PT1962825E - Utilização de adh para tratar uma patologia associada a danos oxidativos nas células - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "UTILIZAÇÃO DE ADH PARA TRATAR UMA PATOLOGIA ASSOCIADA A DANOS OXIDATIVOS NAS CÉLULAS"

Domínio da Invenção A invenção presente diz respeito à utilização de ácido docosahexaenóico (ADH) para fabricar um fármaco ou um nutracêutico para o tratamento de processos que envolvam lesões oxidativas associadas.

Estado da técnica anterior à invenção

Os ácidos gordos ómega-3 são necessários para manter a integridade funcional celular, e eles são necessários em geral para a saúde humana. 0 ácido docosahexaenóico (22:6 n-3, ADH), componente importante ómega-3 do óleo de peixe e das algas marinhas, concentra-se no cérebro, nos foto-receptores e nas sinapses da retina.

As dietas enriquecidas em ADH são inicialmente metabolizadas pelo figado e em seguida distribuídas por intermédio das lipoproteínas do sangue para ir ao encontro das necessidades dos diversos órgãos. A administração de ADH leva a um aumento da sua concentração a nível dos tecidos, induzindo também um aumento da concentração em ácido eicosapentaenóico (AEP) , outro ómega-3 que a ele se 2 liga metabolicamente, enquanto a administração de AEP apenas só aumenta a sua própria concentração e diminui a do ADH a nivel celular.

Em geral, o ADH é incorporado nos fosfolípidos da membrana celular, que têm efeitos sobre a sua composição e a sua funcionalidade, sobre a produção de espécies reactivas de oxigénio (ERO), sobre a oxidação dos lipidos de membrana, sobre a regulação da transcrição, sobre a regulação da biossintese dos eicosanóides e sobre a transdução intracelular do sinal. Além disto, no sistema nervoso central, o ADH está envolvido no desenvolvimento da capacidade de aprendizagem relacionada com a memória, nas funções excitáveis da membrana, na biogénese das células foto-receptoras e na transdução do sinal dependente da proteína quinase. Uma terapia dietética potencial seria baseada na correcção dos níveis óptimos em ácidos gordos ómega-3 de modo a evitar determinadas patologias desde que aparecem, ou a sua progressão, tal como as patologias inflamatórias, os processos tumorais, as doenças cardiovasculares, a depressão e as patologias neurológicas.

No sistema nervoso central, tanto o cérebro como a retina mostram uma capacidade invulgar para reter o ADH, mesmo em situações de deficiência dietética prolongada em ácidos gordos ómega-3. Diversos estudos descreveram o efeito protector do ADH sobre os neurónios, nos quais está presente em teores muito elevados. Por exemplo, ele está envolvido na protecção das células neuronais contra a morte 3 por apoptose. Recentemente, demonstrou-se que o ADH, presente em pequenas quantidades nos hipocampos de ratos de idade avançada, é capaz de proteger culturas primárias das células referidas contra a citotoxicidade induzida pelo glutamato.

Nos foto-receptores da retina, mostrou-se que o ADH também modula os teores em proteínas pro-apoptose e anti-apoptose da família Bcl-2. Os segmentos externos do foto-receptor da retina contêm rodopsina, bem como um conteúdo mais elevado em ADH do que qualquer outro tipo de célula. 0 ADH concentra-se nos fosfolípidos das membranas exteriores do disco do segmento do foto-receptor. Observaram- -se disfunções da retina em condições de diminuição da concentração óptima em ADH na retina. A célula epitelial pigmentar da retina (EPR) desempenha um papel muito activo na absorção do ADH, na sua conservação e no seu transporte. 0 elevado conteúdo em ADH no f oto-receptor e nas células EPR está sobretudo ligado a domínios da membrana com características físicas que contribuem para a modulação dos receptores, dos canais iónicos, dos veículos, etc., enquanto também parece regular a concentração da fosfatidilserina. Não se sabe até à data se estes efeitos são completamente mediados pelo ADH ele próprio ou por alguns seus derivados metabólicos. Determinados derivados do ADH foram identificados na retina. Embora os enzimas envolvidos na síntese dos derivados referidos não tenham sido 4 identificados com precisão, alguns resultados recentes sugerem a participação de uma fosfolipase A2 (PLA2) seguida por uma lipoxigenase (LOX) . A PLA2 liberta o ADH dos fosfolípidos da membrana e a LOX transforma-o nos seus derivados metabolicamente activos.

As espécies reactivas de oxigénio (ERO) são produzidas durante o funcionamento celular normal. Nas ERO incluem-se ERO o anião superóxido, o peróxido de hidrogénio e o radical oxidrilo. A sua elevada reactividade química leva à oxidação de proteínas, de ADN ou de lípidos. Os principais enzimas antioxidantes que protegem contra os danos moleculares e celulares devidos à presença das ERO são a superóxido dismutase (SOD), a catalase (CAT) e a glutationa peroxidase (GPx). A tensão oxidativa activa muitos canais metabólicos; alguns são citoprotectores, enquanto outros levam à morte da célula. Estudos recentes indicam que um desequilíbrio entre a produção e a quebra das ERO é um risco significativo na patogénese de muitas doenças, em alguns casos relacionado com a deterioração do sistema antioxidante. 0 ADH é apresentado como um alvo das ERO que danifica a célula do foto-receptor e as EPR. A degeneração da retina induzida pela luz promove perda de ADH nos foto-receptores. Por exemplo, quando as células EPR são danificadas ou quando morrem, a função do foto-receptor deteriora-se porque as células EPR são essenciais para a sua sobrevivência. Deste modo, a morte da célula EPR por 5 efeito da tensão oxidativa leva a uma deterioração da visão, em especial quando as células da mácula são afectadas, uma vez que ela é responsável pela acuidade da visão. A patofisiologia de muitas degenerações da retina (por exemplo, degenerações maculares relacionadas com a idade e doença de Stargardt) envolve tensão oxidativa que leva á apoptose de células EPR. De facto, a apoptose de células EPR parece ser o factor predominante na degeneração macular observada com a idade. Estes estudos sugerem que as células referidas desenvolveram mecanismos antioxidantes altamente eficazes para se protegerem face ao seu conteúdo elevado em ADH e denotam uma capacidade de adaptação notável.

Além disto, a relação entre os radicais livres e o envelhecimento é extremamente bem aceite, com base nos dados acerca de os radicais livres produzidos durante a respiração aeróbica provocarem danos oxidativos que se acumulam e levam a uma perda gradual dos mecanismos homeostáticos, a uma interferência com os perfis de expressão de genes e a uma perda da capacidade funcional das células, levando ao envelhecimento e à morte. Existe uma relação entre a geração de oxidantes, a protecção antioxidante e a reparação dos danos oxidativos. Foram levados a cabo muitos estudos para determinar se as defesas antioxidantes declinam com a idade. Nestes incluiu-se a análise das suas principais componentes: actividade ou expressão dos enzimas SOD, CAT, GPx, da glutationa redutase, da glutationa-S-transferase e da concentração em 6 compostos com pequena massa molecular com propriedades antioxidantes. Por exemplo, uma sobre-expressão dos SOD e CAT em Drosophila melanogaster aumenta a esperança de vida em 30% e diminui as lesões devidas à oxidação proteica. Neste contexto, a exposição in vitro e in vivo de tecido cutâneo aos raios UV gera radicais livres e outras espécies reactivas de oxigénio, levando a uma tensão oxidativa celular, documentada como contribuindo significativamente para o envelhecimento. Uma exposição excessiva da pele à radiação ultravioleta pode dar origem a lesões agudas e crónicas. Em condições agudas podem resultar eritemas ou queimaduras, enquanto a exposição crónica aumenta o risco de cancro da pele e o envelhecimento. Além disto, sabe-se que as células cutâneas podem reagir a tensão oxidativa aguda ou crónica aumentando a expressão de uma série de proteínas, tais como os enzimas envolvidos na manutenção da integridade celular e da resistência às lesões oxidativas.

Na técnica, sabe-se bem que os telómeros são regiões não codificantes do ADN localizadas nas extremidades dos cromossomas eucarióticos. Estas são constituídos por sequências de ADN fortemente conservadas, repetidas sucessivamente (TTAGG)n e em proteínas associadas, e possuem uma estrutura especial que dificulta a ligação aos terminais de outros cromossomas, evitando a fusão dos telómeros. Eles desempenham um papel essencial na manutenção da integridade dos cromossomas, protegendo o ADN codificante da acção enzimática e da sua degradação, 7 contribuindo para a manutenção da estabilidade dos cromossomas.

Em contraste com as sequências de codificação, que têm uma replicação semiconservadora, os telómeros sofrem uma perda progressiva das suas sequências repetitivas durante as sucessivas divisões celulares. Considera-se hoje em dia que é necessário um comprimento mínimo de telómeros para se manter a função telomérica e que quando eles atingem uma dimensão crítica, eles têm dificuldades na sua divisão, durante a mitose, gerando associação telomérica (TAS) e instabilidade cromossómica. A referida instabilidade cromossómica estaria associada a um aumento da probabilidade de originar erros capazes de gerar alterações genéticas significativas.

Devido à multiplicidade de ligações duplas, os ácidos gordos ómega-3 são considerados como sendo alvos moleculares para a criação e a propagação de radicais livres durante os processos de tensão oxidativa relacionados com a geração de peróxidos lipídicos. Têm sido obtidos resultados contraditórios, no entanto, em diversos estudos de susceptibilidade à tensão oxidativa devidos a suplementos dietéticos de ácidos gordos ómega-3. Alguns estudos em seres humanos mostraram uma maior oxidação da LDL, enquanto outros não encontraram este efeito. Em estudos com animais, verificou-se que um tratamento com ácidos gordos ómega-3 leva a uma maior ou menor susceptibilidade à oxidação da LDL. Por outro lado, uma sobre-expressão dos genes envolvidos no sistema de defesa antioxidante estava presente nos fígados de murganhos alimentados com uma dieta enriquecida em óleo de peixe ao longo de três meses.

Além disto, diversos estudos in vitro com uma linha celular com origem glial mostraram que as membranas ricas em ácidos gordos ómega-3 são mais susceptíveis a lesões oxidativas. Uma suplementação destas células, a longo termo, com concentrações elevadas de ADH, originava aumentos das concentrações em peróxidos lipídicos no meio de cultura, e uma maior percentagem da mote celular devida a apoptose induzida por exposição a peróxido de hidrogénio. Também se mostrou, no entanto, que a administração intra-amniótica de docosahexaenoato de etilo diminui a peroxidação lipídica nos cérebros de fetos de ratos. Foi sugerido que esta reacção é devida a um efeito de sequestro dos radicais livres por activação dos enzimas antioxidantes. Um aumento da capacidade antioxidante do cérebro é importante para a defesa endógena primária contra a tensão oxidativa, porque o cérebro é relativamente rico em ácidos gordos polinsaturados e é relativamente pobre em enzimas antioxidantes.

Estes resultados contraditórios sugerem que a hipótese baseada no conceito de que a oxidação de um ácido gordo aumenta com o número de ligações duplas não é aplicável in vivo, uma vez que outros mecanismos podem potencialmente actuar para diminuir a lesão oxidativa, tais 9 como uma estrutura tridimensional dos ácidos ómega-3 nos lipidos e nas lipoproteínas da membrana que torne as ligações duplas menos susceptíveis a um ataque pelos ERO, uma inibição dos enzimas pro-oxidantes tais como PLA2, ou uma maior expressão dos enzimas antioxidantes.

Por outro lado, a ideia de associar o exercício físico à produção does radicais livres provém do início da década de 1980, devido à observação das lesões nos lipidos membranares durante os acontecimentos de isquémia-reperfusão em tecido hipóxico (veja-se Lovlin et al., Eur. J. Appl. Physiol. Occup. Physiol. 1987, 56(3) 313-6). Ao mesmo tempo, observou-se um aumento da razão GSSH/GSH em células musculares de rato (vejam-se Lew H., et al., FEBS Lett, 1985; 185(2): 262-6, Sen C.K., et al., J. Appl. Physiol. 1994; 77(5): 2177-87) bem como no sangue humano (vejam-se MacPhail Db, et al., Free Radie. Res. Commun. 1993; 18(3): 177-81, Gohil K., et al. J. Appl. Physiol. 1988 Janeiro; 64(1): 115-9). Os radicais livres também podem afectar o ADN e o exercício físico agudo aumenta os danos no ADN, tal como o demonstra o aumento de 8-OxodG. O esforço físico levando à exaustão (correr uma maratona) provoca lesões no ADN que são evidentes durante alguns dias depois da prova e também provoca danos nas células imunocompetentes (que pode ser associado ao decréscimo imunológico exibido pelos desportistas depois de provas destas). 10

No entanto, outros autores não observaram nenhuns efeitos (excepto no que toca a lesões menores) depois de 90 minutos de natação, de 60 minutos de corrida ou de um esforço exaustivo remando. Ao mesmo tempo, investigações em desportistas treinados e não treinados não detectaram nenhuma diferença na excreção urinária de 8-oxo-dG, mesmo naqueles em que se detectavam as lesões, consideradas como sendo secundárias em relação a reacções subsequentes ao esforço, e não devidas à acção do exercício sobre o ADN, de um modo agudo.

Que os acontecimentos envolvendo um exercício físico intensivo produzem uma tensão oxidativa é um facto bem conhecido na técnica, mas a sua origem ainda não foi bem determinada.

