NO20171318A1 - Anvendelse av DHA - Google Patents

Abstract

Den foreliggende oppfinnelse angår anvendelse av en syre anriket på dokosaheksaensyre (DHA) eller eikosapentaensyre (EPA) eller DHA-avledet EPA for fremstilling av et medikament for behandling av prosesser som involverer assosiert oksidativ skade. Særlig er dette for behandling av prosesser assosiert med nevrodegenerative, okulare, iskemiske og inflammatoriske patologier, aterosklerose, med oksidativ skade på DNA og med fysisk trening.

Description

Oppfinnelsens område

Den foreliggende oppfinnelse angår kosmetisk anvendelse av en syre anriket med dokosaheksaensyre (DHA) eller eikosapentaensyre (EPA) eller DHA-avledet EPA til behandling av prosesser som involverer assosiert oksidativ skade. Oppfinnelsen er definert i patentkravene.

Bakgrunn for oppfinnelsen

Omga-3 fettsyrene er nødvendig for å opprettholde cellulær funksjonell integritet, og er nødvendig generelt for den menneskelige helse. Dokosaheksaensyre (22:6 n -3, DHA), en viktig omega-3-komponent i fiskeolje og i marine alger, er konsentrert i hjernen, i fotoreseptorene og i synapsene i retina. DHA-anrikede dietter blir initielt metabolisert av leveren og deretter fordelt via lipoproteiner i blodet for å møte behovet hos de forskjellige organer. Administrering av DHA fører til en økning av dens konsentrasjon på vevsnivå, og induserer i tillegg en økning i konsentrasjonen av omega-3 eikosapentaensyre (CPA) som er koblet metabolsk, mens administrering av EPA bare øker dens konsentrasjon og reduserer konsentrasjonen til DHA på cellenivå.

Generelt blir DHA inkorporert i fosfolipidene i cellemembranen som har virkninger på dens sammensetning og funksjonalitet, på produksjon av reaktive oksygenelementer (ROS), på membranlipidoksidering, på transkripsjonsregulering, på biosyntese av eikosanoider og på intracellulær signaltransduksjon. Videre er DHA involvert i sentralnervesystemet i utvikling av læringskapasitet relatert til hukommelse, i de eksiterbare funksjonene til membranen, i biogenesen til fotoreseptorceller og ved å transdusere signaler avhengig av kinaseprotein. En potensiell dietterapi ville bli basert på å korrigere de optimale nivåer av omega-3 fettsyrer for å forhindre visse patologier fra å oppstå eller utvikle seg, så som inflammatoriske patologier, tumorprosesser, kardiovaskulære sykdommer, depresjon og nevrologiske lidelser.

I sentralnervesystemet viser både hjernen og retina en uvanlig kapasitet for å tilbakeholde DHA, til og med i situasjoner med meget langvarig diettsvikt av omega-3 fettsyrer. Flere undersøkelser har beskrevet den beskyttende virkningen til DHA på nevroner, i hvilke den er tilstede i meget høye nivåer. For eksempel er den involvert i beskyttelsen av nevronal cellene fra død ved apoptose. Nylig er det blitt vist at DHA, funnet i reduserte mengder i hippocampus hos rotter i fremskreden alder, er i stand til å beskytte primære kulturer av nevnte celler mot cytotoksisitet indusert av glutamat.

I fotoreseptorene i retina har DHA også blitt vist å modulere nivåene til pro- og anti-apoptotiske proteiner i BCL-2-familien. De ytre segmenter av den retinale fotoreseptor inneholder rodopsin, så vel som et høyere DHA-innhold enn andre typer av celler. DHA konsentreres i fosfolipidene i fotoreseptorens skivesegments ytre membraner. Retinale dysfunksjoner er blitt observert under betingelser med reduksjon av optimal DHA-konsentrasjon. Pigmentepitelcellene i retina (RPE) spiller en meget aktiv rolle ved DHA-opptak, konservering og transport. Det høye DHA-innhold i fotoreseptorene og i RPE-cellene er hovedsakelig koblet til domener i membranen med fysikalske egenskaper som bidrar til modulering av reseptorer, ionekanaler, bærere, etc., mens det også synes å regulere konsentrasjonen av fosfatidylserin.

Det er opptil nå ukjent om disse virkningene i sin helhet er mediert av DHA i seg selv eller ved noen andre metabolske derivater. Visse derivater av DHA er blitt identifisert i retina. Skjønt enzymene involvert i syntese av nevnte derivater ikke er blitt identifisert presist, foreslår noen nylige resultater deltagelse av en A2fosfolipase (PLA2) etterfulgt av en lipoksygenase (LOX). PLA2frigjør DHA fra membranfosfolipidene og LOX konverterer den til dens metabolske aktive derivater.

De reaktive oksygenelementer (ROS) blir produsert under normale cellulære funksjoner. ROS inkluderer superoksidanion, hydrogenperoksid og oksydrylradikalet. Deres høye kjemiske reaktivitet fører til oksidering av proteiner, av DNA eller av lipider. Superoksiddismutase (SOD), katalase (CAT) og glutationperoksidase (GPx) er de primære antioksidantenzymer som beskytter mot molekylær og cellulær skade forårsaket av nærvær av ROS. Det oksidative stress aktiverer mange metabolske kanaler; noen er cytobeskyttende, mens andre fører til celledød. Nylige undersøkelser angir at en ubalanse mellom ROS-produksjon og nedbrytning er en signifikant risikofaktor i patogenesen av mange sykdommer, i noen tilfeller relatert til en nedbrytning av antioksidantsystemet.

DHA er tilstede som et mål for ROS som produserer skade på cellen i fotoreseptoren og RPE. Den retinale degenerering indusert av lys promoterer tap av DHA i fotoreseptorene. For eksempel når RPE-celler blir skadet eller dør nedbrytes fotoreseptorfunksjonen fordi RPE-celler er essensielle for dens overlevelse. Således fører død av RPE-celler under virkning av oksidativ stress til en nedbrytning av synet, særlig når cellene i makula er påvirket, siden den er ansvarlig for synsskarphet. Patofysiologien til mange retinale nedbrytningstyper (f.eks. makulær degenerering relatert til alder og til Stargardt sykdom) involverer oksidativt stress som fører til RPE-celleapoptose. RPE-celleapoptose synes virkelig å være den dominerende faktor i makuladegenereringen observert med økende alder. Slike undersøkelser foreslår at nevnte celler har utviklet meget effektive antioksidantmekanismer for å beskytte seg selv fra deres høye DHA-innhold og viser bemerkelsesverdig tilpasningskapasitet.

Videre er sammenhengen mellom frie radikaler og aldring meget godt akseptert, basert på den kunnskap at frie radikaler produsert under aerob respirasjon forårsaker oksidativ skade som akkumuleres og fører til et gradvis tap av de homeostatiske mekanismer, interfererer med genekspresjonsmønster og tap av cellens funksjonelle kapasitet, noe som fører til aldring og død. En forbindelse eksisterer mellom dannelsen av oksidanter, antioksidantbeskyttelse og reparasjon av oksidativ skade. Mange undersøkelser er blitt utført for å bestemme om antioksidantforsvaret reduseres med alder. Disse har inkludert analyse av hovedkomponentene derav; aktivitet eller ekspresjon av SOD-, CAT-, GPx-enzymer, glutationreduktase, glutation-S-transferase og konsentrasjonen av forbindelser med lav molekylvekt med antioksidantegenskaper. For eksempel øker en overekspresjon av SOD og CAT i Drosophila melanogaster forventet livslengde med 30 % og reduserer skade ved proteinoksidering. I denne sammenheng danner in vitro og in vivo eksponering av hudvev til UV-stråler frie radikaler og andre reaktive oksygenelementer, noe som fører til cellulært oksidativt stress, dokumentert som å bidra betydelig til aldring. Overskuddseksponering av huden til ultrafiolett stråling kan gi opphav til akutt eller kronisk skade. Under akutte betingelser kan erytem og forbrenninger produseres, mens kronisk overeksponering øker risikoen for hudkreft og aldring. Videre er det kjent at hudcellene kan respondere på akutt eller kronisk oksidativ stress ved å øke ekspresjon av et utvalg av proteiner, så som enzymene involvert i opprettholdelse av celleintegritet og motstand mot oksidativ skade.

I fagområdet er det velkjent at telomerer er ikke-kodende DNA-regioner lokalisert på endene av eukaryote kromosomer. Disse utgjøres av meget konserverte DNA-sekvenser, repetert i tandem (TTAGG)nog assosierte proteiner, og har en spesiell struktur som hindrer ligering av endene til andre kromosomer, og forhindrer den telomeriske fusjon. De har en essensiell rolle i preservering av kromosomintegriteten, beskytter det kodende DNA fra den enzymatiske virkning og dens degradasjon, bidrar til opprettholdelse av kromosomstabiliteten.

I motsetning til de kodende sekvenser som har en halvkonservativ replikasjon gjennomgår telomerene et progressivt tap av sine repetitive sekvenser under påfølgende celledeling. Nå for tiden er det ment at en minimal telomerisk lengde er nødvendig for å opprettholde telomerfunksjonen og når disse når en kritisk størrelse har de vanskeligheter ved deling i mitose, genererende telomerisk assosiasjon (TAS) og kromosomisk instabilitet. Nevnte kromosominstabilitet ville være assosiert med en økning i muligheten til å produsere feil som er i stand til å danne signifikante genetiske forandringer.

På grunn av mangfoldigheten av dobbeltbindinger er omega-3 fettsyrer vurdert å være molekylære mål for dannelse og utbredelse av frie radikaler under de oksidative stressprosessene relatert til dannelse av lipidiske peroksider.

Motstridende resultater er imidlertid blitt oppnådd i forskjellige undersøkelser av sårbarheten for oksidativt stress på grunn av diettsuplementer av omega-3 fettsyrer. Noen undersøkelser hos mennesker har vist øket oksidasjon av LDL, mens andre ikke har funnet en slik effekt. I undersøkelser med dyr har behandling med omega-3 fettsyrer blitt funnet å føre til øket eller redusert sårbarhet for oksidasjon av LDL. På den annen side har en overekspresjon av genene involvert i antioksidantforsvarssystemet blitt funnet i lever til mus fôret på en fiskeoljeanriket diett i tre måneder.

Videre har forskjellige in vitro undersøkelser med en cellelinje av glyal opprinnelse vist at membraner som er rike på omega-3 fettsyrer er mer utsatt for oksidativ skade. Langtids supplering av disse cellene med høye konsentrasjoner av DHA resulterte i økede nivåer av lipidiske peroksider i kulturmediet, og en høyere prosentandel av celledød på grunn av apoptose indusert ved eksponering til hydrogenperoksid. Det er imidlertid også blitt vist at intraamniotisk administrering av etyldokosaheksaenoat reduserer lipidisk peroksidering i føtale hjerner hos rotter. Det er blitt foreslått at denne responsen skyldes en fri radikal chelatdannelse effekt via aktivering av antioksidantenzymer. En økning i antioksidantkapasiteten i hjernen er viktig for det primære endogene forsvar mot oksidativt stress, fordi hjernen er relativt rik på flerumettede fettsyrer og relativt fattig på antioksidantenzymer.

Disse motstridende resultatene antyder at hypotesen basert på det grunnlag at oksidasjon av en fettsyre øker med antall dobbeltbindinger ikke har noe in vivo anvendbarhet, siden andre potensielle mekanismer kan virke for å redusere oksidativ skade, så som en tredimensjonal struktur av omega-3 fettsyrer i lipidene og lipoproteinene i membranen som gjør dobbeltbindingene mindre utsatt for et angrep av ROS, en inhibisjon av pro-oksidantenzymet så som PLA2eller en større ekspresjon av antioksidantenzymer.

På den annen side kommer ideen med å assosiere fysisk trening med produksjon av frie radikaler fra tidlig 80-årene som skyldes observasjon av skaden i membranlipider under ischemireperfusjonshendelser i hypoksisk vev (se Lovlin et al., Eur. J. Appl. Physiol. Occup. Physiol. 1987, 56 (3) 313-6). På samme tid ble en økning i GSSH/GSH-forholdet observert i rottemuskelceller (se Lew H. et al., FEBS Lett, 1985, 185(2): 262-6, Sen CK et al., J. Appl. Physiol. 1994, 77 (5): 2177-87) så vel som i humant blod (se MacPhail Db et al., Free Radic Res Commun 1993, 18 (3): 177-81, Gohil K. et al. J. Appl. Physiol. 1988 Jan; 64 (1): 115-9). Frie radikaler påvirker også DNA og akutt fysisk trening øker skaden i DNA, som vis t ved økningen av 8-OksodG. Utmattende fysisk trening (maratonløp) forårsaker skade i DNA som er evident i noen dager etter utføringen og forårsaker også skade i immunokompetente celler (som kan assosieres med immunreduksjon vist hos sportsmenn etter en slik fysisk anvendelse).

Andre forfattere observerte imidlertid ingen virkninger (med unntagelse av liten skade) etter svømming i 90 min., løping i 60 min. eller å utøve en utmattende anstrengelse ved å ro. På samme tid kan forskning på trenede og ikke-trenede sportsmenn ikke noen forskjell i urinekskresjon av 8-okso-dG, selv i de hvor de fant en slik skade ble dette vurdert å være sekundært til påfølgende reaksjoner på anstrengelsen og ikke til virkningen av treningen på DNA på en akutt måte.

Tilfellet at intens fysisk trening produserer oksidativt stress er meget velkjent på området, mens dets opprinnelse ennå ikke godt bestemt.

