmentos 45 de unión a antígenos de los mismos que se unen a interleucina–22 ("IL–22"), en particular, IL–22 humana, con alta afinidad y especificidad. Los anticuerpos y fragmentos de unión a antígenos de los mismos de la presente invención se refieren también en el presente documento como "anticuerpos anti–IL22" y "fragmentos de los mismos," respectivamente. En una realización, el anticuerpo anti–IL22 o fragmento del mismo es un antagonista de IL–22, y así reduce, neutraliza, y/o antagoniza al menos una actividad asociada a IL–22. Por ejemplo, el anticuerpo anti–IL22 o 50 fragmento del mismo puede unirse a IL–22, por ejemplo, a un epítopo de IL–22 e interferir con una interacción, por ejemplo, unión, entre IL–22 y un complejo receptor de IL–22, por ejemplo, un complejo que comprende receptor de IL–22 ("IL–22R") y receptor 2 de interleucina–10 ("IL–10R2"), o una subunidad del mismo (por ejemplo, IL–22R o IL–10R2, individualmente). Así, los anticuerpos y fragmentos de los mismos de la invención se pueden usar para

interferir con (por ejemplo, inhibir, bloquear, o reducir de otra manera) una interacción, por ejemplo, unión, entre IL–22 y un complejo receptor de IL–22, o una subunidad del mismo.

Además, los solicitantes han mostrado que la administración de IL–22 en vivo induce parámetros de una respuesta de fase aguda y que una reducción de actividad de IL–22 usando un anticuerpo anti–IL–22 neutralizante mejora síntomas inflamatorios en un modelo de artritis inducida por colágeno (CIA) de ratón. La expresión de ARNm de IL–5 22 está regulada por incremento en áreas inflamadas. Así, los antagonistas de IL–22, por ejemplo, anticuerpos anti–IL–22 neutralizantes y fragmentos de los mismos, se pueden usar para inducir inmunosupresión en vivo. De acuerdo con ello, los anticuerpos anti–IL22 o fragmentos de los mismos de la invención son útiles en diagnosticar, tratar y/o evitar trastornos asociados a IL–22, por ejemplo, trastornos autoinmunes (por ejemplo, esclerosis múltiple, trastornos artríticos tales como artritis reumatoide); trastornos respiratorios (por ejemplo, asma, enfermedad pulmonar 10 obstructiva crónica (COPD)); afecciones inflamatorias de, por ejemplo, la piel (por ejemplo, soriasis), el sistema cardiovascular (por ejemplo, aterosclerosis), el sistema nervioso (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer), los riñones (por ejemplo., nefritis), el hígado (por ejemplo, hepatitis) y el páncreas (por ejemplo, pancreatitis).

De acuerdo con ello, en un aspecto, la invención presenta un anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígenos del mismo, que interacciona con, por ejemplo, se une a, IL–22, en particular, a IL–22 de mamíferos, por 15 ejemplo, a IL–22 humana o murina. En una realización, al anticuerpo o fragmento del mismo es un anticuerpo neutralizante, por ejemplo, reduce o inhibe una o más actividades asociadas a IL–22, por ejemplo, secreción de quimiocinas (por ejemplo, secreción de GRO1); una respuesta de fase aguda, fosforilación de una quinasa, por ejemplo, proteína STAT (por ejemplo, proteína STAT–3), proliferación celular (por ejemplo, proliferación y/o fosforilación de HEPG2), entre otras. Los anticuerpos anti–IL–22 o fragmentos de los mismos se pueden unir a IL–22 20 con alta afinidad, por ejemplo, con una constante de afinidad (Kd) de menos de 10E–7 M, preferentemente 10E–8, 10E–9, 10E–10, más preferentemente, 10E–11 o afinidad más alta. En otras realizaciones, los anticuerpos anti–IL–22 o fragmentos de los mismos pueden neutralizar una o más actividades asociadas a IL–22 con una DE50 de al menos aproximadamente 60 nM, típicamente aproximadamente 5 nM a 200 pM o más fuerte. En otras realizaciones, los anticuerpos anti–IL22 o fragmentos de los mismos se asocian con IL22 con cinéticas en el intervalo de 10E–3ª 10E–7 25 1/Ms, típicamente 10E–4 a 10E–6 1/Ms. En aún otra realización, los anticuerpos anti–IL22 o fragmentos de los mismos tienen cinéticas de disociación en el intervalo de 10E–2 a 10E–6 1/s, típicamente 10E–3 a 10E–6 1/s. En una realización, los anticuerpos anti–IL22 o fragmentos de los mismos se unen a IL–22, por ejemplo, IL–22 humana, con una afinidad y/o cinética similar al anticuerpo monoclonal AC–04 producido por una línea celular de hibridoma que tiene un número de acceso de ATCC PTA–5255; o AC–02 producido por una línea celular de hibridoma que tiene número de 30 acceso de ATCC PTA–5254. La afinidad del anticuerpo anti–IL–22 o fragmento del mismo se puede probar usando, por ejemplo, actividad de biosensor (Biacore) (véanse Ejemplos 5 y 22 más adelante). Las actividades inhibidoras de los anticuerpos anti–IL22 (DE50) se pueden probar usando, por ejemplo, un ensayo de fosforilación STAT de células HEPG2 o ensayo de proliferación BaF3 según se describe en el presente documento (véanse por ejemplo, Ejemplos 20–21). 35

En una realización, el anticuerpo anti–IL22 o fragmento del mismo (por ejemplo, un Fab, F(ab')2, Fv o un fragmento de Fv de cadena simple) es un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo de especificidad individual. El anticuerpo o fragmento del mismo puede ser también un anticuerpo humano, humanizado, quimérico, injertado con CDR, o generado in vitro. En aún otras realizaciones, el anticuerpo tiene una región constante de cadena pesada elegida de, por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD e IgE; más particularmente, elegida de, por ejemplo, IgG1, 40 IgG2, IgG3 e IgG4. En otra realización, el anticuerpo es una cadena ligera elegida a partir de, por ejemplo, kappa o lambda.

En otra realización, el anticuerpo anti–IL22 o fragmento del mismo, se une específicamente a IL–22, en particular, IL–22 de mamíferos, específicamente IL–22 humana (por ejemplo, IL–22 humana que tiene una secuencia de aminoácidos de SEC ID N.º: 2, o secuencia humana de IL–22 madura de aproximadamente 34–179 aminoácidos de 45 SEC ID N.º: 2, o una secuencia que es al menos el 85%, 90%, 95%, 99% o más idéntica a la misma). En otra realización, el anticuerpo anti–IL22 o fragmento del mismo, se une específicamente a un fragmento de IL–22, por ejemplo, un fragmento de al menos 10, 20, 50, 75, 100, 150, o 170 aminoácidos contiguos a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID N.º: 2, o una secuencia que es al menos 85%, 90%, 95%, 99% o más idéntica a la misma. En una realización, el anticuerpo anti–IL22 o fragmento del mismo se une específicamente a IL–22 humana y 50 no sufre reacción cruzada sustancialmente con IL–22 de especies no humanas, por ejemplo, IL–22 murina (por ejemplo, de ratón o de rata). En otras realizaciones, el anticuerpo anti–IL22 o fragmento del mismo une a dos o más formas de IL–22 de mamíferos, por ejemplo, IL–22 humana, de primate no humano (por ejemplo, mono) y murina (por ejemplo, de ratón o de rata).

En otra realización, el anticuerpo anti–IL22 o fragmento del mismo, se une específicamente a un epítopo, por 55 ejemplo, un epítopo lineal o conformacional, de IL–22, por ejemplo, en particular, de mamíferos, por ejemplo, IL–22 humana o murina. En otra realización, el anticuerpo anti–IL22 o fragmento del mismo, se une a un complejo elegido entre, por ejemplo, IL–22 e IL–22R ("IL–22/IL–22R"), IL–22 e IL–10R2 ("IL–22/IL–10R2") e IL–22, IL–22R e IL–10R2 ("IL–

22/IL–22R/IL–10R2"). En una realización, el anticuerpo anti–IL22 o fragmento del mismo se une a un complejo de IL–22 y un IL–22R, formando de este modo un complejo del anticuerpo anti–IL22 o fragmento del mismo, IL–22 e IL–22R. La unión del anticuerpo anti–IL22 o fragmento del mismo puede incrementar la estabilidad del complejo y así interferir con una interacción del complejo con IL–10R2.

En otras realizaciones, el anticuerpo o fragmento del mismo, se une a IL–22 e interfiere con (por ejemplo, inhibe, 5 bloquea o reduce de otra manera) una interacción, por ejemplo, unión entre IL–22 y un complejo receptor de IL–22, por ejemplo, un complejo que comprende IL–22R e IL–10R2. En otras realizaciones, el anticuerpo o fragmento del mismo, se une a IL–22 e interfiere con (por ejemplo, inhibe, bloquea o reduce de otra manera) una interacción, por ejemplo, unión entre IL–22 y una subunidad de un complejo receptor de IL–22, por ejemplo, IL–22R o IL–10R2, individualmente. En otra realización, el anticuerpo anti–IL22 o fragmento del mismo, se une a IL–22 e interfiere con 10 (por ejemplo, inhibe, bloquea o reduce de otra manera) una interacción, por ejemplo, unión, entre un complejo de IL–22 y IL–22R ("IL–22/IL–10R2") e IL–22R. En otra realización, el anticuerpo anti–IL22 o fragmento del mismo, se une a IL–22 e interfiere con (por ejemplo, inhibe, bloquea o reduce de otra manera) una interacción, por ejemplo, unión, entre un complejo de IL–22 y IL–10R2 ("IL–22/IL–10R2") e IL–22R2.

En otra realización, el anticuerpo anti–IL22 o fragmento del mismo compite con una proteína de unión a IL–22 (IL–15 22BP), por ejemplo, una IL–22BP de mamíferos (por ejemplo, una IL–22BP humana o murina) para unión a IL–22, por ejemplo, una IL–22 de mamíferos (por ejemplo, una IL–22 humana o murina).

Un ejemplo no limitante de un anticuerpo anti–IL22 que interfiere con unión de IL–22 a IL–22R es "Ac–04." Ac–04 (también referido en el presente documento como anticuerpo monoclonal de rata "P3/2") se une a IL–22 humana y neutraliza al menos una actividad de IL–22 (véanse Ejemplos 5, 16, 17, 20 y 21). Una línea celular de hibridoma que 20 produce Ac–04 se registró en la ATCC el 5 de junio de 2003 y se le ha asignado el número de acceso de ATCC PTA–5255. Otro ejemplo no limitante de un anticuerpo anti–IL22, que interfiere con unión de IL–22 a IL–10R2 es "Ac–02." Ac–02 (también referido en el presente documento como anticuerpo monoclonal de rata "P3/3") se une a IL–22 humana y neutraliza al menos una actividad de IL–22 (véanse Ejemplos 5, 16, 17, 10, 20 y 21). Una línea celular de hibridoma que produce Ac–02 se registró en la ATCC el 5 de junio de 2003 y se le ha asignado el número de acceso 25 de ATCC PTA–5254.

En una realización, el anticuerpo o fragmento del mismo se une específicamente a IL–22, por ejemplo, IL–22 murina o humana e inhibe competitivamente la unión de un segundo anticuerpo a IL–22, por ejemplo, a un epítopo objetivo en IL–22 (por ejemplo, IL–22 murina o humana). El segundo anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal producido por un hibridoma elegido entre, por ejemplo, PTA–5254 y PTA–5255. En otra realización, el anticuerpo o 30 fragmento del mismo comprende al menos una región de unión a antígeno, por ejemplo, una región variable, de un anticuerpo monoclonal producido por un hibridoma elegido entre, por ejemplo, PTA–5254 y PTA–5255. En aún otra realización, el anticuerpo o fragmento del mismo comprende al menos una, dos, tres o cuatro regiones variables de un anticuerpo monoclonal producido de por un hibridoma elegido entre, por ejemplo, PTA–5254 y PTA–5255. En otra realización, el anticuerpo o fragmento del mismo comprende al menos una o dos regiones variables de cadena 35 pesada de un anticuerpo monoclonal producido de un hibridoma elegido entre, por ejemplo, PTA–5254 y PTA–5255. En otra realización, el anticuerpo o fragmento del mismo comprende al menos una o dos regiones variables de cadena ligera de un anticuerpo monoclonal producido de un hibridoma elegido entre, por ejemplo, PTA–5254 y PTA–5255. En aún otra realización, el anticuerpo o fragmentos de mismo comprenden al menos una, dos o tres regiones determinantes de complementariedad (CDR) de una región variable de cadena pesada de un anticuerpo monoclonal 40 elegido entre, por ejemplo, PTA–5254 y PTA–5255. En aún otra realización, el anticuerpo o fragmento del mismo comprende al menos una, dos o tres CDR de una región variable de cadena ligera de un anticuerpo monoclonal producido por un hibridoma elegido entre, por ejemplo, PTA–5254 y PTA–5255. En aún otra realización, el anticuerpo o fragmento del mismo comprende al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis CDR de regiones variables de cadena pesada y de cadena ligera de un anticuerpo monoclonal producido por un hibridoma elegido entre, por 45 ejemplo, PTA–5254 y PTA–5255. En otra realización, el anticuerpo monoclonal está producido por otro ribosoma elegido, por ejemplo, entre PTA–5254 y PTA–5255.

El anticuerpo anti–IL22 o fragmento del mismo descrito en el presente documento se puede derivar o unir a otra molécula funcional, por ejemplo, otro péptido o proteína (por ejemplo, un fragmento Fab’). Por ejemplo, la proteína de fusión o un anticuerpo, o parte de unión a antígeno, puede estar unida funcionalmente (por ejemplo, por 50 acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otro modo) a una o más entidades moleculares, tales como un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico o un anticuerpo multiespecífico), toxinas, radioisótopos, agentes citotóxicos o citostáticos, entre otros.

En aún otra realización, el agente de unión a IL–22, por ejemplo, el antagonista de IL22, (por ejemplo, el anticuerpo anti–IL22 o fragmento del mismo descrito en el presente documento), o una composición farmacéutica del mismo, se 55 administra solo o en terapia de combinación, es decir, combinado con otros agentes, por ejemplo, agentes terapéuticos, que son útiles para tratar trastornos asociados con IL–22. Ejemplos de trastornos asociados con IL–22

incluyen, pero no se limitan a, un trastorno elegido entre uno o más de: trastornos autoinmunes, por ejemplo, artritis (incluyendo artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, osteoartritis, artritis soriática, artritis asociada a lupus o espondilitis anquilosante), escleroderma, lupus eritrematoso sistémico, vasculitis, esclerosis múltiple, tiroiditis autoimmune, dermatitis (incluyendo dermatitis atópica y dermatitis eczematosa), miastenia gravis, enfermedad inflamatoria del intestino (IBD), enfermedad de Crohn, diabetes mellitus (tipo I); afecciones inflamatorias de, por 5 ejemplo, la piel (por ejemplo, soriasis), sistema cardiovascular (por ejemplo, aterosclerosis), sistema nervioso (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer), hígado (por ejemplo, hepatitis), riñón (por ejemplo, nefritis) y páncreas (por ejemplo, pancreatitis); trastornos cardiovasculares, por ejemplo, trastornos metabólicos del colesterol, daños de radicales libres de oxígeno, isquemia; trastornos asociados con curación de heridas; enfermedades respiratorias, por ejemplo, asma y COPD (por ejemplo, fibrosis quística); septicemia; rechace de transplantes y alergia. En una 10 realización, el trastorno asociado a IL–22 es, un trastorno artítico, por ejemplo, un trastorno elegido entre uno o más de artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, osteoartritis, artritis soriática, o espondilitis anquilosante; un trastorno respiratorio (por ejemplo, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD); o una afección inflamatoria de, por ejemplo, la piel (por ejemplo, soriasis), el sistema cardiovascular (por ejemplo, aterosclerosis), el sistema nervioso (por ejemplo, enfermedad de AIzheimer), el páncreas (por ejemplo, pancreatitis) y los órganos 15 gastrointestinales, por ejemplo, colitis, enfermedad de Crohn e IBD.

La terapia de combinación puede incluir uno o más agentes de unión a IL22,por ejemplo, antagonistas de IL–22, (por ejemplo, anticuerpos anti–IL22 o fragmentos de los mismos), co–formulados con, y/o coadministrados con, uno o más agentes terapéuticos adicionales, por ejemplo, una o más citocinas e inhibidores de factor de crecimiento, inmunosupresores, agentes antiinflamatorios (por ejemplo, agentes antiinflamatorios sistémicos), inhibidores 20 metabólicos, inhibidores enzimáticos y/o agentes citotóxicos o citostáticos, como se describe en más detalle en el presente documento.

Ejemplos de agentes terapéuticos adicionales preferidos que pueden coadministrarse y/o coformularse con uno o más agentes de unión a IL22, (por ejemplo, anticuerpos anti–IL22 o fragmentos de los mismos), incluyen, pero no se limitan a, uno o más de: antagonistas de TNF (por ejemplo, anticuerpos quiméricos, humanizados, humanos o 25 generados in vitro, o fragmentos de unión a antígenos de los mismos, que se unen a TNF; fragmentos solubles de un receptor de TNF, por ejemplo, receptor de TNF humano p55 o p75 o derivados de los mismos, por ejemplo 75kdTNFR–IgG (proteína de fusión de receptor de TNF de 75 kD–IgG, Enbrel™), proteína de fusión de receptor de TNF de 55 kD–IgG; antagonistas enzimáticos de TNF, por ejemplo, inhibidores de enzima conversora de TNFα (TACE)); antagonistas de IL–12, IL–15, IL–17, IL–18, IL–21/IL–21R; agentes reductores de linfocitos T y de linfocitos B 30 (por ejemplo, anticuerpos anti–CD4 o anti–CD22); inhibidores de moléculas pequeñas, por ejemplo, metotrexato y leflunomida; sirolimus (rapamicina) y análogos de los mismos, por ejemplo, CCI–779; inhibidores de Cox–2 y cPLA2; NSAID; inhibidores de p38, TPL–2, Mk–2 y NFkb; RAGE o RAGE soluble; inhibidores de P–selectina o PSGL–1 (por ejemplo, inhibidores de molécula pequeña, anticuerpos para éstos, por ejemplo, anticuerpos para P–selectina), agonistas de receptor beta de estrógenos (ERB) o antagonistas de ERB–NFkb. Ejemplos de agentes terapéuticos 35 adicionales preferidos que se pueden coadministrar y/o coformular con uno o más anticuerpos anti–IL–22 o fragmentos de los mismos incluyen uno o más de: un fragmento soluble de un receptor de TNF, por ejemplo, receptor de TNF p55 o p75 o derivados de los mismos, por ejemplo, 75 kdTNFR–IgG (proteína de fusión de receptor de TNF de 75 kD–IgG, Enbrel™); metotrexato, Ieflunomida, o un sirolimus (rapamicina) o un análogo del mismo, por ejemplo, CCI–779. 40

Sin comprometerse con ninguna teoría, los solicitantes creen que IL–22 ejerce sus efectos inflamatorios localmente, por ejemplo, actuando como un amplificador o regulador de inflamación tisular como opuesto a la inflamación sistémica. De acuerdo con ello, la inhibición de la actividad de IL–22, usando, por ejemplo, un anticuerpo anti–IL22 o un fragmento del mismo descrito en el presente documento, puede proporcionar una actividad antiinflamatoria más efectiva, específica de tejido, que las modalidades antiinflamatorias sistémicas. Además, la inhibición de la actividad 45 local de IL–22 usando, por ejemplo, un anticuerpo anti–IL22 o fragmento del mismo descrito en el presente documento, puede proporcionar un candidato útil para combinación con modalidades antiinflamatorias sistémicas.

En otro aspecto, la invención proporciona composiciones, por ejemplo, composiciones farmacéuticas, que incluyen un vehículo farmacéuticamente aceptable y al menos un agente de unión a IL–22, por ejemplo, un antagonista de IL22, (por ejemplo, anticuerpo anti IL–22 o fragmento del mismo descrito en el presente documento). En una 50 realización, las composiciones, por ejemplo, las composiciones farmacéuticas, comprenden una combinación de dos o más de los agentes de unión a IL–22 citados anteriormente, por ejemplo anticuerpos anti–IL22 o fragmentos de los mismos. Las combinaciones de los antagonistas de IL–22, por ejemplo, el anticuerpo anti–IL22 o fragmento del mismo, y un fármaco, por ejemplo, un agente terapéutico (por ejemplo, uno o más inhibidores de citocinas e inhibidores de factores de crecimiento, inmunosupresores, agentes antiinflamatorios (por ejemplo agentes 55 antiinflamatorios sistémicos), inhibidores metabólicos, inhibidores enzimáticos y/o agentes citotóxicos o citostáticos, como se describen en más detalle en el presente documento) están también dentro del alcance de la invención.

El epítopo de IL–22, por ejemplo IL–22 humana, reconocido por Ac–02 o Ac–04 está también dentro del alcance de la

presente invención.

En otro aspecto, la invención presenta un procedimiento para disminuir, inhibir o reducir una respuesta de fase aguda en un sujeto. El procedimiento incluye administrar al sujeto un agente de unión a IL22, por ejemplo, un antagonista de IL–22 (por ejemplo, un anticuerpo anti–IL–22 o fragmento del mismo como se describe en el presente documento), en una cantidad suficiente para disminuir, inhibir o reducir la respuesta de fase aguda en el sujeto. En 5 una realización, el sujeto es un mamífero, por ejemplo, un ser humano que sufre de un trastorno asociado a IL–22, incluyendo, por ejemplo, trastornos respiratorios, trastornos inflamatorios y trastornos autoinmunes. En una realización, el agente de unión a IL–22 se administra localmente, por ejemplo, tópicamente, subcutáneamente, u otras administraciones que no están en la circulación general.

En otro aspecto, la invención presenta un procedimiento para modular, por ejemplo, interferir con (por ejemplo, 10 inhibiendo, bloqueando, o reduciendo de otra manera), una interacción, por ejemplo, unión, entre IL–22 y un complejo receptor de IL–22, o una subunidad del mismo, por ejemplo, IL–22R o IL–10R2, individualmente. El procedimiento comprende, opcionalmente, proporcionar IL–22 y un complejo receptor de IL–22 o una subunidad del mismo (por ejemplo, un complejo receptor de IL–22 soluble o una subunidad del mismo, o un complejo receptor de IL–22 asociado a membrana o subunidad del mismo, por ejemplo, una célula que expresa un complejo receptor de 15 IL–22 o una subunidad del mismo); poner en contacto IL–22 con el complejo receptor de IL–22 o subunidad del mismo, en condiciones que permitan que tenga lugar una interacción entre IL–22 y el complejo receptor de IL–22 o subunidad del mismo receptor para de este modo formar una mezcla de IL–22/receptor de IL–22; y poner en contacto la mezcla IL–22/receptor de IL–22 con al menos un agente de unión a IL–22, por ejemplo, al menos un anticuerpo anti–IL–22 o fragmento del mismo como se describe en el presente documento, modulando de este modo, por 20 ejemplo, interfiriendo con (por ejemplo, inhibiendo, bloqueando o reduciendo de otro modo), la interacción.

El procedimiento en cuestión se puede usar en células in vitro (por ejemplo, en un sistema libre de células), en cultivo, por ejemplo in vitro o ex vivo. Por ejemplo, las células que expresan IL–22 se pueden cultivar in vitro en medio de cultivo y la etapa de puesta en contacto puede efectuarse añadiendo uno o más anticuerpos anti–IL–22 o fragmentos de los mismos, por ejemplo anticuerpos anti–IL–22 o fragmentos de los mismos como se describen en el 25 presente documento, al medio de cultivo. Alternativamente, el procedimiento se puede llevar a cabo en células presentes en un sujeto, por ejemplo, como parte de un protocolo en vivo (por ejemplo, terapéutico o profiláctico).

En otro aspecto, la invención presenta un procedimiento para tratar (por ejemplo, curar, suprimir, mejorar, retardar o evitar la aparición de, o evitar la recurrencia o recaída de) o evitar un trastorno asociado con IL22, en un sujeto. El procedimiento incluye: administrar al sujeto un agente de unión a IL22, por ejemplo, un antagonista de IL–22, (por 30 ejemplo un anticuerpo anti–IL22 o fragmento del mismo como se describe en el presente documento), en una cantidad suficiente para tratar o evitar el trastorno asociado a IL22. En una realización, el agente de unión a IL–22 se administra localmente, por ejemplo, tópicamente, subcutáneamente, u otras administraciones que no están en la circulación general.

El agente de unión a IL–22, por ejemplo, antagonista de IL–22, (por ejemplo, al anticuerpo anti–IL22 o fragmento del 35 mismo), se puede administrar al sujeto, sólo o en combinación, con otras modalidades terapéuticas como se describen en el presente documento. En una realización, el sujeto es un mamífero, por ejemplo, un ser humano que sufre de un trastorno asociado a IL–22, incluyendo, por ejemplo, trastornos respiratorios, trastornos inflamatorios y trastornos autoinmunes.

Ejemplos de trastornos asociados con IL–22 incluyen, pero no se limitan a, un trastorno elegido entre uno o más de: 40 trastornos autoinmunes, por ejemplo, artritis (incluyendo artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, osteoartritis, artritis soriática, artritis asociada a lupus o espondilitis anquilosante), escleroderma, lupus eritrematoso sistémico, vasculitis, esclerosis múltiple, tiroiditis autoimmune, dermatitis (incluyendo dermatitis atópica y dermatitis eczematosa), miastenia gravis, enfermedad inflamatoria del intestino (IBD), enfermedad de Crohn, diabetes mellitus (tipo I); trastornos cardiovasculares, por ejemplo, trastornos metabólicos de colesterol, daño por radicales libres de 45 oxígeno, isquemia, aterosclerosis; trastornos asociados con curación de heridas; trastornos respiratorios, por ejemplo, asma y COPD (por ejemplo, fibrosis quística); trastornos inflamatorios de la piel, por ejemplo, soriasis, del hígado (por ejemplo, hepatitis), del riñón (por ejemplo, nefritis) y del páncreas (por ejemplo, pancreatitis); septicemia; cánceres (por ejemplo, tumores sólidos o tumores de tejidos blandos); rechace de transplantes y alergia. En una realización, el trastorno asociado a IL–22 es un trastorno artrítico, es decir, un trastorno elegido entre uno o más de 50 artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, osteoartritis, artritis soriática, artritis asociada a lupus o espondilitis anquilosante (preferentemente, artritis reumatoide); un trastorno respiratorio (por ejemplo, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD)); y una afección inflamatoria de, por ejemplo, piel (por ejemplo, soriasis), hígado (por ejemplo, hepatitis), riñón (por ejemplo, nefritis) y páncreas (por ejemplo, pancreatitis).

En otras realizaciones, la invención proporciona un procedimiento para tratar (por ejemplo, reducir, mejorar) o evitar 55 uno o más síntomas asociados con artritis (por ejemplo, artritis reumatoide) en un sujeto. El procedimiento

comprende administrar al sujeto un agente de unión a IL–22, por ejemplo, un antagonista de IL22, (por ejemplo, un anticuerpo de IL–22 o un fragmento del mismo), en una cantidad suficiente para tratar (por ejemplo, reducir, mejorar) o evitar uno o más síntomas artríticos. El anticuerpo de IL–22 se puede administrar terapéuticamente o profilácticamente, o de ambas formas. El agente de unión a IL–22, por ejemplo, antagonista de IL–22, por ejemplo, el anticuerpo anti–IL22 o fragmento del mismo, se puede administrar al sujeto, sólo o en combinación, con otras 5 modalidades terapéuticas como se describen en el presente documento. Preferentemente, el sujeto es un mamífero, por ejemplo, un ser humano que sufre de un trastorno asociado a IL–22 como se describe en el presente documento.

En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para detectar la presencia de IL–22 en una muestra in vitro (por ejemplo, una muestra biológica, tal como suero, plasma, tejido, biopsia). El procedimiento en cuestión se puede usar para diagnosticar un trastorno, por ejemplo, un trastorno asociado a células inmunes. El procedimiento 10 incluye: (i) poner en contacto la muestra o una muestra control con el anticuerpo anti–IL22 o fragmento del mismo como se describe en el presente documento; y (ii) detectar formación de un complejo entre el anticuerpo anti–IL22 o fragmento del mismo y una muestra o la muestra de control, en el que un cambio estadísticamente significativo en la formación del complejo en la muestra relativa a la muestra control es indicador de la presencia de la IL–22 en la muestra. 15

En aún otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para detectar la presencia de IL–22 en vivo (por ejemplo, formación de imágenes en vivo en un sujeto). El procedimiento en cuestión se puede usar para diagnosticar un trastorno, por ejemplo, un trastorno asociado a IL–22. El procedimiento incluye: (i) administrar el anticuerpo anti–IL22 o fragmento del mismo como se describe en el presente documento a un sujeto o a un sujeto control en condiciones que permitan unión del anticuerpo o fragmento a IL–22; y (ii) detectar formación de un complejo entre el 20 anticuerpo o fragmento e IL–22, en el que un cambio estadísticamente significativo en la formación del complejo en el sujeto relativo al sujeto control es indicador de la presencia de IL–22.

Preferentemente, el anticuerpo o fragmento del mismo está directa o indirectamente marcado con una sustancia detectable para facilitar detección del anticuerpo unido o no unido. Las sustancias detectables adecuadas incluyen diversas enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes y materiales radiactivos. 25

Se han desarrollado procedimientos para administrar o dirigir un agente, por ejemplo, un agente terapéutico o citotóxico, a una célula que expresa IL–22 en vivo.

Los kits que comprenden los agentes de unión, por ejemplo, los antagonistas de agentes de unión a IL22, por ejemplo, antagonistas de IL22, (por ejemplo, los anticuerpos anti–IL22 o fragmento de los mismos), de la invención para usos terapéuticos y diagnósticos están también dentro del alcance de la invención. 30

A menos que se los defina de otro modo, todos los términos científicos y técnicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que le dan aquellos expertos en la técnica a los que concierne esta invención. Aunque se pueden usar materiales y procedimientos similares o equivalentes a aquellos descritos en el presente documento en la práctica o realización de pruebas de la invención, se describen más adelante materiales y procedimientos adecuados. En caso de conflicto, la presente memoria, incluyendo definiciones, dominará. Además, los materiales, 35 procedimientos y ejemplos son solo ilustrativos y no se desea que sean limitantes.

Otras características y ventajas de la invención serán patentes a partir de la siguiente descripción detallada y de las siguientes reivindicaciones.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1 es un dibujo esquemático que muestra un protocolo experimental usado para analizar el efecto de un 40 anticuerpo de IL–22 en un modelo de artritis murino en vivo.

Figura 2 es una gráfica que muestra la valoración corporal tras tratamiento de ratones artríticos con anticuerpo de IL–22 o control usando un régimen de tratamiento terapéutico.

Figura 3 es una gráfica que muestra la valoración corporal tras tratamiento de ratones artríticos con anticuerpo de IL–22 o control usando un régimen de tratamiento profiláctico. 45

Figura 4 es una gráfica que muestra la valoración corporal tras tratamiento de ratones gravemente artríticos con anticuerpo de IL–22 o control.

Figura 5 es una gráfica que muestra porcentajes relativos de zarpas que muestran un grado de histología dado siguiente con anticuerpo IL–22 o control.

Figuras 6A–6B son representaciones lineales de una interacción entre IL–22 e IL–22R e IL–10R2. Figura 6A es una 50

gráfica lineal que muestra que bio–IL–22 se une al IL–22R–Fc inmovilizado, y se une no detectablemente a IL–10R2–Fc. Los resultados del experimento de unión inversa están gráficamente representados en la Figura 6B. IL–22R–Fc soluble, y no IL–10R2–Fc, se unen a bio–IL–22 inmovilizada. Estos resultados indican que hay una interacción relativamente fuerte entre IL–22 e IL–22R, mientras que IL–10R2–Fc tiene sólo una ligera avidez por IL–22.