Os estudos levados a cabo com ácidos gordos n-3 e relacionados com o desempenhos em desportos focavam-se sobre o efeito anti-inflamatório e tentou-se de facto nos primeiros ensaios detectar uma acção possível destes nutrientes melhorando a absorção alveolar-capilar por diminuírem a bronco-constrição induzida por exercício físico intensivo. A este respeito, Mickleborough provou que depois de se administrarem 3,2 g de AEP e 2,2 g de ADH, numa dieta, as citoquinas proinflamatórias vinham atenuadas por se diminuir a presença de TNF-α e de IL-Ιβ num atleta de elite, em conjunto com uma diminuição da bronco-constrição. Walser relacionou os efeitos vasculares dos ácidos gordos n-3 com efeitos positivos em pessoas que 11 exibiam intolerância ao exercício físico. A este respeito, van Houten et al. estudaram que uma ingestão elevada de ácidos gordos n-3 estava associada a uma melhor recuperação em pacientes que levavam a cabo uma reabilitação cardíaca após uma síndrome coronária. A ausência de resultados positivos no desempenho físico nos estudos que se analisaram é devida à evolução dos pacientes, não de pessoas saudáveis, e aquilo que se investigou foram efeitos vasculares e inflamatórios.

Ao mesmo tempo, foram levadas a cabo investigações baseadas no seguinte conceito teórico: aumentar os ácidos gordos livres no plasma acima de 1 mmol/L (o que ocorre quando o glicogénio é gasto), a competência no transporte do triptofano torna-se maior, o que acarreta um aumento subsequente da serotonina, um neurotransmissor relacionado com a assim denominada "fadiga central" em desportos de longa duração. A este respeito, sabe-se que os ácidos gordos n-3 diminuem a quantidade de ácidos gordos livres no plasma, provavelmente por regularem em alta a oxidação de ácidos gordos ao activarem o factor de transcrição nuclear PPARa. No entanto, estes ensaios não foram bem-sucedidos, uma vez que Huffman (2004), utilizando um regime de dose de 4 g de ácido gordo n-3 (cápsulas de 500 g contendo 300 mg de AEP e 200 mg de ADH), levou a cabo um estudo em corredores de ambos os sexos, sem encontrar nenhuma diminuição de TRP livre nem uma menor percepção do esforço, nem nenhum aumento do desempenho estatisticamente 12 significativo, embora encontrassem uma tendência estatística para a melhoria do desempenho em sujeitos os quais havia sido administrado o ácido gordo n-3, deixando em aberto a possibilidade, para os autores, de que a causa da diminuição da potência estatística do estudo fosse devida ao pequeno número de sujeitos estudados (5 homens e 5 mulheres).

Outra investigação subsequente no qual se procurou avaliar a relação da eficácia dos ácidos n-3 em relação com o desempenho não detectou nenhumas diferenças significativas utilizando óleo de milho como placebo. Raastad, administrando 1,60 g de AEP e 1,04 g de ADH ao dia durante diversas semanas, não detectou nenhuma melhoria em jogadores de futebol (veja-se Raastad et al., Scand J. Med. Sei. Sports 1997; 7(1): 25-31).

Por outro lado, sabe-se que os ácidos gordos livres interferem com a utilização da glucose nos músculos, uma vez que os seus análogos ao nível intracelular, acil-CoA, nas mitocôndrias, inibem a piruvato desidrogenase (inibição pelo produto), e além disto, estimulam a glicogenólise e a gliconeogénese, provocando uma hiperglicemia suave durante o jejum, e de facto, a administração continuada de ácidos gordos polinsaturados durante o jejum ajuda a manter a glicémia, talvez por activar a glucose-6-fosfatase ao nível hepático. Sabe-se também que a composição em ácidos gordos no músculo altera a sensibilidade à insulina, mostrando-se que um conteúdo 13 elevado em ácidos gordos polinsaturados na membrana plasmática melhora a sensibilidade à insulina e que um elevado conteúdo em ácidos gordos saturados origina o efeito inverso. 0 exercício aumenta a absorção de glucose, a perfusão capilar, a velocidade de síntese do glicogénio e a sensibilidade à insulina. Durante a contracção muscular produzem-se alterações da temperatura, do pH intracelular, da razão ATP/ADP, bem como da concentração intracelular em Ca++ e noutros metabolitos, que poderiam actuar como mensageiros na regulação do funcionamento celular aquando do exercício. A este respeito, o Ca++ regula uma grande parte das proteínas intracelulares, incluindo a calmodulina quinase, a proteína quinase C (PKC) e a calcineurina que são intermediários importantes na sinalização da transdução intracelular. Durante o exercício aeróbico, a acetil-CoA carboxilase é desactivada pela AMP quinase (AMPK), levando a uma diminuição dos teores em malonil-CoA, desinibindo a carnitina palmitol transferase, com o resultante aumento do transporte de ácidos gordos nas mitocôndrias (e portanto promovendo a oxidação de ácidos gordos).

Os efeitos da activação da AMPK incluem provavelmente a estimulação da expressão da GLUT4 e da hexoquinase, bem como de enzimas das mitocôndrias. No entanto, surpreendentemente, a activação da AMPK não é o único caminho (independente da insulina) através do qual o exercício aumenta a reacção à glucose no músculo- 14 esquelético. Veja-se Mora e Pessin, J. Biol. Chem. 2000; 275(21): 16323-16328, que mostraram um que aumento da reacção à glucose no músculo, de facto, envolve diversos factores de transcrição tais como MEF2A e MEF2D activando GLUT4, e que estes factores são activados pelo exercicio.

Um aumento dos lípidos intramusculares é habitual nos estados de obesidade e durante o treino físico, mas o resultado é que para pessoas obesas isso se associa à resistência à insulina, enquanto nos desportistas a grande actividade da carnitina palmitol transferase faz com que os ácidos gordos sofram oxidação em beta. Existem fortes indícios de que uma dieta rica em ácidos gordos n-3, mesmo com um aumento da glicémia e da insulinémia (sinais de resistência à insulina), actuam a um nível do receptor de insulina, mantendo o nível da translocação da proteína GLUT-4, o que se mostrou especificamente para o ADH (veja-se Jaescchke H., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1995; 209: 104-11) · O WO 2004/112.776 descreve uma composição incluindo ácido docosahexaenóico sob a forma de éster, triacilglicerol, diacilglicerol, monoacilglicerol, fosfolípidos, glicolípido, esfingolípido ou sulfolípido; e um carotenóide, tal como a astaxantina, para utilização profiláctico e/ou terapêutica quando se curam estados inflamatórios induzidos por traumatismos e pelo stress. 15 A ΕΡ Ο 342.795 proporciona uma composição melhorando a função cerebral, contendo ácido docosahexaenóico (ADH) ou um dos seus derivados ou precursores a titulo de ingrediente activo, e tendo um efeito de melhorar a função cerebral e de curar disfunções cerebrais, que se pode utilizar em medicamentos e em alimentos funcionais ou misturar de um modo apropriado com um veiculo, um excipiente ou um diluente para se obter um agente liquido, um agente em pó, um agente granular, um agente sob a forma de comprimidos ou um agente assumindo outra qualquer forma pretendida. Um tal agente medicinal ou alimento contendo ácido docosahexaenóico ou pelo menos um dos seus derivados é capaz, quando entra no corpo humano, de melhorar a capacidade de aprender e a memória do utilizador.

Colquhoun A., et al., "Gamma-linolenic acid and eicosapentaenoic acid induce modifications in mitochondrial metabolism, reactive oxygen species generation, lipid peroxidation and apoptosis in Walker 256 rat carcinosarcoma cells", Biochimica and Biphysica Acta, Molecular and Cell Biology of Lipids, Elsevier, Amsterdão, Holanda, volume 1533, n° 3, 31 de Outubro de 2001, páginas 207-219, descrevem que os PUFA possuem actividades pro-oxidantes por diminuírem a função das mitocôndrias, o que leva a uma perda do potencial de membrana nas mitocôndrias e a um aumento da produção de ERO. Em especial descrevem as propriedades antitumorais e pro-oxidantes de ácido γ-linolénico (AGL) e de ácido eicosapentaenóico (AEP). 16

Christensen M. S., et al.f "Intestinal and lymphatic transport of eicosapentaenoic (AEP), docosahexaenoic (ADH) and decanoic acids: dependence on intramolecular triacylglycerol structure", The American Journal of Clinicai Nutrition, American Society for Nutrition, U.S., 61, 1 de Janeiro de 1995, páginas 56-61, descrevem triacilgliceróis específicos contendo ADH na posição sn-2 e ácido decanóico nas posições sn-1 e sn-3,e a sua utilização por administração entérica (alimentação intragástrica) de ratos.

Descrição da Invenção A invenção presente diz respeito à utilização de ácido docosahexaenóico tal como se define nas reivindicações 1 a 9, para tratar uma patologia associada com lesões oxidativas celulares, em que a referida patologia associada a lesões oxidativas celulares é uma patologia neurodegenerativa, uma patologia ocular, uma patologia isquémica, ou a aterosclerose.

De acordo com a reivindicação 10, a patologia neurodegenerativa referida é uma de entre o conjunto constituído por esclerose múltipla, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, esclerose lateral amiotrófica, e distrofia muscular. 17

De acordo com a reivindicação 11, a patologia ocular referida é uma de entre o conjunto constituído por retinose pigmentar, degeneração macular, e cataratas.

De acordo com a reivindicação 12, a patologia isquémica é um enfarte do miocárdio ou um enfarte cerebral. A invenção presente também diz respeito à utilização do ácido docosahexaenóico, que é especificamente incorporado em pelo menos uma posição de um glicerol através de uma ligação éster, para a preparação de um nutracêutico, tratando-se preferivelmente de um produto lácteo, caracterizado por o referido ácido docosahexaenóico • estar presente numa percentagem ponderai de entre 40 e 100 %, em relação ao total de ácidos gordos; ou • ser incorporado na posição sn-2, a lesões associada patologia patologia para tratar uma patologia associada oxidativas celulares, em que a referida patologia a lesões oxidativas celulares seja uma neurodegenerativa, uma patologia ocular, uma isquémica, ou a aterosclerose.

As concretizações correspondentes à invenção presente também são descritas em pormenor adiante, sendo as restantes úteis para entender a invenção, mas não fazendo parte dela. 18 A especificação presente diz respeito ao facto inesperadamente verificado de que a administração de ácido docosahexaenóico (também referido neste documento como ADH) ou de ácido eicosapentaenóico (AEP) ou de AEP derivado de ADH, quer sob forma livre quer incorporados em triacilgliceróis, entre outras, actua a titulo de um antioxidante celular.

Deste modo e levando em conta a relação metabólica entre o ADH e o AEP (retroconversão de ADH em AEP) , todos os efeitos descritos observados anteriormente para a administração do ADH devem ser aplicáveis a sistemas mistos ADH/AEP ou mesmo a sistemas monocomponente de AEP, embora o AEP não seja especificamente nomeado.

Um objecto da especificação presente é portanto a utilização do ácido docosahexaenóico para o fabrico de uma composição farmacêutica para o tratamento de lesões celulares.

Outro objecto da especificação presente é a utilização do ácido docosahexaenóico (ADH) numa posição especifica do esqueleto do glicerol, estando também especificadas as duas posições restantes do acilglicerol no que toca à sua funcionalidade, para o tratamento das lesões oxidativas celulares. 19

Um objecto adicional da especificação presente é a utilização do ácido docosahexaenóico (DHA) para fabricar uma composição para o tratamento das lesões oxidativas celulares a nível do ADN. Em especial, a utilização do ácido docosahexaenóico tem como aplicação a de um agente protector no processo natural de encurtamento dos telómeros, e como agente inibidor da senescência prematura no tratamento das lesões oxidativas celulares. É também um objecto da especificação presente a utilização do ácido docosahexaenóico para manufacturar uma composição para o tratamento do envelhecimento celular e das patologias hereditárias associadas a patologias na cadeia respiratórias das mitocôndrias, bem como uma composição para tratar a Síndrome de Down.

Um objecto adicional da especificação presente é a utilização do ácido docosahexaenóico (ADH) para manufacturar uma composição para o tratamento da lesão oxidativa celular associada ao exercício físico. Em especial, a utilização do ácido docosahexaenóico é aplicada como agente incrementador do desempenho nos despostos e como um agente regulador dos teores em glucose no sangue durante o esforço físico. É também um objecto da especificação presente a utilização do ácido docosahexaenóico para o fabrico de uma composição para aumentar o desempenho em desportos, bem como de uma composição para manter os teores em glucose no 20 sangue depois de um exercício físico através de, sobretudo, a administração de um alimento, um produto lácteo ou qualquer forma de administração adequada tipicamente utilizada por indivíduos quando fazem exercício físico.

Tal como se descreve neste documento, a expressão "lesão/ões oxidativa/s celular/es" significa qualquer processo que envolva um desequilíbrio entre a geração e a degradação das espécies oxidantes celulares, com origem endógena ou exógena.

De uma forma surpreendente, tal como se descreve neste documento, os inventores verificaram que o ADH é capaz de inibir a produção das espécies reactivas de oxigénio (ERO), quer relacionadas com uma indução dependente de peróxidos, quer de superóxidos. Mais especificamente, diminui a produção do anião superóxido e deste modo de todas as espécies derivadas produzidas na cascata oxidativa, tais como por exemplo uma diminuição muito significativa da peroxidação lipídica. Além disto, observou-se um aumento da actividade de enzima antioxidante, o que sugere uma adaptação da célula através da indução da expressão de agentes antioxidantes, basicamente enzimas, e uma repressão da expressão de agentes pro-oxidantes tais como as fosfolipases A2.

Numa concretização tal como a descrita neste documento, o referido ácido docosahexaenóico é incorporado num monoacilglicerol, diacilglicerol, triacilglicerol, 21 fosfolípido, éster etílico ou ácido gordo livre. Preferivelmente, o ácido docosahexaenóico referido é incorporado num triacilglicerol.