Undersøkelser utført med n-3 fettsyrer relatert til sportsprestasjon var fokusert på den antiinflammatoriske virkning og de første assayene forsøkte virkelig å finne den mulig virkning av disse næringsmidlene på forbedret alveolær-kapillær absorpsjon ved å redusere bronkokonstriksjon indusert av den intensive fysiske treningen. I denne forbindelse viste Mickleborough at etter administrering av 3,2 g EPA og 2,2 g DHA ble proinflammatoriske cytokiner svekket ved å redusere nærvær av TNF- α og IL-1 β hos eliteidrettsfolk, sammen med en reduksjon i bronkokonstriksjon.

Walser relaterte de vaskulære virkninger av n-3 fettsyrer til positive virkninger hos folk som viste intoleranse til fysisk trening. I denne forbindelse undersøkte van Houten et al. at et høyt inntak av n-3 fettsyrer var assosiert med bedre restitusjon hos pasienter som utførte en hjerterehabilitering etter et koronarsyndrom.

Fravær av positive resultater i fysisk yteevne i de analyserte undersøkelsene skyldes evalueringen av pasienter, ikke friske mennesker, og at det er blitt undersøkt bare vaskulære og inflammatoriske virkninger.

På samme tid er forskning blitt utført basert på følgende teoretiske konsept: Ved økning av frie fettsyrer i plasma over 1 mmol/l (noe som skjer når glykogen blir brukt opp), evnen til tryptofan transport gjør at dette må økes med påfølgende serotoninøkning, en nevrotransmitter relatert til den såkalte ”sentrale utmattethet” i sportsgrener av lang varighet. I denne forbindelse er det kjent at n-3 fettsyrer reduserer mengden av frie fettsyrer i plasma sannsynligvis ved å oppregulere fettsyreoksidasjonen ved å aktivere transkripsjonskjernefaktor PPAR α. Disse assayer var imidlertid ikke vellykket siden Huffman (2004) ved å bruke et doseregime på 4 g av n-3 fettsyrer (500 g kapsler som inneholder 300 mg EPA og 200 mg DHA) utført i en undersøkelse hos løpere av begge kjønn uten å finne noen reduksjon i fri TRP ei heller en mindre følelse av anstrengelse, i tillegg til noen statistisk signifikant økning i yteevnen, skjønt det var en statistisk tendens til å forbedre yteevnen hos individer til hvem n-3 fettsyrer ble administrert. Dette åpner for den muligheten for forfatterne at årsaken til reduksjon av den statistiske kraften i undersøkelsen var det lave antall av individer som ble undersøkt (5 menn og 5 kvinner).

En annen påfølgende forskning hvori effektiviteten til n-3 fettsyrer relatert til yteevne ble evaluert fant ikke noen signifikante forskjeller ved å bruke maisolje som placebo. Raastad administrerte 1,60 g EPA og 1,04 g DHA pr. dag over flere uker men fant ingen forbedring hos fotballspillere (se Raastad et al., Scand J. Med Sci Sports 1997; 7(1): 25-31).

På den annen side er det kjent at fri fettsyrer interfererer med anvendelse av glukose i muskelen, siden dets analoger på intracellulært nivå, acyl-CoA, i mitokondria inhiberer pyruvat dehydrogenase (inhibering ved produkt), og videre stimulerer glykogenolyse og glykoneogenese, og forårsaker en glatt hyperglykemi under fasting. Den kontinuerlige administrering av flerumettede fettsyrer under faste hjelper virkelig til å opprettholde glykemi, men kan kanskje aktivere glukose-6-fosfatase på levernivå. Det er også kjent at en sammensetning av fettsyrer i muskelen forandrer insulinsensitivitet og viser at et høyt innhold av flerumettede fettsyrer i plasmamembran forbedrer insulinsensitiviteten og et høyt innhold av mettede fettsyrer produserer den motsatte virkning.

Trening øker glukoseopptaket, kapillærperfusjon, glykogensyntesehastighet og insulinsensitivitet. Under muskelkontraksjon blir det produsert forandringer i temperatur, intracellulær pH, ATP/ADP-forhold, så vel som Ca<++>intracellulær konsentrasjon og andre metabolitter som kunne virke som budbringere i regulering av den cellulære funksjon under muskelarbeid. I denne forbindelse regulerer Ca<++>en stor mengde av intracellulære proteiner, inkludert calmodulinkinase, proteinkinase C (PKC) og calcineurin som er viktige mellomprodukter i signalene for intracellulære transduksjon. Under aerobt muskelarbeid blir acetyl -CoA-karboksylase deaktivert av AMP-kinase (AMPK) som fører til et fall i malonyl-CoA-nivåer, deinhibering av carnitinpalmitoltransferase med en resulterende økning i fettsyretransport i mitokondriene (for således å fremme fettsyreoksidasjon).

AMPK-aktiveringsvirkninger inkluderer sannsynligvis stimulering av GLUT4 og heksokinaseekspresjon, så vel som mitokondrieenzymer. Overraskende er imidlert id ikke AMPK-aktivering den eneste måten (uavhengig av insulin) hvori muskelarbeid øker responsen til glukose i skjelettmuskel. Se Mora og Pessin, J. Biol. Chem. 2000; 275 (21): 16323-16328, virkelig viste at en økning i glukoseresponsen i muskelen, er det flere transkripsjonsfaktorer så som MEF2A og MEF2D som aktiverer GLUT4 og de faktorene er aktivert under muskelarbeid.

En økning i intramuskulære lipider er vanlig under fedmetilstander og fysisk trening, men resultatet er at for fete mennesker blir det assosiert med insulinresistens, mens hos sportsfolk gjør den store aktiviteten til carnitinpalmitoltransferase at fettsyrer gjennomgår betaoksidasjon. Det er sterke indisier på at en diett som er rik på n-3 fettsyrer, selv med en økning av glykemi og insulinaemi (signaler på insulinresistens), virker på insulinreseptornivå og opprettholder nivået av GLUT-4-proteintranslokasjon, som er spesifikt blitt vist med DHA (se Jaescchke H. Proc. Soc Exp Biol. Med 1995; 209: 104-11).

Beskrivelse av oppfinnelsen

Den foreliggende oppfinnelse angår den uventede oppdagelse at administrering av dokosaheksaensyre (heri også referert til som DHA) eller eikosapentaensyre (EPA) eller DHA-avledet EPA, enten i fri form eller inkorporert i et triglyserid, blant annet virker som en cellulær antioksidant.

På denne måten og ved å ta med i vurderingen det metabolske slektskap mellom DHA og EPA (retrokonvertering av DHA til EPA), må alle virkningene som tidligere er beskrevet observert for administrering av DHA være anvendbare til blandede systemer DHA/EPA eller til og med til monokomponentsystemer av EPA, selv om EPA ikke er navngitt spesifikt.

En hensikt med foreliggende oppfinnelse er derfor anvendelse av dokosaheksaensyre for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning til behandling av cellulær oksidativ skade.

En annen hensikt med foreliggende oppfinnelse er anvendelse av dokosaheksaensyre (DHA) i en spesifikk posisjon i glyserolryggraden, hvor de to gjenværende posisjoner i glyseridet også er spesifisert i sin sammensetning for behandling av cellulær oksidativ skade.

En ytterligere hensikt med foreliggende oppfinnelse er anvendelse av dokosaheksaensyre (DHA) til fremstilling av en sammensetning for behandling av den cellulære oksidative skade på DNA-nivå. Særlig har anvendelse av dokosaheksaensyre applikasjonen som et beskyttende middel i den naturlige prosess for telomerforkorting og som et inhibitorisk middel av prematur aldring i behandling av cellulær oksidativ skade.

Det er også en hensikt med foreliggende oppfinnelse å anvende dokosaheksaensyre til fremstilling av en sammensetning for behandling av cellulær aldring og arvelige patologier assosiert med lidelser i den mitokondrielle respiratoriske kjede, så vel som en sammensetning for behandling av Downs syndrom.

En ytterligere hensikt med foreliggende oppfinnelse er anvendelse av dokosaheksaensyre (DHA) til fremstilling av en sammensetning for behandling av cellulær oksidativ skade assosiert med fysisk trening. Særlig har anvendelse av dokosaheksaensyre applikasjonen som et forsterkingsmiddel i sportsprestasjon og som et regulerende middel for blodglukosenivået under fysiske anstrengelser.

Det er også en hensikt med foreliggende oppfinnelse å anvende dokosaheksaensyre til fremstilling av en sammensetning for å forsterke sportsprestasjon, så vel som en sammensetning for å opprettholde blodglukosenivåer etter fysisk trening ved hjelp av hovedsakelig administrering av en matvare, et meieriprodukt eller enhver egnet administreringsform som typisk blir anvendt av folk når de utøver fysisk trening.

I den foreliggende oppfinnelse betyr uttrykket ”cellulær oksidativ skade” enhver prosess som involverer en ubalanse mellom generering og degradasjon av cellulære oksidantelementer av endogen eller eksogen opprinnelse.

Overraskende har oppfinnerne av foreliggende oppfinnelse funnet at DHA er i stand til å inhibere produksjon av reaktive oksygenelementer (ROS), enten de er relatert til en avhengig induksjon av peroksider eller superoksider. Mer spesifikt reduserer den produksjonen av superoksidanion og derved av alle de avledede elementer produsert i den oksidative kaskaden, så som f.eks. en meget signifikant reduksjon av lipidisk peroksidering. Videre ble det funnet en økning i antioksidantenzymaktivitet som antyder en adaptasjon av cellen ved å indusere ekspresjon av antioksidantmidler, egentlig enzymer, og ved å undertrykke ekspresjon av prooksidantmidler så som A2-fosfolipase.

I én utforming av foreliggende oppfinnelse blir nevnte dokosaheksaensyre inkorporert i et monoglyserid, diglyserid, triglyserid, fosfolipid, etylester eller fri fettsyre. Fortrinnsvis blir nevnte dokosaheksaensyre inkorporert i et triglyserid.

I den foreliggende oppfinnelse skal ”dokosaheksaensyre inkorporert i et glyserid” bety et monoglyserid, diglyserid, triglyserid, fosfolipid, med minst én av de tre posisjonene esterifisert med en dokosaheksaensyre og, eventuelt minst én av de gjenværende esterifiserte posisjoner ytterligere med en syre valgt fra en kort -, middels- eller langkjedet fettsyre og en fosforsyre. Fortrinnsvis er nevnte glyserol et triglyserid.

Valget av triglyserid som kjemisk struktur for DHA er basert på data hentet fra en undersøkelse som sammenlignet biotilgjengeligheten til fire omega-3-syrekonsentrater i form av etylestere, fosfolipider, fri fettsyrer og triglyserider etter oral administrering, som viste at de reesterifiserte triglyseridene presenterte en høyere biotilgjengelighet enn de andre preparatene.

I en foretrukket utforming av foreliggende oppfinnelse er nevnte dokosaheksaensyre funnet i en prosentandel regnet på vekt mellom 20 og 100 % i relasjon til de totale fettsyrer, fortrinnsvis mellom 40 og 100 % i relasjon til de totale fettsyrer, og mer fortrinnsvis er nevnte dokosaheksaensyre tilstede i en prosentandel regnet på vekt mellom 66 og 100 % i relasjon til total fettsyre.

I en annen foretrukket utforming er nevnte dokosaheksaensyre inkorporert i minst én spesifikk posisjon i et glyserol via en esterbinding, et strukturert lipid, til fremstilling av en farmasøytisk sammensetning for behandling av cellulær oksidativ skade.

Et slikt glyserol kan ytterligere omfatte minst én fettsyre og/eller én fosforsyre slik at nevnte dokosaheksaensyre er inkorporert i en posisjon valgt fra sn-1, sn-2 og sn-3, kan også ytterligere omfatte eventuelt minst én syre valgt fra en kort- og/eller middels-kjede fettsyre og en fosforsyre, og når den er inkorporert i sn-2-posisjonen kan den ytterligere omfatte eventuelt minst én syre valgt fra fettsyre og en fosforsyre.

I denne forbindelse når det refereres til betegnelsen eventuelt skal det nevnte dokosaheksaensyre inkorporert i en posisjon valgt fra sn-1, sn-2 og sn-3 kan eller kan ikke ytterligere omfatte minst én syre valgt fra en kort- og/eller middels-kjede fettsyre og en fosforsyre, eller på annen måte at nevnte dokosaheksaensyre inkorporert i sn-2-posisjonen kan eller kan ikke ytterligere omfatte minst én syre valgt fra en langkjedet fettsyre og en fosforsyre.

Overraskende har oppfinnerne av foreliggende oppfinnelse funnet at anvendelse av strukturerte glyseroler hvori posisjonen til dokosaheksaensyre er blitt selektert og sammensetningen av resten av forbindelsen bundet til glyserol fører til en uventet økning, minst to eller til og med tre ganger, av den terapeutiske effektiviteten til anvendelse av dokosaheksaensyre til fremstilling av en farmasøytisk sammensetning for behandling av cellulær oksidativ skade.

Den vanlige definisjonen angår fett som inneholder fettsyre lokalisert i spesifikke posisjoner i glyserolryggraden. Ved likhet med in vivo fettsyrebiofordeling, er de langkjedede flerumettede fettsyrer (PUFA’er) lokalisert fortrinnsvis i sn -2-posisjonen i glyserol og ved å ta inn i vurderingen den intestinale absorpsjonsprosess, blir triglyseridene hydrolysert ved lipaser til frie fettsyrer, di -og monoglyserider, fra hvilke de frie fettsyrer og sn-2-monoglyserider blir absorbert direkte av intestinale epitelceller, kalt enterocytter.

Ved å bruke dokosaheksaensyre inkorporert i en spesifikk posisjon i glyserolryggraden via en esterbinding tilveiebringes en øket bioaktivitet, en øket antioksidantbeskyttelse av den samme molare prosentandelen med hensyn på hele mengden av fettsyrer tilstede og en redusert avhengighet av administreringsdoseringen med hensyn på antioksidantvirkningen av dokosaheksaensyre i glyseridet.