Figuras 7A–7B muestran la caracterización de fusión de receptor Fc en medios condicionados por CHO. Figura 7A 5 es un panel de transferencias de Western que representan medios condicionados de células CHO que expresan bien IL–22R–Fc, bien IL–10R2–Fc o bien ambos Fc de receptores se separan en geles de SDS–PAGE tanto en condiciones reducidas (+βME) como en condiciones no reducidas (–βME). Los geles de SDS–PAGE están unidos a una membrana, que se probó después con anticuerpos policlonales dirigidos bien contra Fc de IgG humano, bien contra IL–22R humano o bien contra IL–10R2 humano. En condiciones reductoras (+βME, Figura 7A), IL–22R y líneas 10 de CHO IL10R2–Fc humanas segregan una proteína de fusión Fc humana con pesos moleculares de especie de ~60 kD es IL–22R–Fc mientras que la especie de –85 kD es IL–10R2–Fc. Figura 7B es una gráfica lineal que representa los resultados de un ELISA que usa medios condicionados de células CHO que expresan bien IL–22R–Fc (■), IL–1OR2–Fc (O) o ambos (▲). Las placas de ELISA se revistieron con anticuerpo de IL–22R antihumano de conejo. Una mezcla 1:1 de los dos homodímeros se añadió también a un control (Δ). Los receptores unidos se detectaron usando 15 un anticuerpo de IL–10R2 anti–humano de cabra biotinilado, seguido por estreptavidina–HRP. Los resultados mostrados en las Figuras 7A–7B indican que las fusiones de receptores de Fc se segregan a partir de células CHO como homodímeros y heterodímeros. Las células CHO que coexpresan IL–22R/IL–10R2–Fc segregan mayoritariamente heterodímero y homodímero IL–10R2–Fc.

Figuras 8A–8B son representaciones lineales de una interacción de IL–22 tanto con IL–22R como con IL–10R2, bien 20 como heterodímeros de fusión de Fc o como homodímeros yuxtapuestos al azar. En la Figura 8A, se capturaron 50 ng/ml de Fc total a partir de medio condicionado por CHO que expresan bien IL–22R–Fc (■), bien IL–10R2–Fc (O) o bien ambos IL–22R–Fc e IL–10R2–Fc (▲) en pocillos recubiertos de IgG anti–humana. Bio–IL–22 se añadió después a los pocillos a diversas concentraciones. La IL–22 unida se detectó subsiguientemente usando estreptavidina–HRP. En la Figura 8B, se capturaron diversas concentraciones del Fc total siguiente en pocillos revestidos de IgG anti–25 humana de una mezcla 1:1 bien de medio condicionado de IL–22R–Fc y proteína Fc irrelevante (■), bien de medio condicionado de IL–22R–Fc y medio condicionado de IL–10R2–Fc (Δ) o bien de medio condicionado de IL–22R–Fc/IL–10R2–Fc a partir de células co–expresadas y proteínas de control de Fc (▲). Se añadió después Bio–IL–22 (30 ng/ml) a los pocillos. La IL–22 unida se detectó subsiguientemente usando estreptavidina–HRP. Los resultados mostrados en las Figuras 8A–8B indican que el dominio extracelular de IL–22R se requiere para la detección del papel de IL–30 10R2 en la unión de IL–22. La unión potenciada de IL–22 se detecta cuando ambos dominios extracelulares están presentes.

Figuras 9A–9B son representaciones lineales de una interacción entre IL–10R2 e IL–22/IL–22R. El efecto de añadir homodímeros de IL–10R2–Fc se evaluó bien antes, bien con o bien tras la adición de bio–IL–22. Figura 9A es una gráfica lineal que representa los resultados de un ELISA usando IL–22R–Fc a partir de medio condicionado 35 capturado sobre pocillos recubiertos de IgG anti–humano. Bio–IL–22 se detectó después y subsiguientemente usando estreptavidina–HRP (línea discontinua). Se añadieron también diversas concentraciones de IL–10R2–Fc y IL–22 biotinilado conjuntamente y después se detectó bio–IL–22 unido (♦). Se añadieron también primero diversas concentraciones de IL–10R2–Fc de medio condicionado, y después se añadió subsiguientemente bio–IL–22 a los pocillos y se detectó bio–IL–22 unido (◊). En la Figura 9B, se capturaron cincuenta ng/ml de IL–22R–Fc de medio 40 condicionado sobre 50 pocillos revestidos de IgG anti–humano. Se añadió después Bio–IL–22 a los pocillos. Bio–IL–22 unida se detectó entonces inmediatamente después, usando estreptavidina–HRP (línea sólida). Se detectó también bio–IL–22 unido después de 1 hora de incubación adicional bien con PBS–BSA al 1% (línea discontinua) o diversas concentraciones de IL–10R2–Fc (•). Los resultados mostrados en el presente documento indican que la unión a LL–10R2 requiere una interacción entre IL–22 e IL–22R antes de sus papeles en potenciar unión de IL–22. 45

Figuras 10A–10C representan la inhibición de actividad IL–22 con anticuerpos de IL–22 anti–humanos monoclonales de rata (Ac–02 o Ac–04). En la Figura 10A, el anticuerpo diluido en serie se pre–incubó con una concentración fijada de IL–22 en medios celulares. Estos medios, incluyendo IL–22 formando complejo con anticuerpo, se aplicaron después a las células HEPG2. Los lisados celulares se prepararon subsiguientemente, la proteína se separó por electroforesis en gel, se sometieron a inmunotransferencia y después se sondearon con un anticuerpo específico 50 para P–STAT3. Las células incubadas con IL–22 solo (+) o sin IL–22 (–) se incluyen como control positivo y negativo, respectivamente. Ambos de estos anticuerpos son capaces de bloquear la actividad de IL–22 en las células: con concentración creciente de anticuerpo, la detección de P–STAT3 decrece. En la Figura 10B, se capturaron cincuenta ng/ml de IL–22R–Fc de medio condicionado sobre pocillos revestidos de IgG anti–humano. IL–22 biotinilada (30 ng/ml) se pre–incubó sola (línea discontinua) o con diversas concentraciones de Ac–02 (•), Ac–04 (▲), anti–IL–10R2 55 (+) o anticuerpo control (–) durante 30 minutos y después se añadió a pocillos con el IL–22R–Fc inmovilizado. La IL–22 biotinilada unida se detectó subsiguientemente usando estreptavidina–HRP. (C) Cincuenta ng/ml de Fc total en medio condicionado de células CHO que expresan tanto IL–22R–Fc como IL–10R2–Fc se incubaron en pocillos

revestidos de IgG anti–humano. IL–22 biotinilada (5 ng/ml) se pre–incubó sola (línea rota) o con diversas concentraciones de Ac–02 (•), Ac–04 (▲), anti–IL–10R2 (+) o anticuerpo control (–) durante 30 minutos y después se añadió a pocillos con el IL–22R–Fc/IL–10R2–Fc inmovilizado. La IL–22 biotinilada unida se detectó subsiguientemente usando estreptavidina–HRP. Estos resultados muestran que tanto Ac–02 como Ac–04 neutralizan actividad de IL–22. Ac–04 bloquea una interacción entre IL–22 e IL–22R y Ac–02 bloquea una interacción entre IL–22 y IL–10R2. 5

Figuras 11A–11C representan la inhibición de actividad de IL–22 usando IL–22BP–Fc. En la Figura 11A, se capturaron cincuenta ng/ml de IL–22R–Fc de medio condicionado sobre pocillos revestidos de IgG anti–humano. Se preincubó IL–22 biotinilado (30 ng/ml) solo (línea discontinua) o con diversas concentraciones de IL–22BP–Fc ( ) durante 30 minutos y después se añadió a pocillos con el IL–22R–Fc inmovilizado. La IL–22 biotinilada unida se detectó subsiguientemente usando estreptavidina–HRP. Los antecedentes están representados por línea de puntos. En la 10 Figura 11B, cincuenta ng/ml de Fc total en medio condicionado de células CHO que expresan tanto IL–22R–Fc como IL–10R2–Fc se incubaron en pocillos revestidos de IgG anti–humana. Se preincubó IL–22 biotinilada (5 ng/ml) sola (línea discontinua) o con diversas concentraciones de IL–22BP–Fc () durante 30 minutos y después se añadió a pocillos con el IL–22R–Fc/IL–10R2–Fc inmovilizado. La IL–22 biotinilada unida se detectó subsiguientemente usando estreptavidina–HRP. En la Figura 11C, se incubaron cincuenta ng/ml de IL–22BP–Fc en medio condicionado en 15 pocillos revestidos de IgG anti–humana. IL–22 biotinilada (1 ng/ml) se pre–incubó sola (línea discontinua) o con diversas concentraciones de Ac–02 (•) o Ac–04 (▲) o con un anticuerpo de rata control (–) durante 30 minutos y después se añadió a pocillos con el IL–22BP–Fc inmovilizado. La IL–22 biotinilada unida se detectó subsiguientemente usando estreptavidina–HRP. Figuras 11A–11C muestran que IL–22BP inhibe actividad de IL–22 en un modo similar a Ac–04, mientras que Ac–02 es distinto. 20

Figura 12 es un diagrama esquemático que representa el ensamblado de un complejo receptor IL–22/IL–22R/IL–10R2. Los anticuerpos representados por Ac–04 se unen a un epítopo de IL–22, la unión de los cuales da como resultado bloqueo de una interacción entre IL–22 e IL22R. Se cree que Ac–04 bloquea una interacción entre IL–22 e IL–22R a un nivel similar como proteína de unión a IL–22 (IL–22BP). Los anticuerpos representados por Ac–02 se unen a un epítopo de IL–22, la unión de los cuales da como resultado bloqueo de una interacción entre IL–22 e 25 IL10R2. Se cree que Ac–02 reduce o bloquea la formación de un complejo entre IL–22/IL–22R e IL–10R2.

Figura 13 es una gráfica que representa la inhibición de actividad IL–22 con anticuerpos monoclonales de IL–22 anti–humanos de rata. Se preincubó una concentración fijada de IL–22 con diversas concentraciones bien de Ac–02 (•) o bien de Ac–04 (▲) o con un anticuerpo control (–) en medios celulares y después se añadieron a células HepG2 transfectadas de forma transitoria por vector pSTAT–TA–Luc. 30

Figure 14 es gráfica que representa la inhibición de actividades de IL–22 con anticuerpo monoclonal de IL–22 antihumano de rata y IL–40 22BP–Fc. Se preincubó una concentración fijada de IL–22 con diversas concentraciones bien de Ac–04 (▲) o bien de IL–22BP–Fc (□) en medios celulares y después se añadieron a células HepG2 transfectadas de forma transitoria por vector pSTAT–TA–Luc.

Figura 15 es una gráfica que representa la inhibición de actividades de IL–22 con anticuerpos monoclonales de IL–22 35 anti–humanos de rata. Se preincubó una concentración fijada de IL–22 con diversas concentraciones bien de Ac–02 (•) o bien de Ac–04 (▲) o con un anticuerpo control (–) en medios celulares y después se añadieron a linfocitos BaF3 que expresan tanto IL–22R como IL–10R2.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La interleucina 22 ("IL–22") es una citocina inducida durante las respuestas inmunes innata y adaptativa. Cuando se 40 administra a un sujeto, ella induce una respuesta de fase aguda, que implica un papel para IL–22 en mecanismos de inflamación. Las cadenas de receptor que conjuntamente con IL–22 forman un complejo de señalización son receptor de IL–22 ("IL–22R") y receptor 2 de IL–10 ("IL–10R2"), dos miembros de la familia de receptores de citocinas de tipo II. En una realización, los solicitantes han caracterizado una interacción entre estas proteínas en un formato basado en ELISA usando citocina biotinilada y dímeros de fusión de dominio de receptor extracelular Fc. Los solicitantes han 45 mostrado que IL–22 tiene afinidad medible por el EDC de IL–22R y afinidad no detectable por IL–10R2 solo (Ejemplo 12). IL–22 tiene una afinidad sustancialmente más grande por ECD de IL–22R/IL–I0R2 presentado como heterodímeros Fc (Ejemplo 13). Los análisis adicionales que implican adiciones temporales sugieren que IL–10R2 se une a una superficie creada por la asociación entre IL–22 e IL–22R. Los solicitantes creen que ECD de IL–10R2 estabiliza adicionalmente la asociación de IL–22 en su complejo receptor de citocinas (Ejemplos 14 y 15). En otras 50 realizaciones, los anticuerpos anti–IL–22 neutralizantes se han generado y caracterizado en términos de su especificidad de unión, afinidad y actividad neutralizante de IL–22 (Ejemplos 5, 16, 17, 20, 21 y 22). En una realización, un anticuerpo de rata de IL–22 e IL–22BP (una proteína de unión a IL–22 segregada y antagonista natural de la misma), definen ambos un epítopo de IL–22 que puede requerirse directamente para reconocimiento de ECD de IL–22R. En aún otra realización, un anticuerpo monoclonal de rata define una región de IL–22 separada 55 importante para el papel del ECD de IL–10R2. Además, los solicitantes han mostrado que la administración de IL–22

en vivo induce parámetros de una respuesta de fase aguda, y que una reducción de actividad de IL–22 usando un anticuerpo anti–IL–22 neutralizante mejora síntomas inflamatorios en un modelo de artritis inducida por colágeno (CIA) de ratón (Ejemplo 9). La expresión de ARNm de IL–22 está regulada por incremento en áreas inflamadas. Así, los antagonistas de IL–22, por ejemplo, anticuerpos anti–IL–22 neutralizantes y fragmentos de los mismos, se pueden usar para inducir inmunosupresión en vivo. 5

De acuerdo con ello, la presente solicitud proporciona, al menos en parte, anticuerpos y fragmentos de unión a antígenos de los mismos que se unen a IL–22, en particular, a IL–22 de ser humano, con afinidad y especificidad altas. En una realización, el anticuerpo anti–IL22 o fragmento del mismo reduce, inhibe o antagoniza al menos una actividad asociada a IL–22. Por ejemplo, el anticuerpo anti–IL22 o fragmento del mismo puede unir a IL–22, por ejemplo, un epítopo de IL–22 e interfiere con una interacción, por ejemplo, unión, entre IL–22 y un complejo receptor 10 de IL–22, por ejemplo, un complejo que comprende receptor de IL–22 ("IL–22R") y receptor 2 de interleucina–10 ("IL–10R2"), o una subunidad del mismo (por ejemplo, IL–22R o IL–10R2, individualmente). Así, los anticuerpos y fragmentos de los mismos de la invención se pueden usar para interferir con (por ejemplo, inhibir, bloquear, o reducir de otra manera) una interacción, por ejemplo, unión, entre IL–22 y un complejo receptor de IL–22, o una subunidad del mismo. Así, los anticuerpos anti–IL22 o fragmentos de los mismos de la invención se pueden usar para 15 diagnosticar, tratar o evitar trastornos asociados a IL–22, por ejemplo, trastornos autoinmunes, por ejemplo, trastornos artríticos (por ejemplo, artritis reumatoide); trastornos respiratorios (por ejemplo, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD)); y afecciones inflamatorias de, por ejemplo, piel (por ejemplo, soriasis), hígado (por ejemplo, hepatitis), riñón (por ejemplo, nefritis) y páncreas (por ejemplo, pancreatitis).

Con el fin de que la presente invención se pueda entender más fácilmente, se definen primero ciertos términos. Las 20 definiciones adicionales se exponen por toda la descripción detallada.

El término "interleucina–22" o "IL–22," como se usa en el presente documento, se refiere a citocina de clase 2 que muestra homología a IL–10, y se regula por incremento en linfocitos T por IL–9 o ConA (Dumoutier L. y col. (2000) Proc Natl Acad Sci EE.UU. 97 (18): 10144–9). IL–22 es una citocina cuya expresión se estimula por LPS, pero no significativamente por IFN–γ. IL–22 se produce predominantemente por linfocitos CD4+ Th1 de ser humano y de 25 ratón activadas, pero no por linfocitos CD4+ Th2. IL–22 modula parámetros indicadores de una respuesta de fase aguda (Dumoutier L. y col. (2000) supra; Pittman D. y col. (2001) Genes and Immunity 2: 172; documento WO 00/65027; Gabay, C. (1999) New England Journal of Medicine 340 (6): 448–454) e inflammation (Kotenko S.V. (2002) Cytokine & Growth Factor Reviews 13 (3): 223–40; documento WO 00/65027). IL–22 se cree que se une a un complejo receptor constituido por receptor IL–22 (también referido en el presente documento como "IL–22R") y 30 receptor 2 de IL–10 (también referido en el presente documento como "IL–10R2"), dos miembros de la familia de receptores de citocinas de tipo II (CRF2). El nucleótido y las secuencias de aminoácidos para estos dos receptores se describen en Xie M.H. y col. (2000) J Biol Chem 275 (40): 31335–9; Kotenko S.V. y col. (2001) J Biol Chem 276 (4): 2725–32 (IL–10R2 de ser humano). Ambas cadenas del receptor de IL–22 se expresan constitutivamente en un número de órganos. Las líneas celulares epiteliales derivadas de estos órganos son responsables de IL–22 in vitro 35 (Kotenko S.V. (2002) Cytokine & Growth Factor Reviews 13 (3): 223–40). IL–22 induce activación de las rutas de JAK/STAT3 y de ERK, así como intermedios de otras rutas de MAPK ((Dumoutier L. y col. (2000) supra; Pittman D. y col. (2000) supra; Pittman D. y col. (2000) J Immunol 164 (4): 1814–9); Kotenko S.V. y col. (2001) J Biol Chem 276 (4): 2725–32; Kotenko S.V. y col. (2002) J Biol Chem 277 (37): 33676–82).

De acuerdo con ello, el término "IL–22" se refiere a una citocina (preferentemente de mamíferos, por ejemplo, de 40 origen murino o humano) que es capaz de de interaccionar con, por ejemplo, un receptor de IL–22, por ejemplo, IL–22R o IL–10R2, o un complejo de los mismos (preferentemente de origen mamífero, por ejemplo, murino o humano) y que tienen una de las siguientes características: (i) una secuencia de aminoácidos de un polipéptido IL–22 de mamíferos que se da en la naturaleza o un fragmento de la misma, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID N.º: 2 (humana) o como SEC ID N.º: 4 (murina) o un fragmento de las mismas; (ii) una 45 secuencia de aminoácidos sustancialmente homóloga a, por ejemplo, al menos el 85%, el 90%, el 95%, el 98%, el 99% homóloga a, una secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID N.º: 2 (humana) o como SEC ID N.º: 4 (murina) o un fragmento de las mismas; (iii) una secuencia de aminoácidos que está codificada por una secuencia de nucleótidos de IL–22 de mamífero que se da en la naturaleza o un fragmento de la misma (por ejemplo, SEC ID N.º: 1 (humana) o SEC ID N.º: 3 (murina) o un fragmento de la misma); (iv) una secuencia de aminoácidos 50 codificada por una secuencia de nucleótidos que es sustancialmente homóloga a, por ejemplo, al menos el 85%, el 90%, el 95%, el 98%, el 99% homóloga a, una secuencia de nucleótidos mostrada como SEC ID N.º: 1 (humana) o SEC ID N.º: 3 (murina) o un fragmento de la misma; (v) una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos degenera a una secuencia de nucleótidos de IL–22 que se da en la naturaleza o a un fragmento de la misma, por ejemplo, SEC ID N.º: 1 (humana) o SEC ID N.º: 3 (murina) o un fragmento de la misma; o (vi) una 55 secuencia de nucleótidos que hibrida con una de las siguientes secuencias de nucleótidos en condiciones restrictivas, por ejemplo, condiciones altamente restrictivas. Preferentemente, el polipéptido IL–22 tiene una o más actividades asociadas de IL–22, por ejemplo, una actividad como se describe en el presente documento.

El ADNc de la IL–22 humana se depositó en la American Type Culture Collection (10801 University Boulevard, Manassas, Virginia, EE.UU. 2010–2209) en el 28 de abril de 1999 como un depósito original bajo el Tratado de Budapest y se dio el número de referencia de ATCC 207231. Todas las restricciones sobre la biodisponibilidad para el público del material depositado se retirarán irrevocablemente con la concesión de la patente salvo para los requerimientos especificados en 37 C.F.R. § 1.808(b), y el término del depósito cumplirá con 37 C.F.R. § 1.806. 5

La frase "una actividad asociada a IL–22" se refiere a una o más de las actividades biológicas de un polipéptido IL–22, por ejemplo, un polipéptido IL–22 maduro (por ejemplo, IL–22 de mamíferos, por ejemplo IL–22 humana o murina que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEC ID N.º: 2 y 4, respectivamente), incluyendo, pero no limitadas a, (1) interaccionar con, por ejemplo, unirse a, un receptor de IL–22 (por ejemplo, un IL–22R o IL–10R2 o un complejo de la misma, preferentemente de mamíferos, por ejemplo, de origen murino o humano); (2) 10 asociarse con una o más moléculas de transducción de señales; (3) estimular fosforilación y/o activación de una proteína quinasa, por ejemplo, JAK/STAT3, ERK y MAPK; (4) modular, por ejemplo, estimular o disminuir, proliferación, diferenciación, función celular efectora, actividad citolítica, secreción de citocinas o quimiocinas, y/o supervivencia de una célula que responde a IL–22, por ejemplo, una célula epitelial de, por ejemplo, riñón, hígado, colon, intestino delgado, glándula tiroides, páncreas, piel); (5) modular al menos un parámetro de una respuesta de 15 fase aguda, por ejemplo, un cambio metabólico, hepático, hematopoyético (por ejemplo, anemia, incremento de plaquetas) o cambio neuroendocrino, o un cambio (por ejemplo, incremento o decremento en una proteína de fase aguda, por ejemplo un incremento en fibrinógeno y/o en amiloide A sérico, o un decremento en albúmina); y/o (6) modular al menos un parámetro de un estado inflamatorio, por ejemplo, modular acciones proinflamatorias mediadas por citocinas (por ejemplo, fiebre, y/o síntesis de prostaglandinas, por ejemplo síntesis de PGE2), modular 20 respuestas inmunes celulares, modular producción/y o secreción de citocinas, quimioquinas (por ejemplo, GRO1), o linfocinas (por ejemplo, producción y/o secreción de una citocina proinflamatoria).

El término "respuesta de fase aguda" está reconocido en la técnica, véase por ejemplo, Gabay, C. (1999) New England Journal of Medicine 340 (6):448–454).

Como se usa en el presente documento, una "cantidad terapéuticamente efectiva" de un antagonista de IL–22, por 25 ejemplo, anticuerpo, se refiere a una cantidad de un agente que es efectivo, tras administración de dosis simple o múltiple a un sujeto, por ejemplo, un paciente humano, en curar, reducir la gravedad de, o mejorar uno o más síntomas de un trastorno, o en prolongar la supervivencia del sujeto más allá de lo que se espera en la ausencia de tal tratamiento.

Como se usa en el presente documento, "una cantidad profilácticamente efectiva" de un antagonista de IL–22, por 30 ejemplo, anticuerpo, se refiere a una cantidad de un agente que es efectivo, tras administración de dosis individual o múltiple a un sujeto, por ejemplo un paciente humano, en evitar o retardar el surgimiento de la aparición o recurrencia de un trastorno, por ejemplo un trastorno como se describe en el presente documento.

El término "inducir", "reducir", "inhibir", "potenciar", "elevar", "incrementar", "disminuir” o similares, por ejemplo, que denotan diferencias cuantitativas entre dos estados, hacen referencia a al menos diferencias estadísticamente 35 significativas entre los dos estados.

Como se usa en el presente documento, un "antagonista de IL–22" se refiere a un agente que reduce, inhibe o disminuye de otro modo una actividad biológica o actividades biológicas de un polipéptido IL–22, por ejemplo, un polipéptido IL–22 humano, o fragmento del mismo. Preferentemente, el antagonista interactúa con, por ejemplo, se une a, un polipéptido IL–22. El antagonismo usando un antagonista de IL–22 no indica necesariamente una 40 eliminación total de la actividad biológica asociada con IL–22. Los antagonistas de IL–22 incluyen sin limitación anticuerpos dirigidos contra proteínas IL–22 humanas; formas solubles del receptor u otro objetivo al que se dirija la IL–22 humana; y los compuestos peptídicos y de moléculas pequeñas que inhiben o interfieren con la interacción de IL–22 humana con su receptor u otro objetivo. En una realización, los antagonistas de IL–22 tienen características de unión similares a Ac–02 (por ejemplo, se unen al mismo epítopo o a un epítopo similar). En otra realización, los 45 antagonistas de IL–22 tienen características de unión similares a Ac–04 (por ejemplo, se unen al mismo epítopo o a un epítopo similar).

Como se usa en el presente documento, un "agonista de IL–22" se refiere a un agente que potencia, induce o mejora de otro modo una actividad biológica o actividades biológicas de un polipéptido de IL–22.

Como se usa en el presente documento, el término “anticuerpo” se refiere a una proteína que comprende al menos 50 una, y preferentemente dos, regiones variables de cadena pesada (H) (abreviadas en el presente documento como VH) y al menos una y preferentemente dos regiones variables de cadena ligera (L) (abreviadas en el presente documento como VL). Las regiones VH y VL pueden subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariabilidad denominadas “regiones determinantes de la complementariedad” (“CDR”), intercaladas con regiones que están más conservadas que se denominan “regiones marco conservado” (FR). La extensión de la región marco conservado y 55

de las CDR se ha definido de forma precisa (véase, Kabat, E.A., y col. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication N.º: 91–3242, y Chothia, C. y col. (1987) J. Mol. Biol. 196:901–917). Cada VH y VL está compuesto por tres CDR y por cuatro FR dispuestas desde el extremo amino al extremo carboxi en el orden siguiente: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 5

El anticuerpo puede incluir adicionalmente una región constante de cadena pesada y una región constante de cadena ligera, para de este modo formar una cadena de inmunoglobulina pesada y ligera, respectivamente. En una realización, el anticuerpo es un tetrámero de dos cadenas de inmunoglobulina pesadas y dos cadenas de inmunoglobulina ligeras, en las que las cadenas de inmunoglobulina pesadas y ligeras están interconectadas mediante, por ejemplo, enlaces disulfuro. La región constante de la cadena pesada está compuesta de tres 10 dominios, CH1, CH2 y CH3. La región constante de la cadena ligera está compuesta de un dominio, CL. La región variable de las cadenas pesada y ligera contiene un dominio de unión que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos median típicamente la unión del anticuerpo a tejidos o factores del huésped, incluyendo diversas células del sistema inmune (por ejemplo, células efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema de complemento clásico. 15

Como se usa en el presente documento, el término "inmunoglobulina" hace referencia a una proteína constituida por uno o más polipéptidos codificados sustancialmente por genes de inmunoglobulina. Los genes de inmunoglobulina humana reconocidos incluyen los genes de regiones constantes kappa, lambda, alfa (IgA1 e IgA2), gamma (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), delta, epsilon y mu, así como la miriada de genes de las regiones variables de inmunoglobulinas. Las “cadenas ligeras” de inmunoglobulinas de longitud total (aproximadamente 25 Kd o 214 aminoácidos) están 20 codificadas por un gen de la región variable en el extremo NH2 (aproximadamente 110 aminoácidos) y un gen de región constante kappa o lamda en el extremo COOH. Las “cadenas pesadas” de inmunoglobulina de longitud total (aproximadamente 50 Kd o 446 aminoácidos), están codificadas de forma similar por un gen de región variable (aproximadamente 116 aminoácidos) y uno de los otros genes de región constante mencionados anteriormente, por ejemplo gamma (que codifica aproximadamente 330 aminoácidos). 25

Como se usa en el presente documento, "isotipo" se refiere a la clase de anticuerpos (por ejemplo, IgM o IgGI) que están codificados por genes de la región constante de la cadena pesada.

El término "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo (o simplemente "parte de anticuerpo," o "fragmento"), como se usa en el presente documento, hace referencia a uno o más fragmentos de un anticuerpo de longitud total que retiene la capacidad de unirse específicamente a un antígeno (por ejemplo, CD3). Ejemplos de fragmentos de 30 unión comprendidos dentro del término “fragmento de unión a antígeno” de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente constituido por los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab’)2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos de Fab engarzados por un enlace disulfuro en la región bisagra; (iii) un fragmento Fd constituido por los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv constituido por los dominios VL y VH de un brazo individual de un anticuerpo, (v) un fragmento dAc (Ward y col., (1989) Nature 341: 544–546), que 35 consisten en un dominio VH; y (vi) una región determinante de complementariedad aislada (CDR). Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, están codificados por genes separados, pueden unirse, usando procedimientos recombinantes, por un engarce sintético que les permite ser fabricardos como una cadena de proteína individual en la que las regiones VL y VH se emparejan formando moléculas monovalentes (conocidas como cadena individual Fv (scFv); véase por ejemplo, Bird y col. (1988) Science 242: 423–426; Huston y col. (1988) 40 Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 85: 5879–5883). Tales anticuerpos de cadena individual se pretende también que estén comprendidos en el término "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpo se obtienen usando técnicas convencionales conocidas por aquellos con habilidad en la técnica, y los fragmentos se rastrean por su utilidad de la misma menara que se rastrean los anticuerpos intactos.

El término "en combinación" en este contexto significa que los agentes se dan de forma sustancialmente 45 contemporánea, bien simultánea o secuencialmente. Si se dan secuencialmente, en la aparición de la administración del segundo compuesto, el primero de los dos compuestos es preferentemente aún detectable a concentraciones efectivas en el sitio de tratamiento.

Las secuencias similares u homólogas (por ejemplo, al menos aproximadamente identidad de secuencia del 85%) a las secuencias descritas en el presente documento son también parte de esta solicitud. En alguna realización, la 50 identidad de secuencia puede ser aproximadamente del 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o superior. Alternativamente, existe identidad sustancial cuando los segmentos de ácidos nucleicos hibridan en condiciones de hibridación selectiva (por ejemplo, condiciones de hibridación altamente restrictivas), al complemento de la hebra. Los ácidos nucleicos pueden estar presentes en células completas, en un lisado celular, o en una forma parcialmente purificada o sustancialmente pura. 55

Los cálculos de "homoIogía" o de "identidad de secuencia" entre dos secuencias (los términos se usan en el

presente documento intercambiablemente) se llevan a cabo como sigue. Las secuencias están alineadas para propósitos de comparación óptima (por ejemplo, se pueden introducir espacios en una o ambas de una primera y una segunda secuencia de aminoácidos o de ácidos nucleicos para alineamiento óptimo y secuencias no homólogas pueden no tomarse en cuenta para propósitos de comparación). En una realización preferida, la longitud de una secuencia de referencia alineada para propósitos de comparación es al menos el 30%, preferentemente al menos el 5 40%, más preferentemente al menos el 50%, incluso más preferentemente al menos el 60% e incluso más preferentemente al menos el 70%, el 80%, el 90%, el 100% de la longitud de la secuencia de referencia. Los residuos de aminoácidos o los nucleótidos en las posiciones de aminoácidos correspondientes o en las posiciones nucleotídicas correspondientes se comparan después. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo residuo de aminoácido o por el mismo nucleótido según la posición correspondiente en la segunda 10 secuencia, después las moléculas son idénticas en esa posición (como se usa en el presente documento “identidad” de secuencia de aminoácidos o de ácidos nucleicos es equivalente a “homología” de aminoácidos o de ácidos nucleicos). El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias, tomando en cuenta el número de espacios, y la longitud de cada espacio, que necesita introducirse para alineamiento óptimo de las dos secuencias. 15

La comparación de las secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre las dos secuencias se puede llevar a cabo usando un algoritmo matemático. En una realización preferida, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se determinó usando el algoritmo de Needleman y Wunsch ((1970) J. Mol. Biol. 48: 444–453) que se ha incorporado en el programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en http://www.gcg.com), bien usando una matriz Blossum 62 o bien usando una matriz PAM250, y un peso de espacios 20 de 16, 14, 12, 10, 8, 6, o 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5, o 6. En aún otra realización preferida, el porcentaje de identidad entre dos secuencias nucleotídicas se determina usando el programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en http://www.gcg.com), usando una matriz NWSgapdna.CMP y un peso de espacios de 40, 50, 60, 70, u 80 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5, o 6. Un grupo de parámetros particularmente preferido (y el único que debería usarse si el practicante está inseguro sobre qué parámetros deberían aplicarse para determinar si una 25 molécula está dentro de una identidad de secuencia o limitación de homología de la invención) son una matriz de valoración Blossum 62 con una penalización de espacios de 12, una penalización de extensión de espacios de 4, y una penalización de espacios de cambios de fase de 5. El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos o nucleotídicas se puede determinar también usando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller ((1989) CABIOS, 4:11–17) que se han incorporado dentro del programa ALIGN (versión 2.0), usando una tabla de residuos 30 de peso PAM120, una penalización de longitud de espacio de 12 y una penalización de espacio de 4.