Tal como descrito neste documento, "ácido docosahexaenóico incorporado num acilglicerol" é interpretado como significando um monoacilglicerol, diacilglicerol, triacilglicerol, fosfolípido, com pelo menos uma das três posições esterificada a um ácido docosahexaenóico e, opcionalmente, pelo menos uma das posições restantes esterificada também a um ácido seleccionado de entre ácidos gordos de cadeia curta, média ou comprida e a um ácido fosfórico. Preferivelmente, o referido glicerol é um triacilglicerol. A escolha do triacilglicerol a t 'tulo de estrutura química para o ADH é baseada em dados obtidos de um estudo no qual se comparou a biodisponibilidade de quatro concentrados de ácidos ómega-3 sob a forma de ésteres etílicos, fosfolípidos, ácidos gordos livres e triacilgliceróis, após administração oral, o qual demonstrou que s triacilgliceróis obtidos por esterificação nas posições acima apresentavam uma biodisponibilidade superior à das outras preparações.

Numa concretização preferida tal como se descreve neste documento, verifica-se que o ácido docosahexaenóico referido estará presente numa percentagem ponderai e entre 20 e 100 % em relação ao total de ácidos gordos, 22 preferivelmente de entre 40 e 100 % em relação ao total de ácidos gordos, e mais preferivelmente o referido ácido docosahexaenóico estará presente numa percentagem ponderai de entre 66 e 100 % em relação ao total de ácidos gordos.

Noutra concretização preferida, incorpora-se o ácido docosahexaenóico referido em pelo menos uma posição especifica de um glicerol através de uma ligação éster, num lipido estruturado, para se fabricar uma composição farmacêutica para o tratamento das lesões celulares oxidativas.

Um tal glicerol pode também incluir pelo menos um ácido gordo e/ou um ácido fosfórico de tal modo que o ácido docosahexaenóico referido estando incorporado numa posição seleccionada de entre sn-1, sn-2 e sn-3, pode incluir opcionalmente, pelo menos um ácido seleccionado de entre um ácido gordo com cadeia curta e/ou média e um ácido fosfórico, e quando incorporado na posição sn-2 pode também incluir, opcionalmente, um ácido seleccionado de entre os ácidos gordos, e um ácido fosfórico. A este respeito, quando se referir o termo opcionalmente, deve entender-se que o referido ácido docosahexaenóico incorporado numa posição seleccionada de entre sn-1, sn-2 e sn-3 pode ou não conter também pelo menos um ácido seleccionado de entre um ácido gordo com cadeia curta e/ou média, e um ácido fosfórico, ou de outra forma, que o referido ácido docosahexaenóico incorporado na 23 posição sn-2 pode ou não incluir também pelo menos um ácido seleccionado de entre um ácido gordo com cadeia comprida e um ácido fosfórico.

Surpreendentemente, tal como se descreve neste documento, os inventores verificaram que a utilização de acilgliceróis estruturados em que a posição do ácido docosahexaenóico seja seleccionada e a composição do resto do composto ligado ao glicerol também, leva a um aumento inesperado, para pelo menos o dobro ou o triplo, a eficácia terapêutica da utilização do ácido docosahexaenóico no fabrico de uma composição farmacêutica para o tratamento de lesões oxidativas celulares. A definição comum diz respeito a gorduras contendo ácidos gordos localizados em posições específicas no esqueleto do glicerol. Por semelhança com a distribuição biológica in vivo dos ácidos gordos, os ácidos gordos polinsaturados com cadeias compridas (PUFA) localizam-se preferivelmente na posição sn-2 do glicerol, e levando em conta o processo de absorção intestinal, os triacilgliceróis são hidrolisados por lipases a ácidos gordos livres, a diacilgliceróis e a monoacilgliceróis, de entre os quais os ácidos gordos livres e os monoacilgliceróis sn-2 são directamente absorvidos pelas células epiteliais do intestino, denominadas enterócitos.

Utilizando ácido docosahexaenóico incorporado numa posição específica do esqueleto do glicerol, por 24 intermédio de uma ligação éster, proporciona-se uma bioactividade maior, uma protecção antioxidante melhor a uma percentagem molar igual, no que toca à quantidade total de ácidos gordos presentes, e uma menor dependência da dosagem administrada no que diz respeito ao efeito antioxidante do ácido docosahexaenóico no acilglicerol.

De uma forma vantajosa, tal como se descreve neste documento, os inventores verificaram que a utilização do ácido docosahexaenóico incorporado numa posição do glicerol seleccionada de entre sn-1, sn-2 e sn-3, incluindo opcionalmente o glicerol referido também pelo menos um ácido seleccionado de entre um ácido gordo com cadeia curta ou média, e um ácido fosfórico, proporciona-se uma maior bioactividade, um aumento da protecção antioxidante a uma percentagem molar igual em relação à quantidade total de ácidos gordos presentes, e uma menor dependência da dosagem administrada em quanto diz respeito ao efeito antioxidante do ácido docosahexaenóico no glicerol.

Também vantajosamente, tal como se descreve neste documento, os inventores verificaram que a utilização do ácido docosahexaenóico incorporado numa posição sn-2 de um glicerol incluindo opcionalmente o referido glicerol também pelo menos um ácido gordo seleccionado de entre os ácidos gordos de cadeia comprida, e um ácido fosfórico, proporciona-se uma maior bioactividade, um aumento da protecção antioxidante a uma percentagem molar igual em relação à quantidade total de ácidos gordos presentes, e 25 uma menor dependência da dosagem administrada em quanto diz respeito ao efeito antioxidante do ácido docosahexaenóico no glicerol.

Preferivelmente, os ácidos também presentes num glicerol com o ácido docosahexaenóico serão ácidos gordos com cadeia curta (C1-C8) ou ácidos gordos com cadeia média (C9-C14) ou um ácido fosfórico, uma vez que estes não têm actividade funcional, mas apenas actividade energética e, portanto, não competirão com o ácido docosahexaenóico.

Portanto, ainda mais preferivelmente, a especificação presente diz respeito à utilização do ácido docosahexaenóico incorporado num a glicerol em que uma das posições sn-1 e sn-3 esteja livre ou ocupada por um ácido gordo com cadeia média (C9-C14) ou por um ácido gordo com cadeia curta (C1-C8), ou por um ácido fosfórico, e em que a posição sn-2 esteja ocupada pelo ADH funcional. Deste modo, consegue-se um aumento ainda maior do ADH uma vez que ele será absorvido mais eficientemente pelas células intestinais.

Portanto, a síntese de acilgliceróis estruturados nos quais o ácido docosahexaenóico haja sido incorporado em qualquer uma das posições do glicerol quando não competir com outros ácidos gordos, e em que o ADH tenha sido incorporado na posição sn-2 do acilglicerol quando ele compete com pelo menos um ácido gordo, denota melhorias no que diz respeito ao seu efeito antioxidante e, portanto, é 26 um modo preferido de fabrico de uma composição para o tratamento das lesões oxidativas nas células.

Tal como se descreve neste documento, os inventores verificaram que uma célula enriquecida com uma composição com ADH, tal como descrito neste documento, está mais bem preparada para fazer face a uma nova situação de tensão oxidativa e portanto a minimizar os efeitos adversos que dela podem derivar. Isto é, a presença do ADH nas biomembranas induz uma reacção de adaptação celular à tensão oxidativa. A reacção de adaptação é um fenómeno celular pelo qual uma exposição a um agente tóxico (em concentrações inferiores às letais) provoca uma reacção celular que subsequentemente proteqerá a célula contra os efeitos nocivos do agente tóxico referido a concentrações letais, ou, por outras palavras, é um efeito benéfico despoletado por uma exposição a um pequeno teor de um agente que é nocivo em teores elevados. A administração do ADH apresenta as seguintes vantagens substanciais: a) Uma maior actividade antioxidante celular; b) Ausência de citotoxicidade celular às dosagens administradas; c) Ausência de alterações significativas do estado de oxidação celular às dosagens administradas; 27 d) Actividade de adaptaçao celular antioxidante.

Devido a quanto consta acima, uma concretização preferida da especificação presente diz respeito à utilização do ácido docosahexaenóico para fabricar uma composição farmacêutica para tratar uma patologia associada a lesões oxidativas em células, sendo a patologia referida uma patologia neurodegenerativa, preferivelmente seleccionada de entre o conjunto que inclui: esclerose múltipla, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, esclerose lateral amiotrófica e distrofia muscular, entre outras.

Noutra concretização tal como se descreve neste documento, a patologia associada às lesões oxidativas é uma patologia ocular, preferivelmente uma que seja seleccionado de entre o conjunto constituído por retinose pigmentar, degeneração macular e cataratas, entre outras.

Noutra concretização ainda, a patologia associada às lesões oxidativas é uma patologia isquémica, em especial um enfarte do miocárdio, um enfarte cerebral, etc.

Noutra concretização ainda tal como se descreve neste documento, a patologia associada às lesões oxidativas é um processo inflamatório, preferivelmente seleccionado de entre o conjunto constituído por artrite, vasculite, glomerulonefrite e lúpus eritomatoso, entre outros. 28

Noutra concretização preferida, a patologia associada às lesões oxidativa é a aterosclerose.

Outro aspecto, tal como se descreve neste documento, é a utilização do ADH como agente protector no processo natural de encurtamento dos telómeros, e como agente inibidor da senescência prematura.

Os mecanismos produzindo associações de telómeros (TAS) que ainda são desconhecidos para os autores da invenção presente, sugerem que pode existir uma associação a um défice da actividade do enzima telomerase, que sintetiza as sequências repetitivas de ADN características para os telómeros, estabilizando deste modo o seu comprimento. A telomerase é muito activa nas células fetais, mas não tem muita actividade nas células dos tecidos de adultos. Os TAS apenas foram raramente detectados nas células normais, mas têm sido observados em células infectadas por vírus e em células tumorais.

Tem sido observada uma diminuição progressiva do número de repetições teloméricas in vitro, bem como na função de envelhecimento das células, in vivo, que está associada a uma inibição da actividade da telomerase na senescência. De igual modo, os autores da invenção presente estudaram o comprimento telomérico em fibroblastos e em 29 linfócitos de pessoas saudáveis centenárias, e observaram um encurtamento telomérico durante a propagação in vitro dos fibroblastos, bem como uma correlação inversa entre os comprimentos teloméricos e as idades dos doadores.

Embora o encurtamento dos telómeros ocorra naturalmente com a replicação celular, foram observadas uma senescência prematura e as quebras dos telómeros quando se induzem lesões oxidativas no ADN. Os telómeros são mais sensíveis a lesões oxidativas e as suas quebras são menos eficientemente reparadas do que outras partes do genoma. Isto leva a uma acumulação de lesões teloméricas que produz um encurtamento mais rápido durante a replicação do ADN diminuindo a esperança de vida da replicação celular. As espécies reactivas de oxigénio (ERO), em especial os aniões superóxido, o peróxido de hidrogénio e os radicais oxidrilo podem acelerar as perdas nos telómeros durante a replicação de alguns tipos de células, embora também induzam senescência prematura independentemente do encurtamento dos telómeros.

Surpreendentemente, os autores da especificação presente verificaram que a utilização do ácido docosahexaenóico para o tratamento das lesões oxidativas ao nível do ADN permite diminuir a velocidade de encurtamento dos telómeros e, portanto, inibir a senescência celular.

Os inventores presentes observaram uma correlação inversa entre a velocidade de encurtamento dos telómeros e 30 a capacidade antioxidante celular em mais de 20 estirpes de fibroblastos humanos. A maioria dos parâmetros celulares destes fibroblastos prematuramente envelhecidos são os mesmos que no envelhecimento normal destas células (morfologia, acumulação de lipofuscina e alterações na expressão genética). Os fibroblastos com uma menor defesa antioxidante encurtam os seus telómeros mais depressa, e vice-versa. A velocidade de encurtamento dos telómeros é maior nas células com uma menor defesa antioxidante. Além disto, as espécies que captam radicais livres diminuem a velocidade de encurtamento dos telómeros.

Estes dados estão de acordo com os que demonstram um papel importante dos enzimas antioxidantes, glutationa peroxidase e superóxido dismutase, sobre a velocidade de encurtamento dos telómeros nos fibroblastos humanos. Estes dados provam que o comprimento dos telómeros é determinado principalmente pela relação entre a tensão oxidativa celular e a capacidade de defesa antioxidante. Deste modo, o comprimento dos telómeros dependente da idade, é uma medição acumulada da história das lesões oxidativas que uma célula sofreu ao longo da sua vida.

Foi mostrada uma correlação entre a tensão oxidativa e a velocidade de encurtamento dos telómeros, em patologias hereditárias associadas com disfunções da cadeia respiratória a nivel das mitocôndrias e para a Sindrome de

Down. 31

Portanto, a relação existente entre os danos celulares oxidativos no ADN e o encurtamento telomérico, bem como o seu efeito sobre a senescência celular, permitem utilizar o ácido docosahexaenóico a titulo de um agente protector poderoso no processo natural do encurtamento de telómeros, a titulo de agente inibidor da senescência prematura.

Por outro lado, a utilização de enzimas para a produção de óleos enriquecidos em ácidos gordos ómega-3 tem diversas vantagens em relação a outros métodos baseados na síntese química e subsequentes processos de purificação (separações cromatográficas, destilação molecular, etc.). Estes últimos obrigam a condições extremas de pH e a altas temperaturas que podem destruir em parte as ligações duplas completamente cis dos PUFA ómega-3, por oxidação, por isomerização cis-trans ou por migração da ligação dupla. As condições suaves utilizadas na síntese enzimática temperatura inferior a 50°C, pH 6-8 e menos reagentes químicos) proporcionam uma alternativa sintética conservando a estrutura original dos PUFA ómega-3 com um aumento da selectividade estrutural nos acilgliceróis, considerados como sendo as estruturas químicas mais favoráveis, de um ponto de vista nutricional. A composição farmacêutica contendo ADH pode existir sob a forma de um óleo ou de uma emulsão, que pode ser administrada pelas vias oral, sublingual, endovenosa, intramuscular, tópica, subcutânea ou rectal, ou mesmo 32 proporcionando simplesmente um contacto entre o ingrediente activo na microemulsão tal como descrita neste documento, sob a forma de vapor ou de liquido com os órgãos olfactivos situados à entrada dos sistemas respiratórios. Deste modo, a administração pode ser levada a cabo por aspersão, nebulização ou atomização das microemulsões, ou por inalação.