Fordelaktig har oppfinnerne av foreliggende oppfinnelse funnet at anvendelse av dokosaheksaensyre inkorporert i en posisjon i glyserolet valgt fra sn-1, sn-2 og sn-3, og at eventuelt nevnte glyserol ytterligere omfatter minst én syre valgt fra en kort- og/eller middels-kjede fettsyre og en fosforsyre, tilveiebringe en øket bioaktivitet, en øket antioksidantbeskyttelse med den samme molare prosentandel med hensyn på den totale mengde av fettsyrer tilstede og en redusert avhengighet av administrasjonsdosering med hensyn på antioksidantvirkningen av dokosaheksaensyre i glyserol.

I tillegg har oppfinnerne av foreliggende oppfinnelse fordelaktig funnet at anvendelse av dokosaheksaensyre inkorporert i en sn-2-posisjon i et glyserol og eventuelt at nevnte glyserol ytterligere omfatter minst én syre valgt fra en langkjedet fettsyre og en fosforsyre, tilveiebringer i tillegg en øket bioaktivitet, en øket antioksidantbeskyttelse på samme molare prosentandel med hensyn på hele mengden av fettsyrer tilstede og en redusert avhengighet av administreringsdoseringen med hensyn på antioksidantvirkningen av dokosaheksaensyre i glyserol.

Fortrinnsvis vil syrer som også er tilstede i et glyserol med dokosaheksaensyren være kortkjedede fettsyrer (C1-C8) eller middelskjedede fettsyrer (C9-C14) eller en fosforsyre, siden disse ikke har noen funksjonell aktivitet, men bare energiaktivitet og vil derfor ikke konkurrere med dokosaheksaensyren.

Derfor angår enda mer fordelaktig den foreliggende oppfinnelse anvendelse av dokosaheksaensyre inkorporert i et glyserol hvori én av posisjonene sn-1 og sn-3 er fri eller okkupert av en middels kjede fettsyre (C9-C14) eller kortkjedet fettsyre (C1-C8) eller en fosforsyre og hvori sn-2-posisjonen som er okkupert av funksjonelt DHA. Således oppnås en enda høyere økning av DHA siden den blir mer effektivt absorbert i de intestinale celler.

Derfor viser syntese av strukturerte glyserider hvori dokosaheksaensyre er blitt inkorporert i enhver posisjon i glyserolet hvor den ikke konkurrer med de andre fettsyrer, og hvori DHA er blitt inkorporert i sn-2-posisjonen i glyseridet når den konkurrerer med minst én fettsyre, forbedringer relatert til dens antioksidantvirkning og derfor er det en foretrukket måte til å fremstille en sammensetning for behandling av oksidativ cellulær skade.

Oppfinnerne av foreliggende oppfinnelse har funnet at en celle anriket med en sammensetning med DHA, i henhold til oppfinnelsen, er bedre preparert til å møte en ny situasjon med oksidativt stress og således til å minimalisere de negative virkninger som kan avledes derfra. Det vil si at nærvær av DHA i biomembranene induserer en cellulær adaptiv respons til det oksidative stress. Adaptiv respons er et cellulært fenomen med hvilke eksponering til et toksisk middel (i suble tale konsentrasjoner) provoserer frem en cellulær respons som deretter vil beskytte cellen mot de ødeleggende virkninger av det samme toksiske middel i letale konsentrasjoner, eller sett på en annen måte, det er en gunstig effekt som blir utløst på et lavt nivå av eksponering til et middel som er skadelig i høyere nivåer.

Administrasjon av DHA har følgende hovedfordeler:

a) øket cellulær antioksidantaktivitet;

b) fravær av cellulær cytotoksisitet i dosene administrert;

c) fravær av signifikante forandringer i cellulær oksidantstatus ved de administrerte doser;

d) adaptiv cellulær antioksidantaktivitet.

På grunn av alt overnevnte angår den foreliggende oppfinnelse i en foretrukket utforming anvendelse av dokosaheksaensyre til å fremstille en farmasøytisk sammensetning for å behandle en patologi assosiert med cellulær oksidativ skade hvor nevnte patologi er en nevrodegenerativ patologi, fortrinnsvis valgt fra gruppen som omfatter multippel sklerose, Alzheimers sykdom, Parkinsons sykdom, amyotrofisk lateral sklerose og muskulær dystrofi blant andre.

I en annen utforming av foreliggende oppfinnelse er patologien assosiert med den oksidative skade en okular patologi, fortrinnsvis én valgt fra gruppen som omfatter retinitis pigmentosa, makulær degenerering og katarakter blant andre.

I enda en annen utforming er patologien assosiert med den oksidative skade en iskemisk patologi, særlig et myokardialt infarkt, cerebralt infarkt, etc.

I enda en annen utforming av foreliggende oppfinnelse er patologien assosiert med den oksidative skade en inflammatorisk prosess, fortrinnsvis valgt fra gruppen som omfatter artritt, vaskulitt, glomerulonefritt og erythematosus lupus blant andre.

I en annen foretrukket utforming er patologien assosiert med den oksidative skade aterosklerose.

En annen side av foreliggende oppfinnelse er anvendelse av DHA som et beskyttende middel i den naturlige prosess for telomerforkortning og som et inhibitorisk middel av prematur aldring.

Mekanismene som fremstiller telomerassosiasjoner (TAS) er fremdeles ukjent men forfatterne av foreliggende oppfinnelse foreslår at dette kunne assosieres med en svikt i aktiviteten til enzymet telomerase som syntetiserer de repetitive sekvenser av DNA som kjennetegner telomerene, for derved å stabilisere deres lengde.

Telomerasen er meget aktiv i føtale celler men har ikke mye aktivitet i voksende vevsceller. TAS er sjelden funnet i normale celler men de er blitt observert i celler infisert av virus eller tumorceller.

Det er blitt observert at det er en progressiv reduksjon i antallet av in vitro telomere repetisjoner, så vel som i funksjon av cellulær aldring, in vivo, som er assosiert med en inhibisjon av telomeraseaktivitet i alderdommen. Likeledes har forfatterne av foreliggende oppfinnelse studert telomerlengde i fibroblaster og lymfocytter fra friske personer på 100 år, og har funnet en telomerforkortning under in vitro utvikling av fibroblastene, så vel som en revers korrelasjon mellom telomerlengdene og giverens alder.

Skjønt telomerforkortning skjer naturlig med cellulær replikasjon, har en prematur aldring og nedbrytning av telomerer ved induksjon av oksidativ skade i DNA blitt observert. Telomerene er mer sensitive for oksidativ skade og deres nedbrytning blir mindre effektivt reparert enn andre deler av genomet. Dette fører til en akkumulering av telomerskade som produserer en hurtigere forkortning under DNA-replikasjonen som reduserer cellens replikative levetidsforventning. De reaktive oksygenelementene (ROS), særlig superoksidanioner, hydrogenperoksid og oksidrilradikaler kan akselerere tapene av telomerene under replikasjon av noen celletyper, selv om de også induserer prematur alderdom uavhengig av telomerforkortning.

Overraskende har forfatterne av foreliggende oppfinnelse funnet at anvendelse av dokosaheksaensyre for behandling av den cellulære oksidative skade på DNA-nivået tillater en reduksjon av forkortningshastigheten av telomerene og derfor inhiberer cellulær aldring.

De foreliggende oppfinnere har funn en revers korrelasjon mellom forkortningshastighetene av telomerene og den cellulære antioksidantkapasiteten i mer enn 20 humane fibroblaststammer. De fleste av de cellulære parametere til disse prematurt aldrende fibroblaster er de samme som ved normal aldring av disse celler (morfologi, akkumulering av lipofuscin og forandringer i genekspresjonen). Fibroblaster med et lavere antioksidantforsvar forkorter sine telomerer hurtigere og vice versa. Forkortningshastigheten til telomerer er høyere i celler med et lavere antioksidantforsvar. Videre reduserer fri radikal ionebyttere (scavengers) forkortningshastigheten til telomerene.

Disse data er i overensstemmelse med de som viser en viktig rolle av antioksidantenzymer, glutationperoksidase og superoksiddismutase, i forkortningshastigheten til telomerene i humane fibroblaster. Disse data viser at lengden av telomerene blir hovedsakelig bestemt ved relasjonen mellom det oksidative stress og den cellulære antioksidant forsvarskapasitet. Således er lengden av aldersavhengige telomerer et akkumulativt mål for historien til den oksidative skade som cellen har gjennomgått i sitt liv.

En korrelasjon mellom oksidativt stress og forkortingshastighet av telomerer er blitt vist for arvelige patologier assosiert med lidelser i den mitokondrielle respiratoriske kjede og for Downs syndrom.

Derfor tillater den eksisterende sammenheng mellom oksidativ cellulær skade i DNA og telomerforkortning og dens virkning ved cellulær aldring anvendelse av dokosaheksaensyre som et kraftig beskyttende middel i den naturlige prosessen til telomerforkortning og som et inhibitorisk middel av prematur aldring.

På den annen side har anvendelse av enzymer til fremstilling av omega-3 fettsyreanrikede oljer flere fordeler med hensyn på andre metoder basert på kjemisk syntese og påfølgende renseprosesser (kromatografiske separasjoner, molekylær destillasjon, etc.). Det siste krever ekstreme betingelser med hensyn på pH og høye temperaturer som delvis kunne ødelegge alle dobbelbindinger, alle cis av omega-3 PUFA’er ved oksidasjon, ved cis-trans-isomerisering eller migrering av dobbeltbindinger. Milde betingelser brukt ved enzymatisk syntese (temperatur lavere enn 50<o>C, pH 6-8 og mindre kjemiske reagenser) tilveiebringer et syntetisk alternativ som konserverer den opprinnelige strukturen til omega-3 PUFA’er med en økning i den strukturelle selektiviteten til acylglyserider, er vurdert å være den gunstigste kjemiske strukturen fra et ernæringssynspunkt.

Den farmasøytiske sammensetningen som omfatter DHA kan finnes i form av en olje eller en emulsjon, som kan administreres ved orale, sublingvale, intravenøse, intramuskulære, topiske, subkutane eller rektale ruter, eller til og med bare ved å bringe den aktive ingrediens i mikroemulsjonen i henhold til oppfinnelsen i flytende eller dampform i kontakt med lukteorganene lokalisert ved inngangen til den respiratoriske trakt. Således kan administrering utføres ved spraying, forstøving eller atomisering av mikroemulsjoner eller ved inhalasjon.

Eventuelt omfatter nevnte farmasøytiske sammensetning ytterligere en andre aktiv ingrediens.

På samme måte kan den farmasøytiske sammensetning som omfatter DHA anvendes i ernæringsindustrien med den hensikt å anrike matprodukter (f.eks. melkeprodukter så som yoghurt, melk, etc.) med et naturlig antioksidantmiddel så som DHA.

Derfor, i en annen utforming av foreliggende oppfinnelse blir nevnte farmasøytiske sammensetning administrert til en pasient som allerede mottar en behandling mot en patologi assosiert med oksidativ skade.

En annen hensikt med foreliggende oppfinnelse er anvendelse av DHA som et forsterkingsmiddel for sportsprestasjon og som et regulerende middel for blodglukosenivåer under fysisk anstrengelse.

På denne måte har forfatterne av foreliggende oppfinnelse overraskende funnet at anvendelse av nevnte dokosaheksaensyre under fysisk trening fører til en økning i sportsprestasjonn under opprettholdelse av blodglukosenivåer (glykemi) etter slik fysisk anstrengelse (uten administrering av karbohydrater).

I denne sammenheng i den foreliggende oppfinnelse skal ”amatør” eller ”ikkekonkurrerende sportsfolk” bety enhver person foretar fysisk trening på en sporadisk måte og ikke profesjonelt. I tillegg betyr ”konkurrerende sportsfolk” eller ”trenede sportsfolk” enhver person som utøver fysisk trening på en regelmess ig måte og/eller på et profesjonelt nivå. Likeledes blir betegnelsene ”fysisk trening” og ”fysisk anstrengelse” brukt på en ekvivalent og utbyttbar måte så vel som at betegnelsen ”sportsfolk” blir brukt for menn og kvinner.

Sportsprestasjon

For å evaluere sportsprestasjon er det flere parametere som tillater at det gis en valorisering av forbedringen av slik sportsprestasjon.

For sportsfolk som utøver aerobisksport er en økning i yteevnen vurdert når det er en økning av maksimalt oksygenopptak prosent VO2maxi UV 2 (anaerobisk terskel), siden VO2maxneppe øker under en konkurransesesong hos meget godt trente sportsfolk. Få forandringer i prosentandelen av VO2maxi terskelen er data direkte relatert til en økning i yteevnen.

De foreliggende oppfinnere har funnet at en statistisk signifikant økning av oksygenopptaket (VO2), både absolutte (p<0,019) og relative (p<0,036) verdier til vekten i den ventilatoriske terskel 2 sammenlignet med basale triangelanstrengelsesforsøk ble de utført etter fire måneders behandling med DHA. Etter økning av denne parameter er vist både for konkurransesyklister (p<0,047) og ikke-konkurransesyklister, hvor forskjellen i den siste er ikke statistisk signifikant (fig. 24).

En annen parameter relatert til en økning i sportsprestasjon er økningen i hjertefrekvens hvori UV2 i anstrengelsesforsøket blir satt, siden når hjertefrekvensen øker i den anaerobe terskelen, er sportsfolkene vurdert å være i stand til i noen grad å øke sin evne til å holde aerob metabolisme på høyere intensiteter. De foreliggende oppfinnere har observert en økning i hjertefrekvens i UV2 for p = 0,082 sammenlignet med nevnte parameter oppnådd i det basale forsøket med den oppnådd i triangelforsøket etter fire måneders inntak av DHA. Disse dataene er vist (p < 0,017) i undergruppen til syklister på et høyt konkurransenivå (fig. 25).

I denne forbindelse er det økning i tiden som er nødvendig for å nå den statistisk signifikante UV2 (fig. 26).