Como se usa en el presente documento, el término "hibrida en condiciones restrictivas" describe condiciones para hibridación y lavado. Las condiciones restrictivas se conocen por aquellos expertos en la técnica y pueden encontrarse en Current Protocols in MolecuIar Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1 –6.3.6. Se describen procedimientos acuosos y no acuosos en esa referencia y se puede usar cualquiera. Un ejemplo, preferido, de 35 condiciones de hibridación restrictivas es hibridación en cloruro de sodio 6X/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45°C, seguida por uno o más lavados en SSC 0,2X, SDS al 0,1% a 50°C. Otro ejemplo de condiciones de hibridación restrictivas son hibridación en SSC 6X a aproximadamente 45°C, seguida por uno o más lavados en SSC 0,2X, SDS al 0,1% a 55ºC. Un ejemplo adicional de condiciones de hibridación restrictivas es hibridación en SSC 6X a aproximadamente 45°C, seguida por uno o más lavados en SSC 0,2X, SDS al 0,1% a 40 60°C. Preferentemente, las condiciones de hibridación restrictivas son hibridación en SSC 6X a aproximadamente 45°C, seguida por uno o más lavados en SSC 0,2X, SDS al 0,1% a 65°C. Condiciones altamente restrictivas particularmente preferidas (y las condiciones que deberían usarse si el practicante está incierto sobre que condiciones deberían aplicarse para determinar si una molécula está dentro de la limitación de hibridación de la invención) son fosfato de sodio 0,5 M, SDS al 7% a 65°C, seguido por uno o más lavados a SSC 0,2X, SDS al 1% a 45 65°C.

Se entiende que los polipéptidos IL–22 y los antagonistas, por ejemplo, anticuerpos, de los mismos de la presente invención pueden tener sustituciones conservadoras adicionales o sustituciones de aminoácidos no esenciales adicionales, que no tienen un efecto sustancial en sus funciones. Una "sustitución de aminoácidos conservadora" es una en la que el residuo de aminoácidos se reemplaza con un residuo de aminoácidos que tiene una cadena lateral 50 similar. Se han definido en la técnica familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparragina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales betaramificadas 55 (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina).

Proteínas IL–22, Fragmentos y Polinucleótidos Que Codifican lo Mismo

Se conocen en la técnica y se proporcionan más adelante nucleótidos de IL–22 y secuencias de aminoácidos. La secuencia de nucleótidos de cada clon se puede determinar también secuenciando el clon depositado de acuerdo con los procedimientos conocidos. La secuencia de aminoácidos predicha (tanto de longitud total como formas maduras) se puede determinar después a partir de tal secuencia nucleotídica. La secuencia de aminoácidos de la proteína codificada por un clon particular se puede determinar también por expresión del clon en una célula huésped 5 adecuada, recogiendo la proteína y determinando su secuencia.

Como se usa en el presente documento, una proteína "segregada" es una que, cuando se expresa en una célula huésped adecuada, se transporta a través o por una membrana, incluyendo transporte como un resultado de secuencias señal en su secuencia de aminoácidos. Las proteínas "segregadas" incluyen sin limitación proteínas segregadas totalmente (por ejemplo, proteínas solubles) o parcialmente (por ejemplo, receptores) desde la célula en 10 la que se expresan. Las proteínas “segregadas" también incluyen sin limitación proteínas que se transportan a través de la membrana del retículo endoplásmico.

La secuencia de nucleótidos de IL–22 humana se reproduce más adelante (SEC ID N.º: 1) e incluye una cola de poli(A). La secuencia de nucleótidos revelada incluye una fase de lectura abierta y la secuencia de aminoácidos de proteína IL–22 de longitud total que corresponde a la secuencia de nucleótidos siguiente se expone en la SEC ID N.º: 15 2. La secuencia de aminoácidos de la IL–22 madura corresponde a aproximadamente los aminoácidos 34–179 de la SEC ID N.º: 2.

(SEC ID N.º: 1)

La secuencia polipeptídica del polipéptido codificado se muestra a continuación. 20

5

(SEC ID N.º: 2)

Las secuencias nucleotídicas que codifican IL–22 murina, y la secuencia del polipéptido codificado, se proporcionan seguidamente:

(SEC ID N.º: 3)

La secuencia de aminoácidos del polipéptido codificada por la secuencia de polinucleótidos anteriormente referida 10 se proporciona seguidamente:

(SEC ID N.º: 4)

Cualquier forma de proteínas IL–22 de menos de la longitud total se puede usar en los procedimientos y en las composiciones de la presente invención, dado que retiene la capacidad para unirse a un receptor de IL–22. Los fragmentos de IL–22, por ejemplo, las proteínas IL–22 de menos de la longitud total, se pueden producir expresando un fragmento correspondiente del polinucleótido que codifica la proteína de IL–22 de longitud total en una célula 5 huésped. Estos fragmentos polinucleotídicos correspondientes son también parte de la presente invención. Los polinucleótidos modificados como se describen anteriormente pueden fabricarse por técnicas de biología molecular estándar, incluyendo construcción de los mutantes de deleción deseada apropiados, procedimientos de mutagénesis dirigida a sitio o por la reacción en cadena de la polimerasa usando cebadores oligonucleotídicos apropiados.

Fragmentos de la proteína pueden estar en forma lineal, o pueden ciclarse usando procedimientos conocidos, por 10 ejemplo, como se describen en H.U. Saragovi, y col., Bio/Technology 10, 773–778 (1992) y en R.S. McDowell, y col., J. Amer. Chem. Soc. 114, 9245–9253 (1992). Tales fragmentos se pueden fusionar a moléculas transportadoras tales como inmunoglobulinas para muchos propósitos, incluyendo incrementar la valencia de los sitios de unión a proteína. Por ejemplo, los fragmentos de la proteína se pueden fusionar a través de secuencias “engarce” a la parte Fc de una inmunoglobulina. Para una forma bivalente de la proteína, una fusión tal puede ser a la parte Fc de una 15 molécula de IgG. Otros isotipos de inmunoglobulina se pueden usar para generar tales fusiones. Por ejemplo, una fusión proteína–IgM genera una forma decavalente de la proteína de la invención.

Las proteínas IL–22 y fragmentos de las mismas incluyen proteínas con longitudes de secuencia de aminoácidos que son al menos el 25% (más preferentemente al menos el 50%, y lo más preferentemente al menos el 75%) de la longitud de una proteína revelada y tienen al menos 60% de identidad de secuencia (más preferentemente, al menos 20 el 75% de identidad, lo más preferentemente al menos el 90% o el 95% de identidad) con esa proteína revelada, donde la identidad de secuencia se determina comparando las secuencias de aminoácidos de las proteínas cuando se alinean de tal forma que maximicen solapamiento e identidad mientras que minimizan los espacios de secuencia. También están incluidas en el presente documento proteínas y fragmentos de proteína que contienen un segmento que comprende preferentemente 8 ó más (más preferentemente 20 ó más, lo más preferentemente 30 ó más) 25 aminoácidos contiguos que comparten al menos identidad de secuencia del 75% (más preferentemente, al menos identidad del 85%; lo más preferentemente al menos identidad del 95%) con cualquier segmento tal de cualquiera de las proteínas descritas.

En otra realización, proteínas, fragmentos de proteínas y proteínas recombinantes de la presente invención incluyen aquellos que se pueden identificar en base a la presencia de al menos un “resto de unión a receptor de IL–22". Como 30 se usa en el presente documento, el término "resto de unión a receptor de IL–22" incluye secuencias de aminoácidos o residuos que son importantes para unión de IL–22 a su receptor requerido. En una realización preferida, una proteína IL–22 contiene un resto de unión a receptor de IL–22 que incluye aproximadamente 50–60 aminoácidos de SEC ID N.º: 2. En otra realización, una proteína IL–22 contiene un resto de unión a receptor de IL–22 que incluye aproximadamente 63–81 aminoácidos de SEC ID N.º: 2. En aún otra realización, una proteína IL–22 contiene un 35 resto de unión a receptor de IL–22 que incluye aproximadamente 168–177 aminoácidos de SEC ID N.º: 2. En una realización preferida, una proteína IL–22 contiene un resto de unión a receptor de IL–22 que incluye al menos uno de 50–60 aminoácidos, 63–81 aminoácidos, y/o aproximadamente 168–177 aminoácidos de SEC ID N.º: 2.

En aún otra realización, un resto de unión a receptor de IL–22 tiene una secuencia de aminoácidos al menos el 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o más idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por 50–60 40 aminoácidos de SEC ID N.º: 2, 63–81 aminoácidos de SEC ID N.º: 2 y 168–177 aminoácidos de SEC ID N.º: 2.

En otra realización, proteínas, fragmentos de proteínas y proteínas recombinantes de la presente invención incluyen aquellos que se pueden identificar en base a la presencia de al menos uno, dos, tres, cuatro o más sitios para glicosilación unida a N. La longitud se puede determinar alineando las secuencias de los polinucleótidos e identificando la región o las regiones de complementariedad de secuencia óptima. 45

Vectores y Células Huésped

Los polinucleótidos de IL–22 se pueden engarzar operativamente a una secuencia de control de expresión tal como los vectores de expresión pMT2 o pED revelados en Kaufman y col., Nucleic Acids Res. 19, 4485–4490 (1991), con el fin de producir la proteína recombinantemente. Se conocen en la técnica muchas secuencias de control de

expresión adecuadas. Se conocen también procedimientos generales de expresar proteínas recombinantes y se ejemplifican en R. Kaufman (1990) Methods in Enzymology 185, 537–566. Según se define en el presente documento, “engarzado operativamente” quiere decir que el polinucleótido aislado de la invención y una secuencia de control de expresión están situados dentro de un vector o célula en un modo tal que la proteína se expresa por una célula huésped que se ha transformado (transfectado) con el polinucleótido ligado/la secuencia de control de 5 expresión ligada.

El término "vector", como se usa en el presente documento, está pensado para hacer referencia a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha engarzado. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un bucle de ADN de cadena doble dentro del que se pueden ligar segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector viral, en el que segmentos de ADN adicionales pueden estar ligados dentro del 10 genoma viral. Ciertos vectores son capaces de replicación autónoma en una célula huésped en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que comprenden un origen de replicación bacteriano y vectores mamíferos episómicos). Otros vectores (por ejemplo, vectores mamíferos no episómicos) se pueden integrar en el genoma de una célula huésped tras la introducción en la célula huésped y de este modo se replican junto con el genoma del huésped. Además, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los que ellos están 15 operativamente unidos. Tales vectores se refieren en el presente documento como "vectores de expresión recombinantes” (o simplemente, "vectores de expresión"). En general, los vectores de expression de utilidad en técnicas de ADN recombinante están a menudo en la forma de plásmidos. En la presente memoria descriptiva, "plásmido" y "vector" se pueden usar intercambiablemente ya que el plásmido es la forma de vector más comúnmente usada. Sin embargo, la invención incluye otras formas tales de vectores de expression, tales como 20 vectores virales (por ejemplo, retrovirus defectivos en replicación, adenovirus y virus adenoasociados), que sirven para funciones equivalentes.

El término “secuencia reguladora” está pensado para incluir promotores, potenciadores y otros elementos de control de expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación) que controlan la transcripción o traducción de los genes de cadena de anticuerpo. Tales secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel; Gene Expression 25 Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Se apreciará por aquellos expertos en la técnica que el diseño del vector de expresión, incluyendo la selección de secuencias reguladoras, puede depender de factores tales como la elección de la célula huésped a transformarse, el nivel de expresión de proteína deseado, etc. Las secuencias reguladoras preferidas para expresión en huésped mamífero incluyen elementos virales que dirigen niveles altos de expresión de proteínas en células de mamíferos, tales como 30 promotores y/o potenciadores derivados de promotor FF–Ia y poliA de BGH, citomegalovirus (CMV) (tal como el promotor/potenciador de CMV), Virus de los Simios 40 (SV40) (tal como el promotor/potenciador de SV40), adenovirus (por ejemplo, el promotor tardío principal de adenovirus (AdMLP)) y polioma. Para descripción adicional de elementos reguladores virales, y secuencias de los mismos, véase, por ejemplo, Patente de los EE.UU. N.º 5,168,062 por Stinski, Patente de los EE.UU. N.º 4,510,245 por Bell y col. y Patente de los EE.UU. N.º 4,968,615 por 35 Schaffner y col.

Los vectores de expresión recombinantes de la invención pueden llevar secuencias adicionales, tales como secuencias que regulan la replicación del vector en células huésped (por ejemplo, orígenes de replicación) y genes marcadores seleccionables. El gen marcador seleccionable facilita la selección de células huésped en las que el vector se ha introducido (véanse por ejemplo, Patentes de los Estados Unidos N.ºs 4,399,216, 4,634,665 y 40 5,179,017, todas por Axel y col.). Por ejemplo, típicamente los genes marcadores seleccionables confieren resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina o metotrexato, en una célula huésped en la que el vector se ha introducido. Los genes marcadores seleccionables preferidos incluyen el gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR) (para usar en células huésped dhfr– con selección/amplificación de metotrexato) y el gen neo (para selección de G418). 45

Una serie de tipos de células pueden actuar como células huésped adecuadas para expresión de la proteína IL–22 o de la proteína de fusión de la misma. Se puede usar cualquier tipo celular capaz de expresar proteína funcional de IL–22. Las células huésped de mamíferos adecuadas incluyen, por ejemplo, células COS de mono, células de Ovario de Hámster Chino (CHO), células de riñón 293 humanas, células epidérmicas A431 humanas, células Colo205, células 3T3, células CV–1, otras líneas celulares de primates transformadas, células diploides normales, cepas 50 celulares derivadas de cultivo in vitro de tejido primario, explantes primarios, células HeLa, células L de ratón, BHK, HL–60, U937, HaK, Rat2, BaF3, 32D, FDCP–1, PC12, M1x o células C2C12.

La proteína IL–22 o la proteína de fusión de la misma se puede producir también engarzando operativamente el polinucleótido aislado de la invención a secuencias control adecuadas en uno o más vectores de expresión de insectos, y empleando un sistema de expresión de insectos. Los materiales y procedimientos para sistemas de 55 expresión de baculovirus/células de insectos están disponibles comercialmente en forma de kit de, por ejemplo, Invitrogen, San Diego, Calif. EE.UU. (el kit MaxBac®), y tales procedimientos se conocen bien en la técnica, como se describen en Summers y Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin N.º 1555 (1987). Las formas

solubles de la proteína IL–22 se pueden producir también en células de insecto que usan polinucleótidos aislados apropiados como se describe anteriormente.

Alternativamente, la proteína de IL–22 o la proteína de fusión de la misma se pueden producir en eucariotas inferiores tales como levadura o en procariotas tales como bacterias. Las cepas de levadura adecuadas incluyen Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, cepas de Kluyveromyces, Candida, o cualquier otra cepa 5 de levadura capaz de expresar proteínas heterólogas. Las cepas bacterianas adecuadas incluyen Escherichia coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, o cualquier otra cepa bacteriana capaz de expresar proteínas heterólogas.

La expresión en bacterias puede dar como resultado formación de cuerpos de inclusión que incorporan la proteína recombinante. Así, se puede requerir el replegado de la proteína recombinante con el fin de producir material activo o más activo. Se conocen en la técnica varios procedimientos para obtener proteínas heterólogas plegadas 10 correctamente a partir de cuerpos de inclusión bacterianos. Estos procedimientos implican generalmente solubilizar la proteína a partir de los cuerpos de inclusión, desnaturalizando después la proteína completamente usando un agente caotrópico. Cuando los residuos de cisteína están presentes en la secuencia de aminoácidos primaria de la proteína, es necesario a menudo llevar a cabo el replegado en un ambiente que permita la formación correcta de los enlaces disulfuro (un sistema redox). Los procedimientos generales de replegado se revelan en Kohno, Meth. 15 Enzym., 185:187–195 (1990). El documento EP 0433225 y la solicitud en trámite junto con el presente documento de los Estados Unidos con N.º de Serie 08/163,877 describen otros procedimientos apropiados.

La proteína IL–22 o proteína de fusión de la misma se puede expresar también como un producto de animales transgénicos, por ejemplo, como un componente de la leche de vacas, cabras, cerdos u ovejas transgénicas que se pueden caracterizar también por células somáticas o germinales que contengan una secuencia polinucleotídica que 20 codifique la proteína IL–22 o proteína de fusión de la misma.

La proteína IL–22 o la proteína de fusión de la misma se puede preparar cultivando células huésped transformadas de un cultivo en condiciones de cultivo necesarias para expresar la proteína deseada. La proteína expresada resultante se puede purificar después a partir del medio de cultivo o de los extractos celulares. Las formas solubles de la proteína IL–22 o de la proteína de fusión se pueden purificar a partir de medios condicionados. Las formas 25 unidas a membrana de proteína IL–22 de la invención se pueden purificar preparando una fracción de membrana total a partir de la célula que está expresando y extraer las membranas con un detergente no iónico tal como Triton X–100.

La proteína IL–22 se puede purificar usando procedimientos conocidos por aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, la proteína IL–22 de la invención se puede concentrar usando un filtro de concentración de proteína 30 comercialmente disponible, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Tras la etapa de concentración, el concentrado se puede aplicar a una matriz de purificación tal como un medio de filtración de gel. Alternativamente, una resina de intercambio aniónico se puede emplear, por ejemplo, una matriz o sustrato que tenga grupos dietilaminoetilo (DEAE) o polietilenoimina (PEI) laterales. Las matrices pueden ser acriIamida, agarosa, dextrano, celulosa u otros tipos empleados comúnmente en purificación de proteínas. Alternativamente, se puede 35 emplear una etapa de intercambio catiónico. Los intercambiadores catiónicos adecuados incluyen diversas matrices insolubles que comprenden grupos sulfopropilo o carboximetilo. Se prefieren los grupos de sulfopropilo (por ejemplo, columnas de S–Sepharose ®). La purificación de la proteína IL–22 o proteína de fusión a partir de sobrenadante de cultivo pueden incluir también una o más etapas de columna tales como resinas de afinidad como concanavalina A–agarosa, heparin–toyopearl® o Cibacrom blue 3GA Sepharose®; o por cromatografía de interacción hidrófoba 40 usando resinas tales como éter fenílico, éter butílico, o éter propílico, o por cromatografía de inmunoafinidad. Finalmente, una o más etapas de cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa (RP–HPLC) que emplean medios de RP–HPLC hidrófobos, por ejemplo, gel de sílice que tiene metilo lateral u otros grupos alifáticos laterales, se pueden emplear para purificar adicionalmente la proteína IL–22. Las columnas de afinidad que incluyen anticuerpos para la proteína IL–22 se pueden usar también en la purificación de acuerdo con procedimientos 45 conocidos. Algunas o todas las siguientes etapas de purificación, en diversas combinaciones o con otros procedimientos adecuados, se pueden emplear para proporcionar una proteína recombinante aislada sustancialmente purificada. Preferentemente, la proteína IL–22 aislada se purifica de tal forma que está sustancialmente libre de otras proteínas de mamíferos.

Se pueden usar también proteínas de IL–22 o proteínas de fusión de la invención para rastrear agentes (por ejemplo, 50 antagonistas de IL–22, por ejemplo anti–anticuerpos de IL–22) que son capaces de unión a IL–22. Los ensayos de unión usando una proteína de unión deseada, inmovilizada o no, se conocen bien en la técnica y se pueden usar para este propósito usando la proteína IL–22 de la invención. Se pueden usar ensayos de rastreo basados en células purificadas o en proteínas (libres de células) para identificar tales agentes. Por ejemplo, la proteína IL–22 puede inmovilizarse en forma purificada en un vehículo y unir o se pueden medir ligandos potenciales para proteína IL–2 55 purificada.

Los polipéptidos IL–22 se pueden producir también por síntesis química convencional conocida. Los procedimientos para construir las proteínas de la presente invención se conocen por aquellos expertos en la técnica. Las secuencias de proteínas construidas sintéticamente, en virtud de que comparten características estructurales y/o conformacionales primarias, secundarias o terciarias con proteínas pueden poseer propiedades biológicas en común con las mismas, incluyendo la actividad proteica. Así, se pueden emplear como sustitutos inmunológicos o 5 biológicamente activos para proteínas purificadas, naturales, en rastreo de compuestos terapéuticos y en procedimientos inmunológicos para el desarrollo de anticuerpos.

Anticuerpos Anti–IL–22 y Fragmentos de Unión a Antígenos de los Mismos

En otras realizaciones, los antagonistas de IL–22 son anticuerpos, o fragmentos de unión a antígenos de los mismos, que se unen a IL–22, preferentemente, IL–22 de mamíferos (por ejemplo, humana o murina). En una realización, el 10 anticuerpo anti–IL22 o el fragmento del mismo (por ejemplo, un Fab, F(ab’)2, Fv o un fragmento Fv de cadena simple) es un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo de especificidad única. El anticuerpo o fragmento del mismo puede ser también un anticuerpo humano, humanizado, quimérico, o generado in vitro contra la IL–22 humana.

Los polipéptidos de IL–22 pueden usarse también para inmunizar animales para obtener anticuerpos policlonales y monoclonales que reaccionan específicamente con los polipéptidos de IL–22. Tales anticuerpos se pueden obtener 15 usando la IL–22 entera como un inmunógeno, o usando fragmentos de IL–22. Se pueden usar fragmentos menores de la IL–22 para inmunizar animales. Los inmunógenos peptídicos pueden contener adicionalmente un residuo de cisteína en el extremo carboxilo y están conjugados a un hapteno tal como la hemocianina de la lapa de California (KLH). Inmunógenos peptídicos adicionales se pueden generar reemplazando residuos de tirosina con residuos de tirosina sulfatados. Se conocen en la técnica procedimientos para sintetizar tales péptidos, por ejemplo, como en R. 20 P. Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85: 2149–2154 (1963); J. L. Krstenansky, y col., FEBS Lett. 211, 10 (1987). Los anticuerpos neutralizantes o no neutralizantes (preferentemente anticuerpos monoclonales) que se unen a IL–22 pueden ser también útiles en el tratamiento de los trastornos asociados a IL–22 descritos en el presente documento. Estos anticuerpos monoclonales neutralizantes pueden ser capaces de bloquear unión de IL–22 a un receptor de IL–22, por ejemplo, IL–22R o IL–10R2 o una combinación de los mismos. 25

El ejemplo 5 más adelante describe la producción de anticuerpos anti–IL–22 en más detalle. Un ejemplo no limitante de un anticuerpo anti–IL22 que interfiere con unión de IL–22 a IL–22R es "Ac–04." Ac–04 (también referido en el presente documento como anticuerpo monoclonal de rata "P3/2") se une a IL–22 humana y neutraliza al menos una actividad de IL–22 (véase Ejemplo 5, 16 y 17). Una línea celular de hibridoma que produce Ac–04 se registró en la ATCC el 5 de junio de 2003 y se le ha asignado el número de acceso de ATCC PTA–5255. Otro ejemplo no limitante 30 de un anticuerpo anti–IL22, que interfiere con unión de IL–22 a IL–10R2 es "Ac–02". Ac–04 (también referido en el presente documento como anticuerpo monoclonal de rata "P3/3") se une a ratón e IL–22 humana y neutraliza al menos una actividad de IL–22 (véase Ejemplo 5, 16 y 17). Una línea celular de hibridoma que produce Ac–02 se ha depositado en la ATCC el 5 de junio de 2003 y se le ha asignado el número de acceso de ATCC PTA–5254.

Se pueden generar anticuerpos monoclonales (Acm) humanos dirigidos contra IL–22 usando ratones transgénicos 35 que lleven los genes de inmunoglobulina humana más que el sistema de ratón. Los esplenocitos de estos ratones transgénicos inmunizados con el antígeno de interés se usan para producir hibridomas que segregan Acm humanos con afinidades específicas para epítopos a partir de una proteína humana (véase, por ejemplo, Wood y col. Solicitud Internacional WO 91/00906, Kucherlapati y col. publicación de PCT WO 91/10741; Lonberg y col. Solicitud Internacional WO 92/03918; Kay y col. Solicitud Internacional 92/03917; Lonberg, N. y col. 1994 Nature 368:856–859; 40 Green, L.L. y col. 1994 Nature Genet. 7:13–21; Morrison, S.L. y col. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851–6855; Bruggeman y col. 1993 Year Immunol 7:33–40; Tuaillon y col. 1993 PNAS 90: 3720–3724; Bruggeman y col. 1991 Eur J Immunol 21: 1323–1326).

Se pueden generar también anticuerpos monoclonales por otros procedimientos conocidos por aquellos expertos en la técnica de la tecnología de ADN recombinante. Un procedimiento alternativo, referido como el procedimiento de 45 "muestra de anticuerpos combinatoria" se ha desarrollado para identificar y aislar fragmentos de anticuerpos que tengan una especificidad antigénica particular, y se puede utilizar para producir anticuerpos monoclonales (para descripciones de muestra de anticuerpos combinatoria véanse por ejemplo, Sastry y col. 1989 PNAS 86: 5728; Huse y col. 1989 Science 246: 1275; y Orlandi y col. 1989 PNAS 86: 3833). Después de inmunizar un animal con un inmunógeno como se describe anteriormente, se clona el repertorio de anticuerpos de la reserva de linfocitos B 50 resultante. Se conocen generalmente procedimientos para obtener la secuencia de ADN de las regiones variables de una población diversa de moléculas de inmunoglobulinas usando una mezcla de cebadores oligoméricos y PCR. Por ejemplo, los cebadores oligonucleotídicos mixtos que corresponden a las secuencias líderes de 5’ (péptido señal) y/o secuencias marco consevado 1 (FR1), así como cebador para un cebador de región constante 3’ conservada se puede usar para amplificación de PCR de regiones variables de cadena pesada y ligera a partir de un 55 número de anticuerpos murinos (Larrick y col., 1991, Biotechniques 11: 152–156). Se puede usar también una estrategia similar para amplificar regiones variables de cadenas pesada y ligera humanas de anticuerpos humanos

(Larrick y col., 1991, Methods: Companion to Methods in Enzymology 2: 106–110).

Los anticuerpos quiméricos, incluyendo cadenas de inmunoglobulina quiméricas, se pueden producir por técnicas de ADN recombinante conocidas en la técnica. Por ejemplo, un gen que codifica la región constante Fc de una molécula de anticuerpo monoclonal murino (o de otras especies) se digiere con enzimas de restricción para retirar la región que codifica la Fc murina, y la parte equivalente de un gen que codifica la Fc murina, y la parte equivalente de 5 un gen que codifica un región constante de Fc humana se sustituye (véase Robinson y col., Solicitud de Patente Internacional PCT/LUS86/02269; Akira, y col., Solicitud de Patente Europea 184,187; Taniguchi, M., Solicitud de Patente Europea 171,496; Morrison y col., Solicitud de Patente Europea 173,494; Neuberger y col., Solicitud Internacional WO 86/01533; Cabilly y col. Patente de los Estados Unidos N.º 4,816,567; Cabilly y col., Solicitud de Patente Europea 125,023; Better y col. (1988) Science 240: 1041–1043; Liu y col. (1987) PNAS 84: 3439–3443; Liu y 10 col., 1987, J. Immunol. 139: 3521–3526; Sun y col. (1987) PNAS 84: 214–218; Nishimura y col., 1987, Canc. Res. 47: 999–1005; Wood y col. (1985) Nature 314: 446–449; y Shaw y col., 1988, J. Natl Cancer Inst. 80: 1553–1559).

Un anticuerpo o una cadena de inmunoglobulina se pueden humanizar por procedimientos conocidos en la técnica. Los anticuerpos humanizados, incluyendo cadenas de inmunoglobulinas humanizadas, se pueden generar reemplazando secuencias de la región variable Fv que no están implicadas directamente en unión a antígeno con 15 secuencias equivalentes de regiones variables Fv humanas. Los procedimientos generales para generar anticuerpos humanizados se proporcionan por Morrison, S. L., 1985, Science 229: 1202–1207, por Oi y col., 1986, BioTechniques 4: 214 y por Queen y col. US 5,585,089, US 5,693,761 y US 5,693,762. Esos procedimientos incluyen aislar, manipular y expresar las secuencias de ácidos nucleicos que codifican todas o parte de las regiones variables Fv de inmunoglobulinas de al menos una de cadena pesada o cadena ligera. Las fuentes de tal ácido nucleico se conocen 20 bien por aquellos expertos en la técnica y, por ejemplo, pueden obtenerse a partir de un hibridoma que produce un anticuerpo contra un objetivo predeterminado. El ADN recombinante que codifica el anticuerpo humanizado, o fragmentos del mismo, se puede clonar dentro de un vector de expresión apropiado.

Se pueden producir moléculas de anticuerpos humanizados o injertados con CDR o inmunoglobulinas por injerto con CDR o sustitución de CDR, en el que uno, dos o todas los CDR de una cadena de inmunoglobulina se pueden 25 reemplazar. Véanse por ejemplo Patente de los Estados Unidos 5,225,539; Jones y col. 1986 Nature 321 :552–525; Verhoeyan y col. 1988 Science 239:1534; Beidler y col. 1988 J. Immunol. 141: 4053–4060; Winter US 5,225,539. Winter describe un procedimiento de injerto con CDR que puede usarse para preparar los anticuerpos humanizados de la presente invención (Solicitud de Patente del Reino Unido GB 2188638A, presentada el 26 de marzo, 1987; Winter US 5,225,539), los contenidos del cual se incorporan expresamente por referencia. Todas las CDR de un 30 anticuerpo humano particular se pueden reemplazar con al menos una parte de un CDR no humano o solo algunos de los CDR pueden reemplazarse con al menos una parte de un CDR no humano. Sólo es necesario reemplazar el número de CDR requeridos para unión del anticuerpo humanizado a un antígeno predeterminado.

Los anticuerpos monoclonales, quiméricos y humanizados, que se han modificado, por ejemplo, borrando, añadiendo o sustituyendo otras partes del anticuerpo, por ejemplo, la región constante, están también dentro del 35 alcance de la invención. Por ejemplo, un anticuerpo se puede modificar como sigue: (i) eliminando la región constante; (ii) reemplazando la región constante con otra región constante, por ejemplo, una región constante quiere decir incrementar semivida, estabilidad o afinidad del anticuerpo, o una región constante de otra especie o clase de anticuerpo; o (iii) modificando uno o más aminoácidos en la región constante para alterar, por ejemplo, el número de sitios de glicosilación, la función celular efectora, la unión al receptor Fc (FcR), la fijación del complemento, entre 40 otras cosas.

Los procedimientos para alterar una región constante de anticuerpo se conocen en la técnica. Los anticuerpos con función alterada, por ejemplo afinidad alterada por un ligando efector, tal como FcR en una célula, o el componente C1 del complemento C1 se pueden producir reemplazando al menos un residuo de aminoácido en la parte constante del anticuerpo con un residuo diferente (véanse por ejemplo, los documentos EP 388,151 A1, US 5,624,821 y US 45 5,648,260). Se podría describir un tipo de alteraciones similar que si se aplica a la inmunoglobulina murina o de otras especies, reduciría o eliminaría estas funciones.

Por ejemplo, es posible alterar la afinidad de una región de Fc de un anticuerpo (por ejemplo, una IgG, tal como IgG humana) por una unión de FcR (por ejemplo, Fc gamma R1), o por unión de C1q reemplazando el/los residuo(s) especificado(s) con residuo(s) que tienen una funcionalidad apropiada en su cadena lateral, o introduciendo un 50 grupo funcional cargado, tal como glutamato o aspartato, o quizás un residuo aromático no polar tal como fenilalanina, tirosina, triptófano o alanina (véase por ejemplo, el documento US 5,624,821).