Opcionalmente, a composição farmacêutica referida contém também um segundo ingrediente activo.

De uma forma semelhante, a composição farmacêutica contendo ADH pode ser utilizada na indústria alimentar com o objectivo de enriquecer produtos alimentares (por exemplo produtos lácteos tais como iogurtes, leites, etc.) com um agente antioxidante natural tal como o ADH.

Portanto, noutra concretização tal como se descreve neste documento, a referida composição farmacêutica é administrada a um paciente que já está a receber um tratamento contra uma patologia associada a lesões oxidativas.

Outro objecto da especificação presente é a utilização de ADH como agente incrementador do desempenho em desportos e como agente regulador dos teores em glucose no sangue durante o esforço físico. 33

Deste modo, os autores da especificação presente verificaram que, de um modo surpreendente, a utilização do referido ácido docosahexaenóico durante o exercício físico leva a um aumento do desempenho em desportos mantendo os teores em glucose no sangue (glicémia) depois de um tal exercício físico (sem se administrarem hidratos de carbono).

Neste contexto, tal como se descreve neste documento, o termo "amador" ou "desportistas sem serem de competição" significa qualquer pessoa que faz exercício físico a título esporádico e de um modo não profissional. E os termos "desportista de competição" ou "desportistas treinados" significam qualquer pessoa que faz exercício físico regularmente e/ou a um nível profissional. De igual modo, os termos "exercício físico" e "esforço físico" são utilizados de um modo equivalente e intercambiável, bem como o termo "desportistas" é utilizado tanto para homens como para mulheres.

Desempenho em desportos

Para se avaliar o desempenho em desportos existem diversos parâmetros que permitem conferir uma valorização à melhoria do desempenho nesses desportos.

Nos desportistas que fazem desportos aeróbicos, considera-se existir um aumento do desempenho quando existe um aumento da percentagem do consumo máximo de oxigénio 34 %V02max no UV 2 (limiar anaeróbico) , uma vez que o V02max quase não aumenta durante uma estação competitiva, em desportistas muito bem treinados. Pequenas alterações na percentagem do VC>2max no limiar são dados directamente relacionados com um aumento do desempenho.

Os inventores presentes mostraram que existe um aumento estatisticamente significativo dos valores do consumo de oxigénio(V02) , tanto o absoluto (p<0,019) como o relativo (p<0,036), em termos ponderais, no limiar de ventilação 2, quando se comparam ensaios de esforço triangular de base com os levados a cabo ao fim de quatro meses de tratamento com ADH. 0 aumento deste parâmetro é ilustrado tanto para ciclistas de competição (p<0,047) e para ciclistas sem ser de competição, sendo a diferença nestes últimos não significativa, do ponto de vista estatístico (figura 24)

Outro parâmetro relacionado com um aumento do desempenho em desportos é o aumento da frequência cardíaca quando o UV2 do ensaio de esforço é fixado, uma vez que neste caso a frequência cardíaca aumenta no limiar anaeróbico, considera-se que os desportistas são capazes de aumentar ligeiramente a capacidade de manter o metabolismo aeróbico a intensidades maiores. Os inventores presentes observaram um aumento da frequência cardíaca no UV2 para p = 0,082, quando compararam o referido parâmetro obtido no ensaio de base com o obtido no ensaio triangular passados 4 meses a consumir ADH. Estes dados são notavelmente exibidos 35 (p<0,017) no subgrupo de ciclistas de alto nivel competitivo (Figura 25). A este respeito, existe um aumento do período necessário para se atingir o UV2 estatisticamente significativo (Figura 26).

Por último, a frequência cardíaca para o mesmo nível de esforço é inferior quando os desportistas forem treinados aerobicamente. Os inventores presentes verificaram que em ciclistas aos quais se administrava ADH a frequência cardíaca diminuía de um modo estatisticamente significativo (p<0,043) em comparação dos dados para ambos os ensaios no ponto em que os desportistas consomem 2.000 mL 02/minuto (Figura 27)

Pode concluir-se que nos desportistas tomando ADH durante 4 meses, se observaram aumentos do consumo de oxigénio, absoluto e relativo, na UV2 (p<0,008 e p<0,015, respectivamente), um aumento da carga correspondendo ao UV2 (p<0,063) e uma diminuição da frequência cardíaca quando o desportista apresenta um consumo de oxigénio de 2.000 mL/minuto (p<0,062). Estes parâmetros indicam todos eles um aumento do desempenho no desporto depois de tomar 2,1 g de ADH/24 h (6 cápsulas de 500 mg, a 70 % em peso), distribuídas por 3 doses diárias, ao longo de 4 meses. As quantidades referidas são expressas a título de exemplo não limitativo da invenção presente. 36

Analisaram-se também diversas variáveis bioquímicas relacionadas com lesões oxidativas, depois das provas de esforço. 1.- Capacidade Antioxidante Total do Plasma (PTAC). Existe um aumento geral e estatisticamente significativo do PTAA (p<0,05) em ensaios rectangulares. Estes aumentos são maiores nos desportistas depois de se lhes administrar o ADH durante três semanas, tanto quando considerados no total ou em ciclistas de competição, não sendo observada nenhuma diferença para desportistas amadores entre o ensaio de base e o ensaio realizado depois de consumirem o ADH durante três semanas (Figura 28) . 2.- 0 malondialdeído (MDA) é o produto mais obtido a partir dos peróxidos lipídicos produzidos por tensão oxidativa com ácido tiobarbitúrico. Mostra-se que um aumento significativo de lesões oxidativas nos lípidos do plasma quando se levam a cabo todos os ensaios de esforço (p<0,035). Depois de ingerirem ADH durante 3 semanas, as lesões oxidativas nos lípidos quando se leva a cabo o ensaio de esforço é menor do que inicialmente (p<0,05). Esta diferença é muito mais importante 37 para esportistas treinados do que que para desportistas amadores (Figura 29). 3.- δ-οχο-7,8-dihidro-2'-desoxiguanosina (8-oxodG). A 8-oxodG é um biomarcador de tensão oxidativa. Existe um aumento das lesões oxidativas no ADN quando se levam a cabo ensaios de esforço rectangulares (p<0,011). Estas lesões oxidativas diminuem depois de se administrar ADH durante 3 semanas (p<0,035). Esta diminuição da tensão oxidativa é mais importante nos ciclistas que não competem do que nos ciclistas de competição, mas a diferença não é estatisticamente significativa (Figura 30).

Estudos de glicémia

Para se estudarem os teores em glucose no sangue levou-se a cabo um ensaio de esforço rectangular numa bicicleta sobre roletes, com uma carga máxima mantida equivalente a uma taxa correspondendo a 75 % do VCbmax calculado sobre o máximo do ensaio de esforço triangular, mantendo o coeficiente angular constante a um valor de 2 %. 0 periodo de tempo do ensaio é de 90 minutos e o consumo de água durante o ensaio é ad libitum.

Uma vez que não foram ingeridas bebidas com hidratos de carbono, era de esperar uma hipoglicémia. Esta hipoglicémia de segunda extracção (vinte minutos depois de 38 acabar o ensaio, em relação à amostra inicial obtida vinte minutos antes de começar o ensaio), é notada no primeiro ensaio de esforço, como era de esperar. No entanto, os dados obtidos depois da administração de ADH ao longo de quatro meses mostram uma manutenção estatisticamente significativa da glicémia, que não havia sido previamente observada e representa um acontecimento surpreendente na investigação levada a cabo.

Em geral, observa-se uma diminuição estatisticamente significativa (p<0,0009) dos teores em glucose no soro para os ensaios de esforço rectangulares. No entanto, o comportamento é diferente consoante o tipo de desportista que se analisa (p<0,003): no caso de ciclistas que habitualmente competem, não existe nenhuma variação significativa da diminuição da glicémia durante os ensaios, mas no caso dos ciclistas amadores, a diminuição da glicémia durante o ensaio de base é maior do que nos ciclistas que habitualmente competem e depois de tomarem ADH durante 3 semanas ou quatro meses, a diminuição referida praticamente desaparece (Figuras 31, 32 e 33). A existência de uma normoglicémia durante o ensaio de esforço a 75 % do V02max durante 90 minutos, sem se beber uma bebida com hidratos de carbono representa uma nova observação que liga o comportamento do ADH durante um esforço físico com o observado e acima mencionado em relação ao aumento da sensibilidade à insulina. A este respeito , Goodyear e Kahn (1998) concluíram que os 39 mecanismos moleculares subjacentes à reacção à glucose no músculo-esquelético, pela insulina ou pelo exercício, são diferentes, após a publicação em 1997 (Winder e Hardie) acerca do facto de que a AMPK (proteína quinase activada por AMP) ser elevada nas fibras lia durante o exercício, considerando que a AMPK tem um efeito pleiotrópico inibindo a acetil-CoA carboxilase e promovendo o transporte de glucose, entre outras acções. Talvez isto possa explicar o que se verificou acerca de uma reacção glicémica diferente nos desportistas, da que é de esperar de acordo com os estudos levados a cabo em indivíduos sedentários.

Destes estudos acerca da acção do ADH sobre o desempenho nos desportos e a glicémia, pode concluir-se o que se segue: 1) Foi provado que a ingestão continuada de ADH durante mais do que 3 semanas origina um aumento da capacidade Antioxidante Total do Plasma (PTAC) de um modo geral e estatisticamente significativo (p<0,05) tanto em ciclistas competitivos como amadores. Além disto, as lesões oxidativas nos lípidos são menores (p<0,05), (diferença que é mais importante para desportistas treinados do que para ciclistas amadores). Finalmente, foi demonstrado que as lesões no ADN medidas por um marcador urinário (8-oxodG) diminui depois de se tomar ADH durante três semanas (p<0,035). 40 2) Provou-se que passados 4 meses de ingestão continuada de ADH, o desempenho nos desportos é melhor (aumento da carga e da frequência cardíaca, bem como da percentagem do V02max no UV2). Além disto, foi observada uma normoglicémia estatisticamente significativa no ensaio de esforço durante 90 minutos a 75 % do V02max, levado a cabo quatro meses depois de se iniciar o consumo do ADH. A associação de ambos os efeitos (uma melhoria do desempenho nos desportos e a normoglicémia durante um exercício de longa duração) constitui um resulta inesperado e desconhecido na técnica.

Além disto, foi possível concluir que esta associação de efeitos é desejável e pode ser uma ajuda ergogénica ainda não conhecida.

Outro objecto da especificação presente é a utilização do ácido docosahexaenóico para o fabrico de uma composição para aumentar o desempenho nos desportos e para manter os teores em glucose no sangue a seguir ao exercício físico, administrada por qualquer meio adequado.

Deve considerar-se que a Comissão da União Europeia para os Alimentos recomenda as seguintes componentes para uma composição de uma bebida que deve ser 41 ingerida durante um exercício físico (veja-se, h t tp: / / e c .europa.e u / f o o d / f s / s c / s c f / o u 16 4__en.pdf) . 80 kcal/1.000 mL Emtm 250 kcal/1.000 mL 20 mmol/L (460 mg/L) n.a. 50 mmol/L (1.150 mg/L) 200 mOs.mL/kg de água Ctoíaridads 330 mOs.mL/kg de água Pelo menos 75 % da energia calórica deve provir de hidratos de carbono com elevada carga glicémica (glucose, maltodextrina, sacarose) Vitamina B1 a 0,2 mg/100 mg de hidratos de carbono A este respeito, a inclusão de hidratos de carbono alveja manter a glicémia para evitar o consumo rápido do glicogénio muscular e hepático. Devem considerar-se as desvantagens do esvaziamento gástrico diminuído, devidas ao aumento da osmolaridade, gerado na presença de concentrações em hidratos de carbono, associado com a sensação de estômago repleto, indesejável para muitos dos desportistas. Portanto, preparar-se uma bebida com uma menor concentração em hidratos de carbono por adição de ADH pode constituir uma vantagem ergogénica com interesse indubitável para o desempenho nos desportos.

Deste modo, outro aspecto da especificação presente diz respeito a uma composição farmacêutica incluindo ADH, que se pode utilizar na indústria alimentar com o objectivo de enriquecer produtos alimentares (por exemplo produtos lácteos tais como iogurtes, leite, etc.) com um agente antioxidante natural tal como o ADH, ou também, incorporar-se numa forma de administração adequada 42 seleccionada de entre o conjunto constituído por uma bebida co todas as suas características já existentes, para durante e depois do exercício físico; uma barra para proporcionar energia; barras ergogénicas; sólidos e preparações para aprovisionamento; suplementos dietéticos e preparações polivitamínicas (sob a forma de, por exemplo, cápsulas, comprimidos, pílulas, sob forma liofilizada, ou em qualquer meio de administração apropriado); adjuvantes ergogénicos; têxteis com nanocápsulas para absorção através da pele, e qualquer outro meio adequado de administração.