Til slutt er hjertefrekvensen for samme anstrengelsesnivå lavere hvis sportsfolk er aerobisk trenet. De foreliggende oppfinnere har sett at hos syklister som blir administrer med DHA reduseres hjertefrekvensen på en statistisk signifikant måte (p<0,043) når disse data sammenlignes med både forsøk på det punkt når sportsfolk bruker 2000 ml O2/min. (fig. 27).

Det kan fra disse undersøkelser konkluderes at hos sportsfolk som tar DHA i fire måneder er det blitt observert en økning i oksygenopptak, absolutt og relativt, i UV2 (henholdsvis p < 0,008 og p < 0,015), en økning i ladningen som tilsvarer UV2 (p < 0,063) og en reduksjon i hjertefrekvens når sportsfolk presenterer et oksygenopptak på 2000 ml/min. (p < 0,062). Alle disse er parametere som angir en økning i sportsprestasjon etter å ha inntatt 2,1 g DHA/24 timer (6 kapsler på 500 mg på 70 vekt%), fordelt på tre daglige doser i fire måneder. Nevnte mengder blir uttrykt ved hjelp av eksempel og skal ikke være begrensende for den foreliggende oppfinnelse.

Flere biokjemiske variabler relatert til oksidativ skade ble også analysert etter anstrengelsesforsøk.

1.- Plasma total antioksidantkapasitet (PTAC). Det er en generell og signifikant statistisk økning av PTAC (p < 0,05) mens det utføres rektangulære forsøk. Disse økningene er høyere hos sportsfolk etter at de er blitt administrert DHA i tre uker, både vurdert som et hele og som konkurransesyklister, uten å vise noe forskjell mellom basale forsøk og forsøk utført etter inntak av DHA i tre uker hos amatørsportsfolk (fig. 28).

2.- Malonyldialdehyd (MDA). MDA er det mest oppnådde produkt etter reaksjon av lipidiske peroksider produsert ved oksidativt stress med tiobarbitursyre. Det er vist at en signifikant økning av oksidativ skade på plasmalipider mens det utføres alle anstrengelsesforsøk (p < 0,035). Etter DHA-inntak i tre uker er oksidativ skade på lipider mens det utføres anstrengelsesforsøk lavere enn i begynnelsen (p < 0,05). Denne forskjellen er mye mer viktig for trenede sportsfolk enn for amatørsportsfolk (fig. 29).

3.- 8-okso-7,8-dihydro-2-’-deoksyguanosin (8-oksodG). 8-oksodG er en oksidativstress biomarkør. Det er en økning av oksidativ skade på DNA mens det utføres rektangulære anstrengelsesforsøk (p < 0,011). Denne oksidative skaden reduseres etter administrering av DHA i tre uker (p < 0,035). Denne reduksjon i oksidativt stress er mer viktig hos ikke-konkurrerende syklister enn hos konkurrerende syklister, hvor forskjellen ikke er statistisk signifikant (fig. 30).

Glykemiundersøkelser

For å undersøke blodglykosenivåer ble et rektangulært anstrengelsesforsøk utført på en sykkelmølle med en maksimal belastning opprettholdt som er ekvivalent til en hastighet som tilsvarer 75 % av VO2maxberegnet over den maksimale triangulære anstrengelsesforsøk, under opprettholdelse av konstant stigning på en verdi på 2 %. Tiden for forsøket er 90 min. og opptaket av vann over samme tid blir utført ad libitum.

Siden drikkevarer med karbohydrater ikke ble inntatt var hypoglykemi forventet. Denne hypoglykemien ved andre prøvetaking (20 min. etter avslutning av forsøket med hensyn på startprøven oppnådd 20 min. før starten), er vist i det første anstrengelsesforsøket, som var forventet. Dataene oppnådd etter DHA-administrering i fire måneder viser imidlertid en statistisk signifikant opprettholdelse av glykemi, som ikke var observert tidligere og dette representerer et overraskende funn i den utførte forskning.

Generelt er det observert en statistisk signifikant reduksjon (p < 0,0009) av serumglukosenivåer gjennom rektangulære anstrengelsesforsøk. Atferden er imidlertid forskjellig avhengig av type sportsfolk som analyseres (p < 0,003): i tilfelle av vanlige konkurransesyklister var det ingen signifikant variasjon i reduksjon av glykemi under forsøkene, men i tilfelle av amatørsyklister er reduksjonen av glykemi under det basale forsøk høyere enn hos vanlig konkurrerende syklister og etter å ha tatt DHA i tre uker eller fire måneder forsvinner tydeligvis nevnte reduksjon (fig. 31, 32 og 33).

Eksistensen av normoglykemi under anstrengelsesforsøket på 75 % av VO2maxi 90 min. uten å drikke leskedrikker med karbohydrater representerer et funn som kobler sammen atferden av DHA under en fysisk anstrengelse med den observert og overnevnte i relasjon til økning av insulinsensitivitet. I denne forbindelse konkluderte Goodyear og Kahn (1998) at de molekylære mekanismer som ligger under responsen til glukose i skjelettmuskel til insulin eller muskelarbeid er forskjellig etter publikasjonen i 1997 (Winder og Hardie) om det faktum at AMPK (AMP-aktivert proteinkinase) var høy i fibre Iia under muskelarbeid, og tyder på at AMPK har en pleiotropisk virkning til å inhibere acetyl-CoA karboksylase og fremme glukosetransport blant andre virkninger. Kanskje dette kan forklare det funn at en glykemisk respons er forskjellig hos sportsmenn fra den forventet i henhold til undersøkelser utført hos sedate folk.

Fra disse studier om virkningen av DHA om sportsprestasjon og glykemi kan følgende konkluderes:

1) Det er blitt bevist at kontinuerlig inntak av DHA over mer enn tre uker frembringer en økning i plasma total antioksidantkapasitet (PTAC) generelt og statistisk signifikant (p < 0,05) i både konkurranse- og amatørsyklister. I tillegg er den oksidative skaden på lipider lavere (p < 0,05) (forskjell som er mer viktig for trenede sportsfolk enn for amatørsyklister). Endelig er det blitt vist at skade på DNA målt ved urinmarkøren (8-oksodG) reduseres etter inntak av DHA i tre uker (p < 0,035).

2) Det er blitt vist at etter fire måneder kontinuerlig inntak av DHA er sportsprestasjonen høyere (økning av belastning og hjertefrekvens så vel som prosentandel av VO2maxi UV2. I tillegg er det blitt observert en statistisk signifikant normoglykemi i anstrengelsesforsøk over 90 min. ved 75 % VO2maxutført fire måneder etter inntak av DHA.

Av begge virkninger (en økning i sportsprestasjon og normoglykemi over langtidsarbeid) er et resultat som ikke var forventet eller kjent på området.

Videre kunne det konkluderes at denne sammensetningen av virkninger er ønskelig og således ikke er kjent.

En annen hensikt med foreliggende oppfinnelse er anvendelse av dokosaheksaensyre til fremstilling av en sammensetning for å styrke sportsprestasjon og å opprettholde blodglukosenivåer etter fysisk anstrengelse administrert ved ethvert egnet middel.

Det bør vurderes at ”European Union Scientific Committee on Food” (EU’s vitenskapelig komité for næringsmidler) anbefaler følgende komponenter for en sammensetning av leskedrikk som skal ta under en fysisk anstrengelse (se http://ec.europa.eu/food/fs/sc/scf/out64_en.pdf).

I denne forbindelse er inklusjon av karbohydrater rettet mot å opprettholde glykemi for å unngå det hurtige forbruk av muskulær og leverglykogen. Det skal bemerkes at problemer med mavetømming ble redusert på grunn av økning av osmolariteten dannet i nærvær av konsentrasjoner av karbohydrater, assosiert med størrelsen av full mave som er uønsket for en del sportsfolk. Følgelig kunne fremstilling av en drikk med en lavere konsentrasjon av karbohydrater ved tilsetting av DHA være en ergogen fordel som uten tvil er av interesse for sportsprestasjon.

Følgelig angår en annen side av foreliggende oppfinnelse en farmasøytisk sammensetning som omfatter DHA som kan brukes i næringsmiddelindustrien med den hensikt å anrike næringsmiddelprodukter (f.eks. meieriprodukter så som yoghurt, melk, etc.) med et naturlig antioksidantmiddel så som DHA, eller ytterligere inkorporert i en egnet administreringsform valgt fra gruppen som omfatter drikker med alle dets egenskaper for før, under og etter fysisk utfoldelse; energigivende biter; ergogene biter, faststoffer og preparater; dietetisk supplement og multivitaminpreparater (i form av f.eks. kapsler, tabletter, piller, lyofilisert form eller ethvert annet egnet administreringsmiddel); ergogene hjelpemidler; tekstiler med nanokapsler for hudabsorpsjon og ethvert annet egnet administrasjonsmiddel.

Nøkkel til figurene

Fig. 1. Virkningen av DHA-konsentrasjon i forhudscellekulturmedium på intracellulær dannelse av ROS. Cellene ble dyrket i nærvær av et triglyserid med 70 vekt% DHA i forhold til de totale fettsyrer over en periode på 3 dager før eksperimentet. (A) ROS-deteksjon ble utført med DHR 123 på celler behandlet med 40 eller 60 mM AAPH i 180 min. Dataene viser gjennomsnitt av tre uavhengige eksperimenter. (B) Deteksjon av ROS ble utført med CDCFDA på celler behandlet med xantin/xantinoksidasesystem i 180 min. For å sammenligne blir dataene oppnådd med 100 μm vitamin E (kontroll) inkorporert. Dataene representerer gjennomsnitt av tre uavhengige eksperimenter.

Fig. 2. Sammenlignende virkning av andel av DHA i et triglyserid i forhudscellekulturmedium på intracellulær dannelse av ROS. (A) Cellene ble dyrket i nærvær av hvert triglyserid i tre dager før eksperimentet. Konsentrasjonen på xaksen er ekvivalenten som ville oppnås med et triglyserid som har et DHA-innhold på 70 vekt%. Deteksjonen av ROS ble utført med DHR 123 på celler behandlet med 40 mM AAPH i 180 min. Dataene representerer gjennomsnitt av tre uavhengige eksperimenter. (B) Representasjon av antioksidantbeskyttelse i relasjon til DHA-konsentrasjonen i olje på 20, 50 og 70 %.

Fig. 3. Virkning av DHA-konsentrasjon på produksjon av TBARS i forhudsceller. Cellene ble dyrket i nærvær av et triglyserid med 70 vekt% DHA i relasjon til de totale fettsyrer over tre dager før eksperimentet med angitt konsentrasjon. Det oksidative stress ble indusert med 40 mM AAPH i 6 timer og 24 timers latenstid. Dataene representerer gjennomsnitt av tre uavhengige eksperimenter.

Fig. 4. Virkning av DHA-konsentrasjon i forhudscellekulturmedium på dannelse av superoksidanioner. Cellene ble dyrket i nærvær av et triglyserid med 70 vekt% DHA i forhold til totale fettsyrer i tre dager før eksperimentet. Deteksjon av superoksidanioner ble utført ved kjemiluminescens øyeblikkelig etter oksidativ induksjon av cellene med 40 mM AAPH og i noen eksperimenter i nærvær av 10 mM Tyron eller av 0,1875 UA/ μl av eksogen SOD. Dataene er representative for tre uavhengige eksperimenter.

Fig. 5A. Virkning av DHA-konsentrasjon i forhudscellekulturmedium på SOD-aktivitet. Cellene ble dyrket i nærvær av et triglyserid med 70 vekt% DHA i forhold til de totale fettsyrer over tre dager før eksperimentet med DHA-konsentrasjoner på 0,5 (A), 5 (B) og 50 μM (C). SOD-aktiviteten ble analysert indirekte ved å analysere reduksjon i kjemiluminescens dannet av luminol som en konsekvens av den endogene SOD-aktivitet. Oksidativ induksjon ble utført med 0,1 mM xantin/0,005 U/ml xantinoksidasesystem som øyeblikkelig danner superoksidanioner. Dataene er representative for tre uavhengige eksperimenter.

Fig. 5B. Virkning av DHA-konsentrasjon i forhudscellekulturmedium på SOD-aktivitet. Cellene ble dyrket i nærvær av et triglyserid med 70 vekt% DHA i forhold til de totale fettsyrer over tre dager før eksperimentet. SOD-aktivitet ble evaluert på det ikke-induserte cellesystem eller system indusert med 40 mM AAPH. Dataene er representative for tre uavhengige eksperimenter.

Fig. 6. Virkning av DHA-konsentrasjon på forhudscellekulturmedium på GPxaktivitet, cellene ble dyrket i nærvær av et triglyserid med 70 vekt% i henhold til de totale fettsyrer over tre dager før eksperimentet. GPx-aktivitet ble evaluert på det ikke-induserte cellulære system eller systemet indusert med 40 mM AAPH. Dataene er representative for tre uavhengige eksperimenter.

Fig. 7. Virkningen av DHA-konsentrasjonen i kulturmedium for ARPE-19-celler på den intracellulære dannelse av ROS. Cellene ble dyrket i nærvær av et triglyserid med 70 vekt% DHA i forhold til totale fettsyrer i tre dager før eksperimentet. (A) Deteksjon av ROS ble utført med DHR 123 (A) eller med CDCFDA (B) på celler behandlet med 40 eller 60 mM av AAPH i 180 min. Dataene representerer gjennomsnitt av tre uavhengige eksperimenter.

Fig. 8. Sammenlignende virkning av DHA-konsentrasjon til et triglyserid i et triglyserid i kulturmediet til ARPE-19-celler på intracellulær dannelse av ROS. Cellene ble dyrket i nærvær av hvert triglyserid i tre dager før eksperimentet.