Composiciones Farmacéuticas

Los agentes de unión a IL–22, por ejemplo, antagonistas de IL22, (por ejemplo, anticuerpos anti–IL–22 y fragmentos de unión a antígeno de los mismos) se pueden usar como una composición farmacéutica cuando se combinan con 55

un vehículo farmacéuticamente aceptable. Una composición tal puede contener, además de los agonistas o antagonistas de IL–22 y vehículo, diversos diluyentes, cargas, sales, tampones, estabilizadores, solubilizadores y otros materiales bien conocidos en la técnica. El término "farmacéuticamente aceptable" quiere decir un material no tóxico que no interfiere con la efectividad de la actividad biológica de el/los ingrediente(s) activo(s). Las características del vehículo dependerán de la vía de administración. 5

La composición farmacéutica de la invención puede estar en forma de un liposoma en el que se combinan los antagonistas IL–22, además de otros vehículos farmacéuticamente aceptables, con agentes anfipáticos tales como lípidos que existen en forma agregada como micelas, monocapas insolubles, cristales líquidos o capas lamelares que están en solución acuosa. Los lípidos adecuados para la formulación liposomal incluyen, sin limitación, monoglicéridos, diglicéridos, sulfátidos, Iisolecitina, fosfolípidos, saponina, ácidos biliares y similares. La preparación 10 de tales formulaciones liposomales está dentro del nivel de habilidad en la técnica, según se revela, por ejemplo, en la Patente de los E.E.U.U. N.º 4,235,871; en la Patente de los Estados Unidos N.º 4,501,728; en la Patente de los E.E.U.U. N.º 4,837,028; y la Patente de los E.E.U.U. N.º 4,737,323.

En llevar a la práctica el procedimiento de tratamiento o uso de la presente invención, se administra una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista de IL–22 a un sujeto, por ejemplo, mamífero (por ejemplo, un ser 15 humano). Un antagonista de IL–22 puede administrarse de acuerdo con el procedimiento de la invención bien solo o bien en combinación con otras terapias, por ejemplo, agentes antiinflamatorios descritos en más detalle a continuación. Cuando se coadministra con uno o más agentes, un antagonista de IL–22 puede administrarse bien simultáneamente con el segundo agente o bien secuencialmente. Si se administra secuencialmente, el medico que atiende decidirá la secuencia apropiada de administrar un antagonista de IL–22 en combinación con otros agentes. 20

La administración de un antagonista de IL–22 usado en la composición farmacéutica o para practicar el procedimiento de la presente invención se puede llevar a cabo en una diversidad de rutas convencionales, tales como ingestión oral, inhalación, o inyección cutánea, subcutánea, o intravenosa. Se prefiere la administración intravenosa al paciente.

Cuando una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista de IL–22 se administra oralmente, el agente de 25 unión estará en la forma de un comprimido, cápsula, polvo, solución o elixir. Cuando se administra en forma de comprimido, la composición farmacéutica de la invención puede contener adicionalmente un vehículo sólido tal como una gelatina. El comprimido, cápsula, y polvo contiene de aproximadamente el 5 a aproximadamente el 95% de agente de unión, y preferentemente de aproximadamente el 25 a aproximadamente el 90% de agente de unión. Cuando se administra en forma líquida, un vehículo líquido tal como agua, se puede añadir el vehículo líquido tal 30 como agua, petróleo, aceites de origen animal o vegetal tales como aceite de cacahuete, aceite mineral, aceite de soja, o aceite de sésamo o aceites sintéticos. La forma líquida de la composición farmacéutica puede contener adicionalmente solución salina fisiológica, dextrosa u otra solución sacarídica, o glicoles tales como etilenoglicol, propilenoglicol o polietilenoglicol. Cuando se administra en forma líquida, la composición farmacéutica contiene de aproximadamente el 0,5 a aproximadamente el 90% en peso del agente de unión, y preferentemente de 35 aproximadamente del 1 al 50% del agente de unión.

Cuando una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista de IL–22 se administra por inyección intravenosa, cutánea o subcutánea, el agente de unión estará en la forma de una solución acuosa parenteralmente aceptable, libre de pirógenos. La preparación de tales soluciones de proteína parenteralmente aceptables, habiendo debido tener en cuenta pH, isotonicidad, estabilidad y similares, esta dentro del oficio en la técnica. Una composición 40 farmacéutica preferida para inyección intravenosa, cutánea o subcutánea contendría, además de agente de unión un vehículo isotónico tal como Inyección de Cloruro de Sodio, Inyección de Ringer, Inyección de Dextrosa, Inyección de Dextrosa y Cloruro de Sodio, Inyección de Ringer Lactato, u otro vehículo como se conoce en la técnica. La composición farmacéutica de la presente invención puede contener también estabilizadores, conservantes, tampones, antioxidantes, u otro aditivo conocido por los expertos en la técnica. 45

La cantidad de un agente de unión de IL–22 en la composición farmacéutica de la presente invención dependerá de la naturaleza y gravedad de la afección que se está tratando, y de la naturaleza de tratamientos previos que el paciente ha sufrido. En última instancia, el medico que atiende decidirá la cantidad de agente de unión con la que tratar a cada paciente individual. Inicialmente, el medico que atiende administrará dosis bajas del agente de unión y observará la respuesta del paciente. Se pueden administrar dosis más grandes de agente de unión hasta que el 50 efecto terapéutico óptimo se obtiene por el paciente, y en ese punto la dosificación no se incrementa generalmente adicionalmente. Se contempla que las diversas composiciones farmacéuticas usadas para poner en práctica el procedimiento de la presente invención contendrían aproximadamente 0,1 μg a aproximadamente 100 mg de agente de unión de IL–22 por kg de peso corporal.

La duración de terapia intravenosa usando la composición farmacéutica de la presente invención variará, 55 dependiendo de la gravedad de la enfermedad que se está tratando y de la condición y respuesta isiosincrática

potencial de cada paciente individual. Se contempla que la duración de cada aplicación del agente de unión IL–22 estará en el intervalo de 12 a 24 horas de administración intravenosa continua. En última instancia el medico que atiende decidirá la duración apropiada de terapia intravenosa usando la composición farmacéutica de la presente invención.

Usos de Agonistas de IL–22 y de Antagonistas de IL–22 5

IL–22 es una citocina implicada en acciones proinflamatorias, por ejemplo, induciendo una respuesta de fase aguda. Como se describe en detalle en los ejemplos a continuación, IL–22 induce cambios asociados con aquellos causados por citocinas inflamatorias (tales como IL–1 y TNFα), y los inhibidores de IL–22 mejoran los síntomas de artritis reumatoide. Por lo tanto, IL–22, y/o agentes que incrementan niveles de IL–22 o imitan las acciones de IL–22 (y otras moléculas de la presente invención) son útiles como agonistas en ciertas indicaciones clínicas, y los antagonistas de 10 esta molécula son útiles en otras situaciones clínicas, particularmente en aquellas en las que se desea la modulación de un estado inflamatorio. Si el agonista o antagonista es el preferido dependerá de los aspectos particulares de la patología morbosa, tal como los tipos celulares implicados, la naturaleza de los estímulos y el microambiente celular.

Los agonistas de IL–22 humanos incluyen sin limitación proteínas IL–22 humanas y fragmentos de IL–22 humana, 15 mutantes de deleción y mutantes de adición de los mismos, y péptidos y compuestos de moléculas pequeñas que interactúan con el receptor o con otro objetivo al que se dirija la IL–22 humana. Los antagonistas de IL–22 incluyen sin limitación anticuerpos dirigidos contra proteínas IL–22 humanas; formas solubles del receptor u otro objetivo al que se dirija la IL–22 humana; anticuerpos dirigidos al receptor u otro objetivo al que se dirija la IL–22 humana; y los compuestos peptídicos y de moléculas pequeñas que inhiben o interfieren con la interacción de IL–22 humana con 20 su receptor u otro objetivo.

En un aspecto, la invención presenta un procedimiento para inhibir al menos una actividad asociada a IL–22, poniendo en contacto una célula, por ejemplo, una célula epitelial, con un antagonista de IL–22 (por ejemplo, un anticuerpo anti IL–22 o fragmento de unión a antígeno del mismo) en una cantidad suficiente para inhibir la actividad. Los antagonistas de IL–22 (por ejemplo, un anticuerpo neutralizante, como se describe en el presente documento) se 25 pueden administrar también a sujetos para los que se desea la inhibición de una actividad asociada a IL–22 inmune. Estas afecciones incluyen, por ejemplo, enfermedades autoinmunes (por ejemplo, trastornos artríticos), trastornos respiratorios o afecciones inflamatorias. Los solicitantes han mostrado que una reducción de actividad de IL–22 usando un agente neutralizante mejora los síntomas inflamatorios en modelos animales de artritis inducida por colágeno de ratón (CIA) (Ejemplo 9). La expresión de ARNm de IL–22 está regulada por incremento en las zarpas de 30 los ratones con CIA (Ejemplo 10). De acuerdo con ello, los antagonistas se pueden usar para inducir inmunosupresión en vivo, por ejemplo, para tratar o evitar trastornos asociados con IL–22, en un sujeto. Como se usa en el presente documento, el término “sujeto” se desea para incluir animales humanos y no humanos. Los animales humanos preferidos incluyen un paciente humano que tiene un trastorno caracterizado por actividad IL–22 anormal. El término "animales no humanos" de la invención incluye todos los vertebrados, por ejemplo, mamíferos y 35 no mamíferos, tales como primates no humanos, roedores, ovejas, perros, vacas, pollos, anfibios, reptiles, etc.

Ejemplos no limitantes de trastornos asociados a IL–22 que se pueden tratar o evitar incluyen, pero no se limitan a, rechace de transplante, enfermedades autoinmunes (incluyendo, por ejemplo, diabetes mellitus, artritis (incluyendo artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, osteoartritis, artritis soriática), esclerosis múltiple, encefalomielitis, miastenia gravis, lupus eritrematoso sistémico, tiroiditis autoimmune, dermatitis (incluyendo dermatitis atópica y 40 dermatitis eczematosa), Síndrome de Sjogren, enfermedad de Crohn, úlcera aftosa, iritis, conjuntivitis, queratoconjuntivitis, colitis ulcerosa, espondioartropatía, espondilitis anquilosante, asma intrínseca, asma alérgica, lupus eritrematoso cutáneo, escleroderma, vaginitis, proctitis, erupciones de fármacos, reacciones reversas de la lepra, eritema nudoso leproso, uveitis autoinmune, encefalomielitis alérgica, encefalopatía hemorrágica necrotizante aguda, pérdida de audición sensorineural bilateral progresiva, anemia aplásica, mielopatía eritroblástica involutiva, 45 trombocitopenia idiopática, policondritis, granulomatosis de Wegener, hepatitis activa crónica, síndrome de Stevens–Johnson, esprue idiopático, líquen plano, enfermedad de Graves, sarcoidosis, cirrosis biliar primaria, uveitis posterior y fibrosis pulmonar intersticial); trastornos respiratorios, por ejemplo, asma o COPD; afecciones inflamatorias de la piel (por ejemplo, soriasis), hígado (por ejemplo, hepatitis), riñón (por ejemplo, nefritis) y páncreas (por ejemplo, pancreatitis); enfermedad de injerto frente a huésped y alergia tal como, alergia atópica; y cánceres (por ejemplo, 50 tumores de tejidos sólidos o blandos). Los trastornos preferidos que se pueden tratar usando los agentes de unión de la invención incluyen trastornos artríticos (por ejemplo, artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, osteoartritis, artritis soriática, y espondilitis anquilosante (preferentemente, artritis reumatoide)), esclerosis múltiple, diabetes de tipo I, lupus (SLE), IBD, enfermedad de Crohn, COPD, asma, vasculitis, alergia, escleroderma y afecciones inflamatorias de la piel (por ejemplo, soriasis), del hígado (por ejemplo, hepatitis), riñón (por ejemplo, nefritis) y 55 páncreas (por ejemplo, pancreatitis).

En otra realización, se pueden usar antagonistas de IL–22, solos o en combinación con, por ejemplo, otros agentes

terapéuticos como se describen en el presente documento (por ejemplo, antagonistas de TNF) para tratar mieloma múltiple y neoplasras malignas de linfocitos B relacionadas (Brenne, A. y col. (2002) Blood Vol. 99 (10): 3756–3762).

En una realización, los antagonistas de IL–22, por ejemplo, composiciones farmacéuticas de los mismos, se administran en terapia de combinación, es decir, combinados con otros agentes, por ejemplo, agentes terapéuticos que son útiles para tratar afecciones o trastornos patológicos, tales como trastornos inmunitarios e inflamatorios. El 5 término "en combinación" en este contexto significa que los agentes se dan de forma sustancialmente contemporánea, bien simultánea o secuencialmente. Si se dan secuencialmente, en la aparición de la administración del segundo compuesto, el primero de los dos compuestos es preferentemente aún detectable a concentraciones efectivas en el sitio de tratamiento.

Por ejemplo, la terapia de combinación puede incluir uno o más antagonistas de IL–22, por ejemplo, un anticuerpo o 10 un fragmento de unión a antígeno como se describe en el presente documento (por ejemplo, un anticuerpo quimérico, humanizado, humano, o anticuerpo generado in vitro o fragmento de unión a antígeno del mismo) contra IL–22 coformulado con, y/o coadministrado con, uno o más agentes terapéuticos adicionales, por ejemplo, uno o más inhibidores de citocinas y de factores de crecimiento, inmunosuprores, agentes antiinflamatorios, inhibidores metabólicos, inhibidores enzimáticos y/o agentes citotóxicos o citostáticos, como se describen en mayor detalle más 15 adelante. Además, uno o más antagonistas de IL–22 descritos en el presente documento se pueden usar en combinación con dos o más de los agentes terapéuticos descritos en el presente documento.

Tales terapias de combinación pueden utilizar ventajosamente dosificaciones menores de los agentes terapéuticos administrados, evitando así posibles toxicidades o complicaciones asociadas con las diversas monoterapias. Además, los agentes terapéuticos revelados en el presente documento actúan en rutas que difieren de la ruta del 20 receptor de IL–22, y así se esperan para potenciar y/o actuar de forma sinérgica con los efectos de los antagonistas de IL–22. Sin comprometerse con ninguna teoría, los solicitantes creen que IL–22 puede ejercer sus efectos inflamatorios localmente, por ejemplo, actuando como un amplificador o un regulador de inflamación tisular como opuesto a la inflamación sistémica. La opinión de los solicitantes está basada, al menos en parte, en el hallazgo de que la expresión de IL–22R parece estar localizada en sitios de tejidos más que en células inmunes circulantes. 25

De acuerdo con ello, la inhibición de la actividad de IL–22, usando, por ejemplo, un anticuerpo anti–IL22 o un fragmento del mismo descrito en el presente documento, puede proporcionar una actividad antiinflamatoria más efectiva, específica de tejido que las modalidades antiinflamatorias sistémicas como se describe en el presente documento. Además, la inhibición de la actividad local de IL–22 usando, por ejemplo, un anticuerpo anti–IL22 o fragmento del mismo descrito en el presente documento, puede proporcionar un candidato útil para combinación con 30 modalidades antiinflamatorias sistémicas descritas en el presente documento.

En una realización, uno o más antagonistas de IL–22 descritos en el presente documento pueden coformularse con, o coadministrarse con, uno o más agentes adicionales tales como otros antagonistas de citocinas o antagonistas de factores de crecimiento (por ejemplo, receptores solubles, inhibidores peptídicos, moléculas pequeñas, fusiones de ligandos); o anticuerpos o fragmentos de unión a antígenos de los mismos que se unen a otros objetivos (por 35 ejemplo, anticuerpos que se unen a otras citocinas o factores de crecimiento, sus receptores, u otras moléculas de la superficie celular); y citocinas antiinflamatorias o antagonistas de las mismas. Ejemplos no limitantes de los agentes que se pueden usar en combinación con los antagonistas de IL–22 descritos en el presente documento, incluyen, pero no se limitan a, antagonistas de una o mas interleucinas (IL) o sus receptores, por ejemplo, antagonistas de IL–1, IL–2, IL–6, IL–7, IL–8, IL–12, IL–13, IL–15, IL–16, IL–18 e IL–21/IL–21R; antagonistas de citocinas o factores de 40 crecimiento o sus receptores, tales como factor de necrosis tumoral (TNF), LT, EMAP–II, GM–CSF, FGF y PDGF. Los antagonistas de IL–22 pueden combinarse también con inhibidores de, por ejemplo, anticuerpos para, moléculas de superficie celular tales como CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD90, o sus ligandos, incluyendo CD154 (gp39 o CD4OL), o LFA–1/ICAM–1 y VLA–4/VCAM–1 (Yusuf–Makagiansar H. y col. (2002) Med Res Rev 22 (2): 146–67). Los antagonistas preferidos que se pueden usar en 45 combinación con antagonistas de IL–22 descritos en el presente documento incluyen antagonistas de IL–1, IL–12, TNFα, IL–15, IL–17, IL–18 e IL–21/IL–21R.

Ejemplos de esos agentes incluyen antagonistas de IL–12, tales como anticuerpos quiméricos, humanizados, humanos o generados in vitro (o fragmentos de unión a antígenos de los mismos) que se unen a IL–12 (preferentemente IL–12 humana), por ejemplo, el anticuerpo descrito en el documento WO 00/56772, Genetics 50 Institute/BASF); inhibidores de receptor IL–12, por ejemplo, anticuerpos para receptor de IL–12 humano, y fragmentos solubles del receptor IL–12, por ejemplo, receptor de IL–12 humano. Ejemplos de antagonistas de IL–15 incluyen anticuerpos (o fragmentos de unión a antígeno) frente a IL–15 o su receptor, por ejemplo, anticuerpos quiméricos, humanizados, humanos o anticuerpos generados in vitro para IL–15 humana o su receptor, fragmentos solubles del receptor de IL–15 y proteínas de unión a IL–15. Ejemplos de antagonistas IL–18 incluyen anticuerpos, por 55 ejemplo, quiméricos, humanizados, humanos o generados in vitro (o fragmentos de unión a antígeno de los mismos), para IL–18 humana, fragmentos solubles de receptor de IL–18 y proteínas de unión a IL–18 (IL–18BP, Mallet

y col. (2001) Circ. Res. 28). Ejemplos de antagonistas de IL–1 incluyen inhibidores de enzima conversora de interleucina–1 (ICE), tales como Vx740, antagonistas de IL–1, por ejemplo, IL–1RA (ANIKINRA, AMGEN), sIL1RII (Immunex) y anticuerpos anti–receptor de IL–1 (o fragmentos de unión a antígenos de los mismos).

Ejemplos de los antagonistas de TNF incluyen anticuerpos quiméricos, humanizados, humanos o generados in vitro (o fragmentos de unión a antígeno de los mismos) para TNF (por ejemplo, TNFα humano), tal como D2E7, 5 (anticuerpo anti–TNFα humano, documento U.S. 6,258,562; BASF), CDP–571/CDP–870/BAY–10–3356 (anticuerpo anti–TNFα humanizado; Celltech/Pharmacia), cA2 (anticuerpo anti–TNFα quimérico; RemicadeTM, Centocor); fragmentos de anticuerpos anti–TNF (por ejemplo, CPD870); fragmentos solubles de los receptores de TNF, por ejemplo, receptores de TNF humanos p55 o p75 o derivados de los mismos, por ejemplo 75 kdTNFR–IgG (proteína de fusión de receptor de TNF–IgG de 75 kD, EnbrelTM; Immunex; véase por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1994) 10 Vol. 37, S295; J. Invest. Med. (1996) Vol. 44, 235A), p55 kdTNFR–IgG (proteína de fusión de receptor de TNF–IgG de 55 kD (Lenercept)); antagonistas de enzimas, por ejemplo, inhibidores de enzima conversora de TNFα (TACE) (por ejemplo, un derivado de ácido alfo–sulfonil–hidroxámico, documento WO 01/55112 e inhibidor TACE de N–hidroxiformamida GW 3333, –005, o –022); y TNF–bp/s–TNFR (proteína de unión a TNF soluble; véase por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, N.º 9 (suplemento), S284; Amer. J. Physiol.– Heart and Circulatory Physiology 15 (1995) Vol. 268, páginas 37–42). Los antagonistas de TNF preferidos son fragmentos solubles del receptor de TNF, por ejemplo, receptores de TNF humanos p55 o p75 o derivados de los mismos, por ejemplo, 75 kdTNFR–IgG e inhibidores de una enzima conversora de TNFα (TACE).

En otras realizaciones, los antagonistas de IL–22 descritos en el presente documento se pueden administrar en combinaciones con uno o más de los siguientes: antagonistas de IL–13, por ejemplo, receptores de IL–13 solubles 20 (sIL–13) y/o anticuerpos contra IL–13; antagonistas de IL–2, por ejemplo, DAB 486–IL–2 y/o DAB 389–IL–2 (proteínas de fusión a IL–2; Seragen; véase por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1993) Vol. 36, 1223), y/o anticuerpos para IL–2R, por ejemplo anti–Tac (anti–IL–2R humanizado; Protein Design Labs, Cancer Res. 1990 Mar 1; 50 (5): 1495–502). Aún otra combinación incluye antagonistas de IL–21 en combinación con inhibidores anti–CD4 inagotables (IDEC–CE9.1/SB 210396 (anticuerpo anti–CD4 primatizado inagotable; IDEC/SmithKIine)). Aún otras combinaciones 25 preferidas incluyen antagonistas de la vía coestimuladora CD80 (B7.1) o CD86 (B7.2) incluyendo anticuerpos, receptores solubles o ligandos antagonistas; así como ligando glicoproteico de p–selectina (PSGL), citocinas antiinflamatorias, por ejemplo, IL–4 (ADNX/Schering); IL–10 (SCH 52000; ADNX de IL–10 recombinante/Schering); IL–13 y TGFB y agonistas del mismo (por ejemplo, anticuerpos agonistas).

En otras realizaciones, uno o más antagonistas de IL–22 se pueden coformular con, y/o coadministrar con, uno o 30 más fármacos anti–inflamatorios, inmunosupresores, o inhibidores metabólicos o enzimáticos. Ejemplos no limitantes de los fármacos o inhibidores que se pueden usar en combinación con los antagonistas de IL–2 descritos en el presente documento, incluyen, pero no se limitan a, uno o más de: fármaco(s) antiinflamatorio(s) no esteroideo(s) (NSAID), por ejemplo, ibuprofeno, Tenidap (véase por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, N.º 9 (suplemento), S280)), Naproxeno (véase por ejemplo, Neuro Report (1996) Vol. 7, páginas 1209–1213), Meloxicam, 35 Piroxicam, Diclofenaco, e Indometacina; Sulfasalazina (véase por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, N.º 9 (suplemento), S281); corticosteroides tales como prednisolona; fármaco(s) antiinflamatorio(s) supresor(es) de citocinas (CSAID); inhibidores de biosíntesis de nucleótidos, por ejemplo, inhibidores de biosíntesis de purinas, antagonistas de folato (por ejemplo, metotrexato de ácido (N–[4–[[(2,4–diamino–6–pteridinil)meti|]metilamino]benzoi|]–L–glutámico)); e inhibidores de biosíntesis de pirimidina, por ejemplo, inhibidores de dihidroorotato deshidrogenasa 40 (DHODH) (por ejemplo, Ieflunomida (véase por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, N.º 9 (suplemento), S131; Inflammation Research (1996) Vol. 45, páginas 103–107). Los agentes terapéuticos preferidos para usar en combinación con antagonistas de IL–22 incluyen NSAID, CSAID, inhibidores de (DHODH) (por ejemplo, Ieflunomida) y antagonistas de folato (por ejemplo, metotrexato).

Ejemplos de inhibidores adicionales incluyen uno o más de: corticosteroides (orales, inhalados y de inyección local); 45 inmunosupresores, por ejemplo, ciclosporina, tacrolimus (FK–506); e inhibidores de mTOR, por ejemplo, sirolimus (rapamicina) o derivados de rapamicina, por ejemplo, derivados de rapamicina solubles (por ejemplo, derivados de éster de rapamicina, por ejemplo, CCI–779 (Elit. L. (2002) Current Opinion Investig. Drugs 3 (8): 1249–53; Huang, S. y col. (2002) Current Opinion Investig. Drugs 3 (2): 295–304); agentes que interfieren con señalización por citocinas proinflamatorias tales como TNFα o IL–1 (por ejemplo inhibidores de IRAK, NIK, IKK, p3B o MAP quinasa); 50 inhibidores de COX2, por ejemplo, celecoxib y variantes de los mismos, MK–966, véase por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, N.º 9 (suplemento), S81; inhibidores de fosfodiesterasa, por ejemplo, R973401 (inhibidor de Tipo IV de fosfodiesterasa; véase, por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, N.º 9 (suplemento), S282)); inhibidores de fosfolipasa, por ejemplo, inhibidores de fosfolipasa citosólica 2 (cPLA2) (por ejemplo, análogos de trifluorometilcetona (documento U.S. 6,350,892)); inhibidores de factor de crecimiento de 55 células endoteliales vasculares o receptor de factor de crecimiento, por ejemplo, inhibidor de VEGF y/o inhibidor de VEGF–R; e inhibidores de angiogénesis. Agentes terapéuticos preferidos para usar en combinación con inmunosupresores antagonistas de IL–22, por ejemplo, ciclosporina, tacrolimus (FK–506); e inhibidores de mTOR,

por ejemplo, sirolimus (rapamicina) o derivados de rapamicina, por ejemplo, derivados de rapamicina solubles (por ejemplo, derivados de éster de rapamicina, por ejemplo, CCI–779; inhibidores de COX2, por ejemplo, celecoxib y variantes de los mismos; e inhibidores de fosfolipasa, por ejemplo, inhibidores de fosfolipasa citosólica 2 (cPLA2) (por ejemplo, análogos de trifluorometilcetona).

Ejemplos adicionales de agentes terapéuticos que se pueden combinar con un antagonista de IL–22 incluyen uno o 5 más de: 6–mercaptopurinas (6–MP); azatioprina sulfasalazina; mesalazina; olsalazina cloroquinina/hidroxicloroquina; pencilamina; aurotiomalato (intramuscular y oral); azatioprina; cochicina; agonistas de adrenorreceptor beta–2 (salbutamol, terbutalina, salmeteral); xantinas (teofilina, aminofilina); cromoglicato; nedocromil; ketotifeno; ipratropio y oxitropio; micofenolato de mofetilo; agonistas de adenosina; agentes antitrombóticos; inhibidores del complemento; y agentes antiadrenérgicos. 10

El uso de los antagonistas de IL–22 revelados en el presente documento en combinación con otros agentes terapéuticos para tratar o evitar trastornos inmunes específicos se discute en detalle adicional más adelante.

Ejemplos no limitantes de agentes para tratar o evitar trastornos artríticos (por ejemplo artritis reumatoide, artritis inflamatoria, artritis reumatoide juvenil, osteoartritis y artritis soriática), con los que se pueden combinar antagonistas de IL–22 incluyen uno o más de los siguientes: antagonistas de IL–12 como se describen en el presente documento, 15 NSAID; CSAID; TNF, por ejemplo, TNFa, antagonistas como se describen en el presente documento; anticuerpos anti–CD4 inagotables como se describen en el presente documento; antagonistas de IL–2 como se describen en el presente documento; citocinas antiinflamatorias, por ejemplo, IL–4, IL–10, IL–13 y TGFa, o agonistas de los mismos; antagonistas de IL–1 o antagonistas de receptor de IL–1 como se describen en el presente documento); inhibidores de fosfodiesterasa como se describen en el presente documento; inhibidores de COX–2 como se describen en el 20 presente documento; Iloprost (véase por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, N.º 9 (suplemento), S82); metotrexato; talidomida (véase por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, N.º 9 (suplemento), S282) y fármacos relacionados con la talidomida (por ejemplo, Celgen); Ieflunomida; inhibidor de activación de plasminógeno, por ejemplo, ácido tranexámico; véase por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, N.º 9 (suplemento), S284); inhibidor de citocina, por ejemplo, T–614; véase por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) 25 Vol. 39, N.º 9 (suplemento), S282); prostaglandina E1 (véase por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, N.º 9 (suplemento), S282); azatioprina (véase por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1 996) Vol. 39, N.º 9 (suplemento), S281); un inhibidor de enzima conversora de interleucina–1 (ICE); inhibidor zap–70 y/o inhibidor 1ck (inhibidor de la tirosina quinasa zap–70 o Ick); un inhibidor de factor de crecimiento cellular endotelial vascular o receptor de factor de crecimiento celular endotelial vascular como se describe en el presente documento; un inhibidor de angiogenesis 30 como se describe en el presente documento; fármacos antiinflamatorios corticosteroides (por ejemplo, SB203580); inhibidores de TNF–convertasa; interleucina–11 (véase por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, N.º 9 (suplemento), S296); interleucina–13 (véase por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, N.º 9 (suplemento), S308); inhibidores de interleucina–17 (véase por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, N.º 9 (suplemento), S120); oro; penicilamina; cloroquina; hidroxicloroquina; clorambucilo; ciclofosfamida; ciclosporina; irradiación linfoide 35 total; globulina anti–timocitos; CD5–toxinas; péptidos y colágeno administrados oralmente; Iobenzarit disódico; Agentes Reguladores de Citocinas (CRA) HP228 y HP466 (Houghten Pharmaceuticals, Inc.); oligodeoxinucleótidos de fosforotioato antisentido ICAM–1 (ISIS 2302; Isis Pharmaceuticals, Inc.); receptor del complemento soluble 1 (TP10; T Cell Sciences, Inc.); prednisona; orgoteína; polisulfato de glicosaminoglicano; minociclina; anticuerpos anti–IL2R; lípidos marinos y botánicos (ácidos grasos de semillas de plantas y de peces; véase por ejemplo, DeLuca y 40 col. (1995) Rheum. Dis. Clin. North Am. 21: 759–777); auranofina; fenilbutazona; ácido meclofenámico; ácido flufenámico; inmunoglobulina intravenosa; zileutón; ácido micofenólico (RS–61443); tacrolimus (FK–506); sirolimus (rapamicina); amiprilosa (terafectina); cladribina (2–clorodeoxiadenosina); y azaribina. Las combinaciones preferidas incluyen uno o más antagonistas de IL–21 en combinación con metotrexato o leflunomida y en casos de artritis reumatoide moderada o grave, ciclosporina. 45

Los ejemplos preferidos de inhibidores para usar en combinación con antagonistas de IL–22 para tratar trastornos artríticos incluyen antagonistas de TNF (por ejemplo, anticuerpos quiméricos, humanizados, humanos o generados in vitro, o fragmentos de unión a antígenos de los mismos, que se unen a TNF; fragmentos solubles de un receptor de TNF, por ejemplo, receptor de TNF humano p55 o p75 o derivados de los mismos, por ejemplo, 75 kdTNFR–IgG (proteína de fusión de receptor–IgG de TNF de 75 kD, Enbrelml, proteína de fusión receptor de TNF p55 kD–IgG; 50 antagonistas enzimáticos de TNF, por ejemplo, inhibidores de enzima conversora de TNFa (TACE)); antagonistas de IL–12, IL–15, IL–17, IL–18, IL–21/IL–21R; agentes que reducen las linfocitos T y las linfocitos B (por ejemplo, anticuerpos anti–CD4 o anti–CD22); inhibidores de moléculas pequeñas, por ejemplo, metotrexato y Ieflunomida; sirolimus (rapamicina) y análogos de los mismos, por ejemplo, inhibidores CCI–779; Cox–2 y cPLA2; NSAID; inhibidores de p38, TPL–2, inhibidores de Mk–2 y de NFkb; RAGE o RAGE soluble; inhibidores de P–selectina o de 55 PSGL–1 (por ejemplo, inhibidores de moléculas pequeñas, anticuerpos para éstas, por ejemplo, anticuerpos para P–selectina); agonistas de receptor de estrógenos beta (ERB) o antagonistas de ERB–NFkB. Los agentes terapéuticos adicionales más preferidos que se pueden coadministrar y/o coformular con uno o más antagonistas de IL–22

incluyen uno o más de: un fragmento soluble de un receptor de TNF, por ejemplo, receptor de TNF p55 o p75 o derivados de los mismos, por ejemplo, 75 kdTNFR–IgG (proteína de fusión de receptor de TNF de 75 kD–IgG, Enbrel™); metotrexato, Ieflunomida, o un sirolimus (rapamicina) o un análogo del mismo, por ejemplo, CCI–779.