Chaves das Figuras

Figura 1. Efeito da concentração em ADH sobre meio de cultura de células de prepúcio na geração intracelular de ERO. Cultivaram-se as células na presença de um triacilglicerol com 70 %, em peso, de ADH, em relação ao total de ácidos gordos, durante três dias antes da experiência. (A) A detecção de ERO foi levada a cabo com DHR 123 sobre células tratadas com AAPH 40 ou 60 mM durante 180 minutos. Os dados mostram a média de três experiências independentes. (B) A detecção de ERO foi levada a cabo com CDCFDA sobre células tratadas com o sistema xantina/xantina oxidase durante 180 minutos. A título de comparação, os dados obtidos com 100 μΜ de Vitamina E (controlo) 43 estão incorporados. Os dados representam a média de três experiências independentes.

Figura 2. Efeito comparado da proporção em ADH num triacilglicerol no meio de cultura de células de prepúcio sobre a geração intracelular de ERO. (A) Cultivaram-se as células na presença de cada triacilglicerol durante três dias, antes da experiência. A concentração ao longo o eixo dos xx é a equivalente que se obteria com um triacilglicerol cujo conteúdo em ADH fosse de 70 %, em peso. Levou-se a cabo a detecção das ERO com DHR 123 sobre células tratadas com 40 mM AAPH durante 180 minutos. Os dados representam a média de três experiências independentes. (B) Representação da protecção antioxidante em relação a uma concentração em ADH no óleo, de 20, 50 e 70 %.

Figura 3. Efeito da concentração em ADH sobre a produção de TBARS em células de prepúcio. Cultivaram-se as células na presença de um triacilglicerol com 70 %, em peso, de ADH, em relação ao total de ácidos gordos, durante três dias antes da experiência à concentração indicada. Induziu-se a tensão oxidativa com AAPH 40 mM durante 6 h e 24 h de latência. Os dados representam a média de três experiências independentes. 44

Figura 4. Efeito da concentração em ADH no meio de cultura de células de prepúcio, sobre a geração de aniões superóxido. Cultivaram-se as células na presença de um triacilglicerol com 70 %, em peso, de ADH, em relação ao total de ácidos gordos, durante três dias antes da experiência. Levou-se a cabo a detecção dos aniões superóxido por quimioluminescência imediatamente após a indução oxidativa das células com AAPH 40 mM e em algumas experiências, na presença de Tyron 10 mM ou de 0,1875 UA/pL de SOD exógena. Os dados são representativos de três experiências independentes.

Figura 5A. Efeito da concentração em ADH no meio de cultura das células de prepúcio, sobre a actividade da SOD. Cultivaram-se as células na presença de um triacilglicerol com 70 %, em peso, de ADH, em relação ao total de ácidos gordos, durante três dias antes da experiência às concentrações em ADH de 0,5 (A), 5 (B) e 50 μΜ (C) . Analisou-se a actividade da SOD indirectamente analisando a diminuição da quimioluminescência gerada pelo luminol em consequência da actividade endógena de SOD. Levou-se a cabo a indução oxidativa com o sistema de xantina 0,1 mM / xantina oxidase a 45 0, 005 U/mL que gera imediatamente aniões superóxido. Os dados são representativos de três experiências independentes.

Figura 5B. Efeito da concentração em ADH no meio de cultura de células de prepúcio sobre a actividade da SOD. Cultivaram-se as células na presença de um triacilglicerol com 70 %, em peso, de ADH, em relação ao total de ácidos gordos, durante três dias antes da experiência. Avaliou-se a actividade da SOD no sistema celular não induzido ou no sistema induzido com AAPH 40 mM. Os dados são representativos de três experiências independentes.

Figura 6. Efeito da concentração em ADH no meio de cultura de células de prepúcio sobre a actividade de GPx. Cultivaram-se as células na presença de um triacilglicerol com 70 %, em peso, de ADH, em relação ao total de ácidos gordos, durante três dias antes da experiência. Avaliou-se a actividade de GPx no sistema celular não induzido ou no sistema induzido com AAPH 40 mM. Os dados são representativos de três experiências independentes.

Figura 7. Efeito da concentração em ADH no meio de cultura de células ARPE-19 sobre a geração intracelular de ERO. Cultivaram-se as células na 46 presença de um triacilglicerol com 70 %, em peso, de ADH, em relação ao total de ácidos gordos, durante três dias antes da experiência. (A) Levou-se a cabo a detecção de ERO com DHR 123 (A) ou com CDCFDA (B) , em células tratadas com AAPH 40 ou 60 mM durante 180 minutos. Os dados são representativos de três experiências independentes.

Figura 8. Efeito comparativo da concentração em ADH num triacilglicerol no meio de cultura de células ARPE-19, sobre a geração intracelular de ERO. Cultivaram-se as células na presença de cada triacilglicerol, durante três dias antes da experiência. A concentração ao longo do eixo dos xx é a equivalente que se obteria com um triacilglicerol com uma proporção de ADH de 70 %, em peso. Levou-se a cabo a detecção das ERO com DHR 123 em células tratadas com AAPH 40 mM durante 180 minutos. Os dados são representativos de três experiências independentes. (B) Representação da protecção antioxidante em relação à concentração em ADH no óleo, a 20, a 50 e a 70 %. em peso, de ADH, em

Figura 9. Efeito da concentração em ADH sobre a produção de TBARS em células ARPE-19. Cultivaram-se as células na presença de um triacilglicerol com 70 %, 47 relação ao total de ácidos gordos, durante três dias antes da experiência, à concentração indicada. Induziu-se a tensão oxidativa com AAPH 40 mM AAPH durante 6 h com uma latência de 24 h. Os dados são representativos de três experiências independentes.

Figura 10. Efeito da concentração em ADH no meio de cultura das células ARPE-19 sobre a geração de aniões superóxido. Cultivaram-se as células na presença de um triacilglicerol com 70 %, em peso, de ADH, em relação ao total de ácidos gordos, durante três dias antes da experiência. Levou-se a cabo a detecção dos aniões superóxido por quimioluminescência imediatamente após a indução oxidativa das células com AAPH 40 mM. Os dados são representativos de três experiências independentes.

Figura 11. Efeito da concentração em ADH no meio de cultura de células ARPE-19, sobre a actividade de GPx. Cultivaram-se as células na presença de um triacilglicerol com 70 %, em peso, de ADH, em relação ao total de ácidos gordos, durante três dias antes da experiência. Avaliou-se a actividade de GPx no sistema celular não induzido ou no sistema celular induzido com AAPH 40 mM AAPH. Os dados sao 48 representativos de três experiências independentes.

Figura 12. Efeito da concentração em ADH no meio de cultura de células ARPE-19 sobre a actividade de SOD. Cultivaram-se as células na presença de um triacilglicerol com 70 %, em peso, de ADH, em relação ao total de ácidos gordos, durante três dias antes da experiência. Avaliou-se a actividade de SOD no sistema celular não induzido ou no sistema celular induzido com AAPH 40 mM. Os dados são representativos de três experiências independentes.

Figura 13. Efeito da concentração em ADH obtido por síntese química (A e C) ou enzimática (B e D) sobre a percentagem de protecção celular contra a tensão oxidativa em células ARPE-19 (A e B) ou de prepúcio (C e D).

Figura 14. Influência do grau de purificação do óleo obtido por síntese química sobre a percentagem de protecção celular contra a tensão oxidativa induzida por ADH em células ARPE-19.

Figura 15. Influência da estrutura química sobre a percentagem de protecção celular pelo ADH contra a tensão oxidativa induzida, em células ARPE-19 cells. 49

Figura 16. Efeito da concentração em ADH sobre a concentração intracelular em glutationa em células ARPE-19 cells. Influência da presença de BSO.

Figura 17. Influência da síntese de novo de glutationa sobre a percentagem de protecção celular pelo ADH, em relação à tensão oxidativa induzida em células ARPE-19.

Figura 18. Efeito da concentração em ADH sobre a concentração intracelular em glutationa em células de prepúcio. Influência da presença de BSO.

Figura 19. Influência do grau de purificação do óleo obtido por sintese quimica sobre a percentagem de protecção celular pelo AEP, contra a tensão oxidativa induzida em células ARPE-19 cells. Estudo de comparação com o ADH.

Figura 20. Efeito da concentração em AEP sobre a percentagem de protecção celular contra a tensão oxidativa em células de prepúcio. Estudo de comparação com o ADH.

Figura 21. Efeito da concentração em AEP sobre a concentração intracelular em glutationa em 50 células de prepúcio. Influência da presença de BSO. A Figura 22 é um gráfico de barras comparativo mostrando o efeito da percentagem em ADH num triacilglicerol estruturado e não estruturado, em diferentes dosagens, em relação à percentagem da protecção celular. A referida Figura 22 mostra os resultados surpreendentes do objecto da adição presente, em comparação entre a estrutura química de um glicérido não estruturado (triacilglicerol), e a mesma estrutura mas na qual as posições sn-1 e sn-3 tenham sofrido substituição por ácido caprílico (estruturado), proveniente de uma fonte enzimática, a dois níveis de partida de conteúdo em ADH, de 20 e 70 %. A partir da Figura, pode observar-se que à mesma concentração, a percentagem de protecção do ácido docosahexaenóico incorporado na posição sn-2 de um acilglicerol (estruturado) , em especial de um triacilglicerol, denota uma eficiência que é cerca de 3 vezes maior do que a de um acilglicerol contendo ADH não estruturado.

Nesta Figura 22, a percentagem de protecção indica a relação entre a diferença da concentração intracelular em espécies reactivas de oxigénio dos poços de 51 com células controlo, e dos tratados com ADH em relação a aqueles, ambos submetidos à mesma tensão oxidativa, expressa em percentagem. Por outras palavras, a existência de uma percentagem de protecção indica, nas células tratadas, uma menor geração intracelular significativa de espécies reactivas de oxigénio, em relação aos controlos. A Figura 23 é um gráfico de comparação mostrando o comprimento médio dos telómeros em fibroblastos humanos cultivados sob tensão oxidativa, com ou sem ADH incorporado, em relação ao número de passagens das populações celulares. A referida Figura 23 mostra os resultados surpreendentes do objecto da adição presente, observando-se que na presença de ADH em condições de tensão oxidativa, o índice de encurtamento telomérico é menor do que o do controlo, ou na ausência de ADH. A Figura 24 é um gráfico que representa o consumo absoluto de oxigénio no "limiar de ventilação 2" (UV2), para ciclistas de competição, para os que não competem, e para todos os ciclistas, ao seu nível de base e ao fim de tomarem ADH durante 4 meses. A Figura 2 5 é um gráfico que representa a frequência cardíaca no UV2 para ciclistas de 52 competição, para os que não competem, e para todos os ciclistas, ao seu nível de base e ao fim de tomarem ADH durante 4 meses. A Figura 26 é um gráfico que representa o período de tempo necessário para atingir o UV2 para ciclistas de competição, para os que não competem, e para todos os ciclistas, ao seu nível de base e ao fim de tomarem ADH durante 4 me s e s. A Figura 27 é um gráfico que representa a frequência cardíaca durante o consumo de 2.000 mL/minuto de 02 no limiar de ventilação, para ciclistas de competição, para os que não competem, e para todos os ciclistas, ao seu nível de base e ao fim de tomarem ADH durante 4 meses. A Figura 28 é um gráfico que representa a capacidade antioxidante total do plasma para desportistas de competição, para os que não competem e para todos eles, ao nível de base e após consumo de ADH durante 3 semanas. Mostra-se caso a caso a capacidade antioxidante antes (barra da esquerda) e a capacidade antioxidante depois (barra da direita), do ensaio de esforço. 53 A Figura 29 é um gráfico que representa as lesões oxidativas dos lípidos do plasma de acordo com a concentração em MDA, para desportistas de competição, para os que não competem, e para todos, ao nivel de base e após consumirem ADH durante 3 semanas. Mostra-se caso a caso as lesões oxidativas antes (barra da esquerda) e as lesões oxidativas depois (barra da direita), do ensaio de esforço. A Figura 30 é um gráfico que representa as lesões oxidativas no ADN utilizando o biomarcador de tensão oxidativa 8-oxodG para desportistas de competição, para os que não competem, e para todos, ao nivel de base e após consumirem ADH durante 3 semanas. Mostra-se caso a caso as lesões oxidativas antes (barra da esquerda) e as lesões oxidativas depois (barra da direita), do ensaio de esforço. A Figura 31 é um gráfico que representa a glicémia em desportistas de competição, durante um esforço fisico, não tendo tomado ADH ou tendo tomado ADH durante 3 semanas ou 4 meses. A Figura 32 é um gráfico que representa a glicémia em desportistas que não são de competição, durante um esforço fisico, não tendo 54 tomado ADH ou tendo tomado ADH durante 3 semanas ou 4 meses. A Figura 33 é um gráfico que representa a glicémia em desportistas de competição e sem ser de competição, durante um esforço físico, não tendo tomado ADH ou tendo tomado ADH durante 3 semanas ou 4 meses.

Os exemplos que se seguem estão incluídos a título de exemplos ilustrativos e não limitativos da invenção.

Exemplos

MATERIAIS E MÉTODOS PARA AVALIAR A ACTIVIDADE ANTIOXIDANTE

Culturas de células

Os modelos celulares utilizados foram células de prepúcio (fibroblastos epidérmicos não diferenciados, CRL-2076) e células ARPE-19 (células epiteliais pigmentares da retina, CRL-2302) obtidas da American Type Culture

Collection. Mantiveram-se as culturas de células em condições adequadas para o seu crescimento em termos de temperatura (37°C) , concentração em C02 (5 %) e humidade (95 %) , numa incubadora especialmente concebida para este propósito. Mantiveram-se as células ARPE-19 em crescimento 55 até à confluência de 0,3xl04 células/cm2, em frascos de cultura com meio DMEM-F12 (Biological Industries) com suplemento de 10 % de soro fetal de bovino, os antibióticos penicilina (a 100 U/mL), estreptomicina (a 100 pg/mL) e glutamina (Biological Industries). Mantiveram-se os fibroblastos CRL-2076 em crescimento em frascos de cultura em meio Dulbecco (Biological Industries) modificado por Iscove, com suplemento de 10 % de soro fetal de bovino, os antibióticos penicilina (a 100 U/mL), estreptomicina (a 100 pg/mL) e glutamina (Biological Industries). Transferiram-se as células para aderência ao substrato durante 24 h a 37°C, dos frascos com 75 mL para placas com 6, 12 ou 96 poços, para se conseguir levar a cabo a experiência (a 106 células/mL).