Konsentrasjonen på x-aksen er den ekvivalenten som ville oppnås med triglyseridet som har en DHA-andel på 70 vekt%. Deteksjon av ROS ble utført med DHR 123 på celler behandlet med 40 mM AAPH i 180 min. Dataene representerer gjennomsnitt av tre uavhengige eksperimenter. (B) representasjon av antioksidantbeskyttelse i relasjon til DHA-konsentrasjon i olje på 20, 50 og 70 %.

Fig. 9. Virkning av DHA-konsentrasjon på produksjon av TBARS i ARPE-19-celler. Cellene ble dyrket i nærvær av et triglyserid med 70 vekt% DHA i relasjon til totale fettsyrer i tre dager før eksperimentet på den angitte konsentrasjon. Det oksidative stress ble indusert med 40 mM AAPH i 6 timer og 24 timers latenstid. Dataene representerer gjennomsnitt av tre uavhengige eksperimenter.

Fig. 10. Virkning av DHA-konsentrasjon i ARPE-19-cellekulturmedium på dannelse av superoksidanioner. Cellene ble dyrket i nærvær av et triglyserid med 70 vekt% DHA i relasjon til de totale fettsyrer i tre dager før eksperimentet. Deteksjon av superoksidanioner ble utført med kjemiluminescens øyeblikkelig etter oksidativ induksjon av cellene med AAPH 40 mM. Dataene er representative for tre uavhengige eksperimenter.

Fig. 11. Virkning av DHA-konsentrasjon i dyrkningsmediet for ARPE-19-celler på GPx-aktivitet. Cellene ble dyrket i nærvær av et triglyserid med 70 vekt% DHA i forhold til de totale fettsyrer i tre dager før eksperimentet. GPx-aktivitet ble evaluert på det ikke-induserte cellesystem eller cellesystem indusert med 40 mM AAPH. Dataene er representative for tre uavhengige eksperimenter.

Fig. 12. Virkning av DHA-konsentrasjon i dyrkingsmediet til ARPE-19-celler på SOD-aktivitet. Cellene ble dyrket i nærvær av et triglyserid med 70 vekt% DHA i forhold til de totale fettsyrer i tre dager før eksperimentet. SOD-aktivitet ble evaluert på det ikke-induserte cellesystem eller på cellesystem indusert med 40 mM AAPH. Dataene er representative for tre uavhengige eksperimenter.

Fig. 13. Virkning av DHA-konsentrasjon oppnådd ved kjemisk syntese (A og C) eller enzymatisk syntese (B og D) på prosentandel av cellulær beskyttelse versus oksidativt stress i ARPE-19-celler (A og B) eller forhudsceller (C og D).

Fig. 14. Innflytelse av rensegraden til olje oppnådd ved kjemisk syntese på prosentandelen av cellulær beskyttelse versus oksidativt stress indusert av DHA i ARPE-19-celler.

Fig. 15. Innflytelse av kjemisk struktur på prosentandel av cellulær beskyttelse versus oksidativt stress indusert av DHA i ARPE-19-celler.

Fig. 16. Virkning av DHA-konsentrasjon på ekstracellulær konsentrasjon av glutation i ARPE-19-celler. Innflytelse av nærvær av BSO.

Fig. 17. Innflytelse av glutation de novo syntese på prosentandelen av cellulær beskyttelse versus oksidativt stress indusert av DHA i ARPE-19-celler.

Fig. 18. Virkning av DHA-konsentrasjon på intracellulær konsentrasjon av glutation i forhudsceller. Innflytelse av nærvær av BSO.

Fig. 19. Innflytelse av rensingsgraden av olje oppnådd ved kjemisk syntese på prosentandelen av cellulær beskyttelse versus oksidativt stress indusert av EPA i ARPE-19-celler. Sammenlignende undersøkelse med DHA.

Fig. 20. Virkning av EPA-konsentrasjon på prosentandel av cellulær beskyttelse versus oksidativt stress i forhudsceller. Sammenlignende undersøkelse med DHA.

Fig. 21. Virkning av EPA-konsentrasjon på intracellulær konsentrasjon av glutation på forhudsceller. Innflytelse av nærvær av BSO.

Fig. 22 er et sammenlignende søylediagram som viser virkningen av DHA-prosentandelen i et strukturert og ikke-strukturert triglyserid ved forskjellige doser med hensyn på prosentandel av cellebeskyttelse.

Nevnte fig. 22 viser de overraskende resultater av hensikten med foreliggende tilsetning under sammenligning av den kjemiske strukturen til et ikke-strukturert glyserid (triglyserid) med den samme struktur hvori sn-1- og sn-3-posisjoner er blitt erstattet med kaprylsyre (strukturert), begge fra en enzymatisk kilde med to utgangsnivåer med hensyn på innhold av DHA på 20 og 70 %.

Fra figuren kan det ses at den samme konsentrasjon, viser prosentandelen av beskyttelse av dokosaheksaensyre inkorporert i sn-2-posisjonen i et glyserid (strukturert), særlig et triglyserid, en effektivitet som er ca. tre ganger høyere enn den til et glyserid som inneholder ikke-strukturert DHA.

I en slik figur 22 angir beskyttelsesprosentandelen sammenhengen mellom forskjellen i intracellulær konsentrasjon av reaktive oksygenelementer i kontrollceller og de behandlet med DHA med hensyn på kontrollceller, begge utsatt for samme oksidative stress uttrykt i prosentandel. Med andre ord angir eksistensen av en beskyttelsesprosentandel i behandlede celler en signifikant statistisk mindre intracellulær dannelse av reaktive oksygenelementer i forhold til kontrollen.

Fig. 23 er et sammenlignende grafisk bilde som viser gjennomsnittlig lengde av telomeren i humane fibroblaster dyrket under oksidativt stress med eller uten DHA inkorporert versus passasjeantall av cellulære populasjoner.

Nevnte fig. 23 viser de overraskende resultater av hensikten med foreliggende tilsetning ved å observere at i nærvær av DHA under oksidative st ressbetingelser er telomerforkortningsindeksen lavere i forhold til kontrollene eller uten DHA.

Fig. 24 er en grafisk representasjon av det absolutte oksygenopptak i den ”ventilatoriske terskel 2” (UV2) for konkurrerende, ikke-konkurrerende og alle syklister i basalnivå og etter fire måneders inntak av DHA.

Fig. 25 er en grafisk representasjon av hjertefrekvens i UV2 for konkurrerende, ikke-konkurrerende og alle syklister på basalt nivå og etter fire måneders inntak av DHA.

Fig. 26 er en grafisk representasjon av tiden som er nødvendig for å nå UV2 for konkurrerende, ikke-konkurrerende og alle syklister på basalt nivå og etter fire måneders inntak av DHA.

Fig. 27 er en grafisk representasjon av hjertefrekvensen under opptak av 2000 ml/min. O2i den ventilatoriske terskel for konkurrerende, ikke-konkurrerende og alle syklister på basalnivå etter fire måneders inntak av DHA.

Fig. 28 er en grafisk representasjon av total plasma antioksidantkapasitet for konkurrerende, ikke-konkurrerende og alle sportsmenn på basalt nivå etter tre ukers inntak av DHA. I hvert tilfelle er det vist antioksidantkapasiteten før (venstre stolpe) og antioksidantkapasiteten etter (høyre stolpe) anstrengelsesprøven.

Fig. 29 er en grafisk representasjon av den oksidative skade til plasmatiske lipider i henhold til MDA-konsentrasjonen for konkurrerende, ikke-konkurrerende og alle sportsmenn på basalnivå og etter tre ukers inntak av DHA. I hvert tilfelle er det vist den oksidative skade før (venstre stolpe) og den oksidative skade etter (høyre stolpe) anstrengelsesprøven.

Fig. 30 er en grafisk representasjon av den oksidative skade på DNA ved å bruke oksidativ stressbiomarkøren 8-oksodG for konkurrerende, ikke-konkurrerende og alle sportsmenn på basalnivå etter tre ukers inntak av DHA. I hvert tilfelle er det vist den oksidative skade før (venstre stolpe) og den oksidative skade etter (høyre stolpe) anstrengelsesprøven.

Fig. 31 er en grafisk representasjon av glykemi i konkurrerende sportsmenn under fysisk anstrengelse som ikke tok DHA eller gjorde det i tre uker eller fire måneder.

Fig. 32 er en grafisk representasjon av glykemi i ikke-konkurrerende sportsmenn under en fysisk anstrengelse som ikke tok DHA eller gjorde det i tre uker eller fire måneder.

Fig. 33 er en grafisk representasjon av glykemi i konkurrerende og ikkekonkurrerende sportsfolk under fysisk anstrengelse som ikke tok DHA eller som gjorde det i tre uker eller fire måneder.

Ytterligere mulige trekk og kombinasjoner av trekk ved det som er beskrevet fremgår av de etterfølgende nummererte aspekter, som ikke skal forveksles med patentkrav.

Aspekt 1: Matvare som omfatter dokosaheksaensyre (DHA), eikosapentaensyre (EPA), eller DHA-avledet EPA for ernæringsmessig anvendelse som en antioksidant.

Aspekt 2: Matvare i henhold til aspekt 1 der nevnte matvare blir administrert til et individ påvirket av cellulær oksidativ skade.

Aspekt 3: Matvare i henhold til aspekt 2 der den cellulære oksidative skade er assosiert med:

• en fysiologisk tilstand valgt fra aldring, fysisk trening, hypoglykemi under eller etter fysisk trening; eller

• en sykdom valgt fra en nevrodegenerativ patologi, en okular patologi, en iskemisk patologi, en inflammatorisk prosess, aterosklerose; hvori nevnte nevrodegenerative patologi kan være valgt fra multippel sklerose, Alzheimers sykdom, Parkinsons sykdom, amyotrofisk lateral sklerose, og muskulær dystrofi; hvori nevnte okulare patologi kan selekteres fra retinisis pigmentosa, makuladegenerering og katarakter; hvori nevnte iskemiske patologi kan selekteres fra myokardialt infarkt og cerebralt infarkt; og hvori nevnte inflammatoriske prosess kan selekteres fra artritt, vaskulitt, glomerulonefritt og erythematosus lupus.

Aspekt 4: Fremgangsmåte til dietthåndtering av cellulær oksidativ skade i et individ der fremgangsmåten omfatter administrering av en effektiv mengde av DHA, EPA eller DHA-avledet EPA til nevnte individ.

Aspekt 5: Fremgangsmåte som angitt i aspekt 4 der den cellulære oksidative skade er assosiert med:

• en fysiologisk tilstand valgt fra aldring, fysisk trening, hypoglykemi under eller etter fysisk trening; eller

• en sykdom valgt fra en nevrodegenerativ patologi, en okular patologi, en iskemisk patologi, en inflammatorisk prosess, aterosklerose; hvori nevnte nevrodegenerative patologi kan være valgt fra multippel sklerose, Alzheimers sykdom, Parkinsons sykdom, amyotrofisk lateral sklerose, og muskulær dystrofi; hvori nevnte okulare patologi kan selekteres fra retinisis pigmentosa, makuladegenerering og katarakter; hvori nevnte iskemiske patologi kan selekteres fra myokardialt infarkt og cerebralt infarkt; og hvori nevnte inflammatoriske prosess kan selekteres fra artritt, vaskulitt, glomerulonefritt og erythematosus lupus.

Aspekt 6: Ikke-terapeutisk anvendelse av dokosaheksaensyre (DHA), eikosapentaensyre (EPA), eller DHA-avledet EPA som en antioksidant.

Aspekt 7: Ikke-terapeutisk anvendelse av DHA, EPA eller DHA-avledet EPA som et anti-aldringsmiddel.

Aspekt 8: Ikke-terapeutisk anvendelse av DHA, EPA eller DHA-avledet EPA som en sportsprestasjonsforsterker hos individer utsatt for fysisk trening.

Aspekt 9: Ikke-terapeutisk anvendelse av DHA, EPA eller DHA-avledet EPA for å opprettholde blodglukosenivåer hos individer under fysisk trening.

Aspekt 10: Ikke-terapeutisk anvendelse i henhold til ethvert av aspektene 6-9, hvori anvendelsen blir utført i næringsmiddelindustrien.

Aspekt 11: Ikke-terapeutisk anvendelse som angitt i ethvert av aspektene 6-10, hvori nevnte anvendelse blir utført på meieriprodukter.

Aspekt 12: Ikke-terapeutisk anvendelse som angitt i ethvert av aspektene 8-9, hvori nevnte DHA, EPA eller DHA-avledet EPA blir administrert gjennom et egnet middel selektert fra gruppen som omfatter en drikk med alle dets egenskaper til å benyttes før, under og etter fysisk trening; energigivende plater; ergogene plater; faststoffer og preparater for proviantering; dietetisk supplement og multivitaminpreparater; ergogene hjelpemidler; tekstiler med nanokapsler for hudabsorpsjon; og ethvert annet egnet administrasjonsmiddel.

Aspekt 13: Ikke-terapeutisk anvendelse som angitt i aspekt 12, hvori nevnte dietetiske supplement og multivitaminpreparat er i form av kapsler, tabletter, piller, lyofilisert form eller ethvert egnet administrasjonsmiddel.

Aspekt 14: Ikke-terapeutisk anvendelse som angitt i ethvert av aspektene 6-9, hvori nevnte anvendelse blir utført i kosmetiske applikasjoner.

Aspekt 15: Anvendelse av DHA, EPA eller DHA-avledet EPA til fremstilling av en farmasøytisk sammensetning til å behandle cellulær oksidativ skade.