Ejemplos no limitantes de agentes para tratar o evitar esclerosis múltiple con la que se pueden combinar antagonistas de IL–22 incluyen los siguientes: interferones, por ejemplo, interferón–aIfa1α (por ejemplo, Avonex™; 5 Biogen) e interferón–1β (Betaseron™; Chiron/Berlex); Copolímero 1 (Cop–1; Copaxone™; Teva Pharmaceutical Industries, Inc.); oxígeno hiperbárico; inmunoglobulina intravenosa; clabribina; antagonistas de TNF como se describen en el presente documento; corticosteroides; prednisolona; metilprednisolona; azatioprina; ciclofosfamida; ciclosporina; metotrexato; 4–aminopiridina; y tizanidina. Los antagonistas adicionales que se pueden usar en combinación con IL–22 incluyen anticuerpos para o antagonistas de otras citocinas humanas o de otros factores de 10 crecimiento, por ejemplo, TNF, LT, IL–1, IL–2, IL–6, IL–7, IL–8, IL–12 IL–15, IL–16, IL–18, EMAP–11, GM–CSF, FGF y PDGF. Los antagonistas de IL–21 como se describen en el presente documento pueden combinarse con anticuerpos para moléculas de la superficie celular tales como CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80, CD86, CD90 o sus ligandos. Los antagonistas de IL–22 se pueden combinar también con agentes, tales como metotrexato, ciclosporina, FK506, rapamicina, micofenolato de mofetilo, Ieflunomida, NSAID, por ejemplo, 15 ibuprofeno, corticosteroides tales como prednisolona, inhibidores de fosfodiesterasa, agonistas de adenosina, agentes antitrombóticos, inhibidores del complemento, agentes adrenérgicos, que interfieren con señalización por citocinas proinflamatorias como se describe en el presente documento, inhibidores de enzimas de conversión de IL–Iβ (por ejemplo, Vx740), anti–P7, PSGL, inhibidores TACE, inhibidores de señalización de linfocitos T tales como inhibidores de quinasas, inhibidores de Ioproteinasa metálica, sulfasalazina, azatioprina, 6–mercaptopurinas, 20 inhibidores de enzima conversora de angiotensina, receptores de citosina solubles y derivados de los mismos, como de describen en el presente documento, y citocinas antiinflamatorias (por ejemplo IL–4, IL– 10, IL–13 y TGF).

Los ejemplos preferidos de agentes terapéuticos para esclerosis múltiple con la que los antagonistas de IL–22 se pueden combinar incluyen interferón–B, por ejemplo, IFNb–1α e IFNb–1β; copaxona, corticosteroides, inhibidores de IL–I, inhibidores de TNF, anticuerpos para ligando CD40 y CD40, antagonistas de IL–12. 25

Ejemplos no limitantes de agentes para tratar o evitar enfermedad inflamatoria del intestino con los que se puede combinar un antagonista de IL–22 incluyen los siguientes: budenosida; factor de crecimiento epidérmico; corticosteroides; ciclosporina, sulfasalazina; aminosalicilatos; 6–mercaptopurina; azatioprina; metronidazol; inhibidores de Iipoxigenasa; mesalamina; olsalazina; balsalazida; antioxidantes; inhibidores de tromboxano; antagonistas de receptor IL–1; anticuerpos monoclonales anti–IL–1; y anticuerpos monoclonales IL–6; factores de 30 crecimiento; inhibidores de elastasa; compuestos de piridinil–imidazol; antagonistas de TNF como de describen en el presente documento; IL–4, IL–10, IL– 13 y/o citocinas de TGFB o agonistas de los mismos (por ejemplo, anticuerpos agonistas); interleucina–11; profármacos conjugados con glucuronida– o conjugados con dextrano de prednisolona, dexametasona o budesonida; oligonucleótidos de fosforotioato antisentido de ICAM–1 (ISIS 2302; Isis Pharmaceuticals, Inc.); receptor del complemento soluble 1 (TP10; T Cell Sciences, Inc.); mesalazina de liberación 35 lenta; metotrexato; antagonistas de Factor Activador de Plaquetas (PAF); ciprofloxacina; y lignocaína.

En una realización, se pueden usar antagonistas de IL–22 en combinación con uno o más anticuerpos digiridos a otros objetivos implicados en regular respuestas inmunes, por ejemplo, rechazo de transplante o enfermedad de injerto frente a hospedador. Ejemplos no limitantes de agentes para tratar o evitar respuestas inmunes con las que se puede combinar un antagonista de IL–21/IL21 R de la invención incluyen los siguientes: anticuerpos contra 40 moléculas de superficie celular, incluyendo pero no limitadas a CD25 (receptor–α de interleucina–2), CD11a (LFA–1), CD54 (ICAM–1), CD4, CD45, CD28/CTLA4, CD80 (B7–1) y/o CD86 (B7–2). En aún otra realización, se usa un antagonista de IL–22 en combinación con uno o más agentes inmunosupresores generales, tales como ciclosporina A o FK506.

Otro aspecto de la presente invención de acuerdo con ello se refiere a kits para llevar a cabo la administración 45 combinada de los antagonistas de IL–22 con otros compuestos terapéuticos. En una realización, el kit comprende uno o más agentes de unión formulados en un vehículo farmacéutico, y al menos un agente, por ejemplo, agente terapéutico, formulado según sea apropiado, en una o más preparaciones farmacéuticas separadas.

Ensayos Diagnósticos

Un procedimiento ejemplar para detectar la presencia o ausencia de proteína IL–22 o ácido nucleico de IL–22 en una 50 muestra biológica implica obtener una muestra biológica a partir de un sujeto de prueba y poner en contacto la muestra biológica con un compuesto o un agente capaz de detectar la proteína IL–22 o el ácido nucleico de IL–22 (por ejemplo, ARNm, ADN genómico) que codifica la proteína IL–22 de tal forma que la presencia de proteína IL–22 o ácido nucleico de IL–22 se detecta en la muestra biológica. Un agente preferido para detector ARNm de IL–22 o ADN genómico de IL–22 es una sonda de ácidos nucleicos marcada capaz de hibridar con ARNm de IL–22 o con ADN 55 genómico de IL–22. La sonda de ácido nucleico puede ser, por ejemplo, un ácido nucleico de IL–22 de longitud total,

tal como el ácido nucleico de SEC ID Nº: 1, 5 o un fragmento o parte de un ácido nucleico de IL–22 tal como un oligonucleótido de al menos 15, 30, 50, 100, 250 ó 500 nucleótidos en longitud y puede ser suficiente para hibridar específicamente en condiciones restrictivas con ARNm de IL–22 o ADN genómico. Otras sondas adecuadas para usar en los ensayos diagnósticos de la invención se describen en el presente documento.

Un agente preferido para detectar proteína IL–22 es un anticuerpo capaz de unión a proteína IL–22, preferentemente 5 un anticuerpo con una marca detectable. Los anticuerpos pueden ser policlonales, o más preferentemente, monoclonales. Se puede usar un anticuerpo intacto, o un fragmento del mismo (por ejemplo, Fab o F(ab’)2). El término "marcado", con respecto a la sonda o anticuerpo, se desea para abarcar marcado directo de la sonda o anticuerpo acoplando (es decir, uniendo físicamente) una sustancia detectable a la sonda o anticuerpo, así como marcado indirecto de la sonda o anticuerpo por reactividad con otro reactivo que se marca directamente. Ejemplos 10 de marcado indirecto incluyen detección de un anticuerpo primario usando un anticuerpo secundario marcado fluorescentemente y marcado en un extremo de una sonda de ADN con biotina tal que se puede detectar con estreptavidina marcado fluorescentemente. El término "muestra biológica" se desea para incluir tejidos, células y fluidos biológicos aislados de un sujeto, así como tejidos, células y fluidos presentes en un sujeto. Es decir, el procedimiento de detección de la invención se puede usar para detectar ARNm de IL–22, proteína Il–22, o ADN 15 genómico de IL–22 en una muestra biológica in vitro así como en vivo. Por ejemplo, las técnicas in vitro para detección de mRMNa de IL–22 incluyen hibridaciones Northern e hibridaciones in situ. Las técnicas in vitro para detección de proteína IL–22 incluyen ensayos inmunoabsorbentes unidos a enzima (ELISA), transferencias de Western, inmunoprecipitaciones e inmunofluorescencia. Las técnicas in vitro para detección del ADN genómico de IL–22 incluyen hibridaciones de Southern. Además, las técnicas en vivo para detección de proteína IL–22 incluyen 20 introducir dentro de un sujeto un anticuerpo anti–IL–22 marcado. Por ejemplo, al anticuerpo puede marcarse con un marcador radioactivo cuya presencia y localización en un sujeto se puede detectar por técnicas de formación de imágenes estándar.

En una realización, la muestra biológica contiene moléculas proteicas del sujeto de ensayo. Alternativamente, la muestra biológica puede contener moléculas de ARNm del sujeto de ensayo o moléculas de ADN genómico del 25 sujeto de ensayo. Una muestra biológica preferida es una muestra de suero aislada por medios convencionales a partir de un sujeto.

En otra realización, los procedimientos implican adicionalmente obtener una muestra biológica control a partir de un sujeto control, poniendo en contacto el sujeto control con un compuesto o agente capaz de detectar proteína IL–22, ARNm, o ADN genómico de IL–22, tal que la presencia de proteína IL–22, ARNm o ADN genómico de IL–22 se 30 detecta en la muestra biológica con la presencia de la proteína IL–22, el ARNm o el ADN genómico de IL–22 en la muestra de prueba. La invención también comprende kits para detector la presencia de IL–22 en una muestra biológica. Por ejemplo, el kit puede comprender un compuesto o agente marcado (por ejemplo, sonda o anticuerpo) capaz de detectar la proteína IL–22 o el ARNm de IL–22 en una muestra biológica; medios para determinar la cantidad de IL–22 en la muestra; y medios para comparar la cantidad de IL–22 en la muestra con un estándar. El 35 compuesto o agente puede estar envasado en un recipiente adecuado. El kit puede comprender adicionalmente instrucciones para usar el kit para detectar la proteína IL–22 o el ácido nucleico.

Ensayos de Exploración

Los antagonistas descritos en el presente documento se pueden usar en ensayos para determinar actividad biológica, incluyéndose en un panel de proteínas múltiples para exploración de alto rendimiento; para generar 40 anticuerpos o para facilitar otra respuesta inmune; como un reactivo (incluyendo el reactivo marcado) en ensayos designados para determinar cuantitativamente niveles de la proteína (o su receptor) en fluidos biológicos; como marcadores para tejidos en los que la proteína correspondiente se expresa preferentemente (bien constitutivamente o en una fase particular de diferenciación tisular o de desarrollo tisular o en un estado morboso), y, por supuesto, para aislar receptores o ligandos correlativos. Los procedimientos descritos en las reivindicaciones adjuntas se 45 pueden usar para rastrear en busca de péptido o de inhibidores o agonistas de moléculas pequeñas de la interacción de unión.

Cualesquiera o todas de estas utilidades de investigación son capaces de administrarse en calidad de reactivo o formato de kit para comercialización como productos de investigación.

Los procedimientos para llevar a cabo los usos enumerados anteriormente se conocen bien por aquellos expertos en 50 la técnica. Las referencias que revelan tales procedimientos incluyen sin limitación "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Sambrook, J., E.F. Fritsch y T. Maniatis eds., 1989, y "Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques", Academic Press, Berger, S.L. y A.R. Kimmel eds., 1987.

La actividad de IL–22 y anticuerpos de la invención puede, entre otros medios, medirse por los siguientes 55

procedimientos:

Ensayos adecuados para citotoxicidad de timocitos o esplenocitos incluyen, sin limitación, aquellos descritos en: Current Protocols in Immunology, Ed por J. E. Coligan, A.M. Kruisbeek, D.H. Margulies, E.M. Shevach, W Strober, Pub. Greene Publishing Associates y Wiley–Interscience (Capítulo 3, In Vitro assays for Mouse Lymphocyte Function 3.1–3.19; Capítulo 7, Immunologic studies in Humans); Herrmann y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2488–2492, 5 1981; Herrmann y col., J. Immunol. 128: 1968–1974, 1982; Handa y col., J. Immunol. 135: 1564–1572, 1985; Takai y col., J. Immunol. 137: 3494–3500,1986; Takai y col., J. Immunol. 140: 508–512, 1988; Herrmann y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2488–2492,1981; Herrmann y col., J. Immunol. 128: 1968–1974, 1982; Handa y col., J. Immunol. 135: 1564–1572, 1985; Takai y col., J. Immunol. 137: 3494–3500, 1986; Bowman y col., J. Virology 61: 1992–1998; Takai y col., J. Immunol. 140: 508–512, 1988; Bertagnolli y col., Cellular Immunology 133: 327–341, 1991; Brown y 10 col., J. Immunol. 153: 3079–3092, 1994.

Ensayos para respuestas de inmunoglobulinas dependientes de linfocitos T y activación/desactivación de isotipos (que identificarán, entre otras cosas, proteínas que modulan las respuestas de anticuerpos dependientes de linfocitos T y que afectan a los perfiles de Th1/Th2) incluyen, sin limitación, aquellos descritos en: Maliszewski, J. Immunol. 144: 3028–3033, 1990; y Ensayos para function de linfocitos B: In vitro antibody production, Mond, J.J. y 15 Brunswick, M. In Current Protocols in Immunology. J.E.e.a. Coligan eds. Vol 1 páginas 3.8.1–3.8.16, 10 John Wiley y Sons, Toronto. 1994.

Ensayos de reacción de linfocitos mixtos (MLR) (que identificarán, entre otras, proteínas que generan predominantemente respuestas de Th1 y CTL) incluyen, sin limitación, aquellos descritos en: Current Protocols in Immunology, Ed por J. E. Coligan, A.M. Kruisbeek, D.H. Margulies, E.M. Shevach, W Strober, Pub. Greene 20 Publishing Associates and Wiley–Interscience (Capítulo 3, In Vitro assays for Mouse Lymphocyte Function 3.1–3.19; Capítulo 7, Immunologic studies in Humans); Takai y col., J. Immunol. 137: 3494–3500,1986; Takai y col., J. Immunol. 140: 508–512, 1988; Bertagnolli y col., J. Immunol. 149: 3778–3783, 1992.

Ensayos dependientes de células dendríticas (que identificarán, entre otras, proteínas expresadas por células dendríticas que activan linfocitos T que no han sido tratados previamente) incluyen, sin limitación, aquellos descritos 25 en: Guery y col., J. Immunol. 134: 536–544, 1995; Inaba y col., Journal of Experimental Medicine 173: 549–559, 1991; Macatonia y col., Journal of Immunology 154: 5071–5079, 1995; Porgador y col., Journal of Experimental Medicine 182: 255–260, 1995; Nair y col., Journal of ViroIogy 67: 4062–4069, 1993; Huang y col., Science 264: 961–965, 1994; Macatonia y col., Journal of Experimental Medicine 169: 1255–1264, 1989; Bhardwaj y col., Journal of Clinical Investigation 94: 797–807, 1994; e Inaba y col., Journal of Experimental Medicine 172: 631–640,1990. 30

Los ensayos para supervivencia/apoptosis de linfocitos (que identificarán, entre otros, proteínas que evitan apoptosis después de inducción de de superantígenos y proteínas que regulan homeostasis de linfocitos) incluyen, sin limitación, aquellos descritas en: Darzynkiewicz y col., Cytometry 13: 795–808, 1992; Gorczyca y col., Leukemia 7: 659–670, 1993; Gorczyca y col., Cancer Research 53: 1945–1951, 1993; Itoh y col., Cell 66: 233–243, 1991; Zacharchuk, Journal of Immunology 145: 4037–4045, 1990; Zamai y col., Cytometry 14: 891–897, 1993; Gorczyca y 35 col., International Journal of Oncology 1: 639–648, 1992.

Ensayos para proteínas que influyen las etapas tempranas de determinación y desarrollo de linfocitos T, incluyen, sin limitación, aquellos descritos en: Antica y col., Blood 84: 111–117, 1994; Fine y col., Cellular Immunology 155: 111–122, 1994; Galy y col., Blood 85: 2770–2778, 1995; Toki y col., Proc. Nat. Acad Sci. USA 88: 7548–7551, 1991.

Se ponen a prueba agentes moduladores identificados por los ensayos de exploración descritos anteriormente en un 40 modelo animal apropiado, por ejemplo, para determinar la eficacia, la toxicidad, o los efectos secundarios de tratamiento con un agente tal. Alternativamente, se ponen a prueba los agentes moduladores en al menos uno de los ensayos in vitro o in situ descritos en el presente documento.

Ensayo de Efectos de Agonistas y Antagonistas de IL–22

La actividad de un agonista o antagonista de IL–22 se puede medir por los procedimientos siguientes: 45

Los ensayos para proliferación de linfocitos T o timocitos incluyen pero no se limitan a aquellos descritos en: Current Protocols in Immunology, Ed por J. E. Coligan, A.M. Kruisbeek, D.H. Margulies, E.M. Shevach, W Strober, Pub. Greene Publishing Associates y Wiley–Interscience (Capítulo 3, In Vitro assays for Mouse Lymphocyte Function 3.1–3.19; Capítulo 7, Immunologic studies in Humans); Takai y col., J. Immunol. 137: 3494–3500, 1986; Bertagnolli y col., J. Immunol. 145: 1706–1712, 1990; Bertagnolli y col., Cellular Immunology 133: 327–341, 1991; Bertagnolli, y col., J. 50 Immunol. 149: 45 3778–3783, 1992; Bowman y col., J. Immunol. 152: 1756–1761, 1994.

Los ensayos para producción de citocinas y/o proliferación de células del bazo, células de los nódulos linfáticos o timocitos incluyen, sin limitación, aquellos descritos en: Polyclonal T cell stimulation, Kruisbeek, A.M. y Shevach,

E.M. In Current Protocols in Immunology. J.E. Coligan eds. Vol 1 páginas 3.12.1–3.12.14, John Wiley and Sons, Toronto. 1994; y Measurement of mouse and human Interferon y, Schreiber, R.D. In Current Protocols in Immunology. J.E. Coligan eds. Vol 1 páginas 3.12.1–6.8.8, John Wiley and Sons, Toronto. 1994.

Los ensayos para proliferación y diferenciación de células hematopoyéticas y linfopoyéticas incluyen, sin limitación, aquellos descritos en: Measurement of Human and Murine Interleukin 2 and Interleukin 4, Bottomly, K., Davis, L.S. y 5 Lipsky, P.E. In Current Protocols in Immunology. J.E.e.a. Coligan eds. Vol 1 páginas 3.12.1–6.30.12, John Wiley and Sons, Toronto. 1991; deVries y col., J. Exp. Med. 173: 1205–1211, 1991; Moreau y col., Nature 336:690–692, 1988; Greenberger y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80: 2931–2938, 1983; Measurement of mouse and human interleukin 6 – Nordan, R. In Current Protocols in Immunology. J.E.e.a. Coligan eds. Vol 1 páginas 3.12.1–6.60.5, John Wiley and Sons, Toronto. 1991; Smith y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83: 1857–1861, 1986; Measurement 10 of human Interleukin 11 – Bennett, F., Giannotti, J., Clark, S.C. y Turner, K. J. In Current Protocols in Immunology. J.E.e.a. Coligan eds. Vol 1 páginas 6.15.1 John Wiley and Sons, Toronto. 1991; Measurement of mouse and human Interleukin 9 – Ciarletta, A., Giannotti, J., Clark, S.C. y Turner, K.J. In Current Protocols in Immunology. J.E.e.a. Coligan eds. Vol 1 páginas 6.13.1 John Wiley and Sons, Toronto. 1991.

Los ensayos para respuestas de clones de linfocitos T a antígenos (que identificarán, entre otras, proteínas que 15 afectan interacciones celulares APC–T así como efectos de linfocitos T directos midiendo proliferación y producción de citocinas) incluyen, sin limitación, aquellos descritos en: Current Protocols in Immunology, Ed por J. E. Coligan, A.M. Kruisbeek, D.H. Margulies, E.M. Shevach, W Strober, Pub. Greene Publishing Associates y Wiley–Interscience (Capítulo 3, In Vitro assays for Mouse Lymphocyte Function; Capítulo 6, Cytokines and their cellular receptors; Capítulo 7, Immunologic studies in Humans); Weinberger y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 6091–6095, 1980; 20 Weinberger y col., Eur. J. Immun. 11: 405–411, 1981; Takai y col., J. Immunol. 137: 3494–3500, 1986; Takai y col., J. Immunol. 140: 508–512, 1988.

La invención se ilustra a continuación con los ejemplos no limitantes siguientes. Los contenidos de todas las referencias, patentes y solicitudes de patentes publicadas se citan a lo largo de esta solicitud, así como el Listado de Secuencias. 25

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Identificación y caracterización de clones "IL–22"

Un polinucleótido de la presente invención se ha identificado como clon “IL–22”. El clon IL–22 se aisló de acuerdo con el siguiente procedimiento. Una EST murina se identificó a partir de una biblioteca de ADNc hecha a partir de esplenocitos activados tanto con ConA como con células dendríticas derivadas de la médula ósea. La EST se 30 identificó usando procedimientos que son selectivos para ADNc que codifican proteínas segregadas (véase Pat. de los EE.UU. N.º 5,536,637). La secuencia EST murina se usó aislando un clon murino de longitud total a partir de la misma biblioteca de ADNc. El análisis de la secuencia de clon murino reveló una homología significativa a interleucina–10 (IL–10).

Con el fin de aislar un homólogo humano del clon murino, se construyeron cebadores de PCR basados en la región 35 de la secuencia murina que mostró homología a IL–10. El uso de tales cebadores para amplificación en una biblioteca de ADNc derivada de PBMC humanas estimuladas por PHA/PMA produjo un producto de PCR de tamaño insignificante. El análisis de la secuencia del producto de PCR confirmó que era un homólogo del ADNc murino. Se construyeron oligonucleótidos a partir de la secuencia del clon humano parcial y se usaron aislando un clon humano de secuencia completa a partir de la biblioteca de PBMC. 40

IL–22 es un clon humano de longitud total, que incluye la secuencia codificante completa de una proteína segregada (también referida en el presente documento como proteína "IL–22"). El análisis de su secuencia de aminoácidos modificada indica que tiene aproximadamente 23% de homología con hIL–10. En base a los restos de unión a receptor teóricos en IL–10, se han propuesto tres restos implicados con función análoga en IL–22 a través de realización de modelos por ordenador. Estas son las regiones de SEC ID N.º: 2 del residuo 50 a 60, del residuo 63 a 45 81, y del residuo 168 a 177. Los análisis de las bases de datos revelaron que IL–22 también presenta niveles similares de homología con IL–10 de otras especies. La secuencia de nucleótidos de IL–22 humana como está determinada actualmente se reproduce más adelante (SEC ID N.º: 1), e incluye una cola de poli(A). La secuencia de aminoácidos de la proteína IL–22 correspondiente a la siguiente secuencia de nucleótidos se comunica en la SEC ID N.º: 2. 50

Ejemplo 2: Caracterización de la proteína IL–22

Las líneas celulares que expresan de forma estable y segregan proteína IL–22 de longitud total se crearon transfectando células CHO con ADNc de IL–22 en vectores de expresión apropiados. Las células COS transfectadas temporalmente usando vectores de expresión IL–22 apropiados se han usado fabricando proteína IL–22 para

análisis. Las transfecciones se llevaron a cabo usando el reactivo Lipofectamina comercialmente disponible (Gibco). De forma interesante, se observó que las células COS que expresan IL–22 no se despegan uniformemente, formando agujeros en la monocapa de cultivo celular. Los medios acondicionados por células COS transfectadas se usaron manifestando actividad similar a citocinas de la proteína IL–22. El análisis de transferencia de Western de lisados celulares mostró que Stat–3 llega a fosforilarse (activarse) en una línea celular derivada de tejido mesangial 5 del riñón que presenta cualidades similares macrófagos (MES–13; véase, Dumoutier y col. (2000) J. of Immunology 164:1814–1819) tras exposición de esa célula a medios condicionados por células que expresan IL–22. Además la fosforilación de Stat–3 está inducida en células COS no transfectadas que se tratan con proteína IL–22.

Los análisis electroforéticos de proteína IL–22 (derivada de líneas celulares COS transfectadas descritas en el presente documento) indicaron que la proteína expresada existe en un intervalo de tamaños. El tratamiento de 10 proteína IL–22 derivada de COS con N–glicanasa anterior a electroforesis da como resultado una banda individual que corresponde a la movilidad más alta (por ejemplo, peso molecular más bajo) vista en IL–22 no tratada. Esto es consistente con eventos de glicosilación propuestos identificados en la secuencia de aminoácidos de IL–22 (residuos aminoacídicos 54–56, 68–70, 97–99 y 176–178 de SEC ID N.º: 2).

La secuenciación N–terminal de Edman determinó que el extremo N–terminal de la proteína IL–22 madura comienza 15 con el residuo en posición 34 de la SEC ID N.º: 2 (alanina). Se crearon vectores de expresión que condensan una marca de afinidad de “histidina 6x” y una marca de epítopo de FLAG en el extremo N–terminal de la proteína IL–22 madura. (La marca de aminoácidos añadida se da en SEC ID N.º: 5 y tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

MKFLVNVALVFMVVYISYIYAGSGHHHHHHGSGDYKDDDDKAPISSHCR).

Estas construcciones marcadas se usaron creando líneas celulares CHO que las expresan establemente y líneas 20 celulares COS que las expresan temporalmente. Las marcas proporcionaron un medio conveniente para detectar IL–22 (por ejemplo, anticuerpos anti–His6x; anticuerpos anti–FLAG) y para purificar la proteína a partir de medios condicionados (usando resina Ni+2). La proteína IL–22 humana purificada por medio de esta marca a partir de las líneas celulares COS que expresan IL–22 podría usarse para inducir activación de Stat–3 en células MES–13.

La comparación de transcritos de ARNm de IL–22 en linfocitos Th1 y Th2 activadas (véase, por ejemplo, Syrbe y col., 25 (1999) Springer Seminars in Immunopathology, 21: 263–85) indicaron un nivel sustancialmente más alto de expression de IL–22 en linfocitos Th1 activadas que en linfocitos Th2 activadas. El análisis de ARNm de IL–22 se llevó a cabo con ensayos de protección de RNAsa. Por lo tanto, IL–22 se induce durante una respuesta immune adaptativa, específicamente por linfocitos T CD4+ Th1.

Ejemplo 3: Creación de vector de adenovirus recombinante de IL–22 y administración en vivo. 30

El vector de IL–22 murino IL–22 (mIL–22) Adori 1–2 se obtiene digiriendo ED6dpc–2mIL–22 con EcoRI y Notl y Iigando el fragmento de ADNc mIL–22 de 1,1 kb con vector Adori 1–2 de adenovirus digerido con EcoRI y Notl. La construcción de proteína fluorescente verde (GFP) de Adori se obtiene digiriendo pEGFP–N1 (CLONTECH Laboratories, Inc., Palo Alto, CA) con EcoR1 y Not1 e insertando la EGFP dentro del sitio de EcoR1 y Not1 de Adori 1–1. Ambas construcciones se verificaron por análisis de digestión de restricción extensiva y secuenciación de los 35 insertos de ADNc en los plásmidos. La expresión del ADNc de mIL–22 y de EGFP se dirigió desde el promotor y el potenciador inmediatamente anteriores de citomegalovirus (CMV).

El adenovirus recombinante de Ad5 E1a suprimido (dI327) se generó por recombinación homóloga en una línea celular renal embrionaria 293. El virus adenovirus recombinante se aisló y se amplificó subsiguientemente en células 293. El virus se liberó a partir de células 293 infectadas por tres ciclos de congelación–descongelación. El virus se 40 purificó adicionalmente por dos gradientes de centrifugación de cloruro de cesio y se dializó frente a medio salino tamponado con fosfato (PBS) pH 7,2 a 4°C. Tras la diálisis, se añadió glicerol a una concentración del 10% y el virus se almacenó a –80°C hasta su uso. El virus se caracterizó por expression del transgén, unidades formadoras de placa en células 293, partículas/ml, medidas de endotoxina y análisis de PCR del análisis de secuencia de la región codificante de IL–22 en el virus. 45

Una dosis individual de 5 X 1010 partículas de adenovirus recombinante que codifican mIL–22 se inyectó en la vena del rabo de ratones C57/B6 hembras, de 7–8 semanas de edad. Los ratones control recibieron un adenovirus que codifica GFP o PBS/glicerol al 10%. Los ratones de cada grupo experimental se sacrificaron a diversos puntos temporales tras la inyección. Se recogió sangre por punción cardiaca para análisis de química hematológica y sérica. La sangre se recogió por medio de seno retroorbital y se llevaron a cabo cuentas diferenciales en frotis de sangre. El 50 tejido se cosechó, se fijó en formalina y se tiñó con hematoxilina y eosina para histopatología.

Ejemplo 4: Efectos inmunológicos de IL–22

Se investigaron los efectos inmunológicos de IL–22 en un contexto de metazoos por introducción viral del ADNc o de

IL–22 murino en ratones. Se usó un vector adenoviral expresando un ADNc de IL–22 murina en ratones hembra C57/B6 de 8 semanas de edad por inyección de 5 x 1010 partículas virales bien intravenosamente o bien subcutáneamente. Los ratones de prueba se sacrificaron a 7 y 14 días después de la inyección y se compararon con ratones control inyectados sólo con tampón o con adenovirus que expresan proteína fluorescente verde (GFP). En los días 7 y 14, se observó que los pesos vihe absolutos y relativos estaban significativamente disminuidos en los 5 ratones que expresaron el IL–22 murino viral. El peso medio absoluto del bazo se disminuyó en el día 14 y los pesos del hígado se incrementaron ligeramente en el día 7. Una atrofia generalizada en bruto del timo así como eliminación linfoide (observada microscópicamente) fue patente en los días 7 y 14. Se observaron también un incremento en peso de riñón y un agrandamiento del hígado.

Además, hubo una serie de efectos hematológicos que se hicieron evidentes el día 7, incluyendo parámetros 10 eritroides, recuento de glóbulos rojos, hemoglobina y hematocritos reducidos. Estos efectos, tomados conjuntamente, indicaron anemia en los animales. Además, hubo un incremento en plaquetas, así como un incremento en las células de la sangre blancas debido a un incremento de neutrófilos. A la luz de estas observaciones no hubo evidencia de una respuesta regeneradora, lo que indicó que los efectos pueden estar a nivel de la médula ósea. Una posible causa para esto es la pérdida de moléculas pequeñas por el riñón o el intestino. 15 Además, hubo un ligero decrecimiento en niveles de albúmina en el día 7 y el día 14, pero un incremento en la proteína amiloide del suero A y los niveles de fibrinógeno, que son indicadoras de una respuesta de fase aguda. En análisis del ARN hepático mostró incrementos en SAA, GRO1, OPN, LCN2, PRTN3 y SOCS3 (véase Tabla 3 a continuación). Otras observaciones clínicas incluyeron pérdida en peso corporal, signos de deshidrataciones mínimas, incremento en gravedad específica de orina, un decrecimiento en producción de orina y la inducción de 20 basofilia tubular proximal renal. La basofilia observada se debe a la division cellular incrementada y el ARNr incrementado presente en las células epiteliales del tubo proximal renal. Los cambios detectados después de administración de IL–22 son consistentes con la capacidad de IL–22 para inducir una respuesta de fase aguda (véase por ejemplo, Gabay, C. (1999) New England Journal of Medicine 340 (6): 448–454).

Ejemplo 5: Preparación y caracterización de anticuerpos anti–IL–22 monoclonales y policlonales. 25

Los anticuerpos monoclonales y policlonales se prepararon usando metodologías de rutina descritas también en la memoria descriptiva actual. La Tabla 1 a continuación ilustra la afinidad de unión, la eficacia de CIA y la especificidad de neutralización de anticuerpos monoclonales P3/1, P3/2, P3/3 y P3/5, así como de anticuerpo policlonal de pollo que se dirige contra IL–22. Los anticuerpos P3/1, P3/2, P3/3 y P3/5 se están refiriendo también en el presente documento como Ac–01, Ac–04, Ac–02 y Ac–03, respectivamente. 30

Tabla 1: Especificidad de unión, afinidad y actividad de neutralización de anticuerpos

: Anticuerpos monoclonales de rata Anticuerpo policlonal

Anticuerpos de IL–22: P3/1 (Ac–01) P3/2 (Ac–4) P3/3 (Ac–02) P3/5 (Ac–03) Policlonal de Pollo

Especifici–dad de Unión: Ratón Humano Ratón/Humano Ratón Ratón/Humano

Especifici–dad Neutralizan–te: Ratón Humano Ratón/Humano Ratón Ratón/Humano

Afinidad (KD) para IL–22 (nM) por Biacore: 0,54 1,51 68,1 0,1

Efecto en ensayo basado en ELISA: Potencia en ELISA de IL22R; bloquea parcialmente en IL22R/IL10R2 Bloquea en ambos Potencia en ELISA de IL22R; bloquea parcialmente en IL22R/IL10R2 Bloquea en ambos

Eficacia de CIA: Buena No disponible Modesta No disponible

Epitopo: Distinto de Ac–02 Epitopo de Ac–04 descrito en el presente documento Epitopo de Ac–02 descrito en el presente documento Distinto de Ac–04

Se determinó la especificidad de unión por ELISA usando placas de microvaloración de IL–22 marcadas con h/f de

ratón o de ser humano. Cada anticuerpo mostró especificidad fuerte bien por IL–22 de ratón o bien por IL–22 humana como se muestra en la Tabla 1. La especificidad de neutralización se determinó valorando la capacidad del anticuerpo para inhibir fosforilación de STAT3 mediada por 5 ng/ml de IL–22 marcada con h/f de ratón o de ser humano. Los ensayos inmunoabsorbentes unidos a enzimas (ELISA) que usan IL–22 de ratón unida demuestran que el mAc P3/1 tiene DE50 ~5 nM en base a ~2 nM para IL–22–Fc y ~10 nM para H/F IL–22. Además, además de 5 reconocer IL–22 recombinante, mAc también une IL–22 nativa segregada desde linfocitos T que se han transfectado con un vector retroviral IL–22. Se ha encontrado que el anticuerpo de IL–22 P3/1 tiene una DI50 de ~1 nM y que trabaja estequiométricamente bloqueando actividad de IL–22 cuando la citocina está presente en condiciones justamente saturantes (1 nM).