Integração do ADH nas células

Adicionou-se o triacilglicerol de ADH (ADH-TG) a diversas concentrações (0,5-50 pM), partindo do ADH-TG enriquecido a 20, 50 e 70 % (densidade do óleo 0,92 g/mL), feito dissolvendo o óleo em etanol para se obter uma solução de partida (a 1:100), preparando-se as soluções de trabalho num meio de cultura preparado com soro. Cultivaram-se as células com meio de ADH-TG com suplemento, durante 3 dias a 37°C.

Indução da tensão oxidativa 56

Utilizaram-se diversas células indutoras para criar uma tensão oxidativa nas células: a) sistema xantina/xantina oxidase 0,8 mM/10~2 U/mL que catalisa a oxidação a hipoxantina e da xantina a ácido úrico, com redução do 02 a O-2 e a H2O2. b) cloridrato de 2,2'-azobis-(2-amidinopropano) (AAPH) 1-100 mM, amplamente utilizado a titulo de iniciador hidrofílico de radicais livres por indução da peroxidação de lípidos e de proteínas. 0 AAPH oxida o ADN, as proteínas e os lípidos por acção dos radicais peroxilo que se formam. Actua além disto no sistema de defesa endógeno, uma vez que desactiva o enzima chave, a SOD, perdendo deste modo a capacidade protectora do CAT e de GPx.

Geração de espécies reactivas de oxigénio (ERO)

Mediu-se o teor em ERO em culturas primárias de fibroblastos CRL-2076 da pele humana e em células epiteliais de retina ARPE-19, empregando a técnica fluorométrica e utilizando dihidrorrodamina 123 (DHR123, Molecular Probes) e diacetato de 2,7-diclorofluoresceína (H2DCFDA, Molecular Probes) como sondas fluorescentes num sistema contínuo e medindo de 30 em 30 minutos até aos 180 minutos. Em ambos os casos, trata-se de uma medição não 57 específica da geração de ERO. As sondas fluorescentes foram adicionadas às células (lxlO6 células/mL) a uma concentração final de 10 μΜ. Mediu-se a fluorescência das sondas oxidadas (2,7-diclorofluoresceína e rodamina 123) num leitor de fluorescência Mithras com um comprimento de onda de excitação de 488 nm e um comprimento de onda de emissão de 525 nm, ao longo do tempo. A fluorescência obtida está modulada pela viabilidade celular determinada pela técnica espectrofotométrica de MTT que se delineia adiante.

Viabilidade celular

Levaram-se a cabo estudos de viabilidade celular para se avaliar o efeito citotóxico de diversas amostras. Este método consiste na adição do reagente MTT brometo de (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazoílo, Sigma), solúvel em meio aquoso, ao meio de incubação. As células viáveis metabolizam este composto que é transformado no sal de formazan. Este sal é um composto colorimétrico insolúvel em meio aquoso, solúvel em DMSO e utilizável para medir a viabilidade celular. O método consiste em adicionar 20 μύ por poço de uma solução de MTT a 7,5 mg/mL (em excesso) . Incuba-se durante uma hora a 37°C de modo a que as células viáveis metabolizem o composto e produzam o sal de formazan, enquanto as células não viáveis não. Depois de se incubar durante uma hora, as células são precipitadas e adiciona-se 100 μύ de DMSO, que dissolve o sal de formazan. Por último, lê-se a absorvância a 550 nm num leitor de 58 placas. Expressam-se os resultados de viabilidade como percentagens de densidade óptica em relação aos controlos, considerando estes últimos como possuindo uma viabilidade de 100 %. Obtiveram-se curvas de viabilidade celular em placas de 96 poços semeando cerca de 20.000 células por poço (depois de uma análise para determinar o número de células adequado em função da sua taxa de crescimento), com um volume de cerca de 200 pL de meio por poço. Leva-se a cabo o estudo da eficiência do produto depois de se exporem as células ao produto durante 72 h, numa gama de concentrações suficientemente ampla para se encontrar o valor de IC50. Ajustam-se os resultados experimentais à equação de Hill utilizando o programa Sigma Plot 8.0 para se determinar o IC50, definido como a concentração em ADH necessária para diminuir a viabilidade da cultura a 50 %, em relação ao controlo.

Determinação de proteínas A determinação é baseada numa detecção colorimétrica e na quantificação total das proteínas com uma formulação optimizada de ácido dizinconínico que permite a quantificação das proteínas em amostras diluídas, numa gama de concentrações de 0,5-20 pg/mL. 0 método utiliza um detector para Cu+1, que é reduzido pelas proteínas em meio alcalino a Cu+2. O produto de reacção violeta é formado por quelação de duas moléculas de BCA pelo ião cuproso. O complexo solúvel em água absorve a 562 nm. Recorrendo a uma curva de calibração, pode obter-se uma 59 equação, com os resultados expressos em pg/mL de proteínas. 0 estojo comercial utilizado é o MicroBCA da Pierce (N° . 23235) .

Análise directa da geração de ERO

Medição da geração de hidroperóxidos lipídicos

Utilizou-se a quantificação do malondialdeído (MDA) em lisados celulares como marcador da peroxidação de lípidos, por espectrofotometria no UV-Vis. 0 MDA e os 4-hidroxialcenaldeídos (HAE) são produtos derivados da peroxidação dos ácidos gordos polinsaturados e ésteres relacionados. A determinação directa destes aldeídos constitui um índice conveniente da peroxidação lipídica. Empregou-se um reagente cromogénico (N-metil-2-fenil-indole em acetonitrilo) que reage com o MDA a 45°C, utilizando o estojo comercial para peroxidação de lípidos da Calbiochem (N° 437634) . Por condensação de uma molécula de MDA com duas moléculas do reagente cromogénico obtém-se um cromóforo estável com uma absorvância máxima a 586 nm, sendo o limite de detecção 0,1 μΜ. Levou-se a cabo a indução durante 6 h com AAPH 40 mM e uma latência de 24 horas. Lisaram-se as células (107 células/mL) com ciclos de congelação e descongelação em N2 líquido. Fraccionaram-se as amostras para se determinar o MDA e as proteínas. Exprimiram-se os resultados em μΜ de MDA/mg de proteína.

Quantificação da geração de anião superóxido 60

Levou-se a cabo a quantificação directa do anião superóxido recorrendo a uma técnica de quimioluminescência em microplacas, medida pelo luminol (Calbiochem, N° 574590). A quimioluminescência para detectar o anião superóxido é uma técnica utilizada devido ao seu potencial para conseguir acesso a todos os locais intracelulares de geração do superóxido, devido à elevada especificidade da reacção com o luminol, à toxicidade intracelular mínima e à maior sensibilidade em relação a outras técnicas químicas. Baseia-se na oxidação do luminol pelo anião superóxido numa reacção que origina fotões que são rapidamente quantificados num iluminómetro habitual. Nos nossos testes utilizámos um leitor de quimioluminescência em microplacas de ELISA, MITHRAS, e além disto, atenta a curta vida média d radical, utilizou-se um incrementador para melhorar a sensibilidade do teste e para amplificar a reacção. Pode utilizar-se este reagente sobre células vivas, uma vez que é não tóxico e não desnatura as componentes do sistema subcelular. A capacidade para inibir a produção de anião superóxido também foi investigada utilizando um agente sequestrante específico para o anião superóxido, Tyron (ácido 4,5-dihidroxi-l,3-benzenodissulfónico, Sigma) frequentemente utilizado para ensaios de bloqueio in vitro da produção de ERO, sendo permeável à membrana celular e, superóxido dismutase (SOD, Sigma) como bloqueador enzimático, constituindo um enzima de primeira linha na defesa antioxidante endógena. A determinação da quimioluminescência nas células submetidas à indução da 61 tensão oxidativa com AAPH foi analisada a cada 60 segundos durante um período global de 4100 segundos, a uma frequência de 120 s/ciclo. Exprimiram-se os resultados em UA de quimioluminescência/mg de proteína.

Determinação da actividade antioxidante do enzima

Medição da actividade da glutationa peroxidase (GPx) A GPx catalisa a redução de hidroperóxidos a glutationa reduzida, uma função destinada a proteger a célula de lesões oxidativas. A glutationa é utilizada a título de último doador de electrões para regenerar a forma reduzida da selenocisteína. A medição indirecta de GPx pode ser obtida por uma reacção acoplada com glutationa redutase. Recicla-se a glutationa oxidada (GSSG) produzida por reacção com os hidroperóxidos por acção do GPx, ao seu estado reduzido, recorrendo a glutationa redutase que utiliza NADPH como coenzima. A oxidação de NADPH a NADP+ é acompanhada pela diminuição da sua absorvância a 340 nm. A taxa de diminuição da absorvância a 340 nm é directamente proporcional à actividade da GPx na amostra. Utilizou-se o estojo de ELISA espectrofotométrico em microplacas da Cayman (N° 703102) para detectar a GPx em lisados celulares de culturas primárias. Cultivaram-se as células por aderência ao substrato, durante 24 h a 37°C. Obteve-se o lisado de células por sonicação em Tris 50 mM, a pH 7,5, contendo EDTA 5 mM e DTT 1 mM. Obteve-se a actividade da 62 GPx determinando a alteração da A340 nm/minuto (ΔΑ340 ) , expressa em nanomoles de NADPH/minuto/mg de proteína da amostra.

Medição da actividade da superóxido dismutase (SOD)

Esta metodologia de quimioluminescência baseia-se na análise da actividade da SOD no sobrenadante das células em relação a um controlo positivo da SOD (Calbiochem N° 574590) . A presença de SOD no sistema de xantina oxidase-xantina-luminol leva a uma diminuição da quimioluminescência produzida por diminuição da dismutação do anião superóxido proporcional à actividade da SOD. Leva-se a cabo a análise num iluminómetro MITHRAS a intervalos de 50 milissegundos, até um período reaccional final de 520 s.

Também se determinou a actividade da superóxido dismutase (SOD) em lisados celulares recorrendo à reacção utilizando sais de tetrazólio para detectar os radicais superóxido gerados pelo sistema xantina oxidase/hipoxantina. Utiliza-se um método espectrofotométrico numa microplaca para medir os 3 tipos de SOD (Cu-Zn-SOD; Μη-SOD e Fe-SOD) , que pertence ao citossol e é mitocondrial). Define-se uma unidade de SOD como a quantidade de enzima necessário para dismutar 50 % do anião superóxido gerado. Para se detectar a SOD em lisados celulares de culturas primárias utilizou-se um 63 estojo Cayman (N° 706002) seguindo o protocolo optimizado pelo fabricante. A gama dinâmica do ensaio é de 0,025-0,25 unidades de SOD/mL.

Determinação da concentração antioxidante intracelular endógena

Medição da concentração intracelular de glutationa reduzida (GSH)

Ensaio cinético directo para determinar a glutationa reduzida (GSH) em lisados celulares. A glutationa pode existir dentro das células sobretudo na forma reduzida (90-95 % da glutationa total), e é o principal antioxidante nos tecidos. 0 seu papel é o de destoxificar os xenobióticos e remover os hidroperóxidos de modo a manter o estado redox nas células. A técnica empregue determina a glutationa total (GSSG + GSH) numa amostra biológica (lisado celular) previamente desproteinizado com ácido sulfossalicilico (estojo Sigma-Aldrich CS0260). A GSH provoca uma redução continua do ácido 5,5'-ditiobis(2-nitrobenzóico) (DTNB) a ácido 5- tio(2-nitrobenzóico (TNB) e a GSSG formada é reciclada pela glutationa redutase com NADPH. Determina-se espectrofotometricamente o TNB a 412 nm. A butionina sulfoximina (BSO) inibindo especificamente a gama- glutamilcisteina sintetase foi utilizada a titulo de inibidor da sintese. 64

AVALIAÇÃO DA ACTIVIDADE ANTIOXIDANTE DE ADH NUM MODELO COM PELE HUMANA

Neste ensaio in vitro utilizaram-se a titulo de modelo celular células de prepúcio (fibroblastos epidérmicos indiferenciados, ATCC CRL-2076), pois são um tipo de célula adequado devido à sua boa reacção in vitro a diversos indutores de oxidação, para além de serem uma cultura primária com necessidades nutricionais e de condições de cultura normais, constituído deste modo um bom modelo in vitro extrapolável à reacção in vivo, para uma aplicação cosmética potencial do ADH.

Resultados

As condições iniciais foram tais que se conseguisse um modelo celular activo para todas as condições possíveis no estudo. Isto significa que os resultados obtidos se referem a células metabolicamente activas. Estudos anteriores já tinham mostrado que nas células de prepúcio, concentrações inferiores a 1.000 μΜ do ADH não afectavam a viabilidade celular nos estudos a 3 dias. Nem a viabilidade celular era afectada por estudos de tensão oxidativa levados a cabo com o sistema xantina/xantina oxidase ou com AAPH. Também já se tinha mostrado que a incorporação de ADH até uma concentração de 50 μΜ numa cultura de células de prepúcio durante 3 dias, não aumenta significativamente o nível oxidativo celular determinado sob a forma da fluorescência celular associada 65 a duas sondas, dihidrorrodamina (DHR 123) e 2,7-diclorofluoresce+ina (H2DCFDA), respectivamente mais específicas para o anião superóxido e para a detecção de hidroperóxidos. Uma vez estabelecidas estas condições, a capacidade antioxidante geral do ADH incorporado na membrana das células de prepúcio foi avaliado em relação à tensão oxidativa induzida pela xantina/xantina oxidase ou pelo AAPH.