Aspekt 16: Anvendelse som angitt i aspekt 15, hvori den cellulære oksidative skade er assosiert med

• en fysiologisk tilstand valgt fra aldring, fysisk trening, hypoglykemi under eller etter fysisk trening; eller

• en sykdom valgt fra en nevrodegenerativ patologi, en okular patologi, en iskemisk patologi, en inflammatorisk prosess, aterosklerose; hvori nevnte nevrodegenerative patologi kan være valgt fra multippel sklerose, Alzheimers sykdom, Parkinsons sykdom, amyotrofisk lateral sklerose, og muskulær dystrofi; hvori nevnte okulare patologi kan selekteres fra retinisis pigmentosa, makuladegenerering og katarakter; hvori nevnte iskemiske patologi kan selekteres fra myokardialt infarkt og cerebralt infarkt; og hvori nevnte inflammatoriske prosess kan selekteres fra artritt, vaskulitt, glomerulonefritt og erythematosus lupus.

Aspekt 17: Matvare i henhold til ethvert av aspektene 2-3, fremgangsmåte i henhold til ethvert av aspektene 4-5, eller anvendelse som angitt i ethvert av aspektene 15-16, der den cellulære oksidative skade omfatter produksjon av reaktive oksygenarter (ROS).

Aspekt 18: Matvare i henhold til ethvert av aspektene 2-3, fremgangsmåten i henhold til ethvert av aspektene 4-5, eller anvendelse i henhold til ethvert av aspektene 15-16 der ROS er superoksidanionet.

Aspekt 19: Matvare i henhold til ethvert av aspektene 2-3, fremgangsmåte i henhold til ethvert av aspektene 4-5, eller anvendelse i henhold til ethvert av aspektene 15-16 der den cellulære oksidative skade omfatter forkortning av DNA-telomerer.

Aspekt 20: Matvare som angitt i ethvert av aspektene 2-3, fremgangsmåte som angitt i ethvert av aspektene 4-5, eller anvendelse som angitt i ethvert av aspektene 15-16, der den cellulære oksidative skade omfatter prematur cellulær aldring.

De følgende eksempler er inkludert for å illustrere og er ikke-begrensende eksempler på oppfinnelsen.

Eksempler

MATERIALER OG METODER FOR Å EVALUERE ANTIOKSIDANTAKTIVITET

Cellekulturer

De cellulære modellene brukt var forhudsceller (udifferensierte epidermale fibroblaster, CRL-2076) og ARPE-19-celler (retinale pigmentepitelceller CRL-2302) oppnådd fra American Type Culture Collection. Cellekulturene ble holdt under egnede vekstbetingelser med temperatur (37<o>C), Co2-konsentrasjon (5 %) og fuktighet (95 %) i en inkubator spesielt konstruert for denne hensikt. ARP-19-celler ble opprettholdt i vekst opptil konfluens på 0,3 x 10<4>celler/cm<2>i kulturflasker med DMEM-F12-medium (Biological Industries) supplementert med 10 % bovint føtalt serum, penicillin som antibiotika (100 U/ml), streptomycin (100 μg/ml) og glutamin (Biological Industries). CRL-2076-fibroblaster ble holdt voksende i kulturflasker i Iscoves modifisert Dulbeccos medium (Biological Industries) supplementert med 10 % bovint føtalt serum, penicillinantibiotika (100 U/ml), streptomycin (100 μg/ml) og glutamin (Biological Industries). Cellene ble overført for tilklebing til substratet 24 timer på 34<o>C fra 75 ml flasker til 6-, 12- eller 96-brønners plater for å være i stand til å utføre eksperimentet (10<6>celler/ml).

Integrering av DHA i cellene

DHA-TG ble tilsatt med forskjellige konsentrasjoner (0,5-50 μm) som startet med DHA-TG anriket med 20, 50 og 70 % (oljetetthet 0,92 g/ml), fremstilt ved å oppløse oljen i etanol for stamløsningen (1:100) og å fremstille arbeidsløsningene i et kulturmedium fremstilt med serum. Cellene ble dyrket med supplementert DHA-TG-medium i tre dager ved 37<o>C.

Induserende oksidativt stress

Forskjellige induksjonsceller ble brukt til å stresse cellene oksidativt:

a) xantin/xantinoksidasesystem 0,8 mM/10<-2>U/ml som katalyserer oksidering av hypoxantin og xantin til urinsyre, med reduksjon av O2til O�<-2>og H2O2.

b) 2,2’-azobis-(2-amidinopropan) dihydroklorid (AAPH) 1-100 mM i stor grad brukt som en hydrofil initiator av frie radikaler ved å indusere lipidisk og proteinperoksidering. AAPH oksiderer DNA, proteinene og lipidene gjennom virkning av de dannede peroksidradikaler. Den virker videre på det endogene forsvarssystem siden det deaktiverer nøkkelenzymet SOD for derved å tape den beskyttende kapasiteten til CAT og GPx.

Dannelse av reaktive oksygenelementer (ROS)

ROS-nivået ble målt i de primære kulturene til humane hud CRL-2076 fibroblaster og i ARPE-19 retinale epitelceller ved å anvende den fluorometriske teknikken ved å bruke dihydrodamin 123 (DHR 123, Molecular Probes) og 2,7-diklorfluoresceindiacetat (H2DCFDA, Molecular Probes) som fluorescerende prober i et kontinuerlig system som måler hvert 30. min. inntil 180 min. I begge tilfeller er dette en uspesifikk måling av ROS-dannelse. De fluorescerende probene ble tilsatt til cellene (1 x 10<6>celler/ml) med en endelig konsentrasjon på 10 μm.

Fluorescensen til de oksiderte prober (2,7-diklorfluorescein og rodamin 123 ble målt i en Mithras fluorescensleser på en eksitasjonsbølgelengde på 488 nm og en emisjonsbølgelengde på 525 nm som en funksjon av tid. Den oppnådde fluorescens blir modulert med den cellulære levedyktighetsbestemmelse ved MTT spektrofotometrisk teknikk skissert nedenfor.

Cellulær levedyktighet

Cellulær levedyktighetsundersøkelser ble utført for å evaluere den cytotoksiske virkning i forskjellige prøver. Denne metoden består av å tilsette MTT-reagensen (3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoylbromid, Sigma), løselig i vandig medium, til inkubasjonsmediet. De levedyktige cellene metaboliserer denne forbindelse og den blir konvertert til formazansalt. Dette saltet er en kolorimetrisk forbindelse som er uløselig i vandig medium, løselig i DMSO og brukbar for å måle cellulær levedyktighet. Fremgangsmåten består av å tilsette 20 μl/brønn av en 7,5 mg/ml (i overskudd) MTT-løsning. Dette blir inkubert i 1 time ved 37<o>C slik at de levedyktige cellene metaboliserer forbindelsen og produserer formazansaltet, mens de ikke-levedyktige cellene ikke gjør dette. Etter inkubering i 1 time blir cellene utfelt og telt og 100 μl av DMSO tilsatt, som vil løse opp formazansaltet. Endelig blir absorbansen på 550 nm lest på en plateleser. levedyktighetsresultatene blir uttrykt som en optisk tetthets prosentandel i relasjon til kontrollene, hvor de siste blir satt til å ha 100 % levedyktighet. Cellulære levedyktighetskurver ble trukket opp på 96-brønners plater ved å så ut ca.20000 celler/brønn (etter analyse av det egnede antall celler som en funksjon av deres vekstforhold) med et egnet volum på 200 μl medium/brønn. Undersøkelsen av effektiviteten til produktet blir utført ved å eksponere cellene til produktet i 72 timer i et tilstrekkelig stort område av konsentrasjoner for å finne verdien til IC50. De eksperimentelle resultatene blir justert til Hill-ligningen ved å bruke Sigma Plot 8.0 for å bestemme IC50, definert som DHA-konsentrasjonen som er nødvendig for å redusere levedyktigheten til kulturen til 50 % i forhold til kontrollen.

Bestemmelse av proteiner

Denne bestemmelse er basert på kolorimetrisk deteksjon og total kvantifisering av proteiner med en optimalisert disinkoninsyreformulering som tillater proteiner å måles i fortynnede prøver i et konsentrasjonsområde på 0,5-20 μg/ml.

Fremgangsmåten benytter en detektor for Cu<+1>, som blir redusert av proteinene i alkalisk medium til Cu<+2>. Det purpurfargede reaksjonsprodukt blir dannet ved chelatering av to molekyler av BCA med kobberionet. Det vannløselige kompleks absorberer på 562 nm. Ved hjelp av en kalibreringskurve kan det oppnås en ligning, hvor resultatene er uttrykt i μg/ml proteiner. Det kommersielle sett brukt er MicroBCA fra Pierce (nr. 23235).

Direkte analyse av ROS-generering

Måling av dannelse av lipidiske hydroperoksider

Måling av malonildialdehyd (MDA) på cellelysater ble brukt som en markør på lipidisk peroksidering ved UV-Vis spektrofotometri. MDA og 4-hydroksyalkenaler (HAE) er produkter avledet fra peroksidering av flerumettede fettsyrer og relaterte estere. Direkte målinger av disse aldehydene utgjør en egnet indeks for lipidiks peroksidering. Et kromogent reagens (N-metyl-2-fenyl-indol i acetonitril) som reagerer med MDA ved 45<o>C ble anvendt, ved å bruke det kommersielle lipidiske peroksideringssett fra Calbiochem (nr. 437634). Kondenseringen av et molekyl av MDA med to molekyler av det kromogene reagens gir en stabil kromofor med maksimum absorbans på 586 nm, hvor deteksjonsgrensen er 0,1 μm. Induksjonen ble utført i 6 timer med 40 mM AAPH og 24 timers latenstid. Cellene (10<7>celler/ml) ble lysert ved hjelp av sykler av frysing og tining i flytende N2. Prøvene ble fraksjonert for å måle MDA og protein. Resultatene ble uttrykt i μm MDA/mg protein.

Måling av generering av superoksidanion

Direkte måling av superoksidanionet ble utført ved hjelp av kjemiluminescensteknikk på mikroplate målt ved luminol (Calbiochem, nr.

574590). Kjemiluminescens for deteksjon av superoksidanion er en teknikk brukt på grunn av dens potensial for å oppnå tilgang til alle de intracellulære setene for superoksiddannelse, på grunn av den høye spesifisiteten av reaksjonen med luminol, den minimale intracellulære toksisitet og den økte sensitivitet i forhold til andre kjemiske teknikker. Den er basert på det superoksidanionoksiderende luminol i en reaksjon som produserer lysfotoner som er hurtig målt ved et standard illuminometer. I våre tester brukte vi en kjemiluminescensleser på mikroplater fra ELISA, MITHRAS og i tillegg, gitt den korte halveringstiden til radikalet, ble det brukt en forsterker for å øke sensitiviteten til testen og forsterke responsen. Dette reagenset kan brukes på levende celler siden det ikke er toksisk og denaturerer ikke de subcellulære systemkomponenter. Kapasiteten for å inhibere produksjon av superoksidanion ble også undersøkt ved å bruke et spesifikk superoksidanion komplekssaltdanner, Tyron (4,5-dihydroksy-1,3-benzendisulfonsyre, Sigma) ofte brukt for in vitro blokkeringsassayer på ROS-produksjon, som er permeabelt i cellemembranen og superoksiddismutase (SOD, Sigma) ble brukt som en enzymblokker, som utgjør et førstelinjeenzym i det endogene antioksidantforsvar. Kjemiluminescensmålingen i cellene utsatt for AAPH oksidativt stress induserende behandling ble analysert hvert 60. sek. over et totalt tidsrom på 4100 sek., i en frekvens med 120 sek./syklus. Resultatet ble uttrykt i UA av kjemiluminescens/mg protein.

Bestemmelse av antioksidantenzymaktivitet

Måling av glutationperoksidase (GPx)-aktivitet

GPx katalyserer reduksjon av hydroksyperoksider til redusert glutation, hvor funksjonen er å beskytte cellen mot oksidativ skade. Den anvender glutation som siste elektrongiver for å regenerere den reduserte formen til selencystein. Den indirekte måling av GPx blir oppnådd ved koblet reaksjon med glutationreduktase. Det oksiderte glutation (GSSG) produsert ved reaksjonen med hydroperoksider ved virkning av GPx blir resirkulert til dens reduserte tilstand med glutationreduktase ved å bruke NADHP som koenzym. Oksidering fra NADPH til NADP<+>blir fulgt av reduksjon av dens absorbans på 340 nm. Graden av reduksjon av absorbans på 340 nm er direkte proporsjonal til GPx-aktiviteten i prøven. ELISA mikroplatespektrofotometrisk sett fra Cayman (nr. 703102) ble brukt for å detektere GPx i cellelysater av primære kulturer. Cellene ble dyrket ved klebing til substratet i 24 timer ved 37<o>C. Cellelysater ble oppnådd ved sonikering i Tris 50 mM, pH 7,5, EDTA 5 mM og DTT 1 mM. Aktiviteten til GPx blir oppnådd ved å bestemme forandringen av A340nm/min. ( ΔA340), uttrykt som nanomol NADHP/min./mg protein fra prøven.

Måling av superoksiddismutaseaktivitet (SOD)

Denne kjemoluminescensmetoden er basert på analyse av SOD-aktivitet i den cellulære supernatanten i forhold til en positiv kontroll av SOD (Calbiochem nr. 574590). Nærværet av SOD i xantinoksidase-xantinluminolsystemet fører til en reduksjon av kjemoluminescens fremstilt som en reduksjon av dismutering av superoksidanionet proporsjonalt med SOD-aktiviteten. Analysen blir utført på et MITHRAS illuminometer i intervaller på 50 msek. opptil en endelig reaksjonstid på 520 sek.

Superoksiddismutaseaktivitet (SOD) i cellulære lysater ved hjelp av reaksjonen som bruker tetrazoliumsalter for å detektere superoksidradikaler dannet av xantinoksidase/hypoxantinsystemet er også blitt bestemt. En spektrofotometrisk metode blir brukt på en mikroplate for å måle de tre typer av SOD (Cu-Zn-SOD; Mn-SOD og Fe-SOD), som er cytosolisk og mitokondriell). En enhet av SOD er definert som mengden av enzym som er nødvendig for å dismutere 50 % av det dannede superoksidanion. For å detektere SOD i cellulære lysater fra primære kulturer ble et Cayman kit (nr. 706002) brukt ved å følge protokollen optimalisert av produsenten. Det dynamiske området for assayet er 0,025-0,25 SOD enheter/ml.