La afinidad de unión (KD) de anticuerpos de rata Ac–02 y Ac–04 para IL–22 de seres humanos se determinó usando 10 Biacore que es 68,1 nM y 1,51 nM, respectivamente. En condiciones similares, la afinidad de unión de IL–22 humana para complejo IL–22R–45 Fc/IL–10R2–Fc e IL–22BP–Fc se determinó que era 1,48 nM y 3,37 nM, respectivamente. Las condiciones experimentales usadas en determinar estas afinidades de unión se describen en más detalle en el Ejemplo 22 a continuación.

Ejemplo 6: Expresión de ARNm de IL–22 y de receptor. 15

Se examinó la expresión de IL–22 y su receptor por reacción en cadena de la polimerasa transcriptasa reversa semicuantitativa (RT–PCR) en una diversidad de tejidos humanos y de ratón. Los experimentos revelan que el ARN mensajero (ARNm) de IL–22 está presente a niveles muy bajos en testículo humano, pulmón, próstata y linfocitos de sangre periférica (PBL) según se normalizan frente a control de actina. Además, la RT–PCR semi–cuantitativa muestra que el receptor de IL–22 se detecta a niveles más altos en el páncreas humano, y a niveles más bajos en el 20 hígado, los intestinos, la piel, el tiroides, el riñón, el corazón, el estómago, el testículo, las glándulas salivares, las glándulas suprarrenales y la próstata. Alternativamente, el receptor murino IL–22 muestra expresión más alta en el hígado, el intestino delgado, el músculo, la piel y los ovarios, con expression más baja en riñón y embriones e8.5 y e19.

Ejemplo 7: Hibridación in situ y tinción apoptótica para proteína IL–22 25

La hibridación in situ para proteína IL–22 y ARN mensajero (ARNm) de receptor de ratones tratados con expresión de adenovirus IL–22 (AdIL–22) o Lipopolisacárido (LPS) se llevó a cabo y los resultados fueron como sigue:

Tabla 2

A. Detección de ARNm de Citocina IL–22

Tejido: Ratones tratados con AdIL–22 Ratones tratados con LPS

Hígado: Día 1: tinción en citoplasma de hepatocitos ligeramente positiva Días 3 y 14: sin ninguna tinción específica 6 horas: tinción en citoplasma de hepatocitos ligeramente positiva

Bazo: Días 1, 3 y 14: tinción ligera en región periarterial Negativa

Corazón: No disponible Negativa

Colon: No disponible Negativa

Riñones: Día 1: tinción en citoplasma de epitelio tubular proximal y distal, asa de Henle en el haz corticomedular, células parietales del espacio de Bowman y algunas células epiteliales son ligeramente positivas Día 4: tinción en citoplasma de epitelio proximal y distal y asa de Henle en el haz corticomedular Día 14: tinción en citoplasma de epitelio tubular proximal 2 horas: tinción en citoplasma de epitelio tubular proximal y distal, asa de Henle en el haz corticomedular fue ligeramente positiva 6 horas: tinción en citoplasma de epitelio tubular proximal y distal y asa de Henle en el haz corticomedular, células de mechones glomerulares, algunas células parietales del espacio de Bowman y pocas células endoteliales fueron de ligeramente a moderadamente positivas

Páncreas: No disponible 2 y 6 horas: tinción en citoplasma o en células acinares ligeramente positiva

Pulmones: No disponible 2 y 6 horas: tinción en neumocitos de tipo II y/o macrófagos intraalveolares se tiñeron de ligera a suavemente

Estómago: No disponible 6 horas: la tinción en citoplasma de células basales fue suave

Duodeno y yeyuno: No disponible 2 y 6 horas: la tinción en citoplasma de enterocitos apicales fue de moderada a marcada y ligeramente positiva en las células del plexo nervioso intestinal.

B. Detección del ARNm de Receptor IL–22 en ratones tratados con LPS

Tejido: Ratones tratados con LPS

Hígado: 2 y 6 horas: la tinción en citoplasma de hepatocitos fue de ligera a moderada, la tinción nuclear se observó en hepatocitos, epitelio de los conductos biliares y células endoteliales.

Riñones: 2 y 6 horas: la tinción fue ligera a moderada en el citoplasma y en el núcleo del epitelio tubular proximal y distal, asa de Henle en el haz corticomedular, células de mechones glomerulares, algunas células parietales del espacio de Bowman y unas pocas células endoteliales

Páncreas: 2 y 6 horas: tinción en el citoplasma de células acinares ligeramente positiva

Corazón: 6 horas: la tinción nuclear fue moderadamente positiva en cardiomiocitos y en células endocárdicas y endoteliales.

El ARNm del receptor de IL–22 se detecta adicionalmente en intestino delgado y grueso, estómago, nódulos linfáticos, bazo y pulmón. La expresión del receptor de IL–22 puede estar adicionalmente regulada por incremento por un mediador de una respuesta immune innata, tal como LPS.

Finalmente, los ensayos de TUNEL de células de riñón tomadas de ratones c57BL/6 que reciben proteína mIL–22 5 mostraron intravenosamente unas pocas células epiteliales apoptóticas en varios túmulos contorneados proximales. Los ratones que reciben el medio salino intravenosamente (grupo control) no demostraron ninguna tinción positiva.

Estos datos demuestran que tanto la citocina como el receptor se pueden inducir durante una respuesta immune

innata, y que la inducción está restringida a tejidos que están en un estado inflamatorio (LPS). Durante una respuesta immune adaptativa, IL–22 puede inducirse también a partir de las linfocitos T CD4+ Th1. Dado que los leucocitos no parecen tener el receptor, este resultado sugiere que las funciones de IL–22 como un efector dentro de una secuencia tisular de una respuesta immune adaptativa, según se refuerza por la expresión tisular del receptor, se regulan por incremento constitutivamente y adicionalmente por un inductor de inflamación innato. 5

Ejemplo 8: Cambios mediados por IL–22 en la expresión génica

Se examinó la capacidad de IL–22 para modular niveles de expresión génica en células hepáticas de ratones infectados con una construcción de AdIL–22 o de Ad–GFP.

Hígados de ratón congelados del día 1 y del día 3 tras la infección se pulverizaron y el ARN se purificó usando los reactivos de Promega RNAgents Total ARN Isolation System (Promega, Madison, WI). El ARN se purificó usando el 10 minikit RNeasy. El ARN total se aisló de PBMC humanos usando el minikit RNeasy (Qiagen, Hidden, Alemania).

Se preparó el ARN total por hibridación desnaturalizando 10 μg de ARN total durante 10 minutos a 70°C con cebador oligo–dT marcado con T7/T24 de 20 pM (sintetizado en el Genetics Institute, Cambridge, MA), y enfriado en hielo. Se llevó a cabo síntesis de la primera hebra de ADNc en las siguientes condiciones de tampón: tampón de primera hebra 1X (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA.), DTT 10 mM (GIBCO/Invitrogen), 500 μM de cada 15 dNTP (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)), 400 unidades de Superscript RT II (Invitrogen Life Technologies) y 40 unidades de inhibidor de RNAsa (Ambion, Austin, TX.). La reacción se lleva a cabo a 47°C durante 1 hora. La segunda hebra de ADNc se sintetizó con la adición de los siguientes reactivos a las concentraciones finales enumeradas: tampón de segunda hebra 1X (Invitrogen Life Technologies), 200 μM adicionales de cada dNTP (Invitrogen Life Technologies), 40 unidades de ADN polimerasa I de E. coli (Invitrogen Life 20 Technologies), 2 unidades de RnasaH de E. coli (Invitrogen Life Technologies) y 10 unidades de ligasa de ADN de E. coIi. La reacción se llevó a cabo a 15,80ºC durante 2 horas. Durante los últimos cinco minutos de la reacción se añadieron 6 unidades de ADN polimerasa T4 (New England Biolabs, Beverly, MA).

El ADN resultante de doble cadena se purificó con el uso de partículas que finalizan en carboxilo como sigue: 0,2 mg de partículas de BioMag (Polysciences Inc., Warnngton, PA) se equilibraron lavando tres veces con EDTA 0,5 M y se 25 resuspendieron a una concentración de 22,2 mg/ml en EDTA 0,5 M. La reacción de ADNc de doble cadena se diluyó a una concentración final de PEG al 10%/NaCl 1,25 M, y se añadió la suspensión de perlas a una concentración final de perlas de 0,614 mg/ml. La reacción se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Los complejos de ADNc/perla se lavaron con 300 μI de etanol al 70%, el etanol se retiró y los tubos se dejaron secar al aire. El ADNc se eluyó con la adición de 20 μl de Tris–acetato 10 mM, pH 7,8, se incubó durante 2–5 minutos y se eliminó el ADNc 30 que contenía supematato.

Se añadieron 10 μI de ADNc de doble cadena purificados a una solución de transcripción in vitro (IVT) que contenía, tampón IVT 1X (Ambion, Austin, TX) 5.000 unidades de ARN polimerasa T7 (Epicentre Technologies, Madison, WI), GTP 3 mM, ATP 1,5 mM, CTP 1,2 mM y UTP 1,2 mM (Amersham/Pharmacia), 0,4 mM cada UTP bio–16 UTP y cada CTP bio–11 (Enzo Diagnostics, Farmingdale, NY) y 80 unidades de inhibidor de RNasa (Ambion, Austin, TX). La 35 reacción se lleva a cabo a 37°C durante 16 horas. Se purificó ARN marcado con el uso de un RNeasy (Qiagen). El rendimiento de ARN se cuantificó midiendo absorbancia a 260 nm.

12 μg del producto de transcripción in vitro se fragmentó en Tris–acetato 40 mM, pH 8,0, acetato de potasio 100 mM y acetato de magnesio 30 mM durante 35 minutos a 94°C. Las sondas de ARN marcadas, fragmentadas se diluyeron en tampón de hibridación a una composición final de ácido 2–N–morfolinoetanosulfónico 1X (MES (tampón 40 (pH 6,5), Bio948 50 pM (oligo biotinilado control que hibrida con características de punto de referencia en la disposición de la sonda (Genetics Institute, Cambridge, MA)), ADN de esperma de arenque 100 μg/ml (Promega, Madison, WI), BSA acetilada 500 μg/ml (Invitrogen Life Technologies) y 1 μl/μg (reactivo patentado suministrado por Gene Logic, Gaithersburg, MD). Esta solución de hibridación se pre–hibridó con dos perlas de vidrio (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) a 45°C durante toda una noche. La solución de hibridación se retiró a un tubo limpio y se 45 calentó durante 1–2 minutos a 95°C y se microcentrifugó arriba durante 2 minutos centrifugando desechos insolubles. Se prehumedecieron cartuchos de disposiciones de oligonucleótidos (Murine 74Kv2, Affymetrix, Santa Clara, CA) con tampón de lavado no restrictivo (NaC 0,9 M, fosfato de sodio 60 mM, EDTA 6 mM y Tween20 al 0,01%) y se incubó a 45°C con rotación durante 5–10 minutos. Se retiró el tampón de los cartuchos, y las disposiciones se hibridaron con 180 μl de la solución de hibridación a 45°C rotando a 45–60 rpm durante toda una 50 noche. Después de incubación durante toda una noche se retiraron las soluciones de hibridación y los cartuchos se rellenaron con tampón de lavado no restrictivo. Los cartuchos de disposiciones se lavaron usando una estación de fluidos de acuerdo con 10 ciclos de 2 mezclas/ciclo de tampón de lavado no restrictivo a 25°C seguidos por 4 ciclos de 15 mezclas/ciclo de tampón de lavado restrictivo (MES 100 mM, Na+ 0,1 M, Tween20 al 0,01% y antiespumante al 0,005%). El ensayo de sondas se tiñó después primero durante 10 minutos a 25°C en solución de SAPE (MES 55 100 mM, Na+ 1M, Tween20 al 0,05%, antiespumante al 0,005%, 2 mg/ml de BSA acetilado (Invitrogen Life

Technologies) y 10 μg/ml de R–ficoeritrina estreptavidina (Molecular Probes, Eugene, OR)). Después de la primera tinción la disposición de sondas se lavó durante 10 ciclos de 4 mezclas/ciclo con tampón de lavado no restrictivo a 25°C. La disposición de sondas se tiñó después durante 10 minutos a 25°C en solución de anticuerpos (MES 100 mM, Na+ 1M, Tween 20 al 0,05%, antiespumante al 0,005%, 2 mg/ml de BSA acetilado (Invitrogen Life Technologies), 100 μg/ml de IgG de cabra (SIGMA, San Luís, MO) y anticuerpo anti–estreptavidina biotinilada 3 5 μg/ml (cabra) (Vector Laboratories). Tras la segunda tinción la disposición de sonda se tiñó de nuevo durante unos 10 minutos adicionales a 25°C en solución de SAPE. Finalmente, la disposición de sonda se lavó durante 15 ciclos de 4 mezclas por ciclo con tampón de lavado no restrictivo a 30°C.

Las disposiciones se exploraron usando un escáner de chip de genes Affymetrix (Affymetrix, Santa Clara, CA). El escáner contenía un microscopio confocal de exploración y usaba un láser iónico de argón para la fuente de 10 excitación y se detecta emisión por un tubo fotomultiplicador en filtro de paso banda de 530 nm (fluoresceína 0 o filtro de paso largo de 560 (ficoeritrina).

Se analizaron los ARNm en el grupo de chips de 74 k murinos (Mu74K). Los datos se redujeron con el uso del programa GENECHIP 4.0. Cada muestra experimental se comparó con un control de tiempo emparejado en un análisis de dos ficheros. Los datos se filtraron con los criterios para genes que se llamaron “Presentes” en un grupo, 15 y que eliminan todos los genes que no se llamaron bien “Crecientes” o bien “Decrecientes”.

Se presentan más adelante datos para tres ratones (ratón 49 AD–GIL–19 , ratón 51 AD–GIL–19 y ratón 52 AD–GIL–19). Se muestran genes cuya expresión cambia de forma relativa al control Ad–GFP, con el cambio de veces promedio mostrado para cada animal. Los cambios observados en la expresión génica de animales tratados con Ad–IL–22 son consistentes con la inducción por IL–22 de una respuesta de fase aguda. Los cambios observados son 20 también indicadores de un estado inflamatorio en el animal tratado.

Tabla 3

Hígados del día 3: Ratón Ad–GIL–19 Ratón Ad–GIL–19 Ratón Ad–GIL–19

: número de ratones 49 51 52

Identificador: Nombre del Gen Cambio en Veces Promedio Cambio en Veces Promedio Cambio en Veces Promedio

1300017C10RIK: gen 1300017C10RIK de ADNc de RIKEN 23,4 17,2 19,3

SAA–PS: amiloide A sérica, pseudogén 24,6 13,9 24,3

SAA1: amiloide A sérico 1 11,9 9,7 12,3

SAA2: amiloide A sérico 2 10,0 8,9 10,3

PRTN3: proteinasa 3 15,2 14,3 17,1

SPP1: fosfoproteína 1 segregada 10,2 7,8 10,7

LCN2: lipocaína 2 13,4 10,3 13,3

SAA3: amiloide A sérico 3 10,5 5,4 8,2

GRO1: Oncogén GRO1 8,2 5,6 7,2

LY6D: complejo de antígeno 6 de linfocitos, locus D 6,0 5,5 4,9

GRO1: Oncogén GRO1 7,0 5,6 7,2

RAD51L1: similar a RAD51 (S. cerevisiae) 4,4 3,7 3,8

GAS6: específico de detención de crecimiento 6 4,1 3,5 4,8

SPI2–2: inhibidor de serina proteasa 2–2 3,7 2,8 3,8

GADD45G: detención del crecimiento e inducible por daños en el ADN 45 gamma 3,9 2,7 3,4

CEBPD: CCAA/proteína de unión a potenciador (C/EBP), delta 5,3 3,2 3,9

TNFRS1A: superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral, miembro 1a 3,6 2,6 3,0

CISH3: proteína 3 que contiene SH2 inducible por citocinas 4,0 3,8

ILR1: receptor de interleucina 1, tipo I 5,2 2,6 5,6

SAP: P–componente amiloide sérico 3,1 2,5 3,3

PEX11A: factor 11a de biogénesis peroxisómica 4,2 3,2

230031 E04RIK: EST 2,9 2,7 3,3

AA880891: EST 2,7 2,4 2,8

CD14: antígeno CD14 3,4 2,3 2,6

MT1: metalotioneína 1 2,7 2,4 2,9

UNK_AW124835: EST 2,2 2,0

TM4SF7: miembro 7 de superfamilia de transmenbrana 4 2,6 2,8 2,4

DNCLC1: cadena ligera 1, citoplásmica, de dineína 2,5 2,4 2,6

SAA4: amiloide A sérico 4 3,2 2,8

2410006H10RIK: gen 2410006H10 de ADNc de RIKEN 2,2 2,1 2,0

RBM3: proteína 3 de resto de unión al ARN 2,7 2,8 2,8

1300003D03RIK: gen 1300003D03 de ADNc de RIKEN 2,2 2,4

CEBPB: CCAAT/proteína de unión a potenciador (C/EPB), beta 2,0 2,3

MT2: metalotioneína 2 2,2 2,1 2,3

ORM2: orosomucoide 2 1,7 1,7 2,0

VNN1: vanin 1 2,0 2,1

GTF2A2: factor IIa de transcripción general, 2 (subunidad de 12 kD) 2,2 2,4

ITH4: inhibidor de inter alfa–tripsina, cadena pesada 4 1,8 1,9

ITIH3: inhibidor de inter alfa–tripsina, cadena pesada 3 1,8 1,7 1,9

NPN3: progresión neoplásica 3 2,2 2,5

U62673: EST –2,4 –3,2

PAPS2: 3’–fosfoadenosina–5’fosfosulfato sintasa 2 –2,0 –2,3

TEMT: S–metiltransferasa de tioéter –2,2 –1,7

TTR: transtiretina –2,0 –1,8

CBG: globulina de unión a corticosteroide –3,4 –2,8 –2,8

HSD11B1: 11–beta–deshidrogenasa 1 de hidroxiesteroide –2,1 –1,9

LIFR: receptor de factor inhibidor de leucemia –2,5 –2,0 –1,7

LIFR: receptor de factor inhibidor de leucemia –2,5 –2,0 –1,7

HPGD: hidroxiprostaglandina deshidrogenada 15 (NAD) –1,9 –2,5

CBG: globulina de unión a corticosteroide –3,5 –2,8 –2,8

HAL: histidina amoniaco liasa –2,2 –2,0 –2,1

CYP2F2: citocromo P450, 2f2 –2,5 –2,3 –1,7

KEG1: gen 1 expresado en el riñón –2,9 –2,2

AI266885: EST –4,7 –3,1 –2,4

Llamado Presente en sólo un animal

PAP: proteína asociada a pancreatitis 9,2

1300007C21RIK: gen 1300007C21 de ADNc de RIKEN 4,7

REG2: homólogo de ratón 2, derivado de islotes que se regeneran de ratas 9,8

UNK_AE000664: EST 9,6

SERINA/TREONINA–PROTEÍNA QUINASA
SERINA/TREONINA–PROTEÍNA QUINASA: 2,1

1300007C21RIK: gen 1300007C21 de ADNc de RIKEN 3,8

CRAT: acetiltransferasa de carnitina 2,6

AS2: arilsulfatasa A 3,2

2310009M24RIK: gen 2310009M24 de ADNc de RIKEN 2,0

2310004B05RIK: gen 2310004B05 de ADNc de RIKEN 2,8

REG1: homólogo de ratón 1, derivado de islotes que se regeneran de ratas 2,3

AW048468: esterasa 31 1,8

PAP: proteína asociada a pancreatitis 7,7

SULT–X1: proteína SULT–X1 relativa a sulfotransferasa –2,6

ES31: esterasa 31 –1,8

AW538652: EST –1,9

GAMT: guanidinoacetato metiltransferasa –2,0

SC5D: esterol–C5–desaturasa (ERG3 fúngico, delta–5–desaturasa), homólogo (S. cerevisiae) –1,9

GHR: receptor de hormona del crecimiento –3,0

AI839995: EST –1,8

0610025L15RIK: gen 0610025L15 de ADNc de RIKEN –1,9

AGXT: aminotransferasas de alanina–glioxilato –2,5

PAH: fenilalanina hidrolasa –2,0

IGFBP2: factor de crecimiento similar a insulina que se une a la proteína 2 –2,5

AI647632: EST –2,1

AI647632: EST –2,1

G6PC: glucosa–6–fosfatasa, catalítico –2,2

CYP17: citocromo P450, 17 –3,0

GSTA2: glutatión S–transferasa, alfa 2 (Yc2) –2,3

CYP26: citocromo P450, 26, ácido retinoico –9,0

THRSP: homólogo de SPOT14 sensible a hormona tiroides (Rattus) –2,7

FMO3: flavina que contiene monooxigenasa 3 –2,6

Ejemplo 9: Efecto de un anticuerpo anti–IL–22 en un modelo de artritis en vivo

Se examinó la capacidad del anticuerpo monoclonal P3/1 para mejorar síntomas en un modelo de artritis inducida por colágeno (CIA) murino. Se usaron ratones DBA/1 (Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine) machos para todos los experimentos. Se administró anticuerpo profiláctica o terapéuticamente a ratones DBA. En el régimen 5 terapéutico, se inició el tratamiento si la enfermedad se observó durante dos días consecutivos en un ratón.

Se indujo artritis con el uso de colágeno bovino de tipo II (Chondrex, Redmond, WA). Se disolvió colágeno bovino de tipo II (Chondrex, Redmond, WA) en ácido acético 0,1 M y se emulsionó en un volumen igual de CFA (Sigma) que contenía 1 mg/ml de Mycobacterium tuberculosis (cepa H37RA). Se inyectaron subcutáneamente 100 μg de colágeno bovino subcutáneamente en la base del rabo en el día 0. En el día 21, los ratones se inyectaron 10 subcutáneamente, en la base del rabo, con una solución que contenía 200 μg de colágeno bovino en ácido acético 0,1 M que se había mezclado con un volumen equivalente de coadyuvante de Freund Incompleto (Sigma). Los animales que no habían sido tratados previamente recibieron los mismos grupos de inyecciones, menos colágeno. El protocolo de dosificación se muestra esquemáticamente en la FIG. 1.

Los ratones se controlaron al menos tres veces por semana en relación a la progresión de la enfermedad. Se asignó 15 una puntuación clínica a los miembros individuales en base al índice: 0 = normal; P = preartrítico, caracterizado por eritema focal en las puntas de los dedos; 1 = eritema visible acompañado por 1–2 dedos hinchados; 2 = eritema pronunciado, caracterizado por hinchazón de zarpa y/o hinchazón multidigital; 3 = hinchazón masiva que se extiende en tobillo o muñeca; 4 = dificultad en uso del miembro o rigidez de las articulaciones. Así, la suma de todas las puntuaciones de los miembros para cualquier ratón dado produjo una puntuación corporal total máxima de 16. 20

En diversas fases de la enfermedad, los animales se sometieron a eutanasia, los tejidos se recogieron y las zarpas se fijaron en formalina al 10% para histología o en paraformaldehído al 4%, pH 7,47, se descalcificaron en EDTA al 20% (pH 8,0) y se incrustaron en parafina para hibridación in situ. Usando microscopía óptica se evaluaron las zarpas en un procedimiento de valoración de 5 grados (0–4) caracterizando la intensidad y extensión de la artritis. Los infiltrados inflamatorios se usaron evaluando además de otros cambios relacionados con la inflamación, tales 25 como formación de tejido sinovial de granulación, carácter fibroso de la membrana sinovial, erosión del cartílago articular y/o destrucción del hueso subcondral. Se determinaron grados histológicos usando lecturas de zarpas individuales: NAD = 0 o nada anormal descubierto; 1 = ligero o moderado; 2: suave a moderado; 3: marcado y 4: masivo.

El efecto de la administración terapéutica de anticuerpo IL–22 se muestra en la FIG. 2. La puntuación corporal se 30

muestra como una función del tiempo. Los ratones administrados con anticuerpo anti–IL–22 mostraron síntomas significativamente disminuidos en relación a ratones administrados con IgG humana control o con PBS control (datos no mostrados).

El efecto de administración profiláctica de anticuerpo IL–22 neutralizante se muestra en las FIGS. 3–5. La evaluación corporal se muestra como una función del tiempo tras administración de un anticuerpo anti–IL–22 o anticuerpo de 5 control. Los ratones administrados con anticuerpo anti–IL–22 mostraron síntomas significativamente disminuidos en relación a ratones administrados con IgG de rata control o con PBS control (datos no mostrados).

La valoración corporal se examinó también en ratones sometidos a un régimen profiláctico separado. Los resultados se muestran en la FIG. 4 como una función del tiempo. Los ratones tratados con anticuerpo control demostraron una evaluación corporal total promedio más alta que los ratones tratados con anti–IL–22. Los ratones administrados con 10 anticuerpo anti–IL–22 mostraron síntomas significativamente disminuidos en relación a ratones administrados con IgG1 de rata control o con PBS control (datos no mostrados).

La progresión de la enfermedad en zarpas de ratones sometidos al régimen profiláctico se muestra en la FIG. 5. Los ratones se sacrificaron en el día 36 y se examinó la gravedad de la enfermedad en sus zarpas. Se asignó a las zarpas un grado histológico de 0 a 4, con 0 correspondiendo a ninguna enfermedad y 4 representando una 15 enfermedad más grave. Para ratas inyectadas con anticuerpo de IL–22, por encima del 60% tuvo un grado histológico de “0” mientras que aproximadamente el 20% de los ratones tuvo un grado histológico de “1”. Aproximadamente el 15% de los ratones mostraron un grado histológico de “2” y aproximadamente el 10% de los ratones mostraron un grado histológico de “3”. Un porcentaje pequeño de ratones mostraron un grado histológico de “4”. Para ratones inyectados con anticuerpo control, aproximadamente el 30% mostraron un grado histológico de “0” 20 y aproximadamente el 5% de los ratones mostraron un grado histológico de “1”. Los ratones que quedaban presentaron grados de patología más graves: aproximadamente el 18% mostraron un grado histológico de “2” mientras que aproximadamente el 20% mostraron un grado patológico de “3” y los ratones que quedaban mostraron un grado histológico de "4". Los ratones administrados con anticuerpo anti–IL–22 mostraron síntomas significativamente disminuidos en relación a ratones administrados con IgG1 de rata control o con PBS control (datos 25 no mostrados).

Estos resultados demostraron que la administración de anticuerpo IL–22 bien profilácticamente o bien terapéuticamente mejora significativamente los síntomas de artritis en un sistema animal.

Ejemplo 10: Hibridación In Situ de Tránscritos de IL–22

Se determinó la expresión de IL–22 y de secuencias del receptor de IL–22 en diversos tipos celulares de almohadillas 30 de patas de ratones artríticos. Las ribosondas de receptor murino de IL–22 y de IL–22 antisentido se produjeron generando 2 productos de PCR independientes de los tránscritos correspondientes. Los oligonucleótidos 5’–GACTGATAATACGACTCACTATAGGGCGAACAATTTTGACTCCGATATTGTC CAAG–3’ (SEC ID N.º: 6) y 5'–AG–GATGGAGACATCTGACTGCCCTACG–3' (SEC ID N.º: 5) se usaron generando una sonda en sentido correcto de receptor IL–22 y se usaron 5’–ACAATTTTGACTCCGATATTGTCCAAG (SEC ID N.º: 7) y 3’–35 GACTGATAATACGACTCACTATAGGGCGAAGGATGGAGACATCTGACTGCC CTACG–3’ (SEC ID N.º: 8) generando una sonda antisentido de receptor de IL–22. Las siguientes sondas de amplificación de PCR se generaron usando ARN polimerasa de T7 y transcripción in vitro.

Se construyó una sonda para secuencias de IL–22 situando la siguiente secuencia en un plásmido y situando la secuencia bajo el control de los promotores de T7 y SP6 produciendo transcritos en el sentido correcto o antisentido: 40

CAGCCATACATCGTCAACCGCACCTTTATGCTGGCCAAGGAGGCCAGCCTTGCAGATAACAACACAGATGTCCGGCTCATCGGGGAGAAACTGTTCCGAGGAGTCAGTGCTAAGGATCAGTGCTACCTGATGAAGCAGGTGCTCAACTTCACCCTGGAAGACGTTCTGCTCCCCCAGTCAGACAGGTTCCA (SEC ID N.º: 9)

Los sitios de unión de la ARN polimerasa T7 se incorporaron dentro de los oligonucleótidos insertando sitios de unión de bien en el extremo 5’ del producto de PCR para ribosonda en el sentido correcto o bien en el extremo 3’ del 45 producto de PCR para la ribosonda antisentido. Las sondas marcadas con digoxigenina se prepararon con el uso de una mezcla de marcado de ARN DIG (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania), según se describen por el fabricante y la polimerasa de ARN T7 (Roche Diagnostics). Las células positivas en ARNm del receptor de IL–22 fueron macrófagos, fibroblastos, una subpoblación de linfocitos, osteoblastos activados, sinoviocitos y epidermis. No se vio ninguna tinción positiva en las zarpas de control o con sondas en sentido correcto. Las células mIL–22 50 positivas fueron: neutrófilos, macrófagos, fibroblastos y osteocitos. No se vio ninguna tinción en la sección de la zarpa tratada con la sonda en sentido correcto y la zarpa de ratón control se tiñó con ARNm de mIL–22. La hibridación in situ mostró la presencia tanto del receptor IL–22 como de citocina en las zarpas de los ratones artríticos.

Ejemplo 11: Protocolos Experimentales para Ejemplos 12–22

IL–22 recombinante, IL–22RECD, IL–10R2ECD y Proteínas de Fusión de IL–22BP

Un vector de expresión de mamíferos que codifica una marca His/Flag N–terminal (GSGHHHHHHGSGDYKDDDDK (Terpe, K. (2003) Applied Microbiology & Biotechnology 60 (5): 523–33) condensada al extremo maduro de la IL–22 humana (APISSH–CRLD) se transfectó en células de Ovario de Hámster Chino (CHO) que se seleccionaron 5 adicionalmente en metotrexato y la citocina recombinante subsiguientemente purificada a partir de medios condicionados, todos por procedimientos estándar (Terpe, K. (2003) supra; Kaufman, R.J. (1990) Methods in Enzymology 185: 537–66; Kaufman, R.J. (1990) Methods in EnzymoIogy 185: 487–511; Hochuli, E. (1988) Bio/Technology 6: 1321–1325). Para usar en ELISA, la IL–22 humana se biotiniló usando kit de Sulfo–NHS–Biotina EZ–Link™ como se recomendó por el fabricante (Pierce, Rockford, IL). Se preparó IL–22 murina recombinante 10 modificada por procedimientos comparables usando un vector de expresión que codificó una fusión entre una marca His/Flag N–terminal (GSGHHHHHHGDYKDDDDK) y el extremo N–terminal maduro de IL–22 murina (LPVNTRCKL). Las citocinas se cuantificaron por absorbancia A280, usando el coeficiente de extinción teórica derivado de la composición de aminoácidos. IL–22 humana y murina se separaron en geles de SDS–PAGE a ~30–40 kD, bien en la presencia o bien en la ausencia de reductor (datos no mostrados). Está extensivamente glicosilada; cuando se trata 15 con N–glicanasa, IL–22 migra a ~19 kD, cerca o en su peso molecular teórico (datos no mostrados).