Quando se induz uma tensão oxidativa moderada com AAPH 40 mM, e utilizando como detector de ERO o DHR123, o ADH denota um efeito inibidor sobre a geração das espécies reactivas de oxigénio, tanto à concentração de 0,5 μΜ (59 % de protecção) como à de 5 μΜ (33 % de protecção), denotando um efeito menor a 10 μΜ (26 % de protecção) ou uma ausência de efeito a 50 μΜ em ADH (Fig. IA) . Quando se submetem as células a uma indução severa com AAPH 60 mM, o ADH denota um efeito protector contra a geração de ERO, tanto a uma concentração de 0,5 μΜ (40 % de protecção), como a 5 μΜ (29 % de protecção), o qual se perde para concentrações em ADH mais elevadas (Fig. IA).

Pode também anotar-se que a protecção conferida pelo ADH 0,5 μΜ ADH exercida contra a tensão oxidativa induzida pela xantina/xantina oxidase (Fig. 1B), denotando um efeito sequestrante das espécies reactivas de oxigénio, e tanto contra o anião superóxido como contra os hidroperóxidos gerados durante o processo oxidativo. Comparando com a capacidade antioxidante em relação a um antioxidante lipofílico tal como a vitamina E (Fig. 1B) , observa-se que elas denotam cinéticas de protecção semelhantes (sendo a oxidação celular inibida em 33,46 % pelo ADH e em 30% pela vitamina E). A cinética da reacção de protecção pelo ADH apresenta sempre um efeito antioxidante máximo a entre 60-120 minutos depois de ser levada a acabo a indução, denotando deste modo uma saturação da capacidade sequestrante do ADH para hidroperóxidos e anião superóxido. O comportamento antioxidante depende criticamente da dose, uma vez que aumentando a sua concentração leva a uma perda a capacidade sequestrante de ERO, tendo a concentração de 0,5 μΜ a capacidade antioxidante mais eficaz. A este respeito, outro parâmetro crítico em termos da optimização da eficiência do sistema é a proporção de ADH em relação aos ácidos gordos totais. Tal como se ilustra na Figura 2, a concentrações idênticas de triacilglicerol, uma diminuição da proporção de ADH para 50 ou 20 % diminui drasticamente a capacidade antioxidante celular, e ele volta a tornar-se pro-oxidante a concentrações pequenas ou moderadas. Estes resultados parecem indicar que o efeito antioxidante celular do ADH não depende exclusivamente da sua concentração, mas que também é um factor decisivo a sua localização molecular, neste caso a sua distribuição na estrutura do triacilglicerol.

No que diz respeito à inibição específica da produção de ERO, analisámos a geração de peróxidos 67 lipídicos (TBARS) e de aniões superóxido. Os resultados obtidos mostravam que as células tratadas com AAPH geravam uma maior concentração de substâncias em relação ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), quando comparadas com as células não induzidas, expressas como μΜ de MDA/mg de proteínas (Fig. 3) . Tal como é de esperar, a incorporação de ADH na membrana das células de prepúcio aumentava ligeiramente a peroxidação lipídica celular de base de um modo dependente da dose (0,5, 5 e 50 μΜ) (Fig. 3). Nas células submetidas a indução oxidativa com AAPH 40 mM, o ADH apresenta uma actividade antioxidante protegendo os fibroblastos de gerarem peróxidos hidrolifílicos nas membranas, tendo a sua acção uma característica de depender da sua concentração, sendo inversa em relação à sua concentração. A protecção com ADH foi de 87 % para o ADH 0,5 μΜ, de 85 % para o ADH 5 μΜ e de 48 % para o ADH 50 μΜ ADH, sempre em triacilglicerol (Fig. 3).

Analisou-se então a geração do anião superóxido. Em células de prepúcio submetidas a uma tensão oxidativa com AAPH 40 mM gerava-se uma produção de anião superóxido 2,5 vezes maior do que nas células não induzidas, nas quais se mantinha um teor constante em anião superóxido (Fig. 4). Na ausência de indução oxidativa, as células com ADH integrado não exibem um teor mais elevado em anião superóxido intercelular em relação às de controlo (Fig. 4). Em condições de tensão oxidativa (Fig. 4) o ADH inibe a geração do anião superóxido em 16,5 %, quando está a uma concentração de 0,5 μΜ, em 10 % a uma concentração de 5 μΜ 68 e a 9 % a uma concentração de 50 μΜ. Confirmou-se a especificidade do método por adição de Tyron (ácido 4,5-dihidroxi-1,3-benzenodissulfónico, um composto que é permeável através da membrana celular e que opera como agente sequestrante fortemente especifico para o anião superóxido intracelular) ou de SOD extracelular (um enzima bloqueador de primeira linha na defesa antioxidante endógena, através da dismutação do anião superóxido intracelular). A produção do anião superóxido em células sob tensão com AAPH, tendo ou não sido nelas previamente integrado ADH, na presença de SOD exógeno ou de Tyron, foi completamente inibida e atingiu valores de base (Fig. 4). diminuindo as

Por último, analisou-se se o ADH sofria a sua actividade antioxidante por modificar a actividade dos enzimas antioxidantes de primeira linha. Analisou-se a actividade da SOD e a da GPx em células de prepúcio com ou sem ADH integrado nelas. No primeiro caso, utilizou-se o sistema xantina/xantina oxidase como gerador instantâneo de aniões superóxido (período total de determinação 520 s, medindo-se a cada 50 milissegundos). Os resultados obtidos denotavam uma boa indução oxidativa com uma cinética rápida, com uma observação directa da dismutação e da não produção de anião superóxido. O máximo da quimioluminescência foi conseguido ao fim de 15 segundos da indução oxidativa, e interpretado como sendo uma medida indirecta e qualitativa da actividade da SOD (Fig. 5A). Sem integração de ADH, determinaram-se as quimioluminescências para 106 células com valores de 310 U.A., 69 quimioluminescências para 106 células para valores de 150 U.A., num sistema previamente incubado com ADH 0,5 μΜ (52 % de protecção antioxidante) (Fig. 5A) . Manteve-se a eficiência antioxidante a 52 % e a 42 % em células tratadas respectivamente com ADH 5 e 50 μΜ (Fig. 5A) . Além disto, sabendo-se que o AAPH oxida o ADN, as proteínas e os lípidos por difusão dos radicais peroxilo gerados, o ADH como antioxidante pode evitar a desactivação da SOD à qual cabe a dismutação dos aniões superóxido, mantendo-se na célula a defesa antioxidante endógena com catalase e glutationa peroxidase. Confirma-se este aspecto na Figura 5B, na qual se apresenta a actividade da SOD como não aumentando a partir da do estado de base quando está presente ADH (-10/-15 %) , mas perdendo-se a actividade da SOD como é próprio do processo de tensão oxidativa com a presença de ADH, caso em que se mantém, ou pode mesmo aumentar a actividade da SOD (10/20 %) . No que toca à actividade da GPx (Fig. 6), verifica-se que ela aumenta a partir da do estado de base celular, a concentrações modestas de ADH (de até 17 % a 5 μΜ) , mas diminui a concentrações elevadas (-20 % a 50 μΜ) . Este comportamento permanece idêntico num estado de tensão oxidativa (Fig. 6). Estes resultados sugerem que o ADH colabora com o sistema endógeno de defesa antioxidante no que toca à dismutação do anião superóxido por gerar SOD ao longo da totalidade da gama de concentrações testada, e é também capaz de controlar a geração de hidroperóxidos a concentrações moderadas, uma vez que aumenta a actividade de GPx. 70

AVALIAÇÃO DA ACTIVIDADE ANTIOXIDANTE DO ADH NUM MODELO COM CÉLULAS DE RETINA

Neste estudo in vitro o modelo celular era baseado em células ARPE-19 (células epiteliais pigmentares da retina, ATCC CRL-2302), que são um tipo de células adequado devido à sua boa reacção in vitro a diversos indutores oxidantes, bem como a serem uma cultura primária com condições de cultura e requisitos nutricionais normais. Constituem também um bom modelo ocular, uma vez que mantêm as propriedades biológicas e funcionais das células epiteliais pigmentares da retina.

Resultados O ensaio levado a cabo com esta linha de células é semelhante ao descrito para células de prepúcio na secção anterior. Os requisitos de base eram os mesmos no que toca a manter-se a viabilidade celular em todas as condições de trabalho (feito do ADH, da tensão oxidativa). A incorporação de ADH às doses analisadas também não envolveu nenhuma alteração significativa do estado de oxidação celular de base.

Quando se induz uma tensão oxidativa moderada com AAPH 40 mM e utilizando como detector de ERO o DHR123, o ADH exibe um efeito inibidor da geração de espécies reactivas de oxigénio, às concentrações de 0,5 μΜ (43 % de protecção) e de 5 μΜ (32 % de protecção) , mas apresenta um 71 efeito inferior a 50 μΜ (4 % de protecção) (Fig. 7A) . Quando se submetem as células a uma indução severa com AAPH 60 mM, o ADH exibe um efeito protector contra a geração de ERO, à concentração de 0,5 μΜ (13 % de protecção) e efeitos menores a concentrações em ADH superiores (Fig. 7A). Estes resultados são semelhantes aos obtidos com as células de prepúcio, embora seja um efeito notavelmente diferente a menor protecção observada para a indução oxidativa severa. Quando se utiliza para a detecção das ERO o CDCFDA, mais especifico para peróxidos, também é revelada a protecção oriunda do ADH e contra a tensão oxidativa induzida pelo AAPH (Fig. 7B). A cinética de protecção do ADH também apresenta sempre um efeito antioxidante máximo 60-120 minutos depois de se levar a cabo a indução, denotando uma saturação dos hidroperóxidos e uma capacidade sequestrante do anião superóxido pelo ADH. Quantitativamente, a capacidade antioxidante é criticamente dependente da dose, uma vez que quando a concentração em ADH é aumentada existe uma perda de capacidade sequestrante das ERO, sendo a concentração de 0,5 μΜ a mais eficaz quanto à sua capacidade antioxidante (Fig. 7A e 7B). A este respeito, outro parâmetro critico em termos de optimizar a eficiência do sistema é a razão entre o ADH e o total de ácidos gordos. Quando se diminui a proporção do ADH para o total de ácidos gordos, de 70 % para 50-20 %, diminui-se de um modo significativo e não proporcional a sua capacidade antioxidante celular às concentrações óptimas (0,5-5 μΜ) , tornando-as iguais às 72 observadas a concentrações elevadas (Fig. 8A and 8B), embora ao contrário do observado para as células de prepúcio, o ADH nunca se torna pro-oxidante a nenhuma concentração. Estes resultados confirmam que o efeito antioxidante celular do ADH não depende exclusivamente da sua concentração, mas que a localização molecular é outro factor decisivo, neste caso a sua distribuição na estrutura do triacilglicerol.

No que toca à inibição especifica da produção de ERO, analisaram-se a geração de peróxidos lipídicos (TBARS) (Fig. 9) e de aniões superóxido (Fig. 10). Os resultados obtidos são muito semelhantes aos obtidos com as células de prepúcio. As células tratadas com AAPH geram uma concentração mais elevada de substâncias, em relação ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) e de aniões superóxido, em relação às células não induzidas. A incorporação de ADH na membrana das células ARPE-19 aumenta ligeiramente e de uma forma dependente da dose (0,5, 5 e 50 μΜ) a peroxidação lipidica celular de base, embora nas células submetidas a uma indução oxidativa, o ADH apresente uma actividade antioxidante celular inibindo-as de gerar hidroperóxidos lipidicos na membrana, a uma razão inversa às suas concentrações. A protecção com ADH foi de 64 % para ADH 0,5 μΜ, de 58 % para ADH 5 μΜ e de 42 % para ADH 50 μΜ (Fig. 9) . Analisou-se então a geração do anião superóxido. Na ausência de uma indução oxidativa, as células com ADH integrado não apresentam um nivel mais elevado de anião superóxido intracelular em relação ao do controlo (Fig. 73 10Α). Uma tensão oxidativa com AAPH 40 mM gera uma produção de superóxido que é parcialmente inibida pelo ADH (20-16 % a concentrações de 0,5-50 μΜ). Esta inibição está de acordo com a actividade da SOD quando está presente ADH (Fig. 10B) . Não se observa aumento da actividade de SOD em relação á do estado de base, com a presença de ADH (-10/15%), mas tal como nas células de prepúcio, a perda da actividade de SOD inerente ao processo de tensão oxidativa é inibida pela presença de ADH mantendo a actividade de base da SOD.

Por último, levou-se a cabo uma análise para averiguar se o ADH alterava a actividade do enzima GPx como antioxidante celular de primeira linha (Fig. 11). A actividade da GPx aumenta em relação à no estado celular de base, a todas as concentrações em ADH que se testaram (12-40 %), e este comportamento é mantido intacto num estado de indução oxidativa, durante o qual está presente uma actividade 2,5 vezes maior da GPx (Fig. 11) . Tal como no caso das células de prepúcio, estes resultados sugerem que o ADH exerce uma parte do efeito antioxidante modulando a actividade da defesa antioxidante do sistema enzimático celular.