Bestemmelse av intracellulær endogen antioksidantkonsentrasjon

Måling av den reduserte glutation intracellulære konsentrasjon (GSH) Direkte kinetisk assay for å måle redusert glutation (GSH) i cellulære lysater.

Glutation kan finnes på innsiden av cellen hovedsakelig i redusert form (90-95 % av totalt glutation), og er den viktigste antioksidanten i vevene. Dens rolle er detoksifyserende xenobiotika og å fjerne hydroperoksider for å opprettholde den cellulære redokstilstand. Den anvendte teknikken måler den totale glutation (GSSG GSH) i en biologisk prøve (cellulært lysat) tidligere deproteinisert med sulfosalisylsyre (Sigma-Aldrich CS0260-sett). GSH forårsaker en kontinuerlig reduksjon fra 5,5’-ditiobis (2-nitrobenzo) syre (DTNB) til 5-tio(2-nitrobenzosyre (TNB) og GSSG dannet blir resirkulert ved glutationreduktase og NADPH. TNB blir spektrofotometrisk målt ved 412 nm. Butioninsulfoksimin (BSO) som spesifikt inhiberer gammaglutamylcysteinsyntetase ble brukt som en synteseinhibitor.

EVALUERING AV ANTIOKSIDANTAKTIVITETEN TIL DHA I EN HUMAN HUDMODELL

I dette in vitro assay ble forhudsceller (udifferensierte epidermale fibroblaster, ATCC CRL-2076) brukt som cellulær modell, idet de er en egnet cellulær type på grunn av deres gode in vitro respons til forskjellige oksidantinduserende midler, i tillegg til å være en primær kultur med normale ernæringskrav og kulturbetingelser, og utgjør således en god in vitro modell som kan ekstrapoleres til in vivo respons for en potensiell kosmetisk anvendelse av DHA.

Resultater

Betingelsene ble lagt ned initielt for å oppnå en aktiv cellulær modell under alle undersøkelsesbetingelser. Dette betyr at de oppnådde resultatene refererer seg til metabolsk aktive celler. Tidligere undersøkelser har allerede vist at i forhudsceller påvirker ikke konsentrasjoner av mindre enn 1000 μM DHA cellulær levedyktighet i undersøkelser over tre dager. Heller ikke ble cellulær levedyktighet påvirket ved undersøkelser av oksidativt stress med xantin/xantinoksidasesystemet eller med AAPH. Det er også blitt vist at inkorporering av DHA opptil en konsentrasjon på 50 μM i en kultur av forhudsceller over tre dager ikke signifikant øker det cellulære oksidative nivå målt som cellulær fluorescens assosiert med to prober, dihydrorodamin (DHR 123) og 2,7-diklordifluorescein (H2DCFDA), mer spesifikt henholdsvis for superoksidanion og for deteksjon av hydroperoksider. Når disse betingelser er blitt etablert ble den generelle antioksidantkapasiteten til DHA inkorporert i membranene i forhudscellene evaluert mot oksidativt stress indusert av xantin/xantinoksidase eller av AAPH.

Ved å indusere et moderat oksidativt stress med 40 mM AAPH og å benytte DHR123 som ROS-detektor viser DHA en inhiberende virkning på dannelse av reaktive oksygenelementer, både ved konsentrasjon på 0,5 μM (59 % beskyttelse) og 5 μM (33 % beskyttelse) og viser en lavere virkning ved 10 μM (26 % beskyttelse) eller ingen virkning ved 50 μM DHA (fig. 1A). Når cellene ble utsatt for alvorlig induksjon med 60 mM AAPH, viser DHA en beskyttende virkning mot dannelse av ROS både ved 0,5 μM konsentrasjon (40 % beskyttelse) og 5 μM (29 % beskyttelse), men mister den ved høyere konsentrasjoner av DHA (fig. 1A).

Vi kan også bemerke den beskyttelsen som 0,5 μM DHA utøver mot det oksidative stress indusert av xantin/xantinoksidase (fig. 1B), som viser en chelatdannelseseffekt på oksygenreaktive elementer, både superoksidanion og hydroperoksider dannet i den oksidative prosess. Ved å sammenligne antioksidantkapasiteten i relasjon til en lipofil antioksidant så som vitamin E (fig.

1B), observerer vi at de utøver lik beskyttelseskinetikk (med DHA som inhiberer cellulær oksidasjon ved 33,46 % og vitamin E ved 30 %).

Beskyttelseskinetikkresponsen til DHA presenterer alltid en maksimal antioksidantvirkning mellom 60-120 min. etter å ha utført induksjonen, og angir således en metning i hydroksyperoksider og superoksidanionsekvestreringskapasistet av DHA. Antioksidantatferden er kritisk doseavhengig siden å øke konsentrasjonen fører til et tap av ROS-chelatdannelseskapasitet, hvor 0,5 μM konsentrasjon har den mest effektive antioksidantkapasitet. I denne forbindelse er en annen kritisk parameter i form av optimalisering av effektiviteten til systemet andelen av DHA i relasjon til totale fettsyrer. Som vist i fig. 2 ved identiske konsentrasjoner av triglyserider, reduserer en reduksjon av andelen av DHA til 50 eller 20 % drastisk den cel lulære antioksidantkapasitet og den reverseres til å bli prooksidant ved lave eller moderate konsentrasjoner. Disse resultatene synes å angi at den cellulære antioksidanteffektivitet til DHA ikke avhenger eksklusivt av konsentrasjonen derav, men at dens molekylære lokalisering også er en avgjørende faktor, i dette tilfellet dets fordeling i strukturen til triglyseridet.

Med hensyn på spesifikk inhibisjon av ROS-produksjon analyserte vi dannelse av lipidiske peroksider (TBARS) og superoksidanioner. De oppnådde resultatene viste at cellene behandlet med AAPH dannet en høyere konsentrasjon av substansene som var reaktive til tiobarbitursyre (TBARS) sammenlignet med ikke-induserte celler, uttrykt som μM av MDA/mg proteiner (fig. 3). Som forventet økte inkorporering av DHA i membranen til forhudscellene noe den basale cellulære lipidiske peroksidering i doseavhengig form (0,5, 5 og 50 μM) (fig. 3). I cellene utsatt for oksidativ induksjon med 40 mM AAPH, presenterer DHA en antioksidantaktivitet som beskytter fibroblastene fra å danne membranhydrolipidiske peroksider, hvor dets virkning er av den inverse konsentrasjonsavhengige type. Beskyttelse med DHA var 87 % for 0,5 μM DHA, 85 % for 5 μM og 48 % for 50 μM DHA-TG (fig.

3).

Dannelse av superoksidanionene ble deretter analysert. Forhudsceller utsatt for et oksidativt stress med 40 mM AAPH dannet en superoksid anionproduksjon som var 2,5 ganger større enn de ikke-induserte celler, som opprettholdt et konstant superoksidanionnivå (fig. 4). I fravær av oksidativ induksjon viser ikke cellene med integrert DHA et høyere nivå av intercellulær superoksidanion i relasjon til kontroll (fig. 4). Under oksidative stressbetingelser (fig. 4) inhiberer DHA dannelse av superoksidanion med 16,5 % ved en konsentrasjon på 0,5 μM, med 10 % ved en konsentrasjon på 5 μM og ved 9 % med en konsentrasjon på 50 μM. Spesifisiteten til metoden ble konfirmert ved tilsetting av Tyron (4,5-dihydroksy-1,3-benzendisulfonsyre, en forbindelse som er permeabel i cellemembranen som virker som et meget spesifikt chelateringsmiddel for intracellulær superoksidanion) eller av ekstracellulær SOD (første linje enzymblokker i det endogene antioksidantforsvar via dismutering av det intracellulære superoksidanion).

Produksjon av superoksidanion i celler stresset med AAPH, med eller uten DHA tidligere integrert, og i nærvær av eksogen SOD eller av Tyron, ble totalt inhibert og oppnådde basale verdier (fig. 4).

Endelig analyserte vi om DHA gjennomgikk sin antioksidantaktivering ved å modifisere aktiviteten til førstelinje cellulære antioksidantenzymer. Aktiviteten til SOD og til GPx i forhudsceller med eller uten integrert DHA ble analysert. I det første tilfellet ble xantin/xantinoksidasesystemet brukt som øyeblikkelige dannere av superoksidanioner (total måletid 520 sek., måling hvert 50. msek.). De oppnådde resultater viser god oksidativ induksjon med hurtig kinetikk, med direkte observasjon av dismutering og ikke-produksjon av superoksidanion. Den maksimale kjemoluminescens oppnådd etter 15 sek. fra oksidativ induksjon ble tolket som et indirekte og kvalitativt mål på SOD-aktivitet (fig. 5A). Uten DHA integrert ble verdier på 310 UA kjemiluminescens/10<6>celler oppnådd, som falt til 150 UA kjemiluminescens/10<6>celler i et system preinkubert med DHA 0,5 μM (52 % antioksidantbeskyttelse) (fig. 5A). Antioksidanteffektiviteten ble opprettholdt ved 52 % og 42 % beskyttelse i cellene behandlet med henholdsvis 5 og 50 % μM DHA (fig. 5A). Videre, under kjennskap til at AAPH oksiderer DNA, kan proteinene og lipidene ved diffusjon av de dannede peroksylradikaler, DHA som antioksidant forhindre deaktivering av SOD betrodd dismutering av superoksidanion, som opprettholder cellens endogene antioksidantforsvar av katalase og glutationperoksidase. Dette aspekt blir konfirmert i fig. 5B, hvori SOD-aktiviteten er vist ikke å økes i basaltilstand når DHA er tilstede (-10/-15 %), men tap av SOD-aktivitet innebygget i den oksidative stressprosess blir inhibert hvormed DHA tilstede som opprettholder eller til og med øker SOD-aktiviteten (10/20 %). Som for GPx-aktivitet (fig. 6), er dette funnet å være øket i cellulær basaltilstand ved moderate konsentrasjoner av DHA (opptil 17 % ved 5 μM), men faller av ved høye konsentrasjoner (- 20 % ved 50 μM). Denne atferd blir holdt intakt i en oksidativ stresstilstand (fig. 6). Disse resultatene antyder at DHA samarbeider med det endogene antioksidantforsvarssystem som relateres til dismutering av superoksidanionene ved å danne SOD over hele området av de testede konsentrasjoner, og er også i stand til å kontrollere dannelse av hydroksyperoksider ved moderate konsentrasjoner siden det øker GPx-aktiviteten.

EVALUERING AV ANTIOKSIDANTAKTIVITET AV DHA I EN RETINACELLEMODELL

I denne in vitro undersøkelsen ble den cellulære modell basert på ARPE-19-celler (pigmentære retinale epitelceller, ATCC CRL-2302), som er en egnet cellulær type på grunn av dens gode in vitro respons til forskjellige oksidantinduktorer, så vel som å være en primær kultur med normale næringskrav og kulturbetingelser. Den utgjør også en god okular modell siden den beholder de biologiske og funksjonelle egenskaper til de retinale pigmentepitelceller.

Resultater

Assayet utført med denne cellelinje er lik den beskrevet for forhudsceller i foregående avsnitt. De basale krav var de samme med hensyn på å opprettholde cellulær levedyktigheten under alle arbeidsbetingelser (virkning av DHA, av oksidativ stress). Ei heller involverte inkorporering av DHA i de analyserte doser noe signifikant forandring i den basale cellulære oksidative tilstand.

Ved å indusere et moderat oksidativt stress med 40 mM AAPH og ved å bruke DHR 123 som ROS-detektor viser DHA en inhiberende virkning på dannelse av de reaktive oksygenelementer, i konsentrasjoner på 0,5 μM (43 % beskyttelse) og 5 μM (32 % beskyttelse), men med en lavere virkning ved 50 μM (4 % beskyttelse) av DHA (fig. 7A). Når cellene blir utsatt for alvorlig induksjon med 60 mM AAPH viser DHA en beskyttende virkning mot ROS-dannelse, ved 0,5 μM konsentrasjon (13 % beskyttelse) og lavere ved høyere konsentrasjoner av DHA (fig. 7A). Disse resultatene er lik de oppnådd med forhudsceller skjønt én bemerkelsesverdig avvikende virkning er den lavere beskyttelsen observert mot en alvorlig oksidativ induksjon. Ved å benytte CDCFDA som er mer spesifikk til peroksider for ROS-deteksjon viste det også at den beskyttelsen DHA utøver mot det oksidative stress blir indusert av AAP (fig. 7B).

Beskyttelseskinetikkene til DHA presenterer også alltid en maksimal antioksidantvirkning 60-120 min. etter at induksjonen ble utført, og viser en metning i DHA’s hydroperoksider og superoksidanionchelatdannelseskapasitet. Kvantitativt er antioksidantkapasiteten kritisk doseavhengig siden DHA-konsentrasjonen økes når DHA-konsentrasjonen økes er det et tap av ROS-chelatdannelseskapasitet, hvor 0,05 μM konsentrasjon er den mest effektive for antioksidantkapasitet (fig. 7A og 7B). I denne forbindelse er en annen kritisk parameter i form av optimalisering av effektiviteten til systemet forholdet mellom DHA og totale fettsyrer. Ved å redusere andelen av DHA i forhold til totale fettsyrer fra 70 % til 50-20 % reduseres signifikant og ikke proporsjonalt dets cellulære antioksidantkapasitet ved optimale konsentrasjoner (0,5-5 μM), og gjør den lik den ved de høye konsentrasjoner (fig. 8A og 8B) mot ulik forhudsceller ved at ingen andel gjør at DHA blir prooksiderende. Disse resultatene konfirmerer at den cellulære antioksidantvirkningen til DHA ikke avhenger eksklusivt av dens konsentrasjon men også er en avgjørende faktor dens molekylære lokalisering, i dette tilfellet dens fordeling i strukturen til triglyseridet.

Med hensyn på spesifikk inhibisjon av ROS-produksjon ble dannelse av lipidiske peroksider (TBARS) (fig. 9) og superoksidanioner (fig. 10) analysert. De oppnådde resultater er meget like de oppnådd med forhudsceller. Cellene behandlet med AAPH danner en høyere konsentrasjon av stoffer som er reaktive til tiobarbitursyre (TBARS) og av superoksidanioner i forhold til de ikke-induserte celler.

Inkorporering av DHA i membranen til ARPE-19-celler øker noe og doseavhengig (0,5, 5 og 50 μM) den cellulære basale lipidiske peroksidering, skjønt i cellene utsatt for oksidativ induksjon presenterer DHA en cellulær antioksidantaktivitet som inhiberer dem fra å danne membranlipidiske hydroperoksider i et inverst forhold til deres konsentrasjon. Beskyttelse med DHA var 64 % for 0,5 μM DHA, 58 % for 5 μM og 42 % for 50 μM DHA (fig. 9). Dannelse av superoksidanionet ble deretter analysert. I fravær av oksidativ induksjon resulterer ikke cellene med integrert DHA et høyere nivå av intracellulær superoksidanion i forhold til kontrollen (fig. 10A). Et oksidativt stress med 40 mM AAPH danner en superoksid anionproduksjon som er delvis inhibert med DHA (20-16 % ved konsentrasjoner på 0,5-50 μM). Denne inhibisjonen er i overensstemmelse med SOD-aktiviteten med DHA tilstede (fig. 10B). SOD-aktivitet er ikke funnet å være øket i basaltilstanden med DHA tilstede (-10/15 %), men som i forhudsceller, blir tap av SOD-aktivitet innebygget til den oksidative stressprosess inhibert med DHA tilstede som opprettholder basal SOD-aktivitet.

Endelig ble det utført en analyse for å finne ut om DHA forandret aktiviteten til GPx-enzymet som førstelinje cellulær antioksidant (fig. 11). GPx-aktiviteten blir øket i cellulær basaltilstand ved alle konsentrasjoner av DHA testet (12-40 %), og denne atferd blir opprettholdt intakt i oksidativ induksjonstilstand, som også presenterer en 2,5 ganger høyere GPx-aktivitet (fig. 11). Som i tilfellet med forhudsceller antyder disse resultater at DHA utøver del av sin antioksidantvirkning ved å modulere aktiviteten til det endogene cellulære enzymsystem for antioksidantforsvar.

INNFLYTELSE AV SYNTETISK METODE PÅ ANTIOKSIDANTAKTIVITET AV DHA INKORPORERT I ET TRIGLYSERID

I det foreliggende in vitro assay ble ARPE-19-celler (retinale pigmentepitelceller, ATCC CRL-2302) og forhudsceller (udifferensierte epidermale fibroblaster, ATCC CRL-2076) brukt som en cellulær modell, idet de er egnede cellelinjer på grunn av sin gode in vitro respons på forskjellige oksidantinduktorer. Tunfiskoljetriglyserider (DHA 20 molar%-TG, 20 molar% i DHA) eller oljederivater anriket med 50 eller 70 molar% i DHA (DHA50 %-TG og DHA 70 %-TG) oppnådd ved kjemiske metoder (CHEM) eller enzymatiske metoder (ENZ) ble brukt som aktive ingredienser.

Resultater

Ved induksjon av et moderat oksidativt stress med 40 mM AAPH i ARPE-19-celler og ved å bruke DHR 123 eller H2DCFDA som ROS intracellulære detektorer viser naturlig DHA (DHA 20 %-TG) og den inkorporert i et kjemisk oppnådd triglyserid (DHA 50 %-TG-CHEM og DHA 70 %-TG-CHEM) en inhibitorisk virkning ved dannelse av reaktive oksygenelementer, både ved 0,5 μM og 5 μM konsentrasjon, noe som viser en lavere virkning av 50 μM (fig. 13A). Denne virkningen avhenger av innholdet av DHA, som er DHA 70 %-TG-CHEM større enn DHA 50 %-TH-CHEM større enn DHA 20 %-TG. Ved de samme konsentrasjoner (0,5, 5 og 50 μM), viser enzymatisk oppnådde oljer en høyere aktivitet ved alle DHA-innhold (DHA 70 %-TG-ENZ og DHA 50 %-TG-ENZ) (fig. 13B). I en lignende undersøkelse med forhudssceller var resultatene enda mer overraskende. Den prooksidative aktivitet vist med DHA 70 % TG-CHEM og DHA 50 %-TG-CHEM ved høye doser (fig. 13C) blir antioksidativ ved alle konsentrasjoner med oljer med enzymatisk opprinnelse (DHA 70 %-TG-ENZ og DHA 50 %-TG-ENZ) (fig. 13D). Fjerning av de inder polymerer av olje oppnådd kjemisk ved hjelp av kromatografiske metoder (DHA 70 %-TG-BPM) forårsaker en enda større reduksjon av antioksiderende aktivitet i ARPE-19-celler som blir prooksidative ved høye konsentrasjoner (5 og 50 μM) (fig. 14). Den antioksidative aktivitet til DHA inkorporert i et triglyserid oppnådd ved enzymatisk syntese blir også høyere (minst dobbelt) enn den vist av DHA inkorporert i andre kjemiske strukturer så som etylestere, fri fettsyrer eller fettsyre koblet til serumalbumin (fig. 15).

Den cellulære antioksidative aktivitet vist ved inkorporering av DHA er relatert til alle aspekter tidligere vurdert så som å opprettholde SOD og GPx enzymatiske aktiviteter, men i tillegg til en økning i glutation intracellulær konsentrasjon (GSH). I ARPE-19-celler (fig. 16) induserer DHA en økning i den intracellulære GSH-konsentrasjon som er direkte relatert til nysyntese av GSH siden tilsetting av BSO (spesifikk inhibitor for GSH-syntese) eliminerer den beskyttende virkning av DHA (fig. 17) i et direkte slektskap med en reduksjon i GSH intracellulær konsentrasjon (fig. 15). En liknende atferd er vist for forhudsceller (fig. 18).

Forbedringen oppnådd i antioksidativ aktivitet av DHA ved en enzymatisk syntese er også anvendbar til andre omega-3 fettsyrer, så som ekosapentaensyre (EPA). I en undersøkelse med ARPE-19-celler er EPA oppnådd enzymatisk (EPA 70 %-TG-ENZ) vist å ha en antioksidativ aktivitet, skjønt meget lavere enn den observer t med DHA (DHA 70 %-TG-ENZ), mens EPA oppnådd kjemisk og fri for polymerer (EPA-70 %-TG-BPM) er vist å være meget prooksidativ (fig. 19). Videre viser EPA (EPA 70 %-TG-ENZ) oppnådd enzymatisk i forhudsceller en bemerkelsesverdig antioksidativ aktivitet som er enda høyere enn den for DHA (DHA 70 %-TG-ENZ (fig. 20), som akkurat som for DHA er relatert til økningen av GSH intracellulær konsentrasjon (fig. 21).

EVALUERING AV ANTIOKSIDANTAKTIVITETEN TIL DHA INKORPORERT I ET STRUKTURERT TRIGLYSERID I EN RETINACELLEMODELL

I dette in vitro assayet ble ARPE-19-celler (retinale pigmentepitelceller, ATCC CRL-2302) brukt som cellemodell, idet de er en egnet celletype på grunn av deres gode in vitro respons til forskjellige oksidantinduktorer, i tillegg til å være en primær kultur med normale ernæringskrav og kulturbetingelser. Videre er det en god okular modell siden den opprettholder de biologiske funksjonelle egenskapene til retinale pigmentepitelceller. Som en aktiv ingrediens er det blitt brukt strukturerte triglyserider avledet fra tunfiskolje (DHA 20 %-TG, 20 molar% i DHA) eller olje anriket med 70 % DHA (DHA 70 %-TG, 70 molar% i DHA), hvori fettsyrene i sn-1- og sn-3-posisjoner gjennom enzymatiske metoder er blitt erstattet med oktansyre. I disse nye forbindelsene er det molare innhold av DHA 7 % i DHA 20 %-TG og 22 % i DHA 70 %-TG.

Resultater (se fig. 22)

Ved å indusere et moderat oksidativt stress med 40 mM AAPH og ved å bruke DHR123 som ROS-detektor viser DHA inkorporert i et normalt triglyserid (DHA 20 %-TG og DHA 70 %-TG) en inhibitorisk virkning på dannelse av reaktive oksygenelementer, både ved konsentrasjoner på 0,5 μM og 5 μM, noe som viser en lavere virkning av 50 μM (fig. 22). Denne virkningen avhenger av innholdet av DHA, som er DHA 70 %-TG > DHA 20 %-TG. Ved de samme konsentrasjoner viser de strukturerte oljer med en virkelig DHA-konsentrasjon som er 2-3 ganger lavere, den samme aktivitet (for 0,5 μM konsentrasjon), eller høyere (for 5 μM og 50 μM konsentrasjoner) i tilfelle av DHA 20 %-TG. I tilfelle av DHA 70 %-TG er effektiviteten til de strukturerte triglyseridene noe lavere enn optimale konsentrasjoner (0,5 μM og 5 μM), men atferden ved høye konsentrasjoner er invertert (50 μM) noe som viser generelt en mer stabil og mindre doseavhengig atferd.

EVALUERING AV DHA-AKTIVITETEN SOM ET BESKYTTENDE MIDDEL FOR LENGDEN AV EN TELOMER ASSOSIERT MED ALDER I EN HUMAN HUDMODELL

I dette in vitro assayet ble forhudsceller (udifferensierte epidermale fibroblaster, ATCC CRL-2076) brukt som cellemodell, idet de er en egnet celletype på grunn av sin gode in vitro respons til forskjellige oksidantinduktorer, i tillegg til å være en primær kultur med normale ernæringskrav og kulturbetingelser, og utgjør således en god in vitro modell som kan ekstrapoleres til in vivo respons, for en potensiell kosmetisk applikasjon av DHA.

Metoder

Cellekulturer

Cellemodellene brukt var forhudsceller (udifferensierte epidermale fibroblaster, CRL-2076) oppnådd fra the American Type Culture Collection. Cellekulturen ble holdt under egnede vekstbetingelser ved temperatur 37<o>C, CO2-konsentrasjon på 5 % og humiditet 95 % i en inkubator som er spesielt konstruert for denne hensikt. CRL-2076-fibroblastene ble holdt voksende i kulturflasker i Iscovs modifisert Dulbeccos medium (Biological Industries) supplementert med 10 % bovint føtalt serum, penicillinantibiotika (100 U/ml), streptomycin (100 μg/ml) og glutamin (Biological Industries).

Integrering av DHA i cellene

Enzymatisk syntetisert DHA-TG 70 % ble tilsatt i en konsentrasjon på 0,5 μM, fremstilt ved å oppløse oljen i etanol for stamløsning (1:100) og fremstilling av arbeidsløsningene i et kulturmedium fremstilt med serum. Cellene ble dyrket med supplementert DHA-TG-medium i tre dager ved 37<o>C.

Induksjon av oksidativt stress

2,2’-azobis-(2-amidinopropan)dihydroklorid (AAPH) ble brukt for å stresse cellen oksidativt ved en konsentrasjon på 40 mM, i utstrakt grad brukt som en hydrofil initiator av frie radikaler ved å indusere lipidisk og proteinperoksidering. AAPH oksiderer DNA, proteiner og lipidene gjennom virkningen av de dannede peroksidradikaler. Den virker videre på det endogene forsvarssystem siden det deaktiverer nøkkelenzymet, SOD, for derved å miste den beskyttende kapasiteten til CAT og GPx.

Måling av lengden av telomeren

De telomere regioner som utgjøres av meget repetitive DNA kan evalueres ved in situ hybridiseringsteknikker. In situ hybridiseringsmetoden med fluorescens (FISH) bruker komplementære prober til de telomere sekvenser tillatt for å detektere nærvær eller fravær av telomerer, så vel som å kvantifisere telomerene pr. celle eller pr. kromosomgruppe. Fremgangsmåten kalt strømnings FISH bruker strømningscytometri i kombinasjon med FISH-teknikk ved å bruke et pan-telomert PNA (peptidnukleinsyre) som en probe og tillater at det måles, ved å bruke fluoresecensintensiteter, de gjennomsnittlige telomerlengder i kromosomendene i individuelle celler. For vår hensikt ble det benyttet fluorescensintensitet av PAN merket med kromosomene i metafasen. Resultatene er uttrykt som telomer fluorescensenhet (TFU) hvor hver TFU tilsvarer 1 kb av repetitive telomerer.

Resultater

Forandringer i gjennomsnittlig lengde av telomerene i humane fibroblaster dyrket under oksidative stressforbindelser med eller uten inkorporert DHA ble analysert ved strømnings-FISH (fig. 23). En lineær regresjon ble brukt til å analysere sammenhengen mellom mengden av telomerer og passasjeantallet til cellulære populasjoner. For alle de analyserte kulturer kan skråningen i regresjonene forstås direkte som telomerforkortningsindeks. I humane fibroblaster akselererer behandling med AAPH, som induserer et overskudd av intracellulære frie radikaler, bemerkelsesverdig telomerforkortningsindeksen. På den annen side reduserer inkorporering av DHA i en konsentrasjon på 0,5 μM, som er blitt vist å øke celleantioksidantforsvaret, nevnte indeks med 50 % med hensyn på dens verdi uten DHA. Videre er inkorporering av DHA i stand til å redusere den telomere forkortningsindeksen, enda med hensyn på normal kontroll av fibroblaster.