Los dominios extracelulares de IL–22R e IL–10R2, según se definen por análisis de hidrofobicidad e IL22–BP se condensaron en fase por medio de un engarce de hidrofobicidad flexible para el dominio Fc de IgG1 humana. Se construyeron vectores de expresión de mamíferos que codifican bien IL–22RECD (TLPDRTWT es la secuencia C–terminal (Xie M.H. y col. (2000) J Biol Chem 275 (40): 31335–9; Kotenko S.V. y col. (2001) J Biol Chem 276 (4): 20 2725–32)), IL–10 R2ECD humana (THDETVPS es la secuencia C terminal (Lutfalla, G. y col. (1993) Genomics 16(2): 366–73)) o IL–22BP humana (EERCVEIP es la secuencia C–terminal (Dumoutier, L. y col. (2001) J Biol Chem 166 (12): 7090–5; Kotenko S.V. y col. (2001) J Biol Chem 166 (12): 7096–103; Kotenko S.V. y col. (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98 (17): 9511–6) condensada a un engarce (AGSGSGSG) y después a Fc de IgG1 humano (la secuencia N–terminal de este dominio comienza en EPKSCDKT). Los medios condicionados que contienen cada uno de estos 25 homodímeros de fusión Fc se prepararon a partir de líneas de CHO estables por metodologías estándar (Kaufman, R.J. (1990) Methods in Enzymology 185: 537–66; Kaufman, R.J. (1990) Methods in Enzymology 185: 487–511). Los medios condicionados que expresan tanto IL–22R–Fc como IL–10R2–Fc se produjeron bien por transfección temporal del vector de expresión de fusión de IL–10R2–Fc en una línea de CHO que expresa IL–22R–Fc estable o por coamplificación de estos receptores de fusión. Se usaron medios condicionados (CM) como la fuente de todos los 30 receptores de condensación de Fc.

La fusión de Fc total en CM se cuantificó con un ELISA en sandwich de IgG anti–humana, usando 1 μg/ml de IgG anti–humana de cabra (Southern Biotech Associates, Inc., Birmingham, AL) como el anticuerpo de revestimiento, IgG–HRP antihumana de cabra diluida 1/10.000 (Southern Biotech Associates, Inc., Birmingham, AL) como el anticuerpo de detección y una proteína de fusión Fc purificada irrelevante como el estándar, cuantificada por su 35 absorbancia a A280. Se da a continuación un protocolo detallado para un ELISA estándar.

La integridad y composición de homodímeros de fusión Fc se evaluó en la presencia o ausencia de β–mercaptoetanol (Figura 7A), usando procedimientos electroforéticos de gel de archilamida de SDS estándar y bien dilución 1:5000 de IgG–HRP anti–humana de cabra (Southern Biotech Associates, Inc., Birminghan, AL), 1 μg/ml anti–IL–22R de conejo (ProSci, Poway, CA) o bien 0,2 μg/ml de anti–hIL–10R2 de cabra (R&D Systems, Minneapolis, MN) 40 como reactivos detectores. Nótese que tanto los anticuerpos de IL–22R como los anticuerpos de IL–10R2 detectarán tanto cadenas del homodímero respectivo como una cadena del heterodímero.

Para la detección específica de heterodímeros IL–22R–Fc/IL–10R2–Fc, se creó un ELISA en sandwich, usando 0,5 μg/ml de anti–hIL–22R de conejo (ProSci, Poway, CA) como el anticuerpo de revestimiento y 0,5 μg/ml de anti–hIL–10R2 de cabra biotinilado (R&D Systems, Minneapolis, MN) como el detector. 45

Anticuerpos de IL–22

Los anticuerpos monoclonales dirigidos contra IL–22 se generaron inmunizando primero ratas LOU (Harlan, Harlan, MA) con citocina murina y después con citocina humana. Se fusionaron bazos de rata con la línea celular de mieloma de ratón P3X63Ag8.653 (ATCC, Rockville, MD) y se generaron líneas celulares de hibridoma usando técnicas estándar (Goding J. Production of Monoclonal Antibodies. En: Monoclonal Antibodies: Principles and 50 Practices. 3ª edición San Diego: Academic Press; 1996, páginas 141–180). Las líneas que segregan anti–hIL–22 se identificaron inicialmente por ELISA, usando placas revestidas con 1 μg/ml de hIL–22 e IgG anti–rata de cabra conjugada con HRP diluida 1/5000 (Pierce, Rockford, IL) como el detector. Se han descrito previamente Ac–02 y Ac–04 como anticuerpos de IL–22 P3/3 y P3/2, respectivamente (véase Ejemplo 5 anteriormente). Los anticuerpos se purificaron de ascitis por procedimientos estándar. Para conversiones a molaridad, 150 ng/ml se define como 55

anticuerpo 1 nM.

ELISA de Unión Citocina IL–22/Fc de Receptor

Se usaron dos formatos estándar estudiando la interacción entre IL–22 y las fusiones del Fc de receptor. Los resultados mostrados en las Figuras 6A, BA–8B, 9A–9B, 10B–10C y 11A–11C se obtuvieron a partir de ensayos de ELISA donde el Fc de receptor de CM de CHO se inmovilizó primero por medio de un revestimiento de anti–hIgG. 5 Placas de ELISA de 96 pocillos, de fondo plano (Costar, Cambridge, MA) se revistieron durante toda una noche a 4°C con 100 μl de anticuerpo IgG antihumano de cabra (Southern Biotech Associates, Inc., Birmingham, AL) a 1 μg/ml en tampón de carbonato de sodio 0,1 M (pH 9,6). Las placas se lavaron dos veces con 200 μl de medio salino tamponado con fosfato que contiene Tween 20 al 0,05% (PBS–T), bloqueado con 100 μl de BSA 1% (Sigma, San Luís, MO) en PBS–T durante 1 hora y se lavó tres veces. Tras una hora de incubaciones secuenciales (100 μl), 10 separada cada una por tres lavados, se emplearon después: fusión/fusiones de un receptor dado a una concentración o diluido en serie, IL–22 biotiniladas (bio–IL–22) a una concentración dada o diluida en serie y después dilución 1/10,000 de estreptavidina–peroxidasa de rábano picante (HRP) (Southern Biotech Associates, Inc., Birmingham, AL). Después de un grupo final de lavado, se añadieron 100 μl de sustrato de peroxidasa de TMB Microwell (BioFX, Owings Mills, MD) durante 20 minutos y la reacción se detuvo con 100 μl de H2SO4 2N. La 15 detección colorimétrica del producto de peroxidasa se hizo a 450 nm en un lector de microplaca de Molecular Devices (Sunnyvale, CA).

Para ciertos ensayos de ELISA del formato anterior donde el receptor Fc y bio–IL–22 están a una concentración fija, se añadió IL–10R2–Pc a diversas concentraciones bien antes de o bien con bio–IL–22 (Figura 9A) o después de la bio–IL–22 (Figura 9B). Para otros ensayos de ELISA del formato anterior donde el receptor indicado Fc y bio–IL–22 20 están también a una concentración fijada, se añadieron los anticuerpos (Figura 10B–10C, 11C) o IL–22BP (Figura 11A–11B) a diversas concentraciones después de una pre–incubación con el bio–IL–22 durante 30 minutos. Para ensayos de ELISA en los que el reclutamiento de IL–10R2–Fc al complejo de IL–22/IL–22R se detectó directamente (datos no mostrados, diseño experimental de Figura 9A), se añadió IL–22 no biotinilado al ELISA y se usó como detector bien anti–hIL–10R2 de cabra policlonal o bien un anti–hIL–10R2 monoclonal de ratón (R&D Systems, Inc, 25 Minneapolis, MN).

La Figura 6B representa los resultados de un ensayo de ELISA llevado a cabo en el formato opuesto, en el que 100 μl de IL–22 biotinilados a 1 μg/ml se añadieron a placas revestidas de estreptavidina de 96 pocillos Reacti–bind (Pierce, Rockford, IL) durante una hora. Después de lavar, el receptor de fusión de Fc se añadió a diversas concentraciones a las placas durante una hora, se lavó y después se detectó con IgG–HRP anti–humana de cabra. 30 En la Figura 6A, se capturaron en pocillos revestidos de IgG anti–humana cincuenta ng/ml de Fc total en medios condicionados (CM) de células CHO que expresan bien IL–22R–Fc (■) o bien IL–10R2–Fc (O). IL–22 biotinilado (bio–IL–22) a diversas concentraciones se añadió después a los pocillos. La IL–22 unida se detectó subsiguientemente usando estreptavidina–HRP. En la Figura 6B, se capturó bio–IL–22 (1 μg/ml) en placas de estreptavidina. Diversas concentraciones bien de IL–22R–Fc (■) o bien de IL–10R2–Fc (O) en CM de CHO se añadieron después a los 35 pocillos. Fc de receptor unido se detectó subsiguientemente usando IgG–HRP anti–humana de cabra.

Inhibición de Fosforilación de STA T3 Usando anticuerpos Anti–IL–22

Se cultivaron las células HepG2 (ATCC, Rockville, MD) en medio esencial modificado de DuIbecco (DMEM) suplementado con suero fetal bovino al 10%, usando placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos (Coming, Corning, NY) sembradas a 4 x 105 células/pocillo. Después de 24 horas, se añadió medio recién preparado, con o sin 50 40 ng/ml de IL–22 humana, durante 25 minutos. Cuando se probó el anticuerpo en su potencia de neutralización, la citocina y el anticuerpo se preincubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las células se lisaron añadiendo 200 μl/pocillo de tampón de lisis celular (New England Biolabs, Beverly, MA). La concentración de proteína total en lisado celular se midió por ensayo de BCA (Pierce, Rockford, IL). Se separaron diez microgramos de proteína en un gel de SDS–poliacrilamida al 4–20% (Invitrogen, Carlsbad, CA) y se inmunotransfirió 45 subsiguientemente a temperatura ambiente durante toda una noche en una membrana de nitrocelulosa (Amersham, Braunschweig, Alemania). El STAT3 fosforilado se detectó usando el kit de anticuerpos p–stat3 Tyr705 (New England Biolabs, Beverly, MA). Se usó un sistema de detección de ECL para expresión de quimioluminiscencia como se recomendó por el fabricante (Pierce, Rockford, IL).

Ejemplo 12: IL–22 une IL–22R y no tiene afinidad detectable por IL–10R2 50

Se evaluó unión de IL–22 al dominio extracelular (ECD) de IL–22R y IL–10R2 usando dos formatos de ELISA. En la primera versión, se inmovilizaron proteínas de fusión de receptor–Fc por medio del dominio Fc en placas revestidas de IgG anti–humana. Se añadió después IL–22 biotinilado y se detectó con estreptavidina–HRP. Figura 6A es una gráfica lineal que muestra que bio–IL–22 se une al IL–22R–Fc inmovilizado, y se une no detectablemente a IL–10R2–Fc. En el formato inverso, se inmovilizó primero bio–IL–22 en placas revestidas de estreptavidina. Se añadió después 55

receptor–Fc y se detectó con anti–hIgG conjugada con HRP. Como se muestra en la Figura 6B, IL–22R–Fc soluble e IL–10R2–Fc no soluble, se unen a bio–IL–22 inmovilizada. Una ligera señal por encima de la precedente (fusión a Fc no específica) se observó cuando se añadió IL–10R2–Fc a este formato de ensayo a concentraciones más altas (3–10 μg/ml; datos no mostrados), sugiriendo que IL–10R2–Fc tiene una avidez muy baja por la bio–IL–22 inmovilizada. En resumen, este primer grupo de experimentos de ELISA indica que hay una interacción relativamente fuerte entre 5 IL–22 e IL–22R, mientras que IL–10R2–Fc tiene sólo una avidez ligera por IL–22.

Ejemplo 13: Preparación y caracterización de homodímeros y heterodímeros de IL–22R–Fc e IL–10R2–Fc

Los siguientes experimentos se dirigieron a evaluar si el dominio extracelular de IL–10R2 se une a IL–22 cuando se yuxtapone con IL–22R–Fc. Dado que se observó que IL–22R–Fc se segrega pobremente a partir de líneas de CHO amplificadas (~50–100 ng/ml) mientras que IL–10R2–Fc se segrega bastante bien (~10 μg/ml), se cree que IL–10R2–10 Fc puede ser capaz de facilitar la secreción de IL–22R–Fc. Una línea de CHO que expresa IL–22R–Fc se transfectó transitoriamente con un vector de expresión de IL–10R2–Fc. La introducción de este plásmido incrementó la expresión de IL–22R–Fc de dos a cuatro veces. Se establecieron subsiguientemente líneas estables que coexpresan ambas cadenas receptoras de fusión de Fc.

Se determinaron fusiones IL–22RECD–Fc e IL–10R2ECD–Fc que tienen pesos moleculares de – 60 kD y de ~85 kD, 15 respectivamente. Los medios (CM) condicionados reducido y no reducido de células CHO que expresan una cualquiera o ambas fusiones de receptor Fc se separaron en geles de SDS–PAGE y se inmunotransfirieron a una membrana que se sondeó después con anticuerpos policlonales dirigidos bien contra Fc de IgG humana, bien contra IL–22R o bien contra IL–10R2. Más específicamente, en la Figura 7A, se separaron medios condicionados de células CHO que expresan bien IL–Fc, bien IL–10R2–Fc o bien ambos Fc de receptor en geles de poliacrilamida al 8% tanto 20 en condiciones reducidas (+βME) como en condiciones no reducidas (–βME) y se transfirieron a transferencias de membrana. Las transferencias de Western se llevaron a cabo usando cualquiera de anticuerpos IgG1 anti–humanos, anti–hIL–22R o anti–hIL–10R2. Para detección de anti–hIgG de una inmunotransferencia, se cargaron 4 ng de fusión de Fc total en CM en cada carril. Para detección de anticuerpos de anti–IL–22R y anti–IL–10R2, se usaron 16 ng de fusión de Fc total en CM de CHO que coexpresan. En la Figura 7B, los medios condicionados de células CHO que 25 expresan bien IL–22R–Fc (■), bien IL–10R2–Fc (O) o bien ambos (▲) se añadieron a placas de ELISA revestidas con anticuerpo anti–IL–22R humano de conejo. Una mezcla 1:1 de los dos homodímeros se añadió también a un control (Δ). Los receptores unidos se detectaron usando un anticuerpo de IL–10R2 anti–humano de cabra biotinilado, seguido por estreptavidina–HRP.

En condiciones reductoras (+ [BME, Figura 7A), líneas de CHO de IL–22R y IL10R2–Fc segregan una proteína de 30 fusión de Fc humana con un peso molecular bien diferenciado. La detección con anticuerpos específicos de cadena de receptor confirma que la especie de –60 kD es IL–22R–Fc mientras que la especie de ~85 kD es IL–10R2–Fc. Ambas de estas proteínas de fusión de receptor maduro tienen pesos moleculares teóricos de ~51 kD. Se predice que, IL–22R–Fc, con cuatro sitios de glicosilación potenciales, está glicosilado menos extensivamente durante su paso a través de una célula de CHO, que IL–10R2–Fc, con cinco sitios unidos a N potenciales. IL–10R2–Fc parece 35 tener modificaciones postraduccionales más extensas. Este análisis, en condiciones reductoras, también muestra que las células de CHO que coexpresan segregan ambas fusiones de Fc. Los datos derivados del panel de detección de anti–hIgG sugieren que IL–10R2–Fc se expresa a un nivel más alto que IL–22R–Fc.

Las células CHO que expresan ambas fusiones de receptor Fc segregan predominantemente heterodímero IL–22R/IL–10R2–Fc y homodímero de IL–10R2–Fc. Dado que estas fusiones de receptor Fc tienen pesos moleculares 40 bien definidos, el análisis del CM por SDS–PAGE (–βME, Figura 7A) no reductor permite la detección del heterodímero de fusión de Fc que se separa en geles entre los dos homodímeros. En estas condiciones, tanto heterodímero IL–22R/IL–10R2–Fc como homodímero IL–10R2–Fc se detectaron con anti–IgG en el CM a partir de células CHO que coexpresan. En contraste, el homodímero IL–22R–Fc se detecta pobremente. El panel de detección de anticuerpos de IL–22R, en condiciones no reductoras, demuestra que CHO que coexpresan segregan 45 homodímero IL–22R–Fc, pero sustancialmente menos que el heterodímero. Tomados conjuntamente, los resultados mostrados en la Figura 7A indican que CHO transfectadas con IL–22R/IL–10R2–Fc segregan heterodímero IL–22R/IL–10R2–Fc covalente y homodímero IL–10R2–Fc y muy poco homodímero IL–22R–Fc.

La presencia de heterodímeros en el CM de células CHO se verificó por ELISA en sandwich, usando anticuerpos específicos para cada cadena del heterodímero. Se añadieron medios condicionados a pocillos revestidos con un 50 anticuerpo policlonal de IL–22R y la proteína unida se detectó después con un anticuerpo policlonal de IL–10R2 biotinilado. Este formato de ELISA detectará sólo moléculas donde hay una asociación estable entre los epítopos de IL–22R y de IL–10R2. CM de CHO que expresan bien IL–22R–Fc solo o bien IL–10R2–Fc solo o bien estos CM mezclados conjuntamente no da señal detectable en este formado de ELISA. Se obtuvo una señal sólo a partir de células CHO que co–expresaron IL–22R–Fc e IL–10R2–Fc. Esta observación demostró, junto con los datos de la 55 Figura 7A, que las células CHO que expresan ambos receptores de fusión de Fc segregan heterodímeros que contienen una asociación covalente entre las cadenas monoméricas de Fc de IL–22RECD y de IL–10R2ECD.

En resumen, los resultados mostrados en las Figuras 7A–7B indican que las fusiones de receptores Fc se segregan a partir de células CHO como homodímeros y heterodímeros. Las células CHO que coexpresan IL–22R/IL–10R2–Fc segregan mayoritariamente heterodímero y homodímero IL–10R2–Fc.

Ejemplo 14: IL–22 presentan unión potenciada a cadenas de receptor IL–22R/IL–10R2 yuxtapuestas

Se evaluó después la unión de IL–22 a la ECD de IL–22R e IL–10R2 segregadas como heterodímero de Fc. Se 5 inmovilizó primero una concentración fijada de la proteína de fusión de Fc total de CM por medio del dominio Fc en placas revestidas de IgG anti–humana. La capacidad de citocina para unirse se evaluó después usando diversas concentraciones de bio–IL–22 como el detector (Figura 8A). Como en la Figura 6A, los homodímeros IL–22R–Fc e IL–10R2–Fc dan una señal y una señal no detectable, respectivamente. La unión más eficiente de bio–IL–22, sin embargo, se obtuvo con receptor de Fc inmovilizado a partir de CM de células CHO coexpresantes: se necesitaron 10 ocho veces menos bio–IL–22 que para una señal comparable con homodímero de IL–22R–Fc inmovilizado. Dado que la unión del componente homodímero de IL–10R2 Fc a IL–22 es indetectable en estas condiciones (Figura 6A, 8A), la unión potenciada de IL–22 por proteína Fc de CM de CHO coexpresantes debe deberse al componente heterodimérico IL–22R/IL–10R2–Fc. De nuevo, se segrega muy poco homodímero IL–22R–Fc por estas células CHO coexpresantes (Figuras 7A–7B). La potencia más fuerte del heterodímero para unir IL–22 se resalta por el hecho de 15 que se usó menos heterodímero inmovilizado en relación al homodímero de IL–22R–Fc en el diseño experimental de la Figura 8A. Dado que una cantidad fija de Fc se añadió a los pocillos, el CM que contiene heterodímero, en contraste con el CM de homodímero de IL–22R–Fc, se diluye por otros componentes de Fc. Se concluyó que el heterodímero IL–22R/IL–10R2–Fc da la mejor señal de unión, indicando un papel en la unión de IL–22 para la ECD de IL–10R2. Dado que el homodímero IL–10R2 no puede unir IL–22, estos resultados también indican que el efecto de 20 IL–10R2 en unión de IL–22 requiere la presencia de IL–22R.

IL–22R e IL–10R2 ECD yuxtapuestos al azar pueden unir también IL–22 más eficientemente que homodímeros de IL–22R–Fc. Para el experimento de la Figura 3B, se prepararon las mezclas 1:1 de CM, conteniendo cantidades equivalentes del homodímero de IL–22R–Fc y bien homodímero de IL–10R2–Fc o bien un homodímero de Fc irrelevante. Las mezclas de fusión de Fc, así como CM que contiene heterodímero, se diluyeron en serie y después 25 se inmovilizaron a concentraciones de Fc totales dadas en placas revestidas de IgG anti–humana. La capacidad de citocina para unirse se evaluó después usando una concentración fijada de bio–IL–22 como el detector. Los resultados de la Figura 8B indican que una mezcla de homodímeros de IL–22R–Fc y de IL–10R2–Fc se une a bio–IL–22 con eficiencia 2–3 veces mayor que una mezcla de IL–22R–Fc y homodímeros de Fc irrelevantes. Esta observación indica que las cadenas de receptor IL–22R e IL–10R2 no necesitan estar covalentemente unidas por IL–30 10R2–Fc para facilitar su función en este formato basado en ELISA. Si la yuxtaposición física apropiada tiene lugar durante el revestimiento aleatorio de los dos homodímeros juntos, después se detecta la unión potenciada de IL–22 biotinilada en relación a la mezcla de IL–22R–Fc y homodímeros irrelevantes de Fc. Esta señal potenciada es más pronunciada a concentraciones más altas del Fc total, donde es más probable que IL–22R e IL–10R2 ECD se yuxtapongan de forma adyacente una con respecto a otra. En contraste, la asociación covalente entre el receptor Fc 35 del heterodímero da una yuxtaposición independiente de la concentración del ECD de estos receptores y así da la señal más fuerte a cualquier concentración de Fc total. En resumen, los resultados mostrados en las Figuras 8A–8B indican que el ECD de IL–22R se requiere para la detección del papel de IL–10R2 en la detección de IL–22. La unión potenciada de IL–22 se detecta cuando ambos dominios extracelulares están presentes.

Ejemplo 15: El dominio extracelular (ECD) de IL–10R2 lleva a cabo la estabilización de una interacción inicial entre 40 IL–22 y el dominio extracelular de IL–22R

La función de unión de IL–22 de IL–10R2 requiere la presencia de IL–22R (Figuras 8A–8B). Evaluando adicionalmente el papel temporal de IL–10R2 en el desarrollo de un complejo receptor de citocinas IL–22, el formato de ELISA se modificó añadiendo homodímero IL–10R2–Fc después del homodímero IL–22R–Fc. El efecto de añadir homodímeros IL–10R2–Fc podría evaluarse bien antes, bien con o bien tras la adición de bio–IL–22. Más específicamente, en la 45 Figura 9A, se capturaron cincuenta ng/ml de IL–22R–Fc de CM en pocillos revestidos de IgG anti–humana. Los pocillos se bloquearon con 100 μg/ml de IgG humana. Se añadió después Bio–IL–22 (30 ng/ml) a los pocillos. La IL–22 unida se detectó subsiguientemente usando estreptavidina–HRP (línea discontinua). Se añadieron también diversas concentraciones de IL–10R2–Fc y IL–22 biotinilada (30 ng/ml) conjuntamente y después se detectó bio–IL–22 unida (♦). Se añadieron también primero diversas concentraciones de IL–10R2–Fc de medio condicionado, se 50 incubaron, se lavaron las placas y después se añadieron subsiguientemente 30 ng/ml de bio–IL–22 a los pocillos y se detectó bio–IL–22 unida (◊). La IL–10R2–Fc se diluyó en serie en hIgG a 100 μg/ml. En la Figura 9B, se capturaron cincuenta ng/ml de IL–22R–Fc de medio condicionado en pocillos revestidos de IgG anti–humana. Se añadió después Bio–IL–22 (30 ng/ml) a los pocillos. Bio–IL–22 unida se detectó entonces inmediatamente después, usando estreptavidina–HRP (línea sólida). Se detectó también bio–IL–22 unido después de 1 hora adicional de incubación 55 bien con PBS–BSA al 1% (línea discontinua) o bien con diversas concentraciones de IL–10R2–Fc (•).

Para el experimento de la Figura 9A, se inmovilizó una cantidad fijada de homodímero de fusión de IL–22R–Fc por

medio de su Fc en placas revestidas de IgG anti–humana. Se añadió después IgG humana (100 μg/ml) ocupando o bloqueando anticuerpo IgG anti–humano aún disponible en la placa. Una concentración fijada de bio–IL–22 da una señal (–1,25), unida a la placa por su interacción con el ECD de IL–22R. Si el homodímero de IL–10R2–Fc, diluido en serie en hIgG, se añade antes de la adición de bio–IL–22, no hay impacto en la cantidad de bio–IL–22 subsiguientemente unida a la placa. Estas observaciones sugieren que los ECD de homodímeros de IL–22R–Fc y de 5 IL–10R2–Fc son incapaces de llevar a cabo solos una asociación estable con cada uno de los otros que se detecta subsiguientemente por una potenciación de unión de IL–22. Más bien, IL–10R2 requiere la presencia de IL–22, así como de IL–22R, con el fin de llevar a cabo su potenciación de unión de citocinas. En el experimento de la Figura 9A, si IL–10R2–Fc se añade con la bio–IL–22, hay ahora un incremento dependiente de dosis de IL–10R2 en la cantidad de bio–IL–22 que está unida al IL–22R. De nuevo, la adición de IL–10R2–Fc no puede efectuar potenciación si se 10 incuba con el IL–22R–Fc inmovilizado antes de la adición de bio–IL–22.

En consideración tanto del requisito previo de la IL–22 (Figura 9A) como del requisito previo deI L–22R (Figura 8) para el efecto de IL–10R2 en la unión de citocinas, se determinó directamente si estos requisitos constituyen una interacción entre IL–22 e IL–22R. Para el experimento de la Figura 9B, se inmovilizó una cantidad fijada de homodímero de fusión de IL–22R–Fc por medio de su Fc en placas revestidas de IgG anti–humana. La adición de una 15 concentración fijada de bio–IL–22 da una señal (~2,5), unida a la placa por su interacción con el ECD de IL–22R. En lugar de detectar la señal de bio–IL–22 inmediatamente, se detectó después de lavados subsiguientes y de una incubación adicional. Cuando primero bio–IL–22 y después BSA al 1% se incuban en los pocillos, se detectan 0,6 (es decir 1,5/2,5) de la señal original, indicando que algunos de los bio–IL–22 se liberaron a partir del homodímero de IL–22R–Fc inmovilizado durante la incubación adicional con BSA al 1%. En contraste, cuando primero bio–IL–22 y 20 después concentraciones crecientes de homodímero IL–10R2–Fc se añaden a los pocillos, se detecta más señal de bio–IL–22, aproximándose al nivel de señal obtenido inmediatamente después de la incubación de bio–IL–22. Estos resultados indican que la función de IL–10R2 en unión de IL–22 requiere una interacción entre IL–22 e IL–22R. La adición de IL–10R2 a los pocillos, después de la incubación de IL–22, induce la formación de un complejo que tiene una constante de disociación más lenta para IL–22 que para IL–22R solo. 25

Tomados conjuntamente, los resultados mostrados en las Figuras 6, 8 y 9 sugieren un modelo temporal para la unión de IL–22 por el ECD de las cadenas receptoras de IL–22R y de IL–10R2. IL–22 se une primero a IL–22R. IL–10R2 se une después a IL–22/IL–22R, manteniendo estabilizando adicionalmente la IL–22 en el complejo receptor de citocinas (resumidas en la parte esquemática de la Figura 12).

Ejemplo 16: Se Requieren Dos Superficies Bien Definidas de IL–22 para la Interacción Respectiva con el ECD de IL–30 22R y con el ECD de IL–10R2

Se generaron dos anticuerpos monoclonales de ratas, Ac–02 y Ac–04, y mostraron unirse a IL–22 humana (Ejemplo 5). Se probaron estos anticuerpos en su capacidad para bloquear la transducción de señales dependiente de IL–22. IL–22 lleva a cabo la fosforilación del factor de transcripción STAT3 en las líneas celulares que expresan tanto cadenas de receptor IL–22R como cadenas de receptor IL–10R2 (por ejemplo HEPG2) (Dumoutier L. y col. (2000) 35 Proc Natl Acad Sci USA 97 (18): 10144–9). Si estos anticuerpos neutralizan IL–22, después se detectaría menos P–STAT3 en los lisados de las células. Para el experimento de Figura 10A, se preincubó el anticuerpo diluido en serie con una concentración fijada de IL–22 en medios celulares. Estos medios, incluyendo IL–22 formando complejo con anticuerpo, se aplicaron después a las células HEPG2. Los lisados celulares se prepararon subsiguientemente, la proteína se separó por electroforesis en gel, se transfirió a una membrana, que se incubó con un anticuerpo 40 específico para P–STAT3. Más específicamente, se preincubó IL–22 humana (50 ng/ml) durante 30 minutos a 37ºC con diversas concentraciones de Ac–02 o Ac–04 en medios celulares, los medios se añadieron después a células HepG2 y las células se incubaron durante 25 minutos. Los lisados celulares se analizaron después por transferencia de Western usando un anticuerpo de anti–fosfo–STAT3. Las células incubadas con IL–22 solo (+) o sin IL–22 (–) se incluyen como control positivo y negativo, respectivamente. Ambos de estos anticuerpos son capaces de bloquear la 45 actividad de IL–22 en las células: con concentración creciente de anticuerpo, la detección de P–STAT3 decrece. Sin embargo, estos anticuerpos difieren en su potencia: DN50 de Ac–02 y Ac–04 son ~33 nM y ~0,4 nM, respectivamente. En resumen, los resultados mostrados en la Figura 10A indicaron que ambos anticuerpos se unen a una(s) superficie(s) en IL–22 importantes para su capacidad de citocinas de señalizar dentro de una célula.

Si cada anticuerpo neutraliza IL–22 inhibiendo su interacción con cadenas receptoras, después Ac–02 y Ac–04 50 definen epítopo(s) de IL–22 requerido(s) para interacción con receptores de citocinas. Los anticuerpos se evaluaron en el ELISA de unión a receptor de citocinas determinando como estos anticuerpos afectan a la unión de IL–22. Para el experimento de la Figura 10B, se inmovilizó una cantidad fijada de homodímero de IL–22R–Fc por medio de su Fc en placas revestidas de IgG anti–humana. Una concentración fijada de bio–IL–22 da una señal (~2,25), unida a la placa por su interacción con el ECD de IL–22R. La preincubación de estos dos anticuerpos con IL–22 tiene impactos 55 cualitativamente diferentes en la capacidad de IL–22 para unirse subsiguientemente a IL–22R. Ac–04 bloquea unión de IL–22 a IL–22R (DN50=0,7 nM) mientras que Ac–02 potencia la unión de IL–22 a IL–22R (CE50 = 0,1 nM). Los fenotipos bien definidos para estos anticuerpos en este ELISA indican que definen diferentes epítopos de IL–22. El

epítopo definido por Ac–04 se requiere bien para el reconocimiento de IL–22 por el ECD de IL–22R o bien el anticuerpo interfiere estéricamente con el reconocimiento de un epítopo de IL–22 adyacente por IL–22R.

Estos anticuerpos se evaluaron también por su efecto en unión de IL–22 cuando el heterodímero IL–22R/IL–10R2–Fc, más que el homodímero de IL–22R, se inmovilizó en pocillos revestidos de IgG anti–humana (Figura 10C). En el experimento de la Figura 10C, la adición subsiguiente de una cantidad fijada de bio–IL–22 dio una señal (~2,5), unida 5 a la placa por su interacción tanto con IL–22R como con IL–10R2. En este caso, ambos anticuerpos inhiben la unión de IL–22 al receptor de fusión de Fc heterodimérico. De nuevo, estos anticuerpos difieren cualitativamente. Ac–04 inhibe la unión casi completamente, con una DN50 = 0,2 nM. En contraste, Ac–02 inhibe la unión parcialmente, con una DN50 ≥ 10 nM. Los autores de la presente invención concluyen que Ac–04 bloquea casi completamente la interacción entre IL–22 y IL–22R tanto en ELISAS de IL–22R (Figura 5B) como en ELISAS de heterodímero (Figura 10 10C). La potencia relativamente baja de Ac–02 en el ELISA de heterodímero es presumiblemente un reflejo de su afinidad relativamente pobre por IL–22. Dado que Ac–02 no bloquea la interacción entre IL–22 e IL–22R (Figura 10B), los resultados mostrados en la Figura 10C sugieren que Ac–02 define un epítopo separado que se requiere bien para estabilización de IL–10R2 de unión de IL–22 o bien para unión del Ac–02 a este epítopo que interfiere estéricamente con reconocimiento de un epítopo de IL–22 adyacente por IL–10R2. 15

Un anticuerpo policlonal de IL–10R2 se evaluó también por su capacidad para inhibir la unión de IL–22 tanto a IL–22R como a heterodímeros de Fc de receptor. En el ELISA anterior, donde IL–10R2 no está presente, se añadieron cantidades crecientes de este anticuerpo con una cantidad fijada de bio–IL–22 y no tuvieron impacto significativo en la interacción entre IL–22 y el homodímero de IL–22R (Figura 10B). En contraste, cuando se añadieron cantidades crecientes de anticuerpo IL–10R2 con IL–22 a un ELISA que incluía IL–22R/IL–10R2–Fc inmovilizado, este anticuerpo 20 bloqueó la unión de IL–22 al heterodímero (DN50 = 3 nM, Figura 10C). La completitud de este efecto indica que la unión de este anticuerpo policlonal a diversos epítopos de IL–10R2 también evitó, presumiblemente por interferencia estérica, la interacción entre IL–22 e IL–22R.

En resumen, los resultados mostrados en las Figuras 10A–10C sugieren que Ac–02 y Ac–04 definen cada uno epítopos distintos en IL–22 que son importantes por su interacción de IL–22 con sus cadenas de receptor. Ac–04 25 define un epítopo esencial para reconocimiento inicial de IL–22R de IL–22 (Figura 12). Ac–02 define un epítopo necesario para el papel de IL–10R2 en la estabilización del complejo receptor de citocinas (Figura 12). Los datos comparables con monoclonales anti–IL–22 murina de rata definen epítopos similares en mIL–22 (datos no mostrados). La inhibición de unión de IL–22 por un anticuerpo policlonal de IL–10R2 corrobora adicionalmente la importancia de IL–10R2 para unión de citocinas. 30

Ejemplo 17: IL–22BP Bloquea la Interacción Entre IL–22 e IL–22R

La proteína de unión de IL–22 (IL–22BP) es un 'receptor’ soluble para IL–22 que tiene homología baja al dominio extracelular de IL–22R. Ello neutraliza la transducción de señales mediada por IL–22 (Dumoutier, L. y col. (2001) J Biol Chem 166 (12): 7090–5; Kotenko S.V. y col. (2001) J Biol Chem 166 (12): 7096–103; Kotenko S.V. y col. (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98 (17): 9511–6; Wei C–C y col. (2003) Genes & Immunity 4: 204–21117). Los medios 35 condicionados de células CHO que segregan una fusión de IL–22BP–Fc se añadieron a ELISA de unión de receptor de citocinas determinando como este antagonista natural bloquea interacción de IL–22 con las cadenas de receptores. Para los experimentos de la Figura 11A y la Figura 11B, se inmovilizó una cantidad fijada de Fc total a partir de células que expresan homodímero de IL–22R–Fc o heterodímero IL–22R/IL–10R2–Fc, respectivamente, por medio de su Fc en placas revestidas con IgG anti–humana. Una concentración fijada de bio–IL–22 da una señal, 40 unida a la placa por su interacción con cadenas de receptores inmovilizados. Donde se añadieron concentraciones crecientes de IL–22BP–Fc con una concentración fijada de IL–22, IL–22BP–Fc bloqueó casi completamente la unión de IL–22 tanto a IL–22R (DN50 = 4 nM; Figura 11A) como al heterodímero (DN50 = 2 nM; Figura 6B). Esto sugiere que IL–22BP inhibe unión bloqueando un epítopo de IL–22 requerido para su reconocimiento por IL–22R. Estas observaciones son similares a aquellas obtenidas con el Ac–04. 45

Con el fin de determinar si IL–22BP, Ac–04 y Ac–02 se unen a epítopos bien diferenciados o solapantes en IL–22, se empleó un ELISA de unión en el que IL–22BP–Fc se inmovilizó por medio de su Fc en placas revestidas de IgG anti–humana (Figura 11C). Una concentración fijada de bio–IL–22 da una señal, unida a la placa por su interacción con IL–22BP. Concentraciones crecientes de Ac–04 o Ac–02 se añadieron también con una concentración fijada de IL–22. Ac–04 bloqueó la interacción entre IL–22 e IL–22BP completamente (DN50 = 0,05 nM), indicando que estos dos 50 inhibidores comparten el mismo epítopo o un epítopo de IL–22 solapante. En contraste, Ac–02 bloqueó el reconocimiento de IL–22BP por IL–22 parcial y débilmente (DN50= 100 nM) indicando que Ac–02 y IL–22BP tienen epítopos bien diferenciados que se solapan sin embargo en IL–22.

En resumen, los resultados mostrados en la Figura 11 indican que IL–22BP y Ac–04 comparten un epítopo similar en IL–22 que es importante para unirse a IL–22R. El epítopo de IL–22 definido por Ac–02 es distinto. 55

Ejemplo 18: IL–22 Interacciona Secuencialmente con el ECD de IL–22R y de IL–10R2

Se usaron las fusiones de citocina IL–22 humana marcada con HIS/FLAG de forma N–terminal e IL–22RECD– e IL–10R2ECD–Fc en un formato basado en ELISA explorando como interacciona IL–22 con las cadenas de su receptor. Como se resume en el modelo esquemático de la Figura 12, IL–22 puede unirse primero al ECD de IL–22R. Después EL–22/IL–22RECD interacciona con el ECD de IL–10R2 formando un complejo receptor de citocinas con una afinidad 5 más alta por IL–22. Mientras que el reclutamiento estable de IL–10R2ECD a este complejo no se ha mostrado directamente, las siguientes observaciones respaldan este modelo.

Se examinó la interacción de IL–22 con las subunidades del receptor individual y se encontró que la unión entre IL–22 e IL–22R podría detectarse fácilmente (DE50 = 20 ng/ml de IL–22 y DE50 = 6 ng/ml de IL–22R–Fc en la Figura 6A y en la 6B, respectivamente). En contraste, solo se pudo detectar una avidez débil entre IL–22 inmovilizada e IL–10R2 10 soluble y esto requirió concentraciones altas de IL–10R2–Fc (3–10 μg/ml; datos no mostrados). Estos resultados son consistentes con los estudios recientes por Logsdon, N.J. y col. infra, donde las interacciones entre IL–22 e IL–22R monoméricos se detectaron en el intervalo nanomolar (Keq –15 nM) mientras que las interacciones entre IL–22 e IL–10R2 estuvieron en el intervalo milimolar (Keq ~1 mM) (Logsdon, N.J. y col. (2002) J Interferon Cytokine Res 22 (11): 1099–112). 15

Sin comprometerse con ninguna teoría, los solicitantes proponen que la ECD de IL–10R2 se asocia subsiguientemente con el complejo IL–22 R/IL–22RECD inicial, en base a su afinidad por un epítopo definido por la interacción de IL–22 y el dominio extracelular de IL–22R. Esta relación temporal del IL–10R2ECD estabiliza la citocina dentro del complejo receptor y conduce a transducción de señales efectiva (Figura 12). Los experimentos que implican bien la adición anterior, concomitante (Figura 9A) o bien la adición secuencial (Figura 9B) de IL–10R2 Fc 20 soluble a IL–22 biotinilada en un ELISA de IL–22R inmovilizado demostraron que el efecto de IL–10R2 en unión de IL–22 es dependiente de una interacción de IL–22/IL–22R anterior (Figura 9). En el sistema usado, IL–10R2–Fc no se puede asociar primero bien con IL–22 (Figura 6) o bien con IL–22R–Fc (Figura 9A) con el fin de llevar a cabo unión de IL–22 potenciada. Estas observaciones son consistentes con las medidas de afinidad de Logsdon y col. (2002) supra donde la afinidad de IL–22 inmovilizada por IL–10R2 solo en fase de solución es ~1 mM (Keq) mientras que su 25 afinidad para fase de solución IL–22R e IL–10R2 conjuntamente es veinte veces mayor (~ 45 μM).

La relación estable de la subunidad IL–10R2 con el complejo IL–22/IL–22R en este sistema de ELISA no se detectó directamente usando bien un anticuerpo de hIL–10R2 policlonal o bien un anticuerpo de hIL–10R2 monoclonal. Ambos de estos reactivos anti–hIL–10R2 detectaron una unión no específica pronunciada de IL–10R2–Fc a las placas de ELISA, incluso en la presencia de 100 μg/ml de IgG humana e independiente de la adición de IL–22R o IL–22. 30 Este antecedente alto puede haber enmascarado una señal menor derivada de la asociación dependiente de IL–22/IL–22R de IL–10R2 a las placas de ELISA. Nótese, sin embargo, que esta unión no específica de IL–10R2–Fc no potencia la señal derivada de bio–IL–22 cuando se añadió citocina subsiguientemente, presumiblemente porque IL–22R–Fc insuficiente se yuxtapone de forma adyacente a IL–22RECD cuando hIgG se añade al ensayo (Figura 9A).

La yuxtaposición covalente de IL–22R a IL–10R2 en el contexto de un heterodímero da detección óptima de unión a 35 IL–22 en el sistema usado en el presente documento (Figura 8A). En efecto, esta asociación covalente incrementa la probabilidad de que IL–10R2ECD esté en proximidad cercana a un complejo IL–22/IL–22RECD, una vez se añade citocina al ensayo. Estos heterodímeros pueden imitar artificialmente una preasociación potencial entre las subunidades del receptor IL–22R e IL–10R2 dentro de una membrana celular. Estudios en un sistema FRET de célula individual desarrollados por Krause y col. (2002) MolecuIar & Cellular Proteomics 1(10): 805–15 indican que 40 las preasociaciones entre cadenas receptoras IFN–γR1 e IFN–γR2 totalmente funcionales se pueden detector por medio de las fusiones de GFP y de BFP C–terminales, con unión de IFN–γ a células en este sistema y la oligomerización presumida del complejo citocina–receptor, la señal FRET disminuye, sugiriendo que los dominios intracelulares aparte fosforilan como quinasas las cadenas receptoras y amplifican la cascada de señales más adelante en la secuencia. En un modelo, las interacciones del receptor de citocinas estudiadas en los modelos de 45 sistemas de ELISA describieron en el presente documento las interacciones requeridas para la oligomerización de cadenas de receptor de IL–22 preasociadas, así como otros tipos de receptores de citocinas de tipo II, en una membrana celular.

Ejemplo 19: IL–22 tiene superficies de unión a IL–22R y a IL–10R2 separadas

Los anticuerpos de IL–22 de rata, Ac–02 y Ac–04, han probado ser herramientas útiles para evaluar los sitios de unión 50 potenciales en epítopos de IL–22 que se requieren para el ensamblaje temporal propuesto del complejo citocina–receptor y para la transducción de señales subsiguiente (Figura 12). El estudio de los efectos de estos anticuerpos permite la caracterización de dos tipos de antagonistas de IL–22. El primer tipo, ejemplificado por Ac–04 e hIL–22BP–Fc, bloquea la interacción inicial entre IL–22 y IL–22R (Figuras 10B y 12). El segundo tipo de inhibidor, ejemplificado por Ac–02, bloquea el reconocimiento subsiguiente de IL–22/IL–22RECD por IL–10R2ECD (Figuras 10C y 12). Estos 55 anticuerpos también bloquearon la transducción de señales mediada por IL–22 (Figura 10A).

Si los epítopos definidos por los anticuerpos de IL–22 se solapan con los sitios de unión al receptor o con el sitio de unión al anticuerpo interfieren estéricamente con el reconocimiento de la citocina por la cadena receptora, estos dos tipos de anticuerpos confirman que IL–22 tiene distintos sitios de unión para IL–22 e IL–10R2. Centrándonos en las características de los anticuerpos comunicados aquí, Ac–04 se une a un epítopo de IL–22 que evita el reconocimiento de IL–22 por IL–22R; este no es el caso para Ac–02. La asociación de IL–22 con IL–22R no está 5 bloqueada por Ac–02. De hecho, Ac–02 potencia la unión de IL–22 a IL–22R inmovilizado (Figura 5B). Se cree que esto es debido al reconocimiento de Ac–02 de un cambio conformacional en IL–22 que se lleva a cabo por esta interacción de citocinas con el ECD de IL–22R. Mientras que Ac–02 no bloquea la primera etapa en ensamblaje de citocinas, es capaz de bloquear la segunda etapa (es decir, el reconocimiento de IL–22/IL–22R por ECD de IL–10R2). Se concluye, por lo tanto, que Ac–04 y Ac–02 bloquean el reconocimiento de sitios de unión distintos por IL–22R e IL–10 10R2, respectivamente, en IL–22. El antagonista que se da en la naturaleza y la proteína de unión para IL–22, IL–22BP, tienen características similares a Ac–04, que interfieren con el reconocimiento de IL–22 por IL–22R (Figura 11A). La capacidad de Ac–04 para interferir fuertemente con la unión de IL–22 a IL–22BP–Fc inmovilizado respalda adicionalmente la conclusión de que Ac–04 e IL–22BP comparten un epítopo similar en IL–22 que es distinto de aquel definido por Ac–04. 15

En resumen, los resultados mostrados en el presente documento sugieren que IL–22 interacciona con sus cadenas receptoras en un mecanismo temporal. Primero, IL–22 se asocia con el ECD de IL–22R donde los antagonistas ejemplificados por Ac–04 e IL–22BP–Fc evitan esta interacción. Segundo, el ECD de IL–10R2 se une a un sitio de unión distinto definido por la interacción anterior entre IL–22 e IL–22R. Esta última interacción se bloquea por antagonistas ejemplificados por Ac–02 (Figura 12). 20

Ejemplo 20: Inhibición de actividad de IL–22 en un ensayo de pSTAT Luciferasa usando anticuerpos de IL–22 anti–humanos de rata

Protocolos Experimentales:

El vector pSTAT–TA–Luciferasa se construyó como sigue. Se clonaron cinco copias de elementos de respuesta a STAT (RN Pearse y col. (1993) PNAS 90: 4314–4318) dentro del vector pTA–Luc obtenido de una fuente comercial 25 (N.º de Cat. de Clontech: PT3606–5).

Se detectó actividad luciferasa usando el siguiente ensayo de pSTAT Luciferasa: en el primer día, se tripsinizaron plenamente células HepG2 y se dividen en platos P–100 (Coming) a una densidad de 5 x 106 células/P100. En el segundo día, las células se transfectaron en las siguientes condiciones por plato P100: Solución 1: 20 μg de pSTAT–TA–Luc ADN + 0,5 ml de medio libre de suero (Opti–MEM de Gibco); y Solución 2: 60 μl de Lipofectamina2000 (de 30 Gibco) + 0,5 ml de medio libre de suero (Opti–MEM de Gibco). La Solución 1 se añadió suavemente en la Solución 2 y se mezcló bien invirtiendo el tubo varias veces. La mezcla se dejó permanecer durante 20 minutos a temperatura ambiente. El medio de células HepG2 se retiró y se lavó una vez con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Se añadieron 9 mI/p100 de medio libre de suero (DME+PSG+HEPES) a P100. Se añadió una adición gota a gota de mezcla de ADN/Lipofectamina 2000 (Solución 1 + Solución 2) a las células. La mezcla se removió suavemente y se 35 volvió a poner en el incubador. En el tercer día, las células se tripsinizaron y plaquearon en una placa de fondo plano de cultivo celular de 96 pocillos, una placa de 96 pocillos/p100, 100 μI/pocillo. En el cuarto día, se preincubó una serie de diluciones de anticuerpos con 30 ng/ml de huIL–22 en DME+PSG+FBS al 10% a 37°C durante 30 minutos. Se añadieron después 100 μl de la mezcla de anticuerpos:citocinas a placas de cultivo celular después de que se retirase el medio. Las células se incubaron a 37°C durante 6 horas. El medio se retiró, se añadieron 50 μl/pocillo 40 para placas de 96 pocillos de tampón de RLB 1x (Promega E3971) y se mezclaron hasta que fueron homogéneos. Se transfirieron 40 μI de lisado por ensayo de luciferasa en placas de ensayo de 96 pocillos de quimioluminiscencia (placas de 96 pocillos opacas de Packard o Wallac). Se añadieron 100 μl de reactivo de ensayo de Luciferasa (Promega E1483). La Luminiscencia se evaluó en Luminómetro (contador de centelleo de Wallax Micro Beta TriLux).

Este Ejemplo describe la inhibición de actividad de IL–22 en un ensayo de pSTAT Luciferasa usando anticuerpos de 45 IL–22 anti–humanos de rata, Ac–02 y Ac–04, comparados con una construcción de fusión de proteína de unión de IL–22 humana fusionada a Fc (huIL22BP–huFc). Figura 13 es una gráfica que representa inhibición de actividades de IL–22 usando anticuerpos monoclonales de IL–22 anti–humanos de rata, Ac–02 y Ac–04. Se preincubó una concentración fija de IL–22 de rata con diversas concentraciones bien de Ac–02 (•) o de Ac–04 (▲) o un anticuerpo de control (–) en medios celulares y se añadieron a células HepG2 temporalmente transfectadas por vector pSTAT–50 TA–Luc. Después de 6 horas, las células se lisaron y se añadió la misma cantidad de lisados celulares con sustrato de luciferasa. La señal se detectó usando un lector de quimioluminiscencia. Las células incubadas con (línea discontinua) o sin (línea de puntos) IL–22 se incluyeron como controles positivos y negativos, respectivamente. DE50 para Ac–02 fue aproximadamente 10 nM. La DE50 para Ac–04 fue aproximadamente 0,3 nM.

La Figura 14 es una gráfica que representa la inhibición de actividades de IL–22 con anticuerpo monoclonal de IL–22 55 antihumano de rata, Ac–04. o IL–40 22BP–Fc. Se preincubó una concentración fijada de IL–22 con diversas

concentraciones bien de Ac–04 (▲) o bien de IL–22BP–Fc (□) en medios celulares y después se añadieron a células HepG2 transfectadas de forma transitoria por vector pSTAT–TA–Luc. Después de 6 horas, las células se lisaron y se añadió a cada muestra la misma cantidad de lisados celulares con sustrato de luciferasa. La señal se detectó usando un lector de quimioluminiscencia. Las células incubadas con (línea discontinua) o sin (línea de puntos) IL–22 se incluyeron como controles positivos y negativos, respectivamente. DE50 para IL–22BP–Fc fue aproximadamente 5 0,4 nM.

Ejemplo 21: Inhibición de actividad de IL–22 en ensayo de proliferación de BaF3 usando anticuerpos de IL–22 anti–humanos de rata

Protocolos Experimentales:

Se clonaron los fragmentos de ADN que codifican IL–22R e IL–10R2 de longitud total en GFP–RV (vector retroviral 10 con Comunicador de Proteínas Fluorescente Verde) e YFP–RV (vector retroviral con Proteína Fluorescente Amarilla) respectivamente. Las linfocitos BaF3 se transdujeron con IL–10R2–YFP–RV y se clasificaron por FACS. Las linfocitos BaF3 positivas en IL–10R2 se transdujeron adicionalmente con IL–22R–GFP RV y se clasificaron por FACS. Las linfocitos BaF3 doblemente positivas en IL–10R2/IL–22R se usaron en el ensayo de proliferación de BaF3 como se describe adicionalmente. 15

Se lavaron las linfocitos BAF3. Se preparó una suspensión a 105/ml en RPMI1640+PSG+FBS al 10% y 50 μI/pocillo de alícuota en placas de cultivos celulares (VWR n.º 62402–929). El anticuerpo diluido en serie se pre–incubó con 1,5 ng/ml de IL–22 humana en RPMI 1640 + PSG + FBS al 10% a 37°C durante 30 minutos. La mezcla se añadió después en placas de cultivo celular a 50 μI/pocillo. Las células se incubaron a 37°C en CO2 al 5% en un incubador humidificado durante 48–72 horas. Evaluando proliferación, las placas de cultivo se retiraron fuera del incubador y se 20 dejaron enfriar hasta temperatura ambiente. Se añadieron aproximadamente 100 μI/pocillo de reactivo Cell–Tirer Glo reconstituido. Las placas se agitaron en agitador orbital durante 2 minutos asegurando la lisis completa de las células. La luminiscencia se leyó a 1 segundo/pocillo usando Trilux (contador de centelleo Wallax Micro Beta TriLux).

Este Ejemplo describe la inhibición de actividad de IL–22 en ensayo de proliferación de BaF3 usando anticuerpos de IL–22 anti–humanos de rata, Ac–02 y Ac–04 (Figura 15). Se preincubó una concentración fijada de IL–22 con diversas 25 concentraciones bien de Ac–02 (•) o bien de Ac–04 (▲) o con un anticuerpo control (–) en medios celulares y después se añadieron a linfocitos BaF3 que expresan tanto IL–22R como IL–10R2. Después de 48–72 horas, se detectó proliferación celular por el reactivo Cell–Tirer Glo. La señal se detectó usando un lector de quimioluminiscencia. Las DE50 para Ac–02 y para Ac–04 fueron aproximadamente 40 nM y 0,2 nM, respectivamente.

Ejemplo 22: Análisis cinéticos de Ac–02 04 IL–22BP–Fc IL–22R de rata y de unión de IL–22R/IL–10R2 a IL–22 de rata 30 por BIAcore

Protocolos Experimentales:

Para preparar un biosensor de superficie, se purificó por afinidad IgG anti–humana de cabra (KPL 01–10–20); Proteína–A (Pierce 21184); se inmovilizaron IgG anti–rata de cabra o proteína de ensayo directamente sobre un chip de carboximetil–dextrano de calidad para investigación (CM5) usando acoplamiento de amina. La superficie se activó 35 con EDC/NHS. El anticuerpo de captura se injertó a una concentración de 50 μg/ml en tampón de acetato de sodio (pH 4,5), la Proteína–A se inyectó a una concentración de 50 μg/ml en tampón de acetato de sodio (pH 4,0), o la proteína de ensayo se inyectó directamente a una concentración de 0,01–1 μg/ml en tampón de acetato de sodio (pH 5,0). La inmovilización se hizo usando las herramientas de wizard con la ayuda de 10.000 unidades de resonancia (RU) para la IgG anti–hu o anti–rata, 3000 (RU) para la Proteína–A y 50–100 (RU) para la proteína de realización de 40 pruebas directamente inmovilizada. Se bloquearon los grupos activados que quedaban con etanolamina 1,0 M (pH 8,0). Como control se usó la primera célula de flujo como superficie de referencia corrigiendo índice de refracción de masas, efectos de matriz y unión no específica, las segunda, tercera, y cuarta células se revistieron con la molécula de captura.

Para análisis cinético, los medios condicionados que contienen complejo receptor de IL–22R–Fc, IL–10R2–Fc, IL–22R–45 Fc/IL–10R2–Fc o proteína IL–22BP–Fc se capturaron en el anticuerpo de IgG anti–humano o en superficies de proteína A. Los anticuerpos de rata se capturaron sobre la superficie de anticuerpos IgG anti–rata, inyectando 60 μl de una solución de 400 ng/ml. La diferencia neta entre la línea base y el punto de aproximadamente 90 segundos después de la finalización se tomó representando la cantidad de ligando unido. Las soluciones de IL–22 a 300, 150, 100, 75, 50, 25, 12,5, 6,5 y 0 nM se inyectaron por triplicado a un caudal de 30 μl por minuto durante 3 minutos y la 50 cantidad de material unido como una función del tiempo se registró en forma de sensogramas. La fase de disociación se sometió a seguimiento en tampón de HBS/EP durante 10 minutos al mismo caudal seguido por inyección de 5 μl de TFA al 0,1% e inyección de 5 μl de glicina a pH 1,5 regenerando una superficie de captura plenamente activa. Se hicieron 11 experimentos de cinética a 22,5°C en tampón de HBS/EP. Se sustrajeron los

efectos del blanco y del tampón para cada sensograma usando referencia doble.

Los datos cinéticos se analizaron usando software 3.0.2 de evaluación de BIA aplicado a un modelo 1:1. Las constantes de velocidad de disociación (kd) y de velocidad de asociación (ka) patentes se calcularon a partir de las regiones apropiadas de los sensogramas usando un ensayo global. La constante de afinidad de interacción entre receptores, anticuerpos e IL–22 se calcularon a partir de las constantes de velocidad cinética por la siguiente 5 fórmula: KD = kd / ka.

La afinidad de unión de anticuerpos de rata a IL–22 se ha probado en BIAcore usando presentación diferente de anticuerpos de rata: anticuerpos de rata revestidos directamente sobre chip de BIAcore o anticuerpos de rata de captura en chip de BIAcore por anticuerpos de IgG anti–rata. Después, se inyectaron diferentes concentraciones de IL–22 en chip seguidos por tampón. La constante de afinidad de la interacción se analizó usando software de 10 evaluación de BIA. Se han obtenido datos similares de experimentos diferentes.

La afinidad de complejo receptor de IL–22R–Fc, IL–10R2–Fc, IL–22R–Fc/IL10R2–Fc y la unión de IL–22BP–Fc a IL–22 se han probado en BIAcore usando medio condicionado que contiene proteína de fusión de receptor–Fc anterior. La proteína de fusión de receptor–Fc se capturó en chip de BIAcore por anticuerpos IgG anti–humanos. Después, se inyectaron diferentes concentraciones de IL–22 en chip seguidos por tampón. La constante de afinidad se analizó 15 usando software de evaluación de BIA. Se han obtenido datos similares de experimentos diferentes.

: Ac–02 Ac–04 IL–22R–Fc Complejo IL–22R–Fc/IL–10R2–Fc IL–22BP–Fc

KD (nM): 68,1 1,51 41 1,48 3,37

*La interacción entre IL–10R2–Fc y IL–22 fue demasiado débil para ponerse a prueba en el análisis de BIAcore.

Depósito de Líneas Celulares de Hibridoma

Las líneas celulares de hibridoma que producen Ac–02 y Ac–04 se depositaron en la American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia, EE.UU. 20110–2209, el 5 de junio de 2003 como un 20 depósito original sometido al Tratado de Budapest y se les asignaron los números de referencia de la ATCC PTA–5254 y PTA–5255, respectivamente. Todas las restricciones de la disponibilidad para el público del material depositado se eliminarán irrevocablemente tras la concesión de la patente, salvo para los requerimientos especificados en 37 C.F.R. § 1.808(b) y el término del depósito cumplirá con 37 C.F.R. § 1.806.

LISTADO DE SECUENCIAS 25

<110> Genetics Institute, LLC

Li, Jing

Tan, Xiang–Yang

Tomkinson, Kathleen N.

Pittman, Debra D. 30

Veldman, Geertruida IVI.

Fouser, Lynette

<120> Anticuerpos contra Interleucina–22 y Usos para Ellos

35

<130> AM101524

<150> US 60/480,652

<151> 23–6–2003

<160> 10

5

<170> Patentln version 3.1

<210> 1

<211> 1191

<212> ADN 10

<213> Homo sapiens

<400> 1

<210> 2 15

<211> 179

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2 20

<210> 3

<211> 1166

<212> ADN

<213> Mus musculus 5

<400> 3

<210> 4

<211> 180 10

<212> PRT

<213> Mus musculus

<220>

<221> MISC_FEATURE 5

<222> (180)..(180)

<223> En la que Xaa es cualquier aminoácido

<400> 4

10

<210> 5

<211> 27

<212> ADN

<213> Artificial

15

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: oligonucleótido para generación de sonda en sentido correcto

<400> 5

20

aggatggaga catctgactg ccctacg 27

<210> 6

<211> 56

<212> ADN

<213> Artificial 5

<220>

<400> 6 10

gactgataat acgactcact atagggcgacgaa caattttgac tccgatattg tccaag 56

<210> 7

<211> 27 15

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: oligonucleótido para generación de sonda antisentido 20

<400> 7

acaattttga ctccgatatt gtccaag 27

25

<210> 8

<211> 56

<212> ADN

<213> Artificial

30

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: oligonucleótido para generación de sonda antisentido

<400> 8

gactgataat acgactcact atagggcgaa ggatggagac atctgactgc cctacg 56

<210> 9

<211> 191 5

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: sonda para secuencias IL–22 10

<400> 9

<210> 10

<211> 49 15

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: marca de aminoácidos 20

<400> 10

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se unen específicamente a interleucina–22 (IL–22) e inhiben competitivamente la unión de un segundo anticuerpo a dicha IL–22, siendo dicho segundo anticuerpo un anticuerpo monoclonal producido por un hibridoma elegido entre PTA–5254 y PTA–5255.
2. El anticuerpo o fragmento del mismo de la reivindicación 1, que tiene una constante de afinidad (Kd) de 10E9 o 5 una afinidad más alta.
3. El anticuerpo o fragmento del mismo de la reivindicación 1, que neutraliza la fosforilación de STAT en HEPG2 o la proliferación de linfocitos BaF3 con una DE50 en el intervalo de aproximadamente 5 nM a 200 pM o más alto.
4. El anticuerpo o fragmento del mismo de la reivindicación 1, que se asocia con IL22 con cinéticas en el intervalo de aproximadamente 10E4 a 10E6 1/Ms y que tiene cinéticas de disociación en el intervalo de aproximadamente 10E3 a 10 10E6 1/s.
5. El anticuerpo o fragmento del mismo de la reivindicación 1, en el que la IL–22 comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos el 90% idéntica a los aminoácidos 34–179 de la SEC ID N.º: 2 y es capaz de inducir la fosforilación de una proteína Stat–3.
6. El anticuerpo o fragmento del mismo de la reivindicación 2, en el que la IL–22 comprende los aminoácidos 34–179 15 de el SEC ID N.º: 2.
7. El anticuerpo o fragmento del mismo de la reivindicación 1, en el que la IL–22 es de origen humano.
8. El anticuerpo o fragmento del mismo de la reivindicación 1, que es un anticuerpo humanizado, injertado con CDR o humano.
9. Un anticuerpo monoclonal producido por un hibridoma elegido entre PTA–5254 y PTA–5255. 20
10. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o fragmento del mismo de la reivindicación 1.
11. La composición farmacéutica de la reivindicación 10, que comprende adicionalmente otro agente terapéutico seleccionado del grupo constituido por un inhibidor de citocinas, un inhibidor de factor de crecimiento, un inmunosupresor, un agente antiinflamatorio, un inhibidor metabólico, un inhibidor de enzimas, un agente citotóxico y un agente citostático. 25
12. La composición farmacéutica de la reivindicación 11, en la que el agente terapéutico está seleccionado del grupo constituido por un antagonista de TNF, un antagonista de IL–12, un antagonista de IL–15, un antagonista de IL–17, un antagonista de IL–18, un antagonista de IL–21R, un agente que reduce las linfocitos T, un agente que reduce las linfocitos B, metotrexato, Ieflunomida, sirolimus (rapamicina) o un análogo de los mismos, un inhibidor de Cox–2, un inhibidor de cPLA2, un NSAID y un inhibidor de p38. 30
13. Uso de un anticuerpo o fragmento del mismo de la reivindicación 1 en la elaboración de un medicamento para tratar o evitar un trastorno asociado con IL22 en un sujeto.
14. Uso de un anticuerpo o fragmento del mismo de la reivindicación 1 en la elaboración de un medicamento para tratar o evitar una respuesta de fase aguda en un sujeto.
15. El uso de la reivindicación 13, en la que el trastorno asociado a IL22 está seleccionado del grupo constituido por 35 un trastorno autoinmune, un trastorno respiratorio y una afección inflamatoria.
16. El uso de la reivindicación 13, en el que el trastorno asociado a IL22 está seleccionado del grupo constituido por artritis reumatoide, osteoartritis, esclerosis múltiple, miastenia gravis, enfermedad de Crohn, enfermedad inflamatoria del intestino, lupus, diabetes, soriasis, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), inflamación cardiovascular, pancreatitis, hepatitis y nefritis. 40
17. El uso de la reivindicación 13 o de la reivindicación 14, en el que el sujeto es un mamífero.
18. El procedimiento de la reivindicación 17, en el que el mamífero es un ser humano.
19. El anticuerpo o fragmento del mismo de la reivindicación 1 para usar en terapia.