INFLUÊNCIA DO MÉTODO DE SÍNTESE NA ACTIVIDADE ANTIOXIDANTE DE ADH INCORPORADO NUM TRIACILGLICEROL

No ensaio presente in vitro, utilizaram-se células ARPE-19 (células epiteliais pigmentares da retina, ATCC CRL-2302) e células de prepúcio (fibroblastos 74 epidérmicos não diferenciados, ATCC CRL-2076) a titulo de modelo celular, porque são linhas de células adequadas devido às suas boas reacções in vitro a diversos indutores oxidantes. Utilizaram-se a título de ingrediente activo triacilgliceróis de óleo de atum (DHA 20 % em TG, 20 % molar em ADH) ou derivados de óleo enriquecidos em ADH a 50 ou 70 % molar (ADH 50 % em TG e ADH 70 % em TG) , obtidos por métodos químicos (CHEM) ou por métodos enzimáticos (ENZ).

Resultados

Quando se induz uma tensão oxidativa moderada com AAPH 40 mM em células ARPE-19, e utilizando DHR123 ou H2DCFDA como detectores intracelulares de ERO, o ADH natural (ADH 20 % em TG) e o incorporado num triacilglicerol obtido quimicamente ADH 50 % em TG CHEM e ADH 7 0 % em TG CHEM) denota um efeito inibidor da geração das espécies reactivas de oxigénio, tanto a 0,5 μΜ como a 5 μΜ e a 5 μΜ, denotando um efeito menor a 50 μΜ (Figura 13A). Este efeito depende do conteúdo em ADH, que é ADH 70 % em TG CHEM > ADH 5 0 % em TG CHEM > ADH 2 0 % em TG. Às mesmas concentrações (0,5, 5 e 50 μΜ) , os óleos obtidos enzimaticamente denotam uma maior actividade a todos os conteúdos em ADH (ADH 70 % em TG ENZ e ADH 50 % em TG ENZ) (Fig. 13B) . Num estudo semelhante em células de prepúcio, os resultados ainda foram mais surpreendentes. A actividade pro-oxidativa denotada na presença de ADH 70 % em TG CHEM e de ADH 50 % em TG CHEM a dose elevada (Fig. 13C) torna-se 75 antioxidativa a todas as concentrações com óleos com origem enzimática (ADH 70 % em TG ENZ e ADH 50 % em TG ENZ) (Fig. 13D). A remoção dos polímeros intrínsecos dos óleos obtidos quimicamente, por métodos cromatográficos (DHA 70 % em TG BPM) provoca uma diminuição ainda maior da actividade antioxidativa em células ARPE-19, tornando-se pro-oxidativa a concentrações elevadas (5 e 50 μΜ) (Fig. 14). A actividade antioxidativa do ADH incorporado em triacilglicerol obtido por síntese enzimática é também maior (pelo menos o dobro) do que a evidenciada pelo ADH incorporado em outras estruturas químicas tais como ésteres etílicos, ácidos gordos livres ou ácidos gordos ligados a albumina do soro (Fig. 15). A actividade antioxidativa celular aquando da incorporação de ADH está relacionada com todos os aspectos considerados acima, tais como a manutenção das actividades enzimáticas da SOD e da GPX, mas também com um aumento da concentração intracelular em glutationa (GSH). Nas células ARPE-19 (Fig. 16), o ADH induz um aumento da concertação intracelular em GSH directamente relacionado com a síntese de novo de GSH, uma vez que a adição de BSO (inibidor específico da síntese de GSH) elimina o efeito protector do ADH (Fig. 17) em relação directa com um decréscimo da concentração intracelular em GSH (Fig. 15). Um efeito semelhante é visível para as células de prepúcio (Fig. 18) . A melhoria obtida da actividade antioxidativa do ADH quando proveniente de síntese enzimática também é 76 aplicável a outros ácidos gordos ómega-3 tais como o ácido eicosapentaenóico (AEP). Num estudo em células ARPE-19, mostra-se que um AEP obtido enzimaticamente (AEP 70 % em TG ENZ) possui uma actividade antioxidativa, embora muito menor que a observada com o ADH (ADH 70 % em TG ENZ), enquanto o AEP obtido quimicamente e isento de polímeros (AEP 70 % em TG BPM) mostra ser muito pro-oxidativo (Fig. 19) . Além disto, o AEP (AEP 70 % em TG ENZ) obtido enzimaticamente denota com células de prepúcio uma actividade antioxidativa notável, mesmo superior á do ADH (ADH 70 % em TG ENZ) (Fig. 20), relacionada com, tal como para o ADH, o aumento da concentração intracelular em GSH (Fig. 21).

AVALIAÇAO DA ACTIVIDADE ANTIOXIDANTE DO ADH INCORPORADO NUM TRIACILGLICEROL ESTRUTURADO, NUM MODELO EM CÉLULAS DE RETINA em TG, 20

Neste ensaio in vitro utilizam-se células ARPE-19 (células epiteliais pigmentares da retina, ATCC CRL-2302) como modelo celular, porquanto pertencem a um tipo de células adequado devido à sua boa reacção a diversos indutores oxidantes in vitro, para além de serem uma cultura primária com condições de cultura e requisitos nutricionais normais. Além disto, trata-se de um bom modelo ocular uma vez que se mantêm as propriedades funcionais e biológicas das células epiteliais pigmentares da retina. A título de ingrediente activo utilizaram-se triacilgliceróis estruturados derivados de óleo de atum (DHA 20 % 77 % molar em ADH) ou óleo enriquecido com 70 % de ADH (ADH 70 % em TG, 70 % molar em ADH) , em que através de métodos enzimáticos os ácidos gordos nas posições sn-1 e sn-3 foram substituídos por ácido octanóico. Nestes novos compostos, o conteúdo molar em ADH é de 7% no ADH 20 % em TG e de 22 % no ADH 70 % em TG.

Resultados (veja-se a Figura 22)

Quando se induz uma tensão oxidativa moderada com AAPH 40 mM AAPH, e utilizando DHR123 como detector de ERO, o ADH incorporado num triacilglicerol normal (ADH 20 % em TG e ADH 70 % em TG) denota um efeito inibidor na geração da espécie de reactiva de oxigénio, tanto a concentrações 0,5 μΜ como 5 μΜ, denotando um efeito inferior a 50 μΜ (Figura 22). Este efeito depende do conteúdo em ADH, que é ADH 70 % em TG > ADH 20 % em TG. A concentrações idênticas, os óleos estruturados, com uma concentração real em ADH 2-3 vezes menor, denotam a mesma actividade (para as concentrações 0,5 μΜ) ou maior (para as concentrações 5 μΜ e 50 μΜ) no caso do ADH 20 % em TG. No caso do ADH 70 % em TG, a eficácia do triacilglicerol estruturado é ligeiramente menor nas concentrações óptimas (0,5 μΜ e 5 μΜ) , mas o comportamento a concentrações elevadas é invertido (50 μΜ) denotando em geral um comportamento mais estável e menos dependente da dose. 78

AVALIAÇÃO DA ACTIVIDADE DE DBA COMO AGENTR PROTECTOR DO COMPRIMENTO DE UM TELÓMERO ASSOCIADO À IDADE NUM MODELO DE PELE HUMANA

Neste ensaio in vitro utilizaram-se células de prepúcio (fibroblastos epidérmicos não diferenciados, ATCC CRL-2076) como modelo celular, por pertenceram a um tipo de células adequado devido à sua boa reacção in vitro a diversos indutores oxidantes, para além de serem uma cultura primária com condições de cultura e requisitos nutricionais normais, constituindo portanto um bom modelo in vitro extrapolável para a reacção in vivo, para uma aplicação cosmética potencial do ADH.

Metodologia

Culturas de células

Os modelos celulares utilizados forma células de prepúcio (fibroblastos epidérmicos não diferenciados, CRL-2076) obtidos da American Type Culture Collection. Mantiveram-se as culturas de células em condições de crescimento adequadas em termos de temperatura (37°C), concentração em C02 (5 %) e humidade (95 %)m numa incubadora especialmente concebida para este fim. Mantiveram-se os fibroblastos CRL-2076 em crescimento em frascos de cultura em meio Dulbecco modificado por Iscove (Biological Industries) com suplemento de 10 % de soro fetal de bovino, antibióticos penicilina (a 100 U/mL), 79 estreptomicina (a 100 pg/mL) e glutamina (Biological Industries).

Integração do ADH nas células

Adicionou-se ADH em TG a 70 % enzimaticamente sintetizado a uma concentração de 0,5 μΜ, obtida dissolvendo o óleo em etanol para se obter uma solução de partida (a 1:200) e preparando as soluções de trabalho em meio de cultura preparado com soro. As células foram mantidas em cultura em meio com suplemento de ADH TG durante 3 dias a 37°C.

Indução da tensão oxidativa

Utilizou-se dicloridrato de 2,2'-azobis-(2- amidinopropano) (AAPH) para proporcionar uma tensão oxidativa às células, a uma concentração de 40 mM, o qual é largamente utilizado com iniciador hidrofilico de radicais livres pela indução de peroxidação lipidica e de proteínas. 0 AAPH oxida o ADN, as proteínas e os lípidos por acção dos radicais peroxilo formados. Além disto actua sobre o sistema endógeno de defesa, uma vez que desactiva o enzima chave, a SOD, perdendo-se deste modo a capacidade protectora da CAT e da GPx.

Medição do comprimento dos telómeros 80

Podem avaliar-se as regiões teloméricas constituídas por ADN altamente repetitivo por técnicas de hibridação in situ. O método de hibridação in situ com fluorescência (FISH), utilizando sondas complementares das sequências teloméricas permite detectar a presença ou a ausência dos telómeros, e também quantificar os telómeros por célula ou por grupo de cromossomas. O método denominado FISH em fluxo recorre a citometria de fluxo em combinação com a técnica FISH utilizando um PNA (ácido péptidonucleico) pan-telomérico como sonda, e permite quantificar, utilizando as intensidades de fluorescência, os comprimentos teloméricos médios nos terminais dos cromossomas em células individuais. Para os nossos objectivos, utilizou-se a intensidade da fluorescência de PAN marcado com cromossomas na metafase. Os resultados são expressos em unidades de fluorescência de telómeros (TFU), correspondendo cada TFU a 1 kb de telómeros repetitivos.

Resultados

Analisaram-se por FISH em fluxo as alterações dos telómeros nos fibroblastos humanos em cultura sob condições de tensão oxidativa, com ou sem ADH incorporado (Figura 23). Utilizou-se uma regressão linear para analisar a relação entre o comprimento dos telómeros e o número de passagem das populações celulares. Para todas as culturas analisadas, podem entender-se directamente os coeficientes angulares das regressões com o índice de encurtamento telomérico. Em fibroblastos humanos, o tratamento com AAPH, 81 que induz um excesso de radicais livres intracelulares, acelera marcadamente o índice de encurtamento telomérico. Por outro lado, a incorporação de ADH a uma concentração de 0,5 μΜ, que se provou aumentar a defesa antioxidante das células, diminui o referido índice em 50 % em relação ao seu valor sem o ADH. Além disto, a incorporação de ADH é capaz de diminuir o índice de encurtamento de telómeros, mesmo em relação ao dos fibroblastos normais de controlo.

Lisboa, 20 de Junho de 2014.

Claims (14)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de ácido docosahexaenóico, que esteja especificamente incorporado por uma ligação éster em pelo menos uma posição de um glicerol, para fabricar uma composição farmacêutica, caracterizada por o referido ácido docosahexaenóico - estar presente numa percentagem ponderai de entre 40 e 100 %, em relação aos ácidos gordos totais; ou - estar incorporado na posição sn-2, para tratar uma patologia associada a lesões oxidativas celulares, em que a patologia referida associada a lesões oxidativas celulares seja uma patologia neurodegenerativa, uma patologia ocular, uma patologia isquémica, ou a aterosclerose.
2. 2. Utilização de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o referido ácido docosahexaenóico estar presente numa percentagem ponderai de entre 66 e 100 %, dos ácidos gordos totais.
3. 3. Utilização de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o referido ácido docosahexaenóico estar 2 incorporado num monoacilglicerol, num diacilglicerol ou num triacilglicerol.
4. 4. Utilização de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o referido ácido docosahexaenóico estar incorporado num triacilglicerol.
5. 5. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o glicerol referido também contenha pelo menos um ácido gordo.
6. 6. Utilização de acordo com a reivindicação 5, em que o glicerol referido também contenha pelo menos um ácido seleccionado de entre um ácido gordo com cadeia curta e/ou com cadeia média.
7. 7. Utilização de acordo com a reivindicação 6, em que o referido ácido gordo com cadeia curta seja um ácido gordo em C1-C8.
8. 8. Utilização de acordo com a reivindicação 6, em que o referido ácido gordo com cadeia média seja um ácido gordo em C9-C14.
9. 9. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada por a referida composição farmacêutica também incluir outro ingrediente activo. 3
10. 10. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a referida patologia neurodegenerativa seja uma de entre o conjunto constituído por esclerose múltipla, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, esclerose lateral amiotrófica, e distrofia muscular.
11. 11. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a referida patologia ocular seja uma de entre o conjunto constituído por retinose pigmentar, degeneração macular, e cataratas.
12. 12. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a referida patologia isquémica seja um enfarte do miocárdio ou um enfarte cerebral.
13. 13. Utilização de ácido docosahexaenóico, que esteja especificamente incorporado em pelo menos uma das posições de um glicerol por uma ligação éster, para a preparação de um nutracêutico, caracterizada por o referido ácido docosahexaenóico - estar presente numa percentagem ponderai de entre 40 e 100 %, em relação aos ácidos gordos totais; ou - estar incorporado na posição sn-2, 4 para tratar uma patologia associada a lesões oxidativas celulares, em que a patologia referida associada a lesões oxidativas celulares seja uma patologia neurodegenerativa, uma patologia ocular, uma patologia isquémica, ou a aterosclerose.
14. 14. Utilização de acordo com a reivindicação 13, caracterizada por o nutracêutico referido ser um produto lácteo. Lisboa, 20 de Junho de 2